JP2007530057A

JP2007530057A - Ｖｅｇｆ転写物の安定性を調節するための治療的分子

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Publication number: JP2007530057A
Application number: JP2007505335A
Authority: JP
Inventors: エリザベスピロスカラコジー; ロバートジェフリーマラノ
Original assignee: ライオンズアイインスティチュートリミテッド
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2005-03-31
Publication date: 2007-11-01
Also published as: CA2561978A1; EP1735441A1; BRPI0509325A; NZ550251A; CN1961075A; US20090048191A1; WO2005095606A1; EP1735441A4; AU2005229159A1

Abstract

本発明は、動物、特にヒトなどの哺乳動物の虚血状態を治療するために有用な核酸組成物および方法を開示する。具体的には、本発明は、特に虚血状態を治療するための方法において、血管形成または血管新生を調節するのに有用な、血管内皮成長因子の遺伝子に由来する転写物の安定性を調節する配列を含むか、またはコードする核酸分子、ならびにこのような分子を含む薬学的組成物を開示する。

Description

発明の分野
本発明は一般に、心臓、腎臓、および脳の虚血、ならびに肢および四肢に影響を及ぼす虚血状態を含む、虚血性の疾患または状態の分野に関する。具体的には本発明は、動物、特にヒトなどの哺乳動物の虚血状態を治療するために有用な核酸組成物および方法に関する。特に本発明は、特に虚血状態を治療する方法において、血管形成または血管新生を調節するのに有用な、血管内皮成長因子の遺伝子に由来する転写物の安定性を調節する配列を含むか、またはコードする核酸分子、ならびにこのような分子を含む薬学的組成物を提供する。

本明細書で番号を付した出版物の書誌的詳細は、本明細書の最後にまとめて示す。

発明の背景
血管の発生は、あらゆる組織の成長の基本的な必要条件であり、および、適切な組織の血管新生が存在しないと、細胞から酸素および栄養が奪われる。このことは、細胞が、新しい血管を枯渇組織に動員するように機能する血管形成因子を産生するための刺激を提供する。新しい血管の形成に関与する血管形成因子の中で最も重要な因子は、高度に調節されていて、かつ1つの遺伝子の選択的スプライシングの結果生じる4種類のイソ型からなる血管内皮成長因子(VEGF)である(1, 2)。全4種類のイソ型の特徴は、VEGFの発現の調節に関与する重要な制御エレメントおよび調節エレメントの大半を含む、異常に長く、かつGCに富む5'-および3'-UTR(1, 2)の存在である(総説は3, 4)。これらのエレメントは、複数の配列内リボソーム進入部位(IRES)(5, 6)、低酸素応答エレメント(HRE)(7)、ならびに、いくつかの安定化配列および不安定化配列(8, 9)を含む。

疾患状態におけるVEGFが関与する血管新生の重要性によって、これは遺伝子治療の魅力的な標的となっている。腫瘍および眼内の血管新生を治療するためにVEGFの発現を下方制御する、いくつかの方法の検討が現在進められている(10〜12)。加えて、本発明者らは過去に、VEGF遺伝子の5'-UTRを標的とするセンスオリゴヌクレオチド(DS-085)について、およびVEGFのインビトロおよびインビボの両方における転写および続く翻訳の下方制御における有効性が明らかなことについて報告した(13)。その作用機構は、ポリメラーゼ停止(14〜18)を引き起こす2本鎖DNAの主溝内におけるフーグスティーン型水素結合に起因すると仮定されており、および他の遺伝子群の調節領域と同様に、このオリゴヌクレオチドはGAプリン残基に富む(19, 20)。

発明の概要
本発明は、遺伝子発現の低下を促進する、VEGF遺伝子の非翻訳領域内における他の制御エレメントの発見に端を発す。本発明者らは、1つもしくは複数のこのような制御エレメントを含むオリゴヌクレオチド、または、このようなエレメントが発現可能で、VEGFの発現をインビトロおよびインビボの両方で増加させ、インビボにおける血管形成を促進し、かつ後述する虚血状態の治療または予防に有用なポリヌクレオチドを見出した。

したがって1つの局面では、本発明は、本質的に、以下の式で表される少なくとも1つのヌクレオチド配列からなる、単離された核酸分子を提供する：

式中、Wは、A、T、またはUであって；

A_nはnヌクレオチドの配列であって、nは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列A_nは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含み；ならびに

B_mはmヌクレオチドの配列であって、mは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列B_mは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含む。

適切には、A_nおよびB_mはそれぞれ、A、T、U、G、およびC、またはこれらの誘導体もしくは類似体から選択される、同じか、もしくは異なるヌクレオチドを含む。

有利には、核酸分子はVEGFの発現を、VEGFを発現する宿主細胞において促進することができる。このタイプの説明目的の態様では、核酸分子は、VEGF遺伝子に由来する転写物の安定性を、同転写物を発現する宿主細胞において促進することができる。

いくつかの態様では、核酸分子は、式(I)で表されるヌクレオチド配列の1つまたは複数のタンデムリピートを含む。このタイプの説明目的の例では、核酸分子は、以下の式で表される：

式中、A_n、B_m、およびWは、式(I)で定義されており；ならびに

pは、2〜約20の整数である。

いくつかの態様では、ヌクレオチド配列は、

の任意の1つから選択される。いくつかの態様では、単離された核酸分子は、本質的に、

から選択される1つもしくは複数の配列からなる。

いくつかの態様では、単離された核酸分子は、本質的に、長さが少なくとも12ヌクレオチド、13ヌクレオチド、14ヌクレオチド、15ヌクレオチド、16ヌクレオチド、17ヌクレオチド、18ヌクレオチド、19ヌクレオチド、20ヌクレオチド、25ヌクレオチド、30ヌクレオチド、または35ヌクレオチド〜約100ヌクレオチド、150ヌクレオチド、200ヌクレオチド、300ヌクレオチド、400ヌクレオチド、もしくは500ヌクレオチドであるVEGF転写物の非翻訳領域、もしくはこの一部に対応する核酸配列からなる。このような核酸配列の説明目的の例は、SEQ ID NO: 6および7に記載されている。本発明は、結果として生じる縮重ヌクレオチド配列が、これに機能的に連結された転写物を不安定化することで、VEGFを発現する宿主細胞におけるVEGFの量を増やすのに十分なホモロジーを保持する限りにおいて、上記配列の1つの一部分と、約99%、約98%、約97%、約96%、約95%、約94%、約93%、約92%、約91%、またはさらには約90%が同一な配列領域を含む核酸分子も想定している。

いくつかの態様では、核酸分子は、式(I)で表される少なくとも1つの配列を含むオリゴヌクレオチドである。適切には、オリゴヌクレオチドは、少なくとも5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、または10ヌクレオチド〜約15ヌクレオチド、20ヌクレオチド、25ヌクレオチド、30ヌクレオチド、35ヌクレオチド、40ヌクレオチド、50ヌクレオチド、60ヌクレオチド、70ヌクレオチド、80ヌクレオチド、90ヌクレオチド、もしくは100ヌクレオチドを含む。このようなオリゴヌクレオチドの説明目的の例は、SEQ ID NO: 9〜36に記載されている。望ましくは、オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性である。他の態様では、核酸分子は、本質的に、式(I)で表される少なくとも1つのヌクレオチド配列からなる転写物をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。さらに他の態様では、核酸分子は、プロモーターに機能的に連結された、このようなポリヌクレオチドを含むコンストラクトである。

本発明の核酸分子は、さまざまな組成物中に調製することが可能であり、かつヒトまたは動物の被験体に、VEGFの発現を増加させるために投与する目的で、適切な薬学的媒体中に製剤化することもできる。したがって別の局面では、本発明は、広く上述したような1つもしくは複数の核酸分子を含む薬学的組成物、および任意で、薬学的に許容されるアジュバント、担体、または希釈剤を提供する。さらに別の局面では、本発明は、上記の式(I)で表される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む核酸分子を、VEGFを発現する宿主細胞に導入する段階を含む、VEGFの発現を促進する方法を提供する。

本発明の核酸分子、およびこれを含む組成物は、血管形成を増加させ、したがって血管形成または血管新生の昂進による利益が得られるであろう、さまざまな状態を治療する、予防する、制御する、または症状を改善するために、新しく、かつ有用な治療薬または予防薬を提供する。適切には、このような状態は、説明目的の例として、脳虚血；腸虚血；脊髄虚血；心血管虚血；心筋梗塞と関連する心筋虚血；うっ血性心不全(CHF)と関連する心筋虚血、加齢性黄斑変性(AMD)と関連する虚血；肝虚血；腎虚血；皮膚虚血；血管狭窄によって誘導される組織虚血；持続勃起症の結果としての陰茎虚血；血栓塞栓症と関連する虚血；微小血管疾患と関連する虚血；および糖尿病性潰瘍、壊疽状態、外傷後症候群、心停止蘇生、末梢神経損傷、またはニューロパシーと関連する虚血を含む虚血状態である。したがって、さらに別の局面では、本発明は、組織内における血管形成または血管新生を増加させる方法を提供する。このような方法は一般に、VEGFが発現され得る組織に、上記の式(I)で表される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはこのような核酸分子を、組織内におけるVEGFの量もしくは発現を促進するのに有効な量で含む薬学的組成物を接触させる段階を含む。いくつかの態様では、組織は、脳組織、腸組織、脊髄組織、心筋組織、眼組織、肝組織、腎組織、皮膚組織、陰茎組織、創傷を含む組織、または移植組織から選択される。関連する局面では、本発明は、被験体における血管形成または血管新生を増加させる方法を提供する。このような方法は一般に、上記の式(I)でそれぞれ表される1つもしくは複数のヌクレオチド配列を含む有効量の核酸分子、または、このような核酸分子を含む薬学的組成物を被験体に投与することで、血管形成または血管新生を増加させる段階を含む。別の関連する局面では、本発明は、このような状態もしくは損傷を有するか、または発生するリスクのある被験体における、上記の式(I)でそれぞれ表される1つもしくは複数のヌクレオチド配列を含む有効量の核酸分子、または、このような核酸分子を含む薬学的組成物を被験体に投与することで、虚血状態を治療するか、もしくは組織損傷を緩和させる段階を含む、虚血状態を予防するか、もしくは治療する方法、または虚血関連組織損傷を緩和するか、予防するか、もしくは治療する方法を提供する。

さらに他の関連する局面では、本発明は、血管形成もしくは血管新生を増加させるか、または虚血状態を予防もしくは治療するか、または虚血関連組織損傷を緩和、予防、もしくは治療するための薬剤の製造における、上記の式(I)でそれぞれ表される1つもしくは複数のヌクレオチド配列を含む核酸分子の使用を提供する。

本明細書で定義される制御エレメントは、RNA不安定化エレメントであって、したがってVEGF転写物の発現を、同転写物の安定性を低下させることによって低下させると提案されている。したがって本発明者らは、本明細書で定義される制御エレメントは、例えば短い半減期の転写物を必要とする応用(例えば一過性のレポーターアッセイ法)に望ましい異種転写物を不安定化させるのにも有用な可能性があると考えている。したがって本発明の別の局面は、式(I)で表される少なくとも1つの配列を含むRNA不安定化エレメントをコードする配列を含み、かつ異種ポリヌクレオチドに機能的に連結された核酸コンストラクトを提供する。関連する局面では、本発明は、ポリヌクレオチドから発現される転写物の安定性を低下させる方法を提供する。このような方法は一般に、上記の式(I)で表される少なくとも1つの配列を含むRNA不安定化エレメントを、ポリヌクレオチドに機能的に連結させる段階を含む。

表A
配列の簡単な説明

発明の詳細な説明
1．定義
文中で特に断らない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する用語と同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似しているか、または同等である任意の方法および材料を、本発明の実施または検討に使用することができるが、好ましい方法および材料について説明する。本発明の目的に鑑み、以下の用語を定義する。

冠詞「1つの(aおよびan)」は、本明細書で、これらの冠詞の文法的対象の1つまたは1つ以上(すなわち、少なくとも1つ)の複数を意味するものとして使用される。例として、「エレメント」は、1つのエレメント、または複数のエレメントを意味する。

「5'-UTR」は、遺伝子の5'(上流)の非翻訳領域を意味する。mRNAの5'-UTRをコードするDNA領域も意味する。

「3'-UTR」は、翻訳されてタンパク質が産生されることのない、ポリヌクレオチドのタンパク質コード領域の終結コドンの下流のポリヌクレオチドの領域を意味する。

「約」は、標準となる分量、レベル、値、次元、サイズ、または量の30%だけ、好ましくは20%だけ、および、より好ましくは10%だけ、ならびに、さらにより好ましくは、9%だけ、8%だけ、7%だけ、6%だけ、5%だけ、4%だけ、3%だけ、2%だけ、もしくは1%だけが変動する分量、レベル、値、次元、サイズ、または量を意味する。

「本質的に〜からなる」、「〜から本質的になる」、およびこれに類するフレーズは、本発明の利点を得るために不可欠な成分、および存在する任意の他の成分が、本発明の概念に関連する特性を有意に変化させないであろうということを意味する。

「〜に対応する」、または「〜に対応している」は、ポリヌクレオチドが、(a)標準ポリヌクレオチド配列の全体もしくは一部に実質的に同一か、もしくは相補的なヌクレオチド配列を有するか、または(b)ペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列に同一なアミノ酸配列をコードすることを意味する。このフレーズは、その範囲に、標準となるペプチドまたはタンパク質のアミノ酸の配列に実質的に同一なアミノ酸配列を有するペプチドもしくはポリペプチドも含む。

「デンドリマー」という用語は、コア分子から生じるポリマーの「アーム」を有する分岐状の巨大分子を意味する。

「有効量」とは、ある状態を治療する、または予防するという文脈において、状態の症状の出現を予防するために、症状を収めるために、および/または既存の症状を治療するために有効な、治療または予防を必要とする個体に活性な量の単回投与、または一連の投与の一部かいずれかによる投与を意味する。有効量は、治療対象となる個体の健康および身体の状態、治療対象となる個体の分類群、組成物の製剤化、医学的状況の評価、ならびに他の関連する諸因子に応じて変動することがある。有効量は、常用の試験法で決定可能な、比較的広い範囲に含まれることが予想される。

「内因性」という用語は、宿主細胞または宿主生物に通常見出される遺伝子、または核酸配列もしくはセグメントを意味する。

「発現ベクター」は、細胞内におけるポリヌクレオチドの発現を可能とするベクターを意味する。ポリヌクレオチドの発現は、転写および/または転写後の事象を含む。

本明細書で用いる「遺伝子」という用語は、宿主ゲノムの任意の、および全ての特定のコード領域、または、機能性RNAのみをコードする領域(例えば、tRNA、rRNA、リボザイムなどの調節性RNA)、ならびに関連する非コード領域、および任意の調節領域を意味する。ある態様では、「遺伝子」という用語は、その範囲に、特定のポリペプチド、イントロン、および発現の調節に関与する、隣接する5'および3'の非コードヌクレオチド配列をコードするオープンリーディングフレームを含む。この点に関して、遺伝子はさらに、天然の状態で、任意の遺伝子と結合した状態にあるプロモーター、エンハンサー、終結シグナル、および/またはポリアデニル化シグナルなどの制御シグナル、または異種の制御シグナルを含む場合がある。遺伝子配列は、cDNAもしくはゲノムDNA、またはこれらの断片の場合がある。遺伝子は、染色体外における維持のために、または宿主への組込みのために、適切なベクター中に導入されてもよい。

「虚血状態」という表現は、起源が病的な医学的事象を意味するか、または組織のある領域への血液循環が、脳虚血における血管攣縮もしくは一過性虚血性発作(TIA)の場合のように一次的に妨げられるか、もしくは阻害されるか、または脳虚血における血栓性(thrombolic)閉塞の場合のように恒久的に妨げられるか、もしくは阻害される、被験体が受ける外科的介入を意味する。影響領域からは、虚血事象イベントの結果として、酸素および栄養が奪われる。こうした枯渇は、梗塞または影響を受けた領域による損傷に至る。本発明は、脳虚血；腸虚血；脊髄虚血；心血管虚血；CHFと関連する虚血、肝虚血；腎虚血；皮膚虚血；レイノー病の結果などの血管狭窄によって誘導される組織虚血；持続勃起症の結果としての陰茎虚血；および血栓塞栓症と関連する虚血；例えば糖尿病および血管炎などの微小血管疾患；糖尿病性潰瘍；壊疽状態；外傷後症候群；心停止蘇生；および末梢神経損傷およびニューロパシー；ならびに、例えば加齢性黄斑変性(AMD)などの目の健康上の問題と関連する虚血を含む他の虚血を含む。虚血は、正常な血流を破壊する傷害、もしくは内出血、および他の類似の状態のために、例えば、卒中、心停止、重度の失血中に脳内で生じる。虚血は例えば、アテローム動脈硬化症およびCHFの結果として心筋組織に生じる。虚血は、組織への外傷後に生じる場合もある。というのは、浮腫によって生じる圧力が、組織内の動脈および静脈を圧迫して平板化することによって、組織全体に血液を運搬する能力が低下するからである。脳虚血は、心肺バイパス外科手術後に生じる場合のような、大塞栓または微小塞栓の結果として生じる場合もある。加齢性黄斑変性は、虚血状態の結果としての網膜に対する酸化的損傷に関連する可能性がある。

「mRNA」は、DNAをテンプレートとして用いて細胞内で産生される「転写物」であり、それ自体はタンパク質をコードするメッセンジャーRNAを意味する。mRNAは典型的には、5'-UTR、タンパク質コード(すなわちコーディング)領域、および3'-UTRを含む。mRNAは部分的には、特に3'-UTR内に位置するが、5'-UTRおよびタンパク質コード領域にも位置する安定性エレメントによって決定される、細胞内における限られた半減期を有する。

本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」という用語は、ホスホジエステル結合(もしくは、関連するこれらの構造的異型もしくは合成類似体)を介して連結された、複数のヌクレオチド単位(デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、または関連するこれらの構造的異型もしくは合成類似体)を含むポリマーを意味する。したがって、「オリゴヌクレオチド」という用語は典型的には、ヌクレオチドおよびヌクレオチド間の連結が天然であるヌクレオチドのポリマーを意味するが、この用語は、その範囲に、ペプチド核酸(PNA)、ホスホラミデート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、2-O-メチルリボ核酸などを含むが、これらに限定されない、さまざまな類似体も含むと理解される。分子の正確なサイズは、特定の応用では変動する場合がある。オリゴヌクレオチドは典型的には、長さが、どちらかといえば短く、一般に約9〜35ヌクレオチドであるが、この用語は、任意の長さの分子を意味する場合があり、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は典型的には、大きなオリゴヌクレオチドについて使用される。

「機能的に連結された」、「機能的に結合された」、「機能的に連結された状態の」、「機能的に連結されている」などという表現は、本明細書では、配列の転写および任意で翻訳を制御する、プロモーターの調節的制御下で転写され得る配列の配置を意味するように使用される。異種のプロモーター/転写され得る配列の組み合わせの構築では、遺伝子配列またはプロモーターを、遺伝子転写開始部位から、天然の状況(すなわち、遺伝子配列またはプロモーターが由来する遺伝子)において遺伝子配列またはプロモーターと、これが制御する遺伝子間の距離と、ほぼ同じ距離のところに配置させることが一般に望ましい。当技術分野で既知のように、この距離の、ある程度の変動は、機能を喪失することなく達成できる。同様に、配置される異種遺伝子に関して、調節配列エレメントの、その制御下における望ましい配置は、エレメントの、その天然の状況(すなわち対象遺伝子が由来する状況)における配置によって決定される。

「薬学的に許容される担体」は、局所投与、局部投与、または全身投与で安全に使用可能な、固体もしくは液体の充填剤、希釈剤、または封入用物質を意味する。

「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は同義であり、かつ多数のヌクレオチドモノマーを有するポリマーを意味する。核酸は、1本鎖もしくは2本鎖の場合があり、およびDNA(cDNAもしくはゲノムDNA)、RNA、合成型、および混合型のポリマーの場合があり、かつ化学的もしくは生化学的に修飾されている場合もあり、または、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む場合がある。このような修飾は例えば、メチル化、1つまたは複数の天然のヌクレオチドと類似体との置換、非荷電性結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど)、荷電性結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)、ペンダント部分(例えばポリペプチド)、挿入剤(例えば、アクリジン、ソラレンなど)、キレーティング剤、アルキル化剤、および修飾型の結合(例えばアルファアノマー核酸など)などのヌクレオチド間修飾を含む。水素結合および他の化学的相互作用を介して結合する能力を有するポリヌクレオチドに似せた合成分子も含まれる。典型的には、ヌクレオチドモノマーは、ホスホジエステル結合を介して連結されるが、合成型の核酸は他の結合(例えば、Nielsen et al.、前記、Science 254, 1497-1500, 1991に記載されたペプチド核酸)を含む場合がある。「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、任意の特定の長さのポリマーを意味せず、かつ、したがって典型的には、約6ヌクレオチド〜約10⁹ヌクレオチド、またはこれ以上の長さの実質的に任意の長さをとり得る。2本鎖のポリマーの場合、「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一方の鎖もしくは両方の鎖を意味する場合がある。

「プロモーター」は、少なくとも部分的には、開始および転写のレベルを制御する、一般にコード領域の上流(5')のDNAの領域を意味する。本明細書で「プロモーター」と表現する時は、広い文脈で使われ、かつTATAボックスおよびCCAATボックスの配列を含む、従来のゲノム遺伝子の転写調節配列、ならびに発生上の刺激および/または環境からの刺激に反応して、または組織特異的に、もしくは細胞型特異的に、遺伝子発現を変化させる追加的な調節エレメント(すなわち、活性化配列、エンハンサー、およびサイレンサー)を含む。プロモーターは通常、発現が調節される構造遺伝子の上流すなわち5'に位置するが、必ずしも位置するわけではない。さらに、プロモーターを含む調節エレメントは通常、遺伝子の転写の開始部位の2 kb以内に位置する。本発明のプロモーターは、細胞内における発現をさらに促進するために、および/または機能的に連結された構造遺伝子の発現のタイミングもしくは誘導性を変化させるために、開始部位に対して、より遠位に位置する追加的な特定の調節エレメントを含む場合がある。「プロモーター」という用語は、その範囲に、誘導的、抑制的、および構成的なプロモーター、ならびに最小プロモーターも含む。最小プロモーターは典型的には、機能的に連結された選択されたDNA配列の転写を開始可能な最小発現制御エレメントを意味する。いくつかの例では、最小プロモーターは、追加的な調節エレメント(例えば、エンハンサー、または他のシス作用性の調節エレメント)の非存在下で転写を基礎レベル以上に開始することができない。最小プロモーターは、TATAボックスまたはTATA様ボックスからなることが多い。数多くの最小プロモーター配列が文献で知られている。例えば最小プロモーターは、fos、CMV、SV40、およびIL-2ほか多くに由来するプロモーター領域を含む、さまざまな既知配列から選択される場合がある。最小CMVプロモーター、または最小IL2遺伝子プロモーター(開始部位に対して-72〜+45；Siebenlist, 1986)を使用する、説明目的の例を提供する。

本明細書で互換的に使用される、「被験体」、もしくは「個体」、または「患者」という用語は、治療もしくは予防の対象として望ましい任意の被験体、特に脊椎動物の被験体、およびさらには特に哺乳動物の被験体を意味する。本発明の範囲に含まれる適切な脊椎動物は、霊長類、鳥類、家畜動物(例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ)、実験動物(例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター)、愛玩動物(例えば、ネコ、イヌ)、および捕獲された野生動物(例えば、キツネ、シカ、ディンゴ)を含むが、これらに限定されない。好ましい被験体は、虚血状態または虚血関連の組織損傷の治療または予防を必要とするヒトである。しかしながら、上述の用語は、症状が存在することを意味しないことが理解されると考えられる。

「治療する」、「治療している」などの表現は、治療および予防のための処置の両方を含む。

「ベクター」は、外来DNA配列を宿主細胞に挿入するための媒体、および/またはDNA配列を、ベクターの複製に関与する細胞中で増幅するための媒体を意味する。最も一般的には、プラスミドは、ファジミド、バクテリオファージ、アデノウイルス、またはレトロウイルスの場合もある。

2．略語
本出願の全体で、以下の省略形を使用する：
nt=ヌクレオチド
nts=ヌクレオチド群
aa=アミノ酸(群)
kb=キロ塩基(群)、またはキロ塩基対(群)
kDa=キロダルトン(群)
d=日
h=時
s=秒

3．VEGF発現を促進する核酸分子
本発明は、少なくとも部分的には、VEGFの非翻訳領域が、VEGFの発現を低下させる、上記の式(I)でそれぞれ表される新しい制御エレメントを含むという発見に基づく。任意の1つの特定の理論または操作法に拘泥するわけではないが、これらの制御エレメントが、VEGF転写物の安定性を、転写物不安定化タンパク質と結合するか、または相互作用することによって低下させることが提案されている。この仮説の裏付けとして、本発明の制御エレメントを含むオリゴヌクレオチドは、これらのエレメントを含まない対照オリゴヌクレオチドと比較して、VEGFを発現する宿主細胞における、VEGFタンパク質の量の2倍の増加、およびVEGFのmRNAの非存在下における約1.25倍〜1.5倍の増加を介在することが判明した。mRNAのレベルは、合成と分解との間に存在するバランスによって決定されるので、安定性の上昇は、分解を低下させ、かつ合成を増やすことなく、より高いレベルのmRNAが存在するように平衡のシフトを引き起こす。改善されたmRNAの安定性、および、したがって半減期の延長は、mRNAの1分子あたりに作られる、比例的に多い量のタンパク質をもたらすことになる。したがって1つの局面では、本発明の核酸分子は例えば、内因性のVEGF転写物を、mRNA不安定化タンパク質との結合をめぐって競合させるために、またはmRNA不安定化タンパク質と転写物の結合を妨げることで、VEGFが発現され得る宿主の細胞もしくは組織におけるVEGFの量を増加させるために、内因性のVEGF転写物を結合させるために、1つもしくは複数の、これらの制御エレメントを含むように設計される。VEGFの発現のこのような増加は、虚血状態の治療のための、血管形成および血管成長の促進を含む応用の範囲において有用である。これらの核酸分子は、典型的には、上記の式(I)で表される少なくとも1つの制御エレメントを含むオリゴヌクレオチド、または少なくとも1つのこのような制御エレメントが発現され得るポリヌクレオチドから選択される。

いくつかの態様では、本発明の核酸分子は、

の任意の1つから選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む。一般に、このようなヌクレオチド配列は、少なくとも5〜約1000ヌクレオチドの長さを有する。核酸分子がオリゴヌクレオチドである態様では、オリゴヌクレオチドは、典型的には、少なくとも5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、または10ヌクレオチド〜約15ヌクレオチド、20ヌクレオチド、25ヌクレオチド、30ヌクレオチド、35ヌクレオチド、40ヌクレオチド、50ヌクレオチド、60ヌクレオチド、70ヌクレオチド、80ヌクレオチド、90ヌクレオチド、もしくは100ヌクレオチドを含み、かつ通常は、少なくとも10ヌクレオチド、11ヌクレオチド、12ヌクレオチド、13ヌクレオチド、14ヌクレオチド、15ヌクレオチド、16ヌクレオチド、17ヌクレオチド、18ヌクレオチド、19ヌクレオチド、または20ヌクレオチドを含む。

いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは12ヌクレオチドの長さを有し、この説明目的の例は、以下の配列の1つを有する。

他の態様では、オリゴヌクレオチドは13ヌクレオチドの長さを有し、この説明目的の例は、以下の配列の1つを有する。

さらに他の態様では、オリゴヌクレオチドは14ヌクレオチドの長さを有し、この説明目的の例は、以下の配列の1つを有する。

さらに他の態様では、オリゴヌクレオチドは15ヌクレオチドの長さを有し、この説明目的の例は、以下の配列の1つを有する。

さらに他の態様では、オリゴヌクレオチドは16ヌクレオチドの長さを有し、この説明目的の例は、以下の配列の1つを有する。

さらに他の態様では、オリゴヌクレオチドは17ヌクレオチドの長さを有し、この説明目的の例は、以下の配列の1つを有する。

さらに他の態様では、オリゴヌクレオチドは18ヌクレオチドの長さを有し、この説明目的の例は、以下の配列の1つを有する。

ある例では、オリゴヌクレオチドは、適切には

の1つから選択されるが、必ずしも選択されるわけではない、少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、または20個の、式(I)で表される制御エレメントを含むように設計される。

本発明は、オリゴヌクレオチドの誘導体、例えば、その塩、特に生理学的に許容される塩も想定している。塩および生理学的に許容される塩は例えば、Remington's Pharmaceuticals Science (1985) Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1418ページ)に記載されている。誘導体は、1つもしくは複数の修飾を、(例えば、特定のヌクレオシド位置に、および/または特定のヌクレオシド間ブリッジに、オリゴヌクレオチド類似体(例えば、ポリアミド核酸(PNA)、ホスホン酸モノエステル核酸(PHONA=PMENA)に、(例えばDNA部分およびPNA部分からなるか、もしくはDNA部分およびPHONA部分からなる)オリゴヌクレオチドのキメラに)有する修飾型オリゴヌクレオチドにも関与する。ある態様では、オリゴヌクレオチドは、その特性を改善する目的で、例えば、そのヌクレアーゼ耐性を高める目的で、もしくはヌクレアーゼに対して耐性をもたせる目的で、mRNA不安定化タンパク質に対する結合親和性を改善する目的で、または、その細胞内への取り込みを増加させる目的で修飾される。

したがって本発明は有利には、上記の特定の配列を有し、および「天然の」核酸と比較して1つまたは複数の化学的修飾を追加的に有するオリゴヌクレオチドに関する。例えば、「天然の」ヌクレオシドデオキシアデノシン(アデニン+β-D-2'デオキシリボース)、デオキシグアノシン(グアニン+β-D-2'デオキシリボース)、デオキシシチジン(シトシン+β-D-2'-デオキシリボース)、およびチミジン(チミン+β-D-2'デオキシリボース)を含むDNAは、ホスホジエステルヌクレオシド間ブリッジを介して連結されている。オリゴヌクレオチドは、同じタイプの修飾、および/または異なるタイプの修飾の1つもしくは複数の修飾を有する場合があり；個々のタイプの修飾は、オリゴヌクレオチドを修飾するために使用されることが知られている修飾のタイプから独立に選択され得る。例えば、天然のDNAと比較して、ホスホジエステルヌクレオシド間ブリッジ、β-D-2'-デオキシリボース単位、および/または天然のヌクレオシド塩基(アデニン、グアニン、シトシン、チミン)はそれぞれ、修飾可能か、または置換可能である。本発明のオリゴヌクレオチドは、個々の修飾が、天然のDNAを含む同じ配列のオリゴヌクレオチドと比較して、特定のホスホジエステルヌクレオシド間ブリッジに位置する、および/または特定のβ-D-2'-デオキシリボース単位に位置する、および/または特定の天然のヌクレオシド塩基の位置に位置する、1つもしくは複数の修飾を有する場合がある。

本発明に有用なオリゴヌクレオチドの特定の例は、修飾型の主鎖、または非天然のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを含む。修飾型の主鎖を有するオリゴヌクレオチドは、リン原子を主鎖中に保持するオリゴヌクレオチド、およびリン原子を主鎖中に有さないオリゴヌクレオチドを含む。本明細書の目的に鑑みて、および、時には当技術分野で言及されることに鑑みて、ヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有さない修飾型のオリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドであるとみなすことができる。

化学的修飾の例は当業者に知られており、例えば、E. Uhlmann and A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543 および "Protocols for Oligonusleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993、およびS. T. Crooke, F. Bennet, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36 (1996) 107-129; J. Hunziker and C. Leuman (1995) Mod. Synt. Methods, 7, 331-417に記載されている。

リン含有結合の作製について記載された代表的な開示は、米国特許第3,687,808号；第4,469,863号；第4,476,301号；第5,023,243号；第5,177,196号；第5,188,897号；第5,264,423号；第5,276,019号；第5,278,302号；第5,286,717号；第5,321,131号；第5,399,676号；第5,405,939号；第5,453,496号；第5,455,233号；第5,466,677号；第5,476,925号；第5,519,126号；第5,536,821号；第5,541,306号；第5,550,111号；第5,563,253号；第5,571,799号；第5,587,361号；第5,194,599号；第5,565,555号；第5,527,899号；第5,721,218号；第5,672,697号、および第5,625,050号を含むが、これらに限定されない。

リン原子を含まない修飾型オリゴヌクレオチド主鎖の説明目的の例は、短鎖のアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、混合型の異種原子、およびアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、または1つもしくは複数の短鎖の異種原子性もしくは異種環状のヌクレオシド間結合によって形成される主鎖を有する。これらは、(部分的に、ヌクレオシドの糖部分から形成される)モルホリノ結合を有するもの；シロキサン主鎖；硫化物、スルホキシドおよびスルホンの主鎖；フォルムアセチルおよびチオフォルムアセチルの主鎖；メチレンフォルムアセチルおよびチオフォルムアセチルの主鎖；リボアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファミン酸主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノの主鎖；スルホネートおよびおよびスルホンアミドの主鎖；アミド主鎖；ならびに混合型のN、O、SおよびCH₂の成分部分を有するものを含む。これらのオリゴヌクレオシドの作製について記載された代表的な開示は、米国特許第5,034,506号；第5,166,315号；第5,185,444号；第5,214,134号；第5,216,141号；第5,235,033号；第5,264,562号；第5,264,564号；第5,405,938号；第5,434,257号；第5,466,677号；第5,470,967号；第5,489,677号；第5,541,307号；第5,561,225号；第5,596,086号；第5,602,240号；第5,610,289号；第5,602,240号；第5,608,046号；第5,610,289号；第5,618,704号；第5,623,070号；第5,663,312号；第5,633,360号；第5,677,437号；第5,792,608号；第5,646,269号、および第5,677,439号を含むが、これらに限定されない。

他の態様では、糖とヌクレオシド間結合の両方、すなわちヌクレオチド単位の主鎖は、新しい官能基と置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。1つのこのようなオリゴマー化合物である、優れたハイブリダイゼーション特性を有することがわかっているオリゴヌクレオチド模倣物は、「ペプチド」または「ポリアミド」核酸(PNA)と呼ばれる。PNA化合物中では、オリゴヌクレオチドの糖主鎖が、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖と置換されている。核酸塩基は保持されており、かつ主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合されている。PNA化合物の調製について記載された代表的な開示は、米国特許第5,539,082号；第5,714,331号；および第5,719,262号を含むが、これらに限定されない。PNA化合物に関するさらなる記述は、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500に記載されている。

ある態様では、オリゴヌクレオチドは、個々の修飾が、以下から独立に選択される1つまたは複数の修飾を含む：(a)ヌクレオシドの3'末端および/または5'末端に位置するホスホジエステルヌクレオシド間ブリッジと、修飾型ヌクレオシド間ブリッジの置換；(b)ヌクレオシドの3'末端および/または5'末端に位置するホスホジエステルブリッジと、脱ホスホブリッジの置換；(c)糖リン酸主鎖に由来する糖リン酸単位と、別の単位の置換；(d)R-D-2'-デオキシリボース単位と、修飾型糖単位の置換；(e)天然のヌクレオシド塩基と、修飾型ヌクレオシド塩基の置換；(f)オリゴヌクレオチドの特性に影響を及ぼす分子との結合；(g)任意で適切なリンカーを介する、2'5'-結合オリゴアデニル酸またはこの誘導体との結合；ならびに(h)オリゴヌクレオチドの3'末端および/または5'末端における3'-3'逆位および/または5'-5'逆位の導入。

オリゴヌクレオチドの化学的修飾の、より詳細な例を以下に示す：

(a)ヌクレオシドの3'末端および/または5'末端に位置するホスホジエステルヌクレオシド間ブリッジと、修飾型ヌクレオシド間ブリッジの置換であって、修飾型ヌクレオシド間ブリッジが、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、NR¹R^1'-ホスホラミデート、ホウリン酸、リン酸-(C₁-C₂₁)-O-アルキルエステル、リン酸-[(C₆-C₁₂)アリール-((C₁-C₂₁)-O-アルキル]エステル、(C₁-C₈)アルキル-ホスホネート、および/または(C₆-C₁₂)-アリールホスホネートブリッジ、(C₇-C₁₂)-α-ヒドロキシメチル-アリール(例えばWO 95/01363に開示)から選択される置換であって、(C₆-C₁₂)アリール、(C₆-C₂₀)アリール、および(C₆-C₁₄)アリールが、任意でハロゲン、アリル、アルコキシ、ニトロ、シアノと置換され、かつR¹およびR^1'が相互に独立に、水素、(C₁-C₁₈)-アルキル、(C₆-C₂₀)-アリール、(C₆-C₁₄)-アリール-(C₁-C₈)-アルキル、適切には水素、(C₁-C₈)-アルキル、好ましくは(C₁-C₄)-アルキル、および/またはメトキシエチルであり、または、

R¹R^1'が、これらを保持する窒素原子と、O、S、およびNからなる群由来の異種原子を追加的に含む場合がある5〜6員複素環を形成する置換；

(b)ヌクレオシドの3'末端および/または5'末端に位置するホスホジエステルブリッジと、例えば脱ホスホブリッジフォルムアセタール基、3'-チオフォルムアセタール基、メチルヒドロキシルアミン基、オキシム基、メチレンジメチル-ヒドラゾ基、ジメチレンスルフォン基、および/またはシリル基から選択される脱ホスホブリッジ(脱ホスホブリッジは例えばUhlmann, E. and Peyman, A. in "Methods in Molecular Biology," Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotide and Analogs," S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Chapter 16, 355ffに記載されている)との置換；

(c)糖リン酸主鎖(糖リン酸主鎖は糖リン酸単位を含む)に由来する糖リン酸単位(β-D-2'-デオキシリボースおよびホスホジエステルヌクレオシド間ブリッジは、ともに糖リン酸単位を形成する)と、以下から選択される別の単位との置換：

(i)例えばモルホリノ-誘導体単位との置換である、「モルホリノ-誘導体」オリゴマー(例えばE. P. Stirchak et al., Nucleic Acids Res. 17 (1989) 6129に記載)；

(ii)例えばPNA主鎖単位との置換、例えば2-アミノエチルグリシンとの置換である、ポリアミド核酸(「PNA」)(例えばP. E. Nielsen et al., Bioconj. Chem. 5 (1994) 3、およびEP 0672677 A2に記載)；

(iii)例えばPHONA主鎖単位との置換である、ホスホン酸モノエステル核酸(「PHONA」)(例えばPeyman et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35 (1996) 2632-2638、およびEP 0739898 A2に記載)；

(d)β-D-2'-デオキシリボース単位と、例えばβ-D-リボース、α-D-2'-デオキシリボース、L-2'-デオキシリボース、2'-F-2'-デオキシリボース、2'-O-(C₁-C₆)アルキル-リボース(適切には2'-O-(C₁-C₆)アルキル-リボースは2'-O-メチルリボースである)、2'-O-(C₂-C₆)アルケニル-リボース、2'-[O-(C₁-C₆)アルキル-O-(C₁-C₆)アルキル]-リボース、2'-NH₂-2'デオキシリボース、β-D-キシロ-フラノース、α-アラビノフラノース、2,4-ジデオキシ-β-D-エリスロ-ヘキソ-ピラノース、および炭素環(例えばFroehler, J. Am. Chem. Soc. 114 (1992) 8320に記載)、および/または、開鎖型の糖類似体(例えばVandendriessche et al., Tetrahedron 49 (1993) 7223に記載)、および/または、二環糖類似体(例えばM. Tarkov et al., Helv. Chim. Acta 76 (1993) 481に記載)から選択される修飾型糖単位との置換；

(e)天然のヌクレオシド塩基と、例えば、ウラシル、ヒポキサンチン、5-(ヒドロキシメチル)ウラシル、N²-ジメチルグアノシン、シュードウラシル、5-(ヒドロキシメチル)ウラシル、5-アミノウラシル、ジヒドロウラシル、5-フルオロウラシル、5-フルオロシトシン、5-クロロウラシル、5-クロロシトシン、5-ブロモウラシル、5-ブロモシトシン、2,4-ジアミノプリン、8-アザプリン、置換型7-デアザプリン、好ましくは天然のヌクレオシド塩基の7-デアザ-7-置換プリン、および/または7-デアザ-8-置換プリン、または他の修飾型(修飾型ヌクレオシド塩基は、例えばEP 0 710 667 A2およびEP 0 680 969 A2に記載)から選択される修飾型ヌクレオシド塩基との置換；

(f)オリゴヌクレオチドの特性(例えば、オリゴヌクレオチドが細胞膜を透過するか、または細胞内に侵入する能力、ヌクレアーゼに対する安定性、n個のmRNA不安定化タンパク質に対する親和性、またはオリゴヌクレオチドの薬物動態)に(望ましくは)影響を及ぼす1つまたは複数の分子に対するオリゴヌクレオチドの結合である、オリゴヌクレオチドの特性に影響を及ぼす分子との結合であって、オリゴヌクレオチドと結合する分子の例が、ポリリシン、挿入剤(ピレン、アクリジン、フェナジン、もしくはフェナンスリジンなど)、蛍光剤(フルオレセインなど)、架橋剤(ソラレンまたはアジドプロフラビンなど)、親油性分子((C₂-C₂₀)-アルキルなど)、脂質(1,2-ジヘキサデシル-rac-グリセロールなど)、ステロイド(コレステロールまたはテストステロンなど)、ビタミン(ビタミンEなど)、適切には、リン酸基を介してオリゴヌクレオチドに連結されたポリエチレングリコールもしくはオリゴエチレングリコール(例えば、トリエチレングリコールリン酸、ヘキサエチレングリコールリン酸)、(C₁₂-C₁₈)-アルキルリン酸ジエステル、および/またはO-CH₂-CH(OH)-O-(C₁₂-C₁₈)-アルキルなどであり、これらの分子は、例えばオリゴヌクレオチド結合体を作製するために、例えばヌクレオシド塩基と5'末端および/または3'末端、および/または配列内部において結合可能であり；オリゴヌクレオチド結合体を作製するプロセスは当業者に既知であり、かつ例えばUhlmann, E. & Peyman, A., Chem. Rev. 90 (1990) 543, M. Manoharan in "Antisense Research and Applications," Crooke and Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, 1993, Chapter 17, p. 303 ff.、およびEP-A 0 552 766に記載されている結合。

(g)例えば、2'5'-結合トリアデニル酸、2'5'-結合テトラアデニル酸、2'5'-結合ペンタアデニル酸、2'5'-結合ヘキサアデニル酸、または2'5'-結合ヘプタアデニル酸分子、およびこれらの誘導体である2'5'-結合オリゴアデニル酸から選択される2'5'-結合オリゴアデニル酸との、適切には、適切なリンカー分子を介する結合であって、2'5'-結合オリゴアデニル酸誘導体が、例えば、コルジセピン(2'5'-結合3'-デオキシアデニル酸)であり、かつ適切なリンカーの例がトリエチレングリコールであり、かつ2'5'-結合オリゴアデニル酸の5'末端が、1個もしくは複数の酸素原子が例えば硫黄原子と置換可能なリン酸、二リン酸、もしくは三リン酸の残基を保持していなければならず、置換がリン酸残基もしくは三リン酸残基による置換であることが望ましい誘導体から選択される結合；および

(h)オリゴヌクレオチドの3'末端および/または5'末端における、3'-3'逆位および/または5'-5'逆位の導入であって、このタイプの化学的修飾が当業者に既知であり、例えば、M. Koga et al, J. Org. Chem. 56 (1991) 3757, EP 0 464 638、およびEP 0 593 901に記載されている導入。

糖リン酸主鎖に由来する糖リン酸単位と、例えばPNA主鎖単位、またはPHONA主鎖単位である別の単位との置換は、適切には、例えば天然のヌクレオシド塩基、および/または修飾型のヌクレオシド塩基、例えば、ウラシルに由来する修飾型ヌクレオシド塩基、ヒポキサンチン、5-(ヒドロキシメチル)ウラシル、N²-ジメチルグアノシン、シュードウラシル、5-(ヒドロキシメチル)ウラシル、5-アミノウラシル、シュードウラシル、ジヒドロウラシル、5-フルオロウラシル、5-フルオロシトシン、5-クロロウラシル、5-クロロシトシン、5-ブロモウラシル、5-ブロモシトシン、2,4-ジアミノ-プリン、8-アザプリン、置換型の7-デアザプリン、好ましくは天然のヌクレオシド塩基の7-デアザ-7-置換型および/または7-デアザ-8-置換型のプリンもしくは他の修飾の1つを既に含むPNA単位もしくはPHONA単位とのヌクレオチドの置換である(修飾型ヌクレオシド塩基については例えばEP 0 710 667 A2およびEP 0 680 969 A2に記載されている)。

ある例では、オリゴヌクレオチド配列中における1つもしくは複数のホスホジエステルヌクレオシド間ブリッジは修飾されており、望ましくは、1つもしくは複数のホスホジエステルヌクレオシド間ブリッジは、ホスホロチオエートヌクレオシド間ブリッジ、および/または(C₆-C₁₂)アリールホスホネートヌクレオシド間ブリッジと、適切には、ベンジル基が好ましくはニトロ、メチル、ハロゲンと置換されているα-ヒドロキシベンジルホスホネートブリッジと置換されている。

他の例では、糖-リン酸主鎖に由来する1つまたは複数の糖リン酸単位は、PNA主鎖単位と、適切には2-アミノエチルグリシン単位と置換される。望ましくは、置換される糖リン酸単位は、少なくともある程度の規模で、ともに連結される。望ましいならば、必ずしも全ての糖リン酸単位が、オリゴヌクレオチド中で均一に置換されるわけではない。このタイプの説明目的の例では、キメラオリゴヌクレオチドは、かつ1つまたは複数のPNA部分、および1つまたは複数のDNA部分を含む。このようなキメラオリゴヌクレオチドに関しては、例えば、DNA-PNA、PNA-DNA、DNA-PNA-DNA、PNA-DNA-PNA、DNA-PNA-DNA-PNA、PNA-DNA-PNA-DNAの修飾パターンの非制限的な例が可能である。比較可能なパターンは、DNA部分およびPHONA部分を含むキメラ分子、例えば、DNA-PHONA、PHONA-DNA、DNA-PHONA-DNA、PHONA-DNA-PHONA、DNA-PHONA-DNA-PHONA、PHONA-DNA-PHONA-DNAであり得ると考えられる。これに加えて、DNA部分(群)、PHONA部分(群)、およびPNA部分(群)のような3つの異なる部分を含むキメラ分子も可能であることは言うまでもない。好ましくは本発明は、少なくとも1つの他のタイプの修飾を追加的に含むオリゴヌクレオチドに関する。

部分的に修飾されたオリゴヌクレオチドの原理は、例えば、A. Peyman, E. Uhlmann, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 377 (1996) 67-70およびEP 0 653 439に記載されている。この場合、5'末端および/または3'末端における1〜5残基の末端のヌクレオチド単位は保護されており、例えば、対応するヌクレオシドの3'末端および/または5'末端に位置するホスホジエステルヌクレオシド間ブリッジは、例えばホスホロチオエートヌクレオシド間ブリッジと置換されている。加えて、少なくとも1残基の内部のピリミジンヌクレオシド(または、それぞれのヌクレオチド)の位置は、典型的には修飾されており；望ましくは、3'末端および/または5'末端における、ピリミジンヌクレオシドのヌクレオシド間ブリッジ(群)は、例えばホスホロチオエートヌクレオシド間ブリッジ(群)によって修飾/置換されている。部分的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、特に有利な特性を示し；例えば、これらは、最小修飾と関連する特に高い程度のヌクレアーゼ安定性を示す。部分的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、全ホスホロチオエートと比較して高い結合親和性も示す。

上記のオリゴヌクレオチドに代わるものとして、本発明は、細胞装置によって転写されて、上記の式(I)で表される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む転写物を生じるポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトの使用も想定している。いくつかの態様では、ヌクレオチド配列は、上記の式(I)で表される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、VEGF転写物の非翻訳領域(UTR)、もしくはこの一部に対応する核酸配列を含む。VEGFのUTRの一部は、少なくとも約12残基、13残基、14残基、15残基、16残基、17残基、18残基、19残基、20残基、25残基、30残基、または35〜約100残基、150残基、200残基、300残基、400残基、もしくは500残基の連続ヌクレオチドの範囲である可能性があるか、または例えば、それぞれSEQ ID NO: 6および7に記載された、VEGF遺伝子の完全長の5'-UTRおよび3'-UTRのほぼ全体の場合がある。

本発明は、十分なホモロジーを保持し、機能的に連結された転写物を不安定化させることで、VEGFを発現する宿主細胞中におけるVEGFの量を増加させる限りにおいて、VEGFのUTRの1つの一部と、結果として生じる縮重ヌクレオチド配列が、約99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、またはさらには70%が同一な配列領域を含む核酸分子も想定している。典型的には、縮重ヌクレオチド配列は、上記の式(I)で表される、少なくとも1つの制御エレメントを含むことになる。したがって本発明は、VEGFの5'-UTRまたは3'-UTRの少なくとも一部と、少なくとも低ストリンジェンシー条件で、好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件で、および、より好ましくは高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列の相補物も含む。

本明細書で用いる、「低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または極めて高いストリンジェンシー条件でハイブリダイズする」という表現は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を意味する。ハイブリダイゼーション反応を実施する際の手引きは、Ausubel et al., (1998、前記), Sections 6.3.1-6.3.6.に記載されている。水性および非水性の方法が同参考文献に記載されており、どちらを使用することもできる。本明細書で、低ストリンジェンシー条件と記載するときは、少なくとも約1% v/v〜少なくとも約15% v/vのフォルムアミド、および少なくとも約1 M〜少なくとも約2 Mの塩を使用する42℃におけるハイブリダイゼーション、および少なくとも約1 M〜少なくとも約2 Mの塩を使用する42℃における洗浄を含み、かつ包含する。低ストリンジェンシー条件は、1%ウシ血清アルブミン(BSA)、1 mM EDTA、0.5 M NaHPO₄ (pH 7.2)、7% SDSを使用する65℃におけるハイブリダイゼーション、および(i)2×SSC、0.1% SDS；または(ii)0.5% BSA、1 mM EDTA、40 mM NaHPO₄ (pH 7.2)、5% SDSを使用する室温における洗浄を含む場合もある。低ストリンジェンシー条件の1つの態様は、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)を使用する約45℃におけるハイブリダイゼーションと、これに続く、0.2×SSC、0.1% SDSを使用する少なくとも50℃における2回の洗浄を含む(洗浄温度は、低ストリンジェンシー条件の場合は、55℃に高めることができる)。中ストリンジェンシー条件は、少なくとも約16% v/v〜少なくとも約30% v/vのフォルムアミド、および少なくとも約0.5 M〜少なくとも約0.9 Mの塩を使用する42℃におけるハイブリダイゼーション、ならびに少なくとも約0.1 M〜少なくとも約0.2 Mの塩を使用する55℃における洗浄を含み、かつ包含する。中ストリンジェンシー条件は、1%ウシ血清アルブミン(BSA)、1 mM EDTA、0.5 M NaHPO₄ (pH 7.2)、7% SDSを使用する65℃におけるハイブリダイゼーション、および(i)2×SSC、0.1% SDS；または(ii)0.5% BSA、1 mM EDTA、40 mM NaHPO₄ (pH 7.2)、5% SDSを使用する60℃〜65℃における洗浄を含む場合もある。中ストリンジェンシー条件の1つの態様は、6×SSCを使用して約45℃においてハイブリダイズさせる段階と、これに続く、0.2×SSC、0.1% SDSを使用する60℃における1回もしくは複数回の洗浄を含む。高ストリンジェンシー条件は、少なくとも約31% v/v〜少なくとも約50% v/vのフォルムアミド、および約0.01 M〜約0.15 Mの塩を使用する42℃におけるハイブリダイゼーション、ならびに約0.01 M〜約0.02 Mの塩を使用する55℃における洗浄を含み、かつ包含する。高ストリンジェンシー条件は、1% BSA、1 mM EDTA、0.5 M NaHPO₄ (pH 7.2)、7% SDSを使用する65℃におけるハイブリダイゼーション、および(i)0.2×SSC、0.1% SDS；または(ii)0.5% BSA、1 mM EDTA、40 mM NaHPO₄ (pH 7.2)、1% SDSを使用する65℃を超える温度における洗浄を含む場合もある。高ストリンジェンシー条件の1つの態様は、6×SSCを使用して約45℃においてハイブリダイズさせる段階と、これに続く、0.2×SSC、0.1% SDSを使用する65℃における1回もしくは複数回の洗浄を含む。

ある態様では、本発明の単離された核酸分子は、極めて高いストリンジェンシー条件でハイブリダイズする。極めて高いストリンジェンシー条件の1つの態様は、0.5 Mリン酸ナトリウム、7% SDSを使用して65℃においてハイブリダイズさせる段階と、これに続く、0.2×SSC、1% SDSを使用する65℃における1回もしくは複数の洗浄を含む。

他のストリンジェンシー条件が当技術分野で周知であり、当業者であれば、さまざまな因子を操作して、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化することが可能なことを理解できると考えれられる。最終洗浄のストリンジェンシーを最適化することで、高い程度のハイブリダイゼーションを確実なものとすることができる。詳細な例については、Ausubel et al.、前記の2.10.1〜2.10.16ページ、およびSambrook et al. (1989、前記)のセクション1.101〜1.104を参照されたい。

ストリンジェントな洗浄は典型的には、約42℃〜68℃の温度で実施されるが、当業者であれば、他の温度がストリンジェントな条件に適切な場合があることを理解すると考えられる。最大ハイブリダイゼーション速度は、典型的には、DNA-DNAハイブリッドを形成するT_mの約20℃〜25℃以下で生じる。T_mが溶解温度、すなわち2つの相補的なポリヌクレオチド配列が解離する温度であることは、当技術分野で周知である。T_mを推定する方法は当技術分野で周知である(Ausubel et al., 前記のページ2.10.8を参照)。一般に、完全にマッチした2本鎖DNAのT_mは、以下の式によって概算値として推定することができる：

T_m=81.5+16.6(log₁₀ M)+0.41(%G+C)-0.63(%フォルムアミド)-(600/長さ)

式中、MはNa⁺の濃度であり、好ましくは0.01モル濃度〜0.4モル濃度の範囲であり；%G+Cは、総塩基数に対するパーセンテージとして表されるグアノシン塩基とシトシン塩基の合計であり、30%〜75%G+Cの範囲であり；%フォルムアミドは、フォルムアミド濃度の体積パーセントであり；長さはDNA 2本鎖中の塩基対の数である。2本鎖DNAのT_mは、ランダムなミスマッチ塩基対の数が1%増すごとに約1℃ずつ低下する。洗浄は一般に、高ストリンジェンシーの場合はT_m-15℃において実施され、中ストリンジェンシーの場合はT_m-30℃で実施される。

ハイブリダイゼーション手順の1つの例では、固定化されたDNAを含む膜(例えば、ニトロセルロース膜またはナイロン膜)を、標識プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液(50%脱イオン化フォルムアミド、5×SSC、5×デンハート液(0.1%フィコール、0.1%ポリビニルピロリドン、および0.1%ウシ血清アルブミン)、0.1% SDS、および200 mg/mL変性サケ精子DNA)を使用して、42℃で一晩ハイブリダイズさせる。次に、膜を対象に、2回の連続的な中ストリンジェンシーによる洗浄(すなわち2×SSC、0.1% SDSを使用する45℃における15分間と、これに続く、2×SSC、0.1% SDSを使用する50℃における15分間)と、これに続く、2回の連続的な高ストリンジェンシーによる洗浄(すなわち、0.2×SSC、0.1% SDSを使用する55℃における12分間と、これに続く、0.2×SSCおよび0.1% SDS溶液を使用する65℃〜68℃における12分間)を行う。

本発明の核酸分子は、VEGFタンパク質の発現を、対照細胞もしくは対照組織に対して約55%、65%、75%、85%、90%、95%、100%、またはこれ以上増加させ、例えば、分泌されるVEGFの量は、細胞を本発明の核酸分子で一般に約0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、または0.5μM〜約10μM、20μM、30μM、40μM、もしくは50μMの濃度で、および通常は約1μM未満の濃度で処理する場合は、約55%、65%、75%、85%、90%、95%、100%、もしくはこれ以上増加する。適切には、本発明の核酸分子は、動物細胞におけるVEGF(イソ型)の発現を効率的に高めることが可能であり、および/または、脊椎動物における管形成または血管成長を促進する能力を有する。

ある態様では、本発明の核酸分子は、核酸コンストラクト(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、もしくはアデノ関連ウイルス、またはレンチウイルスのベクターなどのウイルスベクターなどであるが、これらに限定されない発現ベクター)の形状をとる。いくつかの態様では、このようなコンストラクトは、上記の式(I)で表される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む転写物をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを保持する。プロモーターは、誘導的または構成的、および任意で、組織特異的なプロモーターの場合がある。プロモーターは例えば、ウイルス起源または哺乳動物起源の場合がある。いくつかの態様では、プロモーター-ポリヌクレオチドカセット(および任意の他の所望の配列)が、被験体のゲノム上の所望の部位における相同組換えを促進し、したがってポリヌクレオチドの染色体内発現を提供する領域に隣接する核酸コンストラクトを使用する。これについては例えば、Keller and Smithies, 1989. Proc Natl Acad Sci USA 86: 8932-8935を参照されたい。他の態様では、送達される核酸コンストラクトは、エピソームの状態で留まり、および内因性の遺伝子、またはサイレント遺伝子を誘導する。

1つの説明目的の態様では、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便かつ有効なプラットフォームを提供する。本発明の少なくとも1つの制御エレメントが発現され得るヌクレオチド配列を、当技術分野で周知の手法でベクターに挿入し、およびレトロウイルス粒子中にパッケージすることができる。次に、組換えウイルスを単離して、被験体に送達することができる。いくつかの説明目的のレトロウイルス系は、例えば米国特許第5,219,740号；Miller and Rosman, 1989, Bio Techniques 7: 980-990; Miller, A. D., 1990, Human Gene Therapy 1: 5-14; Scarpa et al., 1991, Virology 180: 849-852; Burns et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037；およびBoris-Lawrie and Temin, 1993, Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109に記載されている。

加えて、いくつかの説明目的のアデノウイルスベースの系についても説明する。宿主ゲノムに組込まれるレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは染色体外の状態で持続し、したがって、挿入変異誘発に関連するリスクを最小化する(例えばHaj-Ahmad and Graham, 1986,J. Virol. 57: 267-274; Bett et al., 1993, J. Virol. 67: 5911-5921; Mittereder et al., 1994, Human Gene Therapy 5: 717-729; Seth et al., 1994, J. Virol. 68: 933-940; Barr et al., 1994, Gene Therapy 1: 51-58; Berkner, K. L., 1988, Bio Techniques 6: 616-629；およびRich et al., 1993, Human Gene Therapy 4: 461-476を参照)。

さまざまなアデノ関連ウイルス(AAV)のベクター系が、ポリヌクレオチド送達用に開発されている。AAVベクターは、当技術分野で周知の手法で容易に構築することができる。これについては例えば、米国特許第5,173,414号および第5,139,941号；国際公開公報番号WO 92/01070およびWO 93/03769；Lebkowski et al., 1988, Molec. Cell. Biol. 8: 3988-3996; Vincent et al., 1990, Vaccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Carter, B. J., 1992, Current Opinion in Biotechnology 3: 533-539; Muzyczka, N., 1992, Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158: 97-129; Kotin, R. M., 1994, Human Gene Therapy 5: 793-801; Shelling and Smith, 1994, Gene Therapy 1: 165-169；ならびにZhou et al., 1994, J. Exp. Med. 179: 1867-1875を参照されたい。

または、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルスなどのアビポックスウイルスを、対象コード配列を送達するために使用することもできる。アビポックスベクターの使用は特に、ヒトおよび他の哺乳動物種で望ましい。というのは、アビポックス属のウイルスは、感受性のある鳥類種で生産的に複製が可能なだけであり、したがって哺乳動物細胞には感染しないからである。組換え型のアビポックスウイルスの作製法は当技術分野で周知であり、および、ワクシニアウイルスの産生に関して上述した遺伝的組換えを利用する。これについては例えば、WO 91/12882；WO 89/03429；およびWO 92/03545を参照されたい。

アルファウイルスベクターの任意のベクターを、米国特許第5,843,723号；第6,015,686号；第6,008,035号、および第6,015,694号に記載されているベクターなどの、本発明のポリヌクレオチド組成物の送達に使用することもできる。ベネズエラウマ脳炎(VEE)に基づく特定のベクターを使用することも可能であり、この説明目的の例は、米国特許第5,505,947号および第5,643,576号に記載されている。

さらに、Michael et al., J. Biol. Chem. 268: 6866-69, 1993；およびWagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6099-6103, 1992に記載されている、アデノウイルスのキメラベクターなどの分子結合体ベクターを、本発明における遺伝子送達に使用することもできる。

他の説明目的の態様では、レンチウイルスベクターを利用して、制御エレメントを発現するポリヌクレオチドを、選択された細胞または組織に送達する。典型的には、このようなベクターは、5'レンチウイルスLTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、1つまたは複数の対象遺伝子に機能的に連結されたプロモーター、第2の鎖のDNAの合成の起点、および3'レンチウイルスLTRを含み、レンチウイルスベクターは、核輸送エレメントを含む。核輸送エレメントは、対象コード配列の上流(5')または下流(3')のいずれかに位置してもよい(例えば、本発明の合成GagまたはEnvの発現カセット)。本発明では、例えば、HIV、HIV-1、HIV-2、FIV、BIV、EIAV、MVV、CAEV、およびSIVからなる群より選択されるレンチウイルスを含む、さまざまなレンチウイルスを使用することができる。レンチウイルスベクターの説明目的の例は、PCT公報番号WO 00/66759、WO 00/00600、WO 99/24465、WO 98/51810、WO 99/51754、WO 99/31251、WO 99/30742、およびWO 99/15641に記載されている。望ましくは、第3世代のSINレンチウイルスを使用する。第3世代のSIN(自己不活性化)レンチウイルスを販売する業者には、Invitrogen (ViraPower Lentiviral Expression System)などがある。レンチウイルスベクターの構築、トランスフェクション、回収、および使用の方法の詳細は例えば、http://www.invitrogen.com/Content/Tech-Online/molecular_biology/manuals_p-ps/virapower_lentiviral_system_man.pdfから入手可能な、Invitrogenのテクニカルマニュアル「ViraPower Lentiviral Expression SystemバージョンB 050102 25-0501」に記載されている。レンチウイルスベクターは、効率のよい遺伝子輸送法として受入れられつつある。生物安全性が改善されていることで、これらのベクターは、生物安全性レベル2(BL2)における使用に適したものとなっている。いくつかの安全性に関する特性が、第3世代のSIN(自己不活性化)ベクターに組み入れられている。ウイルスの3' LTR U3領域を欠くことで、完全長のウイルスRNAを転写できないプロウイルスが生じる。加えて、いくつかの不可欠な遺伝子群は、トランスに供給され、単回の感染および組込みのみ可能なウイルスストックが得られる。レンチウイルスベクターには、以下を含む、いくつかの利点がある：(1)広宿主性のエンベロープタンパク質を使用したベクターのシュードタイプ形成の検討によって、実質的に任意のタイプの細胞にベクターを感染させることが可能なこと；(2)ニューロンを含む、休止状態で有糸分裂後の分化した細胞への遺伝子送達が示されていること；(3)低い細胞毒性が、導入遺伝子送達系のなかで他に類を見ないこと；(4)ゲノムへのウイルスの組込みが、導入遺伝子の長期発現を可能とすること；(5)パッケージング能力(6〜14 kb)が、他のレトロウイルスベクター、またはアデノ関連ウイルスベクターよりかなり高いこと。この系の能力を示した最近の証明では、マウスの幹細胞に感染させて、生きた子孫の入手、生殖細胞系列への伝達、ならびにレポーターのプロモーター特異的な発現および組織特異的な発現を可能とするために、GFPを発現するレンチウイルスベクターが使用された(Ailles, L. E. and Naldini, L., HIV-1-Derived Lentiviral Vectors. In: Trono,D. (Ed.), Lentiviral Vectors, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 2002, pp. 31-52)。現行世代のベクターの例は、Loisらの総説の図2で概説されている(Lois,C., Hong,E. J., Pease,S., Brown,E. J., and Baltimore,D., Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentivirus vectors, Science, 295 (2002) 868-872)。

ある態様では、ポリヌクレオチドは標的細胞のゲノムに組み入れられる場合がある。この組込みは、相同組換え(遺伝子の置換)を介して特定の位置および方向における場合があるか、またはランダムな非特異的な位置に組込まれる場合がある(遺伝子の強化)。さらに別の態様では、ポリヌクレオチドは、細胞中に、DNAの明瞭なエピソームセグメントとして安定に維持される場合がある。このようなポリヌクレオチドセグメント、すなわち「エピソーム」は、宿主細胞の周期に独立して、または同期して、維持および複製を可能とするのに十分な配列をコードする。発現コンストラクトが細胞内に送達される様式、および細胞内においてポリヌクレオチドが留まる部位は、使用する発現コンストラクトのタイプに依存する。

4．送達様式
患者への核酸分子の送達は、直接的(すなわち、患者を核酸もしくは核酸含有ベクターに直接曝す)か、または間接的(すなわち、最初に細胞にインビトロで核酸を接触させた後に、患者に移植する)のいずれかの場合がある。これら2つのアプローチはそれぞれ、インビボまたはエクスビボの遺伝子治療として知られている。本発明の特定の態様では、核酸はインビボで直接投与され、インビボで発現されて、コード産物が産生される。これは、上述したように、核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、およびこれを、細胞内に存在するように(例えば、欠損型もしくは弱毒型のレトロウイルスベクター、または他のウイルスベクターを用いる感染による；米国特許第4,980,286号参照)投与する段階；微粒子銃を使用して裸のDNAを直接注入する段階(例えば「Gene Gun(登録商標)」; Biolistic, DuPont)；核酸を脂質でコーティングする段階；関連する細胞表面受容体/形質導入用薬剤を使用する段階；リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルに封入する段階；これを、デンドリマー状で、もしくは核内に入ることが知られているペプチドと結合させた状態で投与する段階；またはこれを、対象受容体を特異的に発現する細胞のタイプを「標的とする」ために使用可能な、受容体介在型のエンドサイトーシス(例えばWu and Wu, 1987. J Biol Chem 262: 4429-4432参照)の傾向があるリガンドに結合させた状態で投与する段階を含むが、これらに限定されない、当技術分野で周知の任意の数多くの方法で達成することができる。

本発明を実施する上で、遺伝子治療に追加的なアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、ウイルス感染、またはこれに類する方法で、遺伝子を細胞内にインビトロ組織培養で移すことを含む。一般に輸送法は、選択可能なマーカーの細胞への同時輸送を含む。次に細胞に、輸送された遺伝子を取り込んで発現している細胞の単離を容易にするために、選択圧(例えば抗生物質耐性)の下に配置する。次に、これらの細胞を患者に送達する。特定の態様では、結果として生じる組換え細胞のインビボにおける投与に先だち、核酸を細胞内に、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、対象核酸配列を含むウイルスベクターもしくはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体介在型の遺伝子輸送、マイクロセル介在型の遺伝子輸送、スフェロプラスト融合、およびレシピエント細胞の必要な発生学的および生理学的な機能が輸送によって確実に破壊されないようにする類似の方法を含むが、これらに限定されない、当技術分野で既知の任意の方法で導入する。これについては例えば、Loeffler and Behr, 1993, Moth Enzymol 217: 599-618を参照されたい。選択される手法は、細胞によって核酸が発現可能となるように、細胞内への核酸の安定な輸送を可能とすべきである。望ましくは、輸送された核酸は、細胞子孫に遺伝可能であり、かつ細胞子孫で発現可能である。他の態様では、輸送された核酸は、エピソームの状態で留まり、通常はサイレントな内因性の核酸の発現を誘導する。いくつかの態様では、結果として生じる組換え細胞は、上皮細胞(例えば皮下)への注入、組換え皮膚細胞の皮膚移植片としての患者への塗布、ならびに組換え血液細胞(例えば、造血幹細胞もしくは前駆細胞)、または肝細胞の静脈内注射を含むが、これらに限定されない、当技術分野で既知のさまざまな方法で患者に送達することができる。使用が想定される細胞の総量は、所望の作用および患者の状態などに依存し、かつ当業者であれば決定することが可能である。

遺伝子治療の目的で核酸を導入可能な細胞は、任意の望ましい、利用可能な細胞のタイプを含み、および異種(xenogeneic)、異種(heterogeneic)、同系(syngeneic)、または自家(autogeneic)の場合がある。細胞のタイプは、上皮細胞、内皮細胞、角質細胞、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞、および血液細胞などの分化した細胞、またはさまざまな幹細胞もしくは前駆細胞、特に胚性心筋細胞、肝臓幹細胞(国際特許公開WO 94/08598)、神経幹細胞(Stemple and Anderson, 1992, Cell 71: 973-985)、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られる造血幹細胞もしくは前駆細胞を含むが、これらに限定されない。好ましい態様では、遺伝子治療に利用される細胞は、患者にとって自己の細胞である。ある態様では、本発明は、本発明の核酸分子の、適切な宿主細胞への導入用に、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、小胞などの使用を想定している。特に本発明の核酸分子は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、またはナノ粒子などのいずれかに封入された状態で、送達用に製剤化することが可能である。

このような製剤は、本明細書に記載された核酸分子の薬学的に許容される製剤の導入に好ましい場合がある。リポソームの形成および使用は、一般に当業者に既知である。血清安定性および血中半減期が改善されたリポソームが開発されている(米国特許第5,741,516号参照)。さらに、潜在的な薬剤担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物のさまざまな方法の総説が存在する(米国特許第5,567,434号；米国特許第5,552,157号；米国特許第5,565,213号；米国特許第5,738,868号、および米国特許第5,795,587号)。

リポソームは典型的には、水性溶媒中に分散して、多層の求心性の二重層小胞(多重膜小胞(MLV)とも呼ばれる)を自然に形成するリン脂質から形成される。MLVは一般に25 nm〜4μmの直径を有する。MLVを超音波処理することで、コアに水溶液を含む直径が200Å〜500Åの範囲の小型単層小胞(SUV)が形成される。

例えば、特定の市販のトランスフェクション試薬DOTAP (Roche Diagnostics)、リポフェクチン(Lipofectin)、リポフェクタム(Lipofectam)、およびトランスフェクタム(Transfectam)を使用するリポソームの調製および使用は、当技術分野で周知である。リポソームを得るための他の方法は、センダイウイルスまたは他のウイルスの使用を含む。リポソーム法による、細胞へのオリゴヌクレオチドの輸送について開示した出版物の例には例えば、Meyer et al. [J. Biol. Chem. 273, 15621-7 (1998)], Kita and Saito [Int. J. Cancer 80, 553-8 (1999)], Nakamura et al. [Gene Ther. 5, 1455-61 (1998)] Abe et al. [Antivir. Chem. Chemother. 9, 253-62 (1998)], Soni et al. [Hepatology, 28, 1402-10 (1998)], Bai et al. [Ann. Thorac. Surg. 66, 814-9 (1998)、および同誌の考察(p.819-20)も参照], Bochot et al. [Pharm. Res. 15, 1364-9 (1998)], Noguchi et al. [FEBS Lett. 433, 169-73 (1998)], Yang et al. [Circ. Res. 83, 552-9 (1998)], Kanamaru et al. [J. Drug Target. 5, 235-46 (1998)]、およびこれらに含まれる参考文献などがある。リポソーム介在型のオリゴヌクレオチドの取り込みにおけるリポフェクチンの使用については、Sugawa et al. [J. Neurooncol. 39, 237-44 (1998)]に記載されている。融合誘導性の陽イオン-脂質-再構成インフルエンザウイルスエンベロープ(陽イオン性ビロゾーム)の使用については、Waelti et al. [Int. J. Cancer, 77, 728-33 (1998)]に記載されている。

上述の陽イオン性または陰イオン性の脂質剤は、細胞内へのオリゴヌクレオチドの取り込みを促進するように作用するだけでなく、細胞に取り込まれたオリゴヌクレオチドの安定性を改善もする。

または本発明は、本発明の核酸分子の、薬学的に許容されるナノカプセル製剤を提供する。ナノカプセルは一般に、化合物を、安定で、かつ再現性のある方法で包み込むことが可能である。細胞内ポリマーのオーバーロードに起因する副作用を避けるために、このような超微細粒子(サイズは約0.1μm)は典型的には、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計される。こうした要件に適合する、生物分解性のポリアルキル-シアノアクリレートのナノ粒子が本発明の使用に想定されており、および、このような粒子は、例えば米国特許第5,145,684号に記載された手順で容易に作製される。特に、ナノ粒子またはナノスフェアのいずれかを使用する標的細胞へのオリゴヌクレオチド送達法(Schwab et al., 1994; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(22): 10460-10464; Truong-Le et al., 1998, Hum. Gene Ther., 9(12): 1709-1717)も特に、動物への投与、および特にヒトへの投与用の、開示された組成物の製剤化に有用であると想定されている。

他の態様では、本発明は、典型的には、中心となる分岐状分子に連結された2つまたはそれ以上の核酸分子を含む本発明の核酸分子のデンドリマー製剤を提供する。「オリゴヌクレオチドデンドリマー」の作製法は一般に、当技術分野で既知である(例えば、米国特許第6,455,071号；米国特許第6,274,723号；Azhayeva et al., Nucleic Acids Res. 23: 1170-1176, 1995; Horn and Urdea, Nucleic Acids Res. 17: 6959-6967, 1989を参照)。「分岐状分子」は、モノマーまたはポリマーの場合があり、分岐状分子への連結は、共有結合の相互作用または非共有結合の相互作用を介することがある。したがって本発明のデンドリマーは例えば、ヌクレオシド誘導体(例えば、Azhayeva et al.、前記；Horn and Urdea、前記に記載)、またはホスホラミダイトシントン(例えば、Shchepinov et al., Nucleic Acids Res. 25: 4447-4454, 1997を参照)などの、共有結合で分岐状分子に連結された複数のオリゴヌクレオチドを含む場合がある。他の態様では、オリゴヌクレオチドは、非共有結合で、例えば、実質的に相補的な領域のハイブリダイゼーションによって、例えば核酸ポリマーなどの分岐状分子に連結される。例えば分岐状分子は、相補的塩基対合によって内部領域で連結され、および本発明の核酸分子との連結に利用可能な4か所の1本鎖領域を有する、2つの部分的に1本鎖の核酸の二量体である場合がある(例えば、米国特許第6,274,723号を参照)。

しかしながら本発明は、任意の特定の投与様式に制限されないか、または依存せず、その代わりに、核酸組成物のあらゆる送達様式を含むと理解される。

5．薬学的組成物
有効なものとするために、本発明の核酸分子は、本発明の薬学的組成物に含まれる場合も、細胞膜を透過できなければならない。一般にオリゴヌクレオチドは、特定の受容体と関連する、飽和可能な取り込み機構によって細胞膜を透過する能力を有する。オリゴヌクレオチドは1本鎖分子なので、膜内外における受動拡散を促す、ある程度の疎水性を有する。オリゴヌクレオチドが膜を透過する能力を改善するために、オリゴヌクレオチドに修飾を施すことができる。例えば、オリゴヌクレオチド分子を、任意で部分的に不飽和の脂肪族炭化水素鎖を含む官能基、およびカルボン酸基、エステル基、およびアルコール基などの、1つまたは複数の極性または荷電性の官能基に連結させることができる。またはオリゴヌクレオチドを、適切には膜指向性(menbranotropic)ペプチドであるペプチド構造体に連結することができる。このような修飾型オリゴヌクレオチドは、より容易に膜を透過し、これは、その機能に極めて重要であり、したがって、それらの活性を有意に高める可能性がある。パルミチル結合オリゴヌクレオチドについては、Gerster et al. [Anal. Biochem. 262, 177-84 (1998)]に記載されている。ゲラニオール結合オリゴヌクレオチドについては、Shoji et al. [J. Drug Target 5, 261-73 (1998)]に記載されている。ペプチド、例えば膜指向性ペプチドに連結させたオリゴヌクレオチド、およびこれらの作製については、Soukchareun et al. [Bioconjug. Chem. 9, 466-75 (1998)]に記載されている。分子を特定の細胞に向かわせる、および、このような細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込みを促進するアンチセンス分子または他の薬物の修飾については、Wang, J. [Controlled Release 53, 39-48 (1998)]に記載されている。

望ましいならば、本明細書に開示された核酸組成物は、例えば、タンパク質、もしくはポリペプチド、またはさまざまな薬学的に活性のある物質などの他の物質と組み合わせても投与可能であると理解されると考えられる。組成物が、少なくとも1つのVEGF発現促進核酸分子を含む限りにおいては、追加的な物質が標的細胞または宿主組織との接触によって有意な有害な作用を引き起こさないことを考えれば、含まれる可能性もある他の成分に本質的に制限はない。したがって、核酸分子は、特定の状況で必要とされるような、さまざまな他の物質とともに送達することができる。

薬学的に許容される添加剤および担体溶液の製剤化は当業者に周知であり、例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、および筋肉内への投与ならびに製剤化を含む、さまざまな治療措置において、本明細書に記載された特定の組成物を使用する、適切な投与量および治療措置の開発が進んでいる。

または、本明細書に開示された薬学的組成物は、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、またはさらには腹腔内に、または直接、例えば点眼により、例えば米国特許第5,543,158号、米国特許第5,641,515号、および米国特許第5,399,363号に記載された手順で標的器官に投与することができる。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と水を適切に混合することで調製することができる。分散剤も、グリセロール中、液体ポリエチレングリコール中、およびこれらの混合物中に、ならびに油中に調製することができる。保存および使用の一般的な条件では、これらの調製物は、微生物の成長を防ぐための保存剤を含む。

注射可能な使用に適した薬学的剤形は、無菌性の水溶液または分散液、および無菌性の注射液または分散液の即時調製用の無菌性粉末を含む(例えば米国特許第5,466,468号参照)。あらゆる状況において、このような形状は無菌性でなければならず、かつ容易なシリンジ充填性が存在する程度に液状でなければならない。これは望ましくは、製造および保存の条件で安定であり、ならびに、細菌および真菌などの微生物の混入作用を防がなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、これらの適切な混合物、および/または植物油を含む、溶媒または分散媒の場合がある。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、必要な粒径の維持によって(分散剤の場合)、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物を使用することでもたらされ得る。

例えば、水溶液による非経口的投与の場合、溶液には、必要であれば適切に緩衝作用をもたせるべきであり、かつ希釈液を最初に、十分な生理食塩水またはグルコースによって等張性とすべきである。このような特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に特に適している。これと関連して、利用可能な無菌性の水性溶媒が、本開示に鑑みて当業者に知られている。例えば、1つの用量は、1 mlの等張性NaCl溶液に溶解することが可能であり、および1000 mLの皮下注入液に添加するか、または、提案された注入部位に注入することが可能である(例えば"Remington's Pharmaceutical Sciences"、第15版の1035-1038ページおよび1570-1580ページを参照)。用量のいくつかの変形態様は、治療対象となる被験体の状態に応じて必然的に生じることになる。投与の施行者は、いかなる状況においても、個々の被験体に適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒトへの投与の場合、調製物は、治療関連製品を管轄する規制当局によって求められる、無菌性、発熱性、および全般的な安全性、ならびに純度の基準に適合させるべきである。

本明細書に開示された組成物は、中性または塩の状態で製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、酸付加塩(タンパク質の遊離アミノ基によって形成される)を含み、またこれは例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸によって生成される。遊離カルボキシル基によって形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機性基剤、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機性基剤に由来する場合もある。製剤化が完了すると、溶液は、投与剤形に適合した様式で、および治療的に有効な量が投与されることになる。製剤は、注射用溶液、薬剤放出カプセル剤などの、さまざまな投与剤形で容易に投与される。

経口投与に適した本発明の組成物は、所定量の活性成分をそれぞれ含むカプセル剤、小袋(sachet)、もしくは錠剤などの個別の単位として；粉末剤もしくは顆粒剤として；溶液、または水溶液もしくは非水溶液の懸濁物として；または水中油型の乳濁液もしくは油中水型の乳濁液として提示される場合がある。活性成分は、ボーラス、舐剤、またはペースト剤の形状も提示し得る。錠剤は、圧縮または成形によって、任意で1種類または複数の補助成分を使用して作製することができる。圧縮型錠剤は、適切な装置内で活性成分を、粉末または顆粒などの流動性剤形中に、任意で結合剤(例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤(例えば、グリコール酸ナトリウムデンプン、架橋ポビドン、架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース)、界面活性剤、または分散剤を混合して圧縮することで作製できる。成形錠剤は、不活性希釈液で湿らせた粉末状化合物の混合物を、適切な装置内で成形することで作製できる。錠剤は、任意でコーティングまたは溝付けが可能であり、および、含まれる活性成分の緩やかな放出または制御放出を可能とするために、例えば所望の放出プロファイルを得るために、さまざまな割合のヒドロキシプロピルメチルセルロースを使用して製剤化することができる。錠剤は任意で、胃以外では腸の一部における放出を可能とするために、腸溶コーティングが施された状態で提供される場合がある。

本発明の薬学的組成物は一般に、その浸透圧を調節する物質である緩衝剤、および任意で、当技術分野で周知の1つもしくは複数の担体、賦形剤、および/または添加物を、例えば、香、色、滑らかさなどを薬学的組成物に加える目的で含む。好ましい緩衝剤は、浸透圧が調整されたリン酸緩衝生理食塩水溶液(PBS)である。

担体は、デンプン、およびその誘導体、セルロース、およびその誘導体、例えば微結晶性セルロース、キサンタンガムなどを含む場合がある。潤滑剤は、水素化ヒマシ油などを含む場合がある。

いくつかの態様では、薬学的製剤は、担体を含まない製剤である。このような製剤は好ましくは、静脈注射および点眼を含む注射による投与に使用される。

本発明は、本発明の核酸分子または薬学的組成物を、処置を必要とする患者に投与する段階を含む、虚血状態の治療もしくは予防、または虚血関連組織損傷の緩和、予防、もしくは治療にも関する。

本発明が、容易に理解され、かつ実践的な作用を可能とすることを目的として、特定の好ましい態様を、以下の非制限的な実施例を用いて説明する。

実施例
実施例1
VEGF発現の調節
オリゴヌクレオチドS1、S2、S3、およびDS-085(「材料および方法」参照)をRPE 51細胞系列にトランスフェクトし、VEGFの翻訳および転写の作用を、それぞれELISAおよびRT-PCRで測定した。ELISA(図1)の結果、S1 (1073 pg mL^-1)とS2 (969 pg mL^-1)の両方が、非トランスフェクト対照(578 pg mL^-1)と比較して、VEGFタンパク質の有意な(p<<0.01)、約2倍の発現増加を促進することが判明した。オリゴヌクレオチドS3(593 pg mL^-1)は有意な作用を示さず(P>0.05)、トランスフェクション物質であるサイトフェクチン(cytofectin)は、VEGF発現のわずかな低下(508 pg mL^-1)に関与した。しかしながら、この結果は有意ではないことが判明した(p>0.05)。

血管内皮成長因子の調節
転写レベルにおけるVEGFに対する作用を調べるために、オリゴヌクレオチドS1、S2、S3、およびDS-085をトランスフェクトした細胞から全RNAを抽出し、続いてRT-PCRのテンプレートとして使用した(図2a)。PCR産物の濃度測定によって決定した、トランスフェクトした細胞のmRNAレベルのプロファイル(図2b)は、タンパク質濃度のプロファイルを反映していた。S1およびS2によるトランスフェクションは、トランスフェクションの24時間後において、非トランスフェクト対照と比較して、mRNAレベルの1.5倍の上昇に関与した。しかしながら、S1およびS2が関与するmRNAの増加は、タンパク質濃度の上昇に比例しないことが判明した。過去に報告されたオリゴヌクレオチドDS-085は、mRNAレベルを57.5%低下させ、これはタンパク質の減少に正比例する。この結果は、DS-085による発現抑制の機構が、S1およびS2によるタンパク質の発現上昇の機構とは異なるものであり、別個のものであることを意味する。S3オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションは、対照試料と比較して有意な作用を示さず、タンパク質濃度に関してはほぼ同等である。同様に、溶媒(サイトフェクチン(商標))のみによるトランスフェクションは、タンパク質の減少に関して見出されるものと同等の、VEGFのmRNAに若干の減少(5%)を生じ、およびサイトフェクチン(商標)と関連することが知られている若干の細胞毒性作用を反映している可能性がある(22)。

材料および方法
オリゴヌクレオチドの設計
ヒトVEGFの5'-UTR配列を対象に、潜在的な調節部位である可能性のあるホモプリン領域の存在を調べた。次に、ATG開始コドンから塩基対-265位〜-223位で指定されるホモプリンホモピリミジン配列のそれぞれによって先頭と最後の16残基を認識するように、センスのオリゴヌクレオチド1および2 (S1およびS2)を設計した。センスオリゴヌクレオチド(S3)は、センスオリゴヌクレオチド1に対して、すぐ5'側の16残基に対応し、これを対照として使用した。オリゴヌクレオチドDS-085については既に報告がある(Garrett, 2000)。オリゴヌクレオチドは、Proligo (Boulder, CO, USA)から入手し、およびホスホロチオエート(S)主鎖を用いて合成した。

インビトロオリゴヌクレオチドVEGF阻害アッセイ法
ヒト網膜色素上皮(RPE)細胞系列(RPE 51)を培養して成長させ、VEGFのタンパク質およびmRNAの産生に対する、さまざまなオリゴヌクレオチド配列の作用を評価するために使用した。細胞を2×6ウェルプレート(直径35 mm)に、約4×10⁵細胞/ウェルとなるように接種し、10%ウシ胎児血清、0.5%ストレプトマイシン、およびペニシリンを添加したダルベッコ改変イーグル培地で、37℃かつ5% CO₂で、80%コンフルエントになるまで成長させた。サイトフェクチン(商標)(Gene Therapy Systems, San Diego, CA, USA)を、オリゴヌクレオチドを細胞内に、最終濃度が1μMとなるように送達するために製造業者の指示書通りに使用した。対照群は、オリゴヌクレオチドを差し引いたサイトフェクチンをトランスフェクトした細胞、およびこのように操作されなかった非処理細胞からなるものとした。トランスフェクション後に、プレートの1枚をCO₂インキュベーター内に移し、通常酸素条件で5% CO₂で成長させた。他のプレートは、低酸素インキュベーター(2% O₂, 5% CO₂)内に装填し、それぞれ24時間成長させた。

血管内皮成長因子の調節
この後、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)用に、通常酸素および低酸素で成長させた細胞の両方から培地を分取し、市販のキット(CYTELISATM, Cytimmune Sciences, Maryand, USA)を使用して、VEGFの発現レベルを決定した。ELISAは、製造業者の指示書に従って、100μLの未希釈培地を使用して実施した。各ウェルに由来する細胞をトリプシン処理して回収し、2000 gで5分間遠心して、ペレットを得た。細胞ペレットを等張性の生理食塩水で2回洗浄し、250μLの同液中に懸濁した。OD600の読み値を元に細胞密度を決定し、これをVEGF濃度を標準化するために用いた。

mRNAの転写のレベルはRT-PCRで決定した。600μLのTrizol(登録商標)(QIAGEN, Clifton Hill, Vic, Australia)で細胞を、トランスフェクションの24時間後に培養ウェル中で直接処理した。溶解懸濁物を微量遠心チューブに移し、これにクロロホルム(200μL)を添加し、および溶液が完全に混合するようにボルテックスミキサーで混合した。全RNAを含む水層を新しいマイクロ遠心チューブに移し、および1容量のイソプロパノールを添加してRNAを沈殿させた。20000 gで10分間遠心してRNAのペレットを得た後に、70%エタノールでRNAペレットを洗浄した。エタノールを吸引してペレットを風乾し、ヌクレアーゼを含まない200μLの水に再懸濁し、濃度を分光光度計で決定した。ファーストストランドcDNAを生成するために、Omniscript(商標) RTキット(QIAGEN)を、製造業者の指示書に従って、最終容量20μL中で、オリゴdTプライマーを用いて、200μgの全RNAから始めた。この反応物から直接1μLを分取し、内部対照として使用したβ-アクチン断片に加えて、内部VEGF断片のPCRのテンプレートとして使用した。VEGFのプライマーは、センスの

およびアンチセンスの

からなる。β-アクチンの増幅用に使用したプライマーは、センスの

およびアンチセンスの

からなる。両セットのプライマー(Proligo)を、25μLの最終容量中に、以下の反応成分とともに含めた；2.5μLの10×反応緩衝液、2 mM MgCl₂、200μMの各dNTP、6 pmolの各プライマー、および1単位のTth⁺ポリメラーゼ(Fisher Biotech, Perth, WA, Australia)。タッチダウンサイクリング反応を使用した。このサイクルは、94℃で2分間の初期変性段階と、これに続く94℃で10秒間を7サイクル；65℃で1サイクルごとに1℃ずつ下げながら10秒間；72℃で30秒間からなる。続いて94℃で10秒間；58℃で10秒間；71℃で30秒間を41サイクル行った。

試料の統計解析
統計解析のために、トランスフェクションを4セット実施した。結果を1元ANOVAと、これに続く99%の信頼限界のポストホックのTukey/Kramer解析を、GB-Stat(商標)統計ソフトウェアパッケージ(Dynamic Microsystems, Silver Springs, MD, USA)を使用して行った。

実施例2
インビボ解析
インビトロにおける観察を、インビボ作用に解釈し直せるか否かを判定するために、オリゴヌクレオチドをラットの目の前房に注入した。続いて行った眼科検査の結果、S1およびS2を注射した7日後に、ラットの目の虹彩に強い血管新生が認められた(図3)が、S3または媒体を注入したラットの目には作用は認められなかった。この結果は、オリゴヌクレオチドが、眼内におけるVEGFの発現上昇に関与し、かつ血管新生応答を示すことが可能であったことを意味する。

同様に、ラットの網膜下空間にS1およびS2を注入したところ、強い血管新生応答が、眼底写真撮影で認められた。血管新生は、注射部位から、ある程度の距離のある部位で生じており、明瞭なバンドとして網膜の内外で認められた(図4a)。フルオレセイン血管造影による、さらなる調査の結果、血管形成中における「漏出」性の血管に起因する高蛍光領域として現われる、新血管の形成が確認された(図4b)。加えて、フルオレセイン血管造影の結果、S1およびS2を注入した目に微小動脈瘤の存在が判明した(図4c)。注射の14日後に行った後の検査では、S1およびS2を注入した目に、カラー眼底写真撮影時には黒いスポットとして(図4d)、およびフルオレセイン血管造影使用時には低蛍光領域として現われる網膜内出血の発生が認められた(図4e)。これらの結果は、漏出、微小動脈瘤、および網膜内出血が、S1およびS2を注入した目で注入の7日後に認められた、網膜下注射後のマウスモデルで得られた結果と匹敵していた。S3を注入した目では、正常な外見が維持されていた。

材料および方法
注射およびインビボ解析
全ての動物実験は、Association for Research in Vision and Ophthalmologyの動物使用ガイドラインに準じて実施し、ウェスタンオーストラリア大学の動物倫理委員会の承認を得た。ケタミン(50 mg kg^-1体重)およびキシラジン(8 mg kg^-1体重)の筋肉内注射による麻酔後に、塩酸プロパラカインを目に局所塗布した、6週〜8週齢の非着色RCS-rdy⁺ラットを対象に、前房へのオリゴヌクレオチドの送達を実施した。側頭部角膜輪部(テンポラルリンバス)(temporal limbus)経由で各ラットの両目の前房に、5μLのハミルトンシリンジに装着した32ゲージの針を用いて、2.5μlの1 mMオリゴヌクレオチド溶液または媒体(10%グリセロールを含むPBS)を、同容積の体液を抜き去り後に注入した。注入の7日後に目の眼科検査を行い、細隙灯カメラで撮影した。

8週〜9週齢の非着色RCS/rdy⁺ラット、および同齢のC57 Black C6Jマウスを対象に網膜下注射を実施した。使用した注射の手法は、文献に記載されている(21)。簡単に説明すると、結膜を角膜輪部の近傍で切開して強膜を露出させ、次に30ゲージの針で孔を開けた。手術用顕微鏡で観察しながら、32ゲージの針を、この穴に接線方向に通した。2μlのオリゴヌクレオチドを、それぞれの目の網膜下空間に注入した。針を網膜下空間に1分間とどめ、緩やかに抜き取り、および抗生物質含有軟膏を創傷部位に塗布した。

実施例3
配列比較
ウシ、マウス、およびヒトを対象とした、VEGFの5'-UTR配列の種間比較の結果、S1〜S2領域が、ヒトとウシ間では高レベルで保存されていることが判明したが、マウスの5'-UTRはS1配列(図5a)を完全に欠くことが判明した。ラットの5'-UTRに関する配列情報はないので直接比較を行うことはできない。ヒトVEGF遺伝子の5'-UTRおよび3'-UTRの両方について、さらに調査を行ったところ、不安定化エレメントとして複数の潜在的な部位の存在が判明した(図5b)。

実施例に関する考察
インビボにおけるVEGFの制御的調節は、多くの組織および細胞のタイプの健康を維持する上で重要である。しかしながら、虚血状態と関連したVEGFのレベルの上昇は、癌性組織における血管形成を促進することに加えて(25, 26)、糖尿病性網膜症および未熟児の網膜症(23, 24)を含む、さまざまな血管原性の眼疾患に至る。VEGFの調節の中心は、5'-UTRおよび3'-UTRの両方の存在である。このいずれも、安定化エレメントおよび不安定化エレメント(9)に加えて、低酸素応答エレメント、およびグルコース応答エレメント(27)を含む多くの調節エレメントを含む。本研究では本発明者らは、不安定化タンパク質の標的部位として作用する可能性のある、ヒトVEGF遺伝子の5'-UTR内における新しい制御エレメントの発見について、その調節に関するさらなる知見の提供とともに報告する。

VEGF遺伝子の5'-UTR内の潜在的調節領域に似せるように、2種類のセンスオリゴヌクレオチド(S1およびS2)を設計した。第3のオリゴヌクレオチド(S3)を対照として設計し、およびS1のすぐ5'側の16残基にマップされた。インビトロ試験の結果から、S1およびS2が、タンパク質産生の2倍の増加に関与し、およびmRNAの翻訳の最大1.5倍の増加に関与することが判明した。この結果は、S1およびS2に代表される5'-UTRの配列が、VEGF産生の調節に関与する調節エレメントを含むことを意味する。S1およびS2によるVEGFタンパク質の発現増加のあり得る機構は、mRNA不安定化タンパク質か、または転写リプレッサータンパク質のいずれかの競合阻害を含む。後者の場合、転写リプレッサータンパク質については既に報告があり(19, 20)、S1およびS2中の配列に似た、ホモプリンの異型であるGA型配列のコンセンサスモチーフを認識するという共通のテーマを共有する。しかしながら、本発明者らの得たデータは、S1およびS2が、mRNA 不安定化タンパク質の認識部位をめぐって競合することを示唆している。DS-085によるVEGFの発現抑制には、mRNAの産生を阻害する、DNA鎖の3重鎖形成が関与する。したがって本発明者らは、mRNAの減少とタンパク質の減少の間に、比例的かつ直接的な関係の存在を見ている。仮に、発現増加の機構に、リプレッサータンパク質の阻害によるmRNA産生の増加が関与するのであれば、本発明者らは、タンパク質とmRNAとの間に、類似の比例的な増加を認めるであろう。しかしながら、これは、タンパク質が対照と比較して2倍増加する一方で、mRNAが、それぞれ1.5倍および1.25倍しか増加しないS1およびS2に関して実際には認められない。mRNAのレベルは、合成と分解との間に存在する平衡によって決定され、したがって、安定性の上昇は、分解を減じ、かつ、より高いレベルのmRNAが、合成の増加を伴わずに存在することをもたらす平衡のシフトを引き起こす。改善されたmRNA安定性、引いては半減期の延長は、mRNAの1分子あたりに産生される比例的に多くの量のタンパク質をもたらすであろう。加えて、mRNAの安定化/不安定化は、低酸素の期間中におけるVEGFタンパク質の増加と関連する機構であることが過去に報告されており(28)、およびトランスフェリン受容体(29, 30)、エラスチン(31)、およびレジスチン(32)などの他の細胞エレメントの調節に役割を果たすことが詳しく明らかにされている。

オリゴヌクレオチドがインビボでVEGFの調節に及ぼす作用を調べるために、齧歯類の目のモデルを選択した。VEGFのイソ型は全ての組織で同じため、目は、対象として魅力的な器官となる。というのは、VEGFのレベルの変化による目の血管新生に対する作用は、詳しく報告されているからである(33により総説されている)。加えて、目の血管系は、眼科検査で容易に調べることができる。ラットの目の前房に導入されると、虹彩における強い血管新生反応がS1とS2の両方について観察された。同様に、ラットおよびマウスの両方を対象としたS1およびS2の網膜下注入は、微小動脈瘤の形成、および新しい血管の成長に関連する漏出に加えて、類似の反応を網膜にもたらした。血管新生のこのようなパターンは、糖尿病性網膜症(35)の患者に加えて、VEGF導入遺伝子の発現の上昇を示す(34)齧歯類モデルでも観察できる。S3の注入では、インビトロ研究で認められたような、観察可能な反応は認められなかった。この結果は、S1およびS2の存在が、血管新生促進作用を有するVEGFタンパク質レベルの上昇に関与することを強く意味するものであった。加えて、新血管の長期に及ぶ発生および持続が、オリゴヌクレオチドの単回注射によって達成され、これは遺伝子治療の観点から理想的である。5'-UTRの公開配列との比較から、不安定化エレメントの存在が窺われる配列領域には、ある程度の変動があることがわかる。しかしながら、S1およびS2はいずれも、S1配列を欠くマウスモデルにおける反応に関与するので、以上の結果は、阻害が、S1とS2の両方に共通する、より短いコンセンサス配列に起因することの証拠となる。低酸素に対する反応は、6塩基対のコアコンセンサス配列からなる低酸素応答エレメント(HRE)の存在に依存する(36)。同様に、低レベルのグルコースは、グルコース応答エレメント(27)を介して関与してVEGFを増加させる可能性がある。S1およびS2はいずれも、不安定化タンパク質のコア認識配列を代表すると考えられるエレメント(T/A)GGGGを含む。ヒトVEGF遺伝子のさらなる検討の結果、複数のこのようなエレメントが、3'-UTRに加えて5'-UTRにも存在することが判明しており、不安定化エレメントを保持することも判明している(9)。多数の不安定化エレメントの存在は、分解速度を調節する効率的な手段となる可能性がある。すなわち、占有される部位が多くなるほど、分解の速度は速くなる。

本明細書に引用された、全ての特許、特許出願、および出版物の開示は、参照により、その全体が本明細書に組み入れられる。

本明細書における任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が、本出願に対する「先行技術」として利用可能であると認められたと解釈されるべきではない。

本出願の全体を通して、目的は、本発明を任意の1つの態様、または特定の一群の特性に制限することなく、本発明の好ましい態様を説明することである。したがって当業者であれば、本開示に鑑みて、例示された特定の態様に対して、さまざまな修正および変更が、本発明の範囲から解離することなく成され得ることを理解すると考えられる。このようなあらゆる修正および変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

参考文献

培養細胞の培養上清中のVEGFタンパク質の濃度を示すグラフ表示。S3はVEGFタンパク質の発現に有意な作用を有さなかったが、S1およびS2は2倍の増加に関与した。DS-085はVEGFタンパク質を、対照の50%未満に減少させた。さまざまなオリゴヌクレオチドの存在下および非存在下でインキュベートされた細胞から抽出されたVEGFのmRNAのRT-PCRによって得られた増幅産物のアガロースゲル電気泳動図を示す写真表示。β-アクチンは、安定に発現する遺伝子であり、VEGFのmRNAのレベルを標準化するために使用した。図2aに示した電気泳動図の濃度測定解析を示すグラフ表示。mRNAのレベルは、β-アクチンの発現レベルに対して標準化し、対照試料に対するパーセンテージとして表した。オリゴヌクレオチドを前房に注射した7日後のラットの目のスリットランプ写真表示。S1およびS2は強い血管新生反応に関与したが、S3が注入された目は、正常な表現型を保持した。 CFPおよびFA(それぞれfおよびg)の両方を使用した、S3が注入された目に血管新生が含まれず透明であることを示す写真表示。注射部位は、明瞭に視認可能なことがわかる(a、白色の矢印)。オリゴヌクレオチドS1およびS2を注射した7日後に、CFPによる明瞭な赤いバンド(c、黄色の矢印)として現われた血管形成が生じた。続くFAによって、新血管の漏出性に起因する過剰蛍光が明らかとなった(d、黄色の矢印)。注射の14日後に、CFPによる黒色のスポットとして現われた網膜内出血の発生が認められ(e、赤色の矢印)、およびFAによって低蛍光が認められた(f、赤色の矢印)。21日後には、網膜内出血がさらに発生し(g、青色の矢印)、低蛍光の大きな領域として認められる(h、青色の矢印)。複数の種の5'-UTRの配列アラインメント。ホモプリン領域(ボックス領域)を使用して、オリゴヌクレオチドS1、S2、およびS3を設計した。ATG開始コドンを太字で表示する。ヒトのVEGF遺伝子の5'-UTRおよび3'-UTR。不安定化エレメント((A/T)GGGG)の部位に下線を付す。

Claims

本質的に、以下の式で表される少なくとも1つのヌクレオチド配列からなる、単離された核酸分子：

式中、WはA、T、またはUであって；
A_nはnヌクレオチドの配列であって、nは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列A_nは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含み；ならびに
B_mはmヌクレオチドの配列であって、mは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列B_mは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含む。
A_nおよびB_mがそれぞれ、A、T、U、G、およびC、またはこれらの誘導体もしくは類似体から選択される、同じか、もしくは異なるヌクレオチドを含む、請求項1記載の核酸分子。
VEGFを発現する宿主細胞においてVEGFの発現を促進可能な、請求項1記載の核酸分子。
転写物を発現する宿主細胞においてVEGF遺伝子に由来する転写物の安定性を促進可能な、請求項1記載の核酸分子。
式(I)で表されるヌクレオチド配列の1つまたは複数のタンデムリピートを含む、請求項1記載の核酸分子。
以下の式で表される、請求項1記載の核酸分子：

式中、A_n、B_m、およびWは、式(I)で定義され、かつ
pは、2〜約20の整数である。
ヌクレオチド配列が、

の任意の1つから選択される、請求項1記載の核酸分子。
本質的に、

から選択される1つもしくは複数の配列からなる、請求項6記載の核酸分子。
本質的に、長さが少なくとも12〜約500ヌクレオチドであるVEGF転写物の非翻訳領域またはこの一部に対応する核酸配列からなる、請求項1記載の核酸分子。
核酸配列が、SEQ ID NO: 6および7から選択される、請求項1記載の核酸分子。
SEQ ID NO: 6および7から選択される核酸配列の一部に約90%の同一性を示し、かつこれに機能的に連結された転写物を不安定化することで、VEGFを発現する宿主細胞においてVEGFの量を増加させる配列を含む、請求項1記載の核酸分子。
式(I)で表される少なくとも1つの配列を含むオリゴヌクレオチドである、請求項1記載の核酸分子。
オリゴヌクレオチドが少なくとも約5ヌクレオチドを含む、請求項12記載の核酸分子。
オリゴヌクレオチドがSEQ ID NO: 9〜36の任意の1つから選択される、請求項12記載の核酸分子。
オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ耐性である、請求項1記載の核酸分子。
本質的に、式(I)で表される少なくとも1つのヌクレオチド配列からなる転写物をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、請求項1記載の核酸分子。
機能的にプロモーターに連結された、このようなポリヌクレオチドを含むコンストラクトである、請求項1記載の核酸分子。
請求項1記載の1つまたは複数の核酸分子、および任意で、薬学的に許容されるアジュバント、担体、または希釈剤を含む薬学的組成物。
以下の式で表される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む核酸分子を、VEGFを発現する宿主細胞に導入する段階を含む、VEGFの発現を促進するための方法：

式中、WはA、T、またはUであって；
A_nはnヌクレオチドの配列であって、nは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列A_nは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含み；ならびに
B_mはmヌクレオチドの配列であって、mは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列B_mは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含む。
状態に関連する組織であり、かつVEGFが発現され得る組織に、以下の式で表される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、組織におけるVEGFの発現または量を増加させる有効量の核酸分子を接触させる段階を含む、血管形成または血管新生の促進から利益を得る状態の症状を治療する、予防する、または改善するための方法：

式中、WはA、T、またはUであって；
A_nはnヌクレオチドの配列であって、nは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列A_nは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含み；ならびに
B_mはmヌクレオチドの配列であって、mは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列B_mは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含む。
状態が虚血状態である、請求項20記載の方法。
虚血状態が、脳虚血；腸虚血；脊髄虚血；心血管虚血；心筋梗塞と関連する心筋虚血；うっ血性心不全(CHF)と関連する心筋虚血、加齢性黄斑変性(AMD)と関連する虚血；肝虚血；腎虚血；皮膚虚血；血管狭窄によって誘導される組織虚血；持続勃起症の結果としての陰茎虚血；血栓塞栓症と関連する虚血；微小血管疾患と関連する虚血；および糖尿病性潰瘍、壊疽状態、外傷後症候群、心停止蘇生、末梢神経損傷、またはニューロパシーと関連する虚血からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
以下の式で表される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む核酸分子を、組織中における、VEGFの発現または量を増加させるために有効な量に従って組織に接触させる段階を含む、VEGFを発現可能な組織において血管形成または血管新生を増加させる方法：

式中、WはA、T、またはUであって；
A_nはnヌクレオチドの配列であって、nは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列A_nは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含み；ならびに
B_mはmヌクレオチドの配列であって、mは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列B_mは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含む。
組織が、脳組織、腸組織、脊髄組織、心筋組織、眼組織、肝組織、腎組織、皮膚組織、陰茎組織、創傷を含む組織、または移植組織から選択される、請求項23記載の方法。
以下の式で表される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む有効量の核酸分子を被験体に投与することで、被験体の血管形成または血管新生を増加させる段階を含む、被験体における血管形成または血管新生を増加させる方法：

式中、WはA、T、またはUであって；
A_nはnヌクレオチドの配列であって、nは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列A_nは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含み；ならびに
B_mはmヌクレオチドの配列であって、mは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列B_mは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含む。
以下の式で表される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、有効量の核酸分子を被験体に投与することで、虚血状態を治療するか、または組織損傷を緩和する段階を含む、被験体の虚血状態を予防する、もしくは治療する、または虚血関連組織損傷を緩和する、予防する、もしくは治療する方法：

式中、WはA、T、またはUであって；
A_nはnヌクレオチドの配列であって、nは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列A_nは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含み；ならびに
B_mはmヌクレオチドの配列であって、mは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列B_mは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含む。
血管形成または血管新生を増加させるための薬剤の製造における核酸分子の使用であって、該核酸分子が、以下の式で表される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む使用：

式中、WはA、T、またはUであって；
A_nはnヌクレオチドの配列であって、nは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列A_nは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含み；ならびに
B_mはmヌクレオチドの配列であって、mは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列B_mは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含む。
虚血状態を予防する、または治療するための薬剤の製造における核酸分子の使用であって、該核酸分子が、以下の式で表される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む使用：

式中、WはA、T、またはUであって；
A_nはnヌクレオチドの配列であって、nは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列A_nは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含み；ならびに
B_mはmヌクレオチドの配列であって、mは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列B_mは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含む。
虚血関連組織損傷を緩和する、予防する、または治療するための薬剤の製造における核酸分子の使用であって、該核酸分子が、以下の式で表される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む使用：

式中、WはA、T、またはUであって；
A_nはnヌクレオチドの配列であって、nは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列A_nは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含み；ならびに
B_mはmヌクレオチドの配列であって、mは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列B_mは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含む。
以下の式で表される少なくとも1つの配列を含むRNA不安定化エレメントをコードし、かつ異種ポリヌクレオチドに機能的に連結された配列を含む核酸コンストラクト：

式中、WはA、T、またはUであって；
A_nはnヌクレオチドの配列であって、nは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列A_nは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含み；ならびに
B_mはmヌクレオチドの配列であって、mは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列B_mは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含む。
以下の式で表される少なくとも1つの配列を含むRNA不安定化エレメントをポリヌクレオチドに機能的に連結させる段階を含む、ポリヌクレオチドから発現される転写物の安定性を低下させるための方法：

式中、WはA、T、またはUであって；
A_nはnヌクレオチドの配列であって、nは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列A_nは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含み；ならびに
B_mはmヌクレオチドの配列であって、mは0〜約11ヌクレオチドであって、かつ配列B_mは、任意のヌクレオチドから選択される、同じか、または異なるヌクレオチドを含む。