KR20150038531A - 췌장 베타 세포 형성의 생체내 유도를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

췌장 베타 세포 형성의 생체내 유도를 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명의 실시형태는, 베타 세포 생리학의 3개의 수준: (i) 포도당 대사, (ii) 막 수용체 기능, 및 (iii) 당뇨병 치료 목적을 위해 췌장에서의 베타 세포의 생체내 형성을 초래하는 전사 인자를 자극한다. 소정 양상에서, 당해 방법은, 세포 생리학의 3개의 수준: 대사, 막 수용체 기능, 및 유전자 전사의 통합을 포함한다. 세포 생리학의 다중 수준의 통합은, 베타 세포 형성에 대한 상승작용적 효과를 생성시킨다.

Description

췌장 베타 세포 형성의 생체내 유도를 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR IN VIVO INDUCTION OF PANCREATIC BETA CELL FORMATION}
우선권 주장
본 출원은, 본원에 전문이 인용에 의해 포함되는 2012년 7월 31일에 출원된 미국 가특허 출원에 대한 우선권을 주장하는 정규 출원이다.
서열목록에 대한 참조
37 CFR 1.821-1.825에 의해 요구되는 서열목록은 본 출원과 함께 전자적으로 제출된다. 서열목록은 본원에 인용에 의해 포함된다.
대부분의 의학적 약물 치료는 환원적 접근법: 하나의 세포 병리 생리학적 병태에 대해 하나의 분자를 사용하여 왔다. 환원적 접근법은 단일 유전자성 질환에 대해 성공적인 것으로 증명되었지만, 복합 질환에 대해서는 실패하였다. 의사들은, 1형 또는 2형 당뇨병과 같은 복합 장애를 치료하기 위해 접근법들의 조합이 요구됨을 인지하였다. 당뇨병에 대한 한 치료법은, 1922년 이래로 계속 존재하고 있는 인슐린 주사의 투여이다. 그러나, 인슐린 주사는 다수의 1형 및 2형 당뇨병 환자에서 당뇨 합병증(예를 들면, 망막병증, 신경병증, 신장병증, 심혈관 질환, 및 뇌졸중)의 발병을 저지하지 않는다. 이들 당뇨 합병증의 치료 비용은 막대하고, 당뇨 환자의 증가된 건강 관리 비용에 크게 기여한다.
생명의학 연구의 발전이 이루어져 왔지만, 과학자들 및 의사들은 여전히 당뇨병에 대한 효과적인 치료법을 찾고 있다. 소정 형태의 당뇨병에서, 베타 세포는 손상되거나, 결핍되거나, 고갈된다. 당뇨병의 잠재적 치료로는, 둘 다 이들의 한계를 갖는 약물-기반 치료요법 및 세포-기반 치료요법이 포함된다. 약물-기반 치료요법은 일반적으로 증상만을 치료하고, 환자는 이들 치료요법에 만성적으로 의존한다. 세포-기반 치료요법은 세포의 부족 및 이들의 공급원, 면역 거부, 및 높은 제조 및 분포 비용에 의해 방해된다.
세포-기반 치료요법은, 췌장 베타 세포 수 또는 베타 세포 기능의 감소가 원인이되거나 기여하는 당뇨병 및 다른 병태의 치료에 대한 하나의 접근법이다(D'Amour et al., Nature Biotech 24:1392-1401, 2006; Kroon et al., Nature Biotech 26:443-452, 2008). 다중 구성성분 칵테일(multicomponent cocktail)은, 베타 세포의 배아 전구체를 재생하기 위한 하나의 방법이고, 예를 들면, 줄기 세포 연구에서 전사 인자의 칵테일을 사용하거나(Eminli et al., Nature Genetics 41:968-976, 2009), 보다 최근에서 마우스에서 바이러스성 벡터 칵테일을 사용하였다(Zhou et al., Nature 455: 627-632, 2008). 일반적으로, 이들 세포는 포도당에 대한 이들의 반응으로 완전하게 발전되지는 않고, 상기 세포는 인슐린을 함유하고 인슐린을 발현하지만, 이들은 포도당의 존재시 또는 포도당 농도의 변화에 반응하여 인슐린을 분비하는데 실패한다.
따라서, 당뇨병을 치료하는 방법, 예를 들면, 대상체의 생체내에서 인슐린을 발현하고 분비하는 베타 세포를 생산하는 방법에 대한 필요성이 남아 있다.
요약
본원에 기술되어 있는 방법은 시험관내 또는 생체내 췌장 베타 세포 형성을 유도한다. 소정 양상에서, 상기 방법은, 배아 경로를 재현하기 위해 세포를 탈분화시키지 않고 성인 대상체에서의 췌장 베타 세포 형성을 유도한다. 추가의 양상에서, 상기 방법은, 각종 단계의 분화에 존재하는 세포에서의 췌장 베타 세포 형성을 유도한다. 다른 양상에서, 상기 방법은, 베타 세포 형성을 유도하기 위해 시험관내에서 사용할 수 있다. 본원에 기술되어 있는 접근법의 소정 실시형태는, 구체적으로, 췌장의 배아 형성 프로세스(배아 형성 프로세스는 다중 췌장 내분비 세포 유형의 생성을 초래한다)를 재생하지 않는 췌장 베타 세포 형성의 후-배아(post-embryonic) 유도를 목표로 한다. 성인 대상체의 생체내에서 새로운 베타 세포를 생성하는 능력은, 1형 및 2형 진성 당뇨병, 및 다른 유형의 당뇨병을 지닌 환자의 치료를 위한 신규한 치료학적 접근법을 제공할 수 있다. 성인 대상체의 췌장 베타 세포의 수를 증가시키는 능력은, 당뇨병에 관해서 치료학적이고/이거나, 예방학적이고/이거나, 치유성일 수 있다.
소정 실시형태는, 베타 세포 생리학의 3개의 수준: (i) 포도당 대사, (ii) 막 수용체 기능, 및 (iii) 전사 인자를 조정하고 통합하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 소정 양상에서, 본원에 기술되어 있는 방법은, 췌장 베타 세포 형성의 후-배아 유도 프로세스를 목표로 한다. 배아 프로세스는 다중 내분비 세포 유형을 초래하므로, 본원에 기술되어 있는 후-배아 방법은 주로 또는 단지 베타 세포의 형성을 유도하도록 고안된다. 소정 양상에서, 베타 세포는, 기관 또는 조직, 예를 들면, 췌장에서 생체내에서 또는 검출가능한 수준의 다른 내분비 세포 유형(예를 들면, 글루카곤을 분비하는 알파 세포 또는 소마토스타틴을 분비하는 델타 세포)의 형성을 야기하지 않고 시험관내에서 형성된다. 본 발명자들은, 다른 췌장 내분비 세포 유형을 유도하지 않고 성인 대상체의 생체내에서 췌장 베타 세포 형성이 유도된다는 어떠한 보고도 아는 바가 없다. 성인 대상체의 생체내에서 베타 세포를 생성하는 이러하는 능력은, 1형 및 2형 진성 당뇨병, 및 다른 유형의 당뇨병을 지닌 환자의 치료를 위한 신규한 치료학적 접근법을 제공한다.
소정 실시형태는, 췌장 베타 세포 형성을 위해 세포내 표적을 조정하기 위해 유전자 전이 접근법을 사용한다. 다른 실시형태는, 유전자 전이 방법에 의해 조정된 세포 프로세스를 모방하는 치료학적 제제를 이용한다. 또 다른 실시형태는 유전자 전이 및 치료학적 제제의 조합을 이용한다.
소정 양상에서, 글루코키나제(GK)[GenBank 수탁 번호 NP_034422.2(GI:31982798) 또는 NP_000153.1(GI:4503951), 출원 제출일자로 이의 전체가 본원에 인용에 의해 포함됨], 이의 기능성 절편 또는 변이체, 또는 GK 활성의 활성인자는, 포도당 대사 속도를 증가시키기 위해 사용된다. 또한, GK 유전자(GenBank 수탁 번호 NG_008847.1 참조, 이는 본원에 인용에 의해 포함됨)로부터 전사된 다른 GK 핵산의 사용도 고려된다. 소정 양상에서, GK 효소 활성을 유지하는 GK의 변이체도 사용할 수 있다. 추가의 양상에서, 티로신 키나제 수용체 또는 티로신 키나제 관련 수용체 활성을 증가시키기 위해, 단백질 티로신 포스파타제 1B(PTB1B)의 억제제(예를 들면, 억제성 RNA, 안티-센스 DNA, 소분자 억제제 등)를 제공한다. 다른 추가의 양상에서, Pdx-1[GenBank 수탁 번호 NP_000200(GI:4557673), 출원 제출일자로 본원에 인용에 의해 포함됨], 이의 기능성 절편 또는 변이체, 또는 Pdx-1 활성의 활성인자를 제공하여, 베타 세포 형성에 관여하는 유전자를 표적화한다. 소정 양상에서, Pdx-1 전사 활성화 능력을 유지하는 Pdx-1의 변이체도 사용할 수 있다. 또한, Pdx-1 유전자(GenBank 수탁 번호 NG_008183 참조)로부터 전사된 다른 Pdx-1 핵산의 사용도 고려된다. 소정 양상에서, 목적하는 단백질을 암호화하는 핵산을 투여한다. 추가의 양상에서, 각각의 단백질 또는 억제제는, 개별적이고 별개인 발현 카세트 또는 발현 벡터에 포함된다. 다른 양상에서, 2개 이상의 단백질들이 단일 발현 카세트 또는 발현 벡터에서 암호화된다.
소정 양상에서, 베타 세포 유도제(들)가 췌장에 직접 투여된다. 소정 양상에서, 베타 세포 유도성 조성물(들)이 췌관을 통해 투여된다. 추가의 양상에서, 베타 세포 유도제는 경구 또는 혈관내 투여된다.
추가의 양상에서, 베타 세포 유도제(들)는 시험관내에서 세포에 투여된다. 소정 양상에서, 시험관내에서 처리된 세포는, 치료되는 대상체에 대해 이종성이거나 자가성인 세포이다. 한 양상에서, 자가성 세포를 환자로부터 단리하고, 유도제(들)를 투여하고, 이어서, 시험관내에서 처리된 세포를 환자에게 체내이식한다. 다른 양상에서, 이종성 세포를 수득하고, 유도제(들)를 투여하고, 이어서, 시험관내에서 처리된 세포를 환자에게 체내이식한다.
소정 양상에서, 기관, 조직, 또는 세포 표적은, 포도당 수준을 감지하여 인슐린을 분비하도록 유도될 수 있는 표적이다. 소정 양상에서, 표적 세포 또는 조직은, Glut 2 및/또는 글루코키나제의 발현; 프로인슐린의 발현; 및 프로인슐린을 개열시키기 위한 단백질 전환효소의 발현을 유도하거나 이들 발현에 대해 조작되는 능력을 나타낸다. 베타 세포의 2개 이상의 특성을 갖는 세포들은 사람 체내에 존재한다. 내장 K 세포는 이러한 세포의 한 예이다. 내장 K 세포는, Glut 2, 글루코키나제, 및 단백질 전환효소를 발현하므로, 인슐린 발현의 유도를 필요로 한다. 다른 예에서, 간 세포도 Glut 2 및 글루코키나제를 발현한다.
소정 실시형태는, 생체내에서 후-배아 췌장 세포로부터 베타 세포 형성을 유도하는 방법에 관한 것이다. 소정 양상에서, 상기 방법은, 생체내에서 췌장에, (i) 글루코키나제(GK) 수준 또는 화성을 증가시키는 제1 작용제, (ii) 티로신 수용체 키나제 활성을 증가시키는 제2 작용제, 및 (iii) Pdx-1 매개된 전사를 증가시키는 제3 작용제의 조합물을 제공함을 포함한다.
소정 양상에서, 제1 작용제는, 글루코키나제를 암호화하는 핵산이다. 글루코키나제를 암호화하는 핵산은 바이러스성 벡터 내에 포함될 수 있다. 소정 양상에서, 바이러스성 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 다른 핵산 전달 벡터 또는 입자이다. 핵산은 암호화 서열의 3'에 전사 후 조절 요소, 예를 들면, 우드척(woodchuck) 간염 바이러스(WPRE)의 전사 후 조절 요소를 포함할 수 있다. 소정 실시형태에서, 단백질 형질도입 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 세포 또는 대상체에 투여할 수 있다. 소정 양상에서, 글루코키나제는, 단백질 형질도입 도메인을 포함하는 재조합 단백질 융합으로서 제공된다. 단백질 형질도입 도메인(PTD 또는 세포 투과성 단백질(CPP) 또는 막 전좌 서열(MTS: membrane translocating sequence))은, 전형적인 엔도사이토시스(endocytosis)와는 관계없이 세포에 훨씬 더 큰 분자를 수송할 수 있는 소형 펩타이드이다. 다수의 공지되어 있는 PTD들은, 내재화 전에 동일한 표면 분자(헤파란 설페이트 프로테오글리칸, HSPG)에 결합하고, 상기 내재화는 이들 분자들에 의존한다. 추가의 양상에서, 제1 작용제는 글루코키나제의 소분자 활성인자일 수 있다. 글루코키나제의 활성인자로는 R1440, RO0281675, RO4389620(피라글리아틴), LY2121260, PSN-GK1, 또는 GKA-50이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
소정 양상에서, 제2 작용제는 단백질 티로신 포스파타제 1B의 억제제이다. 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제제는 단백질 티로신 키나제 포스파타제 1B의 shRNA 억제제일 수 있다. 소정 양상에서, 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제제는, Wyeth Research Inc., 32D; 안티센스 ISIS-PTP1BRX; Abbott Laboratories, Inc., Isoxazole™; Abbott Laboratories, Inc., PTP1B의 발현을 하향조절하도록 고안된 안티센스 올리고뉴클레오타이드; Merck Frosst Center for Therapeutic Research, PTP1B 화합물 1 및 3의 선택적 억제제; Incyte Corporation, Inc., (S)-이소티아졸리디논((S)-IZD) 헤테로사이클릭 포스포티로신; 또는 Affymax, Inc., 트리아릴 설폰아미드계 PTP1B 억제제일 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
다른 추가의 양상에서, 제3 작용제는 베타 세포 선택적 전사 활성인자이다. 소정 양상에서, 전사 활성인자는, Pdx-1을 암호화하는 핵산이다. 소정 양상에서, 전사 활성인자는 세포 또는 대상체에 단백질 형질도입 도메인과의 재조합 단백질 융합으로서 투여된다. 소정 양상에서, 단독으로 또는 NeuroD, Isl1, Nkx6.1, 및/또는 Pax4 중 하나 이상과의 조합물로 사용되는 다른 전사 활성인자를 사용할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 화합물 트로글리타존은, Pdx-1 전사 활성화 대신에 또는 Pdx-1 전사 활성화와 함께 제공될 수 있다.
소정 양상에서, 제1 작용제, 제2 작용제, 및 제3 작용제는 단일 조성물로 제공된다. 다른 양상에서, 제1 작용제, 제2 작용제, 및 제3 작용제는 별도로 제공된다. 작용제들은 거의 동시에 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10분(들) 또는 시간(들) 투여 윈도우(window) 내에 투여될 수 있다. 소정 실시형태에서, 제1 작용제, 제2 작용제, 및 제3 작용제는 순차적으로 제공된다. 다른 실시형태에서, 제1 작용제, 제2 작용제, 및 제3 작용제는 동시에 제공된다. 소정 실시형태에서, 제1 작용제와 제2 작용제, 제1 작용제와 제3 작용제, 또는 제2 작용제와 제3 작용제는 동일한 작용제이다.
소정 양상에서, 제1 작용제, 제2 작용제, 및 제3 작용제는 췌장, 또는 다른 표적 기관 또는 조직에의 주사 또는 주입에 의해 제공된다. 추가의 양상에서, 췌장에의 주사 또는 주입은 췌관을 통한 것이다.
다른 실시형태는, 생체내에서 췌장 또는 다른 기관 또는 조직에, 상기 기술된 작용제를 포함하는 치료학적 조성물을 제공함을 포함하는, 당뇨병의 치료 방법을 포함한다. 소정 양상에서, 상기 치료학적 조성물은, (i) 기능성 글루코키나제 단백질을 발현하도록 구성된 글루코키나제 발현 카세트, (ii) 티로신 포스파타제 1B 억제제, 및 (iii) 기능성 Pdx-1 단백질을 발현하도록 구성된 Pdx-1 발현 카세트를 포함하고, 여기서, 췌장 베타 세포가 유도된다. 추가의 실시형태에서, 화합물 트로글리타존은 Pdx-1과 함께 제공될 수 있다.
소정 실시형태는, 환자에 대해 이종성인 표적 세포를 수득하거나 환자로부터 자가성 표적 세포를 단리하는 것, 및 시험관내에서 세포에, 상기 기술된 작용제를 포함하는 치료학적 조성물을 제공하는 것을 포함하는, 당뇨병의 치료 방법을 포함한다. 소정 양상에서, 치료학적 조성물은, (i) 기능성 글루코키나제 단백질을 발현하도록 구성된 글루코키나제 발현 카세트, (ii) 티로신 포스파타제 1B 억제제, 및 (iii) 기능성 Pdx-1 단백질을 발현하도록 구성된 Pdx-1 발현 카세트를 포함하고, 여기서, 췌장 베타 세포가 유도된다. 추가의 실시형태에서, 화합물 트로글리타존은 Pdx-1과 함께 제공될 수 있다. 상기 방법은, 환자에게 처리된 표적 세포를 체내이식함을 추가로 포함한다.
소정 양상에서, 1개, 2개, 또는 그 이상의 핵산(즉, 유전자)을 사용할 수 있다. 소정 양상에서, 3개의 핵산을 사용한다. 추가의 양상에서, 1개, 2개, 또는 3개의 핵산은 1개 이상의 화학 작용제와 조합할 수 있다. 다른 추가의 양상에서, 표적 경로를 정적으로(positively) 또는 부적으로(negatively) 조정하는 화학 작용제는 핵산 없이 사용할 수 있다.
소정 실시형태에서, 화학 작용제 조합물로는, PTB1B의 화학 작용제 억제제와의 조합물로의 GK의 화학 작용제 활성인자 및/또는 Pdx-1의 화학 작용제 활성인자; 또는 PTB1B의 화학 작용제 억제제와의 Pdx-1의 화학 작용제 활성인자가 포함될 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
소정 실시형태에서, 핵산은 화학 작용제와의 조합물로 사용할 수 있다. 소정 양상에서, GK 유전자, PTB1B 억제성 핵산, 및/또는 Pdx-1 활성화 핵산 중 하나 이상은, 하나 이상의 화학 작용제 PTB1B 억제제, 화학 작용제 GK 활성인자, 및/또는 화학 작용제 Pdx-1 활성인자와의 조합물로 사용할 수 있다. 본원에서 아용되는 바와 같은 유전자는, 치료학적 핵산을 암호화하는 핵산, 예를 들면, GK 효소를 암호화하는 GK 유전자, 억제성 핵산을 암호화하는 PTB1B 유전자, 또는 Pdx-1 경로의 활성인자를 암호화하는 Pdx-1을 나타낼 수 있다.
작용제들의 각종 조합물로는, 화학 작용제 GK 활성인자(들) + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들); 화학 작용제 GK 활성인자(들) + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들) + 화학 작용제 Pdx-1 활성인자(들); 화학 작용제 Pdx-1 활성인자(들) + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들); GK 유전자 + PTP1B 유전자; GK 유전자 + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들); GK 유전자 + PTP1B 유전자 + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들); GK 유전자 + 화학 작용제 GK 활성인자(들) + PTP1B 유전자; GK 유전자 + 화학 작용제 GK 활성인자(들) + PTP1B 유전자 + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들); GK 유전자 + 화학 작용제 GK 활성인자(들) + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들); 화학 작용제 GK 활성인자(들) + PTP1B 유전자; 화학 작용제 GK 활성인자(들) + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들); 화학 작용제 GK 활성인자(들) + PTP1B 유전자 + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들); GK 유전자 + PTP1B 유전자 + Pdx-1 유전자; GK 유전자 + 화학 작용제 GK 활성인자(들) + PTP1B 유전자 + Pdx-1 유전자; GK 유전자 + 화학 작용제 GK 활성인자 (들) + PTP1B 유전자 + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들) + Pdx-1 유전자; GK 유전자 + 화학 작용제 GK 활성인자(들) + PTP1B 유전자 + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들) + Pdx-1 유전자 + 화학 작용제 Pdx-1 활성인자; GK 유전자 + 화학 작용제 GK 활성인자(들) + PTP1B 유전자 + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들) + 화학 작용제 Pdx-1 활성인자; 화학 작용제 GK 활성인자(들) + PTP1B 유전자 + Pdx-1 유전자; 화학 작용제 GK 활성인자(들) + PTP1B 유전자 + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들) + Pdx-1 유전자; 화학 작용제 GK 활성인자(들) + PTP1B 유전자 + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들) + Pdx-1 유전자 + 화학 작용제 Pdx-1 활성인자(들); 화학 작용제 GK 활성인자 (들) + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들) + 화학 작용제 Pdx-1 활성인자(들); 화학 작용제 GK 활성인자 (들) + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들) + 화학 작용제 Pdx-1 활성인자(들) + PTP1B 유전자; GK 유전자 + 화학 작용제 GK 활성인자(들) + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들) + 화학 작용제 Pdx-1 활성인자 (들); GK 유전자 + 화학 작용제 GK 활성인자(들) + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들) + PTP1B 유전자; GK 유전자 + 화학 작용제 GK 활성인자(들) + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들) + Pdx-1 유전자; Pdx-1 유전자 + PTP1B 유전자; Pdx-1 유전자 + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들); 화학 작용제 Pdx-1 활성인자(들) + PTP1B 유전자; 화학 작용제 GK 활성인자(들) + Pdx-1 유전자 + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들); 화학 작용제 Pdx-1 활성인자(들) + Pdx-1 유전자 + PTP1B 유전자; 화학 작용제 Pdx-1 활성인자(들) + Pdx-1 유전자 + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들); PTP1B 유전자 + 화학 작용제 GK 활성인자(들) + 화학 작용제 Pdx-1 활성인자(들); 화학 작용제 PTP1B 억제제(들) + Pdx-1 유전자 + GK 유전자; 화학 작용제 PTP1B 억제제(들) + Pdx-1 유전자 + PTP1B 유전자; 화학 작용제 PTP1B 억제제(들) + 화학 작용제 Pdx-1 활성인자(들) + GK 유전자; 화학 작용제 PTP1B 억제제(들) + 화학 작용제 Pdx-1 활성인자(들) + PTP1B 유전자; 화학 작용제 PTP1B 억제제(들) + 화학 작용제 GK 활성인자(들) + PTP1B 유전자; GK 유전자 + 화학 작용제 GK 활성인자(들) + Pdx-1 유전자 + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들); 화학 작용제 GK 활성인자(들) + Pdx-1 유전자 + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들) + PTP1B 유전자; GK 유전자 + Pdx-1 유전자 + 화학 작용제 Pdx-1 활성인자(들) + PTP1B 유전자; GK 유전자 + Pdx-1 유전자 + 화학 작용제 Pdx-1 활성인자(들) + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들); GK 유전자 + 화학 작용제 Pdx-1 활성인자(들) + PTP1B 유전자 + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들); GK 유전자 + 화학 작용제 GK 활성인자(들) + Pdx-1 유전자 + 화학 작용제 Pdx-1 활성인자(들) + PTP1B 유전자; GK 유전자 + 화학 작용제 GK 활성인자(들) + Pdx-1 유전자 + 화학 작용제 Pdx-1 활성인자(들) + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들); GK 유전자 + Pdx-1 유전자 + 화학 작용제 Pdx-1 활성인자(들) + PTP1B 유전자 + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들); Pdx-1 유전자 + 화학 작용제 Pdx-1 활성인자(들) + PTP1B 유전자 + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들); 또는 Pdx-1 유전자 + PTP1B 유전자 + 화학 작용제 PTP1B 억제제(들) + GK 유전자가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
소정 실시형태에서, 단일 작용제는, (i) 글루코키나제 활성을 정적으로 조정하고, 티로신 키나제 수용체 활성 및/또는 티로신 키나제 관련 수용체 활성을 정적으로 조정하거나; (ii) 글루코키나제 활성을 정적으로 조정하고, 베타 세포 특이적 전사를 정적으로 조정하거나; (iii) 티로신 키나제 수용체 활성 및/또는 티로신 키나제 관련 수용체 활성을 정적으로 조정하고(예를 들면, PTB1B를 억제하고), 베타 세포 특이적 전사를 정적으로 조정할 수 있다.
소정 양상에서, 화학 작용제 GK 활성인자(들)는, 포도당 대사 속도를 증가시키고 Pdx-1 매개된 유전자 발현을 증가시키는 2 수준으로 작용할 수 있다. 화학 작용제 GK 활성인자(들)와의 조합물로의 화학 작용제 PTB1B 억제제(들)는, 본원에 기술되어 있는 3개의 경로들의 각각을 표적으로 할 수 있다.
소정 양상에서, II형 당뇨병과 같은 질환 상태에서, 화학 작용제 PTP1B 억제제(들)는 인슐린의 존재시 티로신 키나제 수용체 수준 및 GK 수준 둘 다에 작용할 수 있다. 소정 양상에서, GK 활성인자(들)는 포도당 대사 및 Pdx-1 매개된 전사 활성화를 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 로시글리타존은 GK 및 Pdx-1 매개된 효과의 발현을 증가시킨다. 인슐린 분비 역량(competence)과 조합하여 화학 작용제 PTP1B 억제제(들)는 포도당 대사를 증가시키고 티로신 키나제 수용체 활성을 증가시킬 수 있다. 또한, 로시글리타존과 같은 PPAR-감마 활성인자(들)의 패밀리는 GK 발현 및 Pdx-1 발현을 증가시키다. 따라서, 단일 작용제를 투여하여 다중 표적 경로를 조정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "표적 세포" 및 "표적 세포들"은, 베타 세포 또는 베타 세포-유사 세포를 형성하기 위해 유도될 수 있는, 전구체 세포, 단리된 세포, 줄기 세포, 췌장 또는 다른 기관 또는 조직의 세포를 말한다. 세포는 베타 세포 또는 유도 전의 비-베타 세포일 수 있다. 전구체 세포는, 완전하게 분화되지 않은 세포이다.
본원에서 사용된 바와 같은 발현은 mRNA 수준(핵산 발현) 및/또는 단백질 수준(단백질 발현)을 말한다. 예를 들면, RT-PCR을 이용하여 mRNA를 검출하는데 적합한 올리고뉴클레오타이드는, 당해 분야에서 일상적인 기술을 이용하여 고안할 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 임의의 당해 분야-인지되어 있는 기술(예를 들면, 임의의 항체 기반 검출 기술)을 이용하여 단백질 발현을 평가할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료"는, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료학적 전략의 맥락에서 사용되는 경우, 질환 또는 장애의 증상들 중 하나 이상이 개선되거나 그렇지 않으면 이롭게 변경되는 임의의 방식을 의미한다. 본원에 사용되는 바와 같은 특정 질환 또는 장애의 증상들의 개선은, 본 발명의 조성물 및 방법에 의한 치료에 기인하거나 본 발명의 조성물 및 방법에 의한 치료와 관련될 수 있는 영구적이거나 임시적인, 지속적이거나 일시적인 임의의 경감을 말한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량" 및 "치료하는데 유효한"은, 의도된 효과 또는 생리학적 결과를 야기하기 위한 투여의 맥락 내에서 유효한 시간 동안(생체내 급성 또는 만성 투여, 및 주기적 또는 연속적 투여 포함) 이용되는 본원에 기술되어 있는 하나 이상의 화합물 또는 약제학적 조성물의 양 또는 농도를 말한다.
본 발명에서 사용하기 위한 하나 이상의 화합물, 또는 약제학적 조성물의 유효량은, 베타 세포 형성 또는 성숙, 예를 들면, 포도당-의존적 인슐린 분비 세포의 증가 또는 세포로부터의 포도당-의존적 분비의 증가를 촉진하는 양을 포함한다.
용어 "대상체"는 명세서 전체에서 본 발명의 방법에 따른 치료가 제공되는 동물, 사람, 또는 비-사람을 기술하는 것으로 사용된다. 소정 양상에서, 대상체는 사람이다.
용어 "제공하는"은, 이의 일반적인 의미 "사용하기 위해 공급하거나 비치하는 것"에 따라 사용된다. 몇몇의 실시형태에서, 단백질은, 단백질을 투여함으로써 직접 제공되고, 한편, 다른 실시형태에서, 단백질은, 단백질을 암호화하는 핵산을 투여함으로써 제공된다. 다른 실시형태에서, 억제제, 예를 들면, shRNA를 제공하여 세포에서의 단백질 수준을 감소시킬 수 있다. 소정 양상에서, 본 발명은, 치료학적 핵산, 펩타이드, 및/또는 소분자의 각종 조합물을 포함하는 조성물을 고려한다.
본 발명의 다른 실시형태는 본 출원 전체에서 논의된다. 본 발명의 한 양상에 관하여 논의되는 임의의 실시형태는 본 발명의 다른 양상에 적용되고, 그 반대로도 적용된다. 또한, 본 발명의 조성물 및 키트를 사용하여 본 발명의 방법을 달성할 수 있다.
특허청구범위 및/또는 명세서에서의 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우의 단어 "한" 또는 "하나"의 사용은 "1개"를 의미할 수 있지만, 또한, "1개 이상", "적어도 1개", 및 "1개 또는 1개 초과"의 의미와도 일치한다.
본 출원 전체에서, 용어 "약"은, 값이, 값을 측정하는데 사용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함함을 나타내기 위해 사용된다.
특허청구범위에서의 용어 "또는"의 사용은, 대안만을 언급하는 것으로 명확하게 나타내거나 대안들이 상호 배타적이지 않는 한, "및/또는"을 의미하기 위해 사용되지만, 본 개시는 대안만을 그리고 "및/또는"을 나타내는 정의를 지지한다.
본 명세서 및 특허청구범위(들)에서 사용되는 바와 같은 단어 "포함하는(comprising)"(및 "포함한다" 및 "포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 형태), "갖는"(및 "갖다" 및 "가지다"와 같은 갖는의 임의의 형태), "포함하는(including)"(및 "포함한다" 및 "포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 형태), 또는 "함유하는"(및 "함유한다" 및 "함유하다"와 같은 함유하는의 임의의 형태)은, 포괄적이거나 개방적이고(open-ended) 추가의 요소 또는 방법 단계들을 배제하지 않는다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 구체적 실시예들은, 본 발명의 정신 및 범위 내의 각종 변화 및 변형이 이러한 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 당해 분야 숙련가에게 명백해질 것이므로, 본 발명의 특정 실시형태를 나타내면서 설명의 방식만으로 제공된다.
하기 도면은 본 발명의 명세서의 일부를 구성하고, 본 발명의 소정 양상을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은, 본원에 나타낸 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1. 3개의 분자들을 포함하는 유도 칵테일을 이용하여 성인 췌장에서 생체내에서 췌장 베타 세포 형성을 유도하는 접근법의 한 예.
도 2a 내지 도 2c. 렌티바이러스 작제물의 고안 및 유효성 검증을 실증함, (도 2a) 글루코키나제, (도 2b) Pdx-1, 및 (c) shRNA PTP1B.
도 3. PDX-1 및 GK의 생체내 과-발현, 및 CNIP 칵테일(Lenti-GCK + Lenti-Pdx-1 및 Lenti-shRNA PTP1B)에 의한 PTP1B 발현의 억제.
도 4. 위약 칵테일이 주사된 대조군 그룹과 비교한, 베타 세포 형성 칵테일이 주사된 마우스에서의 성체 췌장 조직에서의 단일 베타 세포 염색의 정량화.
도 5. 위약이 주사된 대조군 성체 마우스 그룹과 비교하여, 성체 마우스 췌장에서 증식이 유도된, 3개 분자들(GK, PTP1B 억제제, 및 Pdx-1)을 포함하는 베타 세포 형성 칵테일의 한 예.
도 6. 췌장 베타 세포 질량은, 위약이 주사된 대조군 성체 마우스 그룹과 비교하여, 베타 세포 형성 칵테일(GK, PTP1B 억제제, 및 Pdx-1)이 주사된 성체 마우스에서 유의하게 증가하였다. 인슐린 염색의 면역형광성 화상은 공초점 현미경을 이용하여 포획하였다. 베타 세포 및 총 췌장 면적은 Image J(NIH, Bethesda MD)로 정량하였다. 총 베타 세포 질량은, 췌장의 총 면적 중 백분율로서 나타낸 총 베타 세포 면적으로서 계산하였다.
도 7. 위약이 주사된 대조군 성체 마우스 그룹과 비교한, 베타 세포 형성 칵테일이 주사된 성체 마우스 그룹에서의 췌장 내의 베타 세포 클러스터의 수(클러스터 밀도)를 실증한다. 클러스터 밀도는, 췌장의 총 면적으로 나눈 베타 세포 클러스터의 수로서 결정되었다.
도 8. 위약이 주사된 성체 마우스 대조군 그룹과 비교한, 베타 세포 형성 칵테일(GK, PTP1B 억제제, 및 Pdx-1)이 주사된 성체 마우스 그룹에서의 공복 혈장 인슐린 농도를 실증한다.
도 9. 칵테일(Lenti-GCK + Lenti-Pdx-1 + Lenti-shRNA PTP1B) 또는 2개의 분자에 의한 또는 각각의 분자를 개별적으로 주사 4주 후 섬(islet) 및 외부분비 조직에서의 증식의 BrdU 마커. 당해 도면은, 200㎛로 분리된, 동물당 10개 섹션(각각의 그룹에 대해 n=3 내지 4)에서 실험된 췌장의 면적을 나타낸다. 그 결과는, 대조군과 비교한 BrdU-표지된 세포의 수의 배수-증가로서 나타낸다. 공초점 레이저 현미경을 분석에 사용하였다. Lenti = 렌티바이러스; GCK = 글루코키나제; PTP1B = 단백질-티로신 포스파타제 1B. 데이터는 평균 ± SE로서 나타낸다. *=p<0.001 CNIP 칵테일 대 대조군; =p<0.05 CNIP 칵테일 대 [GK + PTP1B]; # =p<0.01 [GK + PTP1B] 대 대조군.
도 10. 칵테일 대조군과, 그리고, 서로(각각의 그룹에 대해 n=3 내지 4) 비교한, 칵테일 CNIP(Lenti-GCK + Lenti-Pdx-1 + Lenti-shRNA PTP1B) 또는 2개의 분자에 의한 또는 각각의 분자를 개별적으로 주사 4주 후 베타 세포 질량. 각각의 섹션의 총 췌장 및 인슐린 양성 염색 면적은, Image J(NIH, Bethesda, USA)를 이용하여 측정하였다. 베타 세포 질량은, 췌장 조직 습윤 중량을 곱한, 모든 섹션의 총 췌장 면적에 대한 총 인슐린 양성 면적의 비로서 계산하였다. 당해 도면은, 200㎛로 분리된, 동물당 10개 섹션에서 실험된 췌장의 면적을 나타낸다. 공초점 레이저 현미경을 분석에 사용하였다. Lenti = 렌티바이러스; GCK = 글루코키나제; PTP1B = 단백질-티로신 포스파타제 1B. *=p < 0.001 CNIP 칵테일 대 대조군; p<0.001 CNIP 대조군 대 [GK + Pdx-1]; p<0.001 CNIP 칵테일 대 [PTP1B + Pdx-1];
Figure pct00001
=p<0.05 CNIP 칵테일 대 [GK + PTP1B]. # =p < 0.05 [GK + PTPIB] 대 [PTP1B + Pdx-1); p<0.05 [GK + PTP1B] 대 대조군. 데이터는 평균 ± SE로서 나타낸다.
본원에 기술되어 있는 소정 방법은, 한 세포의 제어 프로세스에 대한 한 분자의 과학적 원칙에 모순되는 개념을 나타낸다. 소정 양상에서, 당해 방법은 3개 수준의 세포 생리학: 대사, 막 수용체 기능, 및 유전자 전사의 통합을 포함한다. 다중 수준의 세포 생리학의 통합은 베타 세포 형성에 대해 상승작용적 효과를 생산한다. 상승작용은, 다중 분자들이 함께 작용하여 이들의 개별 효과의 총합보다 더 큰 효과를 생산함을 요구한다. 본원에 기술되어 있는 상승작용적 접근법을 이용하여, 본 발명자들은 성인 췌장에서 췌장 베타 세포 형성을 성공적으로 유도하였다. 성체 동물 및 사람의 생체내에서 베타 세포를 생성시키는 능력은, 1형 및 2형 진성 당뇨병의 치료에 대한 신규한 치료학적 접근법이다.
I. 당뇨병의 치료 방법
본 발명자들은, "Cellular Networking Integration & Processing(CNIP)"을 이용하여 성인 대상체의 생체내에서 췌장 베타 세포 형성이 증가될 수 있음을 입증하였다. CNIP 접근법에 따르면, 본 발명자들은 세포 프로세싱에서 3개의 주요 수준: (1) 첫째로, 세포내 탄수화물 대사의 수준에, (2) 둘째로, 막 수용체 기능의 수준에, (3) 셋째로, 유전자 발현의 수준에 개입한다. 3개의 수준들 모두를 표적으로 함으로써, 본 발명자는, 베타 세포 형성을 유도하는 상승작용적 상호작용을 생성시킬 수 있다. 본 발명자들은, 이러한 방법의 한 예를 "Syner-III"(Syner는 그리스 명칭 synergos로부터의 접두사이고, III은 로마 숫자 3이다)로서 언급한다.
CNIP 접근법은, 성인 대상체에서의 베타 세포의 형성을 모방하고 배아 발달의 단계에서 세포를 재프로그래밍하지 않도록 고안된다. 본 발명자들은, 줄기 세포 연구에서 사용된 전사 인자의 칵테일 또는 마우스 모델에서 보다 최근에 사용된 바이러스성 벡터 칵테일(Zhou et al., Nature 455: 627-32, 2008)을 사용하여 발달의 배아 단계를 재생함으로써 베타 세포가 생성됨에 주목한다. 대조적으로, CNIP 접근법은, 성인 상태에서 작용하도록 고안되고, 3개의 수준의 세포 조절을 통합하여 베타 세포 형성을 유도하는 메커니즘을 이용한다.
본원에 기술되어 있는 방법은, 배아 경로를 재현하기 위해 세포를 탈분화시키지 않고 성인 대상체의 생체내에서의 췌장 베타 세포 형성을 유도한다. CNIP 접근법은, 췌장의 배아 형성 프로세스(배아 형성 프로세스는 다중 췌장 내분비 세포 유형의 생성을 초래한다)를 재생하지 않는 췌장 베타 세포 형성의 후-배아 유도를 목표로 한다. 성인 대상체의 생체내에서 새로운 베타 세포를 생성하는 능력은, 1형 및 2형 진성 당뇨병, 및 다른 유형의 당뇨병을 지닌 환자의 치료를 위한 신규한 치료학적 접근법을 제공할 수 있다. 성인 대상체의 췌장 베타 세포의 수를 증가시키는 능력은, 당뇨병에 관해서 치료학적이고/이거나, 예방학적이고/이거나, 치유성일 수 있다.
소정 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 조성물 및 방법은 췌장 이외의 다른 조직에 적용될 수 있다. 소정 양상에서, 본원에 기술되어 있는 조성물은 내장 내분비 K 세포에 전달될 수 있고, 혈당 상승에 반응하여 인슐린을 분비할 것인 인슐린-유사 베타 세포를 형성할 수 있다. 추가의 양상에서, 본원에 기술되어 있는 조성물은, 간에 전달되어 포도당에 반응하는 베타 세포의 형성을 유도할 수 있다. 또 다른 양상에서, 본원에 기술되어 있는 조성물은, 줄기 세포 분화의 마지막 단계 및/또는 탈분화에 적용되어 베타 세포를 형성할 수 있다. 소정 양상에서, 본원에 기술되어 있는 조성물은, 체내의 각종 세포 및/또는 조직에 전달되어 베타 세포를 형성할 수 있으므로, 본원에 기술되어 있는 구체예에 한정되는 것은 아니다.
소정 실시형태에서, 표적 세포는 시험관내에서 처리된다. 표적 세포는, 베타 세포를 형성하는 능력을 갖거나 베타 세포를 형성하는 능력을 갖도록 유도될 수 있는 세포이다. 이러한 표적 세포를 제공하거나 수득하는 방법은, 당해 분야에 공지되어 있고, 표적 세포를 함유하는 조직을 제공하고 당해 분야에 공지되어 있는 방법에 의해, 예를 들면, 세포 표면 특이적 항체의 도움으로, 그리고, FACS(세포 분류기)를 이용하여 표적 세포를 단리하는 것, 또는 표적 세포의 성장을 가능하게 하는 특정 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함한다. 소정 양상에서, 적합한 표적 세포주가 존재한다(Lieber et al., Int J Cancer 15(5):741-47, 1975).
췌장 베타 세포로 분화할 수 있는 임의의 세포를 본 발명의 방법의 표적 세포로서 사용할 수 있다. 이들로는 사람 또는 동물(예를 들면, 포유동물) 조직으로부터 유도된 전구체 세포가 포함된다. 소정 실시형태에서, 표적 세포는 자가성 표적 세포이고, 즉, 이는, 치료되는 대상체의 세포와 동일한 유전적 정보를 함유한다. 소정 양상에서, 표적 세포는, 치료제가 투여되기 전에 유전적으로 변형되지 않았다. 소정 양상에서, 표적 세포는, 췌장 전구체 세포, 소장 전구체 세포, 간 전구체 세포, 췌관 집단으로부터 유도된 전구체 세포, 신경내분비 세포의 전구체, 및 췌장 줄기 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 이들로는 사람 또는 동물 조직으로부터의 체세포 분화된 세포 모두가 포함된다. 소정 양상에서, 표적 세포는, 간으로부터 체세포 분화된 세포, 내분비 내장 세포, 췌관 세포, 외분비 및 내분비 췌장 세포, 및 신경내분비 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일단 표적 세포가 수득되거나 제공되면, 세포는, 조직 배양 디쉬 및 6-웰, 24-웰, 또는 96-웰 플레이트와 같은 표준 세포 배양 시스템을 포함하는 시험관내 세포 배양 시스템에서 성장되고 조절될 수 있다. 배양 조건은 표적 세포에 의존할 것이고, 당해 분야 숙련가는 세포 배양 방법을 알 것이다.
A. 포도당 대사
포도당 대사는, 성인 췌장 또는 다른 기관 또는 조직에서의 베타 세포 형성 유도에 대한 CNIP 접근법에 있어서 제1 양상이다. 포도당은, 포유동물 세포에 의해 이용되는 주요 에너지 공급원이고, 포도당의 대사는 세포 기능 및 증식을 위한 에너지를 제공한다(Bohnsack and Hirschi, Annu Rev Nutr. 24: 433-453, 2004). 해당(glycolysis)의 억제는 세포 주기 진행을 정지시키고, 이는, 증식을 유도하는 것에 대한 포도당 대사의 필요성을 뒷받침한다(Newcomb et al., Eukaryot. Cell. 2:143-149, 2003). 생체내에서 췌장 베타 세포 형성을 유도하는 인자는, 포도당 대사에서의 증가를 포함한다(Bernard et al., FASEB J. 13:1195-1205, 1999; Alonso et al., Diabetes 56:1792-1801, 2007). 24h만의 기간 동안의 성체 래트에서의 포도당 주입은 베타 세포 수를 약 50%까지 증가시켰다(Bernard et al., FASEB J. 13:1195-1205, 1999). 또한, 포도당은, 시험관내에서의 구성요소 아폽토시스성 프로그램을 억제함으로써 베타 세포 생존을 촉진시킨다(Hoorens et al., J. Clin. Invest. 98:1568-1574, 1996). 포도당 대사는 췌장 베타 세포 형성의 유도를 위해 췌장을 준비시킨다.
소정 양상에서, 포도당 대사의 속도는, 글루코키나제를 암호화하는 핵산을 제공함으로써, 또는 글루코키나제 또는 다른 효소 또는 조절인자의 활성을 증가시킴으로써 증가된다. 소정 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 핵산에 부여되는 기능은, 포도당 대사를 증가시키는 각종 화학적 화합물 또는 소분자를 투여함으로써 제공될 수 있다. 글루코키나제 활성화 화합물로는, Roche Inc., 화합물 R1440; Hoffman-La Roche Inc., 화합물 RO0281675; Hoffman-La Roche Inc., 화합물 RO4389620(피라글리아틴); Eli Lilly Inc., 화합물 LY2121260; OSI Pharmaceuticals, Inc., 화합물 PSN-GK1; Astra-Zeneca, Inc., 화합물 GKA-50; Pfizer Inc., 국제 특허 공개 WO/2007122482에 기술되어 있는 글루코키나제 활성인자); Merck-Banyu Inc., 국제 특허 공개 WO/2003080585에 기술되어 있는 글루코키나제 활성인자; Takeda Inc., 국제 특허 공개 WO/200710434에 기술되어 있는 글루코키나제 활성인자); 및 Johnson & Johnson Inc., 국제 특허 공개 WO/2007075847에 기술되어 있는 글루코키나제 활성인자) 등이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
B. 수용체 티로신 키나제 및 티로신-키나제-관련 수용체
막 수용체 티로신 키나제(들) 및/또는 티로신-키나제-관련 수용체는, 성인 대상체에서 췌장 베타 세포의 형성을 유도하기 위한 CNIP 접근법의 제2 구성성분이다. 생리학적 자극에 따른 췌장 베타 세포의 생성에 있어서 제2 양상은, 이의 막 수용체를 통한 메세지(message)를 수신하기 위한 세포에 관한 것이다. 췌장 베타 세포 질량의 자극에 관여하는 막 수용체는 수용체의 티로신 키나제 패밀리 및 수용체의 티로신-키나제-관련 패밀리 유래이다. 임신 동안의 췌장 베타 세포 질량은, 인슐린 저항성의 발달 및 증가된 태아/태반 에너지 요구에 반응하여 증가하고, 이러한 효과는 증가된 프로락틴, 에스트로겐, 및 태반 락토겐 분비에 의해 매개된다(Heit et al., Annu. Rev Cell Dev. Biol. 22:311-338, 2006). 인슐린 분비를 증강시킴으로써 베타 세포를 보상하는 것의 실패는 임신성 당뇨병을 초래한다. 부검된 임신한 사람에서 섬 비대 및 베타 세포 과형성이 관찰되었다(Van Assche et al., Br. J. Obstet Gynaecol 85: 818-820, 1978). 췌장 베타 세포 질량을 증가시키는 임신 동안의 호르몬 자극(프로락틴, 에스트로겐, 및 태반 락토겐)은 티로신 키나제 관련 수용체를 통해 작용한다(Nielsen et al., Diabetes 50(Suppl. 1): S25-S29, 2001). 또한, 베타 세포 질량을 증가시키는 다른 호르몬은 수용체의 티로신 키나제 패밀리를 통해 작용하고, 간세포 성장 인자, 혈소판-유도된 성장 인자, 성장 호르몬, 인슐린, IGF-1 및 EGF를 포함한다(Nielsen et al., Diabetes 50(Suppl. 1): S25-S29, 2001). 중요하게도, 베타 세포 질량에 대한 이들 호르몬의 효과는, 또한, 포도당 대사에 의존한다. 포도당의 부재시, 티로신 키나제 패밀리를 통해 작용하여 췌장 베타 세포 질량을 증가시키는 호르몬의 능력은 상실된다(Cousin et al., Biochem. J. 344:649-658, 1999). 결과적으로, CNIP 접근법은, 포도당 대사의 효과 및 막 티로신 키나제(들) 및/또는 티로신-키나제(들) 관련 수용체를 조합하여 성인 췌장에서 베타 세포 형성을 유도한다.
소정 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 핵산에 부여되는 기능(들)은, 성인 췌장에서의 베타 세포 형성을 위한 티로신 키나제 수용체 및/또는 티로신-키나제(들) 관련 수용체 활성을 증가시키는 각종 화학적 화합물 또는 소분자를 투여함으로써 제공될 수 있다. 소정 양상에서, 억제성 핵산, 예를 들면, 안티-센스 DNA 또는 억제성 RNA 분자를 사용할 수 있다. 이러한 화합물로는, PTP1B 억제제 화합물, 예를 들면, Wyeth Research Inc., 32D; 안티센스 ISIS-PTP1BRX; Abbott Laboratories, Inc., 이소옥사졸; Abbott Laboratories, Inc., PTP1B의 발현을 하향조절하도록 고안된 안티센스 올리고뉴클레오타이드; Merck Frosst Center for Therapeutic Research, PTP1B 화합물 1 및 3의 선택적 억제제; Incyte Corporation, Inc., (S)-이소티아졸리디논((S)-IZD) 헤테로사이클릭 포스포티로신; 및 Affymax, Inc., 트리아릴 설폰아미드계 PTP1B 억제제 등이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
다른 shRNA 표적화 티로신 포스파타제 패밀리 단백질은 단독으로 또는 shRNA PTP1B와의 조합물로 포함될 수 있다. PTP1B는, 성인 췌장에서의 췌장 베타 세포 기능에 연루된 수용체의 티로신 키나제 패밀리의 대다수에 작용한다. 그러나, 세포내 단백질 포스파타제의 2개의 다른 구성원인 T-세포 단백질 티로신 포스파타제(TCPTP) 및 SHP-2는, 인슐린 신호전달에 연루된 수용체 티로신 키나제를 표적으로 하는 것으로 나타났다(Tonks, Nat Rev. Mol Cell Biol 7:833-46, 2006). SHP-2(SH2-도메인 함유 포스파타제-2)는, 2개의 아미노-말단 Src 상동성 2(SH2) 도메인을 함유하는, 편재 발현되는 세포내 단백질 티로신 포스파타제이다. SH2-2는, 티로신-인산화된 인슐린 수용체 및 IRS-1 둘 다에 결합한다. TCPTP는 2개의 형태: 세포질 세망(endoplasmic reticulum)-표적화된 48-kDa 형태(TC48) 및 핵 45-kDa 형태(TC45)로 존재한다. TC-PTP는, 인슐린 신호전달 및 프로락틴 수용체를 부적으로 조절하는 것으로 입증되었다(Aoki and Matsuda, J.Biol.Chem. 275:39718-26, 2000; Tonks, Nat Rev. Mol Cell Biol 7:833-46, 2006). 따라서, shRNA-SHP-2 및 shRNA-TC-PTP를 발현하는 핵산은, 본원에 기술되어 있는 방법 및 조성물에 사용할 수 있다.
C. 베타 세포 특이적 전사
CNIP 접근법에서의 제3 양상은, 유전자 발현의 수준에 관한 것이고, 성인 췌장에서 베타 세포를 형성하기 위해 글루코키나제, 및 티로신 키나제 수용체(들) 및 티로신 키나제 관련 수용체(들)에 의해 생성되는 포도당 대사 효과 및 대사/분자(metabolic/molecular) 효과를 모아 집중시키기 위한 어트랙터(attractor)로서 이용되는, 전사 활성인자 또는 전사 인자를 포함한다. 용어 "전사"는, 주형으로서 DNA를 이용하여 DNA-지시된 RNA 폴리머라제에 의해 일반적으로 수행되는, 유전자의 DNA 서열을 RNA 생성물에 복사하는 프로세스를 말한다. 모든 시스템은 물리학에서와 같은 조정성 어트랙터를 갖는다. 혼돈 시스템에서, 네트워크 종점의 방향은 어트랙터의 힘에 따를 것이다. 단순한 관점으로부터, 사출물(projectile)의 충돌(impact) 표적은, 공기 저항성과 조합된 초기 추진력 및 사출물에 대한 중력의 효과에 의존할 것이다. 초기 추진력, 공기 저항성 및 중력은, 어트랙터로서 상승작용적으로 작용하여 사출물의 최종 목적지를 위치결정할 것이다. 살아있는 유기체는, "혼돈" 상태로 존재하는 비선형 동력학적 시스템이다. 전사 수준에서, 유전자들의 세트의 발현은 변하지 않은 상태로 남아 있고, 이들 유전자들은 "하우스키핑(housekeeping)" 유전자라고 칭한다. 이들은 세포의 일상적 기능을 수행하고, 반면, 다른 클래스들의 유전자들은 환경적 자극에 반응하여 발현된다. 생리학적 스트레스에 대한 췌장 베타 세포의 적응에 있어서, 유전자 발현의 상향조절은 췌장 베타 세포 형성의 유도에 필수적이다(Bouwens and Rooman, Physiol Rev 85:1255-1270, 2005). 유전자 발현 수준에서의 생리학적 스트레스에 대한 이러한 적응 반응의 주요 매개인자는, 전사 인자의 형태로의 조정성 어트랙터(들)의 활성화에 관여한다(Albert and Barabasi, Rev Mod Physics 74:47-97, 2002; Albert and Othmer, J Theor Biol 223,1-18, 2003). 따라서, CNIP 접근법은, 생리학적 스트레스에 반응하여 성인 췌장에서 베타 세포를 형성하는 것에 연루된 (조정성 어트랙터로서의) 전사 인자(들)를 포함한다.
Pdx-1 과발현 단독은, 다른 TF들의 상승작용적 집중력과 함께 사용하여 CNIP 유전자 발현 패턴을 전하여 췌장 베타 세포 형성을 유도할 수 있었다. 따라서, 성인 췌장 베타 세포 형성에 연루되고 생체내 베타 세포 형성에 대한 Pdx-1의 효과를 증가시킬 수 있는 다른 TF들을, 본원에 기술되어 있는 방법에 사용할 수 있다. 소정 양상에서, 베타 세포 형성에 연루된 TF들을 사용할 수 있다. 다른 내분비 세포 형성에 연루된 TF들은 배제할 수 있다. Pdx-1과 조합물로 또는 Pdx-1 대신에 첨가된 후-발달 기간에서의 췌장 베타 세포 형성에 연루된 TF들로는 NeuroD, Isl1, Nkx6.1, 및 Pax4가 포함된다. 또한, 항-당뇨병성 화합물, 예를 들면, 항-당뇨병성 티아졸리딘디온(예를 들면, 트리글리타존)을, TF들과 함께 사용하여 베타 세포 형성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 트로글리타존은, Pdx-1 프로모터에서의 기능성 퍼옥시좀 증식인자-활성화된 수용체 감마(PPARγ) 반응 요소를 통해 마우스 섬에서의 Pdx-1 발현을 증가시킨다(Gupta et al., J Biol Chem. 283(47):32462-70, 2008). 또한, Pdx-1 유전자의 프로모터에서의 PPARγ 반응 요소의 정적 조정을 통한 Pdx-1의 유도도 고려된다.
D. 치료학적 조성물
소정 양상에서, 본원에 기술되어 있는 치료학적 모이어티 중 1개, 2개, 3개, 또는 그 이상은 하나 이상의 조성물에서 조합될 수 있거나, 조합물로 투여될 수 있다. 한 양상에서, 1개 이상의 치료학적 모이어티는 1개, 2개, 3개, 또는 그 이상의 핵 전달 벡터(들) 및/또는 치료학적 제제(들)의 칵테일로서 제공된다. 이러한 칵테일은, 본원에 기술되어 있는 바와 같이 경구, 국소, 또는 전신 투여될 수 있다.
추가의 양상에서, 치료학적 모이어티 중 2개, 3개, 또는 그 이상은 연결되어 2가, 3가 또는 4가 조성물을 생성할 수 있다. 이러한 조성물은, 본원에 기술되어 있는 바와 같이 경구, 국소, 또는 전신 투여될 수 있다. 소정 양상에서, 이러한 조성물은 경구 투여된다. 다른 양상에서, 상기 조성물은 국소적으로 주사되거나 주입된다.
다른 추가의 양상에서, 1개, 2개, 3개, 또는 그 이상의 치료학적 모이어티들은 화학적 적응 시스템에 의해 한 분자로 연결될 수 있다. 이러한 조성물은, 본원에 기술되어 있는 바와 같이 경구, 국소, 또는 전신 투여될 수 있다.
II. 핵산 조성물
용어 "핵산 벡터"는, 복제되고/되거나, 전사되고/되거나, 번역될 수 있는(즉, 발현될 수 있는) 세포에의 도입을 위해 핵산 서열이 삽입될 수 있는, 담체 핵산 분자를 나타내는 것으로 사용된다. 핵산 서열은 "외인성"일 수 있고, 이는, 상기 핵산 서열이, 벡터가 도입되는 세포와 이질성임을 의미하거나, 상기 서열은, 상기 서열이 통상적으로 발견되지 않는 숙주 세포 내에서의 위치를 제외한 세포에 대해 "내인성"임을 의미한다. 소정 양상에서, 외인성 벡터는 내인성 핵산을 암호화할 수 있다. 핵산 벡터로는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 게놈, 및 다른 발현 벡터(박테리오파지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 및 인공 염색체(예를 들면, YAC) 등이 포함된다. 본 개시를 고려해보면, 당해 분야 숙련가는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제하기 위한 준비를 잘 갖출 것이다(예를 들면, 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York., 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, New York City, NY, John Wiley & Sons, Inc., 1994]을 참조하고, 이들 문헌 둘 다는 본원에 인용에 의해 포함된다).
용어 "발현 벡터"는, 전사될 수 있는 RNA를 암호화하는 핵산을 포함하는, 임의의 유형의 유전자 작제물을 말한다. 몇몇의 경우에, RNA 분자는, 이어서, 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 다른 경우에, 예를 들면, 억제성 RNA, 안티센스 분자, 또는 리보자임의 생산시, 이들 서열은 번역되지 않는다. 발현 벡터는 다양한 "제어 서열"을 함유할 수 있고, 이는, 특정 숙주 세포에서의 작동가능하게 연결된 암호화 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 필요한 핵산 서열을 말한다. 전사 및 번역을 지배하는 제어 서열에 추가하여, 벡터 및 발현 벡터는, 본원에 기술되어 있는 다른 기능을 하는 핵산 서열도 함유할 수 있다.
소정 양상은, 베타 세포 유도 구성성분을 암호화하는 핵산의 사용을 포함한다. 핵산의 예로는, 서열번호 1 및 서열번호 4에 제공된 바와 같은 GK; 서열번호 2에 제공된 바와 같은 PTB1B shRNA; 및 서열번호 3에 제공된 바와 같은 Pdx-1; 또는 당해 분야의 숙련가에 의해 인지될 것인 등가물이 포함된다. 소정 양상에서, 핵산은, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 및/또는 서열번호 4와 80, 85, 90, 95, 98, 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 소정 실시형태에서, 본 발명의 핵산은, 서열번호 5(GK) 또는 서열번호 6(Pdx-1)의 단백질과 80, 85, 90, 95, 98, 또는 100% 동일하고 적절한 활성을 유지하는 단백질을 암호화한다.
서열들은, 단일 아미노산을 암호화하는 한편, 동일한 단백질 또는 폴리펩타이드를 여전히 암호화하는 몇몇의 상이한 코돈의 능력을 고려하여, 변형될 수 있다. 또한, 코돈 선택의 최적화는 발현에 사용되는 특정 유기체의 관점에서 착수할 수 있다.
A. 프로모터 및 인핸서
"프로모터"는, 전사의 개시 및 속도가 제어되는 핵산 서열의 영역인 제어 서열이다. 프로모터는, 조절성 단백질 및 분자가, 예를 들면, RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자들에 결합하여 핵산 서열의 특이적 전사를 개시할 수 있는 유전적 요소를 함유할 수 있다. 어구 "작동적으로 위치된", "작동적으로 연결된", "제어 하에" 및 "전사적 제어 하에"는, 프로모터가, 정확한 기능적 위치에 그리고/또는 핵산 서열과 관련된 배향으로 존재하여 전사적 개시 및/또는 당해 서열의 발현을 제어함을 의미한다.
프로모터는, 일반적으로, RNA 합성을 위한 출발 부위에 위치하는 기능을 하는 서열을 포함한다. 추가의 프로모터 요소는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 출발 부위의 업스트림(upstream)으로 영역 30 내지 110에 위치하지만, 프로모터의 수는, 출발 부위의 다운스트림에도 기능적 요소를 함유하는 것으로 나타났다. 프로모터"의 제어 하에" 암호화 서열을 가져오기 위해, 본 발명자는, 선택된 프로모터의 "다운스트림"(의 3')에 전사 판독 프레임의 전사 개시 부위의 5' 말단을 위치시킨다. "업스트림" 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고, RNA의 발현을 촉진시킨다. 프로모터 요소들 사이의 간격은 흔히 유연하여, 요소들이 서로에 대해 전환되거나 이동되는 경우에 프로모터 기능이 보존된다. 프로모터에 따라서, 개별 요소들은 상호협력하여 또는 독립적으로 기능하여 전사를 활성화할 수 있음이 밝혀진다. 프로모터는 "인핸서"와 함께 사용될 수 있거나 이와 함께 사용되지 않을 수 있고, 인핸서는, 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스(cis)-작용성 조절 서열을 말한다.
프로모터는, 암호화 절편 및/또는 엑손의 업스트림에 위치된 5' 비-암호화 서열을 단리함으로써 얻어질 수 있는 바와 같이, 핵산 서열과 천연적으로 회합되어 있는 것일 수 있다. 이러한 프로모터는, "내인성" 또는 "상동성"으로서 언급될 수 있다. 유사하게, 인핸서는, 당해 서열의 다운스트림 또는 업스트림 중 어느 하나에 위치된 핵산 서열과 천연적으로 회합되어 있는 것일 수 있다. 대안으로, 재조합, 외인성, 또는 이종성 프로모터의 제어 하에 핵산을 위치시킴으로써 소정 이점이 얻어질 것이고, 상기 프로모터는, 이의 천연 환경에서 핵산 서열과 보통 회합되어 있지 않은 프로모터를 말한다. 또한, 재조합 또는 이종성 인핸서는, 이의 천연 환경에서 핵산 서열과 보통 회합되어 있지 않은 인핸서를 말한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는, 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 다른 바이러스, 또는 원핵생물 또는 진핵생물 세포로부터 단리된 프로모터 및 인핸서, 및 "천연 발생"이 아닌, 즉, 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 발현을 변경하는 돌연변이를 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다.
자연히, 발현을 위해 선택된 세포소기관(organelle), 세포, 조직, 기관, 또는 유기체에서의 DNA 절편의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요할 것이다. 분자 생물학 분야의 숙련가들은, 통상적으로, 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서, 및 세포 유형 조합의 사용에 대해 알고 있다(예를 들면, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, vol. I. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 본원에 인용에 의해 포함됨]을 참조한다). 사용된 프로모터는, 도입된 DNA 분절의 높은 수준의 발현을 지시하기 위한 적절한 조건 하에서 구성요소이고/이거나, 조직-특이적이고/이거나, 유도가능하고/하거나, 유용하고, 예를 들면, 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대규모 생산에서 유리하다. 프로모터는 이종성 또는 내인성일 수 있다.
추가로, 임의의 프로모터/인핸서 조합(예를 들면, Eukaryotic Promoter Data Base EPDB, world-wide-web at epd.isb-sib.ch/에 따름)도 발현을 유도하기 위해 사용할 수 있다. T3, T7, 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 사용은 다른 가능한 실시형태이다. 진핵생물 세포는, 적절한 박테리아 폴리머라제가 제공되는 경우, 전달 복합체의 일부로서 또는 추가의 유전자 발현 작제물로서, 소정 박테리아 프로모터로부터의 세포질 전사를 지지할 수 있다.
소정 양상에서, 본 발명의 핵산은, 췌장 조직에서 특이적으로 발현될 것인 비-유도가능한 또는 유도가능한 프로모터를 포함할 수 있다. 이러한 비-유도가능한 프로모터로는 인슐린 유전자, 글루카곤 유전자, 아밀라제 유전자 등 유래의 조직-특이적 췌장 프로모터가 포함된다. 이러한 유도가능한 프로모터로는, 포도당 반응 요소의 제어 하의 췌장 특이적 프로모터, 또는 화학물질, 펩타이드, 리간드, 또는 대사물에 의해 유도가능한 반응 요소의 제어 하의 췌장 특이적 프로모터가 포함된다.
B. 개시 신호
또한, 암호화 서열의 효과적인 번역을 위해 특정 개시 신호가 요구될 수 있다. 이들 신호로는 ATG 개시 코돈 또는 인접한 서열들이 포함된다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 번역 제어 신호가 제공될 필요가 있을 수 있다. 당해 분야의 숙련가들 중 하나는, 이를 쉽게 결정하고 필요한 신호를 제공할 수 있을 것이다. 전체 삽입물의 번역을 확실히 하기 위해, 개시 코돈은 바람직한 암호화 서열의 판독 프레임과 함께 "프레임-내에" 존재하여야 한다는 것은 익히 공지되어 있다. 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연이거나 합성일 수 있다. 발현의 효율은, 적절한 전사 인핸서 요소를 포함시킴으로써 향상될 수 있다.
C. 다중 클로닝 부위
벡터는 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함할 수 있고, 다중 클로닝 부위는, 다중 제한 효소 부위를 함유하는 핵산 영역이며, 이들 중 임의의 것은 벡터를 소화하기 위한 표준 재조합 기술과 함께 사용할 수 있다. "제한 효소 소화"는, 핵산 분자의 특정 위치에서만 기능하는 효소를 이용한 핵산 분자의 촉매적 개열을 말한다. 다수의 이들 제한 효소는 상업적으로 입수가능하다. 이러한 효소의 사용은 당해 분야 숙련가들에게 널리 이해되어 있다. 흔히, 벡터는, 외인성 서열이 벡터에 라이게이션되도록 하기 위해, 선형화되거나, MCS 내에서 자르는 제한 효소를 이용하여 단편화된다. "라이게이션"은, 서로 인접할 수 있거나 서로 인접하지 않을 수 있는 2개의 핵산 단편들 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 프로세스를 말한다. 제한 효소 및 라이게이션 반응에 관여하는 기술들은 재조합 기술 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다.
D. 종결 신호
본 발명의 벡터 또는 작제물은 일반적으로 하나 이상의 종결 신호를 포함할 것이다. "종결 신호" 또는 "종결인자"는, RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사체의 특이적 종결에 관여하는 DNA 서열로 이루어진다. 따라서, 소정 실시형태에서, RNA 전사체의 생산을 종료시키는 종결 신호가 고려된다. 종결인자는, 생체내에서 바람직한 메세지 수준을 달성하는데 필요할 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위해 고려되는 종결인자로는, 본원에 기술되어 있는 전사의 임의의 공지되어 있는 종결인자, 또는 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 종결인자가 포함되고, 이들로는 종결 서열, 예를 들면, 소 성장 호르몬 종결인자, 또는 바이러스 종결 서열, 예를 들면, SV40 종결인자가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 소정 실시형태에서, 예를 들면, 종결 신호에는, 예를 들면, 서열 절단(sequence truncation)으로 인하여 전사가능한 서열 또는 번역가능한 서열이 결여되어 있을 수 있다.
E. 전사-후 조절 요소(PRE)
전사-후 조절은, RNA 수준에서의 유전자 발현의 제어, 즉, 유전자의 전사 및 번역 사이의 제어이다. 소정 양상에서, 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)를 사용한다. WPRE는 핵 전사의 수준을 증가시키고 RNA 배출을 가능하게 한다. WPRE는, RNA 프로세싱의 다른 단계를 가능하게 하여, 보통 핵 내에서 분해되는 RNA를 효과적으로 발현되도록 할 수 있다. 또한, WPRE는, 새롭게 합성된 전사체가 핵에서 분해되는 것으로부터 보호할 수 있는 RNA-단백질 복합체의 생성을 가능하게 하도록 기능할 수 있다. (Zufferey et al., Journal of Virology, 73: 2886-2892, 1999 및 미국 특허 6284469, 이들은 본원에 인용에 의해 포함된다).
F. 폴리아데닐화 신호
발현, 특히, 진핵생물 발현에 있어서, 본 발명자는, 전형적으로, 전사체의 적절한 폴리아데닐화에 영향을 미치는 폴리아데닐화 신호를 포함시킬 것이다. 폴리아데닐화 신호의 성질은, 본 발명의 성공적인 실행에 결정적인 것으로 생각되지 않고, 임의의 이러한 서열을 사용할 수 있다. 바람직한 실시형태는, 편리하고 각종 표적 세포에서 잘 기능하는 것으로 공지되어 있는, SV40 폴리아데닐화 신호 또는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 폴리아데닐화는 전사체의 안정성을 증가시킬 수 있거나, 세포질 수송을 가능하게 할 수 있다.
G. 복제의 기원
숙주 세포에서 벡터를 번식시키기 위해, 복제 부위의 하나 이상의 기원(종종 "ori"라고 칭함)을 함유할 수 있고, 이는, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열이다. 대안으로, 숙주 세포가 효모인 경우에는 자가 복제 서열(ARS)을 사용할 수 있다.
H. 선택가능한 마커 및 선별가능한 마커
본 발명의 소정 실시형태에서, 본 발명의 핵산 작제물을 함유하는 세포는, 발현 벡터에 마커를 포함시킴으로써 시험관내에서 또는 생체내에서 확인될 수 있다. 이러한 마커들은, 세포에 확인가능한 변화를 부여하여 발현 벡터를 함유하는 세포의 용이한 확인을 가능하게 할 수 있다. 일반적으로, 선택가능한 마커는, 선택을 가능하게 하는 특성을 부여하는 마커이다. 양성의 선택가능한 마커는, 마커의 존재가 이의 선택을 가능하게 하는 마커이고, 한편, 음성의 선택가능한 마커는, 마커의 존재가 이의 선택을 방지하는 마커이다. 양성의 선택가능한 마커의 한 예는 약물 내성 마커이다.
통상적으로, 약물 선택 마커의 포함은, 형질전환체의 클로닝 및 확인을 돕고, 예를 들면, 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신, 및 히스티디놀에 대해 내성을 부여하는 유전자들이 유용한 선택가능한 마커들이다. 조건의 이행에 근거하여 형질전환체의 식별(discrimination)을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커들에 추가하여, 그 근거가 비색 분석인 선별가능한 마커들, 예를 들면, GFP을 포함하는 다른 유형의 마커들도 고려된다. 대안으로, 선별가능한 효소들, 예를 들면, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)를 이용할 수 있다. 또한, 당해 분야 숙련가는, 면역학적 마커를, 가능하게는 형광성 보조된 세포 분류(FACS) 및/또는 면역조직화학과 함께 사용하는 방법을 알 것이다. 사용되는 마커는, 유전자 생성물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한, 중요한 것으로 생각되지 않는다. 선택가능한 마커 및 선별가능한 마커의 추가의 예는 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다.
III. 폴리펩타이드 조성물
폴리펩타이드의 아미노산 조성물에서 변형 및/또는 변화가 이루어질 수 있으므로, 본 발명은 폴리펩타이드의 서열에서의 변이, 및 이를 암호화하는 핵산을 고려하고, 그럼에도 불구하고, 여기서, 이들은 본 발명의 치료학적, 예방학적, 및 치유성 양상에 관한 실질적인 활성을 보유할 수 있다.
생물학적 기능성 등가물은, 별도의 서열을 함유하도록 조작된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 한편, 동시에 "야생형" 또는 표준 펩타이드를 암호화하는 능력을 보유할 수 있다. 이는 유전자 암호의 축퇴(degeneracy), 즉, 동일한 아미노산을 암호화하는 다중 코돈의 존재를 통해 달성될 수 있다. 한 예에서, 당해 분야 숙련가는, 폴리뉴클레오타이드에 제한 효소 인식 서열을 도입하는 한편, 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 능력을 방해하지 않는 것을 희망할 수 있다.
다른 예에서, 폴리뉴클레오타이드는, 보다 유의한 변화를 갖는 생물학적 기능성 등가물을 암호화할 수 있다. 소정 아미노산은, 상호작용성 결합 능력의 주목할만한 손실 없이, 예를 들면, 항체의 항원-결합 영역, 기질 분자 및 수용체 등 상의 결합 부위와 같은 구조를 갖는 단백질 구조에서 다른 아미노산에 대해 치환될 수 있다. 구조적 변화는, 고안된 기능을 수행하는 단백질의 능력에 나쁜 영향을 미치는 것이 아니므로, 소위 "보존적" 변화는 단백질의 생물학적 활성을 방해하지 않는다. 따라서, 본원에 개시되어 있는 유전자의 서열 및 단백질에서 각종 변화가 이루어지는 한편, 본 발명의 목표를 여전히 충족시킬 수 있음이 본 발명자들에 의해 고려된다.
기능성 등가물의 관점에서, "생물학적 기능성 등가물" 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 정의는, 분자의 정의된 부분 내에서 이루어질 수 있는 변화의 수에 대한 한계가 존재하는 한편, 등가의 생물학적 활성의 허용가능한 수준을 갖는 분자를 보유하는 개념에 고유함이 당해 분야 숙련가에 의해 잘 이해된다. 따라서, 생물학적 기능성 등가물은, 단백질(및 폴리뉴클레오타이드)로서 본원에서 선택된 아미노산(또는 뉴클레오타이드)이 치환될 수 있는 이들 단백질(및 폴리뉴클레오타이드)로서 정의된다. 소정 양상에서, 폴리펩타이드는, 폴리펩타이드의 야생형 형태와 80, 85, 90, 92 94, 96, 98, 또는 100% 동일하다. 소정 양상에서, 서열번호 5 또는 서열번호 6과 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98, 또는 100% 동일한 폴리펩타이드(들), 또는 이들을 암호화하는 핵산을 사용한다.
일반적으로, 분자의 길이가 짧을 수록, 기능을 보유하면서 분자 내에서 이루어질 수 있는 변화가 더 적다. 보다 긴 도메인은 중간 정도의 변화 수를 가질 수 있다. 전장 단백질은 보다 큰 수의 변화에 대해 최대 허용 오차를 가질 것이다. 그러나, 소정 분자 또는 도메인의 구조에 고도로 의존하는 소정 분자 또는 도메인이 변형을 거의 허용하지 않거나 전혀 허용하지 않음이 이해되어야만 한다. 폴리펩타이드의 기능은, 목적하는 폴리펩타이드의 활성을 검출하는 것으로 공지되어 있는 각종 검정을 사용함으로써 측정될 수 있다.
아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들면, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 및/또는 크기 등에 근거한다. 아미노산 측쇄 치환체의 크기, 형태 및/또는 유형의 분석은, 아르기닌, 리신, 및/또는 히스티딘이 모두 양으로 하전된 잔기이고/이거나; 알라닌, 글리신, 및/또는 세린이 모두 유사한 크기이고/이거나; 페닐알라닌, 트립토판, 및/또는 티로신은 모두 일반적으로 유사한 형태를 가짐을 밝혔다. 따라서, 이들 고려사항에 근거하여, 아르기닌, 리신, 및/또는 히스티딘; 알라닌, 글리신, 및/또는 세린; 및/또는 페닐알라닌, 트립토판, 및/또는 티로신이 생물학적 기능성 등가물로서 본원에 정의된다.
보다 정량적인 변화를 이루기 위해서, 아미노산의 친수성 지수를 고려할 수 있다. 각각의 아미노산에는, 이들의 소수성 및/또는 전하 특성에 근거하여 소수성 지수(hydropathic index)가 할당되었고, 이들은 하기와 같다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및/또는 아르기닌(-4.5).
단백질에 상호작용성 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 소수성 아미노산 지수의 중요성은 당해 분야에서 일반적으로 이해된다(Kyte & Doolittle, 1982, 본원에 인용에 의해 포함됨). 소정 아미노산은, 유사한 소수성 지수 및/또는 스코어를 갖고/갖거나 유사한 생물학적 활성을 여전히 보유하는 다른 아미노산에 대해 치환될 수 있음이 공지되어 있다. 지수에 근거한 변화를 제조함에 있어서, 소수성 지수가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고/하거나, ±1 이내인 아미노산의 치환이 특히 바람직하고/하거나, ±0.5 이내인 아미노산의 치환이 보다 더 특히 바람직하다.
또한, 당해 분야에서는 유사 아미노산의 치환이 친수성에 근거하여 효과적으로 이루어질 수 있음이 이해된다. 미국 특허 4,554,101에 상세히 설명되는 바와 같이, 하기 친수성 값이 아미노산 잔기들에 할당되었다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 유사한 친수성 값에 근거한 변화를 제조함에 있어서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고/하거나, ±1 이내인 아미노산의 치환이 특히 바람직하고/하거나, ±0.5 이내인 아미노산의 치환이 보다 더 특히 바람직하다.
소정 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 바와 같은 재조합 폴리펩타이드는 단백질 형질도입 도메인을 포함한다. 단백질 형질도입 도메인(PTD)은, 생물학적 막에 걸쳐 전좌시키는 능력을 갖는다. PTD는, 이들이 접합되거나, 복합체화되거나 융합되는 단백질 및 다른 거대분자 카고(cargo)에 이러한 명백한 전좌 활성을 부여하는 상대적으로 짧은(1개 내지 35개 아미노산) 서열이다. HIV-유도된 TAT 펩타이드(YGRKKRRQRRR(서열번호 7))는, 예를 들면, 소분자 내지 단백질, 펩타이드 범위, 약제학적 나노담체 및 화상화 제제의 범위의 각종 작용제의 세포내 전달에 널리 사용되어 왔다. 대안으로, 수용체-매개된 식균 메커니즘도 세포내 약물 전달에 사용할 수 있다. 예를 들면, 트랜스페린 수용체-매개된 내재화 경로는, 약물 및 단백질의 부위-특이적 전달을 위해 활용되어온 효율적인 세포 흡수 경로이다. 이는, 치료학적 약물 또는 단백질과의 트랜스페린의 접합에 의해 화학적으로, 또는 트랜스페린의 구조에의 치료학적 펩타이드 또는 단백질의 융합에 의해 유전학적으로 달성된다. 천연적으로 존재하는 단백질(예를 들면, 철-결합 단백질 트랜스페린)은 생물분해성이고, 비독성이고, 비-면역원성이므로, 이들 단백질은 약물 표적화의 영역에 매우 유용하다. 단백질 형질도입 도메인으로는, 단백질로부터 유도된 PTD, 예를 들면, 사람 면역결핍 바이러스 1(HIV-1) TAT(Ruben et al., J. Virol. 63:1-8, 1989), 예를 들면, GRKKRRQRRR(TAT 48-57, 서열번호 8); 헤르페스 바이러스 외피 단백질 VP22(Elliott and O'Hare Cell 88:223-33, 1997); 드로소필라 멜라노가스터 안텐나페디아(Antp) 단백질의 호메오시스성 단백질(페네트라틴 PTD; Derossi et al. J. Biol. Chem. 271:18188-93, 1996); 프로테그린 1(PG-1) 항-미생물성 펩타이드 SynB(예를 들면, SynB1, SynB3, 및 Syn B4; Kokryakov et al. FEBS Lett. 327:231-36, 1993); 및 염기성 섬유모세포 성장 인자(Jans FASEB J. 8:841-47, 1994)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, PTD로는 합성 PTD, 예를 들면, 폴리아르기닌 펩타이드(Futaki et al., J. Mol. Recognit. 16:260-64, 2003; Suzuki et al., J. Biol. Chem. 276:5836-40, 2001); 트랜스포르탄(Pooga et al., FASEB J. 12:67-77, 1988; Pooga et al., FASEB J. 15:1451-53, 2001); MAP(Oehlke et al., Biochim. Biophys. Acta. 1414:127-39, 1998); KALA(Wyman et al., Biochemistry 36:3008-17, 1997); 및 기타 양이온성 펩타이드, 예를 들면, 각종 β-양이온성 펩타이드(Akkarawongsa et al., Antimicrob. Agents and Chemother. 52(6):2120-29, 2008)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
IV. 전달 벡터
소정 양상에서, 구성성분들은, 이러한 구성성분들을 암호화하거나 발현하는 핵산을 사용함으로써 췌장 또는 다른 기관 또는 조직에 제공된다. 본원에 기술되어 있는 방법(예를 들면, Syner-III)에서 바이러스성 및 비-바이러스성 전달 벡터를 사용할 수 있다. 용어 "핵산", "핵산 분자", "핵산 서열", "뉴클레오타이드 서열" 및 "뉴클레오타이드 분자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 달리 구체화하지 않는 한, cDNA, DNA, PNA를 포함하는 데옥시리보핵산의 중합체, 또는 리보핵산(RNA)의 중합체를 나타낸다. 핵산은 세포 추출물, 게놈 또는 게놈외 DNA, 바이러스성 핵산, 또는 인공적으로/화학적으로 합성된 분자로부터 수득할 수 있다. 당해 용어는 이중 가닥 또는 단일 가닥 데옥시리보핵산 또는 리보핵산을 포함할 수 있다.
A. 바이러스성 전달
세포를 감염시키거나 수용체-매개된 엔도사이토시스를 통해 세포에 들어가고, 암호화된 유전자를 바이러스성으로 발현하는 소정 바이러스의 능력은, 이들 바이러스를 세포(예를 들면, 포유동물 세포)에의 외래 핵산의 전이를 위한 매력적인 후보물이 되게 한다. 따라서, 작용제를 암호화하고 발현시켜, 포도당 대사의 활성을 증가시키고, 티로신 키나제 수용체 활성을 증가시키고, 베타 세포와 관련된 유전자의 전사를 증가시키는 바이러스를 이용할 수 있다. 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 비제한적 예는 하기에 기술된다.
아데노바이러스 벡터. 핵산의 전달을 위한 특정 방법은 아데노바이러스 발현 벡터의 사용을 포함한다. 아데노바이러스 벡터는 게놈 DNA에의 통합에 대해 낮은 용량을 갖는 것으로 공지되어 있지만, 이러한 특징은 이들 벡터에 의해 제공되는 유전자 전이의 높은 효율로 평형을 이룬다(counterbalanced). "아데노바이러스 발현 벡터"는, (a) 작제물의 패키징을 지지하기에, 그리고, (b) 결국 그 안에 클로닝된 조직 또는 세포-특이적 작제물을 발현하기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 이들 작제물을 포함하는 것을 의미한다. 유전자 구조의 지식 또는 아데노바이러스, 36kb, 선형, 이중-가닥의 DNA 바이러스는, 7kb 이하의 외래 서열을 갖는 아데노바이러스 DNA의 큰 조각의 치환을 가능하게 한다(Grunhaus and Horwitz, Semin. Virol. 3, 237-252, 1992).
AAV 벡터. 아데노바이러스-보조된 형질감염을 이용하여 핵산을 세포에 도입할 수 있다. 아데노바이러스-커플링된 시스템을 이용한 세포 시스템에서 증가된 형질감염 효율이 보고되었다. 아데노-관련 바이러스(AAV)는 낮은 통합 빈도를 가졌고, 이는 비-분할 세포를 감염시킬 수 있으므로, 조직 배양에서 또는 생체내에서 포유동물 세포에의 유전자의 전달에 유용하게 한다. AAV는 전염성에 대해 넓은 숙주 범위를 갖는다. rAAV 벡터의 생성 및 사용에 관한 상세한 설명은 미국 특허 5,139,941 및 4,797,368에 기술되어 있고, 이들 문헌 각각은 본원에 인용에 의해 포함된다.
레트로바이러스 벡터. 레트로바이러스는, 이들의 유전자를 숙주 게놈에 통합시켜, 대량의 외래 유전자 물질을 전이시키고, 넓은 스펙트럼의 종 및 세포를 감염시키고, 특정 세포주에서 패키징되는 능력을 갖는다. 레트로바이러스 벡터를 작제하기 위해서, 소정 바이러스 서열 대신에 핵산(예를 들면, 목적하는 단백질을 암호화하는 핵산)을 바이러스 게놈에 삽입하여 복제-결합성인 바이러스를 생산한다. 비리온(virion)을 생산하기 위해서, LTR을 포함하지 않지만 gag, pol, 및 env 유전자를 함유하는 패키징 세포주 및 패키징 구성성분을 작제한다. cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드를 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열과 함께 특정 세포주에 (예를 들면, 인산 칼슘 침전에 의해) 도입하는 경우, 패키징 서열은, 바이러스 입자에 패키징되는 재조합 플라스미드의 RNA 전사를 가능하게 하고, 이어서, 이는 배양 배지로 분비된다. 이어서, 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고, 임의로 농축시키고, 유전자 전이에 사용한다. 레트로바이러스 벡터는, 매우 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있다.
렌티바이러스는 복합 레트로바이러스이고, 이는, 통상의 레트로바이러스 유전자 gag, pol, 및 env에 추가하여 조절성 또는 구조적 기능을 갖는 다른 유전자들을 함유한다. 렌티바이러스 벡터는 당해 분야에 익히 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허 6,013,516 및 5,994,136를 참조하고, 이들 문헌은 각각 본원에 인용에 의해 포함된다). 렌티바이러스의 몇몇의 예로는 사람 면역결핍 바이러스: HIV-1, HIV-2 및 유인원 면역결핍 바이러스: SIV가 포함된다. 렌티바이러스 벡터는, 맹독성 유전자, 예를 들면, 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef가 결실된 HIV를 다중적으로 약화시킴으로써 생성되었고, 이는 벡터를 생물학적으로 안전하게 한다.
재조합 렌티바이러스 벡터는 비-분할 세포를 감염시킬 수 있고, 생체내 및 생체외 유전자 전이 및 핵산 서열의 발현 둘 다에 사용할 수 있다. 예를 들면, 적합한 숙주 세포가, 패키징 기능, 즉, gag, pol, 및 env뿐만 아니라 rev 및 tat도 지닌 2개 이상의 벡터로 형질감염되는, 비-분할 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스가 미국 특허 5,994,136에 기술되어 있고, 이 문헌은 본원에 인용에 의해 포함된다.
본 발명자는, 외피 단백질을 항체 또는 특정 세포-유형의 수용체를 표적으로 하는 특정 리간드와 링크시킴으로써 재조합 바이러스를 표적화할 수 있다. 바이러스 벡터에 목적하는 서열을, 특정 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드를 암호화하는 다른 유전자와 함께 삽입함으로써, 예를 들면, 벡터는 이제 표적-특이적이다. 이러한 바이러스성 벡터는 췌장의 세포에 대해 표적화될 수 있다.
다른 바이러스성 벡터. 본 발명의 방법에서 다른 바이러스성 벡터를 사용할 수 있다. 백시니아 바이러스와 같은 바이러스로부터 유도된 벡터(Ridgeway, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (Eds.), Stoneham: Butterworth, 467-492, 1988; Baichwal and Sugden, In: Gene Transfer, Kucherlapati (Ed.), NY, Plenum Press, 117-148, 1986; Coupar et al., Gene 68:1-10, 1988), 신드비스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스를 사용할 수 있다. 이들은 각종 포유동물 세포에 대해 몇몇의 매력적인 특징을 제공한다(Friedmann, Science, 244:1275-1281, 1989; Ridgeway, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (Eds.), Stoneham: Butterworth, 467-492, 1988; Baichwal and Sugden, In: Gene Transfer, Kucherlapati (Ed.), NY, Plenum Press, 117-148, 1986; Coupar et al., Gene 68:1-10, 1988; Horwich et al., J. Virol. 64:642-650, 1990).
변형된 바이러스. 전달되는 핵산은, 특정 결합 리간드를 발현하도록 조작된 감염성 바이러스 내에 하우징될 수 있거나, 특정 결합 리간드에 커플링된다. 따라서, 바이러스 입자는 표적 세포의 동족 수용체에 특이적으로 결합하여 내용물을 세포에 전달할 것이다. 바이러스의 표면 단백질에 대한 또는 바이러스의 표면 단백질에서의 모이어티의 화학적 부가 또는 재조합적 조작에 의한 바이러스의 화학적 또는 유전적 변형에 근거하여 바이러스 벡터의 특이적 표적화를 가능하게 하도록 고안된 신규한 접근법이 개발되었다. 락토스 모이어티를 이용한 하나의 이러한 변형은 시알로당단백질 수용체의 특이적 감염을 허용할 수 있다.
바이러스성 표면 단백질에 대항하는, 그리고, 특정 세포 수용체에 대항하는 비오티닐화된 항체가 사용된, 재조합 바이러스의 표적화에 대한 다른 접근법이 고안되었다. 항체들은, 스트렙트아비딘을 사용함으로써 비오틴을 통해 커플링될 수 있다(Roux et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9079-83, 1989). 주요 조직 적합성 복합체 클래스 I 및 클래스 II에 대항하는 항체를 이용하여, 이들 항체는, 시험관내에서 이들 표면 항원을 동종지향성 바이러스로 천공하는(bore) 각종 사람 세포의 감염을 입증하였다(Roux et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9079-83, 1989).
소정 양상에서, 적응 시스템, 즉, 전달 벡터 및 표적-췌장 세포 수용체 둘 다에 결합하여 췌장에서의 형질도입을 가능하게 하는 분자를 사용할 수 있다. 추가의 양상에서, 천연 바이러스 벡터 수용체의 사용은 췌장 표적화 리간드에 융합될 수 있다. 또 다른 양상에서, 함께 커플링된 2개의 항체들인 이특이적 항체는 전달 벡터에 커플링되어 표적 췌장 세포에 대한 특이성을 갖는 전달 벡터가 얻어질 수 있다. 소정 양상에서, 표적화 모이어티는 화학적 수단에 의해 전달 벡터에 결합될 수 있다. 추가의 양상에서, 전달 벡터의 유전적으로 포함된 Ig-결합 도메인에 결합하는 항체를 사용하여 전달을 개선할 수 있다. 추가의 양상에서, 소형 표적화 모티프(motif)를 캡시드(capsid), 외피, 바이러스 부착물, 다른 바이러스성 표면 단백질에 삽입하여 췌장 세포를 표적으로 할 수 있다.
소정 양상에서, 바이러스성 작제물은 2개의 이종성 단백질 구성성분(예를 들면, GK 및 Pdx-1)을 암호화할 수 있고, shRNA PTP1B를 발현할 수 있다. 추가의 양상에서, 각각의 구성성분은, 개별적이고 별개인 바이러스에 포함될 수 있다.
본원에 기술되어 있는 조성물은, 내시경을 통해 췌관을 거쳐 전달될 수 있다. 간략하게, 환자는 진정제를 투여하거나 마취시키고, 연성 내시경을, 입을 통해 식도 아래로 위에, 유문을 통해 바터(Vater) 팽대부(총담관 및 췌관의 개구)가 존재하는 십이지장으로 삽입한다. 오디(Oddi) 괄약근은, 팽대부의 개구를 제어하는 근육 밸브이다. 당해 여역은 절차를 수행하면서 내시경 카메라로 직접 가시화할 수 있다. 플라스틱 카테터 또는 캐뉼라(cannula)를 팽대부를 통해 삽입하고, 베타 세포 유도 조성물(예를 들면, Syner-III)을 췌장 담관에 도입하여 췌장을 표적으로 한다. 베타 세포 형성 조성물은, 또한, 바이러스성 벡터를 췌장 표적화 모이어티와 커플링시킴으로써, 예를 들면, 췌장 조직만을 표적으로 하는 바이러스 벡터의 외피 구조를 변형시킴으로써, 정맥내 전달될 수 있다.
B. 지질-매개된 형질감염
추가의 실시형태에서, 핵산은 지질 입자, 예를 들면, 리포솜 내에 포집될 수 있다. 리포솜은, 인지질 2층 막 및 내부 수성 매질을 특징으로 하는 다공질 구조이다. 다중층 리포솜은, 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질층을 갖는다. 이들은, 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 구성성분은, 폐쇄된 구조의 형성 전에 자기-재배열을 경험하고, 물을 포집하고, 지질 2층 사이의 용질을 용해시킨다(Ghosh and Bachhawat, In: Liver Diseases, Targeted Diagnosis and Therapy Using Specific Receptors and Ligands, Wu et al. (Eds.), Marcel Dekker, NY, 87-104, 1991). 또한, 리포펙타민(Gibco BRL) 또는 수퍼펙트(Qiagen)와 복합체화된 핵산이 고려된다.
시험관내에서의 외래 DNA의 지질-매개된 핵산 전달 및 발현은 매우 성공적이었다(Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979; Nicolau et al., Methods Enzymol. 149:157-176, 1987). 또한, 배양된 닭 배아, HeLa 및 간세포암 세포에서의 외래 DNA의 지질-매개된 핵산 전달 및 발현의 실행 가능성도 입증되었다(Wong et al., Gene 10:87-94 1980).
본 발명의 소정 실시형태에서, 지질 입자는 적혈구 응집성(hemagglutinating) 바이러스(HVJ)와 복합체화될 수 있다. 이는, 세포막과의 융합을 가능하게 하고 지질-캡슐화된(lipid-encapsulated) DNA의 세포 진입을 촉진시키는 것으로 나타났다(Kaneda et al., Science 243:375-378 1989). 다른 실시형태에서, 지질 입자는 핵 비-히스톤 염색체 단백질(HMG-1)과 복합체화되거나 이와 함께 사용될 수 있다(Kato et al., J. Biol. Chem. 266:3361-3364, 1991). 다른 추가의 실시형태에서, 지질 입자는 HVJ 및 HMG-1 둘 다와 복합체화되거나 이와 함께 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 전달 비히클은 리간드 및 지질 입자를 포함할 수 있다.
소정 양상에서, PTP1B의 shRNA 및 Pdx-1을 암호화하는 핵산 및 글루코키나제를 포함하는 본원에 기술되어 있는 구성성분은 리포솜에 의해 전달될 수 있다. 핵산을 함유하는 리포솜은, 정맥내 전달되어 췌장 조직에 도달할 때 유리될 수 있다. 소정 양상에서, 본 발명의 핵산은, 리포솜 표면 상에 제시되는 화학적으로 커플링된 리간드를 함유하는 리포솜에 포함된다. 리간드는 췌장 세포를 특이적으로 표적으로 한다. 이러한 전략을 이용하여, 각종 리간드 또는 수용체, 예를 들면, 항체, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 및 독소를 리포솜 표면 상에 앤커링시켜(anchored) 베타 세포 유도 구성성분이 췌장 세포에 대해 표적화되고 이에 도입될 수 있다.
C. 수용체 매개된 형질감염
또한, 추가로, 핵산은 수용체-매개된 전달 비히클을 통해 표적 세포에 전달될 수 있다. 이들은, 표적 세포에서 발생할 것인 수용체-매개된 엔도사이토시스에 의해 거대 분자의 선택적 흡수의 이점을 취한다. 각종 수용체의 세포 유형-특이적 분포의 관점에서, 이러한 전달 방법은 본 발명에 다른 특이성 정도(degree)를 추가한다.
소정 수용체-매개된 유전자 표적화 비히클은 세포 수용체-특이적 리간드 및 핵산-결합제를 포함한다. 다른 비히클들은, 전달되는 핵산이 작동적으로 부착된 세포 수용체-특이적 리간드를 포함한다. 몇몇의 리간드들은 수용체-매개된 유전자 전이를 위해 사용되었고(Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432, 1987; EP 특허 0273085), 이는 기술의 작동성(operability)을 확립한다. 본 발명의 소정 양상에서, 리간드는, 표적 세포 집단에 대해 특이적으로 발현된 수용체에 상응하도록 선택될 것이다.
다른 실시형태에서, 세포-특이적 핵산 표적화 비히클의 핵산 전달 비히클 구성성분은, 지질 입자와의 조합물로의 특이적 결합 리간드를 포함할 수 있다. 전달되는 핵산(들)은 지질 입자 내에 하우징되고, 특이적 결합 리간드는 지질층에 기능적으로 포함된다. 따라서, 지질 입자는 표적 세포의 수용체(들)에 특이적으로 결합하여 세포에 내용물을 전달할 것이다. 이러한 시스템은, 예를 들면, EGF 수용체의 상향조절을 나타내는 세포에의 핵산의 수용체-매개된 전달에 있어서 표피 성장 인자(EGF)가 사용되는 시스템을 이용하여 기능성인 것으로 밝혀졌다.
다른 추가의 실시형태에서, 표적화된 전달 비히클의 핵산 전달 비히클 구성성분은 지질 입자 자체일 수 있고, 이는, 바람직하게는 세포-특이적 결합을 지시하는 하나 이상의 지질 또는 당단백질을 포함할 것이다. 예를 들면, 락토실-세라마이드, 갈락토스-말단 아시알로강글리오사이드가 지질 입자에 포함되었고, 간세포에 의한 인슐린 유전자의 흡수를 증가시키는 것으로 관찰되었다(Nicolau et al., Methods Enzymol. 149:157-176, 1987). 본 발명의 조직-특이적 형질전환 작제물은, 유사한 방식으로 또는 본원에 기술되어 있는 바와 같이 표적 세포에 특이적으로 전달될 수 있음이 고려된다.
D. 미세 사출물 충격(Microprojectile Bombardment)
미세 사출물 충격 기술을 사용하여 핵산을 1개 이상의 세포 소기관, 세포, 조직 또는 유기체에 도입할 수 있다(미국 특허 5,550,318; 5,538,880; 5,610,042; 및 PCT 공개 WO 94/09699; 이들 문헌의 각각은 본원에 인용에 의해 포함된다). 이러한 방법은, DNA-코팅된 미세 사출물을 고속으로 가속화하여 세포막을 뚫어 이들을 사멸시키지 않고 세포에 진입하도록 하는 능력에 의존한다(Klein et al., Nature 327, 70-73, 1987). 당해 분야에 공지되어 있는 매우 다양한 미세 사출물 충격 기술이 존재하고, 이들 중 다수는 본 발명에 적용가능하다.
이러한 미세 사출물 충격에서, 하나 이상의 분자들은, 하나 이상의 핵산으로 코팅하고, 추진력에 의해 세포에 전달할 수 있다. 작은 입자들을 가속화하기 위한 몇몇의 장치들이 개발되어 왔다. 하나의 이러한 장치는, 전류를 생성하기 위한 고전압 방출에 의존하고, 이는 결국 구동력을 제공한다. 사용된 미세 사출물은 생물학적 불활성 물질, 예를 들면, 텅스텐 또는 금 입자 또는 비드로 이루어졌다. 예시 입자로는, 텅스텐, 백금, 및 금으로 이루어진 것들이 포함된다. 몇몇의 예에 이써서, 금속 입자 상에의 DNA 침전은, 미세 사출물 충격을 이용한 수용자 세포에의 DNA 전달에 필요하지 않을 것이다. 그러나, 입자는, DNA로 코팅되기보다는 DNA를 함유할 수 있음이 고려된다. DNA-코팅된 입자는 입자 충격을 통한 DNA 전달의 수준을 증가시킬 수 있지만, 그 자체로는 필요하지 않다.
네이키드 플라스미드 DNA는 에어 피스톨(air pistol)(Gene Gun)에 의해 세포에 전이될 수 있다. Syner-III 플라스미드는, 췌장 조직에 도달하기 위한 내시경이 구비된 유전자 총 접근법을 이용하여 췌관을 통해 주사될 수 있다. 유전자 총을 통한 플라스미드 DNA 충격은, 막 세공을 개방하는 물리적 압력에 의해 그리고/또는 세포 막을 통한 네이키드 플라스미드 DNA의 확산을 가능하게 함으로써 세포에 진입한다.
E. 나노입자
본 발명의 핵산은, 췌장 또는 기타 조직을 표적으로 하는 나노 입자의 3차원 다중-구성성분 구조에 포함될 수 있다. 사용되는 나노입자로는 리포솜, 중합체, 단백질, 미셀(micelle), 덴드리머, 양자점, 나노쉘, 나노결정, 금 나노입자, 상자성(paramagnetic) 나노입자, 및 탄소 나노튜브가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
F. 수역학적(hydrodynamic) 유전자 전달
네이키드 플라스미드 DNA는, 수역학적 유전자 전달을 사용하여 췌관을 통해 전달될 수 있다. 벌룬 카테터(balloon catheter)는 췌관에 위치할 수 있다. 췌관에 위치된 벌룬 카테터는 폐쇄-보조된(occlusion-assisted) 주입을 위해 팽창된다.
G. 전기천공
소정 양상에서, 한 쌍의 전극은 췌장 또는 기타 조직 상에 또는 이들 내에 위치할 수 있고, 본 발명의 핵산은 전극 상에 침전되어 유전자 물질이 조직에 전이되었다.
H. 초음파-촉진된 유전자 전이
본 발명의 핵산은, 정맥내 주사되는 미세 기포(microbubble)에 포함될 수 있다. 미세 기포가 췌장 또는 기타 조직에 도달할 때, 이들 미세 기포는 초음파로 표적화된다. 미세 기포가 확대되고 버스트(burst)됨에 따라, 이들은 췌장에 핵산을 방출한다. 국소적 충격파(local shock wave)는, 핵산이 인근의 세포막에 침투되도록 한다.
I. 니들(needle)에 의한 유전자 전이
소정 양상에서, 본 발명의 핵산은, 니들을 이용하여 췌장에 또는 다른 조직에 직접적으로 주사된다.
V. 약제학적 조성물
본 명세서를 고려하여, 적절한 치료 용법(예를 들면, 용량, 투여의 빈도, 전신 대 국소 등)의 결정은 당해 분야 기술 범위 내이다. 투여를 위해, 본원에 기술되어 있는 구성성분들은, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 단위 용량형(용액, 현탁액, 유액 등)으로 제형화될 것이다. 이러한 비히클은 일반적으로 비독성이고 비-치료학적이다. 이러한 비히클의 예로는 물, 염수, 링거(Ringer)액, 덱스트로스 용액, 및 행크(Hank) 용액이 있다. 또한, 비-수성 비히클, 예를 들면, 고정유 및 에틸 올레에이트도 사용할 수 있다. 바람직한 비히클은 염수 중의 5%(w/w) 사람 알부민이다. 비히클은 소량의 첨가제, 예를 들면, 등장성 및 화학적 안정성을 향상시키는 물질, 예를 들면, 완충제 및 보존제를 함유할 수 있다.
본원에 기술되어 있는 치료학적 조성물뿐만 아니라 이들의 생물학적 등가물도 임의의 적합한 경로에 의해 독립적으로 또는 조합물로 투여될 수 있다. 비경구 투여의 예로는 정맥내, 동맥내, 근육내, 및 복강내 등이 포함된다. 본원에 기술되어 있는 투여의 경로는 단지 예이고, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 실시형태에 따라 동물, 특히, 사람에 투여되는 치료학적 조성물의 용량은, 타당한 시간 프레임에 걸쳐 대상체에서 바람직한 반응을 초래하기에 충분해야만 한다. 치료학적 조성물의 용량은, 사용되는 특정 치료학적 조성물의 강도, 동물의 연령, 종, 병태 또는 질환 상태, 및 체중을 포함하는 각종 인자들에 의존함이 공지되어 있다.
또한, 용량 및 투약 용법은 주로 숙주에 대한 생물학적 손상의 유형, 대상체의 유형, 대상체의 병력, 및 투여되는 치료학적 조성물의 유형에 의존할 것이다. 용량의 크기는, 경로, 시점, 및 빈도뿐만 아니라 특정 치료학적 조성물의 투여에 수반될 수도 있는 임의의 유해 부작용의 존재, 성질 및 정도, 및 바람직한 생리학적 효과에 따라 결정될 것이다. 또한, 각종 병태 또는 질환 상태, 특히, 만성 병태 또는 질환 상태는, 다중 투여를 포함하는 연장된 치료를 필요로 할 수 있다.
따라서, 치료학적 조성물의 양은, 향상된 치료학적 지수를 달성하기에 효과적이어야만 한다. 다중 용량이 사용되는 경우, 투여의 빈도는, 예를 들면, 대상체의 유형에 의존할 것이다. 당해 분야 숙련가는, 일상적인 실험에 따라, 주어진 대상체에서 임의의 특정 경우에 가장 효과적인 적절한 경로 및 투여의 빈도를 알아낼 수 있다. 적합한 용량 및 투약 용법은 종래 공지되어 있는 범위-탐색(range-finding) 기술에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 치료는, 보다 작은 용량들로 개시하고, 이는 화합물의 최적 용량 보다 더 적다. 그 후, 그러한 상황 하에 최적 효과가 얻어질 때까지 용량을 소 증분(increment)씩 증가시킨다.
본 발명의 실시형태에서 사용하기 위한 치료학적 조성물은 일반적으로 담체를 포함한다. 이들 담체는 종래 사용되는 것들 중 임의의 것일 수 있고, 투여의 경로 및 화학적 및 물리적 고려사항, 예를 들면, 용해도 및 치료제와의 반응성에 의해서만 한정된다. 또한, 치료학적 조성물은, 제한 없이 중합체성 조성물, 포접 복합체(inclusion complex), 예를 들면, 사이클로덱스트린 포접 복합체, 리포솜, 미소 구체(microsphere), 및 미세 캡슐 등으로서 제형화될 수 있다.
본원에 기술되어 있는 약제학적으로 허용되는 부형제, 예를 들면, 비히클, 항원 보강제(adjuvant), 담체, 또는 희석제는 익히 공지되어 있고 쉽게 입수가능하다. 약제학적으로 허용되는 담체는, 치료학적 조성물과 관련하여 화학적으로 불활성인 것, 그리고, 사용 조건 하에 유해 부작용 또는 독성을 갖지 않는 것이 바람직하다.
부형제의 선택은, 부분적으로, 특정 치료학적 조성물에 의해, 그리고, 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 결정될 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태에서 사용되는 약제학적 조성물의 적합한 제형이 매우 다양하게 존재한다. 예를 들면, 비-제한적 제형은, 주사가능한 제형, 예를 들면, 정맥내, 피하, 근육내, 및 복강내 주사 등을 위한 제형일 수 있지만 이들에 한정되지 않고, 경구 제형, 예를 들면, 현탁액 및 유액을 포함하는 액체 용액, 캡슐, 사쉐트(sachet), 정제, 및 로젠지(lozenge) 등일 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 비경구 투여에 적합한 비-제한적 제형으로는, 항산화제, 완충제, 세균 발육 저지제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 보존제, 및 계면활성제 등과 같은 비-활성 성분을 포함하는 수성 및 비-수성 등장성 멸균 주사액이 포함된다. 용액은, 세제 등을 포함하는 오일, 지방산뿐만 아니라 익히 공지되어 있고 이러한 조성물 중의 통상적인 기타 성분들을 제한 없이 포함할 수 있다.
VI. 실시예
하기 실시예 및 도면은, 본 발명의 소정 실시형태들을 입증하기 위해 포함된다. 실시예 또는 도면에 개시되어 있는 기술들은, 기재되어 있는 방법의 실행시 잘 기능하도록 본 발명자들에 의해 발견된 기술들을 나타내고, 따라서, 이의 실행을 위한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다. 그러나, 당해 분야 숙련가들은, 본 발명의 개시를 고려하여, 개시되는 특정 실시형태에서 다수의 변화가 이루어질 수 있고, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 동일하거나 유사한 결과를 수득할 수 있음을 이해해야만 한다.
실시예 1
성인 췌장에서의 베타 세포 형성
A. 결과
실증의 목적을 위해, 치료학적 모이어티로는 렌티바이러스-CMV-글루코키나제(GK), 렌티바이러스-H1-shRNA PTP1B; 및 렌티바이러스-CMV-PDX-1이 포함된다. 대조군 조성물로는 치료학적 조성물과 동일한 농도로 주사되는 렌티바이러스-CMV-GFP 및 렌티바이러스-H1-shRNA Scramble이 포함된다. 생체내 주사 4주 후, PDX-1 및 GK의 과발현, 및 PTP1B 발현의 억제가 마우스 췌장에서 검출되었다. 글루코키나제 과-발현이 섬 조직에서 그리고 외분비 조직에서 검출되었다. 췌장 조직은 내분비 세포에서만 글루코키나제를 발현하므로, 외분비 조직에서의 글루코키나제의 발현은 치료학적 조성물에 의한 글루코키나제의 과-발현임을 확인시켜 준다. Pdx-1 과발현은, Pdx-1의 cDNA에 포함된 c-Myc 태그를 이용함으로써 검출되어 외인성 및 내인성 발현 사이를 구별한다. 또한, shRNA PTP1B 공동-발현 GFP도 검출되었다. 단백질 발현은 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다.
CNIP 접근법의 제1 양상: CNIP 접근법의 하나의 목표는, 췌장에서의 포도당 대사를 증가시켜 췌장 베타 세포 형성을 유도하는 것이다. 포도당이 해당 경로에 진입하는 경우, 포도당은 우선 막 포도당 수송 시스템을 통해 세포내 공간에 진입해야만 한다. 포도당 수송체인 Glut 1 및 Glut 3은 외분비 및 내분비 사람 췌장 조직에 존재하고, Glut 2는 췌장 베타 세포에 존재한다(Coppieters et al., Diabetes Metab Res Rev 27: 746-754, 2011). 그러나, 포도당 수송은, 해당 경로에의 포도당 진입을 위한 속도-제한 단계가 아니다(Wasserman et al., J.Exp.Biol. 214:254-262, 2011). 해당 경로에서의 포도당 대사를 위한 제1 속도-제한 단계는 헥소키나제에 의한 포도당 인산화의 수준이다. 헥소키나제에 의한 포도당의 인산화는, 대사물인 글루코스 6-포스페이트(G-6-P)를 생산한다. 췌장 베타 세포는 글루코키나제(GK)라고 칭하는 헥소키나제 IV형을 함유한다. 글루코키나제는 다른 헥소키나제와 대조적으로 세포내 G-6-P의 축적에 의해 알로스테릭하게(allosterically) 방해되지 않는다. 따라서, 글루코키나제에 관해, 글루코키나제 효소의 양 및 활성은 해당을 통해 포도당 플럭스(flux)의 속도를 조절한다. 헥소키나제 패밀리의 다른 구성원에 관해, G-6-P에 의한 생성물 억제는 효소 활성의 주요 조절인자이고, 따라서, 포도당이 해당 경로에 진입한다. 포도당이 헥소키나제에 의해 인산화되는 경우, 포도당은, 추가의 대사를 경험할 수 없고, 유전자 발현을 유도하기 위한 전사 기구에 대해 임의의 신호를 생성할 수 없다(Doiron et al., J Biol Chem. 269: 10213-10216, 1994 and J Biol Chem. 271:5321-5324, 1996). 따라서, 소정 양상에서, 글루코키나제는 CNIP 칵테일에 포함되어 췌장 베타 세포 형성을 유도할 수 있다.
본 발명자들은, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 제어 하에 글루코키나제 유전자를 발현하는 렌티바이러스 벡터 작제물을 고안하였다(도 2a). 렌티바이러스 벡터 작제물은, 암호화 서열의 비번역 영역의 3'에 우드척 간염 바이러스(WPRE)의 전사 후 조절 요소를 포함하였고, 이는 전이 유전자의 발현 수준을 증가시켰다. WPRE는, 핵 전사의 수준을 증가시키고 RNA 반감기를 크게 증가시킴으로써 전사 후 유전자 발현을 자극하도록 핵 내에서 기능한다(Zufferrey et al., J. Virol. 73:2886-289, 1999). 마우스 글루코키나제(GCK) 유전자를 pEntCMV-WPRE 벡터에 서브클로닝하였고, DNA 서열분석에 의해 삽입물을 확인하였다. pENT-GCK는 LR 클로나제 II 효소(Invitroge)로 처리하였고, pLenti 벡터에 라이게이션하였다. 재조합 생성물을 이. 콜라이 세포에 형질전환시켰다. 밤새 항온배양한 후, 양성 클론을 선택하였고, 플라스미드 DNA를 정제하였다. pEnt-GCK 및 pLenti-GCK는 293 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 세포를 SDS-PAGE 완충액에 용해시켰고, 4 내지 20% SDS-PAGE 겔 전기영동을 행하였고, 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 1:1000 희석으로 항-GCK 항체를 이용하여, 이어서, HRP 접합된 2차 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. ECL 시약을 이용하여 웨스턴 블롯 막을 전개시켰다.
순수한 고역가 렌티바이러스 벡터의 생산에 pLenti-GCK를 사용한다. Lenti-GCK는 상기 기술되어 있는 바와 같이 성체 마우스의 췌장에 직접적으로 주사될 것이다. 성체 마우스 C57BL/6(8주령; Chrles River, Wilmington, MA)을, 췌장을 렌티바이러스 벡터 작제물로 표적화하는 생체내 실험에 사용할 것이다.
플라스미드 벡터를 이용한 증가된 글루코키나제 발현은, 글루코스-6-포스페이트(G-6-P) 풀을 증가시키는 것으로 밝혀졌다(Doiron et al., J Biol Chem. 269: 10213-10216, 1994). 글루코스 6-포스페이트는, 몇몇의 대사 경로(해당, 포도당신생, 펜토스 포스페이트 경로, 글리코겐 합성, 및 글리코겐 분해)의 연결점에 놓이는 주요 중간물이다. 도이론 등(Doiron et al (1996))은, 전사 기구에 대한 포도당 신호가, 펜토스 포스페이트 경로에 의해 생산되는 대사물인 크실룰로스 5-포스페이트에 의해 매개됨을 입증하였다. 도이론에 의해 입증되는 바와 같이, 크실룰로스 5-포스페이트는, 포도당 대사에 의한 전사 기구 유도를 매개하는데 관여하는 주요 대사물이다. 펜토스 포스페이트 경로를 통해 대사 플럭스를 조절하는 주요 효소는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제(G6PD)이다. G-6-P는 G6PD 효소의 작용을 통해 펜토스 포스페이트 경로에 진입한다. 따라서, 본 발명자들의 CNIP 접근법의 개발에 있어서, 포도당 대사의 전사 효과를 매개하는 크실룰로스-5-포스페이트 형성을 향상시키기 위해 글루코스 6-포스페이트를 펜토스 포스페이트 경로에 전하는 Lenti-CGK 및 Lenti-G6PD의 조합을 사용할 수 있다. 크실룰로스 5-포스페이트의 형성시 다른 중요한 효소는 트랜스케톨라제(TK)이고, 이는 펜토스 포스페이트 경로 아래에 추가로 위치된다. 따라서, 대안의 접근법은, Lenti-TK를 Lenti-CGK와 조합하여 포도당 대사 조절된 유전자 발현의 효과를 증가시키는 것일 것이다. 모든 분자(Lenti-CGK, Lenti-G6PD 및 Lenti-TK)의 상승작용적 작용은, 포도당 대사의 제어 하에 전사 기구를 활성화하고 베타 세포 형성을 증가시키는데 사용될 수 있다.
CNIP 접근법의 제2 양상: CNIP 접근법의 제2 양상은, 막 수용체 티로신 키나제 활성 및 티로신 키나제 관련 수용체 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 포도당 대사는, 성인 췌장에서의 베타 세포의 형성에 관여하는 주요 기작이다. 베타 세포 형성에 연루된 다른 시스템은 티로신 키나제 수용체(들)에 대한 리간드 결합이다. (Vasavada et al., Int J Biochem Cell Biol. 38:931-950, 2006). 생리학적 스트레스(즉, 임신)에 대한 반응으로의 췌장 베타 세포 질량의 증가는 성장 호르몬, 프로락틴, 및 프로락틴 수용체를 통해 작용하는 태반 락토겐에 의해 매개된다. 프로락틴 수용체는 내인성 티로신 키나제 활성을 갖지 않지만, 이는 티로신 키나제의 야누스(Janus) 키나제 패밀리의 구성원과 상호작용한다. 프로락틴 수용체는, 티로신 키나제 관련 수용체(들)의 패밀리의 일부이다. 티로신 키나제의 야누스 키나제 패밀리는, 임신시 발생하는 호르몬 변화에 대한 반응으로의 베타 세포 질량의 증가에 관여한다(Vasavada et al., Int J Biochem Cell Biol. 38:931-950, 2006). 또한, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자, 간세포 성장 인자, 및 표피 성장 인자의 작용은, 막 결합된 티로신 키나제 수용체를 활성화함으로써 베타 세포 질량을 증가시킨다(Vasavada et al., Int J Biochem Cell Biol. 38:931-950, 2006). 따라서, 락토겐(성장 호르몬, 프로락틴 및 태반 락토겐 포함), 인슐린, 인슐린-유사 인자, 간세포 성장 인자 및 표피 성장 인자 수용체는, 췌장 베타 세포 질량을 증가시키기 위해 티로신 키나제(들)의 활성화를 요구한다.
단백질-티로신 포스파타제 1B(PTP1B)는, 티로신 키나제(들)을 활성화하는 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 프로락틴 및 간세포 성장 인자의 능력을 억제하는 것으로 밝혀졌다(Aoki and Matsuda, J. Biol. Chem. 275:39718-39726, 2000; Kakazu et al., Invest Opthalmol Vis Sci. 49:2927-2935, 2008; Tonks, Nat Rev. Mol Cell Biol 7:833-46, 2006). 결과적으로, CNIP 칵테일에 포함될 수 있는 한 분자는, PTP1B를 표적으로 하는 억제제 또는 억제성 RNA(예를 들면, shRNA)이다. shRNA에 의한 PTP1B 단백질 생산의 억제는, 상응하는 호르몬의 생리학적 농도의 결합에 대한 반응으로의 성인 췌장에서의 베타 세포 형성에 관여하는 수용체 티로신 키나제 활성을 증가시킬 것이다. shRNA PTP1B는, H1 폴리머라제 프로모터의 제어 하에 lenti-CGK에 대해 상기에 기술된 동일한 방법을 이용하여 렌티바이러스 작제물에 도입되었다(Doiron et al., Diabetologia 55:719-728, 2012)(도 2c). 폴리머라제 III 프로모터 H1은, 폴리머라제 III의 하우스킵핑 기능으로 인하여 모든 세포에서 편재적으로 활성이다. lenti-shRNA-PTP1B는, 상기 기술된 바와 같이 췌장에 제공되었다.
렌티바이러스 shRNA PTP1B. 소형 헤어핀 RNAi는 pEQU6 벡터에 작제되었다. 표적 서열은 20nt 길이이다(GCCAGGACATTCGACATGAA 서열번호 2). shRNAi 서열은 DNA 서열분석에 의해 확인되었다.
표적 유전자 발현 플라스미드 pEnt-PTP1B 및 하나의 pEQ-PTP1B-shRNA 벡터를 이용하여 공동-형질감염 실험을 수행하였다. 하기 챠트는 각각의 반응의 구성성분을 기술한다. 형질감염 48시간 후, 세포를 SDS-PAGE 완충액에 용해시켰고, 4 내지 20% SDS-PAGE 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯을 행하였다. 1:1000 희석으로 항-PTP1B 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. ECL 시약을 이용하여 막을 평가하였다. 각각의 6-웰에 대해:
Figure pct00002
CNIP 접근법의 제3 양상: 본원에 기술되어 있는 방법에 포함될 수 있는 제3 양상은, 전사 인자(들)을 통한 유전자 발현을 증가시켜, 포도당 대사(양상 1) 및 티로신 키나제 수용체 패밀리 활성(양상 2)의 효과를 통합하여 췌장에서의 베타 세포 형성을 유도하는 것을 포함한다.
이들의 표적 DNA 서열에 결합하기 위한 전사 인자들의 핵으로의 촉진된 확산을 설명하기 위해, 상이한 모델들이 제안되었다. 한 모델은, 촉진된 확산에 의해 전사 인자(TF)가 DNA에 결합함을 제안한다. 우선, TF는, 비-특이적 부위에서 무작위적으로 DNA와 상호작용하고, TF는, DNA를 따라 '슬라이딩'함으로써 TF의 초기 비-특이적 부위로부터 이의 표적 서열로 이동한다. TF가 DNA를 따라 횡전(roll)하고 이의 상응하는 결합 부위를 탐색함에 따라, 이는, 전사 기구의 활성화 또는 억제를 유도한다. TF가 이의 DNA 결합 부위에 도달하는 방법을 설명하기 위해 제안된 모델과 관계없이, 모든 제안된 모델들 및 실험들은, 전사 기구에서 활성화 또는 억제 부위를 탐색하기 위한 TF의 무작위적 이동으로 촉진된 확산을 포함한다. 전사 기구에의 포도당 대사 신호전달의 한 작용은, DNA 분자의 TF 결합 가능성을 증가시키는 것이다(Doiron et al., J Biol Chem. 271:5321-5324, 1996). 실제로, 전사 기구에의 포도당 대사 신호전달은 TF 발현을 유도하고, 세포질로부터 핵으로의 TF 전좌는 포도당-유도된 유전자를 공격한다(Doiron et al., J Biol Chem. 271:5321-5324, 1996). 결과적으로, TF가 포도당-유도된 유전자 발현을 증가시키는 생물물리학적 기작은 핵에 존재하는 TF의 양적 수준에 의존한다. 실제로, 핵에서의 TF의 양이 증가하는 경우, 특이적 결합 부위를 무작위로 탐색하기 위해 DNA 분자와 상호작용할 기회는 증가하였다(Mitanchez et al., Endo Rev 18:520-540, 1997). 성인 췌장에서의 베타 세포 형성에 연루된 유전자의 발현 증가는, 베타 세포 형성 경로를 활성화하는 주요 TF를 과발현시킴으로써 달성되거나 향상될 수 있다.
출현 후 베타 세포 형성에 연루된 주요 전사 인자들 중 하나는 Pdx-1이다(Doiron and DeFronzo, Int J Endocrinol Metab. 9:356-357, 2011). Pdx-1은 췌장에서의 출현 전 및 후에 별개의 효과들을 갖는다(Doiron and DeFronzo, Int J Endocrinol Metab. 9:356-357, 2011). 배아 단계에서, Pdx-1은 췌장 발달에 필수적이고, Pdx-1은 내분비 및 외분비 조직에서 발현된다. 그러나, 출현 후, Pdx-1은 췌장 베타 세포 및 소마토스타틴 세포에서만 발현된다. 따라서, 성인 췌장에서, Pdx-1은, 배아 췌장 발달을 유도하지 않지만, 전사 기구에의 포도당 대사 신호전달에 대한 반응으로의 인슐린 유전자 발현을 유도하기 위한 이의 작용에 의해 췌장 베타 세포 형성을 유도한다(Doiron and DeFronzo, Int J Endocrinol Metab. 9:356-357, 2011; Mitanchez et al., Endo Rev 18:520-540, 1997). Pdx-1은, 발달 후에 성체 동물에서 베타 세포 형성을 유도하는 것으로 입증되었다(Bouwens and Rooman, Physiol Rev 85:1255-1270, 2005). Pdx-1은, 후-배아 작용을 위한 CNIP 접근법에 사용되어 베타 세포 형성을 향상시킬 수 있다.
CNIP 접근법은, 췌장 발달의 배아 경로를 활성화시키지 않고 성체 췌장에서의 베타 세포 형성의 후-배아 발달을 유도하도록 고안된다. 다른 접근법은, 배아 경로 또는 줄기 세포를 사용하여 췌장의 배아 발달을 재생성시켰다.
배아 경로를 유도하여 베타 세포 형성을 증강시키는 것의 난점은, 이것이, 1형 당뇨병 및 2형 진성 당뇨병 둘 다의 포도당 불내증에서 중요한 병원성 역할을 하는 것으로 밝혀진 글루카곤-생산 알파 세포를 포함하는 내분비 세포 유형의 전부를 유도한다는 점이다. CNIP 접근법은 배아 경로 및 줄기 세포 경로를 우회시켜 성인 췌장에서 췌장 베타 세포 형성을 유도한다.
Pdx-1 발현 및 세포질로부터 핵으로의 전좌는 전사 기구에의 포도당 대사 신호전달에 의해 유도된다(Mitanchez et al., Endo Rev 18:520-540, 1997). 기술되는 바와 같이, 포도당 대사는 베타 세포 형성에 필수적이다. 세포 유형을 생성시키기 위해서, 세포의 유전자 발현 프로파일이 변화되었다. 포도당 대사에 의한 유전자 유도는, 혈당 수준에 의해 유전자 발현 프로파일이 제어되고 조절되는 후생적 현상의 한 예이다(Doiron et al., J Biol Chem. 271:5321-5324, 1996; Mitanchez et al., Endo Rev 18:520-540, 1997). Pdx-1 유전자 발현 및 세포질로부터 핵으로의 전좌는 포도당 대사에 의해 유도된다. 그러나, 포도당 대사 신호전달의 효과는, 췌장 베타 세포의 형성과 관련된 전사 기구에 지정되어야만 한다. Pdx-1의 과발현은, DNA 분자에 무작위로 결합하여 이의 특이적 DNA 결합 부위를 탐색할 수 있는 Pdx-1의 양을 증가시킴으로써 베타 세포의 형성을 향상시킬 것이다. 따라서, Pdx-1의 과발현은, CNIP 칵테일에서의 신호전달 기작의 전부를 집중시켜 베타 세포 형성을 자극하는데 있어서 중심 역할을 행한다. 췌장에서의 Pdx-1의 과발현은, CNIP 칵테일에서 분자들의 집중을 초래하여, 베타 세포 형성과 관련되어 있지 않은 전사 기구에 대한 포도당 대사 신호전달의 다른 효과를 활성화시키기 전에 베타 세포를 생산한다(Doiron et al., J Biol Chem. 271:5321-5324, 1996; Mitanchez et al., Endo Rev 18:520-540, 1997). Pdx-1 cDNA는, CMV 프로모터의 제어 하에, lenti-CGK에 대해 상기에 기술된 동일한 방법을 이용하여 렌티바이러스 작제물에 도입되었다. 주사의 생체내 방법을 이용하여 성체 마우스 췌장을 lenti-CMV-Pdx-1로 표적화하였다.
렌티바이러스 CMV-Pdx-1 작제물(도 2b): 마우스 PDX-1 유전자를 pEntCMV-WPRE 벡터에 서브클로닝하였고, DNA 서열분석에 의해 삽입물을 확인하였다. pENT-PDX-1은 LR 클로나제 II 효소(Invitroge)로 처리하였고, pLenti 벡터에 라이게이션하였다. 재조합 생성물을 이. 콜라이 세포에 형질전환시켰다. 밤새 항온배양한 후, 양성 클론을 선택하였고, 플라스미드 DNA를 정제하였다.
pEnt-PDX1 및 pLenti-PDX1은 293 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 세포를 SDS-PAGE 완충액에 용해시켰고, 4 내지 20% SDS-PAGE 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯을 행하였다. 1:1000 희석으로 항-Myc(PDX1 작제물에 대한) 항체를 이용하여, 이어서, HRP 접합된 2차 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. ECL 시약을 이용하여 항체 결합을 검출하였다.
외분비 조직에서의 단일 또는 2개의 인슐린-양성 세포의 수는, 대조군 그룹에 대해 치료 그룹을 비교함으로써 베타 세포 형성의 지표로서 사용되었다(도 4). 치료 그룹의 외분비 조직에서 단일 또는 2개의 인슐린-양성 세포의 증가가 검출되었다.
대조군과 비교한 치료 그룹에서의 단일 또는 2개의 인슐린 양성 세포의 증가는 베타 세포 증식의 증가와 상호관련되어 있고, 마커 BrdU에 의해 정량화하였다(도 5). BrdU 마커는 섬 및 외분비 조직에서의 증식을 입증하였다.
인슐린 양성 세포를 이용한 증식 마커 BrdU의 공동-국소화는, 치료학적 조성물이 주사된 그룹에서의 새로운 췌장 베타 세포의 형성을 입증한다. 췌장 베타(인슐린) 세포 증식만이 관찰되었다. 알파(글루카곤) 또는 델타(소마토스타틴) 세포 증식은 검출되지 않았다. 조직학적 정량화에 의해, 치료학적 조성물은 췌장 베타 세포 형성을 유도하였다. 실제로, 상기 설명된 바와 같이, 치료학적 조성물은, 글루카곤 또는 소마토스타틴 세포의 형성을 야기하지 않으면서 췌장 베타 세포의 후-배아 형성을 유도하도록 고안되었다.
치료 그룹 및 대조군 그룹에서 베타 세포 질량을 정량화하였다(도 6). 췌장 베타 세포 질량은, 대조군 위약이 주사된 대조군 성체 마우스 그룹과 비교하여 치료학적 조성물이 주사된 성체 마우스에서 유의하게 증가하였다.
치료 그룹 및 대조군 그룹에서 베타 세포 클러스터 밀도를 정량화하였다. 치료학적 조성물은, 대조군과 비교하여 베타 세포 클러스터 밀도에서 유의한 증가를 야기하였다(도 7).
췌장 베타 세포 증식, 베타 세포 질량, 및 베타 세포 클러스터 밀도의 증가는, 대조군 위약 그룹과 비교하여 치료학적 조성물이 주사된 성체 마우스에서 밤새 절식시킨 후의 인슐린 생산의 증가와 상호관련되어 있다(도 8).
B. 방법
성인 췌장에의 유전자 전달을 표적화하기 위한 생체내 방법: 성체 동물에서의 베타 세포 형성을 연구하기 위해, 바이러스성 벡터를 이용하여 생체내에서 성체 췌장을 표적화하였다. 당해 방법은 유효성 확인되어 있고(Doiron et al., Diabetologia 55:719-728, 2012), CNIP 접근법을 사용하여 생체내에서 췌장 베타 세포를 생성하였다.
렌티바이러스 벡터의 이점은, 이들이 수지상 세포를 유의한 정도로 활성화시키지 않는다는 점이다. 또한, 렌티바이러스 벡터는 (i) 분할 및 비분할 세포 둘 다를 감염시키고 이에 통합될 수 있고, (ii) 높은 형질도입 효율을 제공하고 생체내에서 유전자 발현을 지속할 수 있고, (iii) 유의한 숙주 면역 반응을 유도하지 않을 수 있고, (iv) 성공적으로 재투여될 수 있다. 중요하게도, 성체 마우스 췌장에의 생체내 바이러스 벡터 주사 방법은, 성인에서 발병하고 배아 발달 동안 유전자가 결실되는 경우에 발생하는 보상 기작의 발달을 회피하는 만성 질환에 대한 새로운 치료 및/또는 잠재적 치유를 평가하는 것을 허용하는 방법이다. 이러한 접근법은, 녹아웃(knock out) 모델로 보고된 몇몇의 역설적인 발견들, 즉, 인슐린 수용체가 녹아웃된 마우스에서의 정상/정상에 가까운 근육 인슐린 감도(Kitamura et al., Annu. Rev. Physiol., 65:313-32, 2003 참조) 및 당뇨병 표현형을 나타내지 않은 GLUT4에 대한 동형접합성 널(null) 돌연변이체(GLUT4 -/-)(Minokoshi et al., Journal of Biol. Chem., 278(36): 33609-12, 2003 참조)의 문제를 제거한다. 따라서, 소정 실시형태에서는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 췌장을 직접적으로 표적화한다.
간략하게, 렌티바이러스 작제물은 하기에 따라 관내 경로를 통해 마우스 췌장에 도입될 수 있다: 32-게이지(gauge) 카테터(Braintree Scientific, Inc, Braintree, MA)를 담낭 내의 작은 개구를 통해 담낭관에 삽입한다. 이어서, 카테터는 보통 담관으로 진행되고, 간으로의 벡터 환류를 예방하기 위해 담관 및 카테터 주위의 0/0 봉합의 매듭으로 적절하게 고정된다. 십이지장으로의 벡터의 유출을 회피하기 위한 Oddi의 괄약근 주위에 위치된 마이크로 클램프를 이용하여, 녹색 형광성 단백질(GFP)을 108TU/ml로 발현하는 100㎕의 렌티바이러스 벡터를, 카테터를 통해 췌관에 서서히 주사한다. 감염 2주 후, 조직학적 검사를 위해 전체 췌장을 제거한다. 48시간 후, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 제어 하의 GFP를 암호화하는 렌티바이러스의 주사는 췌장 조직을 특이적으로 표적화하였다(Doiron et al., 2012). 렌티바이러스 벡터에 의한 췌장 형질도입의 정량적 형태측정 분석은, GFP 발현에 근거하여 조직의 60%가 GFP를 발현하였음을 나타냈다. 4주 후에도 췌장에서 발현이 검출되었다(도 3). 렌티바이러스 벡터 발현된 녹색 형광성 단백질은, 조직학 및 PCR에 의해, 심장, 폐, 간, 뇌, 다리 근육, 및 신장을 포함하는 체내의 어떠한 다른 조직에서도 발견되지 않았다(데이터 도시하지 않음). 췌장 조직은 H&E로 염색하여 주사 후 2일째 및 14일째에 염증(췌장염)의 증거를 탐색하였다. 염증의 증거는 발견되지 않았다. shRNA Grb10 또는 shRNA scramble을 함유하는 렌티바이러스 벡터 주사에 따라, 활성, 주사 후 14일에 걸친 1일 음식 섭취; (shRNA scramble 마우스, 5.4 ± 0.3그램/일 [n=5] 대 shRNA Grb10 마우스, 5.9 ± 0.5그램/일 [n=6]), 및 체중 증가는 shRNA Grb10 및 shRNA scramble 그룹에서 유사하였다. 렌티바이러스 주사 후 대조군 또는 실험 그룹에서 설사는 관찰되지 않았고, 췌장(리파제) 및 간(AST, ALT) 효소는 상승되지 않았다(Doiron et al., Diabetologia 55:719-728, 2012). 이들 결과는, 렌티바이러스 주사 기술은 유해 위장, 췌장, 또는 간 효과를 야기하지 않음을 입증한다.
또한, 본 발명자들은, 글루코키나제(GK), Pdx-1 전사 인자, 및 shRNA 표적화 PTP1B를 발현하는 렌티바이러스를 작제하고 생성하였다. 수컷 C57BL/6 마우스(Charles River, Wilmington, MA, USA) 8주령을 사용하였고, 모든 실험 동안 물 및 정상 음식의 자유식 식이를 유지하였다. 렌티바이러스 벡터 주사 후 1일째에, 마우스에게 PBS 중의 BrdU(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)를 50㎍/g 체중의 용량으로 12일 동안 매일 i.p. 주사하여 베타 세포 증식을 정량화하였다. 렌티바이러스 주사 후 4주째에, 조직학적 검사를 위해 전체 췌장을 제거하였다.
생체내에서의 성체 췌장에의 직접 투여를 이용하여 단백질(들)을 과-생산하거나 단백질(들)의 생산을 억제할 수 있다. 요약하면, 본 발명자들은, 생체내에서 성체 췌장을 표적화하기 위한 방법론적 프로토콜을 개발하였다. 당해 기술은, 베타 세포 형성을 촉진하기 위한 CNIP 접근법의 유효성 확인 연구에서 사용될 것이다. 상기 기술되어 있는 렌티바이러스 주사 방법은, 성체 췌장이 직접 표적화될 수 있다고 하는 개념의 증거를 제공한다. 췌장 베타 세포를 표적화/생성하기 위한 렌티바이러스 접근법을 이용하여 수득된 데이터는 소분자 및 비-바이러스성 치료제를 이용하여 변형될 수 있다.
동물 연구: 수컷 C57BL/6 마우스(Charles River, Wilmington, MA, USA) 8주령을 사용하였고, 모든 실험 동안 물 및 정상 음식의 자유식 식이를 유지하였다. 렌티바이러스 벡터 주사 후 1일째에, 마우스에게 PBS 중의 BrdU(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)를 50㎍/g 체중의 용량으로 12일 동안 매일 i.p. 주사하였다. 렌티바이러스 주사 후 4주째에, 조직학적 검사를 위해 전체 췌장을 제거하였다(하기 참조).
면역형광성 및 면역조직학적 분석: 성체 마우스 췌장 조직을 포스페이트 완충액 4% 파라포름알데하이드 - 1% 글루타르알데하이드 중의 침지에 의해 4℃에서 밤새 고정화하였고, 후속적으로, 동결 절편화(cryostat sectioning)를 위해 조직-Tek OCT 화합물로 포매시켰다. 하기 1차 항체를 사용하였다: 항-소마토스타틴(G-10), 항-Ki-67(M-19), 항-글루카곤(K79bB10) 및 항-인슐린 A(C-12), 항체 및 대조군 토끼 IgG(Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA, USA). 증식 연구를 위해, 췌장 조직을 Ki67(M-19) 항체(Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA, USA)로 또는 래트 모노클로날 BrdU 항체(Abcam Inc., Cambridge, MA, USA)로 염색하였다. 10mM의 시트레이트 완충액 중에서 10분 동안 섹션을 끓임으로써, 이어서, 30분 동안 실온으로 냉각시킴으로써, Ki67 및 BrdU 항체에 대해 항원 회복(Antigen retrieval)를 수행하였다. DAPI(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)로 핵을 대비 염색하였다(counterstained). 사용되는 형광성 2차 항체는 당나귀 항-염소-플루오레세인, 염소 항-마우스-플루오레세인, 염소 항-토끼 텍사스 레드, 및 당나귀 항-염소 텍사스 레드(Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA, USA)를 포함하였다. 베타 세포 면적은, Olympus FV-1000 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 스캐닝된 전체 췌장 표면으로 나눈 인슐린 면역염색에 대해 양으로 염색되는 세포의 표면적을 나타낸다. 인슈린 양성 및 총 췌장 면적은 Image J(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)로 정량화되었다. 베타 세포 질량은, 췌장 습윤 중량을 곱한 베타-세포 면적으로서 계산하였다. 조건당 3마리 이상의 마우스를 분석하였다. 췌장 조직은 H&E로 염색하여 렌티바이러스의 주사 후 2일째 및 14일째에 염증(췌장염)의 증거를 탐색하였다.
웨스턴 블롯: 웨스턴 블롯을 위해, 10 및 15% SDS/PAGE 상에서 등량의 총 단백질을 분리하였고, 니트로셀룰로스 막 상에 이동시켰다. 이어서, 상기 막을 0.1%의 TBS Tween-20 중의 5% 무지방 우유로 차단하였고, Pdx-1(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), PTP1B(Abcam Inc., Cambridge, MA, USA), 글루코키나제(Santa Cruz Inc, Santa Cruz, CA, USA), 및 GAPDH(G9545, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA)에 대항하는 특이적 항체로 프로빙하였다. 이어서, 막을 HRP-접합된 2차 항체(NA934)와 항온배양하였고, 화학발광성 시약(Amersham Bioscience, GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA)으로 전개시켰다.
통계학적 분석: 그 결과는 평균 ± SEM으로서 제시된다. 적절한 경우, 스튜던츠 비쌍형 t 시험 또는 원-웨이 ANOVA를 이용하여 통계학적 비교를 수행하였다. 그 결과는 p < 0.05인 경우 통계학적으로 유의한 것으로 간주되었다.
SEQUENCE LISTING <110> BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR IN VIVO INDUCTION OF PANCREATIC BETA CELL FORMATION <130> STTM0009WO / 2012.021.HSCS <150> US 61/678,077 <151> 2012-07-31 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 703 <212> DNA <213> mus musculus <400> 1 tggcttatcg aaattaatac gactcactat agggagaccc aagcttagat ctgtttaaac 60 ctcgagaatt catggctgtg gatactacaa ggaggggagc ccagtcgttg actctggtag 120 agcagatcct ggcagagttc cagctgcagg aggaagacct gaagaaggtg atgagccgga 180 tgcagaagga gatggaccgt ggcctgaagc tggagaccca tcaggaggcc agtgtaaaga 240 tgttgcccac ctacgtgcgt tccaccccag aaggctcaga agttggagac tttctctcct 300 tagacctggg aggaaccaac ttcagggtga tgctggtgaa agtgggggag ggggaggcag 360 gacagtggag cgtgaagacg aaacaccaga tgtattccat ccccgaggac gccatgacgg 420 gcactgcgga gatgctcttt gactacatct ctgagtgcat ctctgacttc ctggacaagc 480 atcagatgaa acacaagaaa ctacccctgg gcttcacctt ctccttccct gtaaggcacg 540 aagacataga caagggcatc ctgctcaact ggaccaaggg cttcaaggcc tccggagcag 600 aagggaacaa catcgtggga cttctccgag atgctatcaa gaggagaggg gactttgaga 660 tggatgtggt ggcaatggtg aatgacacgg tggccacaat gat 703 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 2 gccaggacat tcgacatgaa 20 <210> 3 <211> 254 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ccatgaacag tgaggagcag tactacgcgg ccacacagct ctacaaggac ccgtgcgcat 60 tccagagggg cccggtgcca gagttcagcg ctaacccccc tgcgtgcctg tacatgggcc 120 gccagccccc acctccgccg ccaccccagt ttacaagctc gctgggatca ctggagcagg 180 gaagtcctcc ggacatctcc ccatacaaag tgcccccgct cgcctccgac gacccggctg 240 gcgctcacct ccac 254 <210> 4 <211> 1398 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgctggacg acagagccag gatggaggcc gccaagaagg agaaggtaga gcagatcctg 60 gcagagttcc agctgcagga ggaggacctg aagaaggtga tgagacggat gcagaaggag 120 atggaccgcg gcctgaggct ggagacccat gaagaggcca gtgtgaagat gctgcccacc 180 tacgtgcgct ccaccccaga aggctcagaa gtcggggact tcctctccct ggacctgggt 240 ggcactaact tcagggtgat gctggtgaag gtgggagaag gtgaggaggg gcagtggagc 300 gtgaagacca aacaccagat gtactccatc cccgaggacg ccatgaccgg cactgctgag 360 atgctcttcg actacatctc tgagtgcatc tccgacttcc tggacaagca tcagatgaaa 420 cacaagaagc tgcccctggg cttcaccttc tcctttcctg tgaggcacga agacatcgat 480 aagggcatcc ttctcaactg gaccaagggc ttcaaggcct caggagcaga agggaacaat 540 gtcgtggggc ttctgcgaga cgctatcaaa cggagagggg actttgaaat ggatgtggtg 600 gcaatggtga atgacacggt ggccacgatg atctcctgct actacgaaga ccatcagtgc 660 gaggtcggca tgatcgtggg cacgggctgc aatgcctgct acatggagga gatgcagaat 720 gtggagctgg tggaggggga cgagggccgc atgtgcgtca ataccgagtg gggcgccttc 780 ggggactccg gcgagctgga cgagttcctg ctggagtatg accgcctggt ggacgagagc 840 tctgcaaacc ccggtcagca gctgtatgag aagctcatag gtggcaagta catgggcgag 900 ctggtgcggc ttgtgctgct caggctcgtg gacgaaaacc tgctcttcca cggggaggcc 960 tccgagcagc tgcgcacacg cggagccttc gagacgcgct tcgtgtcgca ggtggagagc 1020 gacacgggcg accgcaagca gatctacaac atcctgagca cgctggggct gcgaccctcg 1080 accaccgact gcgacatcgt gcgccgcgcc tgcgagagcg tgtctacgcg cgctgcgcac 1140 atgtgctcgg cggggctggc gggcgtcatc aaccgcatgc gcgagagccg cagcgaggac 1200 gtaatgcgca tcactgtggg cgtggatggc tccgtgtaca agctgcaccc cagcttcaag 1260 gagcggttcc atgccagcgt gcgcaggctg acgcccagct gcgagatcac cttcatcgag 1320 tcggaggagg gcagtggccg gggcgcggcc ctggtctcgg cggtggcctg taagaaggcc 1380 tgtatgctgg gccagtga 1398 <210> 5 <211> 465 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Leu Asp Asp Arg Ala Arg Met Glu Ala Ala Lys Lys Glu Lys Val 1 5 10 15 Glu Gln Ile Leu Ala Glu Phe Gln Leu Gln Glu Glu Asp Leu Lys Lys 20 25 30 Val Met Arg Arg Met Gln Lys Glu Met Asp Arg Gly Leu Arg Leu Glu 35 40 45 Thr His Glu Glu Ala Ser Val Lys Met Leu Pro Thr Tyr Val Arg Ser 50 55 60 Thr Pro Glu Gly Ser Glu Val Gly Asp Phe Leu Ser Leu Asp Leu Gly 65 70 75 80 Gly Thr Asn Phe Arg Val Met Leu Val Lys Val Gly Glu Gly Glu Glu 85 90 95 Gly Gln Trp Ser Val Lys Thr Lys His Gln Met Tyr Ser Ile Pro Glu 100 105 110 Asp Ala Met Thr Gly Thr Ala Glu Met Leu Phe Asp Tyr Ile Ser Glu 115 120 125 Cys Ile Ser Asp Phe Leu Asp Lys His Gln Met Lys His Lys Lys Leu 130 135 140 Pro Leu Gly Phe Thr Phe Ser Phe Pro Val Arg His Glu Asp Ile Asp 145 150 155 160 Lys Gly Ile Leu Leu Asn Trp Thr Lys Gly Phe Lys Ala Ser Gly Ala 165 170 175 Glu Gly Asn Asn Val Val Gly Leu Leu Arg Asp Ala Ile Lys Arg Arg 180 185 190 Gly Asp Phe Glu Met Asp Val Val Ala Met Val Asn Asp Thr Val Ala 195 200 205 Thr Met Ile Ser Cys Tyr Tyr Glu Asp His Gln Cys Glu Val Gly Met 210 215 220 Ile Val Gly Thr Gly Cys Asn Ala Cys Tyr Met Glu Glu Met Gln Asn 225 230 235 240 Val Glu Leu Val Glu Gly Asp Glu Gly Arg Met Cys Val Asn Thr Glu 245 250 255 Trp Gly Ala Phe Gly Asp Ser Gly Glu Leu Asp Glu Phe Leu Leu Glu 260 265 270 Tyr Asp Arg Leu Val Asp Glu Ser Ser Ala Asn Pro Gly Gln Gln Leu 275 280 285 Tyr Glu Lys Leu Ile Gly Gly Lys Tyr Met Gly Glu Leu Val Arg Leu 290 295 300 Val Leu Leu Arg Leu Val Asp Glu Asn Leu Leu Phe His Gly Glu Ala 305 310 315 320 Ser Glu Gln Leu Arg Thr Arg Gly Ala Phe Glu Thr Arg Phe Val Ser 325 330 335 Gln Val Glu Ser Asp Thr Gly Asp Arg Lys Gln Ile Tyr Asn Ile Leu 340 345 350 Ser Thr Leu Gly Leu Arg Pro Ser Thr Thr Asp Cys Asp Ile Val Arg 355 360 365 Arg Ala Cys Glu Ser Val Ser Thr Arg Ala Ala His Met Cys Ser Ala 370 375 380 Gly Leu Ala Gly Val Ile Asn Arg Met Arg Glu Ser Arg Ser Glu Asp 385 390 395 400 Val Met Arg Ile Thr Val Gly Val Asp Gly Ser Val Tyr Lys Leu His 405 410 415 Pro Ser Phe Lys Glu Arg Phe His Ala Ser Val Arg Arg Leu Thr Pro 420 425 430 Ser Cys Glu Ile Thr Phe Ile Glu Ser Glu Glu Gly Ser Gly Arg Gly 435 440 445 Ala Ala Leu Val Ser Ala Val Ala Cys Lys Lys Ala Cys Met Leu Gly 450 455 460 Gln 465 <210> 6 <211> 283 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Asn Gly Glu Glu Gln Tyr Tyr Ala Ala Thr Gln Leu Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Pro Cys Ala Phe Gln Arg Gly Pro Ala Pro Glu Phe Ser Ala Ser Pro 20 25 30 Pro Ala Cys Leu Tyr Met Gly Arg Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro His 35 40 45 Pro Phe Pro Gly Ala Leu Gly Ala Leu Glu Gln Gly Ser Pro Pro Asp 50 55 60 Ile Ser Pro Tyr Glu Val Pro Pro Leu Ala Asp Asp Pro Ala Val Ala 65 70 75 80 His Leu His His His Leu Pro Ala Gln Leu Ala Leu Pro His Pro Pro 85 90 95 Ala Gly Pro Phe Pro Glu Gly Ala Glu Pro Gly Val Leu Glu Glu Pro 100 105 110 Asn Arg Val Gln Leu Pro Phe Pro Trp Met Lys Ser Thr Lys Ala His 115 120 125 Ala Trp Lys Gly Gln Trp Ala Gly Gly Ala Tyr Ala Ala Glu Pro Glu 130 135 140 Glu Asn Lys Arg Thr Arg Thr Ala Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Leu Glu 145 150 155 160 Leu Glu Lys Glu Phe Leu Phe Asn Lys Tyr Ile Ser Arg Pro Arg Arg 165 170 175 Val Glu Leu Ala Val Met Leu Asn Leu Thr Glu Arg His Ile Lys Ile 180 185 190 Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Glu Asp Lys Lys 195 200 205 Arg Gly Gly Gly Thr Ala Val Gly Gly Gly Gly Val Ala Glu Pro Glu 210 215 220 Gln Asp Cys Ala Val Thr Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ala Leu Pro Pro 225 230 235 240 Pro Pro Pro Pro Gly Gly Ala Val Pro Pro Ala Ala Pro Val Ala Ala 245 250 255 Arg Glu Gly Arg Leu Pro Pro Gly Leu Ser Ala Ser Pro Gln Pro Ser 260 265 270 Ser Val Ala Pro Arg Arg Pro Gln Glu Pro Arg 275 280 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 7 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 8 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10

Claims (26)

  1. 시험관내에서 또는 생체내에서 세포의 베타 세포 형성을 유도하는 방법으로서,
    상기 방법은, 포유동물 세포에 (i) 글루코키나제(GK) 수준을 증가시키는 제1 작용제, (ii) 티로신 수용체 키나제 활성 및/또는 티로신 키나제 관련 수용체 활성을 증가시키는 제2 작용제, 및 (iii) Pdx-1 매개된 전사를 증가시키는 제3 작용제의 조합물을 제공함을 포함하는, 시험관내에서 또는 생체내에서 세포의 베타 세포 형성을 유도하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 췌장 세포, 간 세포, 내장 K 세포, 신경, 또는 줄기 세포인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 베타 세포 형성의 유도가 시험관내에서 이루어지는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 치료되는 대상체로부터 표적 세포를 단리함을 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 치료되는 대상체에게 처리된 표적 세포를 체내이식함을 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 포유동물 세포가, 치료되는 대상체에 대해 이종성인, 방법.
  7. 생체내에서 췌장 세포로부터 베타 세포 형성을 유도하는 방법으로서,
    상기 방법은, 생체내에서 췌장에 (i) 글루코키나제(GK) 수준을 증가시키는 제1 작용제, (ii) 티로신 수용체 키나제 활성 및/또는 티로신 키나제 관련 수용체 활성을 증가시키는 제2 작용제, 및 (iii) 췌장 세포에서의 Pdx-1 매개된 전사를 증가시키는 제3 작용제의 조합물을 제공함을 포함하는, 생체내에서 췌장 세포로부터 베타 세포 형성을 유도하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제1 작용제가, 글루코키나제를 암호화하는 핵산인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 글루코키나제를 암호화하는 핵산이, 바이러스 벡터 내에 추가로 포함되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 방법.
  11. 제9항에 있어서, 암호화 서열의 3'에 우드척(woodchuck) 간염 바이러스(WPRE)의 전사 후 조절 요소를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 제1 작용제가 글루코키나제의 소분자 활성인자인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 글루코키나제의 활성인자가 R1440, RO0281675, RO4389620(피라글리아틴), LY2121260, PSN-GK1, 또는 GKA-50인, 방법.
  14. 제7항에 있어서, 상기 제2 작용제가 단백질 티로신 포스파타제 1B의 억제제인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 단백질 티로신 포스파타제 1B(PTP1B) 억제제가 단백질 티로신 키나제 포스파타제 1B의 shRNA 억제제 또는 PTP1B 안티-센스 DNA인, 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 단백질 티로신 포스파타제 1B 억제제가 Wyeth Research Inc., 32D; 안티센스 ISIS-PTP1BRX; Abbott Laboratories, Inc., Isoxazole™; Abbott Laboratories, Inc., PTP1B의 발현을 하향조절하도록 고안된 안티센스 올리고뉴클레오타이드; Merck Frosst Center for Therapeutic Research, PTP1B 화합물 1 및 3의 선택적 억제제; Incyte Corporation, Inc., (S)-이소티아졸리디논((S)-IZD) 헤테로사이클릭 포스포티로신; 또는 Affymax, Inc., 트리아릴 설폰아미드계 PTP1B 억제제인, 방법.
  17. 제7항에 있어서, 상기 제3 작용제가, Pdx-1을 암호화하는 핵산인, 방법.
  18. 제7항에 있어서, 상기 제1 작용제, 제2 작용제, 및 제3 작용제가 단일 조성물로 제공되는, 방법.
  19. 제7항에 있어서, 상기 제1 작용제, 제2 작용제, 및 제3 작용제가 10분 투여 윈도우(window) 내에 제공되는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 제1 작용제, 제2 작용제, 및 제3 작용제가 순차적으로 제공되는, 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 제1 작용제, 제2 작용제, 및 제3 작용제가 동시에 제공되는, 방법.
  22. 제7항에 있어서, 상기 제1 작용제, 제2 작용제, 및 제3 작용제가, 췌관을 통한 췌장의 주사에 의해 제공되는, 방법.
  23. 제7항에 있어서, 상기 제1 작용제와 제2 작용제, 제1 작용제와 제3 작용제, 또는 제2 작용제와 제3 작용제가 동일한, 방법.
  24. 1형 또는 2형 당뇨병의 치료 방법으로서,
    상기 방법은, 생체내에서 췌장에 (i) 췌장 세포에서 기능성 글루코키나제 단백질을 발현하도록 구성된 글루코키나제 발현 카세트, (ii) 티로신 포스파타제 1B 억제제, 및 (iii) 췌장 세포에서 기능성 Pdx-1 단백질을 발현하도록 구성된 Pdx-1 발현 카세트를 포함하는 치료학적 조성물을 제공함을 포함하고, 여기서, 췌장에서 췌장 베타 세포가 유도되는,
    1형 또는 2형 당뇨병의 치료 방법.
  25. 제24항에 있어서, 당뇨병이 1형 당뇨병인, 방법.
  26. 제24항에 있어서, 당뇨병이 2형 당뇨병인, 방법.
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