JPH06506599A - パッケージング配列に相補的なアンチセンス核酸によるレトロウイルスの抑制 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 パッケージング配列に相補的な アンチセンス核酸によるレトロウィルスの抑制ウィルス学および医学の分野に属 する本発明は、レトロウィルスのパッケージング配列とハイブリダイズする能力 を有し、それによりレトロウィルス感染を阻止し得るアンチセンスＲＮＡ分子を コードするＤＮＡ配列、当該アンチセンスＲＮＡ配列、当該ＤＮＡ配列でトラン スフェクトされた宿主、並びに細胞および動物にレトロウィルス感染に対する抵 抗性を付与する方法に関するもレトロウィルスはヒトや動物の健康にとって重大 な脅威になっている。このことは世界中に広がったエイズ伝染病におけるＨＩＶ −１の役割によって最も劇的に実証される。今までのところ、レトロウィルス感 染に対する効果的な治療法あるいは救済策は見つかっていない。最近では、感染 因子としてのレトロウィルスが（直接的および間接的に）もたらす損害がメディ カルサイエンスへの最も重大な世界的規模の挑戦になっていることは疑う余地が ない。それ故に、レトロウィルス感染症を予防または治療するための効果的な方 法および組成物の必要性はきわめて明白である。

レトロウィルスは、それらのゲノムＲＮＡを、宿主細胞ゲノムに組み込むことの できるＤＮＡに“逆転写する”性質を有するＲＮＡウィルスの大きいクラスを構 成する。このウィルスクラスの多くのメンバーは腫瘍形成性である。これらのウ ィルスは、宿主細胞または生物体内でそれらの感染周期を完結するために、限ら れた数の遺伝子および遺伝子調節配列を必要とするにすぎない（１−４）。この 注目すべき分子効率により、病原体としてのヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ） のようなレトロウィルスの有効性を部分的に説明できる。他と全く異なる遺伝子 および遺伝子産物の存在も、宿主生物におけるレトロウィルス複製の分子減衰軸 ｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）の標的を示唆している。

レトロウィルスは小型の一本鎖ポジティブセンスＲＮＡウィルスである。それら のゲノムは、とりわけ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、つまり逆転写酵素の 配列を含んでいる。逆転写酵素の多くの分子は成熟ウィルス粒子中でゲノムＲＮ Ａと密接に会合した状態で見いだされる。細胞に入ると、この逆転写酵素はウィ ルスゲノムの二本鎖ＤＮＡコピーを作り、これは宿主細胞のクロマチンに挿入さ れる。いったん挿入されると、ウィルス配列はプロウィルスと呼ばれる。いくつ かの点で、レトロウィルスの組込みは、／ヨウジタウバエのコピア（Ｃｏｐｉａ ）および４１２または酵母のＴｙ−１のような、種々の真核生物の転移遺伝因子 の組込みに類似している。これらの転移遺伝因子およびレトロウィルスの場合に は、高度に保存された配列の長い広がりの両端に逆方向反復配列が存在する。ま た、これらの因子の組込みは宿主細胞のクロマチンの短い直列反復配列を形成さ せることがある。

宿主細胞ゲノムへのレトロウィルスＤＮＡの組込み（プロウィルスＤＮＡの形成 ）の詳細はまだ完全には分かっていないが、それについて幾つかの事実が確立さ れている。レトロウィルスの組込みはウィルスタンパク質に直接依存している。

線状ウィルスＤＮＡの両末端（ＬＴＲ）はプロウィルスＤＮＡの組込みを可能に する構造を形成する。組込み部位には宿主ＤＮＡの短い配列の特徴的な重複が存 在する。

宿主ＤＮＡへのウィルスＤＮＡの挿入に直接関与するレトロウィルスタンパク質 はインテグラーゼタンパク質（ＩＮ）と呼ばれている。ＩＮタンパク質の配列は ウィルスポリメラーゼ遺伝子の３°部分にコードされている。翻訳後、それは大 きい前駆体分子から加水分解によりプロセシングされて活性タンパク質（Ｍｏ　 −ＭＬＶでは４６ｋｄ；トリウィルスおよびヒト免疫不全ウィルスでは３２ｋｄ ）を生成する。組込みの間、ＩＮタンパク質は逆転写酵素により作られたウィル スＤＮＡの両鏡の３°　ヒドロキシル末端から塩基を取り除く。これらの３°末 端は宿主細胞ＤＮＡの５°ホスホリル末端に共有結合で結合される。すべてのレ トロウィルスのＩＮタンパク質は、組込み部位において宿主ＤＮＡ中に付着末端 切断を形成させるエンドヌクレアーゼ活性をもつと考えられている。宿主ＤＮＡ へのウィルスＤＮＡの連結後の細胞酵素によるこの付着末端切断の修復により、 宿主ＤＮＡの短い配列の重複が生成する。

子孫ウィルスゲノムおよびｍＲＮＡは、プロウィルス配列の末端領域にあるロン グ・ターミナル・リピートつまりＬＴＲ内の転写調節シグナルに応答して、挿入 されたプロウィルス配列から宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写され る。ウィルスタンパク質の生産には宿主細胞のタンパク質生産機構が利用される が、ウィルスタンパク質の多くはウィルスコード化プロテアーゼによるプロセシ ングを受けるまで不活性である。一般に、子孫ウィルス粒子は非分解的に細胞表 面から出芽する。レトロウィルス感染は感染した細胞または生物の正常な生活環 を必ずしも妨げない。

多くのクラスのＤＮＡウィルスは腫瘍形成に関係しているが、レトロウィルスは 腫瘍形成能をもつＲＮＡウィルスの分類学上のグループにすぎない。ヒトの後天 性免疫不全症候群の病原ウィルスであるヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）のよ うな種々のレトロウィルスは、高等動物の免疫系のいくつかの非常に稀な疾病の 原因ともなる。

レトロウィルスはすべて共通の形態学的特徴を共有している。

それらは一般に直径１１００ｎ程度の外膜（エンベロープ）をもつウィルスであ る。エンベロープは成熟ウィルスが細胞から出芽するとき宿主細胞の細胞質膜か ら誘導される。それはウィルスゲノムによってコードされる糖タンパク質スパイ クで覆われている。

プロウィルス配列を活発に転写しかつウィルスタンパク質をプロセシングしてい る感染細胞の細胞質膜は、それらの中に挿入されたウィルスのエンベロープ糖タ ンパク質を有している。いくつかの場合には、これらの糖タンパク質が細胞膜の ある領域に集まることが分かっている。さらに、ウィルスはこれらの領域から優 先的に出芽する傾向がある。

エンベロープはウィルスコード化タンパク質から構成される正二十面体キャプシ ドつまり核様体を包囲している。キャプシドはゲノムＲＮＡ、逆転写酵素、イン テグラーゼタンパク質、そしてウィルスゲノムの二本鎖ＤＮＡコピーの形成に必 要な他の因子を含むリボ核タンパク質複合体を包んでいる。キャプシドが常に存 在する細胞ｔＲＮＡ以外の非ウィルスＲＮＡを少量含むことは普通に見られるこ とである。細胞ｔＲＮＡはウィルスゲノムの特定の領域に塩基対合され、そして あとで述べるように逆転写において重要な役割を果たしている。さらに、ヌクレ オキャプシドとエンベロープの間にはコアタンパク質から成る内膜（ｉｎｎｅｒ 　ｃｏａｔ）が見られる。

レトロウィルスに適用可能な分類法がいくつかある。たぶん、最も単純な分類法 は形態に基づくものである。レトロウィルスのこの形態学的分類法は電子顕微鏡 で観察できる構造上の類似性をＣ型およびＤ型と指定された粒子の４つのグルー プまたは型に分割される。

Ａ型粒子は非伝染性で、細胞の内部にだけ見られる。それらの大きさは６６０− ９０ｎの範囲である。それらは被膜をもたない。

それらは嚢内または細胞質内に存在することができる。それらの分類はこれに基 づいてさらに再分割される。嚢内Ａ型粒子の役割は知られていないが、細胞質内 粒子は未熟な形態、つまりＢ型マウス乳癌ピリオンの前駆体であるようだ。それ らはレトロトランスポゾンであるとも推測されている。

Ｂ型粒子はそれらのエンベロープ表面上に非常に目立つスパイクを有し、それら の核様体は中心を離れて存在している。マウス乳癌ウィルスがこの型のレトロウ ィルスの代表例である。

Ｃ型粒子は最も大きな形態学的クラスのレトロウィルスに相当する。Ｃ型ウィル ス粒子のエンベロープスパイクはサイズおよび量の点で大きく変化しているが、 この型のウィルスはすべて成熟ピリオン内に中心に配置されたコアをもっている 。七ロ二−ネズミ白血病ウィルスが代表的なＣ型ウィルスである。

Ｄ型粒子はＢ型と同様に中心を離れて存在している核様体を示す。しかし、Ｄ型 のスパイクはＢ型のものよりもかなり短い。この型の例は霊長類にだけ見られる 。

ここに提示した多くの概念を理解するためには、代表的なレトロウィルスの機構 を知ることが必要である。七ロ二−ネズミ白血病ウィルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）が例 として役立つだろう。ウィルスの全配列は既知であり、Ｓｈｉｍｎｉｃｋ、　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９３＋５４３−４８（１９８１）およびＭｉ ｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｖｅｒｍａ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　４９：２１４−２２ （１９８４）を参照されたい。すべてのレトロウィルスと同様に、Ｍ。

−ＭＬＶは成熟ウィルス粒子内にそのゲノムＲＮＡを２コピー保有している。レ トロウィルスの二倍体ＲＮＡゲノムはウィルスの中でも特異であり、逆転写プロ セスの必要成分である。ウィルスゲノムＲＮＡの同様のサブユニットは真核細胞 のｍＲＮＡ分子のいくつかの特徴を示す。この分子の５′末端はｍ　ＲＮ　Ａに 典型的なキャップ構造（ｍ’Ｇ”　ｐｐｐ”Ｇｍ）をもっている。約２００残基 のポリＡテイルが３′末端に付いており、そして数個の内部アデノシン残基がメ チル化されている。

キャップおよびポリＡテイルのほかに、ウィルスＲＮＡには３つの主要なコード 領域と６つの機能領域が確認される。高度に保存されたＬＴＲ（つまりロング・ ターミナル・リピート）領域のコピーがこの分子の両端に見られる。二倍体ゲノ ムと同様に、逆転写の成功にはこれらが必要である。５°　ＬＴＲ領域はプロモ ーターおよびエンハンサ−活性を有する配列を含んでいる。ＬＴＲ領域もポリＡ 付加シグナルを含む。５’　ＬＴＲ領域の下流にはＵ５領域が存在する。次にＬ （つまり非翻訳リーダー）配列が存在する。Ｌ領域はネガティブ鎖ＤＮＡ合成の 開始のためのプライマー結合（ＰＢ）部位を含む。ネガティブ鎖ＤＮＡ合成の開 始時にプライマーとして用いられるｔＲＮＡ分子はＰＢ部位に塩基対合される。

これはウィルスゲノムのキャプシド化に必要な部位も含んでいる。

次に３つの主要なコード領域が存在する：ウイルスのコアタンパク質をコードす るｇａｇ、つまりグループ特異的抗原遺伝子；ウィルスのポリメラーゼ（つまり 逆転写酵素）をコードするｐ。

１；およびエンベロープタンパク質および糖タンパク質をコードするｅ　ｎ　Ｖ 　ｏこれらの後にＰＢ十部位が続き、この部位はポジティブ鎖ＤＮＡ合成に用い られるプライマーと結合する。次にウィルスエンハンサ−およびプロモーターを 含むＵ３領域が存在する。

Ｕ３領域の下流にはＬＴＲ領域の２番目のコピーが存在する。

ＭＬＶの成熟ウィルス粒子は９種類の主要なタンパク質を含んでいる。これらは −次翻訳産物の翻訳後プロセシングにより作られる。これらのタンパク質は１９ ７４年に導入されたシステムに従って命名される。このシステムでは、記号″ｐ ”　（タンパク質）またはｇｐ”　（糖タンパク質）の後に、ドデシル硫酸ナト リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定されたタ ンパク質のおよその分子量（ｋＤａ）を示す数字を記載する（２３）。４つの内 部構造タンパク質はウィルスｇａｇ遺伝子の産物である。それらは次のものであ る：主要キャプシドタンパク質のｐ３０；疎水性マトリックスタンパク質のｐ１ ５；ヌクレオキャプシド内に見られる塩基性タンパク質のｐｌＯ；および酸性リ ンタンパク質のｐ１２（これはしばしばｐｐ１２と呼ばれ、そのピリオン位置お よび機能はこれがら決定されねばならない）。

ｅｎｖ遺伝子によりコードされる２つの主要なエンベロープ結合タンパク質が存 在する。それらは糖タンパク質のｇｐ７０と非グリコジル化ｐ１５タンパク質で ある。ｐ１５タンパク質はｇＤ７０に結合して、それを膜に定着させるトランス メンブランタンパク質である。ｇｐ７０タンパク質は成熟ピリオンを細胞表面の ウィルスレセプターに結合させる。

ウィルスのポリメラーゼタンパク質もｐ７０と呼ばれる。Ｍ。

−ＭＬＶでは、このタンパク質は非共有結合とジスルフィド結合によって結合さ れた２量体であるようだ（２６）。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとして作用 するほかに、逆転写酵素はＲＮａｓｅＨ活性も有し、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッ ド中のＲＮＡを短いオリゴヌクレオチドに消化する。２つの他のタンパク質は（ 少なくとも一部のレトロウィルスにおいては）ｐｏｌ遺伝子の産物であると考え られる。ウィルスプロテアーゼのｐ１４は他のウィルスタンパク質の成熟化に寄 与する。インテグラーゼタンパク質ｐ４６（ＭｕＬＶのもの）は、二本鎖ＤＮＡ コピーのウィルスゲノムを宿主細胞ＤＮＡに接合または挿入するように働＜（２ ７゜２８、　２９．　３０）。

他のレトロウィルスは別のレトロウィルス遺伝子に特色がある。

かくして、ＨＴＬＶ−ルトロウイルス中に、我々はｔａｘおよびｒｅｘを見いだ すことができる。ウィルスの複製に不可欠なｔａｘの産物は、ウィルスの遺伝子 発現を高めるトランス作用転写活性因子である（Ｓｅｉｋｉ、　Ｍ、　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　８０：３６１８−３６２２　（１９８３）；　５ｏｄｏｒｓｋｉ、　 Ｊ、Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ。

２２５：３８１−３８５　（１９８４）；　Ｃｈｅｎ、　１．　ｅｔ　ａｌ、、 　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２９：５４−５８（１９８７）　）。やはりウィルスの 複製に必要とされるｒｅｘ遺伝子は、ウィルス遺伝子発現の転写後の調節遺伝子 である（Ｈｉｄａｋａ。

Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、、　７：５１９−５２３　（１９８８）； 　Ｉｎｏｕｅ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４：３６５２− ３６５７　（１９８８）　）。

ＨＩＶ−ルトロウイルスもウィルス複製を調節する遺伝子をもち、ｖｉ　ｆ、ｖ ｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕおよびｎｅｆを含んでいる（Ｈａｓｅｌｔｒｎｅ 、　Ｗ、Ａ、、　Ｊ、　Ａｃｑｕｉｒｅｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃ ｙＳｙｎｄｒｏｍｅ、　ｌ：２１７２４０　（１９８Ｂ））。

レトロウィルス複製に必要なもう１つの因子は、ウィルス粒子へのゲノムウィル スＲＮＡ分子の特異的キャプシド化に必要とされるシス作用ウィルスゲノム配列 である（４−１０）。Ｐｓｉと呼ばれるこれらのパッケージング配列が同定され 、そして遺伝子移入用にデザインされたレトロウィルスベクターの構築に利用さ れた（１０−１３）。機能的なパッケージング配列は宿主細胞内でのレトロウィ ルス複製に絶対に必要である。レトロウィルスゲノムからパッケージング配列を 欠失させ（ウィルスの増殖を阻止するため）、このＤＮＡを宿主細胞内に導入す ると、細胞はウイルスタンパク質とウィルスＲＮＡをすべて生産できたが、ウィ ルスＲＮＡゲノムを伝染性粒子にパッケージすることができなかった。しかし、 この種の細胞は“ヘルパー”細胞として役立ち、レトロウィルスのＬＴＲとパッ ケージング配列のみを含むＤＮＡベクターを補足することができた。“ヘルパー ”細胞は次のものを供給した：　（ａ）ベクターＲＮＡをパッケージするのに必 要なｇａｇコード化タンパク質：　（ｂ）キャプシドを形成するためのエンベロ ープタンパク質；および（Ｃ）感染細胞に到達した際にＲＮＡゲノムをＤＮＡコ ピーに変換するための逆転写酵素。ピリオンへのＲＮＡパッケージングに必要な 配列が規定され、ｇａｇ遺伝子の初期部分の先端と５’　ＬＴＲとの間にあるこ とが分かった。

Ｂ、アンチセンスＲＮＡ 遺伝子発現はＤＮＡ鋳型からのプレメツセンジャーＲＮＡの転写、プレメツセン ジャーＲＮＡの成熟メツセンジャーＲＮＡへのプロセシング、およびメツセンジ ャーＲＮＡの１以上のポリペプチドへの翻訳を伴う。最近では、細胞および生物 内のＲＮＡ機能を阻止するためにアンチセンスＲＮＡを使用することが大いに関 心をもたれている（１４−１６）。アンチセンスＲＮＡは高度に特異的な方法て その相補配列（“センスＲＮＡ”）に結合することができる。これはセンスＲＮ Ａのプロセシングおよび翻訳を阻止し、配列特異的ＲＮＡ結合タンパク質との相 互作用を破壊することもある（１７−２０）。例えば、正常なチミジンキナーゼ （ＴＫ）ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡの転写を支配するプロモーターを担うプラス ミドが構築された。このようなプラスミドを、正常に発現されるＴＫ遺伝子を含 むプラスミドと共に、ＴＫを欠失している突然変異マウスＬ細胞に注入すると、 アンチセンス遺伝子の存在が正常プラスミドからのＴＫの発現を実質的に低下さ せた（Ｉｚａｎｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１１．３６：１００７　（１９８４） ）。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは種々のウィルス系において抑制的であること が見いだされた。Ｚａｍｅｃｎｉｋ　ａｎｄ　５ｔｅｐｈｅｎｓｅｎ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　７５：２８０−８４　（１９７８）は、培地に３ °および５°　ＬＴＲの１３ヌクレオチドに相補的なオリゴデオキシヌクレオチ ドを加えることにより、培養ＣＥＦ細胞内でのラウス肉腫ウィルス（レトロウィ ルス）の生産を抑制した。このＤＮＡはエキソヌクレアーゼに対するその感受性 を低下させるべく末端でブロックされた。彼らは、このアンチセンスＤＮＡが環 状化、ＤＮＡの組込み、ＤＮＡの転写、翻訳開始またはリポソーム結合を阻止す ることによって機能しうると推測した。パッケージングの阻止については何も言 及されていないことに留意されたい。

Ｃｈａｎｇ　ａｎｄ　５ｔｏｌｌｚｆｕｓ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６１：９ ２１−２４　（１９８７）は、アンチセンスＲＮＡ　（それらはｅｎｖ遺伝子の コード領域または５′あるいは３′　フランキング領域にハイブリダイズした） を用いて同じウィルスを抑制した。

Ｇｕｐｔａ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６２ニア４９２−９６　（ １９８７）は、５′フランキング領域に相補的なアンチセンスＤＮＡを用いてセ ンダイウィルスのヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ　Ｐ）およびリンタンパク 質（Ｐ、Ｃ）ｍＲＮＡの翻訳を抑制した。コード領域に相補的なオリゴヌクレオ チドは翻訳に何の影響も与えなかった。彼らは有効性におけるこの差異を説明す ることができなかった。

上に示した知見に基づいて、多くの研究所が、アンチセンスＲＮＡてウィルス遺 伝子発現を阻止することにより、エイズの原因ウィルスであるＨＩＶ−１の伝播 を防止しようとした。これまでのところ、これらの努力のとれも成功していない 。

アンチセンス実験が考案され、そしてＮＩＨにより行われた。

Ｓ、　Ａｍ１ｎｉ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　（１９８６）　６（ ７）：２３０５；　Ｍ、　Ｍａｔｓｕｋｕｒａ。

ＰＮＡＳ　（１９８７）　８４ニア７０６；　Ｊ、　Ｈｏ１ｔ、　ＭＣＢ　（１ ９８８）　８（２）＋９６３；に、Ｃｒｏｅｎ、　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｎｅｗｓ　 （１９８９）　１３２：３５６゜この種の実験は一般にレトロウィルスの複製を 阻止するアンチセンス剤の能力をテストすることに向けられる。当分野では、最 近の動向として、複製の阻止はＲｅｖタンパク質のようなウィルスタンパク質の 発現の阻止を意味するという考えが力説されている。この力説のために、抗ウィ ルス活性についてアンチセンス配列をテストするためのアッセイはＨＩＶ−１遺 伝子産物の発現を測定している。Ｓ、　Ｇｏｔｔ。

Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ　（１９８１）　３８（１）：２３９　（ＲＴの試験）　；　 Ｊ、　ＭｃＤｏｕｇａｌ、　Ｊ。

Ｉｎ＋ｎ１ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ、　（１９８５）　７６：１７１　（抗原の検 出）を参照されたい。

ＨＩ　Ｖ−Ｊのアンチセンス核酸阻止の試験に最もよく用いらる発現アッセイで あるＲＮＡノザンプロット分析（Ｔｈｏｍａｓ、　ＰＮＡＳ。

７７：３２０１．１９８０　）は、ウィルスパッケージング配列に相同性の有用 なアンチセンス配列を検出することができない。

Ｒｕｄｅｎ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｏａ、　Ｊ、　Ｖｉｒａｌ、　６３：６７７−６ ８２　（Ｆｅｂ、　１９８９）は、アンチセンスＲＮＡを発現するように遺伝子 操作した一次ヒトＴ細胞においてＨＴＬＶ−１の複製を抑制した。１つのアンチ センスＲＮＡはｔａｘ遺伝子ｃＤＮＡの最初のキロベースに対して誘導された。

他方はプロウィルスＤＮＡの５′末端からの１．　１キロベースのＨｉｎｄＩＩ Ｉ−Ｐｓ　ｔ　Ｉフラグメントてあった。後者の標的は５′スプライス部位、ｔ ＲＮＡプライマー結合部位、および“おそらく”ゲノムウィルスＲＮＡのパッケ ージングのためのシグナルを含むと書かれている。アンチセンスをコードするＤ ＮＡはＳＶ４０初期プロモーターまたはサイトメガロウィルス即時型プロモータ ーに機能しつる状態で連結された。ＣＭＶプロモーターの制御下でアンチセンス ＲＮＡを発現するベクターのみが細胞増殖に対して抑制効果を及ぼしたが、ＳＶ ４０初期プロモーター／アンチｔａｘ遺伝子もウィルス生産を低下させた。

Ｒｕｄｅｎ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｏａにより提唱された種類の大きいアンチセンス 分子はい（つかの欠点を有している。それらは合成するのが困難である（特に、 以下で述べるように異常な塩基が組み込まれている場合）。それらは、ことによ ると、もとのウィルス、他のウィルス、または腫瘍遺伝子と再結合するだろう。

また、それらはウィルス標的へのそれらの結合を妨げる二次構造を形成しやすい 。

さらに、それらは細胞ＤＮＡとハイブリダイズする傾向があり、その結果おそら く必須遺伝子の発現を抑制するだろう。

通常の塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に加えて、研究者らは 遺伝子発現を抑えるためにヌクレオシドまたはヌクレオチドの類似体を利用して いる。このような類似体はヌクレアーゼ加水分解に対する抵抗性および培養下の 哺乳動物細胞の透過向上といった有利な性質を備えている（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｐ 、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ。

、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２０：１８７４−１８８０　（１９８１）） 　ｏ例えば、１６ｓ　ｒＲＮＡのシャインーダルガルノ配列に相補的なオリゴ（ デオキシリボヌクレオシドホスホネート）は大腸菌においてタンパク質合成を抑 制したが、哺乳動物細胞では抑制しなかった（Ｊａｙａｒａｍａｎ。

に、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳ Ａ、　７８：１５３７−１５４１（１９８３）　）。ウサギグロビンｍ　ＲＮ　 Ａの開始コドン領域に相補的なこの種のオリゴマーは無細胞系において翻訳を抑 制した（Ｂｌａｋｅ、　Ｋ、Ｒ，ｅｔ　ａｔ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 　２４：６１３９−６１４５　（１９８５）　）。

一方、水庖性口内炎ウィルスｍＲＮＡの開始コドンに相補的なオリゴマーは感染 し細胞においてウィルスを抑制したが、細胞タンパク質の合成を抑制しなかった （Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｆｅｄｅｒ。

Ｐｒｏｃ、　４３．　ａｂｓけ、　１８１１　（１９８４））　、最近になって 、単純庖疹ウィルスｌ型の即時型プレｍＲＮＡ４および５のスプライス部位に相 補的なオリゴ（ヌクレオシドメチルホスホネート）は、ウィルス感染を選択的に 抑制することが見いだされた（Ｓ＋ｎ１ｔｈ、　Ｃ，Ｃ，ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８３：２７８７−２７９ １　（１９８６）　）。

発明の要約 本発明の目的は、上記の欠点を克服することにある。

より詳細には、本発明者らは、アンチセンスＲＮＡを本質的にウィルスゲノムの パッケージング配列にのみハイブリダイズさせることにより、ウィルスパッケー ジングの阻止に基づいてレトロウィルス複製を抑制する新規な方法を採用した。

１つの態様において、本発明者らは、ネズミ白血病ウィルスのプロウィルスＰｓ ｉ　（パッケージング）配列を、リンパ球性ウィルスプロモーター／モロニーＭ ｕＬＶ　ＬＴＲまたはサイトメガロウィルス即時型領域由来の調節因子の転写制 御下で逆方向に挿入した組換えプラスミドを構築した。これはＰｓｊに相補的な アンチセンスＲＮＡの生成をもたらし、そして生産的ウィルス感染を完全に阻止 する。

これらのアンチセンス配列をｉｎ　ｖｉけ０で細胞に導入し、安定した形質転換 細胞系を単離すると、これらの細胞はＭ　−Ｍ　ｕ　Ｌ　Ｖ感染に抵抗し、そし てパッケージされたウィルスＲＮＡを全く含まないウィルスだけを生産した。

これらのプラスミドに由来するアンチセンスＰｓｉおよび適当な転写調節配列を 含む線状フラグメントを、接合体マイクロインジェクションによりマウスの生殖 細胞系に導入した場合は、アンチセンスＰｓｉＲＮＡの存在がこれらのトランス ジェニックマウスのリンパ球に検出された。相応のレトロウィルスＣＭ−ＭｕＬ Ｖ）を導入しても、アンチセンスＰｓｉ）ランスジェニックマウスのどれも白血 病の徴候を現さなかった。

より一般的には、本発明は、レトロウィルスのパッケージング配列に特異的にハ イブリダイズする能力を有し、それによりレトロウィルスのゲノムＲＮＡのパッ ケージングのみを本質的に抑制することができるアンチセンス分子に向けられる 。好ましくは、アンチセンス分子は約１００塩基より小さく、約６０塩基よりも 小さいことがより好ましい。それはＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの類似体であり 得る。アンチセンス分子は薬剤のように直接投与することができ、また、ＲＮＡ の場合は、導入された遺伝子の発現により被験者においてｉｎ　ｖｉｖｏでそれ を生成させることもできる。アンチセンス分子を直接投与する場合、それは細胞 膜透過性でヌクレアーゼ抵抗性のＲＮＡまたはＤＮＡ類似体から成るものである 。

本発明は、このようなアンチセンス分子に転写可能なりＮＡ配列を含む組換えＤ ＮＡ分子、および上記ＤＮＡ配列で形質転換またはトランスフェクションされた 宿主、好ましくは哺乳動物細胞宿主、最も好ましくはヒト細胞を含むものである 。

本発明はさらに、プロモーターに機能しつる状態で連結されたＤＮＡ配列を細胞 のゲノムに挿入することから成る、レトロウィルスによる生産的感染に対する抵 抗性を細胞に付与する方法に関するものであり、その際ＤＮＡ配列はアンチセン スＲＮＡ分子に転写可能であり、このアンチセンスＲＮＡ分子はパッケージング 配列にハイブリダイズし、それによりレトロウィルスのゲノムＲＮＡのパッケー ジングを抑制して、生産的感染に対する抵抗性を細胞に付与する。

本発明は、哺乳動物の本質的にすべての生殖細胞および体細胞のゲノムに、プロ モーターおよび調節因子に機能しうる状態で連結された逆方向のレトロウィルス パッケージング配列を含むＤＮＡ配列またはそのセグメントを挿入することから 成る、レトロウィルスによる生産的感染に対する抵抗性を哺乳動物のようなを椎 動物に付与する方法を包含する。その際ＤＮＡ配列またはセグメントはアンチセ ンスＲＮＡ分子に転写可能であり、このアンチセンスＲＮＡ分子はレトロウィル スのゲノムＲＮＡのパッケージングを抑制して、感染に対する抵抗性を哺乳動物 に付与する。このＤＮＡ配列は胚期の哺乳動物またはその先祖に導入することが 好ましい。

従って、本発明はさらに、本質的にすべての生殖細胞および体細胞が上記ＤＮＡ 配列を含むヒト以外のトランスジェニック補乳動物に関するものであり、トラン スジェニックでは前記ＤＮＡ配列が胚期の哺乳動物またはその哺乳動物の先祖に 導入されている。

少なくとも一部の細胞が上記ＤＮＡ配列を含むキメラ動物（ヒトを含む）も意図 される。

図面の簡単な説明 図１は、プラスミドｐＬＰＰｓユａｓ（Ａ）およびｐＣＰＰｓ±ａｓ（Ｂ）の構 築を示す模式図である。

図２は、パッケージング配列を含む領域のモロニーネズミ白血病ウィルス（Ｍ− ＭｕＬＶ）の部分配列（配列番号；工）である。

ＣＡＰ、プライマー結合部位、スプライス供与部位、コアパッケージング配列、 およびｇａｇ遺伝子の最初部分には印が付けである。

我々は、ＭｏＭＬＶのプライマー結合部位またはスプライス供与部位に相補的で 、パッケージング配列には相補的でないアンチセンス分子がウィルス感染を有意 に抑制しないが、オーブンボールド配列すなわちパッケージング部位のコア（塩 基３０１−３５０）に相補的なアンチセンスオリゴを用いた場合はウィルス感染 の最大抑制が観察されることを見いだした。

図３は、ウシ白血病ウィルスのゲノムＲＮＡの部分配列（配列番号＝２）であり 、領域（３４１−４１５）はオーブンボールド文字で示されたパッケージングシ グナルを含むと予想される。

図４は、プラーク検定の結果を示す。

図５は、パッケージング配列を含む領域のＨＩ　Ｉ−１の部分配列（配列番号： ３）である。

好ましい態様の説明 パッケージングに必要なウィルスゲノムＲＮＡのＰｓｉ配列とピリオンキャプシ ドタンパク質問の特異的相互作用の妨害はレトロウィルスの複製サイクルを遮断 するだろう。この妨害は、パッケージング配列にハイブリダイズし、それにより 複製を阻止する、パッケージング配列の一部に相補的なアンチセンス核酸（ＤＮ ＡまたはＲＮＡ）の使用により達成される。

レトロウィルス遺伝子に対して誘導されたアンチセンス配列は、本発明のアンチ センス分子はど効果的に複製を阻止しないだろう。

レトロウィルス遺伝子に対して誘導されたアンチセンスＲＮＡ分子は、リポソー ムＲＮＡへの結合について通常のメツセンジャーＲＮＡと競合するが、パッケー ジング配列に対して誘導されたものはゲノムＲＮＡへの結合についてｇａｇコー ド化コアタンパク質と競合する。ＲＮＡ−ＲＮＡの相互作用はＲＮＡ−タンパク 質の相互作用よりも強い。

細胞および動物体においてレトロウィルス複製を阻止するアンチセンスＲＮＡの 効力を調べるために、本発明者らは、モロニーネズミ白血病ウィルス（Ｍ−Ｍｕ ＬＶ）のＰｓｉ配列に相補的なＲＮＡ配列を発現するトランスジェニックマウス を作製した。この種の動物はこの白血病ウィルスによる感染に完全に抵抗するこ とが判明した。

かくして、本発明は、病因がレトロウィルスである疾病を予防および治療する薬 剤としての、レトロウィルスパッケージング配列に相補的なアンチセンスＲＮＡ およびＤＮＡ分子の使用に向けられる。

アンチセンスＲＮＡおよびそれをコードする遺伝子は、レトロウィルスのパッケ ージング配列にハイブリダイズし得る配列を包含するものである。本発明の好ま しいレトロウィルスにはヒトと他の動物のレトロウィルスが含まれる。好ましい ヒトのレトロウィルスとしてはヒト免疫不全ウィルス−１（ＨＩＶ−１）（また はヒトＴリンパ球性ウィルス−３もしくはリンパ節症関連ウィルス）、ヒト免疫 不全ウィルス−２（ＨＩＶ−２）　、ヒトＴリンパ球性ウィルス−１（ＨＴＬＶ −１）　、およびヒトＴリンフく球性ウィルス−２（ＨＴＬＶ−２）がある。ま た、他の動物種、特に農業上重要な動物（例えば、雌ウシやニワトリ）およびペ ット（例えば、イヌやネコ）の別のレトロウィルスも本発明の範囲に含まれる。

本発明の範囲に含まれる他のレトロウィルスの非限定的なリストを以下の表Ｉに 示す。レトロウィルスについてはＷｅｉｓｓ、　Ｒ９らの編集によるＲＮＡ　Ｔ ｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆＴｕ ｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ”　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、、　１ ９８４に詳細に記載されており、参照によりここに引用するものとする。

レトロウィルス感染を抑制するために本発明のアンチセンスＲＮＡがハイブリダ イズすべき標的パッケージング配列は、レトロウィルスゲノムの配列の研究に基 づいて選択されるべきである。

研究したすべてのレトロウィルスのパ・ｙケージング配列は、５゜ＬＴＲのちょ うど３°側のプライマー結合部位と最初のコード化ウィルスタンパク質（通常は ｇａｇタンパク質コード配列）の開始配列の間に位置しているので、この領域内 の配列（例えば、ＨＩＶ−１、単離物ＥＬＩのプロウィルスゲノムでは塩基２０ 〇−３４０）がめるアンチセンスの好ましい候補である。種々のレトロウィルス 間のこの領域の相同性のために、ある特定のウィルスのためにデザインされたア ンチセンス配列を使って、他のウィルスの複製を効果的に抑制することができる だろう。

かくして、例えば、好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドはＭ　ｏ　−Ｍ　 ｕ　Ｌ　Ｖ配列の塩基２８０−３３０の領域に特異的である。その理由は、それ が）ＩＩＶ−１に相同であるからである。ＨＩＶ−１のさまざまの単離物は（ゲ ノム内のわずかに異なる位置に）同じパッケージング配列をもつので、同一の配 列がすべてのＨＩＶ−１株において有効であろう。

１つの好ましいアンチセンス配列は、すべてのレトロウィルスパッケージング配 列に実質的に相補的であるため“万能”インヒビターとして役立つものである。

ＨＩＶ−１由来のコアパッケージング配列（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６３：４０ ８５．１９８９を参照）に相補的な配列はこの点て考慮するに値する。これとは 別に、１組のレトロウィルスのパッケージング配列に対し高度の相補性を有する “共通”のパッケージング配列、あるいは特定のレトロウィルスに特異的なパッ ケージング配列であるオリゴヌクレオチド配列を作ることもてきよう。

ＨＩＶ−１の抑制に有用で、ウィルスゲノムＲＮＡ、ウィルスｍＲＮＡおよびウ ィルスＤＮＡ配列に相補的な、本発明による代表的なオリゴヌクレオチド配列を 以下に示す。ＨＩＶ−１のパッケージング配列については、Ｌｅｖｅｒ、　Ｊ、 　Ｖｉｒｏｌ、、　６３（９）：４０８５−４０９７　（１９８９）；　Ｋｏｒ ｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ。

８４：２１５０−２］５４　（１９８７）を参照されたい。

配列番号＝４はＨＩＶ−１のパッケージング配列に相補的な、以下に示した４４ ｍｅｒ配列である。

ＣＴＣＡＴＧＣＧＧ　ＣＣＧＡＴＣＴＴＣＣＴＣＴＣＴにの配列はＳ、Ｄ部位の すぐ後で始まり（５’　）　、ｇａｇ／Ｍｅｔ部位のすぐ前で終わる（３′）。

下線を引いた１９個の塩基はＨＩＶパッケージング配列の“コア”に相補的であ る。このコア領域に相補的な１９−ｍｅｒアンチセンス分子、およびコアと両側 の４個のフランキング塩基に相補的な２７−ｍａｒも本発明において同様に使用 できる。本発明はこれらのパッケージング部位指向性配列のいずれにも限定され ず、より短いまたは長い配列をも含むものである。

表ＩＶは対象となる多くのパッケージング配列を示す。

本発明のアンチセンス分子（例、ＲＮＡ）は、好ましくは、（ウィルスＤＮＡの 一方の鏡上の）パッケージング配列の少なくとも有意なサブ配列に対し１００％ の相補性を有する。かくして、このＲＮＡをコードするＤＮＡ鎖は、パッケージ ング配列に相補的なりＮＡ鎖に対し１００％相同であるべきである。他の態様に おいて、この配列はもっと低い相同度（例えば少なくとも約６０または８０％） であってもよい。相同は、アンチセンスＲＮＡがその目的（すなわち、ウィルス パッケージングの抑制）を達成するに足る親和性で標的パッケージング配列にハ イブリダイズするように十分でなければならない。

このようなハイブリダイゼーションの効率はハイブリダイズする配列の長さと構 造の関数である。配列が長くなればなるほど、そして相補性が完全に近くなれば なるほど、相互作用は強くなる。

塩基対のミスマツチの数が増えるにつれて、ノλイブリダイゼーション効率は低 下するだろう。さらに、パッケージング配列ＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡの ＧＣ含有量も、ＡＴ（またはＡＵ）塩基対に比べてＧＣ塩基対に存在する付加的 な水素結合のために、ハイブリダイゼーション効率に影響を及ぼすだろう。従っ て、ＧＣ含有量が豊富な標的サブ配列が標的として好ましい。

分子内ハイブリダイゼーションのために二次構造を形成するアンチセンスＲＮＡ の配列は避けることが望ましい。なぜなら、アンチセンスＲＮＡがその意図する 目的に対し乏しい活性をもつようになるか、または不活性になるからである。当 業者は、配列が二次構造を形成する傾向をもつか否かを容易に判別できるだろう 。

二次構造はパッケージング部位内の異なる標的サブ配列を選択することによって 回避することができる。

長さが約１５−１００塩基で、レトロウィルスのパッケージング領域の標的サブ 配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、天然のモノヌクレオシドから、あるいは 非架橋性リンに結合した酸素に置換基を有するモノヌクレオシドから合成するこ とができる。好ましい類似体は天然に存在するモノヌクレオシドのメチルホスホ ネート類似体である。より一般的には、モノヌクレオシドは、類似体の使用が（ ａ）細胞膜を通って拡散する能力の向上および／または（ｂ）被験者の体内での ヌクレアーゼ消化に対する抵抗性といった利点を有するオリゴヌクレオチドをも たらす類似体である（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｐ、Ｓ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ、　２０：１８７４−１８００（１９８１））。このようなヌク レオシド類似体は当分野で公知であり、遺伝子発現の抑制におけるそれらの使用 は多くの文献に詳述されている（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｐ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、前 掲；　Ｊａｙａｒａｍａｎ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｔ、、前掲；　Ｂｌａｋｅ、　Ｋ 、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、前掲；　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｆｅｄ ｅｒ。

Ｐｒｏｃ、、　４３．　ａｂｓｔｒ、　１８１１　（１９８４）；　Ｓｍ１ｔｈ 、　Ｃ，Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、前掲）。

本発明に従って組換えＤＮＡおよびＲＮＡ分子を構築するための基本的な方法は 、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎ：　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ ｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、５ｅｃｏｎｄ　Ｅ ｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌ（ａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８９）に記載されており、こ の文献を参照によりここに引用するものとする。

標的レトロウィルスパッケージング配列に相補的なアンチセンスＲＮＡをコード する鎖を有するオリゴヌクレオチド分子は、当業者によく知られた方法を使って 製造することができる（Ｂｅｌａｇａｊｅ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２５４：５７６５−５７８０（１９７９）；　Ｍａｎ ｉａ目ｓ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、、Ｉｎ：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｃｈａ ｎｉｓｍｓ　１ｎｔｈｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉ ｏｎ、　Ｎ１ｅｒｌｉｃｈ、　Ｄ、Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｅｄｓ、、　Ａｃａｄ、　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ　（１９７６）；　Ｗｕ、　Ｒ， 、ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｇ、　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、、　２１：１０１−１４１　（ １９７８）；　Ｋｈｏｒａｎａ、　Ｒ，Ｇ、。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２０３＋６１４−６２５　（１９７９）　）。さらに、ＤＮ Ａ合成は自動合成機を使っても達成し得る。核酸ハイブリダイゼーションの手法 は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）およびＨａｙｍｅｓ、　Ｂ、Ｄ、ら（Ｉｎ：　 ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃ ａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　ＤＣ（１９８５））によって開示されており、これら の文献を参照によりここに引用するものとする。

“発現ベクター”とは、（適当な転写および／または翻訳調節配列の存在のため に）ベクターにクローニングされたＤＮＡ　（またはｃＤＮＡ）分子を発現して 、それによりＲＮＡまたはタンパク質産物を生産することができるベクターのこ とである。クローン化配列の発現は、発現ベクターを適当な宿主細胞中に導入し たときに起こる。原核生物の発現ベクターを用いる場合は、クローン化配列を発 現し得る原核細胞が相応の宿主細胞となるだろう。

同様に、真核生物の発現ベクターを用いる場合は、クローン化配列を発現し得る 真核細胞が相応の宿主細胞となるだろう。

本発明のアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、連結のための平滑末端 または付着末端、適当な末端をもたらす制限酵素消化、適宜に付着末端の修復、 望ましくない接合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、適当なりガーゼ による連結を含む慣用方法に従ってベクターＤＮＡと結合させることができる。

このような遺伝子操作の技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）により開示されて おり、当分野でよく知られている。

ＤＮＡのような核酸分子は、それが転写調節情報を含むヌクレオチド配列を含み かつこの配列がＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に“機能しうる状態で連結 される”とき、ｍＲＮＡを“発現し得る”と言える。遺伝子発現に必要とされる 調節領域の正確な性質は生物によって変化するが、一般にはＲＮＡ転写の開始を 支配するプロモーターを含む。この種の領域にはＴＡＴＡボックスのような転写 の開始に関係した５′非コ一ド配列が含まれる。

所望により、目的のＲＮＡ産物をコードする遺伝子配列の３゜側の非コード領域 を上記の方法により得ることができる。この領域はその転写終結調節配列（例え ば、終結やポリアデニル化を提供する配列）のために保持されるものである。か くして、自然界でコード配列に隣接する３゛領域を保持しておくことにより、転 写終結シグナルが得られる。転写終結シグナルが発現宿主細胞中で満足に機能し ない場合は、宿主細胞中で機能的な３′領域を代わりに使うことができる。

２つのＤＮＡ配列（例えば、プロモーター領域配列とコード配列）は、これら２ つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）目的遺伝子配列の転写を支配するプロ モーター領域配列にフレームシフト変異を導入しない、あるいは（３）プロモー ター領域配列により転写される遺伝子配列の能力を妨げないとき、機能しつる状 態で連結されていると言える。プロモーター領域は、そのプロモーターがＤＮＡ 配列の転写をもたらす能力をもつならば、ＤＮＡ配列に機能しつる状態で連結さ れているだろう。“機能しうる状態で連結される”ためには、２つの配列が互い に直接隣接している必要はない。

原核または真核細胞宿主において本発明のＤＮＡ配列を生産させるために、本発 明のプロモーター配列は原核生物、真核生物またはウィルスのいずれのものであ ってもよい。適当なプロモーターは誘導可能性、抑制可能性、より好ましくは構 成性である。適当な原核細胞プロモーターの例にはＴ４ポリメラーゼを認識し得 るプロモーター（Ｍａｌｉｋ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｍ、、　２６３：１１７４−１１８１　（１９８４）；　Ｒｏｓｅｎｂｅｒ ｇ、　Ａ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　５９：１９１−２００Ｃ１９８７ ）：　Ｓｈｉｎｅｄｌｉｎｇ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　 Ｂｉｏｌ、、　１９５：４７１−４８０　（１９８７）；　Ｉ（ｕ、　Ｍ、　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　４２：２１−３０　（１９８６）　）　、Ｔ　３、 ｓｐａ、およびＴ　７　（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ ａｔｕｒｅ、　２２８：２２７−２３１　（１９７０）；Ｂａ１ｌｅｙ、　Ｊ、 Ｎ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）　８０：２８１４−２８１８　（１９８３）；　Ｄ ａｖａｎｌｏｏ、　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）　８１：２ ０３５−２０３９　（１９８４）　）　；バ゛　クテリオファージλのＰアおよ びＰＬプロモーター（ＴｈｅＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｌａｍｂｄａ、　Ｈ ｅｒｓｈｅｙ、　Ａ、Ｄ、、　Ｅｄ、、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ 　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９７３ ）；　Ｌａｍｂｄａ　ＩＴ。

Ｈｅｎｄｒｉｘ、　Ｒ，Ｗ、、　Ｅｄ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８ ０）　）　；大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、熱ショック、およびＩ　ａｃＺプロモ ーター；バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター；　ｐＢＲ３２２のβ−ラ クタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター：およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニ コールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターなどが含まれる 。原核細胞プロモーターはＧ１１ｃｋ、　Ｂ、Ｒ，、（Ｊ、　Ｉｎｄ、　Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ。

、　Ｉ：２７７−２８２　（１９８７））；　Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ、　Ｙ、　 （Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、　６８：５０５−５１６　（１９８６））；　Ｗａｔｓ ｏｎ、　Ｊ、Ｄ、　ｅｔ　ａｔ、　（Ｉｎ：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ　ｏｆｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、　Ｆｏｕｒｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｂｅｎｊａ ｍｉｎ　Ｃｕｍｍ１ｎｓ、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ。

ＣＡ　（１９８７））およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ、　Ｓ、　（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ 、　Ｇｅｎｅｔ、、　１８：４１５−４４２　（１９８４））によって検討され ている。

（本頁以下余白） 真核細胞プロモーターにはマウス・メタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（ Ｈａｍｅｒ、　Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ 、、　ｌ：２７３−２８８　（１９８２））；ヘルペスウィルスのＴＫプロモー ター（ＭｃＫｎｉｇｔ＋ｔ、　Ｓ、、　Ｃｅ１１．３１：３５５−３６５　（１ ９８２））；　Ｓ　Ｖ　４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ、　Ｃ，、ｅｔ 　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）、　２９０：３０４−３１０　（ １９８１））；および酵母ｇａ１４遺伝子プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ。

Ｓ、Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　（ＵＳＡ）、　７９：６９７１−６９７５（１９８２）；　５ｉｌｖｅｒ、　 Ｐ、Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

（ＵＳＡ）、　８１：５９５１−５９５５　（１９８４））が含まれる。

レトロウィルス感染の阻止に用いるベクターを作製する場合、感受性真核細胞ま たは動物体では、上記のような真核細胞プロモーターを使用しなければならない 。好ましいプロモーターおよび付加的な調節因子（例えば、ポリアデニル化シグ ナル）は、レトロウィルスが感染する細胞型において最大の発現をもたらすもの である。かくして、例えば、ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ −２、およびモロニー・ネズミ白血病ウィルスはすべてリンパ系細胞に感染する が、これらのウィルスの１種（またはそれ以上）のパッケージング配列に相補的 なアンチセンスＲＮＡを効率よく発現させるために、リンパ系細胞（または組織 ）において効率のよい発現をもたらす転写調節単位（プロモーターおよびポリア デニル化シグナル）が選択される。以下に例示するように、好ましいプロモータ ーは、場合によりウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（３３）と共に用い られるサイトメガロウィルス即時型プロモーター（３２）　、およびリンパ球性 レトロウィルスの場合に用いられるモロニーＭｕＬＶ　ＬＴＲのプロモーターで ある。モロニーＭｕＬＶ　ＬＴＲプロモーターの望ましい性質は、それがレトロ ウィルスと同じ組織向性をもつ点である。

ＣＭＶプロモーターも同様に主としてリンパ球で発現される。メタロチオネイン プロモーターは誘導可能であるという利点を有する。ＳＶ４０初期プロモーター はウシ骨髄細胞において１ｎｖｉｔｒｏて高レベルの発現を示す。

アンチセンスＲＮＡ分子は、予防または治療しようとするヒトもしくは他の動物 に、適合しうるどのような投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮下または腹腔 内）で注入してもよく、経口摂取や吸入で投与することもてきる。徐放性カプセ ルやインブラントのような特殊な剤形も適宜に使用される。また、アンチセンス ＤＮＡ分子も提供しうる。ＤＮＡはＲＮＡよりもｉｎ　ｖｉｔｒｏで比較的簡単 に合成できる。

アンチセンス分子はＤＮＡまたはＲＮＡの類似体であってもよい。本発明は特定 のＤＮＡまたはＲＮＡ類似体の使用に限定されない。たたし、類似体はパッケー ジング配列の相補ゲノムＤＮＡに十分にハイブリダイズする能力を有し、十分な ヌクレアーゼ耐性と、十分な生物利用能および細胞取込みを有するものである。

ＤＮＡやＲＮＡはヌクレオシド間結合を修飾することによって（例えば、メチル ホスホネートまたはホスホロチオエート）、あるいは修飾ヌクレオシド（例えば 、２′−〇−メチルリポースまたは１°−α−アノマー）を組み入れることによ って、ヌクレアーゼのような酵素によるｉｎ　ｖｉｖｏ分解に耐性を示すように なる。

自然界に存在する結合は次のものである：０゛−Ｐ　口　０゜ ０５’ これに代わる結合には次のものが含まれる：コＩ０ ｌ０ ＮＲ２−Ｐ　”　０ ０５’ （ここでＲは水素および／またはアルキルである）０５’ （ここてＲは水素またはアルキルである）また、３’　０−Ｐ−０５“を他の結 合、例えば３°　ＯＣＨｔＣ（０）−０５′、３’　Ｏ−Ｃ（０）−ＮＨ５’　 、および３’　Ｃ−ＣＨ２ＣＨ２５−Ｃ５’　で置き換えることもできる。

アンチセンス分子の全体をこのような修飾結合で形成してもよく、また５“およ び３′末端のようなある部分だけをこのように修飾してエキソヌクレアーゼ耐性 を与えてもよい。

本発明で用いるのに適したアンチセンス分子には、ジデオキシリポヌクレオシド メチルホスホネート（Ｍｉｌｌ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１８：５１３４−４３　（１９７９）を参照）、 オリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエート（Ｍａｔｓｕｋｕｒａ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、　８４ニア７０６−１０　（ １９８７）を参照）、挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）に共 有結合で結合したオリゴデオキシヌクレオチド（２ｅｒｉａ１．　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１５：９９０９−１９（１９８ ７）を参照）、ポリ（Ｌ−リジン）と結合したオリゴデオキシヌクレオチドＣＬ ｅｏｎｅｔｔｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　７２：３２−３３　（１９８ ８）を参照）、およびリボース誘導サブユニットから構成されたカルバメート結 合オリゴ７−　（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ、　Ｊ、、　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｎｕｃ ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、　３７：４４　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ　１９８９）を参照）が含まれるが、これらに限定されない。

アンチセンス核酸薬剤の直接投与は急性の防御をもたらすが、防御期間はこの分 子の半減期に依存する。しかも、アンチセンス核酸の供給量は追加の投与によっ てのみ増加される。従って、アンチセンスＲＮＡの自己補給源を確保するために 、前記アンチセンスＲＮＡを転写し得る組換えＤＮＡ分子をヒトまたは動物体の １以上の細胞に導入することにより、レトロウィルス感染への抵抗性を高めたト ランスジェニックまたはキメラ動物を作ることが望ましいだろう。組換えＤＮＡ は、例えば卵母細胞期の動物への発現カセットのマイクロインジェクション、胚 へのレトロウイルスベクタートランスフエクンヨン、あるいは胎児または生後の 動物へのレトロウィルスベクターの静脈内注射により動物に投与することかでき る。

かくして、本発明はさらに、動物の生殖細胞および体細胞がレトロウィルスのパ ッケージング配列にハイブリダイズし得るアンチセンスＲＮＡをコードする本発 明の組換えゲノムＤＮＡを含む、トランスジェニック真核動物（好ましくはを椎 動物、より好ましくは哺乳動物）に向けられる。′アンチセンス”　ＤＮＡは、 トランスジェニックにしようとする動物またはその動物の先祖に、胚の段階で、 好ましくはｌ細胞期つまり受精した卵母細胞期に、そして一般には約８細胞期よ り遅くならないように導入される。ここで用いる“トランスジーン”という用語 は、動物のゲノムに組み込まれて、動物内で発現され、その結果としてトランス ジェニック動物内にトランスジーンのＲＮＡ転写物を存在させる遺伝子を意味す る。

遺伝子が染色体に組み込まれて発現されるように、遺伝子を動物の胚のゲノムに 導入する方法はい（つか知られている。ＤＮＡは受精卵の雄または雌の前核にマ イクロインジェクションで導入し得る。また、それは胚細胞の細胞質にもマイク ロインジェクションで導入できる。トランスジーンを保有するレトロウィルスで 細胞をトランスフェクションすることもできる。レトロウィルストランスフェク ションの使用は胚期に限られない。胎児または生後の動物に静脈注射または腹腔 内注射によりベクターを導入することもできる。

受精した卵母細胞期に目的の遺伝子配列を導入することにより、トランスジーン は確実にトランスジェニック動物のすべての生殖細胞および体細胞に存在するこ とになり、かつトランスジーンは確実にすべての細胞で発現される可能性をもつ ことになる。トランスジェニック“創始”動物の生殖細胞中にトランスジーンが 存在するということは、すべてのその子孫がそれらの生殖細胞および体細胞のす へてにトランスジーンをもつことを意味する。創始動物に、より遅い胚期でトラ ンスジーンを導入すると、トランスジーンは創始動物の一部の体細胞系列中に存 在するだけである。

しかし、創始動物の生殖細胞からトランスジーンを受け継いでいるこの創始動物 の子孫はすべて、それらの生殖細胞および体細胞のすべてにトランスジーンをも つだろう。

体細胞および生殖細胞の全部ではなく一部が本発明のアンチセンスＤＮＡを含む キメラ哺乳動物、例えば桑実胚または胞胚の細胞の一部がトランスジェニック哺 乳動物を作る過程でトランスフェクションされるときに作られる動物、も本発明 の範囲内に含まれるものである。キメラ動物はトランスジーンが一般には誕生後 に導入される“遺伝子治療”によって作られるだろう。

使用できる技法には、Ｗａｇｎｅｒ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、　７８：６３７６−６３８０　（１９８１）；　Ｗａｇ ｎｅｒらの米国特許第４．８７３，１９１　号　（１９８９）；　Ｐａ１ｍ１ｔ ｅｒ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、。

２０：４６５−９９　（１９８６）；およびＬｅｄｅｒの米国特許第４．７３６ ．８６６号に記載されるものが含まれ、これらの全内容を参照によりここに引用 するものとする。マイクロインジェクションを受けた卵から産まれた子孫マウス 、並びに普通に繁殖させたトランスジェニック動物の子供の分析は、ＤＮＡ抽出 およびトランスジーンの存在についてのＤＮＡのスロット・プロットハイブリダ イゼーションにより達成される（ＭｃＧｒａｎｅ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ 、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６３：１１４４３−１１４５１　（１９８８ ））。

アンチセンスＲＮＡは遺伝子治療法によってエイズ患者のリンパ球に導入するこ とができるかもしれない。例えば、ＨＩＶのノ（ッケージング配列に相補的なア ンチセンスＲＮＡをコードしかつ発現するＤＮＡ配列を含む複製欠損組換えレト ロウィルスベクターで骨髄細胞を処置することができる。この方法では、患者か ら骨髄細胞を取り出し、組換えレトロウィルスベクターで処置し、そしてベクタ ーのＤＮＡゲノムが染色体に組み込まれた細胞を、レトロウィルスベクターに組 み込まれた光視覚化マーカー（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）に基づ＜ ＦＡＣ３細胞選別により選択する。その後、これらのベクターを組み込んだ骨髄 細胞は、照射による他の骨髄細胞の除去後に、患者に再導入されよう。

その結果として、患者はＨＩＶパッケージング配列に対するアンチセンスＲＮＡ 配列をコードするリジンで球のみをもつことになり、ここに記載したトランスジ ーン・ツクマウスがＭ−ＭｕＬＶｉこ抵抗するように、エイズに対して抵抗する であろう。

商業動物の場合は、動物系列へのトランスジーンの導入力（最適きるとは思えな い。なぜなら、この治療法はあまり１こ複雑で、高ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６３：１４６２１；　１９８８）、あるｔ＋１４；！ 筋細胞へこれらの方法を使って、レトロウィルスのパッケージング配列に対して 誘導されたアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を動物に注入すること ができるだろう。これらの“ＤＮＡ注入”は、使用したＤＮＡデリバリ−システ ムが標的とした組織においてウィルス感染を防御するだろう。この方法は、アン チセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ分子、またはレセプター指向性リガンドに結 合させたＤＮＡ分子の注入を必要とするだけなので、動物とヒトの両方にとって 非常に魅力的である。この注入は１年に数回行う必要があるかもしれないが（例 えば、レトロウィルス疾患の発生が一定の地域で起こる場合）、必要な時にレト ロウィルス感染を防御するだろう。

アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡは、動物（ヒトを含む）がすでに感染し ているときに、あるいは予防手段として感染前に導入することができる。後者の 場合は、調節可能なプロモーターの使用が望ましい。

本発明について一般的に説明してきたが、本発明は、例示のためのものであって 本発明を限定するものではない以下の実施例を参照することにより、一層理解し やすくなるだろう。

（本頁以下余白） 実施例１．プラスミド びｐｃＰＰｓｉａｓを構築した。プラスミドｐＬＪ　（２１）をＳｍａＩて開裂 してＭ−ＭｕＬＶ配列を含む５４０ｂｐのＳｍａｌ断片を単離した。３’　Ｍ− ＭｕＬＶ　ＬＴＲ（２２）を含むプラスミドｐ３°　−ＬＴＲ−２をＳｍａ　Ｉ で線状となし、ＤＮＡリガーゼを用いてｐＬＪからの５４０ｂｐの断片に両方向 で融合した。

ＫｐｎＩ消化のパターンに基づいてアンチセンスの方向性をもつｐＬＰＰｓ工の クローンを選択した。ＣＭＶＩＥ　ＣＡＰのちょうど３°のＸｍａｌＩ［部位に 導入したｓｂｐのＢｇｌＩＩリンカ−をもつプラスミドｐ　ＣＭＶ　Ｉ　Ｅ−Ｂ ＧＨ（３０）をＢｇｌＩ［およびＳｍａ　Ｉで開裂し、ＣＭＶプロモーター、ｂ ＧＨポリ−Ａ付加部位およびテトラサイクリン耐性選択マーカーを含む５．４ｋ ｂの断片を単離した。この断片の”付着末端”をＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ 断片の存在下にデオキシヌクレオシド三リン酸（Ａ。

Ｔ、ＧおよびＣ）とともにインキュベートすることによって修復し、平滑末端を ｐＬＪからの５４０ｂｐのＳｍａＩ断片と両方向でライゲーションした。Ｋｐｎ ｌ消化パターンに基づいてアンチマウス受精卵の雄の前核にＤＮＡを直接マイク ロインジェクションすることによってトランスジェニックマウスを作製する方法 が文献に記載されている（２４）。マウス尾からのＤＮＡ抽出およびマイクロイ ンジェクションした卵から得られる子供のスロットプロットハイブリダイゼーシ ョン分析は文献記載の方法により行った（２５）。

実施例３．細胞培養 マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞をｌＯ％Ｎｕ−血清を含むダルベツコの改変イーグル培 地（ＤＭＥＭ）で維持した。修飾したＤＥＡＥデキストラン−ジメチルスルフオ キシドショック法（２６）を用いて、ｐＣＰＰｓ　ｉａｓ　（３６μｇ）および ｐｓＶ４０ｎｅｏ　（０，３６μｇ）（ＡＴＣＣ３３９６４）で同時形質転換す るこした。

実施例４．ＤＮＡおよびＲＮＡ分析並びに酵素アッセイトランスジェニックマウ スへのＤＮＡ配列の取り込みをサザン法（２７）により分析した。Ｆ　ｉｃｏ　 Ｉ　１−Ｈｙｐａｑｕｅグラジェント単離法（２９）を用いて、リンパ球からの ＲＮＡを１段階単離法（２日）で調製した。次いてＲＮＡを１．２％アガロース ／ホルムアルデヒドゲル中、７０Ｖで４．５時間電気泳動にかけ、文献記載の方 法（３０）でニトロセルロース紙に移してハイブリダイゼーションとラジオオー トグラフィーを行った。文献記載の方法（３Ｉ）で逆転写酵素アッセイを行った 。アンチセンスのＲＮＡ鎖を見分けるために、鎖特異的ＲＮＡプローブを用いて リンパ球ＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーションアッセイを行った。ＳＦ３　 ＲＮＡポリメラーゼおよび標識したグアノシン５°−三リン酸を用いて、センス の方向性で挿入した５４０ｂｐのＳｍａＩ　Ｐｓｉ配列含有断片を含むｐＳＰ６ ５ベクターからこのプローブを合成した（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ、、ＭａｄｉｓｏｎＷｉｓｃｏｎｓｉ ｎ）。

Ｍ−ＭｕＬＶ　ＬＴＲまたはサイトメガロウィルス即時型プロモーターの制御下 に逆方向でＭ−ＭｕＬＶパッケージング配列をＥｃｏＲＩ−ＣＩａＩ断片として それぞれ調製した。

これらの配列をマウス生殖細胞系列に導入するために、これらの断片をマウス受 精卵の前核に別々にマイクロインジェクションした（卵１個当たり２００から５ ００コピー）。次いでこれらの卵を偽妊娠した養い親である受容体マウスの卵管 に移植した。得られる子供が約１カ月になったときに、各動物の尾の切片を切り 取り、これからＤＮＡを調製した。トランスジェニックマウスはＤＮＡスロット プロットとサザントランスファーハイブリダイゼーションで検出した。２系列の トランスジェニックマウス（ＬＰ２．２ｋｂのＨｉｎｄＩ［Ｉ断片のマイクロイ ンジェクションによって得られた単一の創始マウスにまで出所がさかのぼり、ま たＣＰ３ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｃ１ａ！断片のマイクロインジェクションによって 得られた単一の創始マウスにまで出所がさかのぼる。

ＬＰＰｓｉａｓ創始者およびその子供からの尾部ＤＮＡ　（ｌ　Ｏμｇ）は５ａ ｃｌおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、またｃＰＰｓｉａｓ創始者およびその 子供のＤＮＡはＫｐｎｌで消化して次いで０．　８％アガロースゲル中、５０Ｖ で９時間電気泳動にかけた。ＤＮＡをサザン法（２７）によりニトロセルロース 紙に移し取った。インキュベーションの後、ニトロセルロース紙を、ＬＰＰｓｉ ａｓ　ＤＮＡについてはｐＢＲ３２２から調製したニックトランスレーションし たＤＮＡプローブ（５ｘｌＯ’から１０ｘｌｏ’ｃｐｍ／μｇ）（このプローブ は構築物中にｐＢＲ３２２配列が存在するのでＬＰＰｓｉユａＳ配列とハイブリ ダイズするが、動物中に存在する内在性レトロウィルス配列とは交差ハイブリダ イズをしない）と、またはＣＰＰ５ｉａｓ　ＤＮＡについてはｐＣＰＰｓユから の１．３ｋｂのＳａｃ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片とハイブリダイズさせた。洗浄およ び乾燥後、ニトロセルロースを一７０℃で１６時間Ｋｏｄａｋフィルムに露光す ることによりオートラジオグラフに付した。サザンプロットから、ＬＰＰｓｉａ ＳおよびＣＰＰΣ±ａＳマウスはいずれも、その染色体成分中に組み込まれた５ ４０ｂｐのアンチセンス配列を生産するための完全な転写単位をもっていること が明らかとなった。ＬＰＰｓｉａｓＤＮＡについては、各ＬＰＰｓｉａｓマウス によって示される１４７０ｂｐのハイブリダイズするＳａｃ　Ｉ−ＥｃｏＲ１断 片により適当な配列の存在が確認され、また各動物からのＣＰＰ５　ｉａＳマウ スＤＮＡが特徴のある４００ｂｐのハイブリダイズするＫｐｎＩ断片を示してい た。

実施例６．ＬＰＰｓｉａｓおよびＣＰＰ５ｊ工ａｓトランスジエニツクマウスに おけるアンチセンス旦Σ±　ＲＮＡの発現これら２系列のマウスに導入された転 写単位は、Ｍ−ＭｕＬＶのリンパ球標的組織内においてアンチセンスＲＮＡの転 写に対して適当な組織向性を与えるように構築された。ＬＰＰｓｉａｓマウス内 において、Ｍ−ＭｕＬＶ　ＬＴＲがらのＵ３Ｒプロモーター／エンハンサ−要素 およびＲＵ５ポリアデニル化シグナルを含む転写単位は、完全なＭ−ＭｕＬＶの 転写制御配列と実質的に同一であり、ウィルス複製部位においてアンチセンスＲ ＮＡを産生ずることが予期される。

サイトメガロウィルス即時型プロモーター（３２）およびウシ成長ホルモンポリ アデニル化シグナル（３３）を含むＣＰＰ５ｉａＳマウス内における転写制御単 位もまた、リンパ球組織向性を有すると予期される（３４）。これらのマウスの リンパ球組織内においてアンチセンスＭ−ＭｕＬＶ　ＲＮＡが産生されているこ とを確認するために、ＬＰＰΣｉａｓおよびＣＰＰ５±ａＳマウスから単離した リンパ球からのＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーション分析を行った。ＣＰＰ ５ｉａｓおよびＬＰＰｓｊａｓ７ウスのどちらから得られたＲＮＡも、ｌ−５ｘ ｌ　Ｏ’ｃｐｍ／μｇの比活性を有する、Ｍ−ＭｕＬＶアンチセンスＰｓ工配列 色配列的な鎖特異的ＲＮＡプローブとハイブリダイズした。すべてのれた７５０ ｂのハイブリダイズするＲＮＡによって、ＬＰＰｓ　ｉａＳおよびＣＰＰ５　ｉ 工ａｓトランスジェニックマウスの白血球中におけるＭ　−Ｍ　ｕ　Ｌ　Ｖのア ンチセンスＰｓｉ配列の産生を確認した。

ＬＰＰｓｉａｓマウスとＣＰＰ５ｉａｓマウスのアンチセンスＲＮＡで長さが異 なるのは、これら２系列のマウスに導入した遺伝子構築物が異なるためである。

ＣＰＰ５ｉａｓマウスはウシ成長ホルモン遺伝子からのエクソン５の小さい部分 およびウシ成長ホルモンポリＡ付加シグナルを含む遺伝子構築物を含み、その結 果より長いアンチセンスＲＮＡ産物が得られる。

寒旌ＰＪ６．アンチセンスＰｓユ　ＲＮＡを発現する細胞中でのＭ−ＭｕＬＶ複 製の阻害 修飾したＤＥＡＥ−デキストラン・ジメチル−スルフオキシドショック法（２６ ）を用いて、線状ｐＣＰＰｓ　ｉａｓ　（３６μｇ）およびｐｓＶ４０ｎｅｏ　 （０，３６μｇ）（ＡＴＣＣ３３６９４）てマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞を同時形質 転換することによって、アンチセンスＰｓｉ配列を発現する安定な細胞系を樹立 した。

Ｇ４１８ＤＭＥＭ培地中で安定な形質転換体を選択し、サザン法を用いて取り込 まれたＣＰＰ５ｉａｓ配列の存在を確認し、そしてノーザン分析を行ってクロー ン化細胞系によるアンチセンスＭ−ＭｕＬＶ　ＲＮＡ産生の存在を確認した。対 照マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣＰＰ５ｉａｓで形質転換した細胞系の両方を Ｍ−ＭｕＬＶ　（４ｘ　ｌ　Ｏ’ＰＦＵ／７５　ｃｍプレート）で２４時間感作 して、洗浄によりウィルスを除き、さらに４８時間培養し、０．４５μｍのフィ ルターで濾過して培地から細胞および細胞性物質を除き、ショ糖グラジェント遠 心法（３５）によって培地からウィルス粒子を濃縮した。フェノール−クロロホ ルム抽出法（３５）によってウィルスベレットからＲＮＡを調製し、Ｍ−ＭｕＬ Ｖウィルス特異的プローブとしてランダムプライマー標識したｐＣＰＰｓ±ａｓ からの５４０ｂｐのＳｍａｌ　ＤＮＡ断片（ｌｘｉ　Ｏ”−５ｘｌ　Ｏ＠ｃｐｍ ／μｇ）を用いて、ノーザン分析によってＭ−ＭｕＬＶゲノムＲＮＡの存在を検 出した。Ｍ−ＭｕＬＶて感作した後アンチセンスＰｓｉ　ＲＮＡを発現するＮＩ Ｈ３Ｔ３細胞からはウィルスＲＮＡが産生されなかったが、Ｍ−ＭｕＬＶで感作 した対照ＮＩＨ３Ｔ３細胞からはかなりの量のウィルスゲノムＲＮＡ　（８，３ ｋｂ）が産生された。

Ｍ−ＭｕＬＶを感染させた後のアンチセンスＰｓｉ　ＲＮＡを発現する安定な細 胞系から得た上清中の逆転写酵素活性を測定して、Ｍ−ＭｕＬＶを感染させた正 常マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞と比較した（３１）。この同じ上清にはウィルスゲノ ムＲＮＡが欠けていることが示されたが、かなりの逆転写酵素活性が観察された （表■参照）。

実施例７．アンチセンスＰｓｉ　ＲＮＡを発現するトランスジェニックマウスに おける白血病の抑制 アンチセンスＰｓｉ）ランスジェニックマウスにおけるＭ−ＭｕＬＶ誘導白血病 の抑制レベルを試験するために、同腹の子の対照およびトランスジェニックマウ スを誕生時にＭ−ＭｕＬＶで感作した。トランスジェニック雄ＬＰｓ±ａＳおよ びＣＰｓｉ工ａＳマウス（Ｃ５７Ｂ６およびＳＪＬのＦ１ハイブリッド）を非ト ランスジェニック（Ｃ５７Ｂ６／５ＪＬ）雌と交配した。それぞれの交配から得 られた各子供に、誕生後数時間以内に１ｘｌＯ５Ｍ−ＭｕＬＶ伝染性ウィルス粒 子を含む０．１ｍｌを腹腔的注射した。４週齢に達したとき、各子マウスの尾部 からのＤＮＡサンプルをスロットプロットハイブリダイゼーションによって分析 し、各マウスの耳にトランスジェニックまたは非トランスジェニックの子供であ ることを示す印を付けた。ｌ　２−１４週齢に達したときに、トランスジェニッ クマウスおよび対照マウスを殺して、白血病の症状を示しているかをアッセイし た。以下の３つの基準二０．５ｇ以上の膵臓重量、３５％以下のへマドクリット 値およびギムザ染色したリンパ球における典型的白血病形態を示していればマウ スを白血病と判断した（３６）。典型的白血病の形態においては、赤血球（ＲＢ 　Ｃ）の数が激減し、ＲＢＣの形が異常であり、リンパ球細胞の数と大きさが顕 著に増加し、またリンパ球の形が悪性の外観を呈するように変化する。正常な血 液細胞の形態では、細胞の大部分が赤血球細胞であり、赤血球細胞は円形で滑ら かに見える。典型的なスライドでは１個または２個のリンパ球が見られるのみで ある。表■に各トランスジェニックマウスおよび対照マウスのデータを示す。対 照マウスのかなりの割合（３３くの対照マウスが明らかに重度の障害をもってお り、０．５ｇ以上の膵臓重量を含む典型的白血病のリンパ球形態を示し、幾つか のマウスでは１．０ｇ以上の膵臓を有していた（図６）が、アンチセンスＰｓｉ ）ランスジェニックマウスはいずれも殺す前には異常であるようには見えず、肥 大した膵臓、低いヘマトクリット値または白血病のリンパ球形態を示さなかった 。対照マウスとトランスジェニックマウスとの膵臓重量の差は２２倍もの大きさ となった（＃　１３／＃　１７）。

したがって、パッケージングの阻害は、ウィルスで感作した後も対照マウスとは 対照的に、正常な血液細胞の形態の保持、正常な膵臓重量および正常なヘマトク リット値をもたらす結果となった。

表■に示すデータは、アンチセンスＲＮＡを産生ずるマウスにおいてＭ−ＭｕＬ Ｖ複製依存性である白血病の開始の強い阻害を明らかに示唆している。これらの マウスで産生されるアンチセンスＲＮＡはＭ　−Ｍ　ｕ　Ｌ　Ｖパッケージング 配列に相補的な配列を含むだけで、コード配列（２１）に相補的な配列を含まな いので、ウィルス復製における阻害部位はパッケージング段階であると結論され る。Ｐｓｉ工配列配列補的なＲＮＡは、Ｐｓｉ工とキャプシドタンパク質問の相 互作用との競合において非常に効果的であるようだ。

実施例８．ＰｓｉエアンチセンスＲＮＡを発現する細胞中におけるｉｎ　Ｖｉｔ ｒＯでの生産的ウィルス感染の抑制を発現する安定な細胞系を作製してＭ−Ｍｕ ＬＶで感作した。対照細胞は、細胞上清から得られたＲＮＡ調製物中にかなりの 量のＭ−ＭｕＬＶウィルスＲＮＡを示したが、アンチセンスＰｓｉＲＮＡを発現 する細胞系から得られた上清はＭ−ＭｕＬＶゲノムウィルスＲＮＡを欠いており 、このことはこれらの細胞がパッケージされたウィルスＲＮＡを含む機能的ウィ ルスを生産できないことを示唆する。細胞上清中にはウィルスＲＮＡが含まれな いにもかかわらず、高感度の逆転写酵素アッセイ（３１）を用いるとかなりの逆 転写酵素活性が測定され（表■）、このことはパッケージング過程でアンチセン スによる阻止があるために、アンチセごとを示唆している。

実施例９．エイズ治療においてＨＩＶ−１のパッケージング配列に相補的なアン チセンス配列を使用することの可能性ＨＴＶ−１、単離物ＥＬＩのパッケージン グ配列は塩基２００−３４０に位置する。このウィルスの塩基２８０−３３０と Ｍ−Ｍ　ｕ　Ｌ　Ｖウィルスのパッケージング配列の間には有意の相同性が存在 する。塩基対２８０−３３０の間のＨＩＶ−１領域のパッケージング配列（ＨＩ Ｖ−１、単離物ＥＬＩのプロウィルスゲノム中にある）と相補的なオリゴヌクレ オチドを標準法により合成する。このようなオリゴヌクレオチドのうちで最長の ものは長さが５０塩基であり、２８０−３３０の全配列と相補的である。これと は別に、既知の方法で天然型モノヌクレオシドのメチルホスホネート類似体を含 む５０塩基のオリゴヌクレオチドを合成する。

天然または類似体ヌクレオチドのいずれかをもつこれらのアンチセンスオリゴヌ クレオチドを約５００ｍｇからｌＯｇの投与量でエイズ患者に数週間、毎日静脈 内注射する。

実施例ＩＯ，ウシ白血病の治療においてウシ白血病ウィルスのパッケージング配 列に相補的なアンチセンス配列を使用することの可能性 塩基対３４１−４１７の間のウシ白血病ウィルス（ＢＬＶ）のパッケージング配 列と相補的なオリゴヌクレオチドを標準法により合成する。このようなオリゴヌ クレオチドのうちで最長のものは長さが５０塩基であり、３５５−４０５の配列 と相補的である。

これとは別に、天然型モノヌクレオシドのメチルホスホネ−１・類似体を含む２ 塩基のオリゴヌクレオチドを既知の方法により合成する。

天然または類似体ヌクレオチドのいずれかをもつこれらのアンチセンスオリゴヌ クレオチドを約５００ｍｇから１００ｇの投与量でウシ白血病ウィルスに感染し たウシに静脈内注射する。

実施例１１．Ｍ○−ＭＬＶに対する各種アンチセンス分子の急性阻害効果を比較 するプラークアッセイ Ｍｏ−ＭＬＶのパッケージング配列ψ＋（６９−１０６）およびψ（２１６−５ ７０）に対する各種アンチセンス分子（３０ｍｅｒ、３８ｍｅｒ、４０ｍｅｒ、 ５０ｍｅｒおよび６０ｍｅ　ｒ）の相対阻害効果を測定するためにプラークアッ セイを行った。これらの分子の標的配列は以下の通りである：３８ｍｅｒ：Ｕ５ 領域の５゛側の半分に位置する塩基６９から塩基１０６まで ６０ｍｅ　ｒ　：塩基２１６から塩基２７５まで５０ｍｅ　ｒ　：塩基３０１か ら塩基３５０まで４０ｍｅ　ｒ　＋塩基４２９から塩基４６８まで３０ｍｅ　ｒ 　：塩基５４１から塩基５７０まで［上記の塩基位置はシニックら（Ｓｈｉｎｎ ｉｃｋ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２９３：５４３−５４８（１９８１） ）のウィルスゲノムＲＮＡ配列に基づいている。］ププラーク内容物は一般にク レメントら（Ｋｌｅｍｅｎｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ。

Ｎ、Ａ、Ｓ、　１３ニア５３−５８（１９６９））およびロウエ（Ｒｏｗｅ　ｅ ｔ　ａｌ、、　ＶｉｒｏｌｏｇＹ、　４２：１１３６−３９（１９７０））の方 法により実施した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は６ウエルのプレートに播いた。翌日、１ ＋ｎｌの１ｘｌＯ’ＰＦＵ／ウエルて、Ｍｏ−ＭＬＶ感染させた。５−６日後、 細胞にＵＶを３０−４５秒照射してその成長を制限し、次いで０．５ｘ１０５細 胞／ウエルでＮＩＨ３Ｔ３細胞の上にＸＣ細胞を置いた。

３−４日後に、細胞を２ｍ１／ウエルのメタノールで固定しく１分）、ｌ　ｍ　 ｌ　／ウェルのヘマトキンリンで染色した（３０４分）。

プラークを解剖用顕微鏡で低倍率で計数した。結果を図４に示す。

異なるオリゴヌクレオチドを用いるウィルスプラークアッセイの結果は５０ｍｅ 　ｒのオリゴヌクレオチドが最良の阻害効果を有することを示した。これは対照 と比較して、５０ｍｅ　ｒのオリゴヌクレオチドがプラーク数を６−７倍減少さ せたことを意味する。

５０ｍｅ　ｒ配列（ＲＮＡ　３００ｂ−３５０ｂ；３’ＧＡＣＡＴＡＧＡＣＣＧ ＣＣＴＧ　ＧＧＣＡＣＣＡＣＣＴ　ＴＧＡＣＴ　ＧＣＴＣＡ　ＡＧＣＣＴ　ＴＧ ＴＧＧ　ＧＣＣＧＧ　５’）（配列番号＝５）はＭｏ−ＭｕＬＶパッケージング 配列のコアと相補的な配列を含む。重要なことに、これはまた、ＨＩ　Ｖ−１パ ツケ一ジング配列のコア部分（１９ｂｐ）と相補的な配列を含む。

同様な方法でセンス鎖を用いても何ら効果はなく、したがって明らかにアンチセ ンス配列が関与していることを示している。

図４の３日目で、対照細胞では約７倍のプラーク数があり、５０ｍｅ　ｒで処理 した細胞ではウィルス阻害を明瞭に示していることに注意されたい。細胞ヌクレ アーゼによって徐々に分解されるアンチセンス分子でただ１度だけ細胞を処理し たときには、プラーク内容物が後に収束することが予期される。ヌクレアーゼ耐 性の類似体を使用するか、またはアンチセンス分子を追加投与して補充するか、 あるいはアンチセンス分子の細胞内発現を提供することによってこの問題は解決 されるであろう。

トリ赤芽球症ウィルス ニワトリ白血病ウィルス（またはリンパ球白血病ウィルス）トリ骨髄芽球症ウイ ルス ヒビ内在性ウィルス ウシ白血病ウィルス ウシシンシチウムウイルス ヤギ脳炎−関節炎ウィルス（またはヤギ白質脳炎ウィルス）トリ骨髄球症ウイル ス アカダイショウレトロウイルスチキンシンシチウムウイルスアヒル伝染性貧血ウ ィルス シカ腎臓ウィルス ウマ皮膚線維肉腫ウィルス ウマ伝染性貧血ウィルス エソンユ（Ｅｓｈ）肉腫ウィルス ネコ白血病ウィルス ネコ肉腫ウィルス ネコンンシチウム形成ウイルス フジナミ（Ｆｕ　ｊ　ｉｎａｍｉ）肉腫ウィルスギボン類人猿白血病ウィルス（ またはサルリンノく腫つィルス、またはサル骨髄性白血病ウィルス） キンケイ（Ｇｏｌｄｅｎ　Ｐｈｅａｓａｎｔ）ウィルスリンパ球増殖疾患ウィル ス 骨髄芽球症関連ウィルス 骨髄球症ウィルス ミンク細胞フォーカス誘導ウィルス 骨髄球症ウィルス１３ ミンク白血病ウィルス ネコ白血病ウィルス マウス乳癌ウィルス メイソンーファイザ−（Ｍａｓｏｎ−Ｐｆ　１ｚｅｒ）サルウイルス ネコ肉腫ウィルス 骨髄性白血病ウィルス 骨髄球症ウィルス 進行性肺炎ウィルス ラット白血病ウィルス ラット肉腫ウィルス ラウス（Ｒｏｕｓ）関連ウィルス０ ラウス関連ウイルス６０ ラウス関連ウィルス６１ 細網内皮症関連ウィルス 細網内皮症ウィルス 細網内皮症ウィルス−形質転換体 キジ（Ｒｉｎｇ−Ｎｅｃｋｅｄ　Ｐｈｅａｓａｎｔ）ウィルスラウス肉腫ウィル ス サルフォーミー（Ｆｏａｍｙ）ウィルス膵臓フォーカス形成ウィルス リスザルレトロウィルス 膵臓壊死ウィルス ヒツジ肺腺疾患／がん腫ウィルス サル肉腫関連ウィルス（またはラボトリック属すル（Ｗｏｏｌｌｙ　Ｍｏ　ｎ　 ｋ　ｅ　ｙ）白血病ウィルス）サル肉腫ウィルス（またはラボトリック属すルウ ィルス）表■ 逆転写酵素（ＲＴ）アッセイ 感染ウィルス ｌＯＯとした） 表■ モロニーネズミ白血病ウィルスで感染した対照マウスとアンチセンスＷトランス ジェニックマウスにおける白血病の頻度２　なし　３３％　０．２５　＋ ３　なし　４９％　０．１５ ４　なし　４６％　０＋１６　− ５　なし　４３％　０．１３ ６　なし　３５％　０．６３　４＋４　１７　なし　３５％　０．１８　＋ ８　なし　４２％　０．１３ ９會　なし　−−−１，０２＋＋＋　１１０　なし　１０％　１−３２　＋＋＋ ＋　１１１　なし　４９％　０．１２ １２　なし　４６％　０．０８ １３　なし　３０％　１７６　＋＋＋＋　−１８なし　４８％　０．１１ １９　なし　４９％　０．１８ ２２　なし　ｓｏｓ　ｏ、ｏａ ２３會　なし　−−−０，５１÷命中　−２４１１なし　−−−０，８６＋−＋ ＋　／２９　なし　３９％　０．１４　土 ３１すし　４２％　０．１３ ３５　なし　３５％　１．０５　＋＋＋＋　１３６　なし　４２％　０．１３　 土 ３７　なし　４７％　０．１１　− ３８　なし　４７％　０．１１　− ３９　なし　４２％　０．１１ ４０　なし　３１％　０．８７　＋＋＋＋　Ｉ４１　なし　２１％　０．７７　 ＋←◆　Ｉ４３　なし　４８％　０．１３ ４５　なし　５２％　０．１２ ４８　なし　４１％　０．１１ ４９　なし　４９％　０．１８ ５２　なし　２０％　０．９７　＋＋＋＋Ｉ６０　なし　４８％　０．１１ １４　なし　４５％　０．１５ ｉｓ　Ｃｌ軸１　４６％　０．１３ １６　０１ａｓ　５４％　０．０９ １７　ＣＷａｇ　４５％　０．０８ ２０　ＣＷａｓ　４８％　０．１１ ２１　Ｃｌ軸１　４７％　０．１１ ２５　Ｇ軸ｓ　５５％　０．１５ ２６　ＣＷ　ａ　ｓ　４６％　０．１２　−２７　ＣＷａｓ　４９％　０．１０ ２８　ＣＷａｓ　４４％　０．１０ ３０　ＣＷａｓ　４３％　０．１４ ３４　ＣＳ軸ＩＩ　４８％　０．１２ ４２　ＣＷａｓ　４９％　０．１４ ４６　ＬＷａｓ　４２％　０．１７ ４７　Ｌ％４ｍｓ　４６％　０．２５ ５０　ＬＷａｓ　４９％　０．１９ ５１　Ｌ淘１　４８％　０．１８ ５３　ＬＷａｓ　４Ｂ％　０．１７ ５４　ＬＷａｓ　５０％　０．１２ ５５　ＬＷａｓ　４９％　０．１９ ５６　ＬＷａｇ　４９％　０．１６　−５７　ＬＷａｓ　４０％　０．０９ ５９　Ｌ％４ａｍ　４９％　Ｑ、Ｌ３　−６１　Ｌｈｉａｔ、　４６％　０．０ ９　−６２　ＬＷａｇ　４４％　０．１２ ６３　ＬＷａｌｌ　５１％　Ｏ，１４ 表■ パッケージング配列の表 以下の各文献は報告されているゲノム配列一般につ（１ての文献と該ゲノム中の パッケージング配列の位置についての文献を含む。

■、細網内皮症ウィルス（Ｒｅｖ） ゲノム：Ｗｉｌｈｅｌｍｓｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５２： １７２−１８２（１９８４）。

塩基１−３　Ｌ　４９　；　Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎｔｕｒ ｅ　２８５：５５０−５５４（１９８０）。塩基３１５０−３６０７、ノくツケ ージング配列（ψ）＝プロウィルスの５１末端に対して０．６７６ｋｂｐのＫｐ ｎ　Ｉ部位と０．８２０ｋｂｐＯ間の１４４塩基。

Ｊ、　Ｅｍｂｒｅｔｓｏｎ　ａｎｄ　Ｈ，Ｔｅｍ１ｎ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　 ６１（９）：２Ｂ７５−２６８３（１９８７）。

２、ヒト免疫不全ウィルスｌ型（ＨＩＶ−１）３、モロニーネズミ白血病ウィル ス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）ライス部位とＡＵＧ部位の間の３５０ヌクレオチド。ｌ、 　１ａｎｎ。

存在。Ｊ、　Ｍｕｒｐｈｙ　ａｎｄ　Ｓ、　Ｇｏｆｆ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　 ６３（１）＋３１９−３２７（１９８９）。

４、トリ肉腫ウィルス（Ａ　Ｓ　Ｖ） １）末端から３００と６００塩基の間の１５０塩基。Ｐ、　５ｈａｎｋａｎｄ　 Ｍ、　Ｌｉｎ１ａ１．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　３６（２）：４５０−４５６（１ ９８０）。

５、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳ　Ｖ） ６、ウシ白血病ウィルス（ＢＬＶ） １−４６８０；　Ｓｅｇａｔａ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　８２：６７７−６８１゜１９８５、完全ＢＬＶプロウィルス 。パツケーシング配列：本発明者らはそれが約塩基３４０のプライマー結合部位 の末端と約塩基４１−８のｇａｇの開始コドンの間に存在すると予測している。

文献 １、　＊ｅｉｓｓ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、　（編集）　、ＲＮＡ腫瘍ウィルス、” 　Ｍｏ１ｅｃｕｆａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ” 、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｊｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔ（ａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、、　１９８４２、　Ｃｏｂｒｉ ｎｉｋ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９Ｂ？、トリ肉腫および白血病ウィルスル ミｌ−タンデム・ロング・ターミナル・リピート結合部の制限酵素認識：開裂に 必要な最小部位はウィルスの成長にも必要である、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１： １９９９．２００８゜３、　Ｂａｒｋｌｉｓ、　Ｅ、、　Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇ ａｎ、　ａｎｄ　Ｒ，Ｊａｅｎｉｓｃｈ、　１９８６、染色体の位置またはウィ ルス突然変異が胚期がん腫細胞におけるレトロウィルス発現を許容する、Ｃｅ１ ｌ　４７：３９１−３９９４、　Ｍａｎｎ、　Ｒａｎｄ　Ｄ、　Ｂａｌｔｉｍｏ ｒｅ、　１９８５、レトロウィルスパッケージング配列の位置の変更が非スプラ イスおよびスプライスＲＮＡ双方のキャプシド化をもたらす、Ｊ、　Ｖ’ｒｒｏ １．５４：４０１−４０７５、　Ｖａｒｍｕｓ、　Ｈ，１９８７、逆転写、Ｓｃ ｉ、　Ａｍｅｒ、　５６−６４６、　Ｃｏｎｅ、　Ｒ，Ｄ、、　Ａ、　Ｗｅｂｅ ｒ−Ｂｅｎａｒｏｕｓ、　Ｄ、　Ｂａｏｒｔｏ　ａｎｄ　Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇ ａｎ、　１９８７、伝播性レトロウィルスベクターによってコードされる完全ヒ トβ−グロビン遺伝子の制御された発現、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　７ ：８８７−８９７ ７、　Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ、　Ｄ、　１９８７．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ ｏｌｏｇｙ；　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、　Ｊｏｎｅｓ　ａｎｄ 　Ｂａｒｔｌｅｔｔ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｂｏｓｔｏｎ　Ｐ ｏｒｔａｌａ　Ｖａｌｌｅｙ、　２ｎｄ　ｅｄ。

８、　Ｔｅｍ１ｎ、　Ｈ，Ｍ、、　１９７２、ＲＮＡ指示によるＤＮＡ合成、Ｓ ｃｉ、　Ａ９、　Ｇ１１ｂｏａ、　Ｅ、、　Ｓ、Ｗ、　Ｍｉｔｒａ、　Ｓ、　Ｇ ａｆｆ　ａｎｄ　Ｄ、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　１９７９、逆転写の詳細なモデ ルおよび決定的な面における試験、Ｃｅ１１１８：９３−１００ １０、　Ｃｏｎ１ｅ、　Ｒ，ａｎｄ　Ｒ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　１９８４、哺乳 動物細胞への効率のよい遺伝子導入：広範囲な哺乳動物宿主域をもつヘルパーの ない組換えレトロウィルスの形成、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ。

ＵＳＡ　８１：６３４９−６３５３ １　］　、　Ｍａｎｎ、　Ｒ，、Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ　ａｎｄ　Ｄ、　Ｂ ａｌｔｉｍｏｒｅ、１９８３、レトロウィルスパッケージング突然変異体の構築 およびこれを用いるヘルパーのない欠損レトロウィルスの形成、Ｃｅ１ｌ　３３ ：１５３−１５１２、５ｈａｎｋ、　Ｐ、Ｒ，ａｎｄ　Ｍ、　Ｌｉｎｊａｌ、　 １９８０、ゲノムＲＮＡが欠失しているトリがんウィルス突然変異体（ＳＥ２１ ０１ｂ）：プロウィルスにおける欠失の特徴、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　３６：４５ ０−４５６１３、　Ｂｅｎｄｅｒ、　Ｍ、Ａ、、　Ｔ、Ｄ、　Ｐａｌｍｅｒ、　 Ｒ，Ｅ、　Ｇｅ１ｉｎａｓ　ａｎｄ　Ａ、Ｄ、　Ｍｉｌｌｅｒ、　＋９８７、ｍ モロニーネズミ白血病ウィルスのパッケージングシグナルがｇａｇ領域まで伸長 していることに関する証拠、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１：６３９−１６４６１４ 　、　Ｗｅｔｎｔｒａｕｂ、　Ｈ，、Ｊ、Ｇ、　Ｉｚａｎｊ　ａｎｄ　Ｒ，Ｍ、 　Ｈａｒｌａｎｄ、　１９８５、遺伝子分析のための分子的道具としてのアンチ センスＲＮＡ５Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１：２２−２５１５、 　Ｔｒａｖｅｒｓ、　Ａ、、　１９８４、アンチセンスＲＮＡによる制御、Ｎａ ｔｕｒｅ　３１１：４１６ １６、Ｉｚａｎｔ、　Ｊ、Ｇ、　ａｎｄ　Ｈ，Ｗｅｉｎｔｒａｎｂ、　１９８５ 、アンチセンスＲＮＡによる外因性および内因性遺伝子の構成的および条件的抑 制、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９二３４５−３５２］　７．　Ｉｎｏｕｙｅ、　Ｍ、 、　１９８８、アンチセンスＲＮＡ　：その機能と遺伝子制御への応用−総説、 Ｇｅｎｅ　７２：２５−３４１８、Ｙｏｋｏｙａｍａ、　Ｋ、　ａｎｄ　Ｆ、　 Ｉｎ＋ａｍｏｔｏ、　１９８７、アンチセンスＲＮＡによる内因性ＭＹＣがん原 遺伝子の転写制御、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８４ニア３６３−７３６７１９　、　Ｍｉｚ ｕｍｏ、　Ｔ、、　Ｍ、Ｙ、　Ｃｈｏｕ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｉｎｏｕｙｅ、　１９ ８４、遺伝子発現を制御する独特のメカニズム：相補的ＲＮＡ転写物（ｍｉｃＲ ＮＡ）による転写阻害、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩ ＳＡ　８１：１９２０、Ｃｈａｎｇ、　Ｌ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｃ，Ｍ、　５ｔｏｌ ｔｚｆｕｓ、　１９８７、アンチセンスＲＮＡのラウス肉腫ウィルス複製の阻害 、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１：９２１−９２４２１　、　Ｋｏｒｍａｎ、　Ａ、 Ｊ、、　Ｊ、Ｄ、　Ｆｒａｎｔｚ、　Ｊ、Ｌ、　Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ　ａｎｄ 　Ｒ，Ｃ。

Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　１９８７、レトロウィルスベクターを用いるヒトクラスＩ Ｉ主要組織適合性複合体抗原の発現、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＬＩＳＡ　８４：２１５０−２１５４．２７２２、　Ｈａｙｅｓ、　１ ９８９、博士論文、オハイオ大学２３、　Ｐａ５ｌｅａｕ、　Ｆ、、　Ｍ、Ｊ、 　Ｔｏｃｃｉ、　Ｆ、　Ｌｅｕｎｇ　ａｎｄ　Ｊ、Ｊ、　Ｋｏｐｃｈｉｃｋ。

１９８５、ラウス肉腫ウィルスのロング・ターミナル・リピートまたはサイトメ ガロウィルス即時型プロモーターによって指示される真核細胞における成長ホル モン遺伝子の発現、Ｇｅｎｅ　３８：２４、　Ｖｌａｇｎｅｒ、　Ｔ、、　Ｐ、 　Ｈｏｐｐｅ、　Ｊ、　Ｊｏｌｌｉｃｋ、　Ｄ、　５ｃｈｏｌｌ、　Ｒ，Ｈｏｄ ｉｎｋａ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｇａｕｌｔ、　１９８１、ウサギＢグロブリン遺伝子 の接合子へのマイクロインジェクションおよび成体ラットならびにその子孫にお ける該遺伝子のその後の発現、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 ＵＳＡ　７８：６３７６−６３８０２５．　ＭｃＧｒａｎｅ、Ｍ、、Ｊ、ｄｅ　 Ｖｅｎｔｅ、Ｊ、Ｙｕｎ、Ｊ、Ｂｌｏｏｍ、Ｅ、Ｐａｒｋｓ。

Ａ、Ｗｙｎｓｈａｗ−Ｂｏｒｉｓ、Ｔ、Ｗａｇｎｅｒ、Ｆ、Ｒｏｔｔｍａｎ、Ｒ ，Ｈａｎｓｏｎ、１９８８、トランスジェニックマウスにおけるキメラ・ホスホ エノールピルビン酸カルボキシキナーゼ／ウシ成長ホルモン遺伝子の組織特異的 発現および食物制御、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６３：１１４４３−１ １４５１２６、　Ｌｏｐａｔａ、　Ｍ、Ａ、、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　Ｄ、Ｗ 、　ａｎｄ　５ｏｌｌｎｅｒ−Ｗｅｂｂ、　Ｂ、。

１９８４、グリセロールシコック処理またはジメチルスルフオキシドを伴うＤＥ ＡＥ−デキストラン媒介性ＤＮＡトランスフェクションによるクロラムフェニコ ールアセチルトランスフェラーゼの高レベル過渡的発現、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、　１２：５７０５−５７１７２７、５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、Ｍ、 、　１９７５、ゲル電気泳動によって分離されたＤＮＡ断片中の特異配列の検出 、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９８：５０３−５０７２８、　Ｃｈｏｍｃｚｙ ｎｓｋｉ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｎ、　５ａｃｃｈｉ、　１９８７、アンラドグアニ ジンチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出によるＲＮＡの１段階単離 法、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６２：１５６−１５９２９、　Ｂａ５ｉ ｎ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｋ、　Ｐｓｈｙｋ、　１９７２、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａ ｑｕｅ上で単核細胞を分離した後の混合白血球培養における反応性の増加、Ｔｒ ａｎｓｐｌａｎｔ、　Ｐｒｏｃ、　４：１６３−１６４３０、　Ｔｈｏｍａｓ、 　Ｐ、、　１９８０、変性ＲＮＡおよびニトロセルロースに移し取ったＤＮＡ小 断片のハイブリダイゼーション、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＬＩＳＡ　７７：５２０１−５２０５３１　、　Ｇａｆｆ、　Ｓ、、　Ｐ、 　Ｔｒａｋｔｍａｎ　ａｎｄ　Ｄ、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、１９８１．モロニー ネズミ白血病ウィルス突然変異体の単離および性質：ウィルス逆転写酵素放出の 迅速なアッセイの使用、Ｊ、　Ｖｊｒｏｌ、　３８：２３９３２、　Ｓｔｅｉｎ ｂｅｒｇ、　Ｒ，Ｍ、、　Ｄ、Ｒ，Ｔｈｏｍｓｅｎ　ａｎｄ　Ｍ、Ｆ、　５ｔｉ ｎｓｋｉ、　１９８４、ヒトサイトメガロウィルスの主要即時型遺伝子の構造分 析、Ｊ。

ＶｉｒｏＬ　４９：ｌ９Ｏ−１９９ ３３、Ｇｏｏｄｗｉｎ、　Ｂ、Ｃ，ａｎｄ　Ｆ、Ｍ、　Ｒｏｔｔｍａｎ、　１９ ８６、最小ウシ成長ホルモンボリアデモル化シグナルの特徴、Ｊ、　ＣｅＩＩ　 Ｂｉｏｃｈｅｍ、前出、ｌＯ：１７０ ３４、　Ｒｏｉｚｍａｎ、　Ｂ、　（編集）、′サイトメガロウィルスの生物学 ″　：Ｔｈｅ　Ｈｅｒｐｅｓ　Ｖｉｒｕｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｐｌｅｎｕ ｍ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８３３５、５ｈｊｅｌｄｓ、　Ａ、、　Ｗｉｔｔｅ、　 ０．Ｎ、、　Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ、　Ｒ，ａｎｄ　Ｂａｌｔｉｍ。

ｒｅ、　Ｄ、、　１９７８、クローン感染におけるモロニーネズミ白血病の異常 発現の頻度、Ｃｅ１ｌ　１４：６０１−６０９３６、　Ｒｕ５ｃｅｔｔｉ、　Ｓ 、、　Ｌ、　Ｄａｖｉｓ、　Ｊ、　Ｆｅ１ｌｄ　ａｎｄ　Ａ、　０１ｉｆｆ、　 １９８１゜フレンドネズミ白血病ウィルスによって誘導された白血病はミンク細 胞フォーカス誘導ウィルスの形成と関連があり、内在性ミンク細胞フォーカス誘 導ゼノトロビックウイルスエンベローブ遺伝子を発現するマウス内で阻止される 、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５４：９０７−　９２０ ３７　、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｃ，Ｃ，、Ｏ，Ｐ、　Ｔｓｌｏ　Ｐａｕｌ　ａｎｄ　 Ｐ、Ｓ、　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３：２７８７−２７９１（１９８ ６）　（アンチウィルス研究において用いる相補的オリゴヌクレオチド法）３８ 、　Ｒｕｄｅｎ、　Ｔ、　ａｎｄ　Ｅ、　Ｇ１１ｂｏａ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、 　６３：６７７−６８２（１９８９）本明細書に引用された文献はすべて、特別 に取り込まれたが否かにかかわらず、参照として本明細書に包含される。

本発明を特定の態様と関連させて記載してきたが、さらなる修飾が可能なことが 理解されるであろう。本出願は本発明の原理に一般的に従うすべての変更、用途 または応用を含み、また本発明の開示しないものであっても、本発明の属する分 野で既知の、または慣用の方法によって達成できるもの、あるいは付属の請求の 範囲に記載する本質的な特徴に応用できるものを含む。

Ｍ−ＭｕＬＶ　配列（一部） ＡＡＣＬＩＧＡＣＧＡＧｔＪＵＣＧＧＡＡＣＡＣＣ口ＧＧＣＣＧＧＡＡＣＣＣＵ ＧＧＣｉＡＧＡＣＧＩＪＣＣＣＡＣｉＧＧＡＣｕｌＪＣＧＧＧＧＧＣＣＣＵＩＪ ＩＪＵｔＪＧＵＧＧＣＣＣＧＡＣＣＩＪＧＡＧＵＣＣＡＡＡＡＡＬＩＣＣＣＧＡ ＬＩＣ（ｉＬＩＬＩＬＩＬhＧＧ くｒ ＨＩＶパッケージング配列： ＡＡＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣＬＩＣＬＩＣＵＣＧＡＣＧＣＡＧＧＡＣＬＪＣＧＧＣ ＬＪＬ！ＧＣＵＧＡＳ、Ｄ。

ψ　５０ｍａｒと相同 ＡＧＡＬＩＧＧＧＬＩＧＣＧＡＧＡＧＡＧＣＧｅｔ −一−◆ｑａｃｔ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ　６１　Ｋ　４８１０ ０　８３１４−４ＣＣ１２Ｎ　５／１０ Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．本質的にレトロウイルスのパッケージング配列にのみ実質的な相同を有し、 それにより細胞中でレトロウイルスＲＮＡのビリオン粒子へのパッケージングを 阻止することができる、アンチセンス核酸分子。 核酸がＲＮＡである、請求項１記載のアンチセンス核酸分子。 核酸がＤＮＡである、請求項１記載のアンチセンス核酸分子。 核酸が１個以上の自然界に存在しないヌクレオシドおよび／またはヌクレオシド 間結合の存在により特徴づけられるＤＮＡまたはＲＮＡの自然界に存在しない類 似体である、請求項１記載のアンチセンス核酸分子。 ５．核酸が１個以上のメチルホスホネートを含む、請求項１記載のアンチセンス 核酸分子。 ６．１００塩基未満の長さを有する、請求項１記載のアンチセンス核酸分子。 ７．細網内皮症ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型、モロニーネズミ白血病ウ イルス、トリ肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、およびウシ白血病ウイルスよ り成る群から選ばれるレトロウイルスのパッケージング配列の少なくとも一部に 実質的に相補的である、請求項１記載のアンチセンス核酸分子。 ８．請求項２に記載のアンチセンスＲＮＡ分子に転写可能なＤＮＡ配列を含む組 換えＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ配列が適当な宿主細胞内でその転写を支配す ることのできるプロモーターに機能しうる状態で連結されている、上記組換えＤ ＮＡ分子。 ９．前記プロモーターがネズミモロニー白血病ウイルスのＬＴＲから誘導される 、請求項８記載の組換えＤＮＡ分子。 １０．前記プロモーターがサイトメガロウイルスの即時型領域（ｉｍｍｅｄｉａ ｔｅ　ｅａｒｌｙ　ｒｅｇｉｏｎ）から誘導される、請求項８記載の組換えＤＮ Ａ分子。 １１．請求項８記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクション された宿主細胞。 １２．アンチセンスＲＮＡ分子が宿主細胞の必須ヌクレオチド配列のどれとも本 質的にハイブリダイズしない、請求項１１記載の宿主細胞。 １３．レトロウイルスによる生産的感染に対する抵抗性を細胞に付与する方法で あって、本質的にレトロウイルスのパッケージング配列にのみハイブリダイズし 、その結果レトロウイルスのゲノムＲＮＡのパッケージングを阻止する請求項２ に記載のアンチセンスＲＮＡ分子に転写可能な、プロモーターに機能しうる状態 で連結されたＤＮＡ配列を該細胞のゲノムに挿入し、これにより該細胞に上記感 染に対する抵抗性を付与する方法。 １４．レトロウイルスによる生産的感染に対する抵抗性を哺乳動物に付与する方 法であって、該動物の少なくとも一部の細胞のゲノムに、本質的にレトロウイル スのパッケージング配列にのみハイプリダイズし、その結果レトロウイルスのゲ ノムＲＮＡのパッケージングを阻止する請求項２に記載のアンチセンスＲＮＡ分 子に転写可能な、プロモーターに機能しうる状態で連結されたＤＮＡ配列を導入 し、これにより該動物に上記感染に対する抵抗性を付与する方法。 １５．前記ＤＮＡ配列が胚の段階で前記哺乳動物または前記哺乳動物の先祖に導 入される、請求項１４記載の方法。 １６．前記アンチセンスＲＮＡを発現する請求項１４の方法によりつくられたヒ ト以外のトランスジェニックまたはキメラ哺乳動物、およびその子孫。 １７．レトロウイルスによる生産的感染に対する抵抗性を哺乳動物に付与する方 法であって、本質的にレトロウイルスのパッケージング配列にのみハイブリダイ ズし、その結果レトロウイルスのゲノムＲＮＡのパッケージングを阻止する請求 項１に記載のアンチセンス核酸分子を該哺乳動物に投与し、これにより該動物に 上記感染に対する抵抗性を付与する方法。