CN1961075A - 调节vegf转录产物稳定性的治疗性分子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于治疗动物，特别是哺乳动物，例如人局部缺血疾病的核酸组合物和方法。具体地说，本发明公开了含有或编码调节血管内皮生长因子基因转录物稳定性的序列的核酸分子，以及用于调节血管生成或血管形成，特别是用于治疗局部缺血疾病方法中含有这种分子的药物组合物。

Description

调节VEGF转录产物稳定性的治疗性分子

                            发明领域

本发明总体上涉及局部缺血疾病或病症，包括心脏、肾脏和脑缺血以及影响四肢和手足的局部缺血疾病领域。更具体地说，本发明涉及用于治疗动物，特别是哺乳动物，例如人的局部缺血疾病的核酸组合物和方法。具体地说，本发明涉及含有或能编码调节血管内皮生长因子基因转录物稳定性的序列的核酸分子，以及用于调节血管生成或血管形成，特别是用于治疗局部缺血疾病方法中的含有这种分子的药物组合物。

本说明书引用的大量出版物和文献的细节见本说明书末尾处。

                            发明背景

血管发育是所有组织生长所必需的，缺乏足够的组织血管形成将导致细胞缺乏氧气和营养。这会刺激细胞产生血管生成因子，该因子的功能是募集新血管长入缺乏(氧气和营养)的组织。涉及新血管形成的最重要血管生成因子是血管内皮生长因子(VEGF)，该因子可受到高度调节，包括单个基因交替剪接所产生的四种同种型(1，2)。所有这四种同种型的特征在于长度异常和富含GC的5’-和3’-UTR(1，2)，该UTR含有参与VEGF表达调节的大多数重要的控制和调节元件(见3，4的综述)。这些元件包括几个内部核糖体进入位点(IRES)(5，6)、缺氧效应元件(HRE)(7)和一些稳定和去稳定序列(8，9)。

VEGF所介导的血管形成在疾病状态中的重要性使它成为有吸引力的基因治疗靶位。目前已研究了下调VEGF来治疗肿瘤和眼新血管形成的几种方法(10-12)。此外，本发明人以前描述了能靶向VEGF基因5’-UTR的有义寡核苷酸(DS-085)，并已证实可在体外和体内有效下调VEGF的转录以及随后的翻译(13)。推测其作用机制是通过双螺旋DNA大沟内的Hoogsteen氢键合此外捕获了聚合酶(14-18)，该寡核苷酸类似于其它基因的调节区域也富含GA嘌呤残基(19，20)。

                            发明概述

本发明依据以下发现：即VEGF基因非翻译区的其它控制元件有助于降低基因表达。如下所述，本发明人发现含有一种或多种这些控制元件的寡核苷酸或表达这些元件的多核苷酸在体外和体内提高了VEGF的表达，增加了体内血管生成，可用于治疗或预防局部缺血疾病。

因此，一方面，本发明提供基本上由如下式所示的至少一种核苷酸序列组成的分离的核酸分子：

A_nWGGGGB_m    (I)，

其中W是A、T或U；

A_n是n个核苷酸构成的序列，其中n是0到约11个核苷酸，序列A_n含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸；和

B_m是m个核苷酸构成的序列，其中m是0到约11个核苷酸，序列B_m含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸。

各A_n和B_m宜含有选自A、T、U、G和C的相同或不同核苷酸或它们的衍生物或类似物。

所述核酸分子优先能提高表达VEGF的宿主细胞表达VEGF。在该类型的一示范性实施方案中，所述核酸分子能提高VEGF基因转录物在表达该转录物的宿主细胞中的稳定性。

在一些实施方案中，所述核酸分子含有式(I)所示核苷酸序列的一个或多个串联重复。在该类型的一示范性例子中，所述核酸分子如下式所示：

[A_nWGGGGBm]_p  (II)

其中A_n、B_m和W如式(I)所定义；和

p是2到约20的整数。

在一些实施方案中，该核苷酸序列选自AGGGG[SEQ ID NO：1]、TGGGG[SEQ ID NO：2]或UGGGG[SEQ ID NO：3]。在一些实施方案中，所述分离的核酸分子基本上由一条或多条选自GGAGGAGGGGGAGGAG[SEQ ID NO：4]或AGGAAGAGGAGAGGGG[SEQ ID NO：5]的序列构成。

在一些实施方案中，所述分离的核酸分子基本上由对应于VEGF转录物的非翻译区或其一部分的核酸序列构成，所述序列长度至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或35到约100、150、200、300、400或500个核苷酸。这种核酸序列的示范性例子见SEQ ID NO：6和7。本发明也考虑了含有与那些序列之一的一部分具有约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约94％、约93％、约92％、约91％或甚至约90％相同的序列区域的核酸分子，只要得到的简并核苷酸序列保留了足够的同源性而使与之操作性相连的转录物去稳定从而能提高表达VEGF的宿主细胞中VEGF的量。

在一些实施方案中，所述核酸分子是含有至少一条式(I)所示序列的寡核苷酸。该寡核苷酸宜含有至少5、6、7、8、9或10到约15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。这种寡核苷酸的示范性例子见SEQID NO：9-36。期望该寡核苷酸耐受核酶。在其它实施方案中，所述核酸分子是含有编码基本上由至少一条式(I)所示核苷酸序列构成的转录物的核苷酸序列的多核苷酸。在还有其它实施方案中，所述核酸分子是含有这种与启动子操作性相连的多核苷酸的构建物。

可将本发明所述的核酸分子制备成各种组合物，也可用合适的药物载体配制后给予人或动物对象以增加VEGF表达。因此，在另一方面，本发明提供含有一种或多种以上广为描述的核酸分子与任选的药学上可接受的佐剂、运载体或稀释剂的药物组合物。在还有另一方面，本发明提供增加VEGF表达的方法，该方法包括将含有至少一种以上式(I)所示核苷酸序列的核酸分子引入表达VEGF的宿主细胞。

本发明所述的核酸分子与含有这些分子的组合物可提高血管生成，因此提供了新的有用治疗或预防方法来治疗、预防、控制或缓解各种可从提高血管生成或血管形成获益的疾病症状。这些疾病宜为局部缺血疾病，其示范性例子包括：脑缺血、肠道缺血、脊髓缺血、心血管缺血、心肌梗塞相关的心肌缺血、充血性心力衰竭(CHF)相关的心肌缺血、年龄相关性黄斑变性(AMD)相关的缺血、肝缺血、肾缺血、真皮缺血、血管收缩诱导的组织缺血、阴茎异常勃起导致的阴茎缺血、血栓栓塞疾病相关的缺血、微血管疾病相关的缺血、和糖尿病、坏疽病、创伤后综合征、心脏停跳复苏(cardiac arrest resuscitation)、外周神经损伤或神经疾病相关的缺血。因此，在另还有一方面，本发明提供增加组织中血管生成或血管形成的方法。这些方法通常包括使可表达VEGF的组织与含有如上定义的式(I)所示至少一种核苷酸序列的核酸分子接触或与含有其量足以提高组织中VEGF的表达或含量的这种核酸分子的药物组合物相接触。在一些实施方案中，所述组织选自：脑组织、肠组织、脊髓组织、心肌组织、眼组织、肝组织、肾组织、皮肤组织、阴茎组织、含有伤口或移植组织的组织。在一相关方面，本发明提供增加某对象中血管生成或血管形成的方法。这些方法一般包括给予该对象含有如上定义的一种或多种式(I)所示各核苷酸序列的核酸分子或含有这种核酸分子的药物组合物来增加血管生成或血管形成。在另一相关方面，本发明提供预防或治疗局部缺血疾病或缓解、预防或治疗患有或处于发生这类疾病或损伤危险之中的对象的局部缺血相关组织损伤的方法，该方法包括给予对象有效量的含有如上定义的一种或多种式(I)所示各核苷酸序列的核酸分子或含有这类核酸分子的药物组合物来治疗局部缺血疾病或减轻组织损伤。

在还有另一相关方面，本发明提供含有如上定义的一种或多种式(I)所示各核苷酸序列的核酸分子在制备增加血管生成或血管形成，或预防或治疗局部缺血疾病，或缓解、预防或治疗局部缺血相关组织损伤的药物中的应用。

提出的本文所定义的控制元件是RNA-去稳定元件，故可通过降低VEGF转录物的稳定性来减少该转录物的表达。因此，本发明人认为本文所定义的控制元件也可用于使异源转录物去稳定，这是(例如)需要具有短半衰期的转录物的应用领域(例如，瞬时报道试验)所需的。因此，本发明的另一方面提供含有编码RNA去稳定元件并操作性连接于异源多核苷酸的序列的核酸构建物，其中所述RNA去稳定元件含有至少一种式(I)所示序列。在一相关的方面，本发明提供降低多核苷酸表达的转录物稳定性的方法。这些方法通常包括使RNA去稳定元件与该多核苷酸操作性连接，所述RNA去稳定元件含有至少一种如上定义的式(I)所示序列。

                            附图简述

图1显示了培养细胞的条件培养液中VEGF蛋白的浓度。S3对VEGF蛋白的表达没有明显的作用，而S1和S2导致了两倍的增加。DS-085则使VEGF蛋白降低至对照的50％以下。

图2a是显示在各种寡核苷酸存在或不存在时从培养细胞中提取VEGFmRNA的RT-PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱的照片。β-肌动蛋白(基因)是一种稳定表达的基因，用于标准化VEGF mRNA的水平。

图2b显示了图2a所示电泳图谱的密度分析。将mRNA水平对β-肌动蛋白的表达水平标准化，以对照样品的百分比表示。

图3是将寡核苷酸注射入眼前房7天后，大鼠眼睛的狭缝灯(slit lamp)照片。S1和S2导致了强烈的新血管应答，而注射S3的眼睛保持正常表型。

图4是利用CFP和FA，显示注射S3的眼睛保持没有新血管形成(分别是f和g)的照片，注射部位澄清可见(a，白色箭头)。注射寡核苷酸S1和S2 7天后导致新血管生成，在CFP下外观呈清晰的红色带状(c，黄色箭头)。接下来的FA显示由于新生血管的渗入导致强荧光(d，黄色箭头)。注射14天后形成视网膜内出血，用CFP显示为黑色斑点(e，红色箭头)，用FA显示为弱荧光(f，红色箭头)。21天后，视网膜内出血进一步发展(g，蓝色箭头)，呈现为大的弱荧光区域(h，蓝色箭头)。

图5a显示几种动物(VEGF基因)的5’-UTR的序列比对。利用同嘌呤(homopurine)区域(带框的)来设计寡核苷酸S1、S2和S3。ATG起始密码子以黑体字表示。

图5b显示了人VEGF基因的5’-UTR和3’-UTR。下划线是去稳定元件的((A/T)GGGG)的位点。

                    表A

                  序列简述

序列ID号	序列	长度
			SEQ ID NO：1	控制元件1	5个核苷酸
SEQ ID NO：2	控制元件2	5个核苷酸

SEQ ID NO：3	控制元件3	5个核苷酸
			SEQ ID NO：4	寡核苷酸S1	16个核苷酸
SEQ ID NO：5	寡核苷酸S2	16个核苷酸
			SEQ ID NO：6	VEGF 5’-UTR	1039个核苷酸
SEQ ID NO：7	VEGF 3’-UTR	1923个核苷酸
			SEQ ID NO：8	寡核苷酸S3	16个核苷酸
SEQ ID NO：9	含有控制元件的寡核苷酸	12个核苷酸
			SEQ ID NO：10	含有控制元件的寡核苷酸	12个核苷酸
SEQ ID NO：11	含有控制元件的寡核苷酸	12个核苷酸
			SEQ ID NO：12	含有控制元件的寡核苷酸	12个核苷酸
SEQ ID NO：13	含有控制元件的寡核苷酸	13个核苷酸
			SEQ ID NO：14	含有控制元件的寡核苷酸	13个核苷酸
SEQ ID NO：15	含有控制元件的寡核苷酸	13个核苷酸
			SEQ ID NO：16	含有控制元件的寡核苷酸	13个核苷酸
SEQ ID NO：17	含有控制元件的寡核苷酸	14个核苷酸
			SEQ ID NO：18	含有控制元件的寡核苷酸	14个核苷酸
SEQ ID NO：19	含有控制元件的寡核苷酸	14个核苷酸
			SEQ ID NO：20	含有控制元件的寡核苷酸	14个核苷酸
SEQ ID NO：21	含有控制元件的寡核苷酸	15个核苷酸
			SEQ ID NO：22	含有控制元件的寡核苷酸	15个核苷酸
SEQ ID NO：23	含有控制元件的寡核苷酸	15个核苷酸
			SEQ ID NO：24	含有控制元件的寡核苷酸	15个核苷酸
SEQ ID NO：25	含有控制元件的寡核苷酸	16个核苷酸
			SEQ ID NO：26	含有控制元件的寡核苷酸	16个核苷酸
SEQ ID NO：27	含有控制元件的寡核苷酸	16个核苷酸
			SEQ ID NO：28	含有控制元件的寡核苷酸	16个核苷酸
SEQ ID NO：29	含有控制元件的寡核苷酸	17个核苷酸
			SEQ ID NO：30	含有控制元件的寡核苷酸	17个核苷酸
SEQ ID NO：31	含有控制元件的寡核苷酸	17个核苷酸
			SEQ ID NO：32	含有控制元件的寡核苷酸	17个核苷酸
SEQ ID NO：33	含有控制元件的寡核苷酸	18个核苷酸
			SEQ ID NO：34	含有控制元件的寡核苷酸	18个核苷酸
SEQ ID NO：35	含有控制元件的寡核苷酸	18个核苷酸
			SEQ ID NO：36	含有控制元件的寡核苷酸	18个核苷酸

                            发明详述

1.定义

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员共同理解的含义。虽然可以采用类似于或等价于本文所述的任何方法和材料来实施或检验本发明，但(本文)所述的方法和材料是优选的。出于本发明的目的，对以下术语定义如下。

本文所用冠词“一”和“一个”表示一个以上(即，至少一个)的该冠词的语法对象。例如，“一个元件”指一个以上的元件。

“5’-UTR”指基因的5’(上游)非翻译区。也用于指编码mRNA的5’-UTR的DNA区域。

“3’-UTR”指多核苷酸蛋白质编码区终止密码子下游的多核苷酸区域，该区域不能翻译产生蛋白质。

“约”指与参比数量、水平、值、量纲、大小或用量相比，数量、水平、值、量纲、大小或用量的变化达30％、优选达20％、更优选达10％、甚至还有优选达9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

短语“基本上由…构成”等指对于获得本发明优点必不可少的组分，而其它组分的存在不会明显改变与本发明概念相关的性质。

“对应于”指以下多核苷酸，(a)具有与参比多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互补的核苷酸序列或(b)编码与某肽或某蛋白质的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多核苷酸。该短语的范围也包括具有与参比肽或蛋白质的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽。

术语“树状聚体”指具有从核心分子散射出的多聚“臂”的支链大分子。

在治疗或预防疾病的段落中，“有效量”指将该用量的活性(物质)以单一剂量或作为一系列剂量的一部分给予需要这种治疗或预防的个体后可有效预防症状发生、防止这类症状和/或治疗现有症状。有效量可依待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的疾病分类、组合物的配方、医学情况的评估和其它相关因素而不同。期望有效量的范围较广可通过常规试验确定。

术语“内源性”指通常见于宿主细胞或宿主生物中的基因或核酸序列或片段。

“表达载体”指能使多核苷酸在细胞内表达的载体。多核苷酸的表达包括转录和/或转录后的翻译。

本文所用的术语“基因”指宿主基因组的任何与全部不连续的编码区，或者只编码功能性RNA(例如，tRNA、rRNA、调节性RNA，如核酶等)的区域以及有关的非编码区和任选的调节区。在某些实施方案中，术语“基因”的范围包括编码特异性多肽的开放读框、内含子和参与表达调节的毗邻5’和3’端的非编码核苷酸序列。关于这点，该基因还可含有控制信号，例如与某给定基因天然相关的启动子、增强子、终止子和/或聚腺苷酸化信号、或异源控制信号。所述基因序列可以是cDNA或基因组DNA或其片段。可将基因引入能在染色体外维持或能整合入宿主的合适载体中。

“局部缺血”指起源于疾病病理或指施加于对象的外科干预的医学状况，次状况中组织的(血液)循环区域受到暂时(例如脑缺血时发生的血管痉挛或短暂性缺血)或永久的(例如脑缺血时的血栓阻塞)阻碍或阻断。由于缺血导致受影响区域缺乏氧气和营养。缺乏(氧气和营养)导致受影响区域损伤或阻塞。本发明包括脑缺血、肠道缺血、脊髓缺血、心血管缺血、CHF相关的缺血、肝缺血、肾缺血、真皮缺血、血管收缩诱导的组织缺血，例如Raynaud疾病，阴茎异常勃起导致的阴茎缺血、血栓栓塞疾病相关的缺血、微血管疾病，例如糖尿病和脉管炎、糖尿病性溃疡、坏疽病、创伤后综合征、心脏停跳复苏、外周神经损伤和神经病，和其它缺血，包括视觉健康，例如年龄相关性黄斑变性(AMD)。在例如中风、心脏停跳、受伤或内出血导致的严重失血和其它破坏正常血流的类似疾病期间大脑发生的缺血。例如，动脉粥样硬化和CHF导致心肌组织缺血。创伤后也可能导致缺血，因为水肿导致的压力使组织中的动脉和静脉变平从而降低了它们将血液携带至组织的能力。大的或微小的栓子也可导致脑缺血，例如心肺搭桥手术(cardiopulmonary bypass surgery)后可发生脑缺血。年龄相关性黄斑变性可能与缺血所致的视网膜氧化损伤有关。

“mRNA”指信使RNA，它是细胞利用DNA作为模板产生的“转录物”，其本身编码蛋白质。mRNA通常包含5′-UTR、蛋白质编码(即，编码)区和3′-UTR。MRNA在细胞中的半衰期有限，这(部分)由特别位于3’-UTR中但也可由位于5’-UTR和蛋白质编码区中的稳定性元件决定。

本文所用的术语“寡核苷酸”指通过磷酸二酯键连接的多个核苷酸单元(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或它们的相关结构性变体或合成的类似物)组成的聚合物。因此，当该术语“寡核苷酸”一般指核苷酸聚合物时，其中所述核苷酸和它们之间的连接键是天然产生的，应该理解该术语的范围也包括各种类似物，包括但不限于：肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核酸等。其分子的确切大小可根据具体应用而不同。寡核苷酸通常较短，一般长约9到35个核苷酸，但该术语可以指任何长度的分子，虽然术语“多核苷酸”或“核酸”一般用于指大寡核苷酸。

术语“操作性连接”、“操作性相连”等在本文中用于指将可转录序列置于启动子的调节控制下，使启动子可控制该序列的转录和任选的翻译。在构建异源启动子/可转录序列组合中，一般需要将遗传序列或启动子置于基因转录起始点的远端，与遗传序列或启动子和天然设置(即，获得该遗传序列或启动子的基因)中所控制基因之间的距离大致相同的位置。如本领域所知的那样，该距离可以有一些变化但不会丧失功能。类似地，可通过将调节序列元件置于其天然设置(即，得到该元件的基因)中的位置而确定异源基因受到其控制的位置。

“药学上可接受的运载体”指可安全用于表面、局部或全身性给药的固体或液体填充剂、稀释剂或包衣物质。

术语“多核苷酸”和“核酸”是同义词，指具有多个核苷酸单体的聚合物。核酸可以是单链或双链，可以是DNA(cDNA或基因组的)、RNA、合成形式和混合的聚合物，也可以是经化学或生物化学方法修饰的或者可含义非天然或衍生的核苷酸碱基。这类修饰包括，例如甲基化、用类似物取代一个或多个天然产生的核苷酸、核苷酸间修饰，例如不带电荷的连接键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、亚磷酰胺(phosphoamidate)、氨基甲酸酯键等)、带电荷的连接键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯键等)、悬垂部分(pendent moiety)(例如，多肽)、嵌入物(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和修饰的连接键(例如，α端基异构核酸等)。也包括模拟它们经氢键和其它化学相互作用能与所设计序列相结合的合成分子。核苷酸单体一般通过磷酸二酯键连接，虽然核酸的合成形式可以含有其它连接键(例如，Nielsen等，同上，Science，254，1497-1500，1991所述的肽核酸)。“核酸”或“多核苷酸”不涉及聚合物的任何具体长度，因此可以是基本上任何长度，通常是约6个核苷酸到约10⁹个以上的核苷酸。就双链聚合物而言，“核酸”或“多核苷酸”可以指任一条链或两条链。

“启动子”指一般位于编码区上游(5’)的DNA区域，该区域至少能部分控制转录的启动和水平。本文提及“启动子”时应以最广泛的范围理解，包括典型基因组基因的转录调节序列，其包括TATA盒与CCAAT盒序列以及在对发育和/或环境刺激的反应中或以组织同源性或细胞类型特异性方式改变基因表达的额外调节元件(即，激活序列、增强子和沉默子)。启动子通常(但不一定)位于其调节表达的结构基因的上游或5’端。此外，含有启动子的调节元件通常位于基因转录起始位点的2kb内。本发明的启动子可以在离起始位点更远的地方含有其它特异性调节元件来进一步提高与其操作性相连的结构基因在细胞中的表达和/或改变结构基因表达的时间或可诱导性。术语“启动子”的范围也包括可诱导的、可抑制的和组成型启动子以及最小启动子。最小启动子通常指能启动与它们操作性相连的所选择DNA序列转录的最小表达控制元件。在一些例子中，最小启动子在没有其它调节元件(例如，增强子或其它顺式作用调节元件)存在时不能启动转录超过基础水平。最小启动子往往由TATA盒或TATA样盒构成。参考文献给出了许多最小启动子序列。例如，可以从各种已知序列中选择最小启动子，包括fos、CMV、SV40和IL-2等的启动子区等。(参考文献)提供了利用最小CMV启动子或最小IL-2基因启动子(距起始位点-72到+45；Siebenlist，1986)的示范性例子。

在本文可互换使用的术语“对象”、“个体”或“患者”指需要治疗或预防的任何对象，特别是脊椎动物对象，更特别指哺乳动物对象。本发明范围内的合适的脊椎动物包括但不限于：灵长类、鸟类、家畜(例如，绵羊、母牛、马、驴、猪)、实验室检验动物(例如，家兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、陪伴动物(例如，猫、狗)和捕获的野生动物(例如，狐狸、鹿、野狗)。优选的对象是需要治疗或预防局部缺血疾病或缺血相关组织损伤的人。然而，应该理解上述术语并不暗示存在症状。

术语“治疗”、“治疗的”等包括治疗性和预防性治疗。

“载体”指能将外来DNA序列插入宿主细胞和/或在支持载体复制的细胞中来扩增DNA序列的运载体。最常用的是质粒，但也可以是噬菌粒、细菌噬菌体、腺病毒或逆转录病毒。

2.缩写

以下缩写用于整个申请中：

nt＝核苷酸

nts＝多个核苷酸

aa＝氨基酸

kb＝千碱基或千碱基对

kDa＝千道尔顿

d＝天

h＝小时

s＝秒

3.提高VEGF表达的核酸分子

本发明至少部分依据以下发现：VEGF的非翻译区含有能减少VEGF表达的如上定义的式(I)所示各新控制元件。不希望受任何具体的理论或操作方式的束缚，本发明提出这些控制元件是通过与转录物去稳定蛋白相结合或相互作用而降低了VEGF转录物的稳定性。与不含有那些元件的对照寡核苷酸相比，发现含有本发明控制元件的寡核苷酸在表达VEGF的宿主细胞中可导致VEGF蛋白含量增加两倍，VEGF mRNA丰度增加约1.25-1.5倍，这支持了此假设。由于合成与降解之间的平衡决定了mRNA的水平，稳定性增加将减少降解并导致平衡在合成不增加的情况下转移为mRNA更高水平。提高mRNA的稳定性因而增加其半衰期将导致每分子mRNA产生的蛋白质量成比例增加。因此，一方面，设计本发明的核酸分子含有一种或多种这样的控制元件(例如)来和内源性VEGF转录物竞争结合mRNA去稳定蛋白，或与VEGF转录物结合而防止mRNA去稳定蛋白与转录物结合，从而增加表达VEGF的宿主细胞或组织中VEGF的含量。VEGF表达的这种增加有许多应用，包括刺激新血管生成和血管生长来治疗局部缺血疾病。这些核酸分子一般选自含有如上定义的至少一种式(I)所示控制元件的寡核苷酸或可表达至少一种这类控制元件的多核苷酸。

在一些实施方案中，本发明的核酸分子含有至少一种选自AGGGG[SEQID NO：1]、TGGGG[SEQ ID NO：2]或UGGGG[SEQ ID NO：3]之一的核苷酸序列。通常，该核苷酸序列长至少5到约1000个核苷酸。在该核酸分子是寡核苷酸的实施方案中，所述寡核苷酸一般含有至少5、6、7、8、9或10到约15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸，通常含有至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。

在一些实施方案中，所述寡核苷酸长度为12个核苷酸，其示范性例子具有以下序列之一：5′-GGCTTGGGGCAG-3′[SEQ ID NO：9]、5′-CTGGGGGCTAGC-3′[SEQID NO：10]、5′-GGCTTGGGGAGA-3′[SEQ ID NO：11]和5′-TGCTTTTGGGGG-3′[SEQ ID NO：12]。

在其它实施方案中，所述寡核苷酸长度为13个核苷酸，其示范性例子具有以下序列之一：5′-GGGCAGGGGCCGG-3′[SEQID NO：13]、5′-GGGTGGAGGGGGT-3′[SEQ ID NO：14]、5′-GGAGGGGGAGGAG-3′[SEQID NO：15]和5′-GAGGAGAGGGGGC-3′[SEQ ID NO：16]。

在还有其它的实施方案中，所述寡核苷酸长度为14个核苷酸，其示范性例子具有以下序列之一：5′-TGGGAGGGGAATGT-3′[SEQ ID NO：17]、5′-GGGCATGGGGGCAA-3′[SEQ ID NO：18]、5′-AGGAGTTTGGGGAG-3′[SEQ ID NO：19]和5′-TGGTGGGGCCAGGG-3′[SEQ ID NO：20]。

在还有其它实施方案中，寡核苷酸的长度为15个核苷酸，其示范性例子具有以下序列之一：5′-TGGGGAGCTTCAGGA-3′[SEQ ID NO：21]、5′-GCTTTGGGGATTCCC-3′[SEQ ID NO：22]、5′-TCGCCCCCAGGGGCA-3′[SEQ ID NO：23]和5′-AATTGTGGGGAAAAG-3′[SEQ ID NO：24]。

在还有其它实施方案中，所述寡核苷酸长度为16个核苷酸，其示范性例子具有下序列之一：5′-CGGAGGCTTGGGGCAG-3′[SEQ ID NO：25]、5′-GCTGGGGGCTAGCACC-3′[SEQ  ID  NO：26]、5′-CGACGGCTTGGGGAGA-3′[SEQ  ID  NO：27]和5′-ACAGGGGCAAAGTGAG-3′[SEQ ID NO：28]。

在还有其它的实施方案中，所述寡核苷酸长度为17个核苷酸，其示范性例子具有以下序列之一：5′-GCTTTTGGGGGTGACCG-3′[SEQ ID NO：29]、5′-AGGCGCGGGCAGGGGCC-3′[SEQ  ID  NO：30]、5′-GGGGTGGAGGGGGTCGG-3′[SEQ  ID  NO：31]和5′-AGGAGGGGGAGGAGGAA-3′[SEQ ID NO：32]。

在还有其它的实施方案中，所述寡核苷酸长度为18个核苷酸，其示范性例子具有以下序列之一：5′-AGAGGGGGCCGCAGTGGC-3′[SEQ ID NO：33]、5′-CTTGAGTTGGGAGGGGAA-3′[SEQ  ID  NO：34]、5′-TTGGTGGGGCCAGGGTCC-3′[SEQ  ID  NO：35]和5′-GCATGGGGGCAAATATGA-3′[SEQ ID NO：36]。

在某些例子中，设计寡核苷酸含有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个适当选自(不限于)AGGGG[SEQID NO：1]、TGGGG[SEQ ID NO：2]或UGGGG[SEQ ID NO：3]之一的式(I)所示控制元件。

本发明也考虑了这些寡核苷酸的衍生物，例如它们的盐，特别是它们的生理上可耐受的盐。盐和生理上可耐受的盐描述于，例如《雷明顿药物科学》(Remingtons Pharmaceuticals Science)，(1985)，Mack Publishing Company，Easton，Pa，(第1418页)。衍生物也与具有一个或多个修饰(例如，在具体的核苷位置和/或在具体的核苷间连接键(internucleoside bridge))的经修饰寡核苷酸、寡核苷酸类似物(例如，聚酰胺-核酸(PNA)、膦酸单酯核酸(PHONAs＝PMENAs))、寡核苷酸嵌合体(例如，由DNA-和PNA-部分构成或由DNA-和PHONA-部分构成))有关。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸以改善其性能，例如增加其对核酶的耐受性或使其能抵抗核酶从而改善其结合mRNA去稳定蛋白的亲和力，或增加其细胞摄入。

因此，与“天然”核酸相比，本发明优先含有上述具体序列和其它一种或多种化学修饰的寡核苷酸。例如，由“天然的”核苷，脱氧腺苷(腺嘌呤+β-D-2′脱氧核糖)、脱氧鸟苷(鸟嘌呤+β-D-2′-脱氧核糖)、脱氧胞苷(胞嘧啶+β-D-2′-脱氧核糖)和胸苷(胸腺嘧啶+β-D-2′-脱氧核糖)构成的DNA经磷酸二酯核苷间连接键相连。寡核苷酸可以含有一种或多种相同类型和/或不同类型的修饰；每种修饰类型可独立选自已知的用于修饰寡核苷酸的修饰类型。例如，与天然DNA的磷酸二酯核苷间连接键相比，可分别修饰或取代β-D-2’-脱氧核糖单元和/或天然的核苷碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶)。与天然DNA构成的相同序列的寡核苷酸相比，本发明的寡核苷酸可以具有一种或多种修饰，其中每种修饰位于特定的磷酸二酯核苷间连接键和/或位于特定的β-D-2’-脱氧核糖单元和/或位于特定的天然核苷碱基位置。

用于本发明的寡核苷酸的具体例子包括含有修饰的骨架或非天然核苷间连接键的寡核苷酸。具有修饰的骨架的寡核苷酸包括保留了骨架中的磷原子或未保留磷原子的寡核苷酸。出于本说明书的目的以及如本领域有时所提及的那样，在其核苷间骨架中不含磷原子的修饰的寡核苷酸也可认为是寡核苷酸。

化学修饰的例子为技术人员已知并描述于，例如E.Uhlmann和A.Peyman，Chemical Reviews，90，(1990)，543和“寡核苷酸和类似物方案”(Protocols forOligonucleotides and Analogs)，《合成与特性以及合成与分析技术》(Synthesisand Properties & Synthesis and Analytical Techniques)，S.Agrawal编，HumanaPress，Totowa，USA，1993和S.T.Crooke，F.Bennet，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，36，(1996)，107-129；J.Hunziker和C.Leuman，(1995)，Mod.Synt.Methods，7，331-417。

指导制备含磷连接键的代表性文献包括但不限于：美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050。

不含磷原子的修饰寡核苷酸骨架的示范性例子是通过短链烷基或环烷基核苷间连接键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接键、或一种或多种短链杂原子或杂环核苷间连接键所形成的骨架。这些骨架包括具有吗啉基连接键(部分由核苷的糖部分形成)的骨架，硅氧烷骨架，硫化物、亚砜和砜骨架，甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)骨架，亚甲基甲酰基(methyleneformacetyl)和硫代甲酰基骨架，核乙酰基(riboacetyl)骨架，含有烯烃的骨架，氨基磺酸酯骨架，亚甲基亚氨基(methyleneimino)和亚甲基肼基(methylenehydrazino)骨架，磺酸酯和磺酰胺骨架，酰胺骨架，和其它混杂N、O、S和CH2组分的骨架。指导制备这些寡核苷酸的代表性文献包括但不限于：美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439。

在其它实施方案中，核苷酸单元的糖和核苷间连接键，即骨架被新的基团取代。保留碱基单元与和合适的靶核酸化合物杂交。一类这样的寡聚化合物，即已显示具有良好杂交性能的寡核苷酸模拟物称为“肽”或“聚酰胺”核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖-骨架被含有酰胺的骨架，特别是氨基乙基甘氨酸骨架取代。保留核碱基(nucleobase)并与该骨架酰胺部分的氮杂氮原子直接或间接相连。指导制备PNA化合物的代表性文献包括但不限于：美国专利号5,539,082；5,714,331和5,719,262。PNA化合物的其它指导可以见Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500。

在某些实施方案中，所述寡核苷酸可以含有一种或多种修饰，其中每种修饰独立选自：a)用修饰的核苷间连接键取代位于核苷3’-和/或5’-端的磷酸二酯核苷间连接键；b)用脱磷酸连接键(dephospho bridge)取代位于核苷3’-和/或5’-端的磷酸二酯连接键；c)用另一单元取代磷酸糖骨架的磷酸糖单元；d)用修饰的糖单元取代R-D-2′-脱氧核糖单元；e)用修饰的核苷碱基取代天然核苷碱基；f)能与影响该寡核苷酸性能的分子偶联；g)任选经合适的接头与2′5′-连接的寡腺苷酸或其衍生物偶联；和h)在该寡核苷酸3’和/或5’端引入3′-3′和/或5′-5′倒置。

寡核苷酸化学修饰的更详细例子是：

a)用修饰的核苷间连接键取代位于核苷3’-和/或5’-端的磷酸二酯核苷间连接键，其中所述修饰的核苷间连接键选自，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR¹R¹′-氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、磷酸-(C₁-C₂₁)--O-烷基酯、磷酸-[(C₆-C₁₂)芳基-((G₁-C₂₁-)-O-烷基)酯、(C₁-C₈)烷基-膦酸酯和/或(C₆-C₁₂)-芳基膦酸酯键、(C₇-C₁₂)-.α.-羟甲基-芳基(例如，WO 95/01363所公开的)，其中(C₆-C₁₂)芳基、(C₆-C₂₀)芳基和(C₆-C₂₄)芳基任选用卤素、烷基、烷氧基、硝基、氰基取代，R¹和R¹′独立为氢、(C₁-C₁₈)-烷基、(C₆-C₂₀)-芳基、(C₆-C₁₄)-芳基-(C₁-C₈)-烷基、合适的氢、(C₁-C₈)-烷基、优选(C₁-C₄)-烷基和/或甲氧基乙基，或

R¹R¹′与携带它们的氮原子一起形成还可含有其它选自O、S和N杂原子的5-6-元杂环；

b)用脱磷酸连接键(脱磷酸连接键描述于，例如Uhlmann，E.和Peyman，A.，《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)，第20卷，“寡核苷酸和类似物的方案”(Protocols for Oligonucleotides and Analogs)，S.Agrawal编，Humana Press，Totowa 1993，第16章，355ff)取代位于核苷3’-和/或5’-端的磷酸二酯连接键，其中脱磷酸连接键选自，例如脱磷酸连接键甲酰基(dephosphobridges formacetal)、3’-硫代甲酰基(3′-thioformacetal)、甲基羟胺(基)、肟(基)、亚甲基二甲基-亚肼基、二亚甲基砜和/或甲硅烷基；

c)用另一单元取代磷酸糖骨架(磷酸糖骨架由多个磷酸糖单元构成)的磷酸糖单元(β-D-2′-脱氧核糖和和磷酸二酯核苷间连接键一起形成磷酸糖单元)，所述另一单元选自：

(i)“吗啉基-衍生”的共聚物(例如E.P.Stirchak等，Nucleic Acids Res.，17，(1989)，6129所述)，即例如用吗啉基-衍生物单元取代；

(ii)聚酰胺核酸(“PNA”)(例如P.E.Nielsen等，Bioconj.Chem.，5，(1994)，3和EP 0672677 A2所述)，即例如用PNA骨架单元(如2-氨基乙基甘氨酸)取代；

(iii)膦酸单酯核酸(“PHONA”)(例如Peyman等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，35，(1996)，2632-2638和EP0739898 A2所述)，即例如用PHONA骨架单元取代；

d)用修饰的糖单元取代β-D-2′-脱氧核糖单元，所述修饰的糖单元选自，例如β-D-核糖、α-D-2′-脱氧核糖、L-2′-脱氧核糖、2′-F-2′-脱氧核糖、2′-O-(C₁-C₆)烷基-核糖(合适的2′-O-(C₁-C₆)烷基-核糖是2′-O-甲基核糖、2′-O-(C₂-C₆)烯基-核糖、2′-[O-(C₁-C₆)烷基-O-(-C₁-C₆)烷基]-核糖)、2′-NH₂-2′-脱氧核糖、β-D-木-呋喃糖(β-D-xylo-furanose)、α-阿拉伯呋喃糖、2，4-二脱氧-β-D-赤型-六-吡喃糖(2，4-dideoxy-β-D-ery-thro-hexo-pyranose)和碳环(例如Froehler，J.Am.Chem.Soc.，114，(1992)，8320所述)和/或开链的糖类似物(例如，Vandendriessche等，Tetrahedron，49，(1993)，7223所述)和/或双环糖类似物(例如M.Tarkov等，Helv.Chim.Acta，76，(1993)，481所述)；

e)用修饰的核苷碱基取代天然核苷碱基，所述修饰的核苷碱基选自，例如尿嘧啶、次黄嘌呤、5-(羟甲基)尿嘧啶、N²-二甲基鸟苷、假尿嘧啶(pseudouracil)、5-(羟甲基)尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、2，4-二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7-脱氮嘌呤、优选7-脱氮-7-取代的和/或7-脱氮-8-取代的嘌呤或天然核苷碱基的其它修饰(例如EP 0 710 667 A2和EP 0 680 969A2所述的修饰的核苷碱基)；

f)与能影响寡核苷酸性能的分子偶联，所述寡核苷酸与一种或多种能(有利地)影响该寡核苷酸性能(例如，该寡核苷酸穿过细胞膜或进入细胞的能力，抵御核酶的稳定性，对n mRNA去稳定蛋白的亲和力或该寡核苷酸的药代动力学性能)的分子偶联，可能与寡核苷酸偶联的分子的例子是聚赖氨酸、嵌入试剂(例如，芘、吖啶、吩嗪或菲啶)、荧光试剂(例如，荧光素)、交联剂(例如，补骨脂素或叠氮硫酸原黄素(azidoproflavin)等)、亲脂分子(例如(C₁₂-C₂₀)-烷基)、脂质(例如(1，2-双十六烷基-外消旋-甘油))、类固醇(例如胆固醇或睾酮)、维生素(例如维生素E)、经磷酸基团与该寡核苷酸合适连接的聚-或寡乙二醇(例如，三甘醇磷酸酯、六甘醇磷酸酯)、(C12-C18)-烷基磷酸二酯和/或O-CH₂-CH(OH)-O-(C₁₂-C₁₈)-烷基，这些分子可以在序列的5′端和/或3′端和/或在序列内偶联，例如与核苷碱基偶联而产生寡核苷酸偶联物；制备寡核苷酸偶联物的方法为本领域技术人员所知，其描述于，例如Uhlmann，E.和Peyman，A.，Chem.Rev.，90，(1990)，543；M.Manoharan在《反义研究和应用》(AntisenseResearch and Applications)所述，Crooke和Lebleu编，CRC Press，Boca Raton，1993，第17章，第303 ff页和EP-A 0 552 766；

g)通过合适的接头分子与2′5′-连接的寡腺苷酸偶联，所述2′5′-连接的寡腺苷酸选自，例如2′5′-连接的三腺苷酸、2′5′-连接的四腺苷酸、2′5′-连接的五腺苷酸、2′5′-连接的六腺苷酸或2′5′-连接的七腺苷酸分子及它们的衍生物，所述2′5′-连接的寡腺苷酸衍生物例如是蛹虫草菌素(2′5′-连接的3′-脱氧腺苷酸)，合适接头的例子是三甘醇，所述2′5′-连接的寡腺苷酸的5′-端必需携带磷酸、二磷酸或三磷酸残基，其中一个或多个氧原子可用诸如硫原子取代，宜用磷酸酯或硫代磷酸酯残基取代；和

h)在该寡核苷酸3’和/或5’端引入3′-3′和/或5′-5′倒置，本领域技术人员已知该类型的化学修饰，其描述见，例如M.Koga等，J.Org.Chem.，56，(1991)，3757；EP 0 464 638和EP 0 593 901。

用另一单元(例如PNA骨架单元或PHONA骨架单元)取代磷酸糖骨架的磷酸糖单元，宜用例如已含有天然核苷碱基和/或选自以下修饰的核苷碱基之一的PNA单元或PHONA单元取代核苷酸：尿嘧啶、次黄嘌呤、5-(羟甲基)尿嘧啶、N²-二甲基鸟苷、假尿嘧啶(pseudouracil)、5-(羟甲基)尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、2，4-二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7-脱氮嘌呤、优选7-脱氮-7-取代的和/或7-脱氮-8-取代的嘌呤或天然核苷碱基的其它修饰(例如，EP 0 710667 A2和EP 0 680 969 A2所述的修饰的核苷碱基)。

在某些实施例中，可修饰该寡核苷酸序列中的一个或多个磷酸二酯核苷间连接键，一个或多个磷酸二酯核苷间连接键宜用硫代磷酸酯核苷间连接键和/或(C₆-C₁₂)膦酸芳酯核苷间连接键取代，(例如)合适地用α-羟基苄基膦酸酯连接键(优选用例如硝基、甲基、卤素取代其中的苄基)取代。

在其它实施例中，磷酸糖骨架的一个或多个磷酸糖单元用PNA骨架单元取代，宜用2-氨基乙基甘氨酸单元合适地取代。理想的是，被取代的磷酸糖单元至少在一定程度上连接在一起。如果需要，该寡核苷酸中所有的磷酸糖单元并非均被取代。在该类型的示范性例子中，该寡核苷酸是嵌合的，由一个或多个PNA部分或一个或多个DNA部分组成。就这种嵌合寡核苷酸而言，例如可能有以下修饰模式的非限制性例子：DNA-PNA、PNA-DNA、DNA-PNA-DNA、PNA-DNA-PNA、DNA-PNA-DNA-PNA、PNA-DNA-PNA-DNA。对由DNA部分和PHONA部分组成的嵌合分子而言，可有与之相当的模式，例如DNA-PHONA、PHONA-DNA、DNA-PHONA-DNA、PHONA-DNA-PHONA、DNA-PHONA-DNA-PHONA、PHONA-DNA-PHONA-DNA。此外，当然可能有包含三种不同部分，例如DNA部分、PHONA部分和PNA部分的嵌合分子。此外，本发明优选涉及包含至少一种其它类型的修饰的寡核苷酸。

部分修饰的寡核苷酸的原理描述于，例如A.Peyman，E.Uhlmann，Biol.Chem.Hoppe-Seyler，377(1996)67-70和EP 0 653 439中。在这种情况中，要保护5’端和/或3’端的1-5个末端核苷单元，例如位于相应核苷3’和/或5’端的磷酸二酯核苷间连接键用例如硫代磷酸酯核苷间连接键取代。此外，通常修饰至少一个内部嘧啶核苷(或各自的核苷酸)位置，嘧啶核苷的3’和/或5’核苷间连接键宜用例如硫代磷酸酯核苷间连接键修饰取代。部分修饰的寡核苷酸显示出特别有利的性能，例如它们显示出与最小修饰相关的特别高的核酶稳定性。部分修饰的寡核苷酸也显示高于所有硫代磷酸酯的结合亲和力。

作为上述寡核苷酸的另一种选择，本发明也考虑采用含有多核苷酸的核酸构建物，所述多核苷酸通过细胞机制转录产生的转录物含有至少一条以上定义的式(I)所示核苷酸序列。在一些实施方案中，该核苷酸序列含有对应于VEGF转录物非翻译区(UTR)或其一部分的核酸序列，其含有至少一条以上定义的式(I)所示的核苷酸序列。VEGF UTR的该部分含有至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或35个至约100、150、200、300、400或500个连续的核苷酸，或几乎多达例如SEQ ID NO：6和7分别所示的VEGF基因的全长5’-UTR和3’UTR。

本发明也考虑含有与VEGF UTR之一的一部分有约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、76％、75％、74％、73％、72％、71％或甚至70％相同的序列区域的核酸分子，只要得到的简并核苷酸序列保留了足够的同源性使与之操作性相连的转录物不稳定从而能提高表达VEGF的宿主细胞中VEGF的含量。所述简并核苷酸序列一般包含至少一个本文定义的式(I)所示控制元件。因此，本发明也包扩至少在低严谨条件下，优选至少在中等严谨条件下，最优选在高严谨条件下能与VEGF 5’-UTR或3’UTR的至少一部分杂交的核苷酸序列的互补序列。

本文使用的术语“在低严谨、中等严谨、高严谨或非常高严谨的条件下杂交”是说杂交和洗涤条件。进行杂交反应的指南见Ausubel等，(1998，同上)，第6.3.1-6.3.6部分。该参考文献描述了可采用的水性和非水性方法。本文提及的低严谨条件包括在42℃杂交时采用的至少约1％v/v到至少约15％v/v的甲酰胺和至少约1M到至少约2M的盐，和在42℃洗涤时采用的至少约1M到至少约2M的盐。低严谨条件也可包括在65℃杂交时采用的1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO₄(pH 7.2)、7％SDS，和在室温洗涤时采用的(i)2×SSC，0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA，1mM EDTA，40mM NaHPO₄(pH7.2)，5％SDS。低严谨条件的一个实施方案包括约45℃在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后50℃(低严谨条件的洗涤温度可以提高到55℃)用0.2×SSC、0.1×SSC洗涤。中等严谨条件包括在42℃杂交使采用至少约16％v/v到至少约30％v/v的甲酰胺和至少约0.5M到至少约0.9M的盐，和在55℃洗涤使采用的至少约0.1M到至少约0.2M的盐。中等严谨条件也可包括在65℃杂交时采用的1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO₄(pH 7.2)、7％SDS，和在60-65℃洗涤时采用的(i)2×SSC，0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA，1mM EDTA，40mM NaHPO₄(pH 7.2)，5％SDS。中等严谨条件的一个实施方案包括约45℃在6×SSC中杂交，然后在60℃用0.2×SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。高严谨条件包括在42℃杂交时采用的至少约31％v/v到至少约50％v/v的甲酰胺和约0.01M到约0.05M的盐，和在55℃洗涤时采用的至少约0.01M到至少约0.02M的盐。高严谨条件也可包括在65℃杂交时采用的1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO₄(pH 7.2)、7％SDS，和在超过65℃洗涤时采用的(i)0.2×SSC，0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA，1mM EDTA，40mMNaHPO₄(pH 7.2)，1％SDS。高严谨条件的一个实施方案包括约45℃在6×SSC中杂交，然后在65℃用0.2×SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。

在某些实施方案中，本发明分离的核酸分子在非常高的严谨条件下杂交。非常高的严谨条件的一个实施方案包括65℃在0.5M磷酸盐、7％SDS中杂交，65℃用0.2×SSC、1％SDS洗涤一次或多次。

其它严谨条件为本领域所熟知，技术人员知道可操纵各种因素来优化杂交的特异性。优化最终洗涤的严谨性可确保杂交程度高。详细的例子见Ausubel等，同上，第2.10.1到2.10.16页和Sambrook等，(1989，同上)，第1.101到1.104部分。

虽然严谨洗涤在约42℃到68℃温度下进行，但本领域技术人员应理解其它温度亦适合于严谨条件。最大杂交速率通常发生在形成DNA-DNA杂合体的T_m以下约20℃到25℃时。本领域熟知T_m是解链温度，或是两条互补多核苷酸序列解离的温度。估计T_m的方法是本领域熟知的(参见Ausubel等，同上，第2.10.8页)。通常，可通过下式预测完美匹配的DNA双螺旋的T_m近似值：

T_m＝81.5+16.6(log₁₀M)+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-(600/长度)

其中：M是Na⁺的浓度，优选0.01摩尔到0.4摩尔；％G+C是鸟嘌呤和胞嘧啶碱基之和占总碱基的百分比，其范围在30％和75％G+C之间；％甲酰胺是以体积计的甲酰胺浓度百分比；长度是DNA双螺旋中碱基对的数目。随机错配碱基对的数目每增加1％，DNA双螺旋的T_m降低约1℃。高严谨性洗涤通常在T_m-15℃进行，或者中等严谨性洗涤在T_m-30℃下进行。

在杂交方法的一个例子中，含有固定化DNA的膜(例如，硝酸纤维素膜或尼龙膜)于42℃在含有标记探针的杂交缓冲液(50％去离子甲酰胺，5×SSC，5×Denhardt溶液(0.1％水溶性聚蔗糖(ficoll)，0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％牛血清白蛋白)，0.1％SDS和200mg/mL变性的鲑鱼精子DNA)中杂交过夜。然后以中等严谨性条件连续洗涤该膜两次(即，2×SSC、0.1％SDS，15分钟，45℃；然后是2×SSC、0.1％SDS，15分钟，50℃)，再在高严谨性条件下连续洗涤两次(即，0.2×SSC、0.1％SDS，12分钟，55℃，然后是0.2×SSC和0.1％SDS溶液，12分钟，65-68℃)。

与对照细胞或对照组织相比，本发明核酸分子增加了VEGF蛋白质表达约55％、65％、75％、85％、90％、95％、100％或更高，例如当用浓度通常约0.1、0.2、0.3、0.4或0.5μM到约10、20、30、40或50μM，通常浓度约1μM以下的本发明核酸分子处理细胞后，所分泌VEGF的量增加了约55％、65％、75％、85％、90％、95％、100％或更高。本发明核酸分子宜能有效增加动物细胞表达VEGF(同种型)在和/或能刺激脊椎动物新血管生成或血管生长。

在某些实施方案中，本发明核酸分子形式是核酸构建物(例如，表达载体，例如但不限于病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒或腺伴随病毒或慢病毒载体)。在一些实施方案中，这种构建物具有的启动子与含有至少一条如上定义的式(I)所示核苷酸序列转录物的编码多核苷酸操作性相连。该启动子可以是可诱导的或组成型启动子，和任选组织特异性启动子。该启动子可以是，例如病毒或哺乳动物来源。在一些实施方案中，在所用的核酸构建物中启动子-多核苷酸盒(与任何其它所需的序列)的侧翼是能促进在对象基因组中所需位点发生同源重组的区域，从而可提供该多核苷酸的染色体内表达。参见，例如Koller和Smithies，1989，Proc Natl Acad Sci USA 86：8932-8935。在其它实施方案中，所递送的核酸构建物保持为游离形式(episomal)并能诱导内源性和其它沉默基因(表达)。

在一个示范性实施方案中，逆转录病毒可为基因递送系统提供方便而有效的平台。可利用本领域已知的技术将可表达本发明至少一种控制元件的核苷酸序列插入载体中和包装入逆转录病毒颗粒中。然后分离重组病毒并递送入对象。几种示范性逆转录病毒系统已有描述，其例子包括：美国专利号5,219,740；Miller和Rosman，1989，Bio Techniques 7：980-990；Miller，A.D.，1990，HumanGene Therapy 1：5-14；Scarpa等，1991，Virology 180：849-852；Burns等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8033-8037；Boris-Lawrie和Temin，1993，Cur.Opin.Genet.Develop.3：102-109)。

此外，几种示范性腺病毒系统也已有描述。与逆转录病毒整合入宿主基因组不同，腺病毒维持在染色体外，因而最大程度降低了插入诱变相关的风险(参见，例如Haj-Ahmad和Graham，1986，J.Virol.57：267-274；Bett等，1993，J.Virol.67：5911-5921；Mittereder等，1994，Human Gene Therapy 5：717-729；Seth等，1994，J.Virol.68：933-940；Barr等，1994，Gene Therapy 1：51-58；Berkner，K.L.，1988，Bio Techniques 6：616-629；和Rich等，1993，Human GeneTherapy 4：461-476)。

也已开发了递送多核苷酸的各种腺伴随病毒(AAV)载体系统。用本领域熟知的技术不难构建AAV载体。参见，例如美国专利号5,173,414和5,139,941；国际公布号WO 92/01070和WO 93/03769；Lebkowski等，1988，Molec.Cell.Biol.8：3988-3996；Vincent等，1990，Vaccines90，冷泉港实验室出版社；Carter，B.J.，1992，Current Opinion in Biotechnology 3：533-539；Muzyczka，N.，1992，Current Topics in Microbiol.and Immunol.158：97-129；Kotin，R.M.，1994，Human Gene Therapy 5：793-801；Shelling和Smith，1994，Gene Therapy 1：165-169；和Zhou等，1994，J.Exp.Med.179：1867-1875。

或者，禽痘病毒，例如鸡痘病毒和金丝雀痘病毒也可用于递送感兴趣的编码序列。禽痘病毒用于人和其它种类哺乳动物时特别理想，因为禽痘病毒属的成员只在易感的禽类中产毒性复制，因此在哺乳动物细胞中无感染性。产生重组禽痘病毒的方法是本领域熟知的，其利用了上述产生牛痘病毒有关的遗传重组技术。参见，例如WO 91/12882、WO 89/03429和WO 92/03545。

许多甲病毒载体之一也可用于递送本发明的多核苷酸组合物，例如描述于美国专利号5,843,723；6,015,686；6,008,035和6,015,694的那些载体。也可用基于委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)的某些载体，其示范性例子见美国专利号5,505,947和5,643,576。

此外，分子偶联载体，例如Michael等，J.Biol.Chem.268：6866-69，1993；和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6099-6103，1992所述的腺病毒嵌合载体也可用于本发明的基因递送。

在其它示范性实施方案中，利用慢病毒载体将表达控制元件的多核苷酸递送给所选择的细胞或组织。这些载体一般含有5’慢病毒LTR、tRNA结合位点、包装信号、与一个或多个感兴趣基因操作性相连的启动子、第二链DNA合成起点和3’慢病毒LTR，该慢病毒载体含有核转运元件。核转运元件可位于感兴趣的编码序列的上游(5’)或下游(3’)(例如，本发明的合成Gag或Env表达盒)。在本发明范围内，可利用各种慢病毒，包括选自HIV、HIV-1、HIV-2、FIV、BIV、EIAV、MVV、CAEV和SIV的慢病毒。慢病毒载体的示范性例子描述于PCT公布号WO 00/66759、WO 00/00600、WO 99/24465、WO 98/51810、WO 99/51754、WO 99/31251、WO 99/30742和WO 99/15641。理想的是利用第三代SIN慢病毒。第三代SIN(自我灭活的)慢病毒的供应商包括Invitrogen(ViraPower慢病毒表达系统)。构建、转染、收集和利用慢病毒载体的详细方法见，例如《Invitrogen技术手册》(Invitrogen technical manual)，“ViraPower慢病毒表达系统B 050102 25-0501版”(ViraPower Lentiviral Expression Systemversion B 050102 25-0501)，可利用http：//www.invitrogen.com/Content/Tech-Online/molecular_biology/manuals_p-ps/virapower_lentiviral_system_man.pdf。慢病毒载体是一种有效的基因递送方法。生物安全特性的改善使这些载体适用于生物安全水平2(BL2)。在第三代SIN(自我灭活的)载体中掺入了许多安全特性。删除病毒3’LTR U3区得到了不能转录全长病毒RNA的前病毒。此外，许多必需基因以反式提供，得到了只能进行一轮感染和整合的病毒原种(stock)。慢病毒载体具有几种优点，包括：1)利用兼嗜性被膜蛋白伪装载体使得它们能病毒性感染任何类型细胞；2)经证明可将基因递送至静息的、有丝分裂后的分化细胞，包括神经元；3)它们的低细胞毒性在转基因递送系统中独一无二；4)病毒整合入基因组使得转基因可长期表达；5)它们的包装能力(6-14kb)远大于其它逆转录病毒或腺伴随病毒载体。近期证明了该系统的能力，可用表达GFP的慢病毒载体来感染小鼠干细胞，得到存活后代、报导基因的种系转移和启动子与组织特异性表达(Ailles，L.E.和Naldini，L.，“HIV-1衍生的慢病毒载体”(HIV-1-Derived Lentiviral Vectors)，刊于Trono，D.编，《慢病毒载体》(Lentiviral Vectors)，Springer-Verlag，Berlin，Heidelberg，New York，2002，第31-52页)。最近一代载体的例子概述于Lois等(Lois，C.，Hong，E.J.，Pease，S.，Brown，E.J.和Baltimore，D.，“慢病毒载体递送的转基因的种系转移和组织特异性表达”(Germline transmission andtissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors)，Science，295(2002)868-872)综述的图2中。

在某些实施方案中，可将多核苷酸整合入靶细胞的基因组中。此种整合可经同源重组位于特定的位置和取向(基因取代)，或者可整合入随机的非特定位置(基因增效)中。在还有其它实施方案中，多核苷酸可作为分离的、游离的DNA区段稳定维持在细胞中。这种多核苷酸区段或“游离体”编码的序列足以不依赖宿主细胞周期而维持和复制或与之同步进行。表达构建物递送入细胞的方式和细胞中多核苷酸维持的方式取决于所用的表达构建物的类型。

4.递送方法

可以直接(即，患者直接与核酸或含核酸的载体接触)或间接(即，先在体外使细胞与核酸接触，然后植入患者)地将所述核酸分子递送给患者。这两种分别作为体内或离体基因治疗的方法是已知的。在本发明的具体实施方案中，直接体内给予核酸，使核酸在体内表达产生所编码的产物。可通过本领域已知的许多方法来实现此目的，包括但不限于：如上所述将所述核酸构建为合适的核酸表达载体的一部分，并以胞内方式给予该载体(例如，利用缺陷型或减毒逆转录病毒或其它病毒载体感染；参见美国专利号4,980,286)；直接注射裸DNA；利用微粒轰击(例如，“Gene Gun”；Biolistic，DuPont)；用脂质包被该核酸；利用相关的细胞表面受体/转染试剂；包裹入脂质体、微粒或微胶囊；以已知能进入细胞核的树状聚体形式或与肽相连给予；或与易通过受体介导而内吞的配体相连给予(参见，例如Wu和Wu，1987，J Biol Chem，262：4429-4432)，所述配体可用于“靶向”特异性表达感兴趣受体的细胞类型，等等。

实施本发明基因治疗的其它方法涉及通过例如电穿孔、脂质转染、磷酸钙介导的转染、病毒感染等方法将基因转移入体外组织培养的细胞。转移方法一般包括同时将可选择标记转移入细胞。然后，将细胞置于选择压力下(例如，抗生素耐受)从而有助于分离摄取和表达所转移基因的那些细胞。然后将那些细胞递送入患者。在具体的实施方案中，先用本领域已知的任何方法将所述核酸引入细胞，再体内给予所产生的该重组细胞，所述方法包括但不限于：转染、电穿孔、显微注射、用含有感兴趣核酸序列的病毒或细菌噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微小细胞介导的基因转移、原生质体融合、和能确保受体细胞发育和生理功能不受此转移干扰的类似方法。参见，例如Loeffler和Behr，1993，Meth Enzymol，217：599-618。所选择的技术应能稳定地将该核酸转移入细胞，从而细胞表达该核酸。理想的是转移的核酸可遗传由细胞后代表达。在其它实施方案中，所转移的核酸保持为游离体并诱导其它内源性沉默核酸表达。在其它实施方案中，可用本领域已知的各种方法将产生的重组细胞递送至患者，这些方法包括但不限于：表皮细胞注射(例如，皮下)、将重组皮肤细胞作为皮肤移植物应用于患者、静脉内注射重组血细胞(例如，造血干细胞或组细胞)或肝细胞。预计所用细胞的总量取决于所需的效果、患者状态等，本领域技术人员可确定这些因素。

为基因治疗目的而引入核酸的细胞包括任何需要的可用的细胞类型，可以是异种、异质、同系或自体(autogeneic)细胞。细胞类型包括但不限于：分化细胞，例如上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞和血细胞，或者各种干细胞或组细胞，特别是胚胎心肌细胞、肝脏干细胞(国际专利公布号WO 94/08598)、神经干细胞(Stemple和Anderson，1992，Cell 71：973-985)、造血干细胞或组细胞，例如得自骨髓、脐带血、外周血、胎儿肝脏等的细胞。在一优选的实施方案中，基因治疗所用的细胞是患者自体的。在某些实施方案中，本发明考虑利用脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、泡囊等将本发明核酸分子引入合适的宿主细胞。特别是，可将本发明核酸分子配制包裹在脂质颗粒、脂质体、泡囊、纳米球或纳米颗粒等中递送。

优选的制剂是能引入本文所述核酸分子的药学上可接受的制剂。本领域技术人员已知制备和使用脂质体的方法。已开发出血清稳定性和循环半衰期改进的脂质体(参见，美国专利号5,741,516)。此外，作为潜在的药物运载体的脂质体和脂质体样制剂的各种制备方法已有综述(美国专利号5,567,434；美国专利号5,552,157；美国专利号5,565,213；美国专利号5,738,868和美国专利号5,795,587)。

通常将磷酸酯分散在水性介质中自发形成多层同心双分子泡囊(也称为多层脂泡(MLV))制备脂质体。MLV的直径一般为25nm到4μm。超声处理MLV可形成核心含有水溶液的直径为200到500的单层小脂泡。

本领域熟知脂质体的制备和使用方法，例如利用某些商品化可购得的转染试剂DOTAP(Roche Diagnostics)、Lipofectin、Lipofectam和Transfectam。获得脂质体的其它方法包括利用仙台病毒或其它病毒。利用脂质体技术将寡核苷酸转移入细胞中一已公布的例子是，例如Meyer等[J.Biol.Chem.273，15621-7(1998)]；Kita和Saito，[Int.J.Cancer 80，553-8(1999)]；Nakamura等[Gene Ther.5，1455-61(1998)]；Abe等[Antivir.Chem.Chemother.9，253-62(1998)]；Soni等[Hepatology，28，1402-10(1998)]；Bai等[Ann.Thorac.Surg.66，814-9(1998)和也参见同一杂志第819-20的讨论]；Bochot等[Pharm.Res.15，1364-9(1998)]；Noguchi等[FEBS Lett.433，169-73(1998)]；Yang等[Circ.Res.83，552-9(1998)]；Kanamaru等[J.Drug Target.5，235-46(1998)]和它们的参考文献。Sugawa等[J.Neurooncol.39，237-44(1998)]描述了在脂质体介导的寡核苷酸摄取中应用Lipofectin。Waelti等[Int.J.Cancer，77，728-33(1998)]描述了融合的阳离子-脂质-重建流感病毒被膜(阳离子病毒体)的应用。

上述阳离子或非离子脂质试剂的作用不仅能提高寡核苷酸的细胞摄取，也改善了被细胞摄入后寡核苷酸的稳定性。

或者，本发明提供本发明核酸分子的药学上可接受的纳米胶囊制剂。纳米胶囊一般可稳定和可再现地包裹化合物。为避免胞内聚合物过量所致的副作用，通常利用能在体内降解的聚合物来设计这种超细颗粒(大小约0.1μm)。如美国专利号5,145,684的实施例中所述，考虑符合这些要求的生物可降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒可用于本发明，这种颗粒不难制备。特别是，也考虑了利用这些纳米颗粒或纳米微球(Schwab等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91(22)：10460-10464；Truong-Le等，1998，Hum.Gene Ther.，9(12)：1709-1717)将寡核苷酸递送至靶细胞的方法可用于配制给予动物，特别是人的上述组合物。

在其它实施方案中，本发明提供了通常含有与中心分枝分子相连的两种或多种核酸分子的本发明核酸分子的树状聚体制剂。制备“寡核苷酸树状聚体”的方法一般为本领域所知。(参见，例如，美国专利号6,455,071；美国专利号6,274,723；Azhayeva等，Nucleic Acids Res.23：1170-1176，1995；Horn和Urdea，Nucleic Acids Res.17：6959-6967，1989)。“分枝分子”可以是单体或聚合的，可经共价或非共价相互作用与分枝分子相连接。因此，本发明的树状聚体可包含，例如与分枝分子，如核苷衍生物(例如Azhayeva等，同上；Horn和Urdea，同上中所述)或亚磷酰胺合成单体(参见，例如Shchepinov等，Nucleic Acids Res.25：4447-4454，1997)共价相连的多个寡核苷酸。在其它实施方案中，所述寡核苷酸通过例如基本上相互补区域的杂交，与分枝分子，例如核酸聚合物非共价相连。例如，分枝分子可以是通过互补碱基配对在内部区域相连的两条部分单链核酸的二聚体，其具有四个可利用的单链区域连接本发明核酸分子(参见，例如美国专利号6,274,723)。

然而，应该理解本发明不限于或依赖于任何具体的给药方式，而是包括核酸组合物的所有递送方式。

5.药物组合物

为了起作用，当本发明核酸分子包含在本发明药物组合物中时，它必需穿过细胞膜。寡核苷酸看来一般能通过与特定受体相关的饱和摄入机制穿过细胞膜。由于寡核苷酸是单链分子，它们在某种程度上是疏水性的，这有利于被动扩散通过细胞膜。寡核苷酸中可引入修饰来提高其穿过膜的能力。例如，可将寡核苷酸分子与任选含有部分饱和的脂族烃链和一个或多个极性或荷电基团，例如羧酸基团、酯基团和醇基团等基团相连。或者，寡核苷酸可以与肽结构(合适的亲膜(membranotropic)肽)相连。这种修饰的寡核苷酸更易于穿过膜，这对它们的功能是关键的，可明显提高它们的活性。Gerster等[Anal.Biochem.262，177-84(1998)]描述了棕榈基连接的寡核苷酸。Shoji等[J.Drug Target 5，261-73(1998)]描述了牻牛儿糖-连接的寡核苷酸。Soukchareun等[Bioconjug.Chem.9，466-75(1998)]描述了与肽，例如亲膜肽相连的寡核苷酸和它们的制备。Wang，J[Controlled Release 53，39-48(1998)]描述了对反义分子或其它药物进行修饰使该分子靶向某些细胞并提高所述细胞对该寡核苷酸的摄取。

也应理解如果需要本文所公开的核酸组合物可以与其它药物，例如蛋白质或多肽或各种药学活性物质联合给予。假定其它药物与靶细胞或宿主组织接触后不含导致明显的不良作用，则只要该组合物包含至少一种能提高VEGF表达的核酸分子，而对也可包含的其它组分没有实际限制。因此，核酸分子可视具体情况需要与各种其它药物一起递送。

如同在各种治疗方案中采用本文所述具体组合物开发的合适的给药和治疗方案那样，本领域技术人员熟知药学上可接受的赋形剂和运载体的配方，例如，包括口服、胃肠外、静脉内、鼻内和肌肉内给药的配方。

或者，如美国专利号5,543,158；美国专利号5,641,515和美国专利号5,399,363所述，可将本文所公开的药物组合物经胃肠外、静脉内、肌肉内或甚至腹膜内或直接(例如通过滴注)输入靶器官。活性化合物作为游离碱或药学上可接受盐的水溶液可通过与表面活性剂，例如羟丙基纤维素适当混合来制备。也可用甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油制备成分散液。在普通的保存和使用条件下，这些制剂应含有防腐剂以防止微生物生长。

适用于注射的药物形式包括无菌水溶液或分散液和临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末(参见，例如美国专利号5,466,468)。所有这些情况，制剂必须是无菌和有一定程度流动性而易于注射。在制备和保存条件下需要稳定，必须防腐以防止微生物，例如细菌和真菌的污染作用。运载体可以是含有，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。例如，可通过用包衣(如卵磷脂)、在分散时维持所需的颗粒大小和用表面活性剂来维持适当的流动性。可用各种抗菌剂或抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、乙基汞硫代水杨酸钠等防止微生物的作用。在许多情况中，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。在该组合物中利用能延迟吸收的物质，例如单硬脂酸铝和明胶可延长可注射组合物的吸收。

例如，对于水溶液的胃肠外给药，如果需要，该溶液应含合适的缓冲液，液体稀释剂应先用足够的盐或葡萄糖赋予等渗性。这些具体的水溶液特别适合于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给药。就此而言，本领域技术人员鉴于本文内容知道可用无菌水性介质。例如，可将一次剂量溶解于1ml等渗NaCl溶液中或加入1000ml皮下输液液体或在输液的合适部位注射(参见，例如《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第15版，第1035-1038和1570-1580页)。因所治疗对象的情况，可能必须对剂量作出某些改变。在任何情况中，负责给药的人应确定每位对象的合适剂量。此外，就人给药而言，制剂应该符合治疗品管理当局(therapeutic goods regulatory authority)所要求的无菌、无热源、总体安全性和纯度标准。

可将本文所述组合物配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，与无机酸，例如盐酸或磷酸，或与有机酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的盐。与游离羧基形成的盐也可得自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱，例如异丙胺、三乙胺、组氨酸、普鲁卡因等。配制后，溶液以和剂量配方相容的方式和治疗有效量给予。这些制剂可以各种剂型给予，例如可注射溶液、药物释放胶囊等。

适用于口服给药的本发明组合物可以不连续单元提供，例如各自含有预定量活性成分的胶囊、囊剂或片剂；粉末或粒剂；水性或非水性液体的溶液或混悬液；或水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。活性成分也可以丸剂、药糖剂或膏剂提供。可任选与一种或多种附加成分压缩或模制来制备片剂。可在合适的机器中压缩自由流动形式的活性成分，例如粉末或粒剂来制备压缩片剂，所述活性成分任选与黏合剂(例如聚乙烯吡咯铜、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羟基乙酸淀粉钠、交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性(剂)或分散剂相混合。可在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制备模制片剂。片剂可任选用包衣或有表面沟纹(scored)，可配制成能缓释或控释其中的活性成分，例如可用各种比例的羟丙基甲基纤维素来提供所需的释放模式。片剂可任选具有肠溶包衣使之在肠道而非胃部释放。

本发明的药物组合物一般含有能调节其克分子渗透压浓度的缓冲剂和任选的一种或多种运载体、赋形剂和/或本领域已知的添加剂，例如为增加该药物组合物的味道、颜色、润滑性等。优选的缓冲剂是磷酸缓冲盐溶液(PBS)，该溶液也可调节克分子渗透压浓度。

运载体包括淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物，例如微晶纤维素、黄原胶等。润滑剂了包括氢化蓖麻油等。

在一些实施方案中，该药物组合物不含运载体。这种制剂优选用于注射给药，包括静脉内注射和滴注。

本发明也涉及治疗或预防局部缺血疾病或减轻、预防或治疗局部缺血相关组织损伤的方法，包括给予需要的患者本发明的核酸分子或药物组合物。

为使本发明易于理解和实施，通过以下非限制性实施例描述特别优选的实施方案。

                            实施例

                           实施例1

                          调节VEGF表达

将寡核苷酸S1、S2、S3和DS-085(见材料与方法)转染入RPE 51细胞系，用ELISA和RT-PCR分别测定(对)VEGF的翻译和转录效果。ELISA(图1)显示与非转染对照(578pg/mL)相比，S1(1073pg/mL)和S2(969pg/ml)均明显(p＜＜0.01)促进了VEGF蛋白上调约2倍。寡核苷酸S3(593pg/mL)无明显作用(P＞0.05)。转染试剂cytofectin导致VEGF表达(508pg/mL)略微下降。然而，该结果不显著(p＞0.05)。

调节血管内皮生长因子。

为检测对VEGF转录水平的作用，提取转染了寡核苷酸S1、S2、S3和DS-085细胞的总RNA，然后用作RT-PCR的模板(图2a)。如PCR产物光密度测定所确定的那样转染细胞中的mRNA水平(图2b)反映了VEGF蛋白质的浓度。与非转染对照相比，转染24小时后，用S1和S2转染导致mRNA水平提高了1.5倍。然而，未发现S1和S2导致mRNA增加与蛋白质浓度增加成比例。先前曾报道寡核苷酸DS-085将mRNA水平降低了57.5％，与蛋白质(浓度)的降低直接成比例。这表明DS-085的下调机制是独立的不同于S1和S2上调蛋白质的机制。与对照样品相比，用S3寡核苷酸转染无明显作用，对蛋白质浓度也无明显作用。类似地，只用载体(cytofectin^TM)转染导致VEGF mRNA略微降低(5％)，与蛋白质降低相当，这可能反映了已知的与cytofectin^TM(22)相关的轻微细胞毒性作用。

                          材料与方法

                         设计寡核苷酸

检查人VEGF的5’-UTR序列是否存在可能提供调节位点的同型嘌呤区域。然后设计有义寡核苷酸1和2(S1和S2)来分别识别所鉴定的从ATG起始密码子开始的碱基对-265到-223同型嘌呤同型嘧啶序列的最前和最后16(个核苷酸)。采用有义寡核苷酸(S3)的5’端到有义寡核苷酸1的16(个核苷酸)作为对照。寡核苷酸DS-085已有描述(Garrett，2000)。这些寡核苷酸购得Proligo(Boulder，CO，USA)用硫代磷酸酯(S)骨架合成。

                     体外寡核苷酸VEGF抑制试验

培养人视网膜色素上皮细胞(RPE)细胞系(RPE51)用于评估各种寡核苷酸序列对VEGF蛋白和mRNA产生的作用。以约4×10⁵个细胞/孔将细胞接种于2×6孔板(35mm直径)中37℃、5％CO₂在补加有10％胎牛血清、0.5％链霉素和青霉素的Dulbecco改进Eagle培养基中生长至80％汇合。按照生产商的使用说明用Cytofectin^TM(Gene Therapy Systems，San Diego，CA，USA)将寡核苷酸以终浓度1μM递送入细胞。对照组为用不含寡核苷酸的cytofectin转染的细胞和未处理的细胞(未经任何操作)。转染后，将一块板转移至CO2培育箱，在5％CO2的正常含氧量条件下生长。另一块板置于低氧培育箱中(2％O2，5％CO2)，各自生长24小时。调节血管内皮生长因子。

然后取出含氧量正常和低氧生长细胞的培养液，利用商业购得的试剂盒(CYTELISATM，Cytimmune Sciences，Maryland，USA)进行酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定VEGF表达水平。按照生产商的使用说明用100μl未稀释的培养液进行ELISA。用胰蛋白酶消化和2000g离心沉淀5分钟收集各孔细胞。用等渗盐水洗涤细胞沉淀物后将其重悬于250μl等渗盐水中。读取OD600值来测定细胞密度，用于VEGF浓度的标准化。

用RT-PCR测定mRNA转录水平。转染24小时后，直接在培育孔中用600μl Trizol^TM(QIAGEN，Clifton Hill，Vic，Australia)处理细胞。将裂解悬液移至微离心管，加入氯仿(200μL)，振荡(vortex)溶液以确保完全混合。将含有总RNA的水相移至新的微离心管，加入一倍体积异丙醇沉淀RNA。20000g离心10分钟沉淀RNA，用70％乙醇洗涤RNA沉淀物。吸弃乙醇，空气干燥沉淀物，重悬于200μL无核酶的水中用发光光度法测定浓度。按照生产商的使用说明书，用Omniscript^TM RT试剂盒(QIAGEN)制备第一链cDNA：200μg总RNA为起始材料、利用寡聚dT引物，20μL终体积。从该反应体系中直接取1μL用作除β肌动蛋白片段(用作内标)以外的内部VEGF片段的PCR模板。VEGF引物为：有义5′CATCACGAAGTGGTGAAGTT-3′和反义5′-AACGCTCCAGGACTTATACC3′。用于扩增β-肌动蛋白的引物为：有义5′-AGGCACCAGGGCGTGAT-3′和反义5′-TTAATGTCACGCACGATTTC-3′。将两组引物(Proligo)加入以下反应组分中，终体积为25μL：2.5μL的10×反应缓冲液、2mM MgCl₂、200μM的各种dNTP、6皮摩尔的各种引物和1单元的Tth+聚合酶(Fisher Biotech，Perth，WA，Australia)。采用包括以下步骤的递降循环反应：初始变性步骤94℃-2分钟，然后进行7轮94℃-10秒；65℃-10秒，每轮降低1℃；72℃-30秒。然后进行41轮94℃-10秒；58℃-10秒；71℃-30秒。

                         样品统计学分析

为统计学分析，进行一式四份转染。用GB-Stat^TM统计学软件包(DynamicMicrosystems，Silver Springs，MD，USA)，依次通过单向ANOVA、Tukey/Kramer分析来分析结果，可信度99％。

                           实施例2

                           体内分析

为测定体外观察结果是否可转化为体内作用，将寡核苷酸注射入大鼠眼睛的前房。随后作眼科检查显示注射S1和S2七天后大鼠眼睛虹膜中有强烈的新血管生成(图3)，但注射S3或载体的大鼠眼睛中未观察到此作用。这表明这些寡核苷酸能上调眼睛中VEGF表达并产生血管生成应答。

类似地，当在大鼠的视网膜下间隙注射S1和S2后，用颜色基底照相术(color fundus photography)观察到强烈的血管生成应答。新血管生成离注射位点有一定距离，显示为延伸穿过视网膜的不同区带(图4a)。在血管生成期间由于血管的“渗漏”性质，进一步用荧光血管照相术(fluorescein angiography)的其它检查证实有显示强荧光的新血管形成(图4b)。此外，荧光血管照相术显示在注射S1和S2的眼睛中存在微动脉瘤(图4c)。注射14天后进行的检查显示注射S1和S2的眼睛中发生视网膜内出血，用颜色基底照相术显示为黑色斑点(图4d)，而用荧光血管照相术显示为弱荧光(图4e)。这些结果与接受视网膜下注射的小鼠模型密切相似，在小鼠模型中，注射S1和S2七天后在眼睛中观察到渗漏、微动脉瘤形成和视网膜内出血。而注射S3的眼睛则维持正常外观。

                          材料与方法

                         注射与体内分析

所有动物实验按照视力与眼科研究协会(Association for Research in Visionand Ophthalmology)的动物使用指南(Animal Use guidelines)进行并得到了西澳大利亚大学动物伦理委员会的批准。将寡核苷酸递送至6-8周龄无着色RCS-rdy+大鼠的前房，这些大鼠通过肌肉内注射氯胺酮(50mg/kg体重)和甲苯噻嗪(8mg/kg体重)麻醉，然后向眼睛局部施用盐酸普鲁卡因。排出相同量的水状液(aqueous humor)后，用与5μL Hamilton注射器相连的32号针头将2.5μL 1mM寡核苷酸溶液或载体(含有10％甘油的PBS)经颞缘(temporal limbus)注射入每只大鼠两眼的前房。注射7天后进行眼睛的眼科检查用狭缝灯(slit lamp)照相机拍照。

对8-9周龄无着色RCS/rdy+大鼠和同龄C57Black C6J小鼠进行视网膜下注射。所用的注射技术已有描述(21)。简言之，切开结膜直至边缘暴露巩膜，然后用30号针头刺入。在操作显微镜下使32号针头以切线方向穿过此孔。将2uL寡核苷酸递送入每只眼睛的视网膜下间隙。针头维持在视网膜下间隙1分钟，轻轻抽出，将抗生素软膏涂在伤口处。

                           实施例3

                          序列比较

牛、小鼠和人之间VEGF 5’-UTR序列的跨种类比较，显示S1到S2区在人和牛之间具有高水平保守性，但小鼠5’-UTR显示完全缺少S1序列(图5a)。大鼠的5’-UTR无序列信息可用，因此未作直接比较。进一步检查了人VEGF基因的5’-和3’-UTR显示存在几个可能的去稳定元件位点(图5b)。

                         实施例讨论

VEGF的体内受控调节对维持许多类型的组织和细胞健康很重要。然而，除了促进癌组织中的血管生成外(25，26)，局部缺血疾病相关的VEGF水平升高可导致各种新血管生成性眼病，包括糖尿病性视网膜病变和早熟性视网膜病(23，24)。调节VEGF的中心点是同时存在5’-UTR和3’-UTR，二者除了含稳定和去稳定元件(9)以外还包含低氧和葡萄糖效应元件(27)等许多调节元件。在该项研究中，我们报道在人VEGF基因的5’-UTR内发现了新的控制元件，除了可进一步了解其调节机制外，该元件可用作去稳定蛋白的靶位点。

设计了两种有义寡核苷酸(S1和S2)来模拟VEGF基因5’-UTR内可能的调节区。设计了第3种寡核苷酸(S3)作为对照，基因图显示为5’到S1的16(个核苷酸)。体外研究的结果表明S1和S2使VEGF蛋白产量提高了2倍，mRNA翻译提高了1.5倍。这表明5’-UTR中S1和S2所代表的序列含有参与调节VEGF产生的调节元件。S1和S2上调VEGF蛋白的可能机制包括对mRNA去稳定蛋白或转录抑制蛋白的竞争性抑制。如果是后者，与S1和S2中发现的序列相似，在后一情况中，已有描述的转录抑制蛋白(19，20)与能识别同型嘌呤变异、GA型序列共有基序具有共同作用机制。然而，我们的数据提示S1和S2能竞争(结合)mRNA去稳定蛋白的识别位点。DS-085通过形成能抑制mRNA产生的DNA链三螺旋而导致VEGF下调。因此，我们观察到mRNA减少和蛋白质减少之间成比例和直接相关。如果上调机制是通过抑制抑制剂性蛋白而提高mRNA的产生所致，我们应观察到蛋白质和mRNA之间类似的成比例增加。然而，S1和S2不是这种情况，与对照相比，其蛋白质增加了两倍，而mRNA只分别增加了1.5和1.25倍。因此，是合成与降解之间存在的平衡决定了mRNA的水平，稳定性增加会导致降解减少从而使平衡转移到产生更高水平的mRNA，但其合成不增加。mRNA稳定性改善和因此半衰期的延长可导致每分子mRNA产生的蛋白质量成比例增加。此外，以前曾证明mRNA的稳定/去稳定机制与VEGF蛋白在低氧期间增加有关(28)，已充分证明次机制在调节其它细胞元件，例如转铁蛋白受体(29，30)、弹性蛋白(31)和抗性蛋白(32)中具有重要作用。

为研究这些寡核苷酸在体内对VEGF的调节作用，选择了啮齿类动物眼模型。所有组织的VEGF同种型相同，眼睛成为最具吸引力的器官，因为VEGF水平变化对眼血管形成的作用已得到充分描述(见(33)所总结的)。此外，通过眼科检查不难研究眼睛的血管结构。当将S1和S2引入大鼠眼睛的前房后，均在虹膜中观察到强烈的新血管应答。类似地，除了形成微动脉瘤和新血管生长相关的渗漏外，在大鼠和小鼠的视网膜下注射S1和S2导致了视网膜中相似应答。除糖尿病性视网膜病变患者外(35)，在VEGF转基因表达提高的啮齿类动物模型中也观察到这种新血管生成模式(34)。在体外研究中，注射S3未产生可观察的反应。这强烈暗示S1和S2的存在导致VEGF蛋白水平提高和刺激新血管形成的作用。此外，一次注射这些寡核苷酸可获得新血管的持续发育和维持，这对基因治疗的前景是理想的。比较5’-UTR已公开的序列，显示该序列区域中有一些不同，提示存在去稳定元件。然而，因为S1和S2在缺乏S1序列的小鼠模型中均介导了应答，证明S1和S2共有的较短共有序列导致了抑制作用。对低氧的应答取决于存在由6个碱基对核心共有序列组成的低氧效应元件(HRE)(36)。类似地，葡萄糖水平低可通过葡萄糖效应元件介导并增加VEGF(27)。S1和S2均含有能提供去稳定蛋白的核心识别序列的元件(T/A)GGGG。除了在3’-UTR中鉴定到具有去稳定元件以外(9)，进一步检查人VEGF基因显示在5’-UTR中也存在几个这种元件。存在的多个去稳定元件可用作调节降解速率的有效工具，即越多位点被占据，降解速率越快。

本文所引用的每篇专利、专利申请和出版物的内容全文纳入本文作为参考。

本文所引用的任何参考文献不应理解为承认该参考文献是本申请可利用的“现有技术”。

本说明书的目的是描述本发明的优选实施方案而非将本发明限制于任何一种实施方案或特定的特征集合中。因此，本领域技术人员应理解，通过阅读本文内容，可在所示例的具体实施方案中作出各种改进和变化而不脱离本发明的范围。所有这种改进和变化应包括在附加权利要求书的范围内。

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                               序列表

<110>莱恩斯眼科协会有限公司(Lions Eye Institute Limited)(指定除美国以外的所有国家)

     E.P.拉克辛(Rakoczy，Elizabeth P)(只在美国)

     R.J.马拉诺(Marano，Robert J)(只在美国)

<120>治疗性分子

<130>12496032

<140>未指定

<141>2005-03-30

<150>USSN 60/558,265

<151>2004-03-31

<160>36

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>5

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>VEGF RNA去稳定元件

<400>1

agggg                                                                5

<210>2

<211>5

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>VEGF RNA去稳定元件

<400>2

tgggg                                                                5

<210>3

<211>5

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>VEGF RNA去稳定元件

<400>3

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<210>4

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有VEGF RNA去稳定元件的寡核苷酸S1

<400>4

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<210>5

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有VEGF RNA去稳定元件的寡核苷酸S2

<400>5

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<210>6

<211>1039

<212>DNA

<213>人

<400>6

cgcggaggct tggggcagcc gggtagctcg gaggtcgtgg cgctgggggc tagcaccagc      60

gctctgtcgg gaggcgcagc ggttaggtgg accggtcagc ggactcaccg gccagggcgc     120

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agaaaagaga aagtgtttta tatacggtac ttatttaata tcccttttta attagaaatt    1260

aaaacagtta atttaattaa agagtagggt tttttttcag tattcttggt taatatttaa    1320

tttcaactat ttatgagatg tatcttttgc tctctcttgc tctcttattt gtaccggttt    1380

ttgtatataa aattcatgtt tccaatctct ctctccctga tcggtgacag tcactagctt    1440

atcttgaaca gatatttaat tttgctaaca ctcagctctg ccctccccga tcccctggct    1500

ccccagcaca cattcctttg aaataaggtt tcaatataca tctacatact atatatatat    1560

ttggcaactt gtatttgtgt gtatatatat atatatatgt ttatgtatat atgtgattct    1620

gataaaatag acattgctat tctgtttttt atatgtaaaa acaaaacaag aaaaaataga    1680

gaattctaca tactaaatct ctctcctttt ttaattttaa tatttgttat catttattta    1740

ttggtgctac tgtttatccg taataattgt ggggaaaaga tattaacatc acgtctttgt    1800

ctctagtgca gtttttcgag atattccgta gtacatattt atttttaaac aacgacaaag    1860

aaatacagat atatcttaaa aaaaaaaaaa gcattttgta ttaaagaatt taattctgat    1920

ctc                                                                  1923

<210>8

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>寡核苷酸S3

<400>8

gggaggagcc gcagcc                                                    16

<210>9

<211>12

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>9

ggcttggggc ag                                                        12

<210>10

<211>12

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>10

ctgggggcta gc                                                        12

<210>11

<211>12

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>11

ggcttgggga ga                                                        12

<210>12

<211>12

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>12

tgcttttggg gg                                                        12

<210>13

<211>13

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>13

gggcaggggc cgg                                                       13

<210>14

<211>13

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>14

gggtggaggg ggt                                                       13

<210>15

<211>13

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>15

ggagggggag gag                                                       13

<210>16

<211>13

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>16

gaggagaggg ggc                                                       13

<210>17

<211>14

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>17

tgggagggga atgt                                                      14

<210>18

<211>14

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>18

gggcatgggg gcaa                                                      14

<210>19

<211>14

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>19

aggagtttgg ggag                                                      14

<210>20

<211>14

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>20

tggtggggcc aggg                                                      14

<210>21

<211>15

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>21

tggggagctt cagga                                                     15

<210>22

<211>15

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>22

gctttgggga ttccc                                                     15

<210>23

<211>15

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>23

tcgcccccag gggca                                                     15

<210>24

<211>15

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>24

aattgtgggg aaaag                                                     15

<210>25

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>25

cggaggcttg gggcag                                                    16

<210>26

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>26

gctgggggct agcacc                                                    16

<210>27

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>27

cgacggcttg gggaga                                                    16

<210>28

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>28

acaggggcaa agtgag                                                    16

<210>29

<211>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>29

gcttttgggg gtgaccg                                                   17

<210>30

<211>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>30

agccgcgggc aggggcc                                                   17

<210>31

<211>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>31

ggggtggagg gggtcgg                                                   17

<210>32

<211>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>32

aggaggggga ggaggaa                                                   17

<210>33

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>33

agagggggcc gcagtggc                                                  18

<210>34

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>34

cttgagttgg gaggggaa                                                  18

<210>35

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>35

ttggtggggc cagggtcc                                                  18

<210>36

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>含有mRNA去稳定元件的寡核苷酸

<400>36

gcatgggggc aaatatga                                                  18

Claims (31)

1.一种基本上由下式所示的至少一种核苷酸序列组成的分离的核酸分子：

A_nWGGGGB_m  (I)，

其中W是A、T或U；

A_n是n个核苷酸构成的序列，其中n是0到约11个核苷酸，序列A_n含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸；和

B_m是m个核苷酸构成的序列，其中m是0到约11个核苷酸，序列B_m含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸。

2.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，各A_n和B_m含有选自A、T、U、G和C的相同或不同核苷酸或它们的衍生物或类似物。

3.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子能提高表达VEGF的宿主细胞表达VEGF。

4.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子能提高VEGF基因转录物在表达该转录物的宿主细胞中的稳定性。

5.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有式(I)所示核苷酸序列的一个或多个串联重复。

6.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子如下式所示：

[A_nWGGGGB_m]_p  (II)

其中A_n、B_m和W如式(I)所定义；和

p是2到约20的整数。

7.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，该核苷酸序列选自AGGGG[SEQ ID NO：1]、TGGGG[SEQ ID NO：2]或UGGGG[SEQ ID NO：3]中的任一种。

8.如权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子基本上由一条或多条选自GGAGGAGGGGGAGGAG[SEQ ID NO：4]或AGGAAGAGGAGAGGGG[SEQ ID NO：5]的序列构成。

9.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子基本上由对应于VEGF转录物非翻译区或其一部分的至少12到约500个核苷酸长的核酸序列构成。

10.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸序列选自SEQID NO：6和7。

11.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有与选自SEQ ID NO：6和7的核酸序列的一部分约90％相同的序列和使与之操作性相连的转录物去稳定从而提高了表达VEGF的宿主细胞中VEGF的含量。

12.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子是含有至少一条式(I)所示序列的寡核苷酸。

13.如权利要求12所述的核酸分子，其特征在于，所述寡核苷酸含有至少约5个核苷酸。

14.如权利要求12所述的核酸分子，其特征在于，所述寡核苷酸选自SEQID NO：9-36中任一种。

15.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述寡核苷酸是核酶耐受的。

16.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子是含有编码基本上由至少一条式(I)所示核苷酸序列构成的转录物的核苷酸序列的多核苷酸。

17.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子是含有与启动子操作性相连的多核苷酸的构建物。

18.一种含有一种以上如权利要求1所述核酸分子与任选的药学上可接受的佐剂、运载体或稀释剂的药物组合物。

19.一种提高VEGF表达的方法，包括将核酸分子引入表达VEGF的宿主细胞中，其中所述核酸分子含有至少一种式(I)所示的核苷酸序列：

A_nWGGGGB_m  (I)，

其中W是A、T或U；

A_n是n个核苷酸构成的序列，其中n是0到约11个核苷酸，序列A_n含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸；和

B_m是m个核苷酸构成的序列，其中m是0到约11个核苷酸，序列B_m含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸。

20.一种治疗、预防或缓解可从提高血管生成或血管形成中获益的疾病症状的方法，该方法包括使与该疾病相关和表达VEGF的组织和有效量的提高该组织中VEGF表达或含量的核酸分子相接触，其中所述核酸分子含有至少一种下式所示的核苷酸序列：

A_nWGGGGB_m  (I)，

其中W是A、T或U；

A_n是n个核苷酸构成的序列，其中n是0到约11个核苷酸，序列A_n含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸；和

B_m是m个核苷酸构成的序列，其中m是0到约11个核苷酸，序列B_m含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述疾病是局部缺血疾病。

22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述局部缺血疾病选自脑缺血、肠道缺血、脊髓缺血、心血管缺血、心肌梗塞相关的心肌缺血、充血性心力衰竭(CHF)相关的心肌缺血、年龄相关性黄斑变性(AMD)相关的缺血、肝缺血、肾缺血、真皮缺血、血管收缩诱导的组织缺血、阴茎异常勃起导致的阴茎缺血、血栓栓塞疾病相关的缺血、微血管疾病相关的缺血、和糖尿病、坏疽病、创伤后综合征、心脏停条跳复苏、外周神经损伤或神经病相关的缺血。

23.一种增加可表达VEGF的组织中血管生成或血管形成的方法，该方法包括使该组织与有效量的提高该组织中VEGF表达或含量的核酸分子相接触，其中所述核酸分子含有至少一种下式所示的核苷酸序列：

A_nWGGGGB_m  (I)，

其中W是A、T或U；

A_n是n个核苷酸构成的序列，其中n是0到约11个核苷酸，序列A_n含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸；和

B_m是m个核苷酸构成的序列，其中m是0到约11个核苷酸，序列B_m含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述组织选自：脑组织、肠组织、脊髓组织、心肌组织、眼组织、肝组织、肾组织、皮肤组织、阴茎组织、含有伤口或移植组织的组织。

25.一种增加其对象中血管生成或血管形成的方法，该方法包括给予该对象有效量的核酸分子来增加血管生成或血管形成，其中所述核酸分子含有至少一种如下式所示的核苷酸序列：

A_nWGGGGB_m  (I)，

其中W是A、T或U；

A_n是n个核苷酸构成的序列，其中n是0到约11个核苷酸，序列A_n含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸；和

B_m是m个核苷酸构成的序列，其中m是0到约11个核苷酸，序列B_m含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸。

26.一种预防或治疗对象的局部缺血疾病或减轻、预防或治疗局部缺血相关组织损伤的方法，该方法包括给予对象有效量的核酸分子来治疗局部缺血疾病或减轻组织损伤，其中所述核酸分子含有至少一种如下式所示的核苷酸序列：

A_nWGGGGB_m  (I)，

其中W是A、T或U；

A_n是n个核苷酸构成的序列，其中n是0到约11个核苷酸，序列A_n含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸；和

B_m是m个核苷酸构成的序列，其中m是0到约11个核苷酸，序列B_m含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸。

27.核酸分子在制备用于增加血管生成或血管形成的药物中的应用，所述核酸分子含有至少一种下式所示的核苷酸序列：

A_nWGGGGB_m  (I)，

其中W是A、T或U；

A_n是n个核苷酸构成的序列，其中n是0到约11个核苷酸，序列A_n含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸；和

B_m是m个核苷酸构成的序列，其中m是0到约11个核苷酸，序列B_m含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸。

28.核酸分子在制备用于预防或治疗局部缺血疾病的药物中的应用，所述核酸分子含有至少一种如下式所示的核苷酸序列：

A_nWGGGGB_m  (I)，

其中W是A、T或U；

A_n是n个核苷酸构成的序列，其中n是0到约11个核苷酸，序列A_n含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸；和

B_m是m个核苷酸构成的序列，其中m是0到约11个核苷酸，序列B_m含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸。

29.核酸分子在制备用于减轻、预防或治疗局部缺血相关组织损伤的药物中的应用，所述核酸分子含有至少一种如下式所示的核苷酸序列：

A_nWGGGGB_m  (I)，

其中W是A、T或U；

A_n是n个核苷酸构成的序列，其中n是0到约11个核苷酸，序列A_n含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸；和

B_m是m个核苷酸构成的序列，其中m是0到约11个核苷酸，序列B_m含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸。

30.一种含有编码RNA去稳定元件并与异源多核苷酸操作性相连的序列的核酸构建物，其中所述RNA去稳定元件含有至少一种下式所示的序列：

A_nWGGGGB_m  (I)，

其中W是A、T或U；

A_n是n个核苷酸构成的序列，其中n是0到约11个核苷酸，序列A_n含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸；和

B_m是m个核苷酸构成的序列，其中m是0到约11个核苷酸，序列B_m含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸。

31.一种降低多核苷酸表达的转录物稳定性的方法，该方法包括使RNA去稳定元件与该多核苷酸操作性连接，其中所述RNA去稳定元件含有至少一种下式所示的序列：

A_nWGGGGB_m    (I)，

其中W是A、T或U；

A_n是n个核苷酸构成的序列，其中n是0到约11个核苷酸，序列A_n含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸；和

B_m是m个核苷酸构成的序列，其中m是0到约11个核苷酸，序列B_m含有选自任何核苷酸的相同或不同的核苷酸。

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