CN1553963A - 用于遗传修饰造血祖细胞的方法和这些被修饰细胞的应用 - Google Patents
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Abstract
描述了涉及基因治疗的组合物和方法,特别适用于造血祖(HP)细胞,转导的细胞和获得它们的方法,以及使用它们以在人受试者中提供修饰的造血细胞的移入。本发明特别涉及HP细胞的体外基因治疗来治疗或预防HIV感染。
Description
本申请要求于2001年7月10日提交的美国临时申请No.60/304,127,2001年7月10日提交的美国临时申请No.60/304,283,2001年12月21日提交的美国临时申请No.60/343,484,和2002年6月4日提交的美国临时申请No.60/386,063的利益,所有这些的内容通过参考结合于此。
贯穿本申请,各种出版物在括号中被参考。这些出版物的完全引用被发现按照字母顺序列于说明书之后和权利要求之前。这些出版物以其整体的内容因此通过参考结合入本申请,以更充分描述本发明所属领域的状态。
发明领域
本发明涉及基因治疗,尤其适用于造血祖细胞,适于转导细胞和获得这些细胞的方法,和使用方法。
发明背景
基因治疗是指利用遗传序列,和将其引入细胞,以改变细胞的遗传组成,从而改变那些细胞的性质或功能。例如,基因治疗可用于通过提供给细胞发挥所需功能的基因的良好拷贝来校正遗传缺陷,或者用于提供一种基因,其编码RNA或蛋白质,所述蛋白质抑制非理想的细胞或病原体活性。
基因治疗可以针对各种遗传相关疾病的任何一种。特别感兴趣的是血液或免疫系统疾病,因为相对容易从受试者收集造血细胞,允许用于体外程序。这些包括血红蛋白病,白细胞产生或功能缺陷,免疫缺陷症,溶酶体贮积病和干细胞缺陷症,如范康尼氏贫血症,慢性肉芽肿病,高歇病,G6PD缺陷等。其中许多疾病已经通过异体骨髓细胞移植成功地进行了治疗(Parkman 1986)。但是,需要免疫抑制或存在免疫作用例如移植物排斥是异体骨髓移植的缺陷。造血干细胞的基因治疗已被提议作为治疗影响人造血系统的疾病的备选方式。
尽管早期允诺对人进行基因治疗是成功的,但是临床上的成功很难取得成功,尽管在过去的10年中,付出了大量的努力(Mountain,2000)。这是因为,至少部分如此,基因转移效率较低,不能修饰足够数量的细胞,不能靶向于适当的细胞类型,以及缺乏在人受试者体内持久的理想作用。
已经证实,人造血干细胞(HS细胞)的基因治疗实际上很难实施(Kohn等1998,Halene和Kohn 2000,Kume等1999)。在人体进行的大部分实验中,含基因的外周血淋巴细胞的水平已经降低,并且这些已经是短暂的,提示没有成功转导重组HS细胞(Bordignon等1995,Kohn 1995,Kohn等1998,Dunbar等1995,Hoogerbrugge等1996)。这是部分由于体内相对少的HS和造血祖细胞(HP细胞)(Bertolini等1998,Reis 1999),而且在采用一些鼠逆转录病毒载体进行转导时,要求这些细胞被活化。这与人静止HS细胞中兼嗜性受体的水平较低有关(Bodine等1998)。多数的人HS细胞是静止的,对刺激的反应相对较慢(Hao等1996,Gothot等1998),在被诱导分裂时,趋于丢失长期种群恢复能力(Traycoff等1998)。目前为止,几乎所有使用HS细胞试图在人体进行的基因治疗遭遇这两个基本问题:没有足够数量全能的,并且能够长期移入的HS细胞被转导,以产生治疗效果,其次,转导的细胞不能长期持续提供修饰的造血细胞。
最有前途的对人HP细胞进行基因治疗的实验是,将基因转入患有X连锁恶性复合免疫缺陷症(SCID)的儿童体内,其导致免疫系统与包含基因的T淋巴细胞重组(Cavazzana-Calvo等2000;Hacein-Bey-Abina等2002)。这个实验使用的是来源于儿科患者(<12月)骨髓的CD34+细胞,并且每千克体重递送超过106个转导的细胞。可从儿童,尤其是低体重儿童分离的CD34+细胞(每千克体重)的数目远高于成年人。胸腺生成(thymopoiesis)在儿童体内也更活跃。而且,该研究是与众不同,因为在SCID-X1环境中胸腺生成仅由含有外源基因的CD34+细胞产生(Cavazzana-Calvo等2001)。在某些方面,该研究类似于那些进行骨髓部分切除术的研究,因为灌注的细胞能够将SCID患者体内未被占据的生理空间添满。异体骨髓移植的早期研究显示,HS细胞移植物在未进行骨髓部分切除术的患者体内不能维持,主要是因为受体HS细胞的持续存在(Parkman 1986)。因此,从以前采用人HS细胞,在部分切除术的环境中进行的移植研究中得到的结论,不能简单地用于非部分切除术的系统中。
人造血祖细胞的用于基因治疗的人临床实验的其它报道的积极结果更少。Kohn等人1999年报道了一个临床实验的结果,他们使用转导了一种编码针对HIV的RRE诱饵(RNA分子)基因的来源于儿科患者(8-17岁)的骨髓衍生的CD34+细胞。但是该实验没有获得祖细胞显著的转导和移入。在另外一个实验中,在转导一种标记基因后用的HP细胞治疗胸腺癌或卵巢癌患者。但是,在骨髓部分切除术后,仅观察到标记细胞的瞬时存在(Bagnis等2002)。在对包括三名高歇病患者进行的临床实验显示,在注射后,包含基因的载体在外周血和骨髓中存在长达3个月,但水平极低(Dunbar等1998)。在另一个例子中,对5位慢性肉芽肿疾病(CGD)患者进行临床实验,实验中将p47phox基因转入外周血来源的CD34+细胞。尽管在注射后的前几个月,在外周血中发现了被校正的嗜中性粒细胞,但是在注射6个月后,便无法检测了(Malech等1997)。此外,在一项治疗范康尼氏贫血症的实验中,互补组C基因被插入到CD34+细胞中,但是在注射后的患者体内,仅短暂检测到该基因(Liu等1999)。
与X偶联SCID情形相反,这些试验中的不良结果可能反映了被治疗的细胞与未治疗的细胞相比缺乏生存优势。此外,在多数例子中,将经过处理的细胞群体给药给未进行或进行部分骨髓切除术的患者,其要求转导细胞与宿主干细胞竞争,才能“移入”。
其他因素也可以发挥作用,在感染HIV的患者体内,HS细胞的数目会被降低(Marandin等1996),在这种情况下更难获得足够数目的这类细胞。而且,HIV感染个体的HS细胞在它们的复制和克隆能力方面受到威胁,并且表现出凋亡的增强趋势(Vignoli等1998,Zauli等1996)。使用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)转移外周血HP细胞的作用在HIV感染个体中被证明(Law等1999)。在给药G-CSF四天后达到最大的转移。去除白细胞的产物每千克含有大约3×106个CD34+细胞。Law等人没有转导分离的CD34+细胞,也没有显示分离的CD34+细胞能够在长期移入受试者。他们只是推测HP细胞的基因治疗有可能为HIV感染提供一种治疗方式。他们还建议,讨论AIDS的基因治疗需要的干细胞的数目还不成熟,因为还有许多不确定的因素,包括遗传修饰细胞的移入潜力,需要化疗,需要或不需要骨髓部分切除术,需要建立被注入细胞的生态位,和在注入细胞后AIDS患者的骨髓中的微环境的未知反应。
在骨髓部分切除术过程中,有效恢复造血系统,尤其是血小板的恢复需要的来源于外周血的CD34+细胞的最小数目已被建议为每kg体重受试者2.0×106(Zimmerman 1995)。但是,在本发明之前,在未进行骨髓部分切除术时,有效移入所需的数目是未知的。是否为被注入细胞必须建立生态位,或者骨髓中的宿主细胞的竞争效应都是未知的。如上所提及,在感染HIV时尤其如此。
许多研究已经使用模式动物系统,尤其是小鼠,来改进转导的方法和增加移入。但是,尽管鼠的HS细胞可以被逆转录病毒载体有效转导,但翻译来自小鼠系统的发现以应用于人HS细胞时已经显示了非常大的困难(Halene和Kohn 2000;Richter和Karlson 2001)。
基因治疗的治疗应用的进一步困难在于为了获得足够的转导细胞数量的扩大程序(Schilz等,2000)。Schilz等人在小鼠模型中测定了转导效率和移入,但是还不清楚这些结论怎样应用于人受试者。
上述每一项因素在本发明中均被阐述。
发明概述
本发明提供了一种适于对人受试者给药的组合物,其含有药用载体和每kg将被给药该组合物的人受试者体重至少1.63×106CD34+造血细胞,至少0.52×106的这类CD34+造血细胞被表达抗HIV剂的病毒构建体转导。
本发明还提供了一种将目的基因插入到人受试者的造血细胞的方法,包括:
a)将CD34+造血祖细胞转移到人受试者的血液中;
b)通过单采血液成分术(apheresis)从受试者分离白细胞;
c)采用免疫筛选方法从已分离的白细胞中分离CD34+造血细胞;
d)在存在使细胞与转导载体共定位(colocalize)的试剂的条件下,将步骤c)的CD34+造血细胞进行用目的基因的转导过程;
e)在步骤d)以后,确定CD34+造血细胞的总数。并且,如果总数是每千克人受试者体重至少1.63×106细胞,则进入步骤f),如果在步骤d)以后,每千克人受试者体重CD34+造血细胞的总数少于1.63×106细胞,则进行至少步骤b)-d),并合并CD34+造血细胞;和
f)将CD34+造血细胞传递到受试者,
从而将目的基因插入到人受试者的造血细胞。
本发明进一步提供了一种该组合物用于制备治疗感染HIV的人受试者的药物的用途,该组合物含有药用载体和每千克将被给药该组合物的人受试者体重的至少1.63×106CD34+造血细胞,至少每千克0.52×106CD34+这类细胞被表达抗HIV剂的病毒构建体转导。
本发明也另外提供了一种试剂盒,包括:
a)一定数量的能够将造血祖细胞转移到人受试者体内的试剂;
b)一种培养基,含有至少一种适合于培养CD34+造血细胞的细胞因子;
c)一种逆转录病毒载体,其包含一种序列的核苷酸,其在细胞内产生核酶,核酶的序列为5′-UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAGGAC GAA ACU GGC UCC-3′(Rz2);并且
d)一些组织培养容器,在其内部包被一种重组的纤连蛋白片段。该构思还提供了包含该试剂盒和其使用的说明书的包装。
附图描述
图1(A).典型逆转录病毒的复制周期。
(A)病毒结合在靶细胞上的细胞表面受体上,并且基因组RNA在融合和去掉病毒外壳后进入到靶细胞内。
(B)发生逆转录导致病毒RNA转换为cDNA。
(C)cDNA进入到核内并被转换为环状形式。
(D)然后cDNA整合到宿主基因组中。
(E)原病毒转录以产生病毒RNA和mRNA。
(F)翻译产生病毒蛋白。
(G)病毒编码的蛋白和病毒RNA包装形成病毒核心。
(H)病毒核心获得膜并通过出芽穿过细胞膜离开细胞。
图1(B).设想的发明作用模型。核酶可以在HIV-1病毒的生命周期的几个点的任何一处发挥作用。它可以在去掉病毒外壳后和逆转录之前切割基因组RNA,或者它可以在核内或胞质内切割病毒转录物以抑制病毒蛋白的翻译,或者它可以组装前或组装过程中切割新形成的基因组RNA。
图2.核酶基因转移以治疗HIV/AIDS的科学原理。A.正常的CD34+造血祖细胞产生可被HIV-1感染的淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞,这些感染的细胞死亡之前产生HIV-1颗粒。B.转导了核酶基因的CD34+造血祖细胞产生表达核酶基因的淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞。在这两种关键的细胞类型中,具有治疗作用的核酶切割HIV-1RNA并抑制HIV-1复制。
图3.血细胞生产的示意图。CD34+造血祖细胞通过中间祖细胞产生增加成熟的细胞。对于HIV/AIDS感染而言,关键的细胞是指CD4+T-淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞(带星号)。图中示出的所有细胞均是造血细胞。
图4.Rz2靶位点的定位。A.HIV-1基因组的示意图,显示出复制性的,调节性的,和附属性的基因的定位。B.tat基因中的核酶序列和互补性靶序列和杂交序列。切割直接发生在三联体GUA的3’端。C.在编码Tat和Vpr蛋白的基因中,GUA靶序列的定位。
图5.CD34+细胞一期临床实验的示意性图示,十个HIV-1感染受试者被登记。LNL6和RRz2载体被分别引入到自体的CD34+造血祖细胞。两种细胞种群均被注入到未经骨髓部分切除术治疗的患者体内。
图6.retronectin对于转导的影响。本图显示了retronectin如何通过使CD34+细胞紧密靠近逆转录病毒载体而促使逆转录病毒转导。
图7.长期的载体存在和表达。在白细胞亚群中使用针对neoR基因的引物进行半定量PCR分析,所述引物与RRz2载体中Rz2序列重叠。LNL6和RRz2的PCR产物分别是174和216个碱基对,并且包括一段neoR基因的非翻译末端的区域。图A显示的是,在注入转导的CD34+细胞2年后,在第5号患者体内的外周血单核细胞(PBMC),骨髓单核细胞(BMMC),T淋巴细胞和单核细胞中LNL6和RRz2载体的序列。图B显示的是,如通过RT-PCR测定,在3个代表性患者的PBMC内,LNL6和RRz2的短期和长期表达。采用放射性标记引物,在逆转录酶(RT+)巢式聚合酶链式反应中评估表达情况。对于每一个样品,均包括不加逆转录酶(-RT)的反应。图C.在天然T淋巴细胞中检测载体序列。胶图显示的是,在注入转导的CD34+细胞两年后,在选自7号患病的CD4+和CD8+T淋巴细胞,和天然淋巴细胞亚群中PCR分析LNL6和RRz2载体序列。图D,E和F显示的是在天然T淋巴细胞内载体序列的检测。胶图显示的是,在选自三个患者的CD4+和CD8+T淋巴细胞,和天然淋巴细胞内,LNL6和RRz2载体序列的PCR结果。在天然T淋巴细胞亚群中,在早至注入后四周检测到了载体序列(F列),注入转导的CD34+细胞两年半和两年后的长期检测分别显示在E和D列。
图8.在10个患者体内,通过PCR检测载体的总结。通过PCR检测细胞来进行LNL6或RRz2载体检测,直至注入后36个月。如所示,细胞类型为骨髓单核细胞,外周血单核细胞(PBMC),粒细胞,T淋巴细胞和单核细胞。每个患者的数据结果均在Y轴被标记出来,加以显示。使用纤连蛋白片段(CH-296)后观察长期的基因标记,使用纤连蛋白片段导致提高转导效率(见表1)。载体检测的存在与否用圆圈显示,而与载体的拷贝数无关:黑色,两种载体均被检测到;空心,两种载体均未被检测到;带竖条纹的圆圈,仅核酶载体被检测到;带横条纹的圆圈,仅LNL6对照载体被检测到。
图9.在T淋巴细胞和骨髓单核细胞中载体的衰变动力学比较。通过T淋巴细胞和骨髓单核细胞比较载体拷贝的衰变速度显示,与LNL6相比,RRz2标记在T淋巴细胞中的持续时间增加(A)。LNL6标记显示在图(B)。图表显示了以基线的百分率表示的载体标记水平,基线被定义为每种细胞类型在4周和12周载体拷贝数的平均值(红色菱形和红线:T淋巴细胞,空心方形和黑线:BMMC)。(C)和(D)显示了描述T淋巴细胞(C)和PBMC(D)中转导了RRz2的CD34+细胞剂量的线性关系,及LNL6和RRz2拷贝数之间的差别(保护指数(protection index))的图表。(E),(F),(G)和(H)显示了T淋巴细胞和骨髓单核细胞中载体衰变动力学之间的比较,和注入的转导的CD34+细胞剂量的相关性。通过比较易受HIV感染攻击和不易受HIV感染攻击的细胞中RRz2和LNL6载体DNA的衰变,评估针对HIV相关细胞消耗的核酶诱导的保护作用。E列显示第7号患者在标出的时间点,在CD4+T淋巴细胞中PCR检测RRz2和LNL6载体。将对于每条带的放射性量标准化至已知的在相同PCR反应中运行的标准物(未显示),RRz2对LNL6的比值(数值显示在每块胶的下面)对于时间进行了作图(列F)。作为RRz2保护作用的阴性对照,BMMC(含有的大部分不易受HIV感染攻击的细胞)的图列在F列(PCR胶图未显示)。通过线性回归评估RRz2标记对于LNL6标记的比值的时间变化趋势,P值反应了与变化率为0的差别(预计假设RRz2和LNL6标记以同样的速率进行衰变)。在这个患者体内,在BMMC中RRz2对LNL6标记的比率随时间的延伸几乎恒定不变(斜率=-0.0005,与0不同,P=.281)。相反,在易受HIV攻击的T淋巴细胞中,随着时间RRz2标记相对于LNL6标记增加(斜率=0.0036,与0不同,P=.008)。在趋势曲线之间的差别统计学上非常显著(P<.0006)。为了确定是否LNL6对RRz2基因标记的差异衰变的数量级,在特定的患者体内,与注入的转导了RRz2的细胞相关,每种载体的衰变斜率间的差别与再次引入的转导了RRz2的CD34+细胞的数目相关(spearman rank)。通过线性回归计算对于LNL6和RRz2的患者特异衰变斜率,这些斜率之间(RRz2-LNL6)的差别被做为RRz2介导的保护作用的指示。G列和H列图示了转导了RRz2的CD34+细胞剂量之间的线性相关和置信区间(点线),和在T淋巴细胞(图H)和PBMC(图G)中LNL6和RRz2拷贝数之间的差别(保护指数)。
图10.在被研究的患者体内CD4+细胞的绝对数量(A)和病毒负荷(B)。通过研究,显示了患者1-10每mm3CD4+细胞的绝对数量(A)和每毫升血中HIV RNA拷贝中的病毒负荷(B)。在某些患者体内,在注入后第一天,观察到病毒负荷最初增加,这些患者在转移期间不再继续抗逆转录病毒的治疗。为了阻止在转导过程中潜在的MMLV逆转录酶的抑制,中止用药,或以核苷类逆转录酶抑制剂替代非核苷类逆转录酶抑制剂或蛋白酶抑制剂,均被包括在方案中。偶然出现的病毒血症通过修改抗逆转录病毒治疗被加以纠正。
图11.自体CD34+I期临床研究,第005号患者造血细胞种群的长期标记。胶图显示的是,在注入2年后的骨髓和外周血细胞群中,LNL6和RRz2标记细胞的PCR扩增条带。
图12.自体CD34+细胞I期临床研究的4个患者的外周血单核细胞的基因表达。在注入2年后两个患者的LNL6和RRz2的表达均被显示。使用放射性标记的引物,在逆转录酶-巢式PCR反应中对表达进行评估。对于每个样品,均包括不加RT(-RT)的反应。RT的存在与否被标出。
图13.在第007号患者体内T淋巴细胞(CD4+,CD8+)亚群的长期标记。结果显示了在注入自体的转导了LNL6或RRz2的CD34+细胞1年后,在天然和记忆性CD4+和CD8+淋巴细胞的标记。
图14.多重靶向能力的RNAi的设计简图。RNA转录物含有三个RNAi单元,每个单元包含有义(1A,2A,3A)和反义(1B,2B,3B)片段,这些片段均被间隔区(SP)分开。这些RNAi单元的两侧有能自身切割的锤头形和发夹形核酶,其切割位置用箭头标出。
发明详述
本发明提供了一种组合物,其含有药用载体和每千克将被给药该组合物的人受试者体重至少1.63×106CD34+造血细胞,至少0.52×106的这类CD34+造血细胞被表达抗HIV剂的病毒构建体转导。备选地,该组合物含有每千克体重至少约1.7×106CD34+造血细胞,至少大约0.5×106这样的细胞被病毒载体转导。该组合物适于对人受试者给药。人受试者可以是成年人。
病毒构建体可以是逆转录病毒构建体。该组合物还可以基本上不含细胞因子,或者基本上不含病毒。
本发明还提供了一种组合物,其中转导了每千克将被给药该组合物的人受试者体重至少5×106CD34+造血细胞;或包含每千克人受试者体重至少9.37×106CD34+造血细胞,其中至少5×106这类CD34+造血细胞被转导;或者包含每千克人受试者体重至少约10×106CD34+造血细胞,其中至少5×106这类细胞被转导;或者其中抗HIV剂是一种RNA分子;或者抗HIV剂是一种RNAi分子;或者其中抗HIV剂是一种反义分子;或者其中抗HIV剂是一种核酶。核酶可以包含具有序列5′-UUA GGA UCCUGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC-3′(Rz2)的核苷酸。
在该组合物中,转导的CD34+细胞能够移入,并且在受试者体内至少12个月产生后代细胞。这些细胞可以在原代细胞培养物中。
还公开了一种组合物,其含有药用载体和每千克将被给药该组合物的人受试者体重至少1.63×106CD34+造血细胞,至少0.52×106的这类CD34+造血细胞被表达抗HIV剂的病毒构建体转导,
其中通过包含下述步骤的方法来生产该组合物:
(a)从受试者分离CD34+造血细胞;
(b)使用至少一种细胞因子培养CD34+造血细胞;
(c)在存在增强细胞和病毒构建体共定位的试剂的条件下,使用表达抗HIV剂的病毒构建体转导CD34+造血细胞;
(d)洗涤CD34+造血细胞,和
(e)将CD34+造血细胞与药用载体混合,从而获得该组合物。该组合物适于对人受试者给药。
在该组合物中,(b)步骤的培养可以在存在至少一种细胞因子,至少两种细胞因子或仅两种细胞因子的情况下进行。(c)步骤可以在存在重组纤连蛋白片段的情况下进行。
本发明还提供了一种组合物,其含有药用载体和每千克将被给药该组合物的人受试者体重至少1.63×106CD34+造血细胞,至少0.52×106CD34+的这类CD34+造血细胞被转化了在转化前于CD34+细胞未发现的目的基因。该组合物适合对人受试者给药。在该组合物中,细胞的数目可以如上定义。受试者可以是成人。在该组合物中,目的基因可以表达RNA制剂。
本发明还提供了一种组合物,其含有药用载体和每千克将被给药该组合物的人受试者体重至少1.63×106CD34+造血细胞,至少0.52×106CD34+的这类CD34+造血细胞被转化了在转化前于CD34+细胞中未发现的目的基因,
其中该组合物可以通过包含下述步骤的方法来生产:
(a)从受试者分离CD34+造血细胞;
(b)使用至少一种细胞因子培养CD34+造血细胞;
(c)在存在增强细胞和载体共定位的试剂的条件下,使用编码目的基因的载体转化CD34+造血细胞;
(d)洗涤CD34+造血细胞,和
将CD34+造血细胞与药用载体混合,从而获得该组合物。该组合物适于对人受试者给药。在该组合物中,细胞的数目可以如上定义。受试者可以是成人。在该组合物中,目的基因可以表达RNA制剂。
本发明还提供了一种向人受试者造血细胞中插入目的基因的方法,包括:
(a)将CD34+造血祖细胞转移到人受试者的血液中;
(b)通过单采血液成分术从受试者血液分离白细胞;
(c)采用免疫筛选方法从已分离的白细胞中分离CD34+造血细胞;
(d)在存在使细胞与转导载体共定位的试剂的条件下,将步骤c)的CD34+造血细胞进行目的基因的转导过程;
(e)在步骤d)以后,确定CD34+造血细胞的总数,并且,如果总数是每千克人受试者体重至少1.63×106细胞,则进入步骤f),如果在步骤d)以后,每千克人受试者体重CD34+造血细胞的总数少于1.63×106细胞,则进行至少步骤b)-d),并合并CD34+造血细胞;和
(f)将CD34+造血细胞传递到受试者,
从而将目的基因插入到人受试者的造血细胞。人受试者可以是成年人。
在该方法中,使细胞与转导载体共定位的试剂可以是纤连蛋白的片段。
在该方法中,步骤(f)可以在未骨髓部分切除术的情况下进行。将造血祖细胞转移在受试者中的步骤(a)可以通过对受试者给药一定数量的足以转移造血祖细胞的细胞因子来完成。在从受试者血液中分离白细胞的步骤中,可以进行至少两次单采血液成分术。
在该方法中,在存在重组纤连蛋白片段的情况下,实施将CD34+造血细胞进行目的基因转导过程的步骤,所述重组纤连蛋白片段可以是重组纤连蛋白片段CH-296。
在该方法中,目的基因可以编码抗HIV剂。抗HIV剂可以是RNA分子;或RNAi分子;或反义分子;或核酶。核酶可以含有具有序列5′-UUAGGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC-3′(Rz2)的核苷酸。
在该方法的实施方案中,在步骤(e)中,如果在(d)步骤后每千克人受试者体重CD34+造血细胞的总数少于1.63×106细胞,则进一步包括低温储存来自(d)步骤的CD34+造血细胞的步骤,重复进行(a)-(d),合并任何低温储存的细胞和来自(d)步骤的细胞。如上所述,可以增加获得的细胞的特定数目。
在该方法中,所有或者几乎所有步骤(e)的CD34+造血细胞被递送给受试者,例如至少总数的90%。
该方法进一步包括在存在至少两种细胞因子或细胞因子混合物的情况下培养步骤(c)的分离的CD34+造血细胞的步骤。
细胞因子混合物可以包含一种或多种选自下述物质的细胞因子:干细胞因子(SCF),巨核细胞生长和发育因子(MGDF),Flt-3配体(FL,有时简写为Flt-3),白介素3(IL-3),粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和血小板生长素(TPO)。细胞因子混合物可以进一步包含一种或多种选自下述物质的细胞因子:白介素1(IL-1),白介素4(IL-4),白介素5(IL-5),白介素6(IL-6),白介素7(IL-7),白介素9(IL-9),白介素11(IL-11),白介素12(IL-12),白介素15(IL-15),粒细胞集落刺激因子(G-CSF),巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF),促红细胞生成素(EPO),白血病抑制因子(LIF),转导生长因子β(TGF-β),巨噬细胞抑制蛋白-1(MIP-1),肿瘤坏死因子(TNF)和基质细胞衍生的因子-1(SDF-1)。
在该方法的另一个实施方案中,细胞因子混合物含有一种选自第一组的细胞因子和一种选自自第二组的细胞因子,其中第一组包括SCF,MGDF,FL,IL-3,GM-CSF,TPO,IL-1,IL-4,IL5,IL-6,IL-7,IL-9,IL-11,IL-12,IL-15,G-CSF,M-CSF,EPO,LIF,TGF-β,MIP-1,TNF和SDF-1,其中第二组包括MGDF,FL,GM-CSF,TPO,IL-1,IL-4,IL-5,IL-7,IL9,IL-11,IL-12,IL-15,G-CSF,M-CSF,EPO,LIF,TGF-β,MIP-1,TNF和SDF-1。
本发明进一步提供了一种向人受试者造血细胞插入目的基因的方法,包括:
(a)将CD34+造血祖细胞转移到受试者的血液中;
(b)通过单采血液成分术从受试者血液中分离白细胞;
(c)采用免疫筛选方法从已分离的白细胞中分离CD34+造血细胞;
(d)在步骤c)以后,确定CD34+造血细胞的总数,如果每千克人受试者体重的总数至少是1.63×106细胞,则进入步骤e),如果在步骤c)以后,每千克人受试者体重的CD34+造血细胞的总数少于1.63×106细胞,则进行b)-c),并合并CD34+造血细胞;
(e)在存在使细胞与转导载体共定位的试剂的情况下,将c)步的CD34+造血细胞进行用目的基因的转导过程;和
(f)将CD34+造血细胞递送给受试者,从而将目的基因插入到人受试者的造血细胞。如同前面所讨论的方法,本方法的相关细节可以发生变化。
本发明进一步提供了一种向人受试者的造血细胞插入基因的方法,该基因表达一种核酶,其含有具有序列5′-UUA GGA UCC UGA UGA GUCCGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC-3′(Rz2)序列的核苷酸,该方法包括:
(a)通过向受试者给药一定数量的足以转移造血祖细胞的细胞因子,将CD34+造血祖细胞转移到受试者的血液中;
(b)通过单采血液成分术从受试者血液分离白细胞,其至少进行两次;
(c)采用免疫筛选方法从已分离的白细胞中分离CD34+造血细胞;
(d)在存在细胞因子的培养基中,将(c)步骤分离的CD34+造血细胞培养大约一天;
(e)将步骤(d)的CD34+造血细胞进行用包含载体的逆转录病毒的转导过程,所述载体在细胞中在存在重组纤连蛋白片段的情况下,产生包含具有序列5′-UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACUGGC UCC-3′(Rz2)的核苷酸的核酶;
(f)确定在步骤(e)以后,CD34+造血细胞的总数,如果每千克人受试者体重的总数至少是1.63×106细胞,则进入步骤g),如果在步骤e)以后,每千克人受试者体重CD34+造血细胞的总数少于1.63×106细胞,则再次进行步骤b)-e),并合并CD34+造血细胞;和
(g)在未骨髓部分切除术情况下,将CD34+造血细胞递送给受试者,从而将表达核酶的基因插入到人受试者的造血细胞。如前面所讨论的方法,本方法的相关细节可以发生变化。
还提供了一种制备上述组合物的方法,包括:
(a)将CD34+造血细胞转移到受试者的血液中;
(b)通过单采血液成分术从受试者血液中分离白细胞;
(c)采用免疫筛选方法从已分离的白细胞中分离CD34+造血细胞;
(d)在存在使细胞与转导载体共定位的试剂的情况下,将步骤(c)的CD34+造血细胞进行用目的基因的转导过程;和
(e)确定在步骤(d)以后CD34+造血细胞的总数,如果每千克人受试者体重CD34+造血细胞的总数少于1.63×106细胞,则再一次进行步骤b)-c),并合并CD34+造血细胞。
还提供了一种该组合物用于制备治疗感染了HIV的人受试者的药物的用途,该组合物含有药用载体和每千克将被给药该组合物的人受试者体重至少1.63×106CD34+造血细胞,至少0.52×106CD34+的这类细胞被表达抗HIV剂的病毒构建体转导。
还提供了一种试剂盒,其包含用于实施上述方法的元素。试剂盒的具体实施方案包含:
(a)一定数量的能够转移造血祖细胞到人受试者的试剂;
(b)一种培养基,其包括至少一种适合于培养CD34+造血细胞的细胞因子;
(c)一种逆转录病毒载体,其包含一种序列的核苷酸,其在细胞内产生核酶,核酶的序列为5′-UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAGGAC GAA ACU GGC UCC-3′(Rz2);和
(d)组织培养容器,在其内部包被一种重组的纤连蛋白片段。另外提供了一种包含所述试剂盒和其使用说明书的包装。
在所述方法的另一个实施方案中,用于培养和转导CD34+造血细胞的步骤的总的合并时间不超过约三天,也就是说,在存在添加的细胞因子(正常水平)的情况下,细胞在37℃培养基的时间不超过约三天。备选地,在存在多于一种细胞因子的培养基中该细胞的存在时间不超过三天。该细胞的转导可以在存在一种重组纤连蛋白片段CH-296或同等制剂的情况下进行。
本发明的组合物和方法可以被用于治疗许多遗传疾病中的任何一种。特别感兴趣的基本是免疫系统疾病。这些疾病包括血红蛋白病,包括癌症的白细胞生产或功能缺陷,免疫缺陷症,如HIV,病毒感染,溶酶体贮积病,干细胞缺陷症,如范康尼氏贫血症,慢性肉芽肿病,高歇症,G6PD缺陷等。它们还包括传染性疾病,例如AIDS/HIV感染,或者获得性疾病,例如癌症,或者心血管疾病。
本发明涉及基因治疗,特指应用于造血母(HP)细胞,涉及转导细胞和获得这些细胞的方法,涉及使用它们以在人受试者中提供延长移入的修饰的造血细胞的方法。本发明特别涉及HP细胞的体外基因治疗来治疗或阻止HIV感染。
本发明提供了转导的HP细胞的组合物,其包含足够数量的,能够提供治疗益处的全能细胞。在一个实施方案中,本发明提供了转导的HP细胞的组合物和抗HIV的基因治疗的方法,以便在人受试者体内产生保护的T淋巴细胞。
对于病毒感染。特别是HIV感染,本发明提供的明显治疗益处,是通过增加的修饰的T淋巴细胞在人受试者中的长期存活,从而增加了T淋巴细胞的数目,和提高免疫功能获得的,导致降低病毒的复制和病毒负荷。
在另一个实施方案中,当注入到患者体内时,转导的人HP细胞的组合物或系统能够长期移入,在注入后产生分化的造血细胞至少12个月,优选注入后至少24个月,甚至更优选至少30个月。在另一个实施方案中,转导的人HP细胞当注入自体受试者时能够长期移入。在另一个实施方案中,转导的人HP细胞当注入未骨髓部分切除术的受试者时能够长期移入。
另一个实施方案提供了一种组合物或系统,其含有足够数量的转导人HP细胞,当递送给人受试者时,可以提供一定水平的长期移入,使得例如通过活体解剖在血液或骨髓中可检测到至少一种细胞类型的至少0.01%基因修饰的细胞。优选细胞类型是T淋巴细胞,或巨噬细胞/单核细胞。优选地,基因修饰的细胞水平是至少0.1%,更优选至少1%,最优选至少10%。优选转导的细胞被递送到自体受试者。优选转导的细胞在缺乏骨髓部分切除术的情况下递送。优选长期移入存在至少12个月,更优选至少24个月,甚至更优选至少30个月。优选转导的基因是为了治疗除SCID以外的疾病,例如癌症和传染病。更优选转导的基因是为了治疗和预防HIV感染。
用于转导的HP细胞优选获自一个受试者。转导的人HP细胞的CD34+纯度(CD34+%)应该为至少65%,优选至少90%,更优选至少95%。转导的百分比应该为至少约10%,优选至少约30%,更优选至少约50%。
在另一个实施方案中,转导的人HP细胞是源自CD34+细胞,其分离自将HP细胞转移到外周血后的人受试者血液。转移可以通过使用细胞因子来实现,细胞因子优选是一种或多种来自下述物质细胞因子:粒细胞集落刺激因子(G-CSF),偶联的G-CSF,pegylated G-CSF和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。这些细胞因子可以进一步包含干细胞因子(SCF),白介素3(IL-3),或基质细胞衍生的因子-1(SDF-1 Lataillade等2000),或者类似作用的细胞因子。可以通过利用以试剂如环磷酰胺进行短期化疗辅助转移。更优选地,使用G-CSF或pegylated G-CSF进行转移。这些细胞因子可以每天给药每千克受试者体重至少约10μg,更优选地,每千克30μg的量。在开始细胞因子治疗后3、4、5、6天或更久通过单采血液成分术收集CD34+细胞。
优选地,至少进行单采血液成分术两次。CD34+细胞可以通过任何本领域中已知的临床级的设备进行筛选,例如Isolex 300i细胞选择系统,或者CEPRATE SC干细胞浓缩系统。
在另一个实施方案中,CD34+细胞在被转导之前,使用细胞因子混合物进行处理以诱导细胞进入细胞周期,该细胞因子混合物优选含有MGDF和SCF,或者基本上MGDF和SCF,优选浓度分别是约100ng/ml和50ng/ml。优选细胞周期诱导在不存在添加的细胞因子IL-3,IL-6或SCF,或者这三种组合的情况下发生。
转导的人HP细胞含有一种引入的基因,其可以编码一种或多种蛋白或RNA分子,例如反义分子,RNAi分子,RNA诱饵或核酶RNA(即RNA试剂)。引入的基因可以是任何引入的基因,只要与未转导的HP细胞相比,该基因编码的蛋白或RNA,或两者以理想的方式改变转导的人HP细胞的性质。在一个实施方案中,引入的基因当表达时,为转导的HP细胞,或这些细胞的分化子代细胞提供一种针对病毒感染的抗性,优选地,是针对HIV感染的抗性。更优选地,引入的基因编码反义或核酶RNA,其能够抑制HIV-1在细胞内的复制。
针对病毒感染,如HIV-1感染,或针对非病毒性疾病设计的核酶的类型包括锤头结构,发夹结构,RNAse P,丁型肝炎病毒(hepatitis delta virus)(HDV),组I型或组II型的间插序列核酶,或者采用体外筛选的方法筛选出的催化基序。优选核酶是锤头或发夹核酶,更优选锤头核酶。这种核酶能够切割与疾病相关的RNA分子。
本发明包括多个核酶的应用(如Ramezani等2002),例如具有多个催化结构域的核酶,或者各种类型核酶的组合。这将在治疗病毒性感染时降低病毒抗性的可能性。还优选核酶切割位点在病毒靶RNA中高度保守,例如Rz2的切割位点。上述任何组合也都是可能的,提供不止一种作用机制。
组合物或系统的转导的人HP细胞被转导了DNA,或质粒,或病毒转移载体。如果适当,引入的基因在逆转录后整合到细胞基因组中是理想的。优选地,这些细胞被转导一种逆转录病毒载体,例如鼠逆转录病毒载体,或慢病毒载体。更优选地,逆转录病毒载体是来源于LNL6(Bender等1987)或其他癌逆转录病毒载体。在具体的实施方案中,这些细胞被转导了RRz2。
引入的基因在转导的人HP细胞或子代细胞中表达自启动子。该启动子可以是组成型表达的或可诱导的,例如在有利的环境或条件下优先表达。该基因采用RNA聚合酶II(RNA pol II启动子)或RNA聚合酶III进行转录。
在本发明的另一个实施方案中,该组合物被配制出那个容易递送到人受试者中。最大多数的细胞应该是活的,例如大于95%,优选大于98%。优选该组合物的量在大约10ml到大约1000ml之间,更优选地,在大约100ml到大约500ml之间。该组合物含有一种药用载体,其优选是含有蛋白试剂的缓冲盐溶液,所述蛋白试剂例如清蛋白或明胶和/或糖类如葡萄糖,该试剂可以发挥稳定细胞的作用。该载体可以包含抗凝剂,如柠檬酸钠。该载体可以含有本领域熟知的血浆扩张剂。在另一方面,该组合物是无菌的(细菌,真菌和支原体),检测不到细菌,内毒素,支原体,HIVP24抗原,或可复制的逆转录病毒,基本上不含自由转导的载体,或者这些的任何组合。在另一方面,该组合物基本上不含有添加的细胞因子。该组合物被通过非肠道途径给药于受试者,优选地,是在某个场合或多个场合下通过输注或注射的方式。
本发明还提供了一种造血细胞的基因治疗方法,特别是造血祖细胞,使用在这里描述的组合物。本发明还提供治疗或预防遗传性或传染性疾病的方法,如HIV感染。该方法可以含有人纤连蛋白的CH-296片段(RetroNectinTM)或等价物的使用,或者一个或多个去除大块(debulking)步骤,以去除不需要的细胞,或者一个或多个洗涤步骤。
基因治疗可以在体外或体内进行。此处描述的方法优选用于体外途径,但是也可以用于体内途径(例如Newbound等,2001)。本发明可以被应用于已经患病的受试者,或者提前预防降低发生或预防疾病。
在本发明方法中使用的HP细胞能够被从外周血中,骨髓中,脐带血或产生造血细胞的干细胞中获得。它们优选从转移后的外周血中获得。HP细胞可以在给药或不给药化疗试剂的情况下,通过给药一种或多种细胞因子转移到外周血中。细胞因子可以选自G-CSF,pegylated G-CSF,偶联的G-CSF和GM-CSF和上述的任何组合。细胞因子可以进一步包含选自SCF,FL,和IL-3的一种或多种。
本发明的方法能够提供至少0.01%的基因修饰的造血细胞长期存在于缺乏骨髓部分切除术的患者体内。
当适用于彼此时,每个如上描述的实施方案的参数和特征可以相互交换,因此不再重复。因此,例如,第一个实施方案的任何参数或特征都可以应用于本发明的其他实施方案中。
定义:
这里使用的造血细胞是指通常在血液中发现的细胞,以及能够产生通常在血液中发现的细胞的细胞,如骨髓中发现的细胞。在上下文中,“通常”包括一个人被进行治疗以改变血液或骨髓中细胞的数量或质量的情形。
这里使用的病毒载体是指含有全部或部分病毒基因组的载体,其能够被引入到细胞内并被表达。这些病毒载体可以包括天然的,突变的,或重组的病毒。这些病毒可以含有RNA或DNA基因组。合适的病毒载体的实例包括逆转录病毒载体(包括慢病毒载体),腺病毒载体,腺相关病毒载体和杂合的载体。
逆转录病毒载体是一种病毒来源于逆转录病毒属的病毒载体。
使用的“构建体”是指重组的核酸,它可以是重组DNA或RNA分子,其已被制备出来是为了表达特定的核苷酸序列,或者将被用于构建其他的重组核酸。通常,此处使用的“构建体”是指一种分离的重组DNA或RNA分子。
此处使用的“抗HIV剂”是指任何可以被哺乳动物细胞表达,抑制HIV复制,或抑制HIV进入哺乳动物细胞的试剂。这些试剂可以是核酸或多肽。
此处使用的术语“能够移入”是指造血细胞植入骨髓中一段延长期的能力,例如至少一年。移植可以直接检测(如通过活体解剖)或通过检测血液中的子代细胞的产生进行检测。
此处使用的术语“转移”和“转移的”是指造血细胞被从骨髓内的储存组织移到外周血中。
使用的术语“细胞因子”是指任何类似激素的,低分子量的蛋白,不论它是由各种类型细胞或重组体分泌,其调整细胞细胞生长或功能的强度和持续时间,例如细胞间信息传递。例如,细胞因子可以介导免疫,过敏反应和调节细胞的成熟和生长。
此处使用的“成年人”是指完全长大的和生理上成熟的人受试者。普遍接受的成年人的年龄是18岁或者更大。
使用转导是指将遗传性物质通过病毒载体引入细胞。
如此处使用,转导的细胞是转导过程的结果,并且含有转导过程之前不具有的遗传物质,无论稳定整和与否。如在一些现有技术中使用,但不如此处所使用,“转导的细胞”可指一群转导过程产生的细胞,该种群包括含有遗传物质的细胞和不含遗传物质的细胞,无论遗传物质在细胞中稳定整和与否。
转染是指将遗传物质引入细胞,而不使用病毒载体。转染的例子包括将“裸露”的DNA或DNA插入到脂质体中,其没有病毒衣壳或包膜。
骨髓部分切除术指通常化学或放射治疗,其导致患者体内至少显著部分骨髓腔(其包括造血祖细胞)被破坏。骨髓部分切除术不包括可仅引起骨髓腔细胞的小部分或非实质性破坏的调理治疗(conditioningtreatment)。
使用短语“药用载体”是指任何标准的药用载体。实例包括,但不限于,磷酸缓冲的盐水,生理盐水,和水。
使用“重组纤连蛋白片段”是指一种在转导过程中用于使细胞与载体共定位的试剂,其是基于纤连蛋白的活性。例如,RetroNectinTM,TaKaRa Shuzo Co.Ltd.,一种重组纤连蛋白片段,它包含三个结构域,中间的细胞结合结构域,其与整联蛋白VLA-5结合,一个高亲和力肝素结合结构域,其与蛋白聚糖结合,和一个在候选剪切IIICS区域内部的CS-1位点,其与整联蛋白VLA-4结合(Williams 1999)。等价的retronectins含有功能上等价于RetroNectinTM的三个结构域,同时与RetroNectinTM类似的共定位试剂含有至少两个功能上等价的结构域。
此处使用的“核酸序列”是指寡聚核苷酸,或多聚核苷酸,及其片段或一部分,或者是基因组或合成来源的DNA或RNA,其可以是单链或双链,以及代表正义链或反义链。与此类似,此处使用的“氨基酸序列”是指寡肽,肽,多肽,或蛋白序列,及其片段或一部分,及天然存在或合成的分子。
此处使用的术语“反义”是指与特定的DNA或RNA序列互补的核苷酸序列。使用术语“反义链”是指与正义链互补的核苷酸链。反义分子可以采用任何方法制备,包括通过将一个或多个目的基因与启动子反向连接来合成,该启动子允许合成互补链。一旦引入到细胞中,该转录的链与细胞产生的天然序列合并以形成双链。然后将这些双链封闭进一步的转录和翻译。按照这种方式,产生了突变表型。名称“负链”有时是指反义链,而“正链”有时是指有义链。
在整个说明书中,用语“包含”可以理解为暗示包括一种特定的要素,整体或步骤,或者要素、整体或步骤的群组,但是不排除任何其他要素、整体或步骤,或者要素、整体或步骤的群组。
证明本发明原理的模型
被选择用于证明本发明的原理的模型是一个HIV感染的人。在人受试者中有效,长期和实用的治疗或根除或预防HIV感染已经成为难以捉摸的目标。因此,本发明的优势在高度复杂的问题的内容中,即在人受试者中治疗HIV感染中被例证子。
但是,正如从以下描述将变得明显,不同的疾病都可以采用本发明的组合物或方法进行治疗,这些疾病包括任何血液或免疫系统疾病。这些包括血红蛋白病,白细胞产生或功能缺陷,免疫缺陷症,溶酶体贮积病,干细胞缺陷症,如范康尼氏贫血症,慢性肉芽肿病,高歇病和G6PD缺陷等。在这些疾病中,许多已经采用异体HP细胞移植进行了成功治疗(Parkman 1986)。但是,需要进行免疫抑制,或一些免疫效应的产生,例如移植排斥或移植物抗宿主反应,都是异体骨髓移植的缺点。本发明具有采用自体HP细胞的优势。本发明还被用于赋予HP细胞或其子代抗骨髓抑制效应的抗性。
本发明还被用于治疗传染性疾病,例如例证的AIDS或其他病毒感染,如HTLV-1(Bunnel和Morgan 1998),或获得性疾病,如心血管疾病(例如参见Orlic等2001),或癌症。对于癌症来讲,骨髓移植技术已经被用于各种癌症,包括那些主要是造血系统的那些癌症。益处在于为造血细胞提供针对抗癌剂的保护作用(Carpinteiro等2002),以允许更为有效的治疗(见Brenner综述2001)。可使用的基因包括多抗病性(MDR)基因,其赋予对蒽环类抗生素,长春花生物碱,鬼臼素和紫杉醇的抗性,和突变的二氢叶酸还原酶(mDHFR)基因赋予对氨甲蝶呤,或trimetrexate的抗性和O-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的基因赋予对烷基化试剂的抗性。本发明的基因治疗方法还能通过改变对癌细胞的免疫反应,或者仅通过标记细胞以监测通常常规治疗方式的效果来用于治疗恶性肿瘤(Cornetta等1996)。为了使用造血细胞的基因治疗方式治疗恶性肿瘤,在递送修饰细胞之前,通常进行部分或完全的重度骨髓抑制(myeloablation)。
HIV-1的基因治疗
人免疫缺陷病毒(HIV)类群包括HIV-1和HIV-2类型。目前HIV-1的复制研究得很清楚。现在标准的治疗方案是使用多种抗逆转录病毒药物的混合物,通常是三种或更多,可以在短期内控制HIV复制,但是通常同时伴随一些副作用,例如药物毒性,病毒抗性,不便的剂量方案(dosingregimes),以及治疗费用等。
使用造血祖细胞作为转导的靶细胞,对HIV/AIDS进行基因治疗是将HIV感染的细胞群体的一部分替代为经过设计修饰的细胞,以抑制病毒的复制。这种策略可以潜在地通过保护CD4+细胞,和通过被保护的免疫元件介导的抗病毒反应的建立来清除病毒。对于这些策略来讲,为了对病毒感染过程产生正面的影响,关键是i)在感染HIV的情况下,发生免疫重建的程度。ii)保护免疫重建系统以免受到HIV诱导的损耗,使其能够识别抗原,和保护宿主不受病原体的攻击。希望该策略可以影响病毒负荷。关于在HIV感染时,免疫重建的可能性,几个报道已经强调了高活性抗逆转录病毒治疗(HAART)对于免疫系统的影响(Ho等1995;Zhang等1998)。从本质上讲,HAART是与CD4+细胞的数目提高密切相关,这主要是因为在HAART的前4个月记忆细胞的扩增。随后是天然CD4+细胞的增多,同时伴有CD4活化标记的减少和再次回应抗原的增殖反应的提高(Autran等1997;Pakker等1998)。
尽管体外研究已经证实,成人未感染的胸腺保持促进T淋巴细胞生成的能力(Jamieson等1999;Poulin 1999),但是先前还没有证据证明,造血祖细胞基因治疗可以导致具有被设计以抑制HIV-1复制的细胞的免疫系统延长的恢复。关于缺乏基因治疗,当对于先前是HAART首次的患者而言已经在外周出现近来的胸腺迁出者时,它仅维持与病毒血症在鸡中维持一样长的时间(Douek等1998;Zhang等1999)。还不清楚,是否在患有更严重的HIV感染的患者在药物抗性和不能控制的病毒血症情况中会发生类似的反应。另外,产生这些近来的胸腺迁出者的祖细胞来源还未被阐明;还不了解是否与胸腺生成的程度有关的造血前体在HARRT之后在成人体内观察到作为对T细胞损耗的应答从骨髓迁移到胸腺,或者是否在HARRT后,T淋巴细胞(T-lymphoid)的发育来源于生命早期聚集在胸腺的T淋巴细胞祖先。事实上,在HIV活跃复制的条件下,外周血祖细胞在成人胸腺中进行T淋巴细胞发育的能力目前还未被阐明,这是因为HIV患者自体移植后,T淋巴细胞的出现可以归因于产生自内源的残余T淋巴细胞前体的T-淋巴细胞发育(Gabarre等2000)。进而,使用筛选的CD34+细胞使未感染的成人患者接受异体造血祖细胞移植,患者表现出明显的迟滞和低于最佳标准的T淋巴细胞恢复,表示在增强的骨髓抑制后,低于正常水平的胸腺活性(Behringer等1999;Martinez等1999)。还应该考虑的是,对造血祖细胞进行遗传修饰的方法本身固有的一些潜在因素可能影响它们进行T淋巴细胞发育的能力。这些先前确定的因素包括,在为进行鼠逆转录病毒转导做准备时,诱导祖细胞进入细胞周期的因素(Roe等1993),其可导致骨髓谱系定型,和组成型表达的外源基因的出现,其可以干扰需要的祖细胞的迁移,归巢和分化的过程。因此,我们尝试证明,是否遗传保护的T淋巴细胞,包括天然T淋巴细胞,可以在成人感染HIV时产生。
对HIV-1繁殖的干涉可以在其复制周期的任何阶段发生。细胞逆转录病毒的感染是由病毒糖蛋白与其细胞受体之间的相互作用所触发的(A)(见图1)。然后是吸附和脱衣壳,病毒RNA进入到靶细胞内和在逆转录酶一带入到病毒粒子中的一种酶,的作用下转换成cDNA(B)。cDNA采用环状的形式(C),被转换成双链cDNA,然后通过整合酶的作用整合到宿主细胞基因组DNA内(D)。一旦整合,原病毒cDNA从位于5“LTR的启动子进行转录(E)。包括gag,pol和env的mRNA的转录的RNA以及调节因子tat,rev和vpr被翻译以产生病毒蛋白(F)或被留下来作为初生病毒的RNA。病毒RNA包含一个Psi包装序列,对其包装进入病毒颗粒非常重要(G)。病毒颗粒一旦形成,就会通过从细胞质膜上出芽释放到(H)。一般来说,逆转录病毒不引起宿主细胞的裂解;HIV在这一方面是一个例外。原病毒cDNA保持稳定整合在宿主基因组中,并且随着宿主DNA的复制一起复制,所以子代细胞也继承了原病毒。潜在的抗病毒剂可以靶向任何这些复制控制点。例如,下调CCR5受体可抑制HIV-1的复制(Bai等2000)。
本发明可以采用的用于抗HIV-1的基因治疗的不同类型的方法包括胞内表达反式显性蛋白(transdominant protein)(如Smythe等1994),胞内抗体(如Marasco等1998,Shaheen等1996),反义核糖核酸(RNA)(如Sczakiel和Pawlita 1991),病毒诱饵(如Kohn等1999),催化核酶(如Sarver等1990;Sun等1996),和RNAi(如Novina等2002)。
反式显性(突变)蛋白,尤其是突变的Rev或Tat蛋白,通过与HIVRNA或HIV复制所需的因子结合发挥作用。与非突变的蛋白相比,它们功能发生改变,从而它们干扰非突变蛋白的功能。它们可以是一种融合蛋白,具有两种或多种活性。在一个具体实施方案中,反式显性蛋白是RevM10蛋白(Ranga等1998),该蛋白已经被证明能够抑制初级T细胞中HIV-1的复制。RevM10转导的来源于人脐带血或外周血的CD34+细胞在小鼠模型内产生成熟的胸腺细胞,并且保护T细胞抗HIV-1(Bonyhadi等1997)。进一步,在HIV-1感染的个体中,RevM10的逆转录病毒递送到CD4+细胞保护这些细胞(Ranga等1998)。
胞内抗体,通常是单链类型,如产自逆转录病毒构建体pSLXCMV的抗体(Shaheen等1996),可以通过结合或螯合特定的病毒蛋白抑制HIV的生命周期。在一个具体的实施方案中,抗逆转录酶(RT)抗体片段在体外抑制了HIV感染(Maciejewski等1995)。
反义RNA可以结合到病毒RNA上,基因组RNA或转录产物均可以,破坏了RNA的稳定性或者抑制例如翻译或从核内转出的过程。结合到初生的病毒RNA上还可以抑制RNA多产地包装到病毒颗粒中。如本领域所熟知,反义分子的互补区可以最少至15个核苷酸,更优选多于30个核苷酸,最优选在100到500个核苷酸长度之间。对HIV-1复制的抑制作用已经证实反义RNA靶向抗几种病毒调节和结构基因,包括pol,gag,env,tat,vif,和psi(见Veres等1998)。使用含有反义tat/rev基因的淋巴细胞处理后,相关猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的复制被限制,在猴子体内疾病进程被减慢(Donahue等1998),这表明反义表达能够抑制慢病毒属的体内复制。在一个具体的实施方案中,逆转录病毒载体HGTV43编码针对HIV-1基因组的tar基因和tat/rev区域的两个独立的位点的反义分子。这个分子已经被证明能够在体外提供保护以抗HIV感染。
RNA诱饵,如RRE诱饵和TAR诱饵,也已经被用于保护细胞以抗HIV感染(Lee等1994,Lisziewicz等1993),而且优选地,采用多聚体的形式,以增加与HIV-1相关蛋白结合的能力,并且螯合它们。
核酶可以不仅通过与病毒RNA结合,而且通过切割和灭活它们来发挥作用,所以对于用于本发明非常吸引人。它们包括一个或多个(通常是两个)与靶RNA互补的区域和一个提供酶活性的催化区域。核酶,尤其是那些具有较长杂交臂的核酶,可以采用类似通过反义分子使用的那些机制发挥作用。应用最为广泛的核酶基序是锤头型和发夹型,其在美国专利号6,127,114和美国专利号6,221,661中分别进行了描述。在一个具体实施方案中,逆转录病毒载体pTCAG编码一种靶向与RRE序列的一部分融合的HIV-1 LTR的U5区(从帽子位点开始第+111/112位)的发夹型核酶,和一种靶向rev/env编码区(HXB2分离株,第8629位与8644位之间)的核酶,两种核酶均表达自tRNA val启动子(Gervaix等1997)。
RNAi分子是具有双链RNA区域的分子,该区域以一种序列特异的方式触发宿主细胞的RNA降解机制。因此这些分子可以被用于灭活内源性的RNA或病原体RNA,如HIV-1 RNA。每一个双链区域可以相对较短,例如长21-25个碱基对,优选长度少于约30个碱基对,更优选地,具有19-25个碱基对的双链区域。优选在每个双链区域不超过一个错配(错配被定义为不包括G:U对),更优选没有错配,最优选地双链区域完全匹配。如果靶分子是变化的(如HIV-1 RNA),应该靶向高度保守的区域。突变体家族也能够被靶向,只要他们与RNAi分子的双链区域的一条链或另外一条链存在不超过一个碱基的错配。对于较长的RNAi分子,几个短双链体可以被连再一起,这样允许靶向于多个基因,优选地用于具有更高变化的目标。RNAi双链体还可以由较长的RNA转录物通过剪切或自我切割的方式产生,例如将自我剪切性核酶插入到双链体之间或在双链体两侧。RNAi分子可以容易地形成于含有一个反向重复结构的DNA分子。备选地,RNAi双链体可以形成于两个具有互补区域的RNA分子。只要是核定位的,例如如果它们不含有胞质输出信号如聚腺苷酸化的序列,具有大于30个碱基对的双链区域的RNAi分子可以被采用。到最近为止,RNAi还没有被证明在人细胞内有效。但是,最近,RNAi(也称iRNA,或短siRNA,或发夹RNA)已经被证明能够抑制T淋巴细胞中的HIV-1复制(Novina等2002)。靶向病毒LTR,或附属的vif和nef基因的RNAi分子抑制了细胞系或初生淋巴细胞中HIV-1复制的早期和后期步骤(Jacque等2002)。RNAi还被成功靶向其他病毒(如Gitlin等2002)并且可靶向内源性基因。
在此公开的用于本发明的RNA剂可以表达自病毒启动子(如逆转录病毒LTR,巨细胞病毒)或者其他使用RNA聚合酶II的启动子进行高水平表达。RNA剂可以被插入到较长的转录物中,例如标记基因的3‘非翻译区。为了释放制剂,转录物可以被设计成能够自我剪切。使用来源于tRNA的基因,腺病毒VA1,U1和U6,或者其他小核RNA基因的基因构建体,RNA制剂也可表达自RNA聚合酶III启动子。而且,RNA制剂可以被赋予有助于将其集中到靶分子的信号(例如见Michienzi等2000)。
使用核酶或其他基因治疗HIV或其他传染病的科学基本原理被图示在图2中。
本发明的一个目的是通过提高CD4+细胞的存活,和建立一种由被保护的免疫元件执行的增加的免疫反应,允许保护的T淋巴细胞的长期存在的治疗效果。
血细胞生成
造血细胞包括通常在血液中发现的细胞,和产生通常在血液中发现的细胞的细胞,如骨髓中发现的细胞。在本文中,“通常”包括患者被治疗以改变血液或骨髓中细胞的数量和质量的情况。造血细胞分化的过程被图示于图3中。血细胞生成是一个通过其使血液形成系统被维持的过程。这个过程涉及细胞死亡和新细胞再生和分化的平衡。
成熟淋巴细胞的产生要求前体细胞离开骨髓,经历胸腺内的筛选机制,并以天然细胞的形式转运到外周血中。这个过程的效率是与年龄相关的,这是因为胸腺随年龄消退,而它将CD4+T淋巴细胞向外转运的速率因此衰变。产生活化T细胞和记忆T细胞的T淋巴细胞的存活和扩增依赖于一个自然稳态机制。
血细胞生成是由一群多能造血干细胞(HS)来维持的,所述造血干细胞具有长期自我更新能力以及产生增殖和分化成为骨髓和淋巴群组的成熟效应血细胞的后代(Ogawa等1993,Orlic和Bodine 1994)。通过细胞的分裂,HS细胞的数目被维持,所以这些细胞是无限有效的。至少从理论上讲,整个造血系统可再生自单一的HS细胞。许多HS细胞在机体中是静止的(Hodgson和Bradley 1979,Jones等1990)。
造血祖细胞(HP)特征在于存在CD34细胞表面抗原,和它们能产生骨髓和淋巴类型的多种谱系后代。一些CD34+造血祖细胞具有自我再生的能力,可以被当作真正的干细胞,而其他CD34+造血细胞可能不具有自我更新的能力,或者仅具有有限的能力。在多个成熟造血细胞上无CD34+抗原。
CD34+细胞本身是异质性的(Bertolini等1998),基于其它标记的表达,如CD38(Hogan等2002),可以被分为亚群。表示约5%CD34+细胞群的人CD34+/CD38-细胞在SCID小鼠模型中显示比CD38+细胞更长期的的重建能力(Hogan等2002)。因此,2.5×104 CD34+/CD38-(CD34+/CD38低)细胞可相当于5×105CD34+细胞。其他可以被用于富集具有长期重建能力的细胞群的标记包括Thy-1+,CD133+,人KDR+(VEGF受体),人ClQRP +,HLA-DR-,和低水平保留的活体染料如罗丹明123或Hoechst33342。
最近的报道显示,至少在某段时间内,可能存在缺少CD34抗原的HS细胞(Halene和Kohn 2000,Dao和Nolta 2000)。在鼠HS细胞上发现CD34标记的可逆表达,提示CD34是一种激活标记(Sato等1999)。CD34-细胞已经被证明能够多谱系移入并产生CD34+细胞(Zanjani等1998)。
通过根据本发明的基因治疗改变的HP细胞的能力以移入和产生长期多谱系分化的后代是本发明的关键特点。这在人受试者中提供存在基因修饰的造血细胞。这个能力可以通过种群恢复重度骨髓抑制的动物(Harrison1980,Harrison 1988),或者优选重度骨髓抑制的人,或更优选非重度骨髓抑制的人的造血系统的能力来分析。甚至更优选地,在病毒感染,如HIV-1感染时进行检测。
HP细胞及其分离
人HP细胞的分离和纯化近来已经被加以综述(To等1997,Huss2000,Thomas等1999,Sadelain等2000)。
在用于根据本发明的基因治疗的HP细胞可以从转移后的外周血,骨髓,或者脐带血进行分离。HP细胞也可以获自产生造血细胞的干细胞。
优选地,HP细胞获自转移后的外周血(Huss 2000)。从转移的外周血中分离HP细胞具有一些优点。由于可以处理的血的数量相对较大,所以与骨髓或脐带血相比,从转移后的外周血可收集较高的绝对数量的CD34+细胞。这个过程不需要常规的麻醉剂,并且可以降低医疗费用。如本领域熟知(如Fu和Liesveld 2000),转移过程可以通过使用一种或多种细胞因子处理来进行,任选增加用试剂如环磷酰胺进行短期的化疗(Campos等1993)。HP细胞可以通过使用G-CSF(Ho 1993,Lane等1995),pegylatedG-CSF,偶联的G-CSF,GM-CSF(Siena等1989),或者它们的任何组合而被转移到外周血中。转移过程可以通过将一种或多种这些细胞因子与其它如干细胞因子(SCF),Flt-3配体(Ho等1996简写为Flt3),或者白介素3,(IL-3;Huhn等1996)组合而得到加强。转移过程可以通过阻碍基质细胞衍生的因子-1(SDF-1;Benboubker等2001)或者其它起负作用以限制转移的因子而得到加强。在HIV感染个体中,使用G-CSF的外周血HP细胞转移已经得到了Law等1999的证明。最大的转移在施用G-CSF4天后实现。在4,5,6天,或者更久可以通过单采血液成分术获得HP细胞。从约前面3天可以检测血液中CD34+细胞水平,例如在使用细胞因子过程中可以每天进行全血计数(CBCs),分化的和血小板计数,以评估白细胞增多的程度。在开始单采血液成分术之前,优选CD34+细胞的数目多于20个细胞/mm3。
单采血液成分术可以采用Cobe Spectra(Gambra),Hemonetics(Domediac),Amicus(Baxter),或者同等设备来进行。单采血液成分术导致白细胞群高度富集在单核细胞中,并减少粒细胞。如果获自第一次转移/单采血液成分术的CD34+细胞不充分,同样的过程,或者进行修改后的方案可以重复。
备选地,可以重复单采血液成分术。来自第一程序的CD34+细胞可以被冷藏,并与来自后续程序的细胞合并。
已经证明原初HP细胞在感染HIV的患者体内被降低或者消失(Marandin等1996);这样就使在感染HIV时获得足够数量的细胞更加困难。
也可以通过分离单核细胞(MNC)和纯化CD34+细胞从抽吸的骨髓中分离HP细胞。HP细胞还可以分离自脐带血(Gluckman2000)。在婴儿出生时,可以获得多达约200ml脐带血。这些细胞可以被冷藏并用于成功转导和后续的移植(Huss 2000)。有证据表明,与来源于外周血的HP细胞相比,来源于脐带血的HP细胞更容易被转导,并且具有更大的自我更新潜能(Moore和MacKenzie 1999)。
已经开发了装置允许富集CD34+细胞用于临床应用,包括Isolex 300i或其同类产品。这些都是基于CD34+细胞表面抗原的识别,该抗原是一种跨膜唾液粘蛋白,其被表达在HP细胞和血管内皮细胞上。这些方法包括使用对CD34抗原特异的抗体的免疫选择方法,该抗体可以被允许筛选的磁珠、荧光或其他标记所标记。细胞可能在内部表达CD34抗原,但是这不允许免疫筛选。只有在细胞表面上表达CD34抗原同时允许接近抗体的细胞被当作CD34+。
被高度富集为CD34+的造血细胞群还可以通过抗原排除策略获自上述提及的来源,例如选择性清除表达谱系特异的标记的细胞,所述标记如CD2,CD3,CD14,CD16,CD19,CD24,CD56,或者CD66b糖蛋白A。这种策略类型允许分离富含CD34-HS细胞和CD34+细胞的细胞群。富集的CD34+群或谱系排出的细胞优选含有至少40%,更优选至少60%和最优选至少80%的这种类型的细胞。所需细胞的纯度和恢复之间的平衡必然受到影响。
样品中CD34+细胞的比率可以采用流式细胞术进行测定,如Bender等1991所进行,或者采用免疫方法。CD34+细胞的绝对数量和比例均可以采用标准程序进行测定(Barnett等1998,Sandhaus等1998)。绝对的有核细胞的数量可以采用血液分析仪或更优选单板分析实验进行测定,其中从单个流式细胞分析就可以直接产生绝对的CD34数。CD34+细胞的计算方法和可以使用的一些设备最近已经被加以总结(Reis 1999)。
一旦分离,可以在任何本领域熟知的适当的培养基中,在容器如细颈瓶或培养袋如透气性的聚丙烯培养袋(Giarratana等1998)中培养CD34+细胞。
越来越多的证据表明,在短期而不是长期重建过程中涉及大多数CD34+细胞,并且所有CD34+细胞仅小部分具有长期多谱系移入的潜力(参见Bertolini等1998)。这增加了在较早报道对CD34+数目的计算和移入潜力的关注(Ducos等2000)。我们此处已经显示转导的人CD34+细胞和能够提供长期多谱系移入的本发明的方法。
处理HP细胞以与鼠肿瘤逆转录病毒载体转导
人HP细胞与鼠肿瘤逆转录病毒载体(例如,以MMLV为基础的载体)和一些其他的逆转录病毒载体的有效转导需要诱导细胞周期,例如使用一种或多种细胞因子(生长因子)(Dao和Nolta 1999)或细胞周期控制的抑制剂。组合使用血小板生成素(TPO),Flt-3配体(FL)和Kit配体(KL,也称做SCF)的方法已经在体外被使用(Murray等1999,Ng等2002)。联合使用MGDF,SCF和FL的方法被用于灵长类中的种群恢复分析(Wu等2000)。Amado等人显示在小鼠模型中,与细胞因子的其他联合使用相比,使用MGDF和SCF处理细胞可以更好的支持胸腺前体细胞的存活(Amado等1998)。IL-3,IL-6,SCF或TPO,或其组合已经被证明对HP细胞的转导具有有利的作用(Nolta等,1992,Hennemann等1999)。联合使用FL/SCF/IL-3/IL-6,SCF/G-CSF,FL/SCF/TPO/IL-6,FL/SCF/G-CSF,FL/SCF/TPO和FL/SCF/GM-CSF也已经被用在大动物模型(Richter和Karlson 2001)。但是,有证据表明,联合使用IL-3,IL-6和SCF可以削弱移入(Peters等1996)。其他诱导HP细胞的周期的方法包括使用P27(kip1)的抑制剂(如反义分子或抗体)(Dao等1998,Cheng等2000),或者转化生长因子β-1(Ducos等2000,Imbert等1998)以增加细胞数量。但是,在本发明之前,以任何这些方法刺激然后转导以赋予在人体长期移入的能力是未知的。
SCF(c-kit配体)是一种主要由骨髓基质细胞产生的细胞因子,在HSC细胞的存活和自我更新中扮演重要的角色(Lyman和Jacobsen1998)。在HS细胞从干细胞群体中转移到子代过程中它还可以作为辅助性有丝分裂原。Flt-3配体(FL)是一种与表达在原始造血细胞上的III型受体酪氨酸激酶结合的细胞因子(Lyman和Jacobsen 1998)。FL和SCF对于HP细胞的存活和增殖具有协同作用(Dao等1997)。血小板生成素(TPO)是c-Mp1受体的配体,是一种在早期血细胞生成以及巨核细胞和血小板的形成中涉及的生长因子(Solar等1998)。MGDF是pegylated和缩短形式的TPO,以类似于TPO的方式发挥作用;其可以被认为在功能上等同于TPO。这些细胞因子的任何一种都可以被修饰,不同配制或被偶联,只要仍然提供相同的作用效果。
核酶
核酶是能够特异切割RNA的具有酶活性的RNA(如,Haseloff和Gerlach,1988)。具有催化活性,它们显示周转并可因此切割多个靶分子。通过互补序列核酶与特定的靶RNA配对,并沿着RNA的磷酸酯骨架诱导在特定位点的切割(Haseloff和Gerlach,1988;Rossi等,1992;Hampel等1990;Ojwang等1992)。锤头型核酶小而简单,当被插入到各种侧翼序列基序中时具有保持位点特异性切割的能力(Haseloff和Gerlach,1988;Rossi等,1992)。核酶的切割需要一个RNA的易接近区,对锤头型核酶而言,是一个NUH靶基序(其中N代表任何核苷酸,H是A,C或U核苷酸)。剪切紧接发生在NUH靶基序的3’端。这些特点使其尤其适用于基因的抑制。其它类型的核酶包括所谓的发夹核酶,丁型肝炎病毒核酶(HDV),RNAse P,间插序列(IVS)I型,IVS II型,和采用体外筛选的方法鉴定的基序。锤头型和发夹型是其中最小的,也是应用最为广泛的类型。
Rz2的描述
许多实验已经在检测试管反应中证明核酶的切割活性,和在组织培养系统中抗HIV-1的实验室和临床分离株的保护作用(Sarver等1990;Sun等,1995;Wang等1998)。被命名为Rz2的一个特定的锤头型核酶直接针对tat基因的高度保守区(图4)。tat基因对于HIV-1的复制是必需的;它编码并产生Tat蛋白,其是整合的HIV-1原病毒的转录激活物。Sun等人(1995)使用Rz2在体外保护T淋巴细胞抗HIV-1,但是没有描述在患者中的结果。他们也没有公开为了延长移入必须使用的转导的HP细胞的最小数目,或者可能的数目。Amado等人(1999)概括的描述了在I期临床实验使用的方案,以确定在HIV-1感染的个体中用基于MoMLV的逆转录病毒载体转导CD34+细胞的可行性和安全性。他们没有描述实验的结果,或者可用于长期移入的转导的HP细胞最小数目。实验的目的是包括确定转导的效率和安全性,以及检验核酶是否能够在体内为子代细胞提供一种存活优势(或劣势)。
图4显示了Rz2的结构和在HIV-1品系HXB2(Genbank序列K03455)中位于5833-5849的它的靶序列,其中切割发生在5842位置的GUA三联体后面。靶序列包括参考品系HIV-HXB2(Genbank登记号K03455)的核苷酸5833-5849(GGAGCCA GUA GAUCCUA),或者HIV IIIB(Genbank登记号X01762)的核苷酸5865-5882(GGAGCCA GUA GAUCCUA),或者其他HIV品系的相应区域。具有相应于Rz2核酶的序列5’-TTAGGA TCC TGA TGA GTC CGT GAG GAC GAA ACT GGC TC-3’的DNA核苷酸被插入质粒pLNL6内neoR基因的3‘非翻译区的SalI位点,该质粒含有无复制能力的逆转录病毒载体LNL6(Genbank登记号M63653),以产生新的病毒RRz2。核酶序列以neoR-核酶融合转录物的形式,从位于RRz2中的莫洛尼鼠类白血病病毒(MoMLV)长末端重复区(LTR)开始表达。
优选地,直接分布在核酶切割位点周围的核苷酸序列在病毒靶RNA中高度保守。这可以通过将在序列数据库中获得的序列进行比较,或者通过多次传代实验进行实验检测容易地确定(Wang等人,1998)。在HIV-1中的Rz2靶/切割位点在几乎所有天然存在的感染性的分离株中高度保守。在I期临床实验中,相对于在切割位点的GUA三联体的位置-4和-1发现了两个序列变体。但是这些变体可能代表不太适合的假型。
由于CD4+和CD8+T淋巴细胞,单核细胞和巨噬细胞对HIV感染最敏感,所以对这些细胞进行遗传修饰,使之表达Rz2,就可以抑制HIV的感染。优选地,遗传修饰在血细胞生成的早期完成。
载体
不同类型的载体可被用于HP细胞的转导或转化。这些包括质粒或病毒载体。目前逆转录病毒载体已经被广泛应用于基因治疗(Chu等人,1998),尤其基于莫洛尼鼠类白血病病毒(MoMLV)-鼠肿瘤逆转录病毒的成员的那些载体。其他可以使用的鼠逆转录病毒载体包括基于鼠胚胎干细胞病毒(MESV)和鼠干细胞病毒(MSCV)的那些。基于鼠肿瘤逆转录病毒的载体可以被用于细胞的高效转导,但是,它们要求细胞处于活跃的细胞分裂。在进入胞质和逆转录后,将预整合复合物转运到核内需要在有丝分裂时核膜破裂。因此使用基于鼠逆转录病毒的载体转导HP细胞需要对细胞进行活化。
慢病毒属载体(Amado和Chen等人1999)是逆转录病毒载体的一个亚类,也可以被用于进行高效转导(Haas等人2000,Miyoshi等人1999,Case等人1999),并且能够转导非分裂的细胞(Uchida等人1998,Sutton等人1998)。预整合复合物不需要有丝分裂就可以进入核仁,所以慢病毒属转导不需要诱导HP细胞进入细胞周期。这提高了细胞保持多能性的可能。慢病毒属载体应用于抗HIV的基因治疗已经被综述(Mautino和Morgan 2002)。
其他组的逆转录病毒如spumaviruse,例如泡沫病毒(Vassilopoulos等2001)也可以有效转导非分裂细胞。
发明中可以使用的其他类型的病毒载体包括腺病毒载体(Fan等人2000,Knaan-Shanzer等人2001,Marini等人2000),腺相关病毒(AAV)载体(Fisher-Adams等人1996),基于SV40的载体(Strayer等人2000),或者杂合载体的形式(例如Feng等人1997或Lieber等人1999)。腺病毒载体能够以高滴度容易地生产,其可被容易地浓缩(1012pfu/ml),并且可以转导非分裂细胞。适于大的DNA插入片段(7-8kb)。体内针对腺病毒的免疫反应可以通过移去编码某些蛋白的基因而被减弱。
AAV载体是非致病性的,可以转导增殖性或非增殖性的细胞,后者包括CD34+细胞,并且可以稳定整合在细胞基因组中(Grimm和Kleinschmidt 1999)。另外,它们不诱导宿主免疫反应,在无辅助系统中可以产生约1010cfu/ml的高滴度。AAV是非包膜病毒,具有单链DNA基因组。AAV载体可以容易地插入长达约4kb的新DNA,尽管最近的研究已经将这个范围扩大。AAV载体可以有效转导长期培养的CD34+细胞(Chatterjee等人1999)。
优选将引入的基因插入到细胞基因组中的载体,以在将细胞回输到患者体内后,能够获得长而持久的效应,例如逆转录病毒载体,其包括慢病毒属载体,和AAV载体。整合型载体此处定义为能够导致所有或部分它们的遗传物质整合到细胞基因组中的载体。它们包括逆转录病毒载体和AAV载体。它们还包括杂合载体,例如腺病毒/逆转录病毒载体(例如Feng等人1997)和腺病毒/AAV载体(例如Lieber等人1999)。但是,以附加体的形式稳定复制的载体也可以使用。在细胞系中以高滴度,成本有效的方式生产,并且对于患者的危险性最低,例如不会产生有复制能力的病毒,这样的载体也是理想的。
载体制备
构建和制备逆转录病毒载体的方法在Gambotto等人(2000)中综述。将载体包装在包装细胞系中,例如PA317或AM-12细胞系,这些细胞系中含有辅助性载体,其在包装过程中是自身缺陷型的。制备高滴度逆转录病毒培养上清的方法的几种变体已经被描述(Schilz等人2001),其包括改变培养基,包装细胞,收获温度和通过离心或络合的浓缩方法(LeDoux等人2001)。这些方法的任何一种都可以为本发明所用。
包装在鼠双嗜性包膜中的逆转录病毒不能有效转导原始的HP细胞,因为双嗜性受体水平低(Bodine等人1998)。但是,细胞周期诱导已经被证明可以导致双嗜性受体的表达提高,同时提高基因转移(Orlic等人1999)。备选的方法是为假型逆转录病毒载体提供包膜,例如来源于长臂猿白血病病毒(GALV)的包膜(Kiem等人1997,Eglitis和Schneidaman1997,Relander等人2002),疱疹性口炎病毒(VSV-G蛋白)(Naldini等人1996,von Laer等人1998),或者猫内源性病毒(Kelly等人2002)的包膜。假型载体可以进行浓缩,例如通过离心。
AAV载体可以在包装细胞系或组成型或瞬间表达AAV rep和cap基因的细胞中生产。AAV载体的制备已经被加以综述(Grimm和Kleinscmidt 1999),其包括开发无需辅助的包装方法和建立制备载体的细胞系。腺病毒载体可以采用标准的方法进行制备和纯化(如参见Fan等人2000)。
病毒储存物的生物滴度可容易确定(例如Tavoloni等人1997)。
在载体中基因的表达。
被引入的基因在本发明的转导的人HP细胞或子代细胞中从启动子表达。启动子可以是组成型表达的,或可诱导的,例如在适当的环境和条件下进行优势表达(例如Chang和Roninson 1996,Saylors等1999)。对特定细胞类型的靶向表达优选具有某些遗传疾病,例如血红蛋白病,或者地中海贫血病(Grande 1999)。病毒载体的启动子/增强子,例如MoMLV逆转录病毒LTR启动子可以被修饰以提高表达(Robbins等1998,Helene等1999)或者通过插入元件如绝缘体(Rivella等2000),或者支架附着区(SAR)(Murray等2000)修饰。优选的启动子和附加调节元件,例如聚腺苷酸化信号是那些应该在细胞类型(如T淋巴细胞)中产生最大表达的那些,所述细胞类型将表达基因治疗制剂。因此,例如,HIV-1,HIV-2,HTLV-1,HTLV-2都可以感染淋巴细胞,为了有效地表达针对这些病毒的基因治疗制剂,转录控制单元(启动子和聚腺苷酸化信号)被选择出来,其可以在造血细胞特别是淋巴细胞(或组织)中提供有效表达。优选的启动子是巨细胞病毒(CMV)急早期启动子,任选地,与生长激素聚腺苷酸化信号联用,和Moloney-MoMLV LTR的启动子。LTR启动子的一个理想的特征是,它应该与它的起源的逆转录病毒具有相同的组织趋向性。CMV启动子被表达在淋巴细胞中。其他的启动子包括VA1和tRNA启动子,其依赖于RNA聚合酶III。金属硫蛋白启动子具有可诱导的优势。SV40早期启动子在骨髓细胞中在体外显示高水平表达。造血细胞特异的启动子可以被用来取代病毒启动子(例如Malik等1995)。
从基于MoMLV的载体,几种抗HIV基因的表达被长期维持(Austin等2000,Su等1997)。基于逆转录病毒而不是MoMLV的载体已经显示了延长时间的表达,例如,小鼠干细胞病毒(MSCV)载体(Cherry等2000),或FrMLV(Cohen-Haguenauer等1998)。来自慢病毒属载体的表达似乎也被维持在转导细胞中(Case等1999)。在转导小鼠造血细胞后,可以观察到来自逆转录病毒载体的基因表达的损失(Challita和Kohn 1994,Lange和Blankenstein 1997),但是如果有的话,在人中在转导的人HP细胞中很少观察到。
转导方法
在使用一些鼠逆转录病毒载体进行转导时,人HP细胞可能需要被使用生长因子处理以诱导细胞周期(见上文)。在使用其他逆转录病毒载体时,不会遇到类似的问题。在任何这类处理后,细胞需要与转导的载体接触。
在本发明的转导方法中,优选使用胞外基质蛋白纤连蛋白(或者纤连蛋白的胰凝乳蛋白酶酶解片段),它促使细胞和病毒颗粒的共定位和提高转导频率(Hanenberg等1996,Hanenberg等1997,Kramer等1999,Williams等1999),或者更优选地,是重组的纤连蛋白片段CH-296。含有肝素结合域和备选的剪切类型3的连接片段区的同等片段也可以被使用(Kiem等1998)。正如小鼠异种移植模型所显示的,使用CH-296还有助于维持HP细胞的再生潜力(Dao等1998)。CH-296和生长因子的联合使用已经被用于犬科模型(Goerner等1999),但是还不知道这种方式是怎样用于人。其他的共定位制剂,例如1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物和精蛋白硫酸盐也可以被使用。这些制剂通过明显提高病毒颗粒的滴度发挥作用。
还可以通过使用滤器(Hutching等1998),或者通过在包被了纤连蛋白的管中进行离心(Sanyal和Schuening 1999)来实现细胞和载体的物理性共定位。
在生产载体的鼠成纤维细胞的单层上共定位HP细胞导致有效的基因转移,但是其不具有临床用途,因为这种方式将使患者暴露于大量的被注入的鼠细胞(Halene和Kohn 2000)。相反,人间充质干细胞可以为有效的CD34+转导提供基质支持(Reese等1999)。
制备逆转录病毒载体来转导人HP细胞的无血清方法可以被采用(例如Glimm等1998,Schilz等1998)。在存在纤连蛋白片段条件下,通过降低含有培养基的载体的浓度,或者单独将载体预加负荷到纤连蛋白片段上,可以提供转导频率,尤其对于CD34+CD38低细胞而言(Relander等2001)。通过富集病毒样品,例如采用阳离子或阴离子聚合物也可以实现提高的转导频率(LeDoux等2001)。
通过使用阳离子脂质体,或DNA-蛋白复合物,例如聚-赖氨酸-DNA复合物,或者其他本领域抑制的方式,可以实现通过非病毒方式的细胞转染。
几个作者已经综述了将基因转移到人造血细胞中的条件(Moore和MacKenzie 1999,Sadelain等2000)。
转导频率
将基因转移到人HP细胞中的频率可以采用标准的方法进行测定,例如PCR或荧光检测的方法(Gerard等1996)。高至70-100%的转导频率已经采用逆转录病毒载体获得,但是这个结果适用于相对少的细胞样品(Halene等1999)。放大到临床相关水平的材料时,通常会导致较低的转导频率,尤其对于更多的需要长期重建的原始HP细胞而言(例如在1-5%的范围内,不需要共定位试剂)。
已经有人提示,更多数量的转导的人HP细胞能够通过体外扩增的方式获得。但是,这样会导致细胞全能性的损失和干细胞损伤(Bunting等1999,Briones等1999,Takatoku等2001)。优选体外扩增保持在最小,尽管某些培养条件允许HP细胞的某些扩增而不损失种群恢复潜能(Kobari等2000,Lewis和Verfaillie 2000,Rosler等2000)。例如,细胞因子的组合:Flt3-配体,SCF和血小板生长素(TPO)可以被使用(Ng等2002)。进一步添加IL-3和IL-6不是优选的(Herrera等2001)。备选地或附加地,转导后的细胞与SCF单独培养两天可以提高移入潜能(Dunbar等2001)。灭活转导后的细胞的处理方法可以提高细胞移入潜能。
当脐带血被预先冷藏时,分离自脐带血的人HP细胞与逆转录病毒载体的转导频率被提高(Orlic等1999)。
转导的人HP细胞也可以通过引入标记基因而被富集,所述标记基因如编码细胞表面受体的基因(例如见Fehse等1997),但是在临床研究中这种做法是不理想的。
转导频率可以采用本领域中众所周知的方法进行测定,例如通过PCR,当科选择的标记包含在构建体中时,在存在筛选试剂如G418时克隆的生长,或荧光激活的分选方法。优选在来自总群体的真正有代表性的细胞样品来测定转导频率,例如通过对来自细胞群的样品的总DNA进行定量PCR方法(例如实时PCR)来测定。对产自群体中的细胞的单个克隆的转导频率的分析是不优选的,但是不应被排除。
在本发明中,我们已经发现为了延长移入必须使用的最少量的转导的人HP细胞。而且,转导的HP细胞必须能够经历胸腺生成过程,以产生分化的多谱系白细胞。
引入的基因的类型
在本发明中,任何基因都可以通过转导被引入到人HP细胞中。可以使用基因来校正免疫缺陷,包括严重联合免疫缺陷症。例如,表达腺苷脱氨酶基因,在淋巴细胞缺陷类型的SCID中缺乏的RAG1,RAG2或者重组/DNA修复过程基因,CD45基因,或者γc,Jak3,IL-7Rα基因的载体都可以被采用(Cavazzana-Calvo 2001)。溶酶体贮积病如高歇氏病—最为普遍的人溶酶体贮积病,可以被治疗。编码葡糖脑苷脂酶(GC)基因的载体,如MFG-GC逆转录病毒载体(Takiyama等1998)就可以被用于治疗高歇病(Dunbar等1998a,Dunbar等1998b)。慢性肉芽肿病(CGD)是由于NADPH氧化酶—具有四个组分的多亚基酶,缺乏而产生的,这种疾病可以通过使用一种适当的基因而被校正,例如p47phox基因或者gp91phox基因。在人群中比较常见的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷可以用G6PD基因治疗(Rovira等2000)。至少8种基因中的任何一种的缺陷导致的范康尼氏贫血症可以使用适当的基因来校正,例如用补体群C基因(Liu等1999)。血红蛋白病如同格兰茨曼血小板机能不全病(Wilcox等2000),和弥漫性体血管角质瘤(Takenaka等2000),每个都可以使用适当的基因加以校正。CD34+细胞可与骨髓保护性基因例如MDR-1一同转导,可以部分治疗造血性恶变,包括白血病,骨髓瘤和淋巴瘤,以及非造血性恶变,其中化疗方案将导致重度骨髓抑制(例如Abonour等2000,Michallet等2000)。非重度骨髓抑制调理可以在这些病例中使用(Nagler等2000)。如果存在这些基因的表达对HP细胞产生有害作用的可能,这是我们不希望见到的,那么这些基因的表达可以被可调控启动子控制,这在本领域中是充分了解的。
应该考虑到,在转导的人HP细胞中存在组成型表达的外源基因时,可能干扰干细胞迁移,归巢和分化的过程。针对该蛋白的免疫反应也可以导致含有基因的细胞的消除。这种情况在腺病毒介导的基因递送中已经被发现,但是在逆转录病毒介导的基因递送或向CD34+细胞引入基因时,通常不会发生。针对neo基因产物的免疫反应通常观察不到。在本发明中我们已经发现,在两个不同的逆转录病毒载体中引入组成型表达的外源基因不会干扰干细胞的迁移,归巢和分化的过程。而且,期待使用人HP细胞作为校正遗传疾病的目标是有利的,因为对于转基因产物的免疫耐受可以在这些细胞中被诱导形成(Halene和Kohn 2000)。
此外,来自转基因的RNA产物,例如核酶,被认为具有可被忽略的免疫原性。编码一种抗HIV蛋白的RevM10基因在SCID小鼠中不会抑制转导的人CD34+细胞的分化(Su等1997,以及Yu等1995)。一些蛋白,例如INFα,已经被表达在CD34+细胞中,但是没有影响在NOD/SCID小鼠中的移入和分化(Quan等1999)。
此外,人HP细胞可以被修饰以在体内,在一定环境下(例如Kirby等2000)或者在存在筛选试剂时(Omori等1999,Ragg等2000)提供给它们选择优势。
实施例
实施例1:试剂
所有的步骤都是在二级生物安全柜中无菌进行。
1.1 DNAse溶液(10mg/ml)
在制备CD34+冷藏培养基中可使用储存的DNAse溶液。将1.4ml无菌的盐溶液(无菌盐水吸入溶USP液(0.9%NaCl),Dey公司,NDC#49502830)加入到1.5ml无菌螺旋盖eppendorf管(Sarstedt,目录号#72692005)中的DNAse(DNAse I型IIS,Sigma目录号#D-4513)中,通过轻轻振荡溶解。-20℃储存。每50ml冷藏培养基使用1ml储存的DNAse。
1.2 PBMC冷藏培养基(90%FBS+10%DMSO)
PBMC冷藏培养基用于冷藏PBMC细胞,以便用于存档和安全检测目的。培养基的组成应为冻融的PBMC细胞提供最大程度的活性恢复。它含有90%胎牛血清(StemCell Technologies,目录号#HCC-6450)和10%DMSO(Sigma,目录号#D-2650),过滤除菌后以4ml等分试样储存。一旦打开,每个等分试样被保存以唯一用于一个患者。
1.3 CD34+冷藏培养基
其被用于冷藏CD34+细胞,以便用于存档和安全检测的目的。培养基的组成应为冻融的CD34+细胞提供最大程度的活性恢复。该程序用于制备50ml冷藏培养基。
以下列顺序将下述物质吸入到无菌50ml管中:
31ml IMDM(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium;Gibco BRL,目录号12440-046)
10ml DMSO(二甲亚砜,Sigma,目录号D-2650)
8ml Albuminarc25TM(25%人血清白蛋白(HSA)American Red Cross,目录号451-0513)
15μl肝素溶液(肝素,10,000U/ml,Elkins-Sinn Inc.)
1ml DNAse储存液(10mg/ml),见上文1
通过旋涡将这些组分充分混合。为过滤除菌,将混合物通过Corning150ml滤器系统(Corning目录号#25932-200)进行过滤。分装在5ml的无菌Nunc管中,每份成4ml,-20℃保存。
对于存档的样品和共培养的样品,一管(ml)用于一个病人。冷藏培养基被融化后放置在4℃保存直至使用。(DMSO在较高的温度下对细胞具有毒性。
1.4 MGDF(100μg/ml重组人pegylated巨核细胞生长和发育因子)
重组人pegylated巨核细胞生长和发育因子被用于培养干细胞,以促进细胞的生长和逆转录病毒的转导。它被制备并等分成100mg/ml的工作储存液,加入到干细胞的培养基时终浓度为100ng/ml。
MGDF小瓶的内容物(Amgen Inc.500mg/ml重组人pegylated MGDF,在1ml含5%山犁醇的10mM乙酸钠,pH5中)和一些IMDM培养基(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium;Gibco BRL,目录号12440-046)被预热到室温。使用无菌技术,从小瓶中取出1ml MGDF溶液,转移到无菌的15ml管中(聚丙烯圆锥形管,Corning目录号25319-15或Falcon目录号#352097)。使用4ml IMDM将MGDF稀释至5ml的终浓度,以制成100mg/ml的工作储存液。每份工作储存液(1ml)均被转移到无菌的螺旋盖的微量离心管中(Sarstedt目录号#72692005)。
一旦制备完成,MGDF工作储存液具有3天的有限的保存期。制备好的MDGF等分试样被储存在4-8℃直至3天而不冷冻。在制备好CD34+细胞的当天(培养的第一天),每个患者需要的每批MDGF应该被新鲜制备。对于每个患者而言,MDGF工作储存试样应制备自独立的物质小瓶,用完后丢弃。对于至少5份独立的细胞培养基制剂制备足够的试样。
1.5 干细胞因子(50μg/ml重组甲硫氨酰人干细胞因子)
重组甲硫氨酰人干细胞因子被用于干细胞培养基,以促进细胞的生长和逆转录病毒的转导。它被制备成50mg/ml的储存液,并以50ng/ml的终浓度使用。
SCF小瓶的内容物(Amgen Inc.1875mg/ml冻干的重组人甲硫氨酰SCF)和IMDM培养基(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium;Gibco BRL,目录号12440-046)被预热到室温。使用无菌技术,使用注射器中的针头取出1.25ml无菌水,注入SCF小瓶中。通过涡流而不是摇动将SCF重组。使用新的针头和注射器取出0.2ml SCF溶液,加入到15ml含5.8ml IMDM的无菌锥形管中,管内已加。这样就可以制成6ml的50mg/ml的工作储存液。使用无菌的5ml吸管,将1ml分装的SCF工作储存液转移到无菌微量离心管。
制备好的SCF试样在4-8℃储存至3天而不冻结。在制备CD34+细胞的当天(培养的0天),为每个患者准备的50mg/ml储存液被新鲜制备。每个患者单独使用一个独立的小瓶材料。仅对于日常的细胞培养基制品单独使用每个等分试样。
1.6 奈韦拉平(Nevirapine)(5mg/ml Nevirapine-VirimmuneTM,18.7mM)
奈韦拉平(VirimmuneTM)被用于抑制在细胞培养和逆转录病毒转导期间HIV在CD34干细胞中的复制。奈韦拉平被制备和分装成5mg/ml(18.7mM)的储存溶液,并且被以500nM的终浓度加入到细胞培养基中。单独一个批次的奈韦拉平工作储存液被制备用于整个临床实验。将盖储存液等分以便为每天的培养基制剂提供给每个患者三小瓶。
大约100mg奈韦拉平无水粉末(Boehringer Ingelheim.Mfr#43074)被称重后加入到50ml管中(BluemaxTM 50ml无菌聚丙烯离心管;Falcon目录号2098)。乙醇(200 Proof Dehydrated Alcohol USP,Punctilious;Quantum Chemical Corp)被加入到该管中制成5mg/ml的溶液。将5mg/ml的工作储存液的0.5ml等分试样转移到1.5ml的无菌螺旋盖微量离心管中(Sarstedt目录号72692005),并且被储存在-20℃。
在使用之前,将奈韦拉平储存液在室温解冻。对于日常的细胞培养基制剂单独使用每个等分试样。
1.7 胎牛血清
胎牛血清是CD34+细胞培养基的一种组分,使用浓度是20%。用于转导的病毒上清含有10%FBS,因此在用于转导CD34+细胞之前需要补加10%FBS。
FBS,以500ml瓶子包装供应,被分装50ml体积以最小化浪费。血清(胎牛血清,500ml,Stem Cell Technologies HCC-6450)被置于37℃水浴中进行解冻,通过涡流而不是振荡混合,直到目测已经混匀,然后无菌分装成50ml体积置于50ml的离心管中(BluemaxTM 50ml无菌聚丙烯离心管;Falcon目录号2098)。将等分试样冷冻保藏。对于日常培养基制剂单独使用每个等分试样。
1.8 CD34+细胞培养基的制备
在进行转导之前,分离的CD34+细胞在这种细胞培养基中至少生长一天。设计该培养基以维持祖细胞的高生存力。下面的操作程序用于制备500ml培养基:
以下列顺序将下述物质吸入到滤器漏斗中(0.45μm,带过500ml收集器的滤瓶;Nalgene目录号SFCA 162-0045):
400ml IMDM(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium;Gibco BRL,目录号12440-046)
100ml FBS(胎牛血清2×50ml,按照上述1.2等分)
500ml SCF(见上述1.5)
500ml MGDF(见上述1.4)
13.3ml 奈韦拉平(见上述1.6)
使用真空直到在一半已经通过过滤,然后将内容物温和涡流以混合。完成过滤并将内容物再次涡流。
CD34+培养基在需要时新鲜制备。一直在室温避光保存直至使用前30分钟,然后在水浴中加热至37℃。超过当时需要的培养基被标记上患者的CRF ID#,并且储存在4℃。它不用于任何其他的患者,并且当患者细胞培养/转导/收获过程结束后丢弃。
1.9 鱼精蛋白硫酸盐
在病毒条件培养基(Virus conditioned medium)中,鱼精蛋白促进载体结合到靶CD34+细胞上。
安瓿包装的鱼精蛋白硫酸盐(Elkin-Sinn,5ml,10mg/ml)被进行等分以最小化浪费。每个患者每次CD34+转导需要两个等分试样,所以约0.5ml的等分试样被分散在10×1.5ml的无菌螺旋盖微量离心管中。它们会被保存在4℃,不要冰冻。每天转导(第一天和第二天)使用一小瓶以制备VCM转导混合物。单独使用等分试样,并在每天制备VCM后丢弃。
1.10 含有鱼精蛋白硫酸盐的VCM转导混合物
使用Magenta公司(bIOrELIANCE Corp.)制备的病毒条件培养基(VCM),在GMP条件下转导培养的CD34+细胞。有两种VCM制剂相应于核酶和对照载体。PA317/RRz2 VCM的病毒滴度低于PA317/LNL6VCM,因此每次转导使用300ml RRz2或200ml LNL6,以补偿感染性病毒颗粒的数目。
转导过程持续两天。为了制备VCM转导混合物,每种VCM均被补加生长因子和血清,以如下与第一天的培养基匹配:
第一天,一份200ml瓶装的PA317/LNL6 VCM,两份200ml瓶装的PA317/RRz2 VCM和2×30ml等分试样的胎牛血清在37℃水浴中完全解冻。等分试样的奈韦拉平在室温解冻,其他的试剂加温至室温:一等分试样鱼精蛋白硫酸盐,一等分试样SCF,一等分试样份MGDF。
在开始混合RRz2前完成LNL6混合物的制备。为了制备LNL6 VCM,下列物质被按照下列顺序吸取加入到滤器漏斗中(Nalgene 0.45mm滤瓶,其具有500ml收集器,Nalge SFCA 162-0045):
20ml FBS(见上文)
88ml 鱼精蛋白硫酸盐(见下文)
220ml SCF(见上文)
220ml MGDF(见上文)
6ml 奈韦拉平(见上文)
200ml PA317/LNL6(PA317/LNL6-3;Magenta公司,滴度:1.4×107ivp/ml)。
将漏斗温和旋涡以混合,并施加真空以过滤混合物。
RRz2 VCM按照同样的方式进行制备,除了使用下述体积:
30ml FBS
132ml 鱼精蛋白硫酸盐
330ml SCF
330ml MGDF
9ml 奈韦拉平
300ml PA317/RRz2(PA317/RRz2-17R′;Magenta公司,滴度:.8×107ivp/ml)
剩下的100ml RRz2 VCM被标记为CRF#,并且立即-80℃再次冻存。其被用于第二天的转导。
在第二天,同样的操作程序被用于制备第二种LNL6和RRz2 VCM转导混合物,除了一个200ml瓶装的PA317/RRz2和第一天剩下的100ml被用于RRz2混合物。
每种VCM转导混合物都是在转导的当天新鲜制备,并且储存在生物安全柜中,直至CD34+细胞被准备好进行转导。
1.11 Retronectin的准备(25mg/ml Retronectin,溶解在PBS中)
Retronectin(人纤连蛋白片段CH-296)溶液被用于包被组织培养器皿,以促进CD34+细胞的逆转录病毒转导。
一个装有2500mg冻干的Retronectin的小瓶被加热到室温,Retronectin来自Takara Shuzo Co.Ltd.,货号#T100B,从BioWhittaker订购。将2.5ml无菌水加入,通过轻轻的涡流溶解物质,使用带针头的注射器将其转移。混合物通过一个Millex滤器(Millipore,目录号#SLGV013 0S)过滤到一个50ml的管(50ml无菌组织培养管;Falcon目录号#2098)中,用4ml PBS稀释,分装到两个50ml的管中,并且使总体积达到100ml。200ml被取出进行内毒素检测,并同时作为终产物,其余的产物被储存在4℃。一般来讲,该试剂被立即包被到器皿上。
1.12 2%HSA的制备(人血清白蛋白溶解在PBS中)。
2%的HSA被用于封闭已经被Retronectin包被的组织培养器皿。它是通过将8ml 25%HSA溶液(Albumarc 25TM)与92ml PBS(无钙和镁,1×Virus Core Lab或JRH Biosciences目录号#59321-78P)无菌混合来制备。该试剂通常现制现用。
1.13 Retronectin包被的器皿
包被有Retronectin的细颈瓶被用于某些患者,以便使用逆转录病毒载体转导CD34+细胞。
25ml Retronectin溶液(见上文)被吸取加入到4×175ml的细颈瓶中(细菌用塑料细颈瓶,175cm2,带有0.2μm的通气盖,Sarstedt 83.1812.502),并在室温保持静止2个小时。溶液被从细颈瓶中取出,并加入25ml2%HSA。再在室温放置30分钟后,其中的溶液被取出,使用25mlIMDM(Iscove′s Modiied Dulbecco′s Medium;GIBCO BRL,目录号#12440-046)洗细颈瓶。这些细颈瓶被密封在塑料袋中,并在使用之前的2-3天于4℃保存。
1.14 VCM转导混合物(与Retronectin一同使用)。
当retronectin包被的细颈瓶被用于转导时,鱼精蛋白硫酸盐被从VCM转导混合物中省略。以与上文1.10.中所描述类似的方式制备它们,除了使用了下列的体积:
对于在第二天早晨的第一次转导,将200ml等分试样的病毒制剂置于37℃水浴中进行解冻,与等分试样的FBS的做法相同。LNL6或RRz2 VCM转导混合物(带有Retronectin)通过按照以下顺序加入到滤器漏斗(Nalgene0.45μm滤瓶,其带有250ml的收集器,Nalge SFCA 162-0045)中得到制备:
10ml FBS(见上文)
110ml SCF(见上文)
110ml MGDF(见上文)
3ml 奈韦拉平(见上文)
100ml PA317/LNL6或100ml PA317/RRz2(见上文)
这些组分通过轻轻涡流混合,并过滤除菌。在开始RRz2混合前完成LNL6混合物的制备。
对于在晚上进行的第二次转导,采用同样的方式,剩下100mlPA317/LNL6和100ml PA317/RRz2被用于制备VCM转导混合物。这些在室温储存直至被使用。
1.15 与Retronectin一起被使用的VCM转导混合物(8-10号患者)。
用于8-10号患者的VCM转导混合物被采用同样的方式制备和使用,除了在制备时使用的体积被加倍。三轮转导在两天完成,也就是说,在第一天的晚上,第二天的早上和下午。
1.16 CD34+细胞洗涤缓冲液(PBS含有Ca2+& Mg2+,+1%HSA)。
含有1%(终浓度)HSA的CD34+洗涤缓冲液是在注射转导的CD34+细胞之前使用洗涤细胞。每个患者使用1L洗涤缓冲液,并且是新鲜制备或提前几天制备。
使用无菌的25ml的吸液管从新的1L瓶装的PBS中取出40ml PBS,这样大约960ml PBS被保留。使用带18量规针头的50ml注射器,将40ml25%的HSA溶液(25%HAS溶液,Albumarc25TM)无菌转移到PBS瓶中,并且采用涡流的方式充分混匀,不振荡。洗涤缓冲液在4℃保存,在用前预热到37℃。1L批次被唯一用于一个患者,并且是单独使用,任何剩余物均丢弃。
1.17 CD34+注射缓冲液(RPMI,无酚红,+5%人血清白蛋白)。
设计CD34+注射缓冲液以维持转导的CD34+细胞收获物的生存力,直到被注射。RPMI是不含有酚红的,这是因为它将被直接注入患者体内。它含有5%终浓度的人血清白蛋白。
100ml该缓冲液被用于悬浮每批经过洗涤后收获的细胞。该缓冲液可以在收获/注射的当天新鲜制备,或者提前几天制备。
使用25ml的无菌移液管,80ml无酚红的RPMI(无酚红,Gibco-BRL,目录号118-030)被转移到250ml的锥形离心管中。使用25cc带21量规针头的注射器,无菌条件下,加入20ml 25%的HSA溶液(Albumarc25TM),美国红十字。该混合物被轻轻涡流混匀。如果该制剂是提前制备,在4℃保存,但是如果是在收获的当天新鲜制备,应该在室温保存,直至使用。混合物在使用之前被预先加热到37℃。100ml批次被唯一用于一个患者,并且是单独使用。
1.18 FACS PBS的制备(PBS,无Ca2+ & Mg2+,+2%胎牛血清,+0.1%NaN3)。
FACS PBS是一种洗涤缓冲液,在FACS染色过程中,被用于洗涤细胞。另外,如果FACS分析在染色之后立即进行(即在接下来的4-6小时内进行),它还用于悬浮染色的细胞。
叠氮化物的储存液(10%)的制备是通过将4g叠氮化钠溶解在50ml管中的蒸馏水中来完成。通过在50ml管中加入48.5ml PBS,1ml胎牛血清和0.5ml叠氮钠溶液来制备FACS PBS溶液。该溶液储存在4℃。叠氮化物储存液具有无限制的保存限期,FACS PBS具有1年的保存限期。FACS PBS被冷却使用。
1.19 FACS封闭剂的制备(5%人AB血清,溶解在PBS中,无Ca2+和Mg2+)。
其被用在FACS的抗体染色反应中,以减低细胞的非特异背景染色。它含有5%人AB血清(Sigma目录号#H-4522,-20℃储存,在37℃水浴中解冻),稀释在无菌的PBS中(无钙 & 镁,1×,Virus Core Lab或JRHBiosciences目录号#59321-78P)。使用Acrodisc 0.45μm滤器(Gelman#4184)过滤除菌,并以1ml等分试样储存在-20℃。
1.20 FACS低聚甲醛固定剂的制备(PBS,无钙&镁,2%低聚甲醛)。
FACS低聚甲醛是一种固定溶液,它可以在抗体染色后保存细胞,用于FACS分析。在FACS染色后,使用1%的浓度重悬浮细胞,这样抗体染色将维持稳定直到至少3天。在此之后,荧光抗体带来的背景信号将会提高。它含有10ml 10%低聚甲醛(Polysciences#04018)混合以40ml PBS,并且在4℃保存。细胞被悬浮在200μl PBS中,然后与200μl该缓冲液固定以产生1%的工作浓度。
1.21 尿素裂解缓冲液
尿素裂解缓冲液被用于制备细胞裂解物,以便酚抽提DNA。它含有84g尿素(Boehringer-Mannheim 1685 899),4g SDS(USB 21651),1ml 0.2MEDTA,1ml 1M Tris碱,1ml 1M TrisHCl,14ml 5M NaCl,溶解在水中,终体积为200ml。该溶液经0.45μ滤器过滤后,保存在室温。
实施例2:I期临床实验
我们进行I期基因治疗临床研究以研究:i)是否将抗HIV-1核酶引入到循环的造血祖细胞可以导致带有载体序列的胸腺迁出者的出现,ii)是否正常的T淋巴细胞的成熟可以发生在遗传修饰的细胞中,iii)是否载体可以长期存在和表,和iv)是否核酶可以赋予易受HIV-1攻击的细胞以存活优势(Amado等1999)。
为了用核酶基因转导细胞,RRz2被使用。RRz2编码锤头型核酶Rz2,其直接针对HIV-1的tat基因的高度保守区。编码Rz2的DNA序列被亚克隆到pLNL6(Bender等1987)中新霉素磷酸转移酶(neoR)基因的非翻译区内的SalI位点,以制备RRz2。在RRz2中从MoMLV LTR核酶以neo-核酶转录物的形式被表达。为了控制对祖细胞移入和T淋巴细胞发育潜在的核酶特异的效应,以及为了研究Rz2赋予的对T淋巴细胞存活的潜在影响,祖细胞还被转导对照逆转录病毒载体LNL6。
在本研究中,具有病毒血症少于10,000拷贝/ml和CD4数在300-700个细胞/mm3之间的HIV-1感染的患者经历了6天与细胞因子粒细胞集落刺激因子(G-CSF)一同转移外周血祖细胞(PBPC)的过程。患者皮下接受10μg/kg日剂量的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)6天。PBPC的获得是通过使用COBEOSpectraTMApheresis System(Gambro BCT,Lakewood,CO)在G-CSF处理的5和6天进行一个血体积的单采血液成分术来完成。使用CEPRATESC干细胞浓缩系统(CellPro Inc.Bothell,WA)(患者1-7号)和Isolex 300i细胞选择系统(Nexell Therapeutics,Irvine,CA)(8-10号患者)进行CD34+细胞筛选。在纯化用于CD34表面标记表达的PBPC后,细胞在CD34培养基中仅培养一天,以便联合使用巨核细胞生长和发育因子(MGDF)和干细胞因子(SCF)诱导进入细胞周期(Amado等1998)。MGDF和SCF由Amgen Inc.(Thousand Oaks,CA)提供,分别在浓度为100ng/ml和50ng/ml时被使用。
近似地,用RRz2和LNL6载体独立转导同样数量的CD34+细胞。产生LNL6和RRz2的细胞系在两个阶段的过程中被制备,其通过将pLNL6或pRRz2的cDNA构建体转染到psi2包装细胞系中,以产生两个种群的嗜亲性无复制能力的病毒。然后将这两个种群用于感染PA317双嗜性包装细胞系(Miller和Buttimore 1986)。来源于下列在G418中筛选的产生克隆的细胞系,被用于检验构建体的完整性,并且被送到BioReliance公司(Rockville,MD)用于制备母细胞库和随后制备经过安全检验的GMP病毒。所有批次的逆转录病毒上清(LNL6和RRz2)都被BioReliance公司检验无菌性,复制能力的逆转录病毒和一般的安全性。病毒滴度是通过使用系列稀释物感染NIH 3T3细胞系和评价G418抗性来确定。LNL6和RRz2滴度分别是1.4×107和0.8×107感染性病毒颗粒/ml。逆转录病毒上清(VCM转导混合物)对于1-3号患者一天加一次,加两天,对于4-7号患者一天加两次,对于8-10号患者两天加三次。对于4-10号患者,转导在包被了人纤连蛋白CH296片段(RetroNectinTM,Takara Shuzo,获自BioWhittaker,Inc.Walkersville,MD)的细颈瓶中进行。为了抑制潜在的HIV体外复制,CD34+细胞的培养和转导均是在存在500nM奈韦拉平(BoehringerIngelheim,Ridgefield,CT)的条件下进行。通过采用ELISA方法在最终的注入物(infusate)中检测p24抗原来确认HIV复制的不存在(所有10份样品均无可检测到的p24水平)。用于10个患者的最终细胞产物均是真菌性,细菌性和支原体性培养,以及内毒素分析阴性。
在转导之后,收集细胞以检验无菌性,细胞数目,生存力,CD34/CD38表型,p24,和内毒素,然后洗涤并注入到未骨髓抑制的自体受体患者体内。这个治疗方案在图5中被加以阐明。保留样品,用于后续的CFC检测,转导效率的RCR分析和PCR分析。
在本研究中登记注册了10名患者(表1)。中间年龄是42岁(32-59岁之间)。使用的抗逆转录病毒疗法的中间数目是3(范围为1-6)。注射的CD3+细胞总数在每千克(kg)体重1.3-10.1×106个细胞(中值为3.2+/-1.1×106个细胞/kg)。在存在鱼精蛋白硫酸盐的条件下进行的前三个患者转导的效率低(在<1%-4%的范围),说明注入的转导的CD34+细胞的数目在0.01-0.08×106个细胞/kg(表1)。在第一个患者的体内,携带转基因的细胞的可检测时间长达6个月(核酶存在于骨髓和外周血单核细胞(PBMC)中,LNL6存在于粒细胞中),在二号患者体内长达9个月(RRz2存在于PBMC中),和在3号患者体内12个月(LNL6存在于PBMC中和RRz2存在于粒细胞中)。
表1.患者和CD34+细胞注入产物的表征。该表显示了患者的年龄,性别,先前抗逆转录病毒治疗方案的数目(ART),为了支持转导使用retronectin,CD34+纯度,注入的CD34+细胞的数目,转导百分率,和注入的转导的CD34+细胞的数目。
表1
患者 年龄 性别 ART Retronectin CD34+纯度(%) 注入的CD34+细 转导(%) 转导的CD34+
胞(×106/kg) 细胞(×106/kg)
01 59 M 1 无 65 3.38 0.4 0.01
02 44 M 4 无 80 2.08 4 0.08
03 40 M 4 无 66 2.98 2 0.06
04 44 M 6 有 67 1.29 10 0.13
05 37 M 6 有 94 10.01 7 0.70
06 32 M 3 有 90 1.63 32 0.52
07 41 M 3 有 96 8.45 48 4.06
08 46 M 2 有 98 9.37 57 5.34
09 48 M 3 有 93 1.64 36 0.59
10 38 F 1 有 95 5.07 28 1.42
为了提高转导效率,7个后续患者接受了在存在人纤连蛋白CH296片段(Hanenberg等1997,Haneberg等,1996)的条件下转导的自体CD34+细胞。在这些患者体内,转导效率被提高到32%+/-6.9的中值水平(范围为7%-57%)(图6)。转导效率的计算是通过对转导的CD34+细胞进行竞争性PCR(Knop等1999)完成的。转导效率还可以通过针对从最终的转导CD34+细胞产物生长的单个克隆中的载体序列进行PCR来测定。
平均来看,LNL6的转导率比RRz2高1.6倍,可能反映了载体滴度的差别。在平均经过30个月(范围为12-36个月)后,在所有的患者体内,在多个时间点和在多个造血细胞谱系中,转基因都可以被检测到。平均来看,0.1-0.01%被分析的PBMC被检测到基因的存在。
图7显示了一个具体患者体内,长期的多谱系基因的存在。图7a显示的是,在注入转导的CD34+细胞2年后,第5号患者的外周血单核细胞(PBMC),骨髓单核细胞(BMMC),T淋巴细胞和单核细胞中LNL6和RRz2载体的序列。T淋巴细胞和单核细胞选自PBMC纯度为>90%,如通过流式细胞术进行确认。对于每种细胞类型,一群样品的四个复制的结果被显示。
我们还使用RT-PCR的方法分析PBMC中基因构建体的表达。使用Qiagen RNeasy试剂盒(Valencia,California),按照制造商的说明书,从通过Ficoll-Hypaque离心血样选择的PBMC来制备RNA。残余DNA被采用DNase消化的方法去除。使用Gibco的Superscript逆转录酶(Carlsbad,California)逆转录RNA,每个样品复制7次。然后收集样品,对10个复制品进行cDNA扩增。第一轮热启动PCR使用Promega的Taq珠(Madison,WI)。第二轮使用Perkin Elmer Ampliwax gem(Boston,MA)。图7b显示的是,在注射两年后,在三个代表性的患者体内,在PBMC中,使用放射性标记的引物检测的LNL6和RRz2的短期和长期载体表达。对于每个样品,均包括不含有反转录酶的反应(-RT)。
为了确定在HIV感染的患者体内,转导的CD34+细胞是否能够经历T细胞发育过程,我们选择外周血CD4+和CD8+细胞,进行CD45RA和CD62L表面标记的表达,其表征天然T淋巴细胞(Sanders等1988;Tedder等1985;Kansas 1996;Picker等1993),并且我们分析了这些T淋巴细胞亚群中LNL6和RRz2的存在。
在白细胞亚群中,使用直接针对覆盖Rz2载体中的Rz2序列的neoR基因的引物进行半定量PCR分析。为了进行PCR检测,DNA被从细胞群体中提取,使用的是Acest多聚体提取法(Ward等1998)。DNA比例对照是通过稀释来自CEM T4细胞的DNA至0.005%标记细胞的浓度来建立,其中所述CEM T4细胞在PBL(阴性)DNA作为背景中用LNL6&RRz2以1∶5的比率转导(其中LNL6=1)。然后在50μ1的PCR反应混合物中进行巢式(热启动)PCR。使用的引物是:5L1A:CAC TCA TGA GATGCC TGC AAG;3L2A:GAG TTC TAC CGG CAG TGC AAA;5Nes1:GAT CCC CTC GCG AGT TGG TTC A(第一轮引物#1:5Nes1 & 3L2A,第二轮#2:3L2A和标记的5LlA)。在17个循环,退火温度68℃,变性温度94℃的第一轮PCR中包括每个样品10个复制品。然后收集重复样品,用做第二轮PCR的模板,共35个循环,退火温度68℃,变性温度94℃。使用5%变性PAGE胶分离四重产物样品,并使用Molecular DynamicsImagequant软件定量分析。LNL6和RRz2的PCR产物分别为174和216碱基对,还包括一段neoR基因的非翻译末端。如果比例对照在可以接受的限度(在含有样品的0.005%载体中,LNL6:RRz2的比例为1∶3.5,可接受的范围是1∶1.1到1∶6.9)内,结果就被包括在内。
图7c显示了天然T淋巴细胞中载体序列的检测。胶图显示的是,在注入转导的CD34+细胞两年后,从第7号患者的外周血中选出来的CD4+和CD8+T淋巴细胞,和天然T淋巴细胞亚群内的LNL6和RRz2载体序列的PCR分析。天然T淋巴细胞群选自CD4+和CD8+选择的种群,纯度大于90%。使用CD3和CD14 MACS微珠(MicroBeads)(Miltenyi BiotecInc.,Auburn,CA),T淋巴细胞和单核细胞被选自于PBMC。以FITC-偶联的单克隆IgG1抗CD45RA抗体(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)进行染色,接着用抗FITC Multisort试剂盒(Miltenyi Biotec Inc.,Auburn,CA)进行选择,筛选天然T淋巴细胞。随后,使用鼠IgG2a抗CD62L抗体(BectonDickinson,Franklin Lakes,NJ)筛选CD62L,接着使用兔抗鼠IgGa+b微珠(Miltenyi Biotec Inc.,Auburn,CA)进行筛选。
图7(D)显示的是,在第2.5年,在5号患者体内的天然T细胞亚群中被检测到的载体序列。
图7(E)显示的是,在第2年,在7号患者体内的天然T细胞亚群中被检测到的载体序列。
图7(F)显示的是在注入后4周,在8号患者体内的天然T细胞中被检测到的载体序列。
图8显示的是,在所有10个患者体内的,直至注入后3年,在骨髓单核细胞(BMMC),PBMC,粒细胞,T淋巴细胞和单核细胞中通过半定量PCR对于核酶和对照载体转基因的检测的总结。
在所有10个患者体内,,在转导的末期,使用病毒上清和培养的CD34+富集的细胞,对于可复制的逆转录病毒(RCR)的生物学分析结果都是阴性的。在Mus dunni细胞系中利用2代扩增步骤,通过共培养,对在转导的末期5%的培养上清以及1%转导的CD34+细胞进行最终细胞注入物的RCR检测。然后,采用PG4 S+L-聚焦分析(focus assay)方法对产生的Mus dunni细胞培养上清检测感染性病毒。注入CD34+细胞后6个月和一年的时间,通过PCR对患者PBMC样品的RCR进行分析,显示没有任何RCR的证据。为了对患者细胞做RCR检测,在注入转导的CD34+细胞之后6个月和一年,从PBMC提取的DNA被用于分析双嗜性包膜序列的存在,使用的引物如下:5′-CTA TGT GAT CTG GTC GGA GA-3′和5′-CCA CAG GCA ACT TTA GAG CA-3′。该分析通过扩增编码包膜基因的宿主决定区部分的高度保守区域,允许检测能复制的逆转录病毒,该区域对于通过双嗜性受体感染细胞是必需的。扩增区域是289个碱基长。该分析的灵敏度是在105个阴性细胞作为背景时,可以检测到一个阳性细胞。作为阳性对照,PA317包装细胞系在做每一个分析中使用。2.5%的NuSieve凝胶上分离PCR产物。
对于两种载体来说,我们发现在PBMC(LNL6 p=0.021;RRz2 p=0.034)和T淋巴细胞(对于LNL6和RRz2,p<0.0001)中注入的转导的CD34+细胞数目和在注入2年后基因检测的持续性之间存在线性相关。Spearmanrank相关性被用来定量再次引入的转导的细胞数目与随后的子代PBMC和T淋巴细胞标记之间的关系。分析是基于每个患者给出的细胞个数/kg数值。在这些分析中,LNL6标记与再次引入的LNL6转导的细胞的数目相关,而RRz2标记与再次引入的RRz2转导的细胞量相关。使标记时间超过一年的转导的CD34+细胞的最小数目是0.5×106细胞/kg。
在天然细胞中,检测到序列,直至注入后2.5年(评估的最后一个时间点)。例如,图7c显示了在一个典型患者体内,在高度富集的天然细胞胞内存在载体序列。
在天然细胞中,直至注入后3年(评估的最后一个时间点)检测到载体序列。图7D-F显示,在三个患者体内,在注入后4-130周,在高度富集的天然和记忆性细胞中的载体序列。天然T淋巴细胞被检测到载体序列的患者平均年龄和病毒负荷分别是41岁(范围在32岁-48岁)和3,680拷贝/ml(范围:无法检测-22,628拷贝/ml)。在天然T淋巴细胞中的载体检测和检测时的病毒负荷总结在表2中。我们还分析了4个患者淋巴结处细针吸取物中载体序列的存在。在4个患者中的2个(7号患者在注入后两年,10号患者在注入后1年)检测到LNL6和RRz2。
表2-天然T细胞载体检测总结。
循环的天然T淋巴细胞群选自CD4和CD8选择过的细胞群,纯度大于85%。通过PCR分析细胞。在分析载体时的病毒负荷在每一个符号下被标出,ND:没有被检测。两个数值说明在一个时间间隔内可以做两次检测。NT:没有被测试;(+):在CD4+CD45+CD62L+或CD8+CD45+CD62L+(天然)T淋巴细胞中检测到LNL6,RRz2或两种载体;(-):在CD4或CD8天然T细胞中没有检测到载体。
患者序号 <3月 3-6月 6-12月 12-24月 >24月
1 NT NT + NT NT
660
2 NT NT + NT NT
12,893 --
3 NT NT - - NT
782 ND
4 + NT + NT NT
590 22,628
5 NT NT + + ++
3,183 3,899 130/15,800
6 NT ++ - - NT
368/606 2,905
7 + NT + + +
4,509 ND 12,496 ND
8 + NT NT NT NT
ND
9 + NT + + NT
ND ND ND
10 NT + + + NT
925 1,384 4,562
为了确定是否抗HIV-1核酶在CD4+细胞存在可以保护其不受HIV感染,我们采用PCR方法,随着时间在不同的细胞类型中测定LNL6和RRz2载体的拷贝数。标记衰变速率的内构建体比较被当作一种混合效应线性回归来执行(Miller,1986)。按照(a)(log)自从注入的时间,(b)细胞类型的指示,(c)一种时间×细胞类型相互作用的术语(乘法的产物)标记强度被回归。对于这些数据,可以进行混合线性模型分析,因为估值运算法则一贯地汇聚在一点上(模型适合SAS PROC MIXED)。对于这些数据,利用“重复测量”程序块结构(blocking structure)模拟标记强度的内受试者相关性。贯穿这些分析,我们使用开放的(unstructured)方差-协方差矩阵,或者采用一种复合对称矩阵(compound symmetric matrix),对残余数据进行模型拟合。实质上,对每种类型的分析均做了均一性参数评估和显著性检验。
在易受HIV攻击的细胞类型中,RRz2标记的持续水平高于未经历HIV诱导的损耗的细胞类型,这与为RRz2转导的细胞提供选择性生存优势的Rz2诱导的保护一致。
如图9a所示,在外周血T淋巴细胞中,RRz2标记的衰变速率大约是BMMC(T淋巴细胞每对数周-0.081个细胞对BMMC每对数周-0.643个细胞,差异p=0.0095)的1/8。与含RRz2的BMMC的衰变速率不同,含RRz2的T淋巴细胞的衰变速率与零点没有显著性差异,并且在两个速率之间的差异是显著地(对于BMMC p<0.0001,对于T淋巴细胞p=0.55,对于在两种细胞类型间含RRz2细胞的衰变速率的比较的统计检验,p=0.009)。为了排除这些结果是由于细胞类型之间内在的衰变速率差异的可能性,LNL6标记被显示在图9b中。这个分析显示了,对于T淋巴细胞LNL6拷贝数的衰变速率是-0.716,对于BMMC是-0.725。两个曲线与零点衰变曲线(对于T淋巴细胞和骨髓,p值分别是0.0019和0.004)有显著性差异。比较两种细胞类型RRz2衰变速率的统计学检验p值是0.97,反映了LNL6载体的接近一致的衰变动力学。这些比较是以混合效应回归模型实现的(Miller 1986)。与缺乏LNL6赋予的抗HIV的保护性活性一致,在这两种细胞类型之间,没有观察到LNL6标记差别性衰变(p=0.9781),(图9b)。这些结果显示,在两种载体之间标记衰变速率的统计学显著性差异被观察到有利于RRz2在PBMC和T淋巴细胞中的存在,但是对于BMMC和粒细胞而言,在载体之间观察到同等的衰变速率。而且,含有RRz2的天然T淋巴细胞随着时间进程数目增多,而含LNL6的细胞则减少(对于RRz2和LNL6分别是每对数周+0.145对-0.240,差异p=0.033)。这些结果说明,在HIV感染患者体内,RRz2赋予易受HIV攻击的细胞一种选择性存活优势,包括新的胸腺迁出者。
我们进一步试图确定,是否含有LNL6和RRz2的T淋巴细胞之间的差异性衰变的数量级,与每个患者接受的RRz2转导的CD34+细胞的数目有关。结果,每个患者两种载体之间衰变斜率间的差别与注入的RRz2转导的CD34+细胞数目有关。LNL6和RRz2标记的患者特异衰变斜率被通过线性回归进行计算,斜率的差别(RRz2-LNL6)被当作一种RRz2介导的保护作用的指示参数。Spearman rank相关性被用于检查差异衰变速率和注入的转导的CD34+细胞数目之间的关系。
描述T淋巴细胞和PBMC衰变速率的关系的点图分别如图9c&d所示。这些分析表明,在注入的转导的CD34+细胞数目和在PBMC和T淋巴细胞中LNL6对RRz2的差异性衰变的数量级之间存在强烈的线性相关。在回归分析中,当再次注入的RRz2转导的CD34+细胞数目被视为预测随着时间的变化标记的差异衰变的持续变量时,结果具有显著性差异,p<.0001(对于(对数)时间,注入的细胞数目,和它们的产物-术语相互作用(term interaction),在差异性标记(RRz2-LNL6)的回归中,对于相互作用术语进行回归系数t统计)。这些数据指出,在被保护的和未被保护的易受HIV-1攻击的细胞之间,存在一种对于差异性存活非预期的剂量依赖的效应,并且使用造血祖细胞的基因治疗策略的临床疗效将依赖于给药给患者的转导的祖细胞的剂量。
I期临床研究的所有患者曾经接受过抗逆转录病毒治疗,目前为止,还没有一个患者发展成机会性感染。CD4+细胞数的动力学和病毒负荷被图示在图10中,在某些患者体内,在注入后第1天观察到病毒负荷的初始增加,这些患者在转移期间没有继续进行抗逆转录病毒的治疗。终止用药,或者将核苷类逆转录酶抑制剂替换为非核苷类逆转录酶抑制剂或蛋白酶抑制剂,被包括在本方案中,以防止在转导期间MMLV逆转录酶的潜在抑制(H.Bazin等,1989)。偶然发生的病毒血症是对抗逆转录病毒治疗进行修正的反应。
从开始到第3年,CD4+T淋巴细胞数目的平均变化是每mm3增加10个细胞(范围是-40-+80)。在6个患者体内,病毒负荷平均下降2.25对数(范围是0.35-3.9),在3个患者体内保持没有检测到,在一个患者体内上升1个对数。这些变化与在任何细胞类型中载体检测或载体表达的程度或持续性无相关性,并且被认为受到对抗逆转录病毒治疗的个体病毒敏感性的影响。
病毒基因型显示了所有患者体内的多个药物抗性突变(数据未显示)。在研究开始和治疗后12,24,52和104周,我们对所有患者HIV的Rz2结合/切割区域进行了基因型分析。核酶切割位点的分析按照前面描述的方法(Wang等1998)进行,只进行微小的修改。简要的讲,病毒RNA被抽提后,使用Access RT-PCR试剂盒(Promega,Madison,WI),使用引物1(TG GCAATGAAAGCAACACT)在48℃反应45分钟逆转录。通过加入引物2(TTTAGAGGAGCTTAAGAATGA),产生的cDNA被PCR扩增25个循环(94℃ 20 sec.,55℃ 30 sec.,和68℃ 30 sec.)。用于循环测序的单链DNA由第二步PCR产生,其使用AmpliTaq(Perkin-Elmer)和引物3(AGTTTT AGGCTGACTTCCTGG)扩增25个循环,反应条件:94℃ 20sec.,55℃ 30sec.,和68℃ 30sec.。使用ABI PRISM染料终止循环测序迅速反应试剂盒对纯化的PCR产物进行测序,使用的是AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer)在自动DNA测序仪(ABI Model 377,AppliedBiosystems,Foster City,CA)上使用引物4(TGGAAGCCATAATAAGAAT)。使用序列浏览(Navigator)软件(Perkin-Elmer)进行序列比对,并手工校正和编辑。产生的序列被与HXB2进化分枝B HIV-1参考株比较。
10个患者中的6个具有允许序列测定的病毒负荷。患者1,2,5和6具有野生型序列。患者4在从GUA靶三联体的-1位置有A到C的转换。患者7在从GUA靶三联体的-4位置有G到T的转换。有证据表明突变的RNA可以被核酶清除。在这些患者中检测的突变在治疗前存在;因此它们不是作为对构建体的有效诱导的抗性的结果而出现。
此处描述的研究是在不存在骨髓抑制的情况下进行的,因此改造的CD34+细胞有助于形成一种嵌合的造血系统。转导的CD34+细胞一定会与内源的干细胞竞争进行造血系统重建。确实,我们的结果显示了细胞剂量和具有转导的细胞的移入物的长度之间的相关性。因为存活优势不被期望发生在转导的CD34+细胞的水平上,并且假设确立了存活与注入的CD34+细胞数目之间的相关性,将来的研究将着眼于增加注入的基因修饰细胞的数量。最近,据报道,γC细胞因子受体缺陷的遗传校正可以导致功能性免疫系统的发育,该缺陷体现为人恶性复合免疫缺陷(SCID)-X1疾病(Cavazzana-Calvo等2000)。对于基因校正策略而言,HIV感染模型与SCID-X1模型不同。不同于HIV/AIDS的设置,其中转导的和非转导的CD34+细胞都能够促进胸腺生成,在SCID-X1情形中,其中产生的功能性受体介导存活信号,胸腺仅产生自含有外源基因的CD34+细胞。因此,在HIV感染时,在CD4+T淋巴细胞的水平上,导致这些携带核酶的细胞扩增的存活优势推测可以在存在HIV复制的情况下发生。这种情况下,由于未被保护的细胞将保持敏感性,所以病毒提供一种选择性生存压力。由于我们的患者还维持逆转录病毒治疗,所以该设想在我们的研究中没有被证实。有可能,在有未控制的病毒复制时,优势生长的程度会更大。
这些结果已经显示,基因构建体能够通过逆转录病毒被引入CD34+造血祖细胞,而这些细胞将有助于在HIV感染患者中的长期多谱系造血作用。我们的研究对HIV感染的干细胞基因治疗实验的第二个报告提出异议。早先的一个实验在儿童患者体内使用了一种含有rev反应元件诱饵基因的逆转录病毒载体,结果只是接受细胞注射后第一天的一个机会,4个患者中的2个被检测到抗HIV基因。在注射后30天所有四个患者均被检测到,90天后3个患者被检测到,250天和330天后1个患者被检测到低水平的对照载体。这些结果与我们的长期重建结果有差异。根据我们的结果,在早先的报道中的短期标记似乎是由于,至少部分由于给药的转导的CD34细胞的低剂量。而早先使用转导的T淋巴细胞的HIV基因治疗研究显示,在注射后直至1年,治疗性载体的持续时间比对照载体更长(Ranga等1998),我们的结果是第一次报道,指出在感染HIV的情况下,来源于遗传修饰的造血祖细胞的T淋巴细胞长期发育,而且显示了针对HIV诱导的损耗的天然和记忆T淋巴细胞的细胞保护作用。含有转基因的天然T淋巴细胞的持续产生发生在甚至具有可检测的病毒血症的患者体内,这个发现是非常重要的,假设天然胸腺细胞已知被HIV感染(Ostrowski等1999),和在T淋巴细胞分化时,胸腺可以作为HIV潜伏源发挥作用(Brooks等2001)。由于在成人患者体内胸腺形成持续进行,所以将这些基于天然T淋巴细胞的潜在来源替代为被设计以有效抑制病毒复制的细胞,可以在撤消抗逆转录病毒治疗后,或者在发展成药物抗性后,使被保护的免疫细胞得到恢复和抑制病毒性反弹。在其他病毒源例如单核细胞中存在的核酶序列还有助于控制在这些设定中的病毒复制。这些结果证明进一步探索以抗HIV干细胞基因转移作为抗HIV治疗的一种形式是正确的。
实施例3:使用的特殊方法
3.1 支原体分析
在培养和转导之后,收获的细胞培养物被进行支原体的检测。使用的程序是基于对支原体特异的DNA序列的PCR扩增,和对扩增子进行后续的ELISA检测。该程序使用了支原体PCR ELISA检测试剂盒(BoehringerMannheim,目录号#1 663 925)。检测样品(一个供体一份样品)和一份阴性对照样品(1ml含有5%人血清白蛋白的新鲜RPMI培养基的等分试样)在微量离心管中被以最大速度在4℃离心10分钟,以沉淀任何支原体。为了溶解沉淀物,加入10μl无菌水和10μl裂解试剂(试剂盒中的溶液1)。进一步的操作按照试剂盒的指导进行。在所有的吸液步骤,使用新的吸头,样品和试剂的交叉污染就可以被避免。每个实验包括两个阴性对照和一个阳性分析对照。PCR扩增的第一个循环是:95℃ 5min,其余39个循环:94℃ 30secsC;62℃ 30secs;72℃ 1min,以72℃10分钟结束。在按照制造商的说明书完成ELISA步骤之后,如果阴性对照低于0.25A450-A690-单位则可以接受,否则该检测被重做。阳性分析对照高于1.2A450-A690-单位是可以被接受的,如果低于这个数值重复进行检测。如果样品的吸收值高于阴性对照多于0.2A450-A690-单位,则样品被认为是支原体污染阳性。
3.2内毒素分析
在培养和转导之后,细胞培养物中内毒素被检测有两个原因:在细胞培养物中存在低水平的内毒素显示先前可能污染革兰氏阴性微生物,第二,而高水平的内毒素对培养的细胞具有毒性。在转导之后收获细胞的当天,注射之前,做该项检测。使用QCL-1000 Limulus Amebocyte Lysate试剂盒(BioWhittaker#50-647U),按照厂商的说明书完成该检测。一种含有25%冰醋酸的终止溶液需要被制备,因为在BioWhittaker试剂盒中不提供该试剂。一个试剂盒足够进行5个患者的培养物的检测。结果用Softmax软件进行分析。如果稀释的注射样品或稀释的VCM样品的检测结果高于5 EU/ml,注射将不被继续进行下去。如果未稀释的注射样品或未稀释的VCM样品的检测结果高于0.3 EU/ml,需要参考革兰氏染色的结果来确定在注射袋中可能的细菌污染。否则注射过程继续进行。
3.3革兰氏染色。
革兰氏染色被用来检测注射前细胞培养物中的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。按照厂商的说明书,使用阳性和阴性对照整合在一起的质量控制玻片(Fisherbrand Gramv QC slides目录号#08-80)和Fisher诊断性革兰氏染色套装试剂(目录号#SG 100D)。每个注射混合物取5μl样品均匀涂在玻片上。染色后,玻片在100×物镜下油浸观察。在标记“+”的第一栏对照方格内,含有革兰氏阳性葡萄球菌,以暗紫红色的圆点出现。在标记“-”的第一栏对照方格内,含有革兰氏阴性大肠杆菌,以粉红色的棒状物出现。如果对照没有出现这些结果,染色需要被重做。如果注射样品中含有任何看起来类似对照的物体,注射不能被进行下去。培养细胞以相对大的物体出现,细胞膜看上去是一种淡颜色的细碎片。
3.4 用于RCR检测的共培养和扩增样品的制备。
患者逆转录病毒转导的细胞和转导的细胞培养上清被用来检测可复制的逆转录病毒(RCR)。依照美国食品与药品管理局(FDA)的要求,每个患者总的转导的患者细胞的1%或108个细胞(任何一个都少)在Musdunni共培养分析中进行检测,5%的转导的细胞培养上清被采用Mus dunni扩增方法进行检测。这些检测均是在BioReliance Corp.,(以前是MABioServices in Rockville,Maryland,USA)完成。这些检测的样品是在细胞收获时和用于注射的制剂中提取的,并且储存直至所有患者的转导/收获流程完成以后,然后送出检测。
按照如下的方法,扩增RCR样品被制备以储存。来自最终收获的CD34+细胞的上清样本被制成三等份,并且包含alignots的被澄清的上清(每管装5%总体积)。它们被储存在-80℃,直到最终的转导患者扩增样品被收集完。双份的RCR共培养样品被制备以储存,每个样品使用每批CD34+细胞的2%,并且重悬浮在冷藏培养基中。然后将样品储存在液氮中,直到运输。足够的细胞被包括在内,以保证在BioReliance Corp.的实验室解冻样品时,可以实现正确的活细胞数目(1%)。
3.5 血浆/PBMC/骨髓的分离。
血液样品和骨髓样品取自注射前正在筛选的患者,和注射后的不同时间点直至至少3年。血液被收集到10ml的ACD管中,收集的体积取决于需要的检测。来自这些血液样品,血浆被收集,PBMC被制备成细胞沉淀或冷藏样品。BMMC从骨髓中制备,而且被新鲜用于CFC检测,剩余的冷藏。使用的程序如下:
血浆的收集:盛有血液的管子(10ml,ACD-A vacutainers)被2000rpm离心10分钟。来自每管的血浆部分被仔细收集并汇集在50ml的无菌管中。2ml体积的血浆被分装并储存在-80℃。
PBMC的制备:在收集完血浆后,使用红细胞/白细胞沉淀。使用洗涤缓冲液将细胞稀释到初始体积的3倍,并分装在50ml的离心管中,每管30ml。每个稀释的细胞悬液均被10ml Ficoll-Paque(Pharmacia目录号#17-0849-03)支撑,并在活动的吊篮式转子中4℃2000rpm离心20分钟。吸出上层,使单核细胞层不被破坏,留在中间相。中间相的细胞被转移到新的50ml管中,如果适当的话汇集,用洗涤缓冲液洗涤,1500rpm离心15分钟,将沉淀重悬浮在5-10ml的洗涤缓冲液中。使用血细胞计数器和Trypan Blue(1∶25稀释)对50μ1的细胞混合物进行活细胞计数。细胞被分装成1-2×106细胞每管,如果需要冷冻保存,使用140μl尿素裂解缓冲液裂解。对于冷藏,细胞被以1-5×106细胞/ml重悬浮在PBMC冷藏培养基中,并且在液氮中逐渐冷却以便保存。
骨髓单核细胞(BMMC)的制备:用洗涤缓冲液以1∶1的比例稀释骨髓,30ml的样品被Ficoll-Paque支撑,然后按照上述和PBMC一样的操作进行处理。对30μl的样品进行活细胞计数,留出CFC分析所需的量以用于分析。所有剩余的BMMC被以1×107细胞/ml冷藏在CD34+冷藏培养基中。
3.6 筛选样品骨髓CFU检测
对来自注射前患者的骨髓进CFU检测,从而为注射后进行的所有克隆检测提供基线或对照。由于细胞尚未被暴露于治疗性基因或对照基因,它们不能被G418筛选出来。所有的操作都在一个生物防护罩(biocontainment hood)中进行,所以时间均使用无菌技术。
如上制备的BMMC被等分到3个1.5ml的无菌微量管中,每管分别装15×106细胞,7.5×105细胞和3×105细胞。将样品2500rpm离心2分钟,培养基被吸出后,细胞沉淀被彻底重悬浮在300μl RPMI(Gibco BRL,目录号#118-030)+1%FBS(Stem Cell technologies,目录号#HCC-6450)。细胞混合物被吸取加入到小管(6ml聚苯乙烯,Falcon,目录号#2058)中,每管含有3ml Methocult GFH4434(Stem Cell Technologies,目录号#HCC-4434)。内容物被充分涡流至少15秒后,静置直至没有气泡,将1.1ml的等分试样仔细分层在排列在培养皿中的方格盘(Nunc目录号#174926)上。培养皿中额外带有一个方格盘,内盛无菌水,并开盖以保持培养过程中的湿度。带有方格盘的培养皿被放在一个37℃湿度培养箱中,在10-14天后克隆可以被观察到。
3.7 注射后CFC检测。
注射后克隆形成细胞(CFC)检测包括带有G418和不带有G418的培养物。这个实验被用来评估注射后转导的祖细胞的发育。两个细胞数/盘被用来保证挑选时克隆处于合适的密度。
BMMC的制备如上所述,并被等分到无菌微量离心管中,细胞数是6×105或1.5×106个细胞。将细胞~2500rpm离心2分钟。培养基被吸出之后,细胞沉淀被彻底重悬浮在600μl RPMI+1%FBS中。300μl每种细胞混合物被加入到含有3ml Methocult GFH4434(Stem Cell Technologies,目录号#HCC-4434)的管中。其中一个加入G418,浓度为0.9mg/ml(G418,结晶的遗传霉素,Gibco-BRL目录号#11811-031),另一个不加G418。然后将样品涡流并如上用于筛选样品骨髓CFU检测所述进一步处理。
3.8 从血液制备T细胞,单核细胞和粒细胞。
在注射后的几个时间点,从患者的血液分离白细胞。这些细胞被分为三种类型(T细胞,巨噬细胞和粒细胞谱系),以便监测RRz2或LNL6的存在和HIV的水平。血液根据一步形态(1-Step polymorphs)首先分为红细胞,粒细胞和外周血单核细胞(PBMCs)。PBMCs进一步被分为两组:CD3一组产生淋巴细胞,CD14一组产生单核细胞。粒细胞部分被采用吉姆萨染色的方法评估纯度,而淋巴细胞和单核细胞部分被采用FACS染色评估纯度。所有部分被处理以制备用于随后的DNA提取和PCR分析的细胞裂解物。
所有的操作都在2级生物安全柜中进行。在用前少于2小时收集并保持在室温的被放置在10ml管中的5ml新鲜的ACD抗凝的人血被涂在3.5ml的一步多形核白细胞(Polymorphs)(Accurate Chemical & ScientificCorporation,目录号#AN221710,室温避光保存)上。
在活动的吊篮转子中在室温下1650rpm离心试管30分钟。离心后可见两个白细胞的带。在血浆/一步界面上的顶带,由单核细胞组成,较低的带由PMN细胞(粒细胞)组成。红细胞被沉淀。吸出所以但是约1ml的血浆被吸出并被转移到血浆管中,使在界面的单核细胞层不被破坏。每个患者的所有血浆收集物被汇集,等分成2ml的小份,保存起来用于以后制备粒细胞株系(stain)。PBMC界面细胞被小心转移到PBMC管中,小心不要挑起较低的带。每个患者的所有PBMC收集物被汇集。将较低的带转移到粒细胞管中,并汇集。同样体积的低渗PBS被加到粒细胞管中。“PBMC”和“粒细胞”管都被添充洗涤缓冲液直至50ml,混合并在室温1500rpm离心15分钟。上清被吸出之后,用50ml洗涤缓冲液洗涤细胞一次。沉淀后,细胞被重悬浮在10ml的PBS中。进行细胞计数(1∶20倍稀释PBMC细胞悬液,1∶5倍稀释粒细胞悬液)。
粒细胞沉淀/裂解物的制备和表型分型:原始的悬液或细胞沉淀被重悬浮起来至终浓度为1×107个细胞/ml,如果必要的话,首先再次沉淀细胞。将100μl转移到微量离心管中,用于表型染色。将这些细胞在微量离心管(microfuge)中大约3000rpm离心1分钟沉淀,悬浮在10μl血浆组分中,5μl这种浓缩的悬浮液被涂布在两个显微玻片的每个上。这些玻片被风干后,吉姆萨染色30分钟,用蒸馏水清洗,并空气干燥。在20×倍的物镜下检查它们,粒细胞组分被计数。剩余的粒细胞在微量离心管中被大约3000rpm离心2分钟沉淀以用于随后的DNA提取。
3.9 从细胞制备DNA(真空管(vacutainer)-酚化(phenoling)DNA)。
真空管(Hemogard,SerumSep,6ml.目录号#369789)被用于某些DNA提取。这是一种快速的从CD34选择的细胞,甲基纤维素克隆和患者PBMC中提取DNA的方法。在1.5ml微量离心管中的1或2百万细胞被3000rpm离心3分钟沉淀在微量离心管中,用1ml PBS洗一次,然后再次分散在70μl的水中。每管加入140μl尿素裂解缓冲液,通过涡流离心管5-8次彻底混合各相。这些离心管被无限期冻存在-70℃。对于每个样品,0.5ml酚溶液(Tris平衡的,United States Biochemical#20083,每400m加入0.4g半硫酸盐羟基喹啉),使用带23-25G针头的1ml注射器抽吸混合物2或3次,然后注入到含有210μl水的真空管中。然后向每个管中加入15μl氯仿子。加盖后,将它们在2400rpm离心5分钟,然后加入0.5毫升酚/氯仿。将它们振荡30秒后,在2000rpm再次离心3分钟。重复进行酚/氯仿抽提,接着使用氯仿/异戊醇抽提2次。在插栓以上的400μl抽提物被转移到一个带有抗气溶胶尖的微量离心管中,使用25μl 5M NaCl和850μl无水乙醇-20℃沉淀DNA。通过离心回收DNA,使用70%乙醇洗涤一次,空气干燥,再悬浮在50μl水或5 mM Tris pH9中。对于PBMC部分或骨髓样品,每106个细胞使用20μl。DNA制剂被储存在-70℃。对于来自克隆的样品,在真空管中210μl水含有作为载体的10μg tRNA(Sigma R 9001)。
还可以采用“Acest方法”从细胞中制备DNA,并用于竞争性PCR和PCR-RCR检测。在微量离心管中约5×106个细胞的沉淀被重悬浮在300μl裂解缓冲液中(10mM Tris-HCl,50mM KCl,3mM CaCl2,0.4%Triton×100,pH8.0,过滤除菌),加入3μl PreTaq(Boehringer Mannheim目录号#1696491),将样品煮沸5分钟,在13000rpm离心2分钟。上清被转移到一个1.5ml的带螺旋盖的清洁管中,加入100μl ACES缓冲液(2.28Aces(Sigma目录号A-7949),12.5ml 05M NaOH,12.5ml吐温-20,pH6.8,总体积50ml,过滤除菌)和25μl聚合物(Ward等1998),通过简单涡流混合样品,然后13000rpm离心2分钟。将沉淀重悬浮在50μl 20mM NaOH中,放置在室温,直至完全被溶解。将样品煮沸5分钟,并通过测定260nm的光密度测定DNA浓度。由于HIV的存在,注射后样品的提取在PC3防范(containment)下进行来自注入后细胞的提取。
3.10 PCR
为了检测细胞或细胞克隆中的LNL6或RRz2序列,进行细胞DNA的PCR分析。PCR引物被标记P32以进行PCR产物的定量检测。标记采用推荐的程序,使用γ32P-ATP(ICN#3502005)和T4多核苷酸激酶(GIBCOBRL目录号#18004-010)进行。额外的未被插入的标记被使用G25Sephadex旋转柱清除。用在PCR反应的10×缓冲液含有250mM Tris,50mM MgCl2,500mM NaCl,2.5mM每种dATP,dCTP,dGTP,dTTP(GibcoBRL 10297-018),1.0mg/ml BSA(Sigma A-4378,以100mg/ml制备),pH8.0。
pLNL6和pRRz2 DNA的标准物被稀释在5mM Tris,pH9中,每μl1,000和100,000个拷贝,其使用人肝脏DNA作为载体并随后稀释到每5μl样品含有5-5000个拷贝的范围。对于人β球蛋白分析,人DNA标准物从1mg/ml储存物制备,以制成每μl 10,000,3000,1000,300和100个基因拷贝的稀释物。
LNL6/RRz2″高拷贝″:被用来定量DNA制剂中的相对高水平的LNL6和RRz2的方法。这些DNA来自于CD34细胞和造血细胞克隆。在这个方案中,PCR反应体系是25μl,含有不超过104拷贝的人基因组。寡核苷引物是5L1A,3L1D,Taq聚合酶购自Fisher。扩增如下进行:使用是MJ Research Programmable Thermal Controller,94℃ 3分钟,68℃ 1分钟,然后27个循环:94℃ 1分钟,68℃ 1分钟。10个标准(对照)样品也被处理,分别含有5000,1000,500,100,50,10,5,0,0和0拷贝的RRz2,以及0,0,0,5,10,50,100,500,1000和5000拷贝的LNL6,所有存在5000拷贝的人基因组。
LNL6/RRz2″低拷贝″:被用来定量DNA制剂相对低水平的LNL6和RRz2的方法。这些DNA来自于外周血细胞(淋巴细胞,巨噬细胞和粒细胞)。在这个方案中,用具有约106拷贝的人基因组的50μl样品进行反应。20μl的DNA样品被与30μl含有引物5L1A和3L1D(一个被标记),缓冲液和聚合酶的混合物混合,并且按照“高拷贝”的方法进行处理,除了94℃步骤的时间是90秒。标准样品是存在106拷贝人基因组。
扩增样品在5%或6%的聚丙烯酰胺凝胶上被电泳分析,使用的是Tris-硼酸盐-EDTA缓冲液(10×TBE,0.89M Tris硼酸盐pH8.3+20mMEDTA),使用AMBIS 4000放射成像仪(Radioimager)定量电泳带的放射性。
作为附加的标准物,在DNA制剂中,β球蛋白DNA被定量,这时人基因组的拷贝数是10000。这些的DNA来自CD34+细胞和造血细胞克隆,和患者PBMCs,T细胞,和骨髓。扩增反应使用寡核苷酸引物LX1和LA2,94℃ 1min,65℃ 2min反应25个循环。
当少于大约0.01%的细胞任一构建体时,也可使用巢式放射性PCR方法来计算LNL6;RRz2标记的比例。两轮PCR提供了增加的灵敏度,插入放射性标记容易地允许使用成像软件进行定量。细心操作的实验技术被用来避免交叉污染,而且合适的对照也被采用。第一轮PCR使用1μg模板DNA,引物5Nes1和3L2A,含有2mM MgCl2的缓冲液II(PerkinElmer目录号#N808-0010),dNTPs和Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer目录号#N801-0060),反应体系50μl,其中带有taqbeads(Perkin Elmer目录号#N808-0100)。在Thermofast 96孔PCR板(Advanced Biotechnologies,目录号#AB0600)中每个样品被扩增10个复制子,其利用94℃1个循环,接着30sec/68℃和30sec/94℃进行17个循环,并4℃冷却。10个复制子的产物被汇集,并将5μl汇集的样品用于每一个第二轮扩增反应。第二轮PCR使用了标记的引物5L1A和引物3L2A,采用与第一轮相同的条件,只是进行了35个循环的扩增。产物在聚丙烯酰胺凝胶上被分析。RRz2对应216bp的产物,LNL6对应174bp的产物。
3.11 RCR-PCR
RCR-PCR分析允许通过扩增env基因的高度保守区来检测可复制的逆转录病毒。扩增的序列编码部分包膜蛋白的宿主决定区,其是通过双嗜性受体感染细胞所必需的。扩增区有289bp长。分析的灵敏度是一百万个阴性细胞(10-6)背景中检测一个阳性细胞。
PCR反应使用7μl DNA样品,引物5RCR6=5′-CTA TGT GAT CTGGTC GGA GA-3′和3RCR6=5′-CCA CAG GCA ACT TTA GAG CA-3′和缓冲液II(Perkin Elmer,目录号#N808-0010)和Mg2+(Perkin Elmer,目录号#N808-0010),0.25mM dNTPs(Gibco BRL 10297-018),和Taq聚合酶(TaqbeadTMDNA聚合酶,Promega,目录号#M5661)。扩增反应是94℃ 3分钟,然后94℃ 30秒,63 30秒和72℃ 30秒进行45个循环。扩增的样品在2.5%NuSieve凝胶上分析。存在289bp条带显示RCR的存在。
一个含以水代替样品DNA的“无DNA”的对照在每一个PCR实验中进行,以确认没有任何试剂的污染。一个阴性对照(CEMT4 DNA)也被运行,以保证产生的扩增子的特异性。在每一个PCR反应中,一个阳性对照(10-5PA317)被采用,以确保PCR的灵敏度是在100,000个阴性细胞中至少1个阳性。″PA317粗短刺状″样品,指的是向所有在复制PCR管中的测试样品中添加10μl 10-3PA317‘粗短刺状’DNA,浓度是20ng/ml,这些样品也被包括在每个实验中。加入这个阳性对照,10-3PA317DNA确证了阴性的PCR结果是一个真正的RCR阴性结果,而不是由于不可扩增DNA产生的假阴性。所有的操作需要细心的实验技术,以避免交叉污染,例如使用0.1M的氢氧化钠清洗工作台和移液管,常换手套和使用气溶胶塞的枪头。
3.12 在CFC检测中的克隆分离
对患者的骨髓细胞,来自单采血液成分术的CD34+细胞,和最终的转导产物进行CFC检测。如上所述,通过PCR分析来自所述检测的克隆的LNL6和RRz2基因。来自甲基纤维素培养基上生长14天克隆的细胞的分离和裂解如下。在显微镜下,个别的克隆被使用P200抗气溶胶的枪头吸出,并被加入到微量管中。使用PBS洗涤枪头以去除所有甲基纤维素。将样品中等速度涡流15秒,以在不剪切细胞的情况下溶解甲基纤维素。如上所述在裂解后从细胞分离DNA。
3.13 RNA提取和RT-PCR分析
使用QIAmp RNA血液微量试剂盒(Qiagen目录号52304),通过按照厂商的说明书,RNA被从患者样品中提取。从1-5×106个细胞中提取RNA,并重悬浮在50μl无RNA酶的水中。在使用RQ-1 DNase(Promega,目录号M6101)对RNA制剂进行DNase处理后,通过每个反应使用约700-1000ng RNA,引物3L2A,和酶Superscript Rnase H RT(Gibco目录号18053-017),在37℃反应45分钟来合成cDNA。每个RNA样品进行7次复制,并在上述巢式PCR方法中用作模板前汇集产物。
实施例4:
如下收获HP细胞,转导和再次注射。该方法包括下列步骤:
从人受试者的骨髓将
HP细胞转移到外周血中;
对个体的外周血液进行
单采血液成分术,以获得被转移的HP细胞;
洗涤步骤#1:通过使用细胞洗涤器洗涤未纯化的外周血单核细胞,为去大块(de-bulking)作准备。
去大块步骤:以去除额外的红细胞,粒细胞,血小板,和T淋巴细胞;
洗涤步骤#2:使用细胞洗涤器洗涤富集的HP细胞;
从HP细胞群体进行
CD34 + 细胞筛选或减少抗原阳性细胞;
洗涤步骤#3,使用洗涤器洗涤纯化后HP细胞;
细胞培养 通过将纯化的HP细胞置于具有细胞因子/生长因子的培养物中进行;
转导程序 在存在转导促进试剂的条件下,使用含有基因构建体的逆转录病毒载体进行HP细胞的转导程序,优选使用细胞洗涤器引入病毒载体;
收获细胞产物和洗涤HP细胞,其包括使用细胞洗涤器的转导的HP细胞;
注射产物的制备 将HP细胞置于注射袋中并进行产物安全释放测试;和
患者的注射 将细胞递送回到同样的受试者。
如下的实施例和其它修改更详细描述这些步骤:
步骤1-HP细胞的转移
该程序的第一个步骤使用一种试剂将HP细胞从骨髓转移到外周血中。这里的一个实例是使用粒细胞集落刺激因子(G-CSF,NeupogenTM),其被皮下注射到患者体内,至少10μg/kg/天和优选30μg/kg/天,一天一次,连续五天。在给药G-CSF期间,每日进行全血计数(CBCs),分化的(differential)和血小板计数,来评价白细胞增多的程度。在给药G-CSF后3天,血液样品被用来进行CD34+细胞计数,以保证在单采血液成分术开始前,外周血CD34+细胞的数目多于20个细胞/mm3。但是,没有获得CD34+细胞的数目并不妨碍在给药G-CSF的4,5和6天的单采血液成分术。
步骤2-单采血液成分术
单采血液成分术是一种“血液过滤”以获得外周血中的单核细胞组分的方法。它是用Cobe光谱(Gambra),Hemonetics(Domedica)或Amicus(Baxter)机器,在至少两个不同的时间进行的,(优选转移后4,5和6天,这里第一天是诱导转移的当天),尽管在其他的实施例中这可通过测定外周血中的CD34+细胞数目多于5个细胞/mm3,或更优选10个细胞/mm3,和最优选20个细胞/mm3的日期,可以在更早或更晚的时间来进行。在一个优选的实施方案中,单采血液成分术可以从流过的5L,优选5-10L,但更优选10-20L,和还最优选20L或更多的血液中产生细胞产物。来自每次单采血液成分术的产物被分别处理,或者在一个优选的实施方案中,在再次单采血液成分术后被汇集。总细胞数目和纯的CD34+细胞数被记录下来。应用步骤1&步骤2将产生直至多于5×106,优选多于2×107,更优选多于4×107HP(如通过CD34阳性来测定)细胞/kg。
步骤3-洗涤步骤#1(优选在单采血液成分术时进行)
汇集的细胞被洗涤。这是通过细胞离心或更优选使用自动细胞洗涤器来进行,在一个实施例中,通过使用Nexell CytoMate洗涤器进行细胞洗涤。
步骤4-去大块步骤(优选在单采血液成分术时进行)
在一个实施方案中,采用类似Charter Medical DACS-SCTM系统的系统将来自单采血液成分术程序的细胞“去大块”。在一个实施方案中,其中来自第一天的产物被储存过夜,以便与第二天的产物汇集,这两种单采血液成分术产物均被在收集的当天去大块,并且将第一天的产物储存起来直至第二天的产物已被去大块。
步骤5-洗涤步骤#2(优选在第6天)
细胞被采集,汇集(在有两个产物的实施方案中)并通过离心或通过用Nexell CytoMate设备或类似设备洗涤。(如果有多于两个产物,所有产物将被在最后的时间点被汇集)。
步骤6-CD34
+
细胞的筛选(优化在第6天)
从洗涤后产物筛选CD34+细胞是通过使用Isolex 300i,Miltenyi或根据细胞表达标记(例如CD2,CD3,CD14,CD16,CD19,CD24,CD56,CD66b糖蛋白A,StemSep)的谱系减少策略。富集的CD34+细胞,或谱系减少的细胞优选地含有至少40%,更为优选的至少60%,和最为优选的至少80%这种类型的细胞。
步骤7-洗涤步骤#3(优选在第6天)。
通过离心或通过使用Nexell CytoMate或类似设备洗涤细胞。步骤8-细胞培养(优选在第6-9天)
细胞被计数后,以优选密度为1×105-5×106个细胞/ml置于细胞培养瓶中,细胞培养袋或在一个优选实施方案中,置于1,000ml(390cm2)NexellLifecell X-Fold培养袋,或类似物中,其具有Iscove′s Modified Dulbecco′sMedium加上含有细胞因子/生长因子的10%胎牛血清(FBS)。在优选的实施方案中,细胞因子/生长因子混合物包含干细胞因子(50ng/ml)和巨核细胞生长和发育因子(100ng/ml)。步骤3-9将产生每kg多达12×107个HP细胞或更多(如通过CD34阳性评估)。
步骤-9转导程序(优选在第8天)。
细胞被从第一个培养瓶,组织培养袋,包括优选实施方案中活细胞培养袋或类似物,和使用Cytomate装置或类似物中收获,重悬浮在逆转录病毒上清中(它的一个实例是200ml等分试样)和转移到另一个组织培养容器中,其一种类型是Lifecell X-Fold Culture Bag,里面含有逆转录病毒转导促进剂。这些试剂包括1,5-二甲基-1,5二氮十一亚甲基聚甲溴化物,鱼精蛋白硫酸盐,阳离子脂类,或在一个优选的实施例中,在已经以1-4mcg/cm2预先包被RetroNectin的组织培养容器。在4-10小时后,或直至24小时,使用CytoMate或类似物重复转移程序;对于该第二次转导,将细胞转移到一个新的组织培养容器1,5-二甲基-1,5二氮十一亚甲基聚甲溴化物,鱼精蛋白硫酸盐)中,或者返回它们出处的原来的,或类似的包被RetroNectin的容器。在一个优选的实施例中,这是在新鲜的等分试样的逆转录病毒上清中进行,并培养过夜。在其它实施方案中,这个过程或者不进行,或者类似的时间重复几次。收集等分试样的逆转录病毒上清用于无菌检测。这样每kg将产生多达6×107含有基因的HP细胞,或者更多(如通过CD34阳性来评估)。这个数值是通过定量分析测定的。转导效率至少是20%,优选地是在30-50%的范围内,更优选的是高于50%。
步骤10-收获细胞产物(优选在第9天)。
在第9天的早上,细胞被收获和使用标准的细胞离心或自动化系统,如细胞培养的Cytomate样品,进行洗涤。这样每kg将产生多达5.7×107含有基因的HP细胞或更多(如通过CD34阳性评估)。
步骤11-注射产品(优选在第9天)
细胞被重悬浮在生理注射缓冲液中,其含有5%人血清白蛋白或类似物作为载体。等分试样的样品被灭菌处理(除需氧菌,厌氧菌,真菌,支原体)。注射产物不能被使用,直至得到内毒素(LAL)和革兰氏染色检测的结果。
步骤12-患者的注射(优选在第9天)。
CD34+细胞的制备物被给药给预先适当用药的患者。在一个优选的实施方案中,患者接受每千克体重0.5-6×107转导的CD34+细胞的单一注射,所述细胞在生理注射缓冲液中,其含5%人血清白蛋白或类似物作为载体。每个患者使用的转导的CD34+细胞的剂量将取决于转移,单采血液成分术,分离,培养和转导过程的每个步骤的效率。CD34+细胞的总数(转导的和非转导的细胞)通过细胞计数和流式细胞方法确定。引入的含有基因的HP细胞产生嵌合型造血系统,其中在骨髓中存在一定比例的含有基因的HP细胞。在一个优选的实施方案中,即用于治疗HIV/AIDS的实施方案,含有基因的HP细胞的比例至少是5,优选地大于10%,更为优选地大于20%。
实施例5.具有多重靶向能力的RNAi抑制HIV-1复制的应用。
具有针对HIV-1的多重靶向能力的RNAi构建体被如下设计。一个盒子结构包括三个RNAi单元,每个单元有19-25核苷酸片段,对应于HIV-1正义方向(1A,2A,3A)和反义方向(1B,2B,3B),见图14,1B,2B和3B分别与1A,2A和3A在序列上互补。序列1A,2A和3A被选择,因为在大多数HIV-1毒株中是高度保守的,例如HXB2株的5831-5849位置序列(atggagccagtagatccta),5852-5870位置序列(ctagagccctggaagcatc)和5971-5989位置序列(tggcaggaagaagcggaga)或者其他株系中的相应区域。使用下列网站的服务这些序列被计算出来:http://hiv-web.lanl.gov/content/hiv-db/NUM-HXB2/HXB2.Nuc.html。与多数HIV-1毒株的相应序列相比,优选地,序列1A,2A和3A的差异不超过一个核苷酸。上述19个核苷酸序列的每一个在许多HIV亚型中在tat基因中都是相当保守,并且在B亚型中非常保守。这些19个核苷酸序列的每一个与在亚型B中的共有序列的差别不超过一个碱基对。第一个序列包括Rz2的靶序列。在接近序列的末端的差别可以更被允许。RNAi单元被间隔区隔开,间隔区可以长3-7个核苷酸。间隔区可以更长一些,例如含有内含子序列以辅助RNAi单元的胞质定位。该盒子结构被自我切割的核酶序列侧接,以允许释放多个RNAi分子。例如,5’末端可以被锤头型核酶加工,其中根据美国专利号6,127,114设计催化结构域,在3’端被自身催化的发夹核酶处理,其被根据美国专利号5,856,188设计。这样的结构允许RNAi分子碱基对的末端(钝圆),无额外的核苷酸,尽管这些可被改变。在带箭头的位置(图14)发生自我切割以释放3含有RNAi的分子。间隔区1/2和2/3可以含有可切割的序列,例如可以被锤头型,或发夹型核酶或者另外的核酶单元切割的序列,以便将RNAi单元分开。很清楚,单个RNAi单元可以被使用,或者多达6个或甚至10个单元的多聚体也可以被使用。
盒子结构被以一个来自重叠退火的寡核苷酸的DNA分子的形式装配,并被插入到T7启动子控制下的质粒载体中。一种重组缺陷的大肠杆菌菌株,允许带有反向重复序列的质粒稳定复制,在本领域中很易于被理解,就是被用作一种克隆宿主。更长的间隔区(如内含子)也可以在这点上发挥作用。插入的DNA的核苷酸序列通过DNA测序被确认。在存在放射性标记的UTP的情况下,T7RNA聚合酶被用于体外转录DNA,并通过在聚丙烯酰胺凝胶上电泳转录产物和放射自显影来检测核酶的自我切割能力。在37℃转录一个小时的情况下,自我切割的效率大于90%。如果切割效率低于预期,在核酶结构域中的颈和环的长度和/或序列可以被调整。
盒子结构被插入到质粒形式的逆转录病毒载体中,例如pLNL6在RNA聚合酶II依赖性启动子控制下。备选地,RNA聚合酶III依赖性启动子也可以被使用。盒子结构以合适的方向被插入到载体的限制性酶切位点。产生的质粒被引入到包装细胞系中,例如AM-12细胞系,将稳定转染的细胞用于产生逆转录病毒载体。Cem T4细胞系或PBLs被转导了逆转录病毒载体,RNAi构建体的表达通过RNAse保护性检测或逆转录-PCR来测定,这在本领域很容易被理解。在感染几种HIV-1毒株的任何一种后,观察到转导的细胞的显著保护作用。与对照(不含RNAi盒子结构的载体)相比,观察到多于90%的p24产生的下降,显示了HIV-1复制的降低。
CD34+细胞被从患者体内获得,在存在RetroNectin的条件下,用在本申请早些描述的方法被逆转录病毒转导。至少每kg体重(患者体重)在多于每千克1.63×106CD34+这类细胞的总细胞群中至少每千克(患者的体重)0.5×106个转导的CD34+细胞被通过注射的方法对患者给药。优选地,多于每千克5×106转导的CD34+细胞被给药。这些细胞移入到患者的骨髓中,并在注射多于3年产生保护的T淋巴细胞和巨噬细胞/单核细胞。这些细胞被相关地保护以抗HIV-1感染和促进提高免疫功能。
结论性讨论
在此处描述的临床实验中,将表达抗HIV-1试剂的基因体外引入到CD34+细胞中,并将这些细胞回输到自体患者体内,被证明在技术上是可行的和安全的。发现在外周血淋巴细胞和骨髓细胞中,核酶构建体的存在和表达至少3年。在本研究治疗的10个患者体内,细胞标记的程度有变化,这产生了下述结论。发现细胞标记程度的相关参数是CD34+细胞转导的百分比,注射的转导的CD34+细胞的数目,和注入的CD34+细胞的总数。发现转导的细胞的实际数目是重要的。非转导的细胞可在加强转导的细胞在外周血和器官如肝脏中的存活中扮演角色,因为这些细胞是要回到骨髓腔的。在不需要重度骨髓抑制的预调理的条件下,延长的转导的CD34+造血细胞的移入需要在至少1.63×106细胞的总CD34+细胞群中最小剂量为至少0.52×106的转导的细胞。与对照淋巴细胞相比,含有核酶的淋巴细胞存在生存优势,即使在相对低水平的筛选条件下也是如此。优势生存的程度是CD34+细胞剂量依赖型的,即,与注入的转导细胞的数目正相关,这是意想不到的。在较高水平筛选条件下,有理由期待甚至更高程度的核酶保护的淋巴细胞的优势生存,在更高的剂量下,期望更大的治疗效果。
这就为用于治疗AIDS/HIV感染和许多其他疾病的造血细胞的有效基因治疗提供了基础。它为在临床环境中有效的质量保证和程序评估提供了重要的知识。
参考文献:
Abonour et al 2000 Nature Medicine 6:552-8
Amado et al 1998 Human Gene Ther 9:173-183
Amado and Chen 1999 Science 285:674-676
Amado et al 1999 Human Gene Ther 10:2255-2270
Austin et al 2000 Blood 95:829-36
Autran et al 1997 Science 277:112-116
Bagnis et al 2002 Exp Hematol 30:108-15
Bai et al 2000 Molecular Therapy 1:244-54
Barnett et al 1998 Brit J Hematol 102:553-65
Bazin et al 1989 Biochem Pharmacol 38:109-19
Behringer et al 1999 Bone Marrow Transplant 24:295-302
Benboubker et al 2001 Brit J Hematol 113:247-50
Bender et al 1987 J Virol 61:1639-46
Bender et al 1991 Blood 77:2591-6
Bertolini et al 1998 Bone Marrow Transplant 21:S5-7
Bodine et al 1998 Ann NY Acad Sci 850:139-50
Bonyhadi et al 1997 J Virol 71:4704-16.
Bordignon et al 1995 Science 270:470-5
Brenner 2001 J Int Medicine 249:345-58
Briones et al 1999 Haematologica 84:483-8
Brooks et al 2001 Nature Med 7:459-64
Bunnell and Morgan 1998 Clin Micro Rev 11:42-56
Bunting et al 1999 Ann NY Acad Sci 872:125-40
Campos 1993 Leukemia 7:1409-15
Case et al 1999 Proc Natl Acad Sci USA 96:2988-93
Carpinteiro et al 2002 Int J of Cancer 98:785-92
Cavazzana-Calvo et al 2000 Science288:669-672
Cavazzana-Calvo 2001 J Gene Med 3:201-6
Challita and Kohn 1994 Proc Natl Acad Sci USA 91:2567-71
Chang and Roninson 1996 Gene 183:137-42
Chatterjee et al 1999 Blood 93:1882-1894
Cheng etal,2000 Nat Med 6:1235-40
Cherry etal,2000 Mol Cell Biol 20:7419-26
Chu et al 1998 J Mol Med 76:184-192
Cohen-Haguenauer et al 1998 Hum Gene Ther 9:207-16
Cometta et al 1996 Hum Gene Ther 7:1323-30
Crystal 1995 Science 270:404-10
Dao et al 1997 Blood 89:446-56
Dao et al 1998 Proc Natl Acad Sci USA 95:13006-11
Dao et al 1998 Blood 92:4612-21
Dao and Nolta 1999 Leukemia 13:1473-80
Dao and Nolta 2000 Leukemia 14:773-6
Donahue et al 1998 Nature Med 4:181-6
Douek et al 1998 Nature 396:690-695
Ducos et al 2000 Gene Ther 7:1790-4
Dunbar et al 1995 Blood 85:3048-3057
Dunbar et al 1998a Hum Gene Ther 9:2629-40
Dunbar et al 1998b Hum Gene Ther 7:231-53
Dunbar et al 2001 Ann NY Acad Sci 938:236-45
Eglitis and Schneiderman 1997 Biochem Biophys Res Commun 231:477-80
Fan et al,2000 Hum Gene Ther 11:1313-27
Fehse et al,1997 Hum Gene Ther 8:1815-24
Feng et al 1997 Nature Biotechnol 15:866-870
Fisher-Adams et al 1996 Blood 88:492-504
Fu and Liesveld 2000 Blood Rev 14:205-18
Gabarre et al 2000 The Lancet 355:1071-2
Gambotto et al 2000 Methods Mol Biol 135:495-508
Gerard et al 1996 Hum Gene Ther 7:343-54
Gervaix et al 1997 Hum Gene Ther 8:2229-38
Giarratana et al 1998 Bone MarrowTranspl 22:707-15
Gitlin et al 2002 Nature advance online publicn.26 June 2002
Glimm et al 1998 Hum Gene Ther 9:771-8
Gluckman 2000 Exp Hematol 28:1197-205
Goemer et al 1999 Blood 94:2287-92
Gothot et al 1998 Blood 92:2641-2649
Grande et al 1999 Blood 93:3276-85
Grimm and Kleinschmidt 1999 Hum Gene Ther 10:2445-2450
Haas et al 2000 Mol Ther,2:71-80
Hacein-Bey-Abina et al 2002 New Eng J Medicine 346:1185-93
Halene et al 1999 Blood 94:3349-57
Halene and Kohn 2000 Hum Gene Ther 11:1259-67
Hampel et al 1990 Nucleic Acids Res 18:299-304
Hanenberg et al 1996 Nat Med 2:876-82
Hanenberg et al 1997 Hum Gene Ther 8:2193-2206
Hao et al 1996 Blood 88:3306-3313
Harrison 1980 Blood 55:77-81
Harrison et al 1988 Proc Natl Acad Sci USA 85:822-6
Haseloff and Gerlach 1988 Nature 334:585-91
Hennemann et al 1999 Exp Hematol 27:817-825
Herrera et al 2001 Brit J Hematol 114:920-30
Hesforffer et al 1998 J Clin Oncol 16:165-72
Ho 1993 Leukemia 7:1738-46
Ho et al 1995 Nature 373:123-126
Ho et al 1996 Blood 88(suppl 1):405a
Hodgson and Bradley 1979 Nature 281:381-2
Hogan et al 2002 Proc Natl Acad Sci USA 99:413-8
Hoogerbrugge et al 1996 Gene Ther 3:179-183
Huhn et al 1996 Exp Hematol 24:839-47
Huss 2000 Stem Cells 18:1-9
Hutchings et al 1998 J Hematother 7:217-24
Imbert et al 1998 Exp Hematol 26:374-81
Jacque et al 2002 Nature advance online publicn 26 June 2002
Jamieson et al 1999 Immunity 10:569-575
Jones et al 1990 Nature 347:188-9
Kansas 1996 Blood 88:3259-87
Kiem et al 1997 Blood 90:4638-4645
Kiem et al 1998 Blood 92:1878-1886
Kirby et al 2000 Blood 95:3710-5
Knaan-Shanzer et al 2001 Hum Gene Ther 12:1989-2005
Knop et al 1999 Gene Therapy 6:373-84
Kobari et al 2000 Exp Hematol 28:1470-80
Kohn 1995 Nature Medicine 1:1017-1023
Kohn et al 1998 Nature Medicine 4:775-780
Kohn et al 1999 Blood 94:368-71
Kr mer et al 1999 Proc Natl Acad Sci USA 96:2087-92
Kume et al 1999 Int J Hematol 69:227-33
Lane et al 1995 Blood 85:275-82
Lange and Blankenstein 1997 Gene Therapy 4:303-8
Lataillade et al 2000 Blood 95:756-68
Law et al 1999 Exp Hematol 27:147-54
LeDoux et al 2001 Hum Gene Ther 12:1611-21
Lee et al 1994 J Virol 68:8254-64
Lewis and Verfaillie 2000 Exp Hematol 28:1087-95
Lieber et al 1999 J Virol 73:9314-24
Lisziewicz et al 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90:8000-4
Liu et al 1999 Hum Gene Ther 10:2337-46
Lyman and Jacobsen 1998 Blood 91:1101-34
Maciejewski et al 1995 Nature Med 1:667-73
Malech et al 1997 Proc Natl Acad Sci USA 94:12133-8
Malik et al 1995 Blood 86:2993-3005
Marandin et al 1996 Blood 88:4568-78
Marasco et al 1998 Human Gene Ther 9:1627-42
Marini et al 2000 Caner Gene Ther 7:816-25
Martinez et al 1999 Exp Hematol 27:561-8
Mautino and Morgan 2002 AIDS Patient Care and Stds 16:11-26
Michallet et al 2000 Exp Hematol 28:858-70
Michienzi et al 2000 Proc Natl Acad Sci USA 97:8955-60
Miller 1986 Beyond ANOVA;New York;John Wiley and Sons
Miller and Buttimore 1986 Mol Cell Biol 6:2895-902
Miyoshi et al 1999 Science 283:682-686
Moore and MacKenzie 1999 Prog Exp Tumor Res 36:20-49
Mountain 2000 TIBTECH 18:119-128
Murray et al 1999 Exp Hematol 27:1019-28
Murray et al 2000 Hum Gene Ther 11:2039-50
Nagler et al 2000 Exp Hematol 28:1096-104
Naldini et al 1996 Science 272:263-7
Newbound et al 2001 Exp Hematol 29:163-73
Ng et al 2002 Brit J Hematol 117:226-37
Nolta et al 1992 Exp Hematol 20:1065-1071
Novina et al 2002 Nature advance online publicn 3 June 2002
Ogawa et al 1993 Blood 81:2844-2853
Ojwang et al 1992 Proc Natl Acad Sci USA 89:10802-6
Omori et al 1999 J Hematother Stem Cell Res 8:503-14
Orlic and Bodine 1994 Blood 84:3991-3994
Orlic et al 1999 Ann NY Acad Sci 872:115-24
Orlic et al 2001 Ann NY Acad Sci 938:221-230
Ostrowski et al 1999 J Virol 73:6430-5
Quan et al 1999 Exp Hematol 27:1511-8
Pakker et al 1998 Nature Medicine 4:208-14
Parkman 1986 Science 232:1373-78
Peters et al 1996 Blood 87:30-7
Picker et al 1993 J Immunol 150:1105-21
Poulin et al 1999 J Exp Med 190:479-86
Ragg et al 2000 Cancer Res 60:5187-95
Ramezani et al 2002 Frontiers in Bioscience 7:A29-36
Ranga et al 1998 Proc Natl Acad Sci USA 95:1201-6
Reese et al 1999 J Hematother Stem Cell Res 8:515-23
Reis 1999 Transplant Proc 31:2970-2
Relander et al 2001 J Gene Med 3:207-18
Relander et al 2002 J Gene Med 4:122-32
Richter and Karlson 2001 Int J Hematol 73:162-69
Rivella et al 2000 J Virology 74:4679-87
Robbins et al 1998 Proc Natl Acad Sci USA 95:10182-7
Roe et al 1993EMBO J 12:2099-2108
Rosler et al 2000 Exp Hematol 28:841-52
Rossi et al 1992 AIDS Res and Human Retroviruses 8:183-9
Rovira et al 2000 Blood 96:4111-7
Sadelain et al 2000 Curr Opin Hematol 7:364-77
Sanders et al 1988 Immunol Today 9:195-9
Sandhaus et al 1998 Exp Hematol 26:73-8
Sanyal and Schuening 1999 Hum Gene Ther 10:2859-68
Sarver et al 1990 Science 247:1222-5
Sato et al 1999 Blood 94:2548-2554
Saylors et al 1999 Gene Ther 6:944-6
Schilz et al 1998 Blood 92:3163-71
Schilz et al 2000 Mol Ther 2:609-18
Schilz et al 2001 J Gene Med 3:427-36
Sczakiel and Pawlita 1991 J Virol 65:468-72
Shaheen et al 1996 J Virol 70:3392-400
Siena et al 1989 Blood 74:1905-14
Smythe et al 1994 Proc Natl Acad Sci USA 91:3657-61
Solar et al 1998 Blood 92:4-10
Strayer et al 2000 Gene Ther 7:886-95
Su et al 1997 Blood 89:2283-90
Sun et al 1995 Proc Natl Acad Sci USA 92:7272-6
Sun et al 1995 Nucl Acids Research 23:2909-13
Sun et al 1996 Nucl Acids Mol Biol Catalytic RNA 10:329-342
Sutton et al 1998 J Virol 72:5781-8
Takatoku et al 2001 J Clinical Investig 108:447-55
Takenaka et al 2000 PNAS 97:7515-20
Takiyama et al 1998 Eur J Hematol 61:1-6
Tavolini 1997 Gene Ther 4:150-5
Thomas et al 1999 Methods 17:202-18
To et al 1997 Blood 85:2233-58
Traycoff et al 1998 Exp Hematol 26:53-62
Uchida et al 1998 Proc Natl Acad Sci USA 95:1939-44
Vassilopoulos et al 2001 Blood 98:604-609
Veres et al 1998 J Virol 72:1894-
Verfaillie et al 2000 Exp Hematol 28:1071-9
Vignoli et al 1998 AIDS 12:999-1005
von Laer et al 1998 J Virol 72:1424-30
Wang et al 1998 Human Gene Ther 9:1283-91
Ward et al 1998 American J Pathology 153:373-379
Wilcox et al 2000 Blood 95:3645-52
Williams et al 1999 Ann NY Acad Sci 872:109-13
Yu et al 1995 Proc Natl Acad Sci USA 92:699-703
Zaniani et al 1998 Exp Hematol 26:353-60
Zauli et al 1996 J Exp Med 183:99-108
Zhang et al 1999 J Exp Med 190:725-32
Zhang et al 1998 Proc Natl Acad Sci USA 95:1154-9
Zimmermann et al 1995 Bone Marrow Transpl 9:439-44
Claims (42)
1.一种组合物,其含有一种药用载体和每千克人受试者体重至少1.63×106CD34+造血细胞,所述人受试者将被给药该组合物,至少0.52×106的这类CD34+造血细胞被表达抗HIV试剂的病毒构建体转导。
2.权利要求1的组合物,其包含每千克人受试者体重至少9.37×106CD34+造血细胞,其中至少5×106的这类CD34+造血细胞被转导。
3.权利要求1的组合物,其中所述抗HIV试剂是RNA
4.权利要求1的组合物,其中所述抗HIV试剂是RNAi分子。
5.权利要求1的组合物,其中所述抗HIV试剂是一种反义分子。
6.权利要求1的组合物,其中所述抗HIV试剂是核酶。
7.权利要求1的组合物,其中所述抗HIV试剂是含有具有序列5′-UUAGGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC-3′的核苷酸的核酶。
8.权利要求1的组合物,其中所述病毒构建体是逆转录病毒构建体。
9.权利要求1的组合物,其中所述组合物实质上不含细胞因子。
10.权利要求1的组合物,其中所述组合物实质上不含有病毒。
11.权利要求1的组合物,其中所述转导的CD34+细胞能够移入到所述受试者中,并且能够在所述受试者中产生子代细胞至少12个月。
12.一种组合物,其含有药用载体和每千克受试者体重至少1.63×106CD34+造血细胞,所述受试者将被给药该组合物,至少0.52×106的这类CD34+造血细胞被表达抗HIV试剂的病毒构建体转导,
其中所述组合物用包含下述步骤的方法来生产:
(a)从所述受试者分离CD34+造血细胞;
(b)将所述CD34+造血细胞与至少一种细胞因子培养;
(c)在存在加强所述细胞和所述病毒构建体共定位的试剂的条件下,用表达所述抗HIV试剂的所述病毒构建体转导所述CD34+造血细胞;
(d)洗涤所述CD34+造血细胞,和
(e)将所述CD34+造血细胞与药用载体混合,从而获得所述组合物。
13.权利要求12的组合物,其中所述步骤(b)的培养在存在至少两种细胞因子的条件下进行。
14.权利要求12的组合物,其中所述步骤(b)的培养在存在两种细胞因子的条件下进行。
15.权利要求12的组合物,其中所述步骤(c)中细胞的转导在存在重组纤连蛋白片段的条件下进行。
16.一种组合物,其含有药用载体和每千克人受试者体重至少1.63×106CD34+造血细胞,所述人受试者将被给药该组合物,这类CD34+造血细胞的至少0.52×106CD34+被一种目的基因转化,所述目的基因在转化前未在所述CD34+细胞中发现。
17.权利要求16的组合物,其含有对每千克人受试者体重至少9×106CD34+造血细胞,其中至少5×106CD34+造血细胞被转导。
18.权利要求16的组合物,其中所述目的基因表达一种RNA试剂。
19.权利要求16的组合物,其中所述受试者是成人。
20.一种组合物,其含有药用载体和每千克人受试者体重至少1.63×106CD34+造血细胞,所述人受试者将被给药该组合物,这类CD34+造血细胞的至少0.52×106CD34+被一种目的基因转化,所述目的基因在转化前未在所述CD34+细胞中发现,
其中所述组合物用包含下述步骤的方法生产:
(a)从所述受试者分离CD34+造血细胞;
(b)将所述CD34+造血细胞与至少一种细胞因子培养;
(c)在存在加强所述细胞和所述载体共定位的试剂的条件下,用编码目的基因的所述载体转化所述CD34+造血细胞;
(d)洗涤所述CD34+造血细胞,和
(e)将所述CD34+造血细胞与药用载体混合,从而获得所述组合物。
21.一种向人受试者的造血细胞插入目的基因的方法,其包含:
a)将CD34+造血祖细胞转移到所述人受试者的血液中;
b)通过单采血液成分术从所述受试者的血液中分离白细胞;
c)用免疫筛选方法从分离的白细胞中分离CD34+造血细胞;
d)在存在一种使所述细胞与转导载体共定位的试剂的条件下,将步骤c)的所述CD34+造血细胞进行目的基因的转导过程;
e)在步骤d)后,测定CD34+造血细胞的总数,如果总数是每千克所述人受试者体重至少1.63×106细胞,则进行步骤f),如果在步骤d)后CD34+造血细胞的总数少于每千克人受试者体重1.63×106细胞,则进行至少步骤b)-d)和合并CD34+造血细胞;和
f)将所述CD34+造血细胞递送给所述受试者,
从而将目的基因插入到所述人受试者的造血细胞。
22.权利要求21的方法,其中所述将细胞与转导载体共定位的试剂是纤连蛋白的片段。
23.权利要求21的方法,其中步骤f)在无重度骨髓抑制的情况下进行。
24.权利要求21的方法,其中所述将造血祖细胞转移到所述受试者中的步骤是通过对所述受试者给药一定数量的,足以转移所述造血祖细胞的细胞因子而进行的。
25.权利要求21的方法,其中在从所述受试者的血液分离白细胞的步骤中,至少进行两次单采血液成分术。
26.权利要求21的方法,其中在存在重组纤连蛋白片段的条件下实施将所述CD34+造血细胞进行目的基因的转导过程的步骤。
27.权利要求21的方法,其另外包含在存在至少两种细胞因子的条件下,培养步骤c)的分离的CD34+造血细胞的步骤。
28.权利要求21的方法,其中所述人受试者是成年人受试者。
29.权利要求21的方法,其中所述目的基因编码一种抗HIV试剂。
30.权利要求29的方法,其中所述抗HIV试剂是RNA。
31.权利要求29的方法,其中所述抗HIV试剂是一种反义分子。
32.权利要求29的方法,其中所述抗HIV试剂是核酶。
33.权利要求32的方法,其中所述抗HIV试剂是含有具有序列5′-UUAGGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC-3′的核苷酸的核酶。
34.权利要求21的方法,其中在步骤e)中,如果步骤d)后的CD34+造血细胞的总数少于每千克人受试者体重1.63×106细胞,则另外包括低温保存来自步骤d)的CD34+造血细胞,重复步骤a)-d),和将任何低温保存的细胞与来自步骤d)的细胞合并的步骤。
35.一种向人受试者的造血细胞中插入目的基因的方法,其包含:
a)将CD34+造血祖细胞转移到所述受试者的血液中;
b)通过单采血液成分术从所述受试者的血液分离白细胞;
c)用免疫筛选的方法从所述分离的白细胞中分离CD34+造血细胞;
d)在步骤c)后,测定CD34+造血细胞的总数,如果总数是每千克所述人受试者体重至少1.63×106细胞,则进行步骤e),如果步骤c)后CD34+造血细胞的总数少于每千克所述人受试者体重1.63×106细胞,则至少进行步骤b)-c),然后合并所述CD34+造血细胞;
e)在存在使所述细胞与转导载体共定位的试剂的条件下,将步骤c)的CD34+造血细胞进行目的基因的转导过程;和
f)将所述CD34+造血细胞递送给所述受试者,
从而将目的基因插入到所述人受试者的造血细胞中。
36.权利要求35的方法,其中所述使细胞与转导载体共定位的试剂是纤连蛋白的片段。
37.一种向人受试者的造血细胞中插入表达核酶的基因的方法,所述核酶包含具有序列5′-UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GACGAA ACU GGC UCC-3′的核苷酸,该方法包含:
a)通过向所述受试者给药一定数量的,足以转移所述造血祖细胞的细胞因子,将CD34+造血祖细胞转移到所述受试者的血液中;
b)通过单采血液成分术从所述受试者的血液分离白细胞,所述单采血液成分术进行至少两次;
c)用免疫筛选方法,从所述分离的白细胞中分离CD34+造血细胞;
d)在存在一种细胞因子的培养基中培养步骤c)的分离的CD34+造血细胞大约一天;
e)在存在重组纤连蛋白片段的条件下,将步骤d)的CD34+造血细胞进行逆转录病毒的转导过程,所述逆转录病毒包含一种在细胞中产生核酶的载体,所述核酶包含具有序列5′-UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGUGAG GAC GAA ACU GGC UCC-3′的核苷酸;
f)在步骤e)后,测定CD34+造血细胞的总数,如果总数是千克所述人受试者体重至少1.63×106细胞,则进行步骤g),如果步骤e)后CD34+造血细胞的总数少于每千克所述人受试者体重1.63×106细胞,则再次进行步骤b)-e)并合并CD34+造血细胞;和
g)在无重度骨髓抑制的情况下将所述CD34+造血细胞递送给所述受试者,
从而将表达所述核酶的基因插入到所述人受试者的造血细胞中。
38.一种制备权利要求1的组合物的方法,其包含
a)将CD34+造血细胞转移到所述受试者的血液中;
b)通过单采血液成分术从所述受试者的血液分离白细胞;
c)用免疫筛选的方法从所述分离的白细胞中分离所述CD34+造血细胞;
d)在存在使所述细胞与转导载体共定位的试剂的条件下,将步骤c)的CD34+造血细胞进行目的基因的转导过程;和
e)在步骤d)后,测定CD34+造血细胞的总数,如果在步骤d)后CD34+造血细胞的总数是少于每千克所述人受试者体重1.63×106细胞,则再次进行步骤b)-d)和合并所述CD34+造血细胞。
39.一种组合物用于制备用于治疗感染HIV的人受试者的药物中的应用,所述组合物包含药用载体和每千克人受试者体重至少1.63×106个CD34+造血细胞,所述人受试者将被给药该组合物,每千克体重至少这类细胞的0.52×106个CD34+细胞被转导一种表达抗HIV试剂的病毒构建体。
40.一种试剂盒,其包含在实施权利要求35的方法中使用的元素。
41.一种试剂盒,其包含
a)一定数量试剂,所述试剂能够将造血祖细胞转移到人受试者;
b)一种培养基,其包括至少一种适于培养CD34+造血细胞的细胞因子;
c)一种逆转录病毒载体,其包含具有在细胞中产生核酶的序列的核苷酸,所述核酶具有序列5′-UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAGGAC GAA ACU GGC UCC-3′;和
d)在它们的内部包被了一种重组纤连蛋白片段的组织培养容器。
42.一种包装,其含有权利要求41的试剂盒,和该试剂盒的使用说明书。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103471896A (zh) * | 2013-09-09 | 2013-12-25 | 上海兰卫临床检验有限公司 | 革兰染色液质控品制备方法 |
Families Citing this family (38)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020058636A1 (en) * | 1994-09-21 | 2002-05-16 | Geoffrey P. Symonds | Ribozymes targeting the retroviral packaging sequence expression constructs and recombinant retroviruses containing such constructs |
CA2279673A1 (en) * | 1995-12-15 | 1997-06-16 | Enzo Therapeutics, Inc. | Property effecting and/or property exhibiting constructs for the expression of non-native nucleic acids for therapeutic and diagnostic uses |
US6627442B1 (en) * | 2000-08-31 | 2003-09-30 | Virxsys Corporation | Methods for stable transduction of cells with hiv-derived viral vectors |
DE60238486D1 (de) | 2001-07-10 | 2011-01-13 | Johnson & Johnson Res Pty Ltd | Verfahren zur genetischen modifikation hämatopoetischer vorläuferzellen und verwendungen der modifizierten zellen |
US20030082158A1 (en) * | 2001-07-10 | 2003-05-01 | Geoffrey Symonds | Production of transduced hematopoietic progenitor cells |
ES2358187T3 (es) | 2001-07-10 | 2011-05-06 | JOHNSON & JOHNSON RESEARCH PTY LIMITED | Procedimientos para la modificación genética de las células progenitoras hematopoyéticas y utilizaciones de las células modificadas. |
US7737124B2 (en) * | 2001-09-13 | 2010-06-15 | California Institute Of Technology | Method for expression of small antiviral RNA molecules with reduced cytotoxicity within a cell |
US7919309B2 (en) | 2001-09-13 | 2011-04-05 | California Institute Of Technology | Method for expression of small antiviral RNA molecules within a cell |
DE10212892A1 (de) * | 2002-03-20 | 2003-10-09 | Basf Plant Science Gmbh | Konstrukte und Verfahren zur Regulation der Genexpression |
DE10224750A1 (de) * | 2002-06-04 | 2003-12-24 | Fresenius Medical Care De Gmbh | Vorrichtung zur Behandlung einer medizinischen Flüssigkeit |
WO2004071418A2 (en) * | 2003-02-06 | 2004-08-26 | Walter Reed Army Institute Of Research | Compounds for the treatment of systemic lupus erythematosus |
WO2004090121A2 (en) * | 2003-04-08 | 2004-10-21 | Yeda Research And Development Co. Ltd | Stem cells having increased sensitivity to a chemoattractant and methods of generating and using same |
GB0410130D0 (en) * | 2004-05-06 | 2004-06-09 | Molmed Spa | Cell preparation |
US7935074B2 (en) * | 2005-02-28 | 2011-05-03 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Cassette system for peritoneal dialysis machine |
US8197231B2 (en) | 2005-07-13 | 2012-06-12 | Purity Solutions Llc | Diaphragm pump and related methods |
US20070041948A1 (en) * | 2005-07-20 | 2007-02-22 | Seoul National University Industry Foundation | Method for culturing and proliferating hematopoietic stem cells and progenitor cells using human endometrial cells |
EP2032691A2 (en) * | 2006-06-15 | 2009-03-11 | Neostem, Inc | Processing procedure for peripheral blood stem cells |
JP2011160661A (ja) * | 2008-06-02 | 2011-08-25 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | 血球細胞の初期化法 |
US8112365B2 (en) * | 2008-12-19 | 2012-02-07 | Foster Scott C | System and method for online employment recruiting and evaluation |
US20100210989A1 (en) | 2008-12-23 | 2010-08-19 | Janet Lesley Macpherson | Processing blood |
US8192401B2 (en) * | 2009-03-20 | 2012-06-05 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Medical fluid pump systems and related components and methods |
WO2010117974A2 (en) * | 2009-04-09 | 2010-10-14 | Stemcyte Inc. | Hiv-resistant stem cells and uses thereof |
EP2453946B1 (en) | 2009-07-15 | 2013-02-13 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Medical fluid cassettes and related systems |
US8720913B2 (en) | 2009-08-11 | 2014-05-13 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Portable peritoneal dialysis carts and related systems |
JP5946775B2 (ja) * | 2010-12-01 | 2016-07-06 | 日産化学工業株式会社 | ピラゾール化合物による造血幹細胞の製造方法 |
DE102010053973A1 (de) | 2010-12-09 | 2012-06-14 | Fresenius Medical Care Deutschland Gmbh | Medizinisches Gerät mit einer Heizung |
US9694125B2 (en) | 2010-12-20 | 2017-07-04 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Medical fluid cassettes and related systems and methods |
US9624915B2 (en) | 2011-03-09 | 2017-04-18 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Medical fluid delivery sets and related systems and methods |
EP2699280B1 (en) | 2011-04-21 | 2015-12-09 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Medical fluid pumping systems and related devices and methods |
US9186449B2 (en) | 2011-11-01 | 2015-11-17 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Dialysis machine support assemblies and related systems and methods |
US9610392B2 (en) | 2012-06-08 | 2017-04-04 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Medical fluid cassettes and related systems and methods |
US9500188B2 (en) | 2012-06-11 | 2016-11-22 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Medical fluid cassettes and related systems and methods |
KR102287541B1 (ko) * | 2012-09-07 | 2021-08-10 | 예일 유니버시티 | 유전적으로 변형된 비-인간 동물 및 이것들의 사용 방법 |
AU2013353573B2 (en) | 2012-12-06 | 2019-01-17 | Enlivex Therapeutics R&D Ltd | Therapeutic apoptotic cell preparations, method for producing same and uses thereof |
US9561323B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-02-07 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Medical fluid cassette leak detection methods and devices |
US10117985B2 (en) | 2013-08-21 | 2018-11-06 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Determining a volume of medical fluid pumped into or out of a medical fluid cassette |
WO2018201065A1 (en) * | 2017-04-27 | 2018-11-01 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Therapeutic formulations containing cd34+ stem cells derived from negative selection |
WO2019099619A1 (en) * | 2017-11-15 | 2019-05-23 | Weird Science Llc | Methods and compositions for non-myeloablative bone marrow reconstitution |
Family Cites Families (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2065919T5 (es) | 1987-12-15 | 2005-06-16 | Gene Shears Pty Limited | Ribozimas. |
US5254678A (en) | 1987-12-15 | 1993-10-19 | Gene Shears Pty. Limited | Ribozymes |
US5866701A (en) | 1988-09-20 | 1999-02-02 | The Board Of Regents For Northern Illinois University Of Dekalb | HIV targeted hairpin ribozymes |
US4978514A (en) | 1989-09-12 | 1990-12-18 | Fuel Tech, Inc. | Combined catalytic/non-catalytic process for nitrogen oxides reduction |
US5225337A (en) | 1989-09-25 | 1993-07-06 | Innovir Laboratories, Inc. | Ribozyme compositions and methods for use |
US5500357A (en) * | 1990-11-02 | 1996-03-19 | Agency Of Industrial Science & Technology, Ministry Of International Trade & Industry | RNA transcription system using novel ribozyme |
JPH06506599A (ja) | 1991-04-05 | 1994-07-28 | エディソン アニマル バイオテクノロジー センター,オハイオ ユニバーシティー | パッケージング配列に相補的なアンチセンス核酸によるレトロウイルスの抑制 |
US5693535A (en) * | 1992-05-14 | 1997-12-02 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | HIV targeted ribozymes |
US5525468A (en) * | 1992-05-14 | 1996-06-11 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Assay for Ribozyme target site |
US5911983A (en) | 1992-06-26 | 1999-06-15 | University Of Pittsburgh | Gene therapy for Gaucher disease using retroviral vectors |
JPH08500971A (ja) | 1992-06-29 | 1996-02-06 | ジーン・シアーズ・ピーティーワイ・リミテッド | 核酸及びウイルス性病原体をコントロールするためのこれらの使用方法 |
CA2154363A1 (en) | 1993-01-22 | 1994-08-04 | Bruce A. Sullenger | Localization of therapeutic agents |
IL108719A0 (en) | 1993-02-25 | 1994-08-26 | Ortho Pharma Corp | Expression constructs containing hiv inhibitory antisense and other nucleotide sequences, retroviralvectors and recombinant retroviruses containing them |
WO1995004818A1 (en) | 1993-08-06 | 1995-02-16 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method and reagent for inhibiting human immunodeficiency virus replication |
US5624803A (en) * | 1993-10-14 | 1997-04-29 | The Regents Of The University Of California | In vivo oligonucleotide generator, and methods of testing the binding affinity of triplex forming oligonucleotides derived therefrom |
US5712384A (en) * | 1994-01-05 | 1998-01-27 | Gene Shears Pty Ltd. | Ribozymes targeting retroviral packaging sequence expression constructs and recombinant retroviruses containing such constructs |
EP1298208B1 (en) | 1994-01-05 | 2006-03-15 | Gene Shears Pty Limited | Ribozymes targeting a hiv tat sequence |
US20020058636A1 (en) | 1994-09-21 | 2002-05-16 | Geoffrey P. Symonds | Ribozymes targeting the retroviral packaging sequence expression constructs and recombinant retroviruses containing such constructs |
AU5557196A (en) | 1995-04-20 | 1996-11-07 | Chiron Corporation | High efficiency ex vivo transduction of hematopoietic stem cells by recombinant retroviral preparations |
US5741706A (en) | 1996-06-13 | 1998-04-21 | Immusol, Incorporated | Anti-HIV ribozymes |
TWI239352B (en) * | 1997-07-23 | 2005-09-11 | Takara Bio Inc | Gene transfer method with the use of serum-free medium |
US6506559B1 (en) * | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
US6060317A (en) | 1998-08-11 | 2000-05-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of transducing mammalian cells, and products related thereto |
WO2000034495A2 (en) | 1998-12-04 | 2000-06-15 | City Of Hope | A method of genetically modifying very primitive quiescent human hematopoietic stem cells |
WO2000075291A2 (en) * | 1999-06-08 | 2000-12-14 | Novartis Ag | Cells with enforced expression of bcl-xl |
JP2004509120A (ja) | 2000-09-13 | 2004-03-25 | バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | カスパーゼ阻害剤およびそれらの用途 |
US20020160393A1 (en) | 2000-12-28 | 2002-10-31 | Symonds Geoffrey P. | Double-stranded RNA-mediated gene suppression |
ES2358187T3 (es) | 2001-07-10 | 2011-05-06 | JOHNSON & JOHNSON RESEARCH PTY LIMITED | Procedimientos para la modificación genética de las células progenitoras hematopoyéticas y utilizaciones de las células modificadas. |
DE60238486D1 (de) | 2001-07-10 | 2011-01-13 | Johnson & Johnson Res Pty Ltd | Verfahren zur genetischen modifikation hämatopoetischer vorläuferzellen und verwendungen der modifizierten zellen |
US20030082158A1 (en) | 2001-07-10 | 2003-05-01 | Geoffrey Symonds | Production of transduced hematopoietic progenitor cells |
KR100646702B1 (ko) * | 2001-08-16 | 2006-11-17 | 에스케이씨 주식회사 | 홀 및/또는 그루브로 형성된 화학적 기계적 연마패드 |
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Cited By (1)
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