CN1122138A - 折回三螺旋形成寡核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的寡核苷酸,它与目标核酸形成双螺旋,然后与该寡核苷酸和该目标核酸形成的双螺旋形成三螺旋。
Description
本发明涉及合成寡核苷酸。更详细地说,本发明涉及用于调节基因表达的合成寡核苷酸。
自从Zamecnik和Stephenson(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:280-284(1978))首次证实合成寡核苷酸对病毒复制的抑制以来,人们对作为治疗剂的寡核苷酸已引起极大兴趣。近些年来,对作为治疗剂和基因表达调节剂的寡核苷酸的开发活动也越来越激烈了。最大的进展是在可与目标mRNA形成Watson-Crick双螺旋的所谓反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide)的使用上。Agrawal(Trends in Biotechnology,10:152-158(1992))详细综述了反义寡核苷酸作为抗病毒药剂的进展情况。
一个同样重要,但还没有充分开发的方法是所谓的反基因寡核苷酸方法(antigene oligonucleotide approach),其中,寡核苷酸通过Hoogsteen碱基配对与目标DNA双螺旋形成三螺旋。Chang和Pettitt(Prog.Biophys.Molec.Biol.,58:225-257(1992))最近曾对后一方法进行了综述。曾观察到DNA和不同类型的寡核苷酸之间形成的三螺旋结构。Cooney等(Science,241:456-459(1988))讲述了DNA和寡脱氧核苷酸磷酸二酯之间三螺旋的形成。Latimer等(Nucleic Acids Res.,22:1549-1561(1989))公开了寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯参与的三螺旋的形成。Kibler-Herzog等(NucleicAcids Res.,18:3545-3555(1990))公开了短的寡脱氧核苷酸甲基膦酸酯参与的三螺旋的形成。也已知了促进三螺旋形成的不同的碱基修饰,包括胞嘧啶核苷的C5-甲基化(Xodo等,J.Molec.Biol,19:5625-5631(1991)),使用二环胞嘧啶核苷类似物,MODA(Young等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:10023-10100(1991)),和使用合成α-异构核苷酸(Praseuth等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:1349-1353(1988))。Giovannangeli等(J.Am.Chem.Soc.113:7775-7777(1991))讲述了在加帽的寡核苷酸5′端加上吖啶插入物也增加三螺旋的稳定性。寡核苷酸中介的三螺旋的形成,至少在体外可造成转录的抑制(参阅Cooney等和Young等前述文献)。
反义寡核苷酸方法和反基因寡核苷酸方法二者都能调节基因表达,并以此为目标,这对理解基因的表达,和涉及基因表达的疾病或状况的治疗都是有益的。非常适于达到这些目标的寡核苷酸化合物的两个主要特点是高度的特异性和结合后对基因表达的干扰能力。增强这些特性总是人们所期望的。因而,需有一种具有更强的特异性和能形成更稳定的复合物的新的寡核苷酸,使其比现有化合物具有更强的干扰基因表达的能力。
本发明提供了比现有寡核苷酸具有更强特异性和能与目标核酸形成更稳定复合物的新的寡核苷酸。根据本发明的寡核苷酸具有一个双螺旋形成区,该区通过Watson-Crick碱基配对与一个单链目标核酸杂交,并有一个三螺旋形成区,该区折回到双螺旋形成区与目标核酸形成的双螺旋上,落入大沟,并在此通过Hoogsteen碱基酸对与目标核酸形成三螺旋。双螺旋形成区和三螺旋形成区是由连接区连接在一起的,该连接区可以是允许双螺旋形成区和三螺旋形成区都结合到目标核酸上的一个寡核苷酸环或任一种柔韧的化学结构。因而,根据本发明的目标核酸与寡核苷酸之间形成的复合物,在调节基因表达方面,既具有类似于反义方法中的双螺旋结构的特点,也具有类似于反基因方法中的三螺旋结构的特点。因为同一个寡核苷酸既具有双螺旋形成的功能也具有三螺旋形成的功能。该结构被称为折回三螺旋(foldback triplex),而根据本发明的寡核苷酸,即与目标核酸结合而形成折回三螺旋的寡核苷酸被称为折回三螺旋形成寡核苷酸(foldback triplex-forming oligonucleo-tides)。
折回三螺旋形成寡核苷酸的增强的特异性产生于这样一个事实,即它们必须两次解读目标核酸,一次是通过Watson-Crick碱基配对形成双螺旋,再一次是通过Hoogsteen碱基配对形成三螺旋。折回复合物提高的稳定性产生于寡核苷酸和目标核酸之间形成的氢键数目的增加。根据本发明的折回三螺旋形成寡核苷酸可用于进行不同的参数下双螺旋和三螺旋形成动力学的体外研究。它们也可用于组织培养或动物模型中的基因表达调节研究。最后,根据本发明的折回三螺旋形成寡核苷酸作为治疗剂,可用于具有反义和反基因治疗方法特点的新型治疗方法中。
附图简要说明:
图1表示调节基因表达的反义和反基因方法。
图2表示具有与三螺旋形成有关的Watson-Crick和Hoogsteen氢的键合类型的C-G·C+和T-A·T碱基三联体。
图3显示根据本发明的折回三螺旋形成寡核苷酸,通过Watson-Crick(=)和Hoogsteen(:)碱基配对与目标核酸结合。黑链代表三螺旋形成区。
图4显示4种不同类型的折回三螺旋。
图5显示G四联体和A四联体的氢的键合类型。
图6显示折回四螺旋形成引起的分子结节。
图7显示证实目标RNA或DNA与本发明的折回三螺旋形成寡核苷酸之间折回三螺旋形成的分光光度结果。
图8显示证实目标DNA与本发明的折回三螺旋形成寡核苷酸在pH5.0时形成,但在pH7.4时不形成(除非有多胺精胺存在)折回三螺旋的分光光度结果。
图9显示RNA酶H对结合于根据本发明的折回三螺旋形成寡核苷酸或,结合于作为对照的双螺旋形成寡核苷酸的目标RNA分子的水解类型。
图10是图9所示的RNA酶H水解类型的图解图。细箭头代表RNA酶H的核酸内切酶活性。粗箭头代表RNA酶H核酸外切酶活性的抑制点。
图11展示所使用的寡核苷酸,以显示折回三螺旋复合体增强的稳定性,以及它们之间相互杂交的方式。
图12A显示反义寡核苷酸和目标序列23所形成的不同复合物的熔解曲线。图12B是图12A所示曲线的一次导数曲线图。
图13是DNA酶I对目标序列23的不同复合物消化的分布图。
图14是显示目标序列23形成的复合物对DNA酶I敏感和保护的放射自显影图。
图15是显示与目标序列23形成的复合物泳动率变化的放射自显影图。
本发明涉及用于调节基因表达的合成寡核苷酸。本发明提供了比现有寡核苷酸具有更高特异性和能与目标核酸形成更稳定复合物的合成寡核苷酸。
现有的寡核苷酸中介的调节基因表达的方法是反义方法和反基因方法,如图1所示。在反义方法中,目标核酸是一单链核酸,基因表达调节剂是一互补寡核苷酸。该互补寡核苷酸与该目标核酸通过互补碱基间的Watson-Crick碱基配对形成双螺旋。基因表达的调节可能是通过多种机制进行的,包括RNA酶H对RNA的降解、阻止核糖体在RNA上的功能、或阻止RNA或DNA上酶的功能。相比之下、反基因方法中,目标核酸是双链核酸,基因表达调节剂是寡核苷酸,该寡核苷酸能够落入该目标双螺旋的大沟,与该目标双螺旋的一条链形成Hoogsteen碱基配对,例如图2所示的配对。这一相互作用的结果是三螺旋的形成。基因表达的调节可能是通过干扰转录过程进行的。
根据本发明的寡核苷酸具有反义和反基因方法两者的特点。本发明的寡核苷酸的目标核酸是单链核酸,同反义方法。本发明的寡核苷酸有一双螺旋形成区,该区与目标核酸互补,并通过互补碱基对之间的Watson-Crick碱基配对与目标核酸形成双螺旋,这一点也同反义方法。然而,本发明的寡核苷酸也有一个三螺旋形成区,该区的核苷酸序列与该寡核苷酸双螺旋形成区的核苷酸序列相同,但极性相反,即为一反向重复或半回文结构。该三螺旋形成区通过Hoogsteen碱基配对,在该寡核苷酸的双螺旋形成区与目标核酸形成的双螺旋大沟中,与目标核酸相互作用。这一相互作用的结果是三螺旋的形成。这样的复合物被称为折回三螺旋(foldback tripl-ex),图3所示的是根据本发明的两个寡核苷酸与它们的目标核酸形成的两个复合物。简言之,折回三螺旋是一寡核苷酸与一目标核酸形成的一复合物,其中,该寡核苷酸首先与该目标核酸形成双螺旋,然后,该同一个寡核苷酸分子折回来并与在该目标核酸和该寡核苷酸之间形成的双螺旋形成三螺旋。因为本发明的寡核苷酸能够与目标核酸形成折回三螺旋,该寡核苷酸特此被称为折回三螺旋形成寡核苷酸。
折回三螺旋形成寡核苷酸确能形成双螺旋和三螺旋这一事实已被相互独立的证据证实。首先,在允许含有胞苷的三螺旋形成链参与的Hoogsteen碱基配对形成的条件下(pH5.0,这时胞苷被质子化),折回三螺旋形成寡核苷酸与一目标核酸形成一复合物,该复合物在热变性时产生两个明显A260增加(每一增加代表一次变性的发生)。这两个A260增加发生的温度大约在三螺旋和双螺旋热变性的预期温度。考虑到G+C含量,较高温度(第二个)的A260增加发生在由Watson-Crick碱基配对形成的复合物解离时的预期温度。较低温度(第一个)的A260增加被认为是由较热不稳定的Hoogsteen碱基配对形成的复合物的解离引起的。相比之下,若变换条件,阻止含有胞苷的三螺旋形成链参与的Hoogsteen碱基配对的形成(ph7.4,这时胞苷不被质子化),只有较高温度的S260增加可观察到。并且,在多胺的生理浓度下(3.0mM精胺,稳定三螺旋结构),就恢复为两个A260增加。
对由折回三螺旋形成寡核苷酸形成的折回三螺旋结构存在的独立的支持来自RNA酶H的水解分析。当一反义寡核苷酸磷酸二酯和一目标RNA(下文实施例2)形成双螺旋时,该RNA被赋予对RNA酶H消化的敏感性,先由RNA酶H的核酸内切酶活性作用,再由RNA酶H的核酸外切酶活性作用。然而,当使用折回三螺旋形成寡核苷酸磷酸二酯时,参与三螺旋形成的区域并不抑制或减弱RNA酶H核酸内切酶活性,但抑制RNA酶H的核酸外切酶活性。因而,在反义寡核苷酸或折回三螺旋形成寡核苷酸的专门的双螺旋形成区,与其目标核酸之间形成双螺旋时,RNA酶H的核酸外切酶活性不被抑制,而在所有形成三螺旋的区域中该活性都被抑制。这就提示,若需得到激活RNA酶H的折回三螺旋形成寡核苷酸,只需要留下专门形成双螺旋和含有激活RNA酶H的核苷酸的一段寡核苷酸(如:核苷酸磷酸二酯或硫代磷酸酯)。观察到的RNA酶H水解的结果与这样一个观念相一致,即三螺旋的形成使RNA酶H的核酸外切酶活性不能触及双螺旋的大沟,这是由于三螺旋结构产生于涉及一寡核苷酸链的Hoogsteen碱基的配对,并且该寡核苷酸链将大沟占据。用折回三螺旋形成寡核苷酸硫代磷酸酯或嵌合体应得到相同的结果,因为在嵌合寡核苷酸中的寡核苷酸硫代磷酸酯或单独的寡核苷酸硫代磷酸酯,在与RNA形成的双螺旋中也能激活RNA酶H(参阅美国专利NO5149797,其内容在本文中引作参考)。两相变性的观察的结果与三螺旋形成区特异的RNA酶H核酸外切酶抑制现象二者结合起来,有力地支持了折回三螺旋形成寡核苷酸与其目标核酸之间折回三螺旋的形成。这些发现的意义包括以下方面。它们提示,折回三螺旋形成寡核苷酸能够干扰与核酸双螺旋的大沟相互作用的酶的活性,这些很有可能包括任一种加工酶活性(processive enzymatic activity),如聚合酶活性。另外,与一般的反义寡核苷酸相反,折回三螺旋形成寡核苷酸和它们的目标核酸形成的拉链状或夹子状复合物不能被核糖体解离。
折回三螺旋形成寡核苷酸一般来说具有至少三个结构特征,一个双螺旋形成区,一个三螺旋形成区,和一个连接区。本文中提及的完整的折回三螺旋形成寡核苷酸和各个结构区域,除另有特别说明外,结构特征包括(但不限于):具有5′-3′连接的核糖核苷、2′取代的核糖核苷、和/或脱氧核糖核苷酸聚合物;其中,核苷酸间连键可以是天然的磷酸二酯连键或人造的连键,诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、烷基膦酸酯、烷基硫代膦酸酯、磺酸酯、氨基甲酸酯和/或磷酸三酯连键;并且,这样的寡核苷酸包括在碱基和/或糖基上具有修饰的寡核苷酸,也包括在3′和/或5′端具有携带核酸酶抗性的取代基或大取代基的寡核苷酸。折回三螺旋形成寡核苷酸的选样示于表1。
折回三螺旋形成寡核苷酸的双螺旋形成区的特征是,它具有与目标核酸序列足以互补的核苷酸序列,从而在实验或生理条件下与目标核酸序列杂交。该双螺旋形成区最好具有约8-50个核苷酸,更优选的是,具有约12-约35个核苷酸。作为实验用途,该目标核酸可具有实际上任一种核苷酸序列。然而,当折回三螺旋形成寡核苷酸用于治疗和医学时,该双螺旋形成区最好具有与引起特定疾病或生理状态的核酸的核苷酸序列在生理条件下足以互补并杂交的核苷酸序列。一些双螺旋形成区具有HIV gag-互补序列的折回三螺旋形成寡核苷酸示于表1。
折回三螺旋形成寡核苷酸的三螺旋形成区的特征是,其核苷酸序列是双螺旋形成区的镜像,从而与整个或部分双螺旋形成区形成回文结构。换句话说,若不考虑任何碱基修饰,三螺旋形成区的碱基序列是同一个折回三螺旋形成寡核苷酸的全部或部分双螺旋形成区的反向重复(从而与目标序列反向互补)。三螺旋形成区最好至少有8个核苷酸,并且可以是直至双螺旋形成区长度的任一长度。在优选的实施方案中,三螺旋形成区的碱基包括5-溴脱氧尿嘧啶和/或5-甲基胞嘧啶,这两者在生理pH值或接近生理pH值时促进Hoogsteen碱基配对的形成。双环胞嘧啶类似物MODA,α-异构核苷酸和/或末端吖啶,其它末端插入物,或DNA剪切或修饰剂(如EDTA-FeII和CC-1065),或疏水或双亲性基团(如胆甾醇、环糊精或多胺)也可出现于三螺旋(或双螺旋)形成区,从而促进三螺旋的稳定性或目标核酸的解体。
三螺旋形成寡核苷酸的连接区是连接双螺旋形成区和三螺旋形成区的柔韧性区域。连接区可以是约3个至约10个核苷酸的寡核苷酸。在优选的实施方案中,该连接区是有约5个核苷酸的寡核苷酸。或者,连接区是一些其它柔韧性化学结构,如具有约4-20个碳原子的取代的或非取代的烷基或芳香基(如异丙基,邻二甲苯基),或核糖或1′,2′-二脱氧核糖链。在优选的实施方案中,该连接区是六甘醇。最少时,该连接区是一个单独的共价键。下面表1列出几种优选方案的折回三螺旋形成寡核苷酸。表1部分折回三螺旋形成寡核酸和一种作为对照的反义寡核苷酸
环或 三螺旋 寡核苷酸双螺旋形成区
连接区 形成区 序列编号5′-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT--CACAC--TCTTCCTCTCTCTAC 15′-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT----L*----TCTTCCTCTCTCTAC 2
5′-CATCTCTCTCCTTCT--CACAC--TCTTCCTCTC 3
5′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCTACCCACGCT 4
5′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCTACCCACGC 5
5′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCTACCCACG 6
5′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCTACCCAC 7
5′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCTACCCA 8
5′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCTACCC 9
5′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCTACC 10
5′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCTAC 11
5′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCTA 12
5′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCT 13
5′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTC 14
5′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCT 15
5′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTC 16
5′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--TCTCT--TTCCTCTCTCTACCCACGCT 17
5′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--TCTCT--TTCCTCTCTCTACC 18
5′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--TCTCT--TTCCTCTC 19
3′-TTCCTCTCTCTACCCACGCT--TCTCT--TCGCACCCATCTCT 20
3′-TTCCTCTCTCTACCCACGCT--TCTCT--TCGCACCC 215′-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT 22六甘醇
根据双螺旋形成区是在环或连接区的该5′一边至3′一边,也根据三螺旋形成区的长度,折回三螺旋形成寡核苷酸可通过四种不同的方式与目标单链核酸形成折回三螺旋。这四种构型示于图4。如图4所示,表1所示的寡核苷酸中,4号和17号形成A型折回三螺旋,而1-3号,5-16号,18号和19号形成C型折回三螺旋,20号和21号形成D型折回三螺旋(这二者也示于图4)。
因为DNA能呼吸(参阅,如,Ussery和Sindem,Biochemistry,32:6206,1993),折回三螺旋形成寡核苷酸可与DNA形成三螺旋(参阅,如,Helene和Toulme,Biochemica et Biophysica Acta:99(1990),第100页)。
癌细胞比普通细胞具有较低的pH值(参阅,如,Lutz F.Tietzein Molecular Aspects of Chemotherapy:Proceedings of theSecond International Symposium on Molecular Aspects ofChemotherapy,第5章(E.Borowski and D.Shugar Eds.,PergamonPress,1990))。因而,可设计出仅能在癌细胞中形成折回三螺旋的折回三螺旋形成寡核苷酸,通过将折回三螺旋形成寡核苷酸设计成具有短的三螺旋形成区并含有很多的胞嘧啶(必须质子化,最好在低pH值条件下)才能形成Hoogsteen键,可在癌细胞中获得该寡核苷酸的活性。
通过精心选择目标序列,以及折回三螺旋形成寡核苷酸的双螺旋和三螺旋形成区序列,应有可能创造出参与形成四螺旋(a/k/a四螺旋)结构的寡核苷酸。这种寡核苷酸应被称为折回四螺旋形成寡核苷酸,因为同一个核苷酸与目标核酸参与不同类型的Hoogsteen碱基的配对,以形成四螺旋。对四条并排的、不同的链和仅限于分子内部构型的四螺旋较高级结构已进行过描述(参阅,如,Zimmerman等,J.Mol.Biol.92:181-192(1975); Lee等,NucleicAcids Res.8:4305-4320(1980);Sen和Gilbert,Nature334:364-366(1988)和344:410-414(1990))。然而,具有可使其与单链目标核酸形成四螺旋的结构的寡核苷酸还未见描述。在这种寡核苷酸中,目标核酸和寡核苷酸应含有四个相连的G碱基或与G碱基相邻的A碱基,以形成四螺旋形成所需的四联体。G四联体包含对称地分布于一个中心轴周围的以Hoogsteen方式氢键连结在一起的四个G碱基,如图5所示。由分子模型推测的A四联体包含由类似的Hoogsteen方式氢键连结在一起的四个A碱基,也如图5所示。A4四联体中心配置的6-NH2基影响该结构的稳定性,并且不利于四螺旋DNA中相连着的A4四联体。然而,相邻的G4四联体通过G4四联体的O6羰基氧和A4四联体的N6氨基质子之间有利的静电相互作用的稳定作用,有利于A4四联体的形成。同样,已知存在有C+4四联体和U4四联体。
能够形成折回四螺旋的本发明的折回三螺旋形成寡核苷酸可用于研究四螺旋的结构,最近对其生物学意义已引起关注(参阅,如,Blackburn,Nature,350:569-573,1991)。另外,这类寡核苷酸可与单链mRNA或双链RNA或DNA相互作用,形成复杂的分子结节,如图6所示的与mRNA作用的情况。这种结构应能强烈抑制mRNA到蛋白质的转译,或RNA或DNA的复制或转录,并且应该对细胞培养中基因表达调节的研究和作为治疗剂都是非常有用的。
根据现有技术已知的合成寡核苷酸的任一种方法都可合成本发明的折回三螺旋形成寡核苷酸。例如,美国专利5,047,524讲述了寡核苷酸的亚磷酰胺合成方法,其内容结合在本文中作为参考。还有美国专利5,149,748讲述了寡核苷酸合成的优化的H-膦酸酯方法,其内容结合在本文中作为参考,在将任一个羟基首先用一适当的,如二甲氧基三苯甲基的保护基保护,将任一存在的氨基用一适当的,如三氟乙酰基的保护基保护,并将一端连接于适当的、如β-氰乙基亚磷酰胺或H-膦酸酯基的偶联基的条件下,也可根据这些方法合成含有非寡核苷酸连接区的折回三螺旋形成寡核苷酸。
本发明的三螺旋形成寡核苷酸可用于多种目的。首先,它们可用于核酸三螺旋形成的体外研究。在一个折回三螺旋形成寡核苷酸中,可以改变多种参数,如核苷酸间连键类型、碱基修饰、连接长度和柔韧性能等,以研究三螺旋形成和解离的动力学,这可能是一个重要的生物学过程。另外,折回三螺旋形成寡核苷酸可代替传统的反义寡核苷酸,用于组织培养和动物模型中的基因表达研究。在这些系统中,折回三螺旋形成寡核苷酸的提高了的特异性和复合物的稳定性应该是有益的。
最后,折回三螺旋形成寡核苷酸可作为治疗剂用于与特定基因表达有关的疾病或生理不适的治疗。适于用特定的折回三螺旋形成寡核苷酸治疗的疾病或身体不适依赖于生理条件下双螺旋形成区足以互补并杂交的核苷酸序列。许多情况下,该核酸序列为病毒核酸序列。使用反义寡核苷酸来抑制各种病毒的方法已公知,最近在Agrawal,Tibtech,10:152-158(1992)中有综述。反义抗病毒方法中获得的知识可用于双螺旋形成区。对许多病毒的可与有效的反义寡核苷酸杂交的病毒核酸序列已有描述,包括人类免疫缺陷I型病毒(U.S Patent NO 4806463,其内容结合在本文中作为参考)、单纯性疱疹病毒(U.S Patent NO 4689320,其内容结合在本文中作为参考),流感病毒(U.S.Patent NO 5194428,其内容结合在本文中作为参考),和人类乳头瘤病毒(Storey等,Nucleic Acids Res.,19:4109-4114(1991))。可与这些核酸序列中的任一种序列杂交的序列都可用作。折回三螺旋形成寡核苷酸的双螺旋形成区,与来自其它病毒的核酸序列互补的核苷酸序列也一样可用作折回三螺旋形成寡核苷酸的双螺旋形成区。已知核酸序列的,并可制备出与该序列作用的折回三螺旋形成寡核苷酸的另外一些病毒包括,但不限于,口蹄疫病毒(参阅Robertson等,J.Virology,54:651(1985);Harris等,J.Virology,36:659(1980)),黄热病病毒(参阅Rice等,Science,229:726(1985)),水痘—带状疱疹病毒(参阅Davison和Scott,J.Gen.Virology,67:2279(1986)),黄瓜花叶病毒(参阅Richards等,Virology,89:395(1978)),乙型肝炎病毒(参阅Raney和McLachlen,in Molecular Biology of Hepatitis B Virus(CRC Press,1991)),丙型肝炎病毒(参阅Miller和Purcell,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:2057-2061(1990);Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4942-4946(1992);J.General Virology,74:661-668(1993)),和呼吸道合胞病毒(参阅Collins,in The Paramyxo Viruses,第四章,第103-162页(David W.Kingsbury,Ed.,1991))。或者,双螺旋形成区可以具有与致病生物的核酸序列互补的核苷酸序列。已对多种致病生物的核酸序列进行过描述,包括致疟疾生物恶性疟原虫,和许多致病细菌。可与任一种这类致病生物的核酸序列杂交的核苷酸序列都可构成折回三螺旋形成寡核苷酸的双螺旋形成区。已知核酸序列并对该序列可制备出折回三螺旋形成寡核苷酸的致病真核生物的实例包括,但不限于,冈比亚布氏锥虫和利什曼原虫(参阅Campbell等,Nature,311:350(1984)),肝片吸虫(参阅Zurita等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:2340(1987))。制备抗真菌折回三螺旋形成寡核苷酸可用,如,与几丁质合成酶基因的核酸序列互补的核苷酸序列作为双螺旋形成区,制备抗细菌折回三螺旋形成寡核苷酸可用,如,丙氨酸消旋酶基因。在另一个实施方案中,折回三螺旋形成寡核苷酸的双螺旋形成区可具有与细胞基因或基因转录物互补的核苷酸序列,该细胞基因或基因转录物的异常表达或异常产物导致疾病的发生。对几种这类细胞基因的核酸序列已有描述,包括朊病毒蛋白(Stahl和Prusiner,FASEB J.,5:2799-2807(1991)),与早老性痴呆(Alzheimer′s disease)症相关的淀粉样蛋白(U.S Patent NO5015570,其内容结合入本文中作参考),和各种公知的癌基因和原癌基因,如:c-myb,c-myc,c-abl,和n-ras。另外,抑制主要或专门与精子发生,精子运动,精子与卵子结合或其它影响精子存活的任一步骤相关的结构蛋白或酶的合成的寡核苷酸可被用作男人的避孕药物。同样,用于妇女的避孕药物可以是抑制与排卵,受精,植入或参与那些过程的激素的生物合成相关的蛋白质或酶的寡核苷酸。高血压可通过寡核苷酸抑制血管紧张肽原酶/血管紧张肽系统中的血管紧张肽转化酶或相关的酶的合成来进行控制;血小板凝集可通过抑制合成血栓烷A2所需的酶的合成来控制,用以治疗心肌和脑的循环障碍、梗塞、动脉硬化、栓塞和血栓的形成;胆固醇在动脉壁的沉积可通过抑制脂酰辅酶A:动脉硬化中的胆固醇酰基转移酶的合成来抑制;抑制胆碱磷酸转移酶的合成可能对低脂血(hypo-lipidemia)非常有益。有许多神经异常可用折回三螺旋形成寡核苷酸减轻或消除其负面效应。例如,抑制单胺氧化酶的合成可用于帕金森氏病(Parkinson′s disease);抑制儿茶酚O-甲基转移酶可用于治疗抑郁症;抑制吲哚N-甲基转移酶可用于治疗精神分裂症。抑制从花生四烯酸级联反应导致生成前列腺素和白细胞三烯中选出的酶,可能用于控制血小板凝集、变态反应、炎症、疼痛和哮喘。抑制由多种药物抗性(mdr)基因表达的蛋白质(该蛋白质导致对各种抗癌药物的抗性的产生从而成为化学疗法中的主要障碍),在癌症的治疗中可能非常有益。与上述任一种基因的核酸序列互补的核苷酸序列都可用作本发明的折回三螺旋形成寡核苷酸的双螺旋形成区;同样,与其它任一种细胞基因或基因转录物(其异常表达或其异常产物导致疾病的发生)互补的寡核苷酸序列也可用作本发明的折回三螺旋形成寡核苷酸的双螺旋形成区。植物细胞中基因表达的反义调节在美国专利5107065中已有描述,其内容结合在本文中作为参考。由于双螺旋形成区的核苷酸序列能与基本上任一种基因形成Watson-Crick碱基配对,折回三螺旋形成寡核苷酸的治疗范围应该是很宽的。然而,有几种疾病特别引起人们的关注。例如:各种病毒性疾病可用折回三螺旋形成寡核苷酸治疗,包括AIDS、ARC、口腔或生殖器疱疹、乳头瘤肉赘、流感、口蹄疾、黄热病、水痘、带状疱疹、HTLV-白血病、和肝炎。可由折回三螺旋形成寡核苷酸治疗的真菌性疾病中有念球菌病、组织胞浆菌病、隐球菌病、芽生菌病、曲霉病、孢子丝菌病、着色芽生菌病、dematophytosis和球孢子菌病。该方法也能用于治疗立克次氏体病(如、斑疹伤寒、落矶山斑疹热),和由沙眼衣原体或性病性淋巴肉芽肿引起的性传播疾病。多种可用折回三螺旋形成寡核苷酸治疗的寄生虫病包括阿米巴病、Chegas′病、亏形体病、肺孢子虫病、贾第鞭毛虫病、隐孢子虫病、滴虫病、和卡氏肺囊虫肺炎;以及蠕虫病(肠虫病),例如:蛔虫病、丝虫病、旋毛虫病、血吸虫病和线虫或绦虫感染。用折回三螺旋形成寡核苷酸可治疗疟疾,不管是它是由恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫引起的或由三日疟原虫引起的。上文所述的传染性疾病都能用折回三螺旋形成寡核苷酸治疗,因为这些疾病的传染因素都是已知的,因而可制备出根据本发明的折回三螺旋形成寡核苷酸,其目标形成区具有可与传染因子的传播必须的核酸序列(如必须的基因)杂交的核酸序列。
下述实施例的目的是为了进一步说明本发明的一些优选实施方案,不是为了限定其内容。实施例1
用分光光度计证实折回三螺旋的形成
将目标RNA或DNA和折回三螺旋形成寡核苷酸(均为0.2 A260单位)干燥,然后一同溶于500μl 100mM乙酸钠/1mM EDTA(乙二胺四乙酸)中。加热该溶液至80℃,保持30分钟,并缓慢冷却至室温,然后在4℃培养12小时。然后将该溶液以0.5℃/分钟的速率加热至80-90℃,在此期间测定A260值。A260的增加是螺旋结构解离的标志。这些研究的结果综合于下面表2。
在pH5.0的乙酸钠缓冲液中进行起始研究,其中,胞嘧啶被质子化,并能与鸟嘌呤形成Hoogsteen碱基配对。在这些研究中,寡核苷酸1和2(参阅表1)以两个明显A260变换(参阅图7)与互补RNA或DNA结合。寡核苷酸1和互补DNA在59.5和65.8℃显示A260变换。寡核苷酸2具有六甘醇连接区,在58.8和65.6℃与互补DNA,在55.3和64.3℃与互补RNA显示A260变换。这些结果显示,寡核苷酸1和2都形成折回三螺旋,即与RNA和DNA形成双螺旋和三螺旋,并且在大约预期的温度下双螺旋解离和在较低的温度下三螺旋先解离。
为进一步测试该结果的这种解释,在与起始研究相同的条件下,只是乙酸钠缓冲液的pH值为7.4,进行另一个实验。在这些条件下,观察到较高温度的A260变换。但观察不到较低温度的A260变换。这进一步支持了在pH5.0观察到的两个变换是双螺旋和三螺旋的形成和解离这一解释。因为pH7.4时胞嘧啶不被质子化,因而不能形成三螺旋结构必须的Hoogsteen氢键(参阅图2)。
最后,为测试这些寡核苷酸在生理条件下是否能与互补RNA或DNA形成折回三螺旋,用寡核苷酸4(参阅表1),除了乙酸钠缓冲液为pH7.4并含有3.0mM精胺,在与初始研究相同的条件下进行一个实验。在这些条件下,恢复了两个明显的A260变换(见图8)。这些结果显示,这些寡核苷酸在生理条件下(含有毫摩尔量的多胺)确能形成折回三螺旋。
表2
折回三螺旋的分光光度分析结果
Tm.℃*序列 三螺旋 双螺旋 条件(pH)编号 DNA RNA DNA RNA1 58.8 - 65.6 - 5.02 59.5 55.3 65.8 64.3 5.03 56.5 - 61.3 - 5.04 N** - 65.8 - 7.44 56.0 - 68.8 - 7.4+S**** 两个值的平均值** 没有观察到*** 表示加有精胺实施例2
双螺旋和折回三螺旋的RNA酶H水解分析
为检验折回三螺旋形成对用以RNA为底物酶活性的影响效果,进行RNA酶H的水解分析。在这些研究中,使用具有HIV-1 gag RNA序列的长度为39的核糖核苷酸(RNA)。将该39聚体,5′-AGAAGGAG-AGAGAUGGGUGCGAGAGCGUCAGUAUUAAGC-3′,5′端用32P标记,并与不同浓度的专门的双螺旋形成(反义)或折回三螺旋形成寡核苷酸(DNA),在30μl 20mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)—HCl,pH7.5/10mM MgCl2/100mM KCl,0.1mM DTT(二硫苏糖醇),3mM精胺,5%蔗糖(重量/体积),和40单位RNasin(Promega)中,在4℃温浴12小时。取出7μl的等分试样作对照,在剩余试样中加入10μl(0.8单位)E.coli RNA酶H(Promega),然后在室温下温浴。RNA酶H处理开始后的1、10和20分钟取出等分试样。然后将对照和实验等分试样用20%变性PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析。
图9是这些实验所得的放射自显影图。这些结果显示,折回三螺旋的形成并不抑制RNA酶H的核酸内切酶活性,但确实抑制RNA酶H的核酸外切酶活性。这些结果用图解法示于图10,其中,宽箭头指示观察到的RNA酶H核酸外切酶抑制点。细箭头指示RNA酶H的核酸内切酶活性点。当RNA酶H作用于底物时,它首先在接近寡核苷酸5′端双螺旋和单链接合处,在RNA上产生一个核酸内切切口,然后用核酸外切酶活性从核酸内切切口位点降解RNA。在专门的双螺旋形成的对照中(寡核苷酸22),在图9中只见到两条带,一个产生于RNA酶H的核酸内切活性(慢泳动带),一个产生于RNA酶H的核酸外切酶活性(较快泳动带)。由于没有抑制的核酸外切酶活性的作用,观察不到中间的泳动带。相比之下,当使用折回三螺旋形成寡核苷酸时,总存在几个中间泳动带。这些带表示几个位点对RNA酶H核酸外切酶活性的抑制,这是由于三螺旋的形成封闭了大沟所致。实施例3
总的来说,折回三螺旋结构应赋予反义寡核苷酸两个重要的性质。1)折回三螺旋复合物应比双螺旋和常规三螺旋具有更强的稳定性,2)折回三螺旋形成寡核苷酸应比常规反义和反基因(三螺旋)寡核苷酸呈现更强的特异性。
我们设计了几种可形成折回三螺旋的寡核苷酸,以进一步验证上述的两个特性。请参阅图11。我们从HIV-I的gag mRNA区选出了一段16碱基长的纯嘌呤片段作为目标序列,并将其包含于一段30碱基长的序列中(序列编号:23,图1)。预期寡核苷酸序列24和25通过折回三螺旋结构与目标结合,如图11所示。寡核苷酸26仅通过双螺旋的形成与目标结合。伸出的区域不形成三螺旋,因为它是一段非配对序列。该段寡核苷酸充当对照,以验证寡核苷酸24和25是否形成预期的折回三螺旋。寡核苷酸27通过双螺旋的形成与目标结合。寡核苷酸28是一段常规的三螺旋形成序列。热变性研究
在100mM乙酸钠,pH5.0和7.4;98mM乙酸钠和10mM氯化镁,pH5.0和6.5的缓冲液中进行热熔解研究。将0.2 A260单位的每种反义寡核苷酸(序列编号24-28)与等量的目标序列23混合,并在快速真空器中干燥。将干燥的寡核苷酸溶于适当的缓冲液中,加热至95℃,保持10分钟,缓慢冷却至室温,然后置于4℃过夜。每种样品的熔解温度是在连于一个热控制器的Perkin-Elmer Lambda 2分光光度计上测量的。加热速率为0.5℃/分。从一次导数曲线求出的Tm值列于表3。98mM乙酸钠和10mM氯化镁、pH5.0缓冲液中典型的熔解曲线及其一次导数曲线图示于图12。
表3
反义寡核苷酸与目标序列23在不同的盐和pH条件下的Tm值
100mM 98mM 98mM 100mM复合物 NaOAc* NaOAc+ NaOAc+ NaOAc
(pH5.0) MgCl2 MgCl2 (pH7.4)
(pH5.0) (pH6.5)23+27 41.0 51.3 53.4 44.023+27+28 41.1 52.1 53.5 44.123+24 46.7 58.8 42.1;50.5 39.523+25 47.1 59.4 42.6;50.2 39.623+26 36.7 48.2 50.5 38.9*NaOAc为乙酰钠
与23仅形成双链结构的寡核苷酸27,在乙酸钠和氯化镁、pH5.0的缓冲液中的Tm值为51.3℃。在相同条件下,由寡核苷酸23、27和28形成的常规三螺旋显示两个明显的熔解变换,一个在20.5℃,另一个在52.1℃。较低温度变换可归结于第三条链,寡核苷酸28的解离,较高温度变换则代表了寡核苷酸23和24形成的双螺旋的变性。在相同条件下,寡核苷酸24和25各自与23分别呈现出58.8和59.4℃的Tm值。与常规三螺旋的情况一样,没有观察到其它明显的变换(见图12)。作为对照的寡核苷酸26,由于三螺旋形成区不配对,仅形成双螺旋,其Tm值为48.2℃。这表明该伸出的序列促使双螺旋结构一端的解离,从而导致较低Tm值的产生。类似地,在用寡核苷酸24和25时,若寡核苷酸的三螺旋形成区没有结合,与寡核苷酸26的情况一样,将得到较低的Tm值。在pH7.4的缓冲液中(表3),这时胞嘧啶不被质子化,不能形成完整的三螺旋结构,这一情况可清楚地观察到。在这些条件下,由寡核苷酸23与寡核苷酸24、25和26分别形成的复合物具有相近Tm值,该Tm值低于与寡核酸27得到的Tm值。所有这些结果结合起来明确地证实了,在适当的条件下形成了折回三螺旋,并且比常规反义双螺旋和反基因三螺旋结构更加稳定。折回三螺旋的形成促进了所形成的整个复合物的稳定性能。实施例4
DNA酶I水解测试
用实施例3所讨论的同样的寡核苷酸,我们通过两种方法进行了DNA酶I的水解测试。
分光光度计方法:DNA酶I是一种核酶内切酶,它在镁离子的存在下将脱氧核糖核酸水解至单核苷酸水平,没有强的序列选择性。双链DNA是其最适底物,但在某种程度上也水解单链DNA。当DNA被水解成短片段或单体时,260nm处的光吸收将增加。在这一实验中,我们测量了DNA酶I对双链和单链寡核苷酸的水解引起的随着时间的光吸收增加程度。DNA酶I不水解三链DNA结构。
以前节所述的方式制备样品。将每一样品在20℃平衡10分钟,加入4单位DNA酶I,并混匀,将260nm吸收值作为时间的函数记录在Perkin-Elmer Lambda 2分光光度计上。
图13显示随着时间的对单、双和三链结构的水解结果。24和25与23形成的复合物具很强的DNA酶I抗性,表明它们具有不同于单链和双链的结构。然而,寡核苷酸26(不形成三螺旋)和27(仅形成双螺旋)被很快地水解。目标寡核苷酸23是单链结构,也被水解,但其水解速度低于双链。与寡核苷酸23、27和28形成的常规三螺旋对DNA酶I具有抗性。然而,由于常规三螺旋较低的稳定性,观察到随着时间的缓慢水解。
凝胶电泳方法:该方法使用32P 5′末端标记的寡核苷酸23。将目标序列23用T4多核苷酸激酶进行32P 5′末端标记。将等于3000-5000cpm的末端标记的寡核苷酸加进适量的同一种无标记的寡核苷酸中,使其浓度达到0.2 A260单位,与等量的反义寡核苷酸(核酸编号24-28)在100mM乙酸钠,pH5.0、10mM氯化镁缓冲液中混合,加热至95℃,冷却,4℃过夜,如热变性研究一节所述。然后,将每个样品用2单位DNA酶I在20℃处理10分钟,将水解产物在含有7M尿素的变性聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。
显示在DNA酶I存在下,不同复合物水解类型的放射自显影图示于图14。可清楚地看到,单链结构的寡核苷酸23,以及寡核苷酸26和27与23形成的双链结构被完全消化(分别为6、2和1道)。相比之下,与24和25形成的折回三螺旋结构具有很高的抗性(分别为4和5道),常规三螺旋有一定程度的水解(3道)。这些进一步证实了折回三螺旋的形成以及它们的稳定性比常规三螺旋结构高。实施例5
凝胶泳动变化分析
我们用与实施例3所讨论的同样的寡核苷酸,通过凝胶泳动变化分析,进一步检验折回三螺旋的形成。其原理是,在非变性凝胶上,由于分子量的影响,三螺旋结构应比双螺旋结构泳动得慢。使用与实施例4凝胶电泳部分所描述的一样的方法,只是缓冲液中不含有氯化镁,样品不用DNA酶I处理。样品是在20%不含尿素的原本的聚丙烯酰胺凝胶上分析的。一个典型的放射自显影图示于图15。该放射自显影图显示出单独的寡核苷酸23(1道)和存在有寡核苷酸27(2道),27和28(3道),24(4道),25(5道)和26(6道)的情况。寡核苷酸24和25的复合物确实形成了折回三螺旋,它在胶上比单链、双链和常规三螺旋结构运动得都慢。24和25的复合物比26的复合物运动得稍快,虽然整个复合物的分子量和电荷都相同。这是由于与24和25形成的复合物结构具有高度的有序性和致密性。这些进一步支持了折回三螺旋的形成。用RNA作目标序列得到相似的结果。实施例6
折回三螺旋形成寡核苷酸的序列特异性
折回三螺旋寡核苷酸两次解读目标序列,第一次是它与目标序列形成双螺旋时,第二次是它折回到已形成的双螺旋上形成三螺旋。正因为如此,我们预期这些寡核苷酸比常规的反义(与单链目标序列仅形成双螺旋)和反基因(与双链目标序列形成三螺旋)寡核苷酸显示更高的特异性。
为检验折回三螺旋形成寡核苷酸的序列特异性,我们合成了几种类似于目标序列的寡核苷酸,但在几个位点含有错配碱基,与寡核苷酸25和27通过热熔解实验进行研究。与寡核苷酸23(完全匹配的目标序列)相比的、由目标序列中错配碱基引起的Tm值变化(ΔTm)的结果示于表4。在所有情况下,折回三螺旋形成寡核苷酸25的ΔTm大于双螺旋形成寡核苷酸27的ΔTm,表明25比常规的反义寡核苷酸27具有更强的特异性。 表4折回三螺旋的序列特异性
*FbT=折回三螺旋结构+D=双螺旋结构**nd=没有确定
编号 | 目标序列 | Tm(ΔTm)℃FbT- D+ | |
23 | 5′-TAA GGC C-AG GGG GAA AGA AAA AA-T ATA AAT | 59.4 | 51.3 |
29 | 5′-TAA GGC C-AG GGG GAA AGA AAA TA-T ATA AAT | 56.7(-2.7) | 49.2(-2.1) |
30 | 5′-TAA GGC C-AG GGG GAA AGA AAT TA-T ATA AAT | 54.1(-5.3) | nd** |
31 | 5′-TAA GGC C-AG GGG GAA ACT AAA AA-T ATA AAT | 41.2(-18.2) | 36.7(-14.6) |
32 | 5′-TAA GGC C-AG GGG GAA TCT AAA AA-T ATA AAT | 40.1(-19.3) | 35.6(-15.7) |
33 | 5′-TAA GGC C-AG GGG GAT AGT AAA AA-T ATA AAT | 38.4(-21.0) | 34.2(-17.1) |
34 | 5′-TAA GGC C-AC GGG CAA GAA AAA TA-T ATA AAT | nd** | 43.3(-8.0) |
35 | 5′-TAA GGC C-AC GGG GAT AGA AAA AA-T ATA AAT | 413(-18.1) | 37.4(-13.9) |
36 | 5′-TAA GGC C-AG GGG CTT AGA AAA AA-T ATA AAT | 33.0(-26.4) | 30.2(-21.1) |
序列表(1)综合信息:(i)申请人:Kandimalla,Ekambar R
Agrawal,Shuhir(ii)发明题目:折回三螺旋形成寡核苷酸(iii)序列数:22(iv)通信地址:
(A)ADDRESSEE:Allegretti & Witcoff,Ltd
(B)STREET:10 South Wacker Drive
(C)CITY:Boston
(D)STATE:Massachusetts
(E)COUNTRY:U.S.A.
(F)ZIP:02109(v)计算机可读方式:
(A)媒介类型:软盘
(B)计算机:IBM PC兼容
(C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS
(D)软件:Patentin Release#1.0,Version#1.25(vi)目前的申请情况
(A)申请号:
(B)申请日:
(C)分类:(viii)代理人
(A)姓名:Greenfield,Michael S
(B)登记号:37,142
(C)案号:93,000-A(ix)通讯号码:
(A)电话:617/345-9100
(B)传真:617/345-9111(2)序列编号(SEQ ID NO):1:(i)序列特征:
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CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCTCACAC TCTTCCTCTC TCTAC 45(2)序列编号:2:(i)序列特征:
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CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCTTCTTC CTCTCTC TAC 40(2)序列编号:3:(i)序列特征:
(A)长度:30碱基
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CATCTCTCTC CTTCTCACAC TCTTCCTCTC 30(2)序列编号:4:(i)序列特征:
(A)长度:45碱基
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TCGCACCCAT CTCTCTCCTT CTCTCTTCCT CTCTCTACCC ACCCT 45(2)序列编号:5:(i)序列特征:
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TCGCACCATC TCTCTCCTTC TCTCTTCCTC TCTCTACCCA CGC 43(2)序列编号:6:(i)序列特征:
(A)长度:43碱基
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
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TCGCACCCAT CTCTCTCCTT CTCTCTTCCT CTCTCTACCC ACG 43(2)序列编号:7:(i)序列特征:
(A)长度:42碱基
(B)类型:核酸
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TCGCACCCAT CTCTCTCCTT CTCTCTTCCT CTCTCTACCC AC 42(2)序列编号:8:(i)序列特征:
(A)长度:41碱基
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线型(ii)分子类型:DNA(基因组)(iii)是否假定:否(iv)反义:是(xi)序列描述:序列编号:8:
TCGCACCCAT CTCTCTCCTT CTCTCTTCCT CTCTCTACCC A 41(2)序列编号:9:(i)序列特征:
(A)长度:40碱基
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TAAGGCCAGG GGCTTAGAAA AAATATAAAT 30
Claims (6)
1、一种折回三螺旋形成寡核苷酸,包括与目标核酸形成双螺旋的双螺旋形成区,与该双螺旋形成区和该目标核酸形成的双螺旋形成三螺旋的三螺旋形成区,和一个连接该双螺旋形成区和该三螺旋形成区的连接区。
2、根据权利要求1的折回三螺旋形成寡核苷酸,其中,该双螺旋形成区具有大约8至大约50个核苷酸。
3、根据权利要求2的折回三螺旋形成寡核苷酸,其中,该三螺旋形成区是一段具有大约8至大约50个核苷酸的该双螺旋形成区的反向重复序列。
4、根据权要求3的折回三螺旋形成寡核苷酸,其中,该连接区包含一个化学取代基,选自寡核苷酸、取代的或未取代的具有约4个至约20个碳原子的烷基或芳香基和一个化学键。
5、一种折回三螺旋,包括寡核苷酸和目标核酸形成的双螺旋和该双螺旋与该寡核苷酸形成的三螺旋。
6、根据权利要求5的折回三螺旋,其中,该目标核酸是单链RNA。
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