KR20040032852A - 조혈모세포의 유전적 변이 치료 방법 및 변이 세포의 용도 - Google Patents

Abstract

특히 조혈모(HP)세포에 적용되는 유전자 치료, 그리고 변이 세포와 이를 얻는 방법, 그리고 인체 내에서 변이된 조혈 세포의 연장된 생착을 제공하도록 이들을 사용하는 방법에 관련된 조성물 및 방법이 기재된다. 본 발명은 특히, HIV 감염의 치료 또는 예방을 위한, 체외에서의 HP 세포의 유전자 치료에 관한 것이다.

Description

조혈모세포의 유전적 변이 치료 방법 및 변이 세포의 용도{METHODS FOR GENETIC MODIFICATION OF HEMATOPOIETIC PROGENITOR CELLS AND USES OF THE MODIFIED CELLS}

유전자 치로는 유전자 서열의 사용과 세포의 유전자 구성을 변화시키기 위한 상기 유전자 서열의 세포로의 도입, 그리고, 상기 도입 등에 의하여 상기 세포의 특성을 변화시키거나, 이러한 세포를 기능화시키는 것을 지칭한다. 유전자 치료는, 예를 들어, 바람직한 기능을 하는 유전자의 좋은 카피를 세포에 제공하거나, 바람직하지 않은 세포 또는 병원균의 활성을 억제하는 RNA 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 제공함으로써, 유전적 결함을 고치는데 사용될 수 있다.

유전자 치료는 유전적 측면이 있는 여러 가지 질병의 치료를 목표로 할 수 있다. 특히, 조혈 세포는 생체 밖(ex vivo)에서의 방법에 대한 사용을 허용하면서도, 대상물로부터 얻기가 비교적 용이하므로, 혈액 또는 면역계의 질병은 주된 관심의 대상이 되고 있다. 이러한 질병에는 혈색소병(hemoglobinopathies), 백혈구 형성 또는 기능의 결손(defects of leukocyte production or function), 면역 결핍(immune dificiencies), 리소좀 저장 장애(lysosomal storage disease) 및 파코니 빈혈(Faconi's anemia)과 같은 줄기 세포 결함, 만성육아종성질환 (chronic granulomatous disease), 고셔병(Gaucher's Disease) 및 포도당-6-인산탈수소효소(G6PD) 결핍 등이 포함된다. 이러한 장애 중 다수는 동종 골수 세포 이식(allogeneic bone marrow cell transplants)에 의해 성공적으로 치료되어 왔다(Parkman 1986). 그러나, 면역 억제에 대한 요구 또는 이식 거부 반응과 같은 면역적 영향의 발생은 동종 골수 이식의 불편함이었다. 조혈 줄기 세포의 유전자 치료는 인체의 조혈계에 영향을 미치는 질병을 치료하기 위한 대안적 방법으로 제안되어 왔다.

일찍이 인체에서의 유전자 치료에 대한 성공이 예견되어 왔으나, 지난 10년 간의 광범위한 노력에도 이에 대한 임상적 성공을 이루기는 어려웠던 것이 사실이다(Mountain, 2000). 이는 적어도 부분적으로는, 유전자 전이에 대한 낮은 효율, 충분한 세포를 변이시킬 수 없다는 사실, 적정한 종류의 세포를 겨냥할 수 없다는 사실, 그리고, 인체내에서 바람직한 효과의 지속에 대한 결여에 기인한다.

인간 조혈 줄기 세포(human hematopoietic stem cell; human HS cell)는 실제적으로 수행하기 어렵다는 사실이 입증되었다(Kohn et al 1998, Halene and Kohn 2000, Kume et al 1999). 인체에 대한 대부분의 시도에 있어서, 말초혈 백혈구의 유전자 보유 수준이 낮았고, 이들은 짧은 수명을 가지고 있었으며, 이러한 사실은 재구성하는 HS 세포에 대한 형질 도입의 실패를 암시한다(Bordignon et al 1995, Kohn 1995, Kohn et al 1998, Dunbar et al 1995, Hoogerbrugge et al 1996). 이는 부분적으로는 상대적으로 체내에 거의 없는 HS 및 조혈 모세포(HP cell)와(Bertolini et al 1998, Reis 1999), 형질 도입을 위해 쥐에서 매개되는 RNA 종양 바이러스성 벡터(murine retroviral vectors) 중 어떤 것이 사용될 경우 상기 세포가 활성화 되어야 한다는 요구에 관련된다. 이는 활동하지 않는 인간 HS 세포내의 암포트로픽 수용체의 낮은 수준에 관련된다(Bodine et al 1998). 대부분의 인간 HS 세포는 활동하지 않는 상태에 있고, 자극에 대한 응답이 상대적으로 느리며(Hao et al 1996, Gothot et al 1998), 분리가 유도되는 경우, 장기간의 재증식 능력을 상실하는 경향이 있다(Traycoff et al 1998). HS 세포를 사용한 인간에대한 거의 모든 유전자 치료의 시도는, 이러한 두 가지 기본적인 문제점에 의해 지금까지 시달리고 있다 : 분화 전능성이고, 치료 효과를 나타내기 위하여 형질 도입되는 장기간의 생착이 가능한 HS 세포의 불충분한 숫자와, 두 번째로, 상기 형질 도입된 세포가 변이된 조혈 세포를 장기간 제공하도록 유지되지 못함.

인간 HP 세포에 대한 유전자 치료 중 가장 보장된 시도는, 유전자 보유 T-림프구를 가지는 면역계의 재구성을 초래하는, X에 연계된 중증 혼합 면역 결핍증(X-linked severe combined immunodeficiency; X-linked SCID)을 앓고 있는 아이들에 대한 유전자의 전이를 포괄한다(Cavazzana-Calvo et al 2000; Hacein-Bey-Abina et al 2002). 그러한 시도에서는 소아과 환자(12 개월 미만)의 골수로부터 추출된 CD34⁺세포를 사용하였으며, kg 당 10⁶ 보다 많은 형질 도입 세포를 배출하였다. 어린이들로부터 분리될 수 있는 CD34⁺세포의 수(kg 체중 당)는, 특히 낮은 체중의 어린이에 있어서, 어른들의 경우보다 훨씬 높았다. 티모포이에시스(thymopoiesis) 역시 어린이들에게서 더욱 활성이다. 게다가, 이러한 연구는, SCID-X1 환경에서의 티모포이에시스가, 다만 외인성 유전자를 함유하는 CD34⁺세포로부터 기인한다는 점에서 희귀한 것이다(Cavazzana-Calvo et al 2001). 어떤 면에서, 이러한 연구는, SCID 환자에서 채워지지 않는 생리학적 공간을 주입 세포가 채울 수 있다는 점에서, 골수 절제(myeloablation)가 실행되는 것과 동종의 연구이다. 동종 골수 이식을 통한 이전의 연구는, 주로 수용 HS 세포의 연속적인 존재로 인하여, 골수가 절제되지 않았던 환자에서 HS 세포 생착이 유지되지 않았음을 보여준다(Parkman 1986). 그러므로, 절제 환경(ablative context)에서 인간 HS 세포를 사용한 종래의 생착 연구로부터 도출된 결론은, 미절제 계로 단순히 대체될 수 없다.

조혈 모세포의 유전자 치료에 대한 인체의 임상적 시도에 관한 다른 보고는 덜 긍정적이다. Kohn et al 1999는, HIV에 대한 RRE 디코이(RNA 분자)를 코딩하는 유전자에 의해 형질 도입된, 소아과 환자(8-17세)에서 추출된 골수-유래 CD34⁺세포를 사용한 임상적 시도의 결과를 보고하였다. 이러한 시도에서는 모세포의 현저한 형질 도입 및 생착을 얻어내는데 실패하였다. 다른 시도에 있어서, 유방암 또는 난소암을 앓고 있는 환자들이, 표지 유전자로 형질 도입된 후의 HP 세포로 치료되었으나, 골수 절제 후에는, 단지 표지된 세포의 일시적인 존재만이 관찰되었다(Bagnis et al 2002). 고셔병을 앓고 있는 세 환자들을 포함하는 임상적 시도는, 매우 낮은 수준이기는 하나, 3 개월 까지의 말초혈과 골수에서의 유전자 보유 벡터의 존재를 보여준다(Dunbar et al 1998). 다른 예에서, 만성 육아종성 질환(CGD)을 앓고 있는 다섯 환자에 대한 다른 시도는, 말초혈로부터 추출된 CD34⁺세포로p47phox유전자가 도입됨으로써 실행된 바 있다. 주입 후 처음 몇 달동안 치료된 중성 백혈구가 말초혈에서 발견되었으나, 그들은 주입 후 6 개월의 시점에서는 검출될 수 없었다(Malech et al 1997). 또한, 상보군 C 유전자가 CD34⁺세포로 삽입된 파코니 빈혈을 치료하기 위한 시도에서는, 다만, 주입 후의 환자에서 상기 유전자가 일시적으로 검출되었을 뿐이었다(Liu et al 1999).

이러한 시도들에서의 빈약한 결과는, X에 연계된 중증 혼합 면역 결핍증의 경우와는 반대로, 미치료된 세포에 비해서 치료된 세포의 생존적 잇점의 결핍을 반영한다. 게다가, 이러한 예의 대부분에 있어서, 조작된 세포 집단은 골수 절제가 없었거나, 부분적으로만 있었던 환자들에게 투여되었는데, 이는 형질 도입된 세포가 이미 존재하고 있는 줄기 세포와 경합하면서 생착할 것을 요구하였다.

다른 인자 역시 마찬가지로 작용할 수 있다. HS 세포는 HIV로 감염된 환자에서 그 숫자가 감소될 수 있는데(Marandin et al 1996), 이로 인해 이러한 세포의 충분한 수를 확보하기가 더욱 어려워진다. 더구나, HIV-감염된 개체의 HS 세포는 그 복제 및 클론원성 능력에 있어서 타협되며, 자멸사에 대한 증가된 경향성을 나타낸다(Vignoli et al 1998, Zauli et al 1996). 호중구 집락 자극 인자(granulocyte colony-stimulating factor; G-CSF)를 사용한 말초혈 HP 세포의 동원은 HIV-감염 개체에서 논증되었다(Law et al 1999). 최대의 동원은 G-CSF 투여 후 4일이 경과된 시점에 달성되었다. 백혈구 분리 반출법(leukapheresis)의 산물은 kg 당 약 3×10⁶CD34⁺세포를 함유하였다. Law et al은 분리된 CD34⁺세포를 형질 도입시키지도 않았으며, 분리된 CD34⁺세포가 개체에 장시간 동안 생착될 수 있음을 보이지도 않았다. 다만, HP 세포의 유전자 치료가 HIV 감염에 대한 치료를 제공할 수 있음을 추측할 뿐이다. 이러한 연구는 또한, 유전적으로 변이된 세포의 생착 가능성, 화학 요법의 필요성, 골수 절제에 대한 필요성 여부, 주입된 세포의 적소 확립에 대한 요구, 그리고, 세포의 주입 이후에 AIDS 환자 골수 내의 극소 환경의 알려지지 않은 반응 등을 포함하는 많은 불확정성으로 인하여, AIDS의 유전자 치료에 요구되는 줄기 세포수에 대한 논의가 시기 상조임을 언급한다.

골수 절제의 환경 하에서, 조혈계의 효과적인 복구, 특히, 혈소판 회복을 위해 요구되는, 말초혈로부터의 CD34⁺세포의 최소 수는 개체의 체중 kg 당 2.0 × 10⁶세포로 제안되어 왔다(Zimmerman 1995). 그러나, 골수 절제를 행하지 않은 경우, 효과적인 생착을 위해 요구되는 숫자는 본 발명 이전에 알려진 바 없다. 주입된 세포에 대해 "적소"가 확립되어야 하는지 여부, 또는 골수 내에서 이미 존재하는 세포와의 경합의 효과는 아직 알려진 바 없다. 상술한 바와 같이, 이는 특히 HIV 감염의 환경에서 사실이다.

형질 도입 방법을 발전시키고 생착을 향상시키기 위해, 많은 연구들은 동물계 모델, 특히, 쥐의 모델을 사용하여 왔다. 그러나, 쥐에서 매개되는 HS 세포가 RNA 종양 바이러스에 의해 효과적으로 형질 도입됨에도 불구하고, 쥐에서 매개되는 시스템에서의 발견을 인간 HS 세포에 대한 적용으로 바꾸어 옮기려는 노력은 큰 어려움에 봉착하였다(Halene and Kohn 2000; Richter and Karlson 2001).

유전자 치료의 치료상의 적용에 대한 다른 어려움은, 충분한 수의 형질 도입 세포를 얻기 위하여, 방법의 규모를 확대시키는데 있다(Schilz et al, 2000). Schilz et al은 쥐의 모델에서 형질 도입 효율 및 생착을 측정하였으나, 이러한 결론이 어떻게 인체에 적용될 수 있는지는 불명확하다.

이러한 인자들의 각각은 본 발명에 의해 다루어진다.

본 출원은 2001. 7. 10. 자로 출원된 미국 가출원 제 60/304,127 호, 2001. 7. 10. 자 미국 가출원 제 60/304,283 호, 2001. 12. 21. 자로 출원된 미국 가출원 제 60/343,484 호 및 2002. 6. 4. 자로 출원된 미국 가출원 제 60/386,063 호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 출원은 각각 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용되어 있다.

본 출원 전체를 통해, 여러 가지 간행물이 괄호 내에 인용되어 있다. 이러한 간행물들의 모든 인용은 청구범위의 바로 앞에 있는 명세서의 말미에 알파벳 순으로 나열되어 있다. 이러한 간행물의 전체적인 내용은, 본 발명이 속하는 기술 분야에서의 종래 기술을 좀 더 구체적으로 설명하기 위하여, 본 출원에 참고로 포함되어 있다.

본 발명은 특히, 조혈모 세포(hematopoietic progenitor cells; HP cells)에 적용되는 유전자 치료, 형질 도입 세포와 이를 얻는 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.

도 1(A). 통상적인 RNA 종양 바이러스의 복제 주기.

(A) 바이러스가 표적 세포 상의 세포 표면 수용체(cell surface receptor)에 결합하고, 게놈 RNA가 융합 및 바이러스성 언코팅(viral uncoating) 과정을 거쳐 표적 세포로 들어간다.

(B) 바이러스 RNA를 cDNA로 전환시키는 역전사가 일어난다.

(C) cDNA가 핵으로 들어가 환형으로 변형된다.

(D) cDNA는 그리고 나서 숙주 세포 게놈에 통합된다.

(E) 바이러스 RNA와 mRNA를 만들기 위한 프로바이러스(provirus)의 전사

(F) 번역에 의해 바이러스 단백질이 생성된다.

(G) 바이러스성으로 코딩된 단백질과 둘러 쌓여진 바이러스 RNA로부터 바이러스 코어(viral core)가 형성된다.

(H) 상기 코어가 막을 얻고, 세포막을 통해 출아하여 상기 세포를 나간다.

도 1 (B). 본 발명에서 제안된 작용 방법. 리보자임은 HIV-1 바이러스의 라이프 사이클에서, 여러 가지 지점의 어떤 곳에서도 작용할 수 있다. 이는 언코팅 후 역전사 이전에 게놈 RNA를 잘라내거나, 또는, 바이러스 단백질의 번역을 억제하기 위해 핵이나 세포질 내의 바이러스성 전사체를 잘라내거나, 또는, 조립 전이나 조립 중에 새로이 형성된 게놈 RNA를 잘라낼 수 있다.

도 2. HIV/AIDS를 치료하기 위하여 리보자임 유전자 전이를 사용하는 과학적 근거. A. 보통의 CD34⁺조혈모세포는 HIV-1에 의해 감염될 수 있는 림프구와 백혈구/대식세포를 발생시키며, 상기 감염된 세포들은 죽기 전까지 HIV-1 입자를 생기게 한다. B. 리보자임 유전자에 의해 형질 도입된 CD34⁺조혈모세포는 리보자임 유전자를 발현하는 림프구와 백혈구/대식세포를 발생시킨다. 치료적인 리보자임이 HIV-1 RNA를 잘라내며, 상기한 바와 같은 두 종류의 중요 세포에 있어서 HIV-1의 복제를 억제한다.

도 3. 조혈의 개략도. CD34⁺조혈모세포는 중간 모세포(intermediate progenitor cell)을 통하여 향상된 성숙도의 세포를 발생시킨다. HIV/AIDS의 감염에 있어서 중요 세포는 CD4⁺T-림프구와 백혈구/대식세포(별표)이다. 도식화된 세포 모두는 조혈 세포이다.

도 4. Rz2 표적 사이트의 위치. A: 증식성, 조절성 및 보조적인 유전자의 위치를 나타내는 HIV-1의 개략도. B: 상보적인 표적과 함께 있는 리보자임 서열 및 tat 유전자 내에서 잡종화된 서열. 트리플렛 GUA의 3'에서 바로 잘려진다. C: Tat 및 Vpr단백질을 코딩하는 유전자 내에서의 GUA 표적 유전자의 위치.

도 5. CD34⁺I상 임상 시도의 개략적 대표도. HIV-1에 의해 감염된 10 개체가 대상으로 되었다. LNL6 및 RRz2 벡터는 자가 이식한 CD34⁺조혈세포에 분리되어 도입되었다. 양 쪽 세포군 모두 골수 절제 처리를 행하지 않은 환자에 주입되었다.

도 6. 형질 도입에 대한 레트로넥틴(retronectin)의 효과. 이 도면은 레트로넥틴이, CD34⁺세포를 RNA 종양 바이러스성 벡터에 아주 근접하게 가져감으로써, RNA 종양 바이러스성 형질 도입을 촉진하는 방법을 개략적으로 보여준다.

도 7. 장기간의 벡터의 존재 및 발현. RRz2 벡터 내의 Rz2 서열과 겹쳐지는 neo^R유전자를 거슬러 향하고 있는 프라이머(primer)를 사용하여, 백혈구의 부분에서 반 정량적인 PCR 분석을 행하였다. LNL6 및 RRz2에 대한 PCR 산물은 각각 174와 216의 염기쌍이며, neo^R유전자의 번역되지 않는 말단 지역을 포함한다. 그래프 A는, 형질 도입된 CD34⁺세포가 주입된 후 2년 경과 시에, 환자 5의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 골수 단핵 세포(BMMC), T-림프구 및 백혈구 내에서의 LNL6 및 RRz2 벡터 서열을 나타낸다. 그래프 B는, RT-PCR에 의해 측정된, 3명의 표본 환자의 PBMC내에서의 LNL6 및 RRz2에 대한 단기간과 장기간의 발현 양 쪽 모두를 나타낸다. 이러한 발현은 방사선 표지된 프라이머를 사용하여, 역전사효소(reverse-transcriptase; RT⁺)에 맞추어진 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)을 진행함으로써 평가되었다. 각각의 샘플에 대해, 역전사 효소(-RT)를 함유하지 않는 반응이 포함되었다. 그래프 C. 항원에 노출되지 않은 T-림프구에 대한 벡터 서열의 검출. 겔은 형질 도입된 CD34⁺세포가 주입된 후 2년 경과 시에, 환자 7의 말초혈로부터 선택된 항원에 노출되지 않은 T-림프구 부분과, CD4⁺및 CD8⁺T-림프구에서의 LNL6 및 RRz2 벡터 서열에 대한 PCR 분석 결과를 나타낸다. D, E 및 F는 항원에 노출되지 않은 T-림프구에서의 벡터 서열의 검출을 나타낸다. 겔은 세 환자의 말초혈로부터 선택된 항원에 노출되지 않은 T-림프구 부분과, CD4⁺및 CD8⁺T-림프구에서의 LNL6 및 RRz2 벡터 서열에 대한 PCR 결과를 나타낸다. 벡터 서열은 주입 후 4주 정도로 빠른 항원에 노출되지 않은 T-림프구에서 검출되었으며(패널 F), 또한, 장기간의 검출은, 형질 도입된 CD34⁺세포가 주입된 후 각각 2.5년과 2년이 경과한 시점의 패널 E 및 D에서 나타난다.

도 8. 10 환자에서 PCR에 의한 벡터 검출의 요약.

세포는 주입 후 36 개월에 이르기까지, LNL6 및 RRz2 벡터 검출에 대한 PCR에 의해 검사되었다. 세포 종류는 지칭된 바와 같이, 골수 단핵 세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 과립성 백혈구, T-림프구 및 백혈구였다. 데이터는 Y-축에 표시된 각 환자에 대해 나타난다. 피브로낵틴 단편(CH-296)을 사용한 후에, 더 장기간의 유전자 표시가 관찰되었는데, 이는 형질 도입 효율의 증가를 초래한다(표 1 참조). 벡터 검출의 존재 또는 부존재는, 백터 카피 수에 상관없이, 원으로 표시된다 : 흑색, 양 쪽 백터가 모두 검출; 빈원, 양 쪽 백터 모두가 비검출; 수직선이 있는 원, 리보자임 벡터만이 검출; 수평선이 있는 원, LNL6 조절 백터 만이 검출.

도 9. T-림프구와 골수 단핵 세포에서 벡터 붕괴에 대한 동역학 비교. T-림프구와 골수 단핵 세포(BMMC)에 벡터 카피의 붕괴율 비교는 LNL6와 비교하여, T-림프구 내의 RRz2 표시에 대한 증가된 지속성을 보여준다 (A). LNL6 표시는 (B)에 나타난다. 각 점들은 기준선의 퍼센트로써 나타나는 벡터 표시의 수준을 나타내는 데, 여기서 기준선은 각 세포종(붉은색 다이아몬드와 선 : T-림프구, 빈 사각형 및 검은 선 : BMMC)에서, 4 주 및 12 주 시점에서의 벡터 카피수의 평균으로 정의된다. (C) 및 (D)는 RRz2-형질 도입 CD34⁺세포 복용량과, T-림프구 (C)와 PBMC (D)에서 LNL6과 RRz2의 카피수 차이(보호 인덱스) 사이의 선형 관계를 보여주는 점들을 나타낸다. (E), (F), (G) 및 (H)는 T-림프구와 골수 단핵 세포에서 벡터 붕괴의 동역학 사이의 비교와, 주입된 형질 도입-CD34⁺세포 복용량과의 상호 관계를 나타낸다. HIV-관련된 세포 소모에 대한, 리보자임에 의한 보호는, HIV 감염에 대한 취약성이 있는 세포 및 취약성이 없는 세포의 RRz2 및 LNL6 벡터 DNA의 붕괴를 비교함으로써 평가된다. 패널 E는 표시된 시점에서 환자 7에 대하여, CD4⁺T-림프구 내에서의 PCR에 의한 RRz2 및 LNL6의 검출을 보여준다. 각 밴드에 대한 방사능의 크기는, 유사한 PCR 반응(미도시)에서 알려진 표준적 진행으로 표준화되고, LNL6에 대한 RRz2의 비율(각각의 겔 하에서 나타난 수치)은 시간에 대하여 표시된다(패널 F). RRz2에 대한 음성적 조절로써, BMMC(HIV 감염에 대해 취역하지 않은 세포의 대부분을 포함함.)에 대한 도면은 패널 F(PCR 겔은 미도시)에 나타난다. LNL6에 대한 RRz2 표시의 비율에서 시간에 따른 경향을 선형 회귀에 의해 평가되며, 여기서 P값은 0(RRz2 및 LNL6 표시 붕괴가 균등한 비율로 이루어진다고 가정할 경우.)의 변화율과의 차이를 반영한다. 이 환자에서, BMMC의 LNL6 표시에 대한 RRz2의 비율은 시간에 따라 대략 일정하게 유지된다(기울기 = -0.0005, 0과의 차이 P = .281). 반대로, HIV에 취약한 T-림프구에서, RRz2 표시는 시간에 따라 LNL6 표시에 비례하여 증가하였다(기울기 = 0.0036, 0과의 차이 P = .008). 경향선 사이의 차이는 통계적으로 현저하였다(P < .0006). 소정의 환자에 대하여, LNL6 대 RRz2 의 유전자 표시에 대한 차이의 크기가 주입된 RRz2-형질 도입 세포의 수와 관련되는지 여부를 결정하기 위하여, 각 벡터의 붕괴 기울기를, 재도입된 RRz2-형질 도입 CD34⁺세포의 수와 상호 관련시켰다(스피어먼 랭크; spearman rank). LNL6 및 RRz2 표시에 대한 환자 특이성의 붕괴 기울기는 선형 회귀에 의해 계산되었으며, 이러한 기울기(RRz2 - LNL6) 간의 차이는 RRz2-매개된 보호의 지표로 고려되었다. 패널 G 및 H는, RRz2-형질 도입 CD34⁺세포 복용량과, T-림프구 (H의 점)와 PBMC (G의 점)에서 LNL6과 RRz2의 카피수 차이(보호 인덱스) 간의 이러한 선형 관계 및 신뢰 구간(점선)을 보여주는 점들을 나타낸다.

도 10. 연구 대상 환자에서의 절대적인 CD4⁺세포의 총수(A)와 바이러스성부하(B). mm³당 절대적인 CD4⁺세포의 총수(A)와 혈액의 ml 당 HIV RNA 카피에서의 바이러스성 부하(B)가 상기 연구를 통하여 환자 번호 1-10으로 나타난다. 동원의 기간 동안 항RNA 종양 바이러스성 치료를 중지한 몇몇 환자에서, 주입 후 1일 경과시에 바이러스성 부하의 초기 증가가 관찰되었다. 약물 중지 및 비뉴클레오시드 역전사 효소 억제 인자 또는 프로테아제 억제 인자를 뉴클레오시드 역전사 효소 치환 억제인자로 치환하는 것은, 형질 도입 중에 MMLV 역전사 효소의 잠재적인 억제를 방지하기 위하여 연구 계획에 포함되었다. 때때로 일어나는 바이러스 감염은 항RNA 종양 바이러스성 치료의 변이 후에 치료된다.

도 11. I 상의 자가 이식한 CD34⁺세포 연구에서. 환자 #005 내의 조혈 세포군의 장기간 표시. 주입 후 2년 경과 시에, 골수 및 말초혈 군에서 LNL6 및 RRz2 표시된 세포로부터의 PCR 증폭 밴드가 겔에서 나타난다.

도 12. I 상의 자가 이식한 CD34⁺세포 연구에서, 4 환자 내의 말초 혈액 단핵 세포에서의 유전자 발현. 주입 후 2년 경과 시에, 2 환자에 대해 LNL6 및 RRz2의 양 쪽의 발현이 모두 나타난다. 이러한 발현은 방사선 표지된 프라이머를 사용하여, 역전사효소에 맞추어진 PCR 반응을 진행함으로써 평가되었다. 각 샘플에 대해, RT를 함유하지 않는 반응(-RT)이 포함되었다. RT의 존재 또는 비존재는 표시된 바와 같다.

도 13. 환자 #007에서 T-림프구(CD4⁺, CD8⁺) 하위 군의 장기간 표시. 실험결과는, 자가 이식한 LNL6 또는 RRz2으로 형질 도입된 CD34⁺세포의 주입 후 1년 시점에서, 자연 상태 및 메모리 CD4⁺및 CD8⁺림프구에서 표시를 나타낸다.

도 14. 다중-표적 설정 능력을 가진 RNAi의 개략적인 디자인. RNA 전사체는 스페이서(SP)에 의해 분리된 센스 단편(1A, 2A 3A)과 안티센스 단편(1B, 2B, 3B)을 각각 함유하는 세 개의 RNAi 유닛을 포함한다. RNAi 유닛에서는 자기 절단 해머헤드 및 헤어핀 리보자임이 측면에 위치하고, 이들은 화살표에 의해 표시된 부분을 잘라낸다.

본 발명의 요약

본 발명은, 약학적으로 허용 가능한 담체와 투여 대상 인체의 체중 kg 당 적어도 1.63×10⁶의 CD34⁺조혈 세포를 포함하며, 적어도 0.52×10⁶의 상기 CD34⁺조혈 세포가 항-HIV 제제를 발현하는 바이러스성 구성체에 의해 형질 도입되는, 인간에 투입하기에 적합한 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 하기의 단계를 포함하는, 소정의 유전자를 인체의 조혈 세포에 삽입하는 방법을 제공한다 :

a) CD34⁺조혈모세포를 인체의 혈액 내로 동원하는 단계;

b) 혈장 교환에 의해 인체로부터 백혈구를 분리하는 단계;

c) 면역 선택적인 방법에 의해, 상기 분리된 백혈구로부터 CD34⁺조혈 세포를 분리하는 단계;

d) 형질 도입 벡터와 함께 CD34⁺조혈 세포를 모이도록 하는 제제의 존재 하에, 소정의 유전자를 가지고 상기 c) 단계의 CD34⁺조혈 세포에 대해 형질 도입 과정을 진행하는 단계;

e) 상기 d) 단계 후에 CD34⁺조혈 세포의 총 수를 결정하고, 상기 총 수가 인체의 체중 kg 당 적어도 1.63×10⁶이면, 하기의 f) 단계를 진행하며, d) 단계 후의 CD34⁺조혈 세포의 총 수가 인체의 체중 kg 당 1.63×10⁶보다 작으면, 적어도 b)-d) 단계를 진행한 후 CD34⁺조혈 세포를 합하는 단계; 및

f) 인체에 상기 CD34⁺조혈 세포를 이송함으로써, 인체의 조혈 세포에 소정의 유전자를 삽입하는 단계.

본 발명은 또한, 약학적으로 허용 가능한 담체와 투여 대상 인체의 체중 kg 당 적어도 1.63×10⁶의 CD34⁺조혈 세포를 포함하며, kg 당 적어도 0.52×10⁶의 상기 CD34⁺의 세포가 항-HIV 제제를 발현하는 바이러스성 구성체에 의해 형질 도입되는 조성물을, HIV에 의해 감염된 인체의 치료를 위한 약품을 제조하기 위하여 사용하는 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, a) 인체 내에서 조혈 모세포를 동원할 수 있는 제제의 상당량;

b) CD34⁺조혈 세포를 배양하기에 적합한 사이토킨(cytokine)을 적어도 하나 포함하는 배양 배지;

c) 5' - UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC - 3' (Rz2)의 서열을 가지는 리보자임을 세포 내에서 발생시키는, 서열을 가지는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA 종양 바이러스성 벡터; 및

d) 그 내부가 재조합 피브로넥틴(fibronectin) 단편으로 코팅된 조직 배양용기를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트와 그 사용 설명서를 포함하는 패키지 역시 본 발명의 사상에 의해 제공된다.

발명의 상세한 설명

본 발명은, 약학적으로 허용 가능한 담체와 투여 대상 인체의 체중 kg 당 적어도 1.63×10⁶의 CD34⁺조혈 세포를 포함하며, 적어도 0.52×10⁶의 상기 CD34⁺조혈 세포가 항-HIV 제제를 발현하는 바이러스성 구성체에 의해 형질 도입되는, 조성물을 제공한다. 선택적으로, 상기 조성물은 kg 당 적어도 약 1.7×10⁶의 CD34⁺조혈 세포를 포함하며, kg 당 적어도 0.5×10⁶의 상기 세포가 바이러스성 구성체에 의해 형질 도입된다. 상기 조성물은 인체에 투여하기 적합하다. 상기 인체는 성인으로 될 수 있다.

상기 바이러스성 구성체는 RNA 종양 바이러스성 구성체로 될 수 있다. 상기 조성물은 또한, 실질적으로 사이토킨이 없거나, 실질적으로 바이러스가 없는 상태로 될 수 있다.

본 발명은 또한, 투여 대상 인체의 체중 kg 당 적어도 5×10⁶의 CD34⁺조혈 세포가 형질 도입되거나; 인체의 체중 kg 당 적어도 9.37×10⁶의 CD34⁺조혈 세포를 포함하고, 적어도 5×10⁶의 상기 CD34⁺조혈 세포가 형질 도입되거나; 체중 kg 당적어도 약 10×10⁶의 CD34⁺조혈 세포를 포함하고, 적어도 5×10⁶의 상기 세포가 형질 도입되거나; 상기 항-HIV 제제가 RNA 분자이거나; 상기 항-HIV 제제가 RNAi 분자이거나; 상기 항-HIV 제제가 안티센스 분자이거나; 상기 항-HIV 제제가 리보자임인 조성물을 제공한다. 상기 리보자임은 5' - UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC - 3' (Rz2)의 서열을 가지는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

상기 조성물에서, 상기 형질 도입된 CD34⁺세포는 생착이 가능하며, 인체 내에서 적어도 12 개월 동안 아들 세포(progeny cell)을 발생시킬 수 있다. 상기 세포는 일차 세포 배양 내에 있을 수 있다.

또한, 본 발명은, 약학적으로 허용 가능한 담체와 투여 대상 개체의 체중 kg 당 적어도 1.63×10⁶의 CD34⁺조혈 세포를 포함하며, 적어도 0.52×10⁶의 상기 CD34⁺조혈 세포가 항-HIV 제제를 발현하는 바이러스성 구성체에 의해 형질 도입되는 조성물로써,

하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 조성물을 개시한다 :

a) CD34⁺조혈 세포를 개체로부터 분리하는 단계;

b) CD34⁺조혈 세포를 적어도 하나의 사이토킨으로 배양하는 단계;

c) 상기 CD34⁺조혈 세포와 바이러스성 구성체를 함께 모이도록 유도하는 제제의 존재 하에, 항-HIV 제제를 발현하는 바이러스성 구성체를 가지고 CD34⁺조혈세포에 형질 도입하는 단계;

d) 상기 CD34⁺조혈 세포를 세척하는 단계; 및

e) 상기 CD34⁺조혈 세포를 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여, 조성물을 얻는 단계. 상기 조성물은 인체에 투여하기 적합하다.

상기 조성물에서, 상기 배양 단계 (b)는 적어도 하나의 사이토킨, 적어도 두 종류의 사이토킨 또는 단지 두 종류의 사이토킨의 존재 하에 수행될 수 있다. (c) 단계는 재조합 피브로넥틴 단편의 존재 하에 수행될 수 있다.

본 발명은 또한, 약학적으로 허용 가능한 담체와 투여 대상 인체의 체중 kg 당 적어도 1.63×10⁶의 CD34⁺조혈 세포를 포함하며, 적어도 0.52×10⁶의 상기 CD34⁺조혈 세포가, 형질 전환 전의 CD34⁺세포에서는 발견되지 않던 소정의 유전자에 의해 형질 전환되는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 인체에 투여하기 적합하다. 이러한 조성물에서, 상기 세포의 수는 이미 본 발명의 명세서에서 상술한 바와 같이 정의될 수 있다. 이러한 조성물에 있어서, 소정의 유전자는 RNA 제제를 발현할 수 있다.

본 발명은 또한, 약학적으로 허용 가능한 담체와 투여 대상 인체의 체중 kg 당 적어도 1.63×10⁶의 CD34⁺조혈 세포를 포함하며, 적어도 0.52×10⁶의 상기 CD34⁺조혈 세포가, 형질 전환 전의 CD34⁺세포에서는 발견되지 않던 소정의 유전자에 의해 형질 전환되는 조성물로써,

하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 조성물을 제공한다 :

a) CD34⁺조혈 세포를 상기 인체로부터 분리하는 단계;

b) CD34⁺조혈 세포를 적어도 하나의 사이토킨으로 배양하는 단계;

c) 상기 CD34⁺조혈 세포와, 소정의 유전자를 코딩하는 벡터를 함께 모이도록 유도하는 제제의 존재 하에, 상기 벡터를 가지고 CD34⁺조혈 세포를 형질 전환하는 단계;

d) 상기 CD34⁺조혈 세포를 세척하는 단계; 및

e) 상기 CD34⁺조혈 세포를 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여, 조성물을 얻는 단계. 상기 조성물은 인체에 투여하기 적합하다. 이러한 조성물에서, 상기 세포의 수는 이미 본 발명의 명세서에서 상술한 바와 같이 정의될 수 있다. 상기 인체는 성인으로 될 수 있다. 이러한 조성물에 있어서, 소정의 유전자는 RNA 제제를 발현할 수 있다.

또한, 본 발명은, 하기의 단계를 포함하는, 소정의 유전자를 인체의 조혈 세포에 삽입하는 방법을 제공한다 :

a) CD34⁺조혈모세포를 인체의 혈액 내로 동원하는 단계;

b) 혈장 교환에 의해 인체의 혈액으로부터 백혈구를 분리하는 단계;

c) 면역 선택적인 방법에 의해, 상기 분리된 백혈구로부터 CD34⁺조혈 세포를 분리하는 단계;

d) 형질 도입 벡터와 함께 CD34⁺조혈 세포를 모이도록 하는 제제의 존재 하에, 소정의 유전자를 가지고 상기 c) 단계의 CD34⁺조혈 세포에 대해 형질 도입 과정을 진행하는 단계;

e) 상기 d) 단계 후에 CD34⁺조혈 세포의 총 수를 결정하고, 상기 총 수가 인체의 체중 kg 당 적어도 1.63×10⁶이면, 하기의 f) 단계를 진행하며, d) 단계 후의 CD34⁺조혈 세포의 총 수가 인체의 체중 kg 당 1.63×10⁶보다 작으면, 적어도 b)-d) 단계를 진행한 후 CD34⁺조혈 세포를 합하는 단계; 및

f) 인체에 상기 CD34⁺조혈 세포를 이송함으로써, 인체의 조혈 세포에 소정의 유전자를 삽입하는 단계. 상기 인체는 성인으로 될 수 있다.

이러한 방법에서, 형질 도입 벡터와 함께 CD34⁺조혈 세포를 모이도록 하는 상기 제제는 피브로넥틴 단편으로 될 수 있다.

이러한 방법에 있어서, 상기 f) 단계는 골수 절제없이 수행될 수 있다. 인체 내에서 조혈모세포를 동원하는 a) 단계는, 조혈모세포를 동원하기에 충분한 다량의 사이토킨을 투여함으로써 수행될 수 있다. 인체의 혈액으로부터 백혈구를 분리하는단계에서, 혈장 교환은 적어도 두번 수행될 수 있다.

이러한 방법에서, 소정의 유전자를 가지고 CD34⁺조혈 세포에 대해 형질 도입 과정을 진행하는 단계는, 재조합 피브로넥틴 단편의 존재 하에 수행되며, 상기 단편은 재조합 피브로넥틴 단편 CH-296으로될 수 있다.

이러한 방법에서, 소정의 유전자는 항-HIV 제제를 코딩할 수 있다. 항-HIV 제제는 RNA 분자; 또는 RNAi 분자; 또는 안티센스 분자; 또는 리보자임으로 될 수 있다. 리보자임은 5' - UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC - 3' (Rz2)의 서열을 가지는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

상기 방법의 일실시예에 있어서, e) 단계에서는, d) 단계 후의 CD34⁺조혈 세포의 총 수가 인체의 체중 kg 당 1.63×10⁶보다 작으면, 상기 d) 단계에서의 CD34⁺조혈 세포를 극저온으로 저장하는 단계를 부가적으로 포함하고, a)-d) 단계를 반복하며, 그리고 나서, 극저온으로 저장된 모든 세포를 d) 단계 후의 세포와 합한다. 세포의 구체적인 숫자는 상술한 바와 같이 증가될 수 있다.

이러한 방법에 있어서, e) 단계의 모든 또는 거의 모든 CD34⁺조혈 세포는 인체로 이송되며, 예를 들어, 총 세포수의 약 90%가 이송된다.

상기 방법은, 적어도 두 종류의 사이토킨 또는 하나의 사이토킨 혼합물의 존재 하에서 상기 c) 단계의 분리된 CD34⁺조혈 세포를 배양하는 단계를 부가적으로포함할 수 있다.

상기 사이토킨 혼합물은 줄기 세포 인자(stem cell factor; SCF), 거핵구 성장 및 발생 인자(megakaryocyte growth and development factor; MGDF), Flt-3 리간드(FL, 때때로 축약되어 Flt-3), 인터류킨 3(IL-3), 과립세포-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF) 및 트롬보포이에틴(TPO)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 사이토킨을 포함할 수 있다. 상기 사이토킨 혼합물은 또한, 인터류킨 1(IL-1), 인터류킨 4(IL-4), 인터류킨 5(IL-5), 인터류킨 6(IL-6), 인터류킨 7(IL-7), 인터류킨 9(IL-9), 인터류킨 11(IL-11), 인터류킨 12(IL-12), 인터류킨 15(IL-15), 호중구 집락 자극 인자(G-CSF), 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF), 에리트로포이에틴(EPO), 백혈병 억제 인자(LIF), 형질 전환 증식 인자 베타(TGF-β), 대식세포 억제 단백질 1(MIP-1), 종양 괴사 인자(TNF) 및 기질 세포-파생 인자 1(stromal cell-derived factor 1; SDF-1)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 사이토킨을 포함할 수 있다.

상기 방법의 다른 실시예에 있어서, 상기 사이토킨 화합물은 첫 번째 그룹에서 선택된 하나의 사이토킨과 두 번째 그룹에서 선택된 하나의 사이토킨을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 첫 번째 그룹은 SCF, MGDF, FL, IL-3, GM-CSF, TPO, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15, G-CSF, M-CSF, EPO, LIF, TGF-β, MIP-1, TNF 및 SDF-1로 이루어지고, 상기 두 번째 그룹은 MGDF, FL, GM-CSF, TPO, IL-1, IL-4, IL-5, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15, G-CSF, M-CSF, EPO, LIF, TGF-β, MIP-1, TNF 및 SDF-1으로 이루어진다.

본 발명은 또한, 하기의 단계를 포함하는, 소정의 유전자를 인체의 조혈 세포에 삽입하는 방법을 제공한다 :

a) CD34⁺조혈모세포를 인체의 혈액 내로 동원하는 단계;

b) 혈장 교환에 의해 인체의 혈액으로부터 백혈구를 분리하는 단계;

c) 면역 선택적인 방법에 의해, 상기 분리된 백혈구로부터 CD34⁺조혈 세포를 분리하는 단계;

d) 상기 c) 단계 후에 CD34⁺조혈 세포의 총 수를 결정하고, 상기 총 수가 인체의 체중 kg 당 적어도 1.63×10⁶이면, 하기의 e) 단계를 진행하며, c) 단계 후의 CD34⁺조혈 세포의 총 수가 인체의 체중 kg 당 1.63×10⁶보다 작으면, 적어도 b)-c) 단계를 진행한 후 CD34⁺조혈 세포를 합하는 단계;

e) 형질 도입 벡터와 함께 CD34⁺조혈 세포를 모이도록 하는 제제의 존재 하에, 소정의 유전자를 가지고 상기 c) 단계의 CD34⁺조혈 세포에 대해 형질 도입 과정을 진행하는 단계; 및

f) 인체에 상기 CD34⁺조혈 세포를 이송함으로써, 인체의 조혈 세포에 소정의 유전자를 삽입하는 단계. 이러한 방법에 관한 구체화는 이전의 방법에 대해 기술한 바와 같이 다양화될 수 있다.

본 발명은 또한, 하기의 단계를 포함하는, 인체의 조혈 세포에 5' - UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC - 3' (Rz2)의 서열의 뉴클레오티드를 포함하는 리보자임을 발현하는 유전자를 삽입하는 방법을 제공한다 :

a) CD34⁺조혈모세포를 동원하기에 충분한 다량의 사이토킨을 인체에 투여함으로써, 상기 조혈모세포를 인체의 혈액 내로 동원하는 단계;

b) 적어도 두 번에 걸쳐 수행되는 혈장 교환에 의해 인체의 혈액으로부터 백혈구를 분리하는 단계;

c) 면역 선택적인 방법에 의해, 상기 분리된 백혈구로부터 CD34⁺조혈 세포를 분리하는 단계;

d) 사이토킨의 존재 하에서, 상기 단계 c)에서 분리된 CD34⁺조혈 세포를 약 1 일 동안 배양 배지에서 배양하는 단계;

e) 재조합 피브로넥틴 단편의 존재 하에, 5' - UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC - 3' (Rz2)의 서열의 뉴클레오티드를 포함하는 리보자임을, 세포 내에서 발생시키는 벡터를 포함하는 RNA 종양 바이러스를 가지고, 상기 c) 단계의 CD34⁺조혈 세포에 대해 형질 도입 과정을 진행하는 단계;

f) 상기 e) 단계 후에 CD34⁺조혈 세포의 총 수를 결정하고, 상기 총 수가 인체의 체중 kg 당 적어도 1.63×10⁶이면, 하기의 g) 단계를 진행하며, e) 단계 후의 CD34⁺조혈 세포의 총 수가 인체의 체중 kg 당 1.63×10⁶보다 작으면, 다시 b)-e) 단계를 진행한 후 CD34⁺조혈 세포를 합하는 단계; 및

g) 인체에, 골수 절제 없이, 상기 CD34⁺조혈 세포를 이송함으로써, 인체의 조혈 세포에 리보자임을 발현하는 유전자를 삽입하는 단계. 이러한 방법에 관한 구체화는 이전의 방법에 대해 기술한 바와 같이 다양화될 수 있다.

본 발명에 따르면, 또한, 하기의 단계를 포함하는, 상술한 조성물의 제조 방법이 제공된다 :

a) CD34⁺조혈 세포를 인체의 혈액 내로 동원하는 단계;

b) 혈장 교환에 의해 인체의 혈액으로부터 백혈구를 분리하는 단계;

c) 면역 선택적인 방법에 의해, 상기 분리된 백혈구로부터 CD34⁺조혈 세포를 분리하는 단계;

d) 형질 도입 벡터와 함께 CD34⁺조혈 세포를 모이도록 하는 제제의 존재 하에, 소정의 유전자를 가지고 상기 c) 단계의 CD34⁺조혈 세포에 대해 형질 도입 과정을 진행하는 단계; 및

e) 상기 d) 단계 후에 CD34⁺조혈 세포의 총 수를 결정하고, d) 단계 후의 CD34⁺조혈 세포의 총 수가 인체의 체중 kg 당 1.63×10⁶보다 작으면, 다시 b)-d)단계를 진행한 후 CD34⁺조혈 세포를 합하는 단계.

본 발명에 의하면, 또한, 약학적으로 허용 가능한 담체와 투여 대상 인체의 체중 kg 당 적어도 1.63×10⁶의 CD34⁺조혈 세포를 포함하며, kg 당 적어도 0.52×10⁶의 상기 CD34⁺의 세포가 항-HIV 제제를 발현하는 바이러스성 구성체에 의해 형질 도입되는 조성물을, HIV에 의해 감염된 인체의 치료를 위한 약품을 제조하기 위하여 사용하는 용도가 제공된다.

본 발명에 따르면, 또한, 상술한 방법을 수행하는데 사용되는 구성 요소를 포함하는 키트가 제공된다. 키트의 구체적인 실시예는 a) 인체 내에서 조혈 모세포를 동원할 수 있는 제제의 상당량;

b) CD34⁺조혈 세포를 배양하기에 적합한 사이토킨(cytokine)을 적어도 하나 포함하는 배양 배지;

c) 5' - UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC - 3' (Rz2)의 서열을 가지는 리보자임을 세포 내에서 발생시키는, 서열을 가지는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA 종양 바이러스성 벡터; 및

d) 그 내부가 재조합 피브로넥틴 단편으로 코팅된 조직 배양 용기를 포함한다.

또한, 상기 키트와 그 사용 설명서를 포함하는 패키지 역시 제공된다.

상술한 방법의 실시예에 있어서, CD34⁺조혈 세포의 배양 및 형질 도입 단계에 소요되는 총 시간은, 약 3일보다 많지 않게 되는데, 이는, 부가된 사이토킨의 존재 하에 37℃의 온도에서, 상기 세포가 배양 배지에 있는 동안의 시간이 약 3일을 넘지 않기 때문이다. 선택적으로, 하나 이상의 사이토킨의 존재 하에 상기 세포가 배양 배지에 있는 시간은 3일 보다 많지 않다. 상기 세포의 형질 도입은 재조합 피브로넥틴 단편 CH-296 또는 이와 균등한 제제의 존재 하에 수행될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 방법은 유전적 측면이 있는 다양한 질병의 어떤 것을 치료하기 위해서도 사용될 수 있다. 특히 주된 관심이 되는 질병은, 혈액 또는 면역계의 질병이다. 이러한 질병에는 혈색소병, 암을 포함하는 백혈구 형성 또는 기능의 결손, HIV와 같은 면역 결핍, 바이러스성 감염, 리소좀 저장 장애 및 파코니 빈혈과 같은 줄기 세포 결함, 만성육아종성질환, 고셔병 및 G6PD 결핍 등이 포함된다. 상기 질병은 또한, AIDS/HIV와 같은 감염성 질환 또는 암 또는 심혈관 질환과 같은 후천성 질병을 포함한다.

본 발명은 특히, 조혈모세포(HP 세포)에 적용되는 유전자 치료, 형질 도입된 세포 및 이를 얻는 방법, 그리고 인체 내에서 변이된 조혈 세포가 연장된 생착을 유지할 수 있도록 형질 도입된 세포를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히, HIV 감염의 치료 또는 예방을 위한 HP 세포의 체외 유전자 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명은 치료적 잇점을 제공할 수 있는 충분한 수의 분화 전능성 세포를 포함하는 형질 도입된 HP 세포의 조성물을 제공한다. 일 실시예에 있어서, 본 발명은 형질 도입된 인간 HP 세포의 조성물과, 인체 내에서, 보호된 T-림프구를 발생시키기 위한 HIV에 대한 유전자 치료 방법을 제공한다.

바이러스성 감염, 특히, HIV 감염의 환경 하에서, 본 발명에 따르면, 인체 내에서 변이된 T-림프구의 장기간의 생존을 증가시키고, 이에 의해 T-림프구의 숫자를 증가시키는 동시에 면역 기능을 향상시키며, 보다 낮은 바이러스 복제 및 바이러스 부하를 유도함으로써, 현저한 피료적 잇점이 제공된다.

본 발명의 실시예에 있어서, 조성물 및 시스템의 형질 도입된 인간 HP 세포는, 환자에 주입된 경우, 주입 후 적어도 12 개월 동안, 바람직하게는 적어도 24 개월 동안, 더욱 바람직하게는 주입 후 적어도 30 개월 동안 분화된 조혈 세포를 발생시키면서, 장기간의 생착이 가능하다. 본 발명의 실시예에 있어서, 상기 형질 도입된 인간 HP 세포는, 자가 증식성 개체에 주입된 경우, 장기간의 생착이 가능하다. 본 발명의 실시예에 있어서, 상기 형질 도입된 인간 HP 세포는, 골수 절제 없이 개체에 주입된 경우, 장기간의 생착이 가능하다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 인체에 이송된 경우, 예를 들어, 생체 검사법에 의해, 혈액 또는 골수 중에서 적어도 한 종류의 세포의 적어도 0.01%의 유전자 변이된 세포가 검출되는 수준으로 장기간의 생착을 제공할 수 있는, 충분한 숫자의 형질 도입된 인간 HP 세포를 포함하는 조성물 또는 시스템이 제공된다. 상기 세포의 종류는 T-림프구 또는 대식세포/백혈구로 됨이 바람직하다. 바람직하게는, 유전자 변이된 세포의 수준이 적어도 0.1%, 더욱 바람직하게는 적어도 1%, 가장 바람직하게는 적어도 10%임이 바람직하다. 상기 형질 도입된 세포는 자가 증식성 개체의 내부로 이송됨이 바람직하다. 상기 형질 도입된 세포는 골수 절제 없이이송됨이 바람직하다. 장기간의 생착은 적어도 12 개월동안 일어남이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 적어도 24 개월, 좀 더 바람직하게는 적어도 30 개월 동안 일어난다. 상기 형질 도입된 유전자는 SCID가 아닌 질병, 예를 들어, 암 또는 감염성 질병의 치료를 위한 것임이 바람직하다. 상기 형질 도입된 유전자는 HIV 감염의 치료 또는 예방을 위한 것임이 더욱 바람직하다.

형질 도입을 위한 상기 HP 세포는 바람직하게는 단일 개체로부터 얻어진다. 형질 도입된 인간 HP 세포(% CD34⁺)의 CD34⁺순도는 적어도 65%로 되어야 하며, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%로 된다. 형질 도입 퍼센트는 적어도 약 10%로 되어야 하며, 바람직하게는 적어도 약 30%로 되고, 더욱 바람직하게는 적어도 약 50%로 된다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 형질 도입된 인간 HP 세포는 말초혈로 HP 세포가 동원된 후에, 인체의 혈액으로부터 분리된 CD34⁺세포로부터 유도된다. 이러한 동원은, 사이토킨, 바람직하게는 호중구 집락 자극 인자(G-CSF), 컨쥬게이티드 G-CSF(conjugated G-CSF), 페질레이티드 G-CSF(pegylated G-CSF) 및 과립세포-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 사용함으로써 이루어질 수 있다. 상기 사이토킨은 또한, 줄기 세포 인자(SCF), 인터류킨 3(IL-3)이나 기질 세포-파생 인자 1(SDF-1; Lataillade et al 2000) 또는 이와 동종의 활성 사이토킨을 포함할 수 있다. 시클로포스프아미드(cyclophosphamide)와 같은 제제를 사용하여 단 기간의 화학 요법을 진행함으로써, 상기 동원을 보조할수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 동원은, G-CSF 또는 페질레이티드 G-CSF를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 사이토킨은 개체의 체중 kg 당 적어도 약 10μg, 더욱 바람직하게는 kg 당 적어도 약 30μg의 양으로 매일 투여될 수 있다. CD34⁺세포는 사이토킨 처리를 개시한 후 3, 4, 5, 6일 또는 그 보다 늦은 날에 혈장 교환에 의해 모집될 수 있다.

바람직하게는, 혈장 교환은 적어도 두 번 수행된다. CD34⁺세포는 Isolex 300i 세포 선택 시스템 또는 CEPRATE SC 줄기 세포 농축 시스템과 같이, 당업계에서 주지된 임상적 분류 장치 중 어느 것에 의해서도 선택될 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 CD34⁺세포는 형질 도입 전에, 사이토킨 혼합물, 바람직하게는 MGDF 및 SCF, 또는 세포 주기로의 진입을 유도하기 위하여, 본질적으로 각각 약 100ng/ml 및 50ng/ml의 농도로 MGDF 및 SCF를 포함하는 것에 의해 처리된다. 세포 주기 유도는 사이토킨 IL-3, IL-6 및 SCF, 또는 이들 3 종의 조합이 추가되지 않고, 실행됨이 바람직하다.

형질 도입된 인간 HP 세포는, 하나 이상의 단백질 또는 RNA 분자, 예를 들어, 안티센스 분자, RNAi 분자, RNA 디코이 또는 리보자임 RNA(즉, RNA 제제)를 코딩할 수 있는 도입된 유전자를 함유한다. 상기 도입된 유전자는, 형질 도입되지 않은 HP 세포와 비교하여, 바람직한 방향으로 형질 도입된 HP 세포의 성질을 바꿀 수 있는 코딩된 단백질 또는 RNA라면, 어떤 것이라도 될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 도입된 유전자는, 발현된 경우, 형질 도입된 HP 세포 또는 이러한 세포의분화된 아들 세포에, 바이러스성 감염에 대한 저항력을 제공하며, 바람직하게는 HIV 감염에 대한 저항력을 제공한다. 더욱 바람직하게는, 상기 도입된 유전자는, 세포 내에서 HIV-1 복제를 억제할 수 있는 안티센스 또는 리보자임 RNA를 코딩한다.

HIV-1 감염과 같은 바이러스성 감염 또는 비-바이러스성 질병에 대항하도록 유도될 수 있는 리보자임의 종류에는, 해머헤드, 헤어핀, RNAse P, 헤파티티스 델타 바이러스(hepatitis delta virus; HDV), 그룹 I 또는 그룹 II의 인터비닝 시퀀스 리보자임(intervening sequence rebozyme), 또는 시험관 내의(in vitro)선택 방법에 의해 선택된 촉매 모티프가 포함된다. 상기 리보자임은 바람직하게는 해머헤드 또는 헤어핀 리보자임이며, 더욱 바람직하게는 해머헤드 리보자임이다. 이러한 리보자임은 상기 질병에 관련된 RNA 분자를 잘라낼 수 있다.

본 발명은 다중 리보자임(예를 들어, Ramezani et al 2002), 예를 들어 다중 촉매계를 가지는 리보자임이나, 여러 종류의 리보자임에 대한 조합물의 사용을 포괄한다. 이는 바이러스 감염에 대한 치료의 경우에, 바이러스성 내성의 경향성을 감소시킨다. 또한, 상기 리보자임 절단 부위(cleavage site)는, Rz2 절단 부위에 대한 경우와 같이, 바이러스성 표적 RNA에서 보존성이 강하게 됨이 바람직하다. 또한, 하나 이상의 효과에 대한 메카니즘을 제공하는 상술한 구성의 어떤 조합도 가능하다.

본 발명의 조성물 또는 시스템의 형질 도입된 인간 HP 세포는, DNA 또는 플라스미드 또는 바이러스성 전이 벡터에 의해 형질 도입된다. 도입된 유전자는, 적절하다면 역전사 후에, 세포 게놈에 통합됨이 바람직하다. 바람직하게는, 상기 세포는 RNA 종양 바이러스성 벡터, 예를 들어, 쥐에서 유래한 RNA 종양 바이러스성 벡터 또는 렌티바이럴 벡터(lentiviral vwctor)에 의해 형질 도입된다. 더욱 바람직하게는, 상기 RNA 종양 바이러스성 벡터는 LNL6(Bender et al. 1987) 또는 이와 다른 발암 RNA 종양 바이러스성 벡터로부터 유래됨이 바람직하다. 특별한 실시예에 있어서, 상기 세포는 RRz2로 형질 전환된다.

상기 도입된 유전자는 형질 도입된 인간 HP 세포 또는 프로모터로부터의 아들 세포에서 발현된다. 상기 프로모터는 구조적으로 발현되거나 유도될 수 있고, 예를 들어, 좋은 조건 또는 환경 하에서 우선적으로 발현된다. 상기 유전자는 RNA 폴리머라제 II(RNA 폴리머라제 II 프로모터) 또는 RNA 폴리머라제 III에 의해 전사될 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 조성물은 인체 내로의 이송이 쉽도록 제제화된다. 대부분의 세포는 예를 들어 95% 이상, 바람직하게는 98% 이상이 생존 가능하도록 되어야 한다. 상기 조성물의 부피는 바람직하게는 약 10ml 내지 약 1000ml이고, 더욱 바람직하게는 약 100ml 내지 약 500ml이다. 상기 조성물은, 바람직하게는 알부민 또는 젤라틴과 같은 단백질 제제 및/또는 글루코오스와 같은 당을 포함하는 완충염 용액인(이러한 제제는 상기 세포를 안정화시키도록 작용한다.) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 상기 담체는 소디움 시트레이트와 같은 응고 저해제를 함유한다. 상기 담체는 당업계에서 주지된 플라즈마 확장제(plasma expander)를 포함할 수 있다. 다른 측면에 있어서, 상기 조성물은, 박테리아, 균내독소(endotoxin), 미코플라즈마, HIV p24 항원 또는 복제 능력이 있는 RNA 종양 바이러스가 검출되지 않으며, 실질적으로 자유 형질 도입 벡터가 없고, 상기한 것들의 조합이 실질적으로 존재하지 않는 멸균성(박테리아성, 균성, 미코플라즈마성)이다. 또 다른 측면에서, 상기 조성물은 실질적으로 추가된 사이토킨이 없는 것이다. 상기 조성물은 비경구적으로, 바람직하게는 한 회 이상의 주입 또는 주사에 의해 개체에 투여될 수 있다.

본 발명은 또한, 상술한 조성물을 사용하는, 조혈 세포, 특히, 조혈모세포의 유전자 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 유전적 또는 감염성 질병, 예를 들어, HIV 감염의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 인간 피브로넥틴의 CH-296 단편(RetroNectin^TM)이나 그 균등물에 대한 사용, 또는 불필요한 세포를 제거하는 하나 이상의 부피 축소 단계, 또는 하나 이상의 세척 단계를 포함할 수 있다.

유전자 치료는 체외 또는 체내에서 수행될 수 있다. 상술한 바와 같은 방법은 바람직하게는, 체외적 접근법으로 적용함이 바람직하나, 체내적 접근법으로 적용하는 것도 가능하다(예를 들어, Newbound et al., 2001). 본 발명은 이미 질병을 가지는 개체에 대해 실행되거나, 예방학적으로 질병의 발생을 감소 또는 질병을 예방하기 위해 실행될 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용되는 HP 세포는, 말초혈, 골수, 제대혈 또는 조혈 세포를 발생시키는 줄기 세포로부터 얻어질 수 있다. 상기 세포는 바람직하게는 동원 후의 말초혈로부터 얻어진다. HP 세포는, 화학 요법 제제의 투여의 존재 또는 부존재 하에, 하나 이상의 사이토킨을 투여함으로써 말초혈로 동원될 수 있다. 상기 사이토킨은 G-CSF, 페질레이티드 G-CSF, 컨쥬게이티드 G-CSF, GM-CSF 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다. 상기 사이토킨은 또한, SCF, FL 및 IL-3로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 골수 절제 없는 환자 내에서, 적어도 0.01%의 유전자-변이된 조혈 세포를 장기간 제공할 수 있다.

상술한 실시예의 각 특징과 매개 변수는, 서로 적용 가능한 경우에, 상호 교환될 수 있으므로, 반복하지 않기로 한다. 따라서, 예를 들어, 첫 번째 실시예의 어떠한 매개 변수 및 특징도 본 발명의 다른 실시예에 적용될 수 있다.

정의

본 명세서에 사용된 조혈 세포라 함은, 골수에서 발견되는 세포와 같이, 통상적으로 혈액에서 발견되는 세포를 발생시키는 세포 뿐만 아니라, 혈액 내에서 통상적으로 발견되는 세포까지를 지칭한다. 이러한 지문에서, "통상적으로"라 함은, 혈액 또는 골수 내의 세포의 수 또는 특성을 바꾸기 위해 치료되는 사람의 경우까지를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바이러스성 벡터라 함은 세포 내에 도입되어 발현되는 바이러스 게놈의 모두 또는 이러한 바이러스 게놈을 부분적으로 포함하는 벡터를 의미한다. 이러한 바이러스성 벡터는 자연적, 돌연변이성 또는 재조합성 바이러스를 포함할 수 있다. 이러한 바이러스는 RNA 또는 DNA 게놈을 가질 수 있다. 적절한 바이러스성 벡터의 예에는, RNA 종양 바이러스성 벡터(렌티바이럴 벡터 포함), 아데노 바이러스성 벡터(adenoviral vector), 아데노-연관 바이러스성 벡터(adeno-associated viral vector) 및 혼성 벡터가 포함된다.

RNA 종양 바이러스성 벡터는 바이러스가 RNA 종양 바이러스과에서 유래된 바이러스성 벡터이다.

본 명세서에 사용된 "구성체"는 재조합 DNA 또는 RNA 분자로 될 수 있으며, 특정한 서열의 발현을 목적으로 발생된 재조합 핵산을 의미하는 것으로 사용되며, 또는 다른 제조합 핵산의 구성에 사용되는 것이다. 일반적으로, "구성체"는 본 명세서에서 분리된, 재조합 DNA 또는 RNA 분자를 지칭하는 것으로 사용된다.

본 명세서에서 사용된 "항-HIV 제제"는 포유류 세포 내에서 발현될 수 있고, HIV의 복제 또는 HIV의 포유류 세포에 대한 진입을 억제하는 모든 제제를 지칭한다. 이러한 제제는 핵산 또는 폴리펩티드로 될 수 있다.

"생착할 수 있다"는 어휘는, 본 명세서에서 조혈 세포가 연장된 시간, 예를 들어, 적어도 1년 동안 골수로 이식되어 유지될 수 있는 능력을 의미한다. 이러한 이식은 직접적으로(예를 들어, 생체 검사법에 의해) 또는 혈액 내에서의 아들 세포의 생성에 의해 검출될 수 있다.

"동원" 및 "동원된"이라는 어휘는, 본 명세서에서 조혈 세포가 골수 내의 조직 저장소로부터 말초혈로 이동하는 것을 지칭한다.

"사이토킨"이라는 어휘는, 여러 종류의 세포 또는 재조합 형태로부터 분비된것인지 여부에 무관하게, 세포 성장 또는 기능, 예를 들어, 세포간 연락의 강도 또는 지속 기간을 조절하는, 호르몬과 유사한, 임의의 수의 저분자량 단벡질을 지칭하는 것으로 사용된다. 사이토킨은, 예를 들어, 매개 면역(mediating immunity), 알러지, 그리고 조절성 숙성(regulating maturation) 및 세포의 성장에 참여할 수 있다.

본 명세서에 사용된 "성인"이라 함은 완전히 자라고, 육체적으로 성숙한 인체를 지칭한다. 인간 "성인"의 일반적인 나이는 18 세 또는 그 이상이다.

형질 도입은 바이러스성 백터를 사용한, 세포로의 유전적 물질의 도입을 지칭하는 것으로 사용된다.

본 명에서에서 사용된 바에 따르면, 형질 도입된 세포는 형질 도입 과정을 통해 발생되고, 안정적으로 통합되었는지 여부와는 무관하게, 형질 도입 전에는 함유되지 않았던 유전적 물질을 포함하게 된다. 몇몇 종래 기술에서 사용되었으나, 본 명세서에서는 사용되지 않은 바에 따르면, "형질 도입된 세포"는 형질 도입 과정을 통해 발생되고, 안정적으로 통합되었는지 여부와는 무관하게 유전적 물질을 포함하는 세포와, 이를 포함하지 않는 세포를 동시에 함유하는, 일군의 세포를 지칭할 수 있다.

트랜스펙션이라 함은 바이러스성 벡터가 사용되지 않은, 세포로의 유전적 물질의 도입을 지칭한다. 트랜스펙션의 예에는, 바이러스성 코팅 또는 외피가 없는, "노출된" DNA 또는 리포좀 내의 DNA의 삽입을 들 수 있다.

골수 절제라 함은, 환자 체내에서, 적어도 골수 구획(myeloid compartment)의 상당 부분(조혈 모세포를 포함하는 부분)을 파괴하는, 일반적으로 화학적 또는 방사성의 치료를 지칭한다. 골수 절제는, 골수 구획 세포의 작거나, 비실질적인 부분 만을 파괴하는 적응 치료를 포함하지 아니한다.

"약학적으로 허용 가능한 담체"라는 어구는, 표준적인 약학적으로 허용 가능한 염에 속하는 임의의 물질을 의미하는 것으로 사용된다. 이러한 물질의 예에는, 이에 한정되지는 않으나, 인산 완충 식염수, 및 물이 포함된다.

"재조합 피브로넥틴 단편"은 형질 도입 과정 중 벡터와 함께 세포를 모이도록 하는 작용을 하며, 피브로넥틴의 활성에 기초하는 제제를 지칭하는 것으로 사용된다. 예를 들어, RetroNectin^TM, TaKaRa Shuzo Co. Ltd.,는, 인테그린 VLA-5에 결합하는 중앙 세포 결합 영역, 프로테오글리칸에 결합하는 고친화성 헤파린-결합 영역, 그리고 인테그린 VLA-4에 결합하는 IIICS를 선택적으로 접합하는 지역 내의 CS-1부의 세 영역을 함유하는 재조합 피브로넥틴 단편이다(Williams 1999). 균등한 레트로넥틴 역시 기능적으로 RetroNectin^TM와 균등한 세 영역을 함유하며, RetroNectin^TM과 유사한, 세포와 벡터를 함께 모이도록 하는 제제(colocalization agent)는 기능적으로 균등한 적어도 두 영역을 함유한다.

본 명세서에서 사용된 "핵산 서열"이라 함은, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드, 그리고 이의 단편 또는 일부와, 단일- 또는 이중-가닥으로 될 수 있는 게놈 DNA 또는 게놈 RNA 또는 합성원을 지칭하며, 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낸다. 마찬가지로, 본 명세서에서 사용된 "아미노산 서열"이라 함은, 올리고펩티드, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 서열, 그리고 이의 단편 또는 일부와, 자연 발생적 또는 합성된 분자를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된, "안티센스"라는 어휘는 특정한 DNA 또는 RNA 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본 명세서의 "안티센스 가닥"이라는 어휘는, "센스" 가닥과 상보적인 핵산 가닥을 언급하는 것으로 사용된다. 안티센스 분자는 상보적인 가닥의 합성을 가능하게 하는 프로모터에, 소정의 유전자를 역방향으로 붙혀 안티센스 분자를 합성하는 방법을 포함하는, 어떠한 방법으로도 발생시킬 수 있다. 일단 세포에 도입되면, 이러한 전사체 가닥은 세포에 의해 형성된 자연적인 서열과 합해져 이중 구조(duplex)를 형성한다. 이러한 이중 구조는 더 이상의 전사 또는 번역을 차단한다. 이러한 방법으로, 돌연변이 표현형이 발생할 수 있다. "음성"의 지정은 때때로 안티센스 가닥을 언급하기 위해 사용되며, "양성"은 때때로 샌스 가닥을 언급하기 위해 사용된다.

본 명세서를 통하여, "포함한다", 또는 "포함하고"나 "포함하는"과 같은 이의 변형어는, 기재된 구성 요소, 완전체 또는 단계, 또는 일군의 구성 요소, 복수의 완전체 또는 단계에 대한 포괄을 나타내며, 기재되지 않은 다른 어떠한 구성 요소, 완전체 또는 단계, 또는 일군의 구성 요소, 복수의 완전체 또는 단계의 추가가 배제되지 않는 것으로 이해될 것이다.

본 발명의 원리를 입증하기 위한 모델

본 발명의 원리를 입증하기 위해 선택된 모델은 HIV 감염된 인간이다. 인체내의 HIV에 대한, 효과적이고, 장기간의 실질적인 치료 또는 박멸 또는 예방은 달성하기 힘든 목표이다. 따라서, 본 발명의 잇점은 지극히 복잡한 문제, 즉, 인체 내에서 HIV 감염에 대한 치료의 환경 하에서 실증된다.

그러나, 하기의 기재로부터 명백히 드러나는 바와 같이, 혈액 또는 면역계의 모든 질병을 포함하는 다른 질병 역시 본 발명의 조성물 또는 방법을 통하여 치료될 수 있다. 이러한 질병에는 혈색소병, 백혈구 형성 또는 기능의 결손, 면역 결핍, 리소좀 저장 장애 및 파코니 빈혈과 같은 줄기 세포 결함, 만성육아종성질환, 고셔병 및 포도당-6-인산탈수소효소 결핍 등이 포함된다. 이러한 장애의 다수는 동종 HP 세포 이식에 의해 성공적으로 치료되어 왔다(Parkman 1986). 그러나, 면역 억제에 대한 요구 또는 이식 거부 반응이나 이식편 숙주 반응 질환(graft versus host disease)와 같은 면역적 영향의 발생은 동종 골수 이식의 불편함이었다. 본 발명은 자기 증식성 HP 세포가 사용되는 잇점을 제공한다. 본 발명은 또한, 골수 억제성 영향에 대한 내성을 HP 세포 또는 그의 아들 세포에 부여하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 예시된 AIDS 또는 HTLV-1 (Bunnel and Morgan 1998)과 같은 다른 바이러스성 감염 등의 감염성 질병이나, 심혈관 질환(예를 들어, Orlic et al 2001 참조) 등의 후천성 질병 또는 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 암과 관련하여, 골수 이식 기술이, 주로 조혈계의 암을 포함하는 여러 가지 암에 대해 사용되어 왔다. 이는 보다 효과적인 치료를 제공하면서(review by Brenner 2001 참조), 항암제로부터 조혈 세포를 보호할 수 있는(Carpinteiro et al 2002) 이점이있다. 사용 가능한 유전자에는, 안트라사이클린, 빈카 알칼로이드(Vincaalkaloids), 포도필린스(podophyllins) 및 탁솔에 대한 내성을 부여하는 다중 약물 내성(MDR) 유전자, 그리고 메토트렉세이트(methotrexate) 또는 트리메트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 돌연변이 디하이드로폴레이트 리덕타아제(mDHFR) 유전자, 그리고 알킬화제에 대한 내성을 위한 O-알킬구아닌-DNA-알킬트랜스퍼라아제에 대한 유전자가 포함된다. 본 발명의 유전자 치료 방법은, 암에 걸린 세포에 대한 면역 응답을 변경하거나, 단순히 종래의 치료 효율을 모니터하기 위해 셀을 표시함으로써(Cornetta et al 1996), 악성 종양의 치료에도 사용될 수 있다. 조혈 세포의 유전자 치료 역시 수행되는 악성 종양의 치료에 대해서는, 변이 세포의 이송 전에 부분적이거나 완전한 골수 절제가 실행되는 경우가 많다.

HIV-1에 대한 유전자 치료

인간 면역 결핍(HIV) 군에는 HIV-1과 HIV-2 타입이 있다. HIV-1에 대한 복제는 현재 잘 알려져 있다. 최근의 표준적인 치료는 항 RNA 종양 바이러스 제제의 조합, 많은 경우 세 종류 이상의 조합을 사용하며, 단 기간 동안 HIV 복제의 조절을 제공할 수 있으나, 대개의 경우 약물 독성, 바이러스성 내성, 거북한 투약 방식 및 치료 비용과 같은 부정적인 측면에 관련된다.

형질 도입 표적으로 조혈모세포를 사용하는, HIV/AIDS에 대한 유전자 치료는 HIV로 감염된 세포의 풀을 바이러스 복제를 억제하도록 설계된 세포로 치환함을 목표로 한다. 이러한 방법은, CD4⁺세포를 보호하고, 보호된 면역 요소에 의해 매개된 항바이러스성 응답의 구축을 허용함으로써, 잠재적으로 바이러스의 근절에 기여할 수 있다. HIV 감염 진행 중에 긍정적인 영향을 내기 위한 이러한 방법에 있해서는, i) 어느 정도의 면역 재구성이 HIV 감염의 환경 하에서 일어날 것, ii) 재구성된 면역계가, 항원 인식 및 병원체에 대한 숙주의 보호를 가능하게 하면서, HIV-유래된 체액 소모로부터 보호될 것의 두 가지가 필수적이다. 바이러스성 부하에 대한 이러한 방법의 효과는 바람직하다. HIV 감염에서 면역 재구성에 대한 잠재력과 관련하여, 몇 가지의 보고에서, 면역계에 대한 고활성 항 RNA 종양 바이러스 치료(HAART)의 효과가 언급된 바 있다(Ho et al 1995; Zhang et al 1998). 본질적으로, HAART는, 기본적으로 HAART의 첫 4개월 동안의 메모리 세포의 확대로 인하여, CD4⁺세포의 총 수에 대한 증가와 연관된다. 이는 항원에 노출되지 않은 CD4⁺세포의 증가를 수반하며, CD4 활성 표지의 감소 및 항원을 되부르기 위한 증식성 응답의 증가에 관련된다(Autran et al 1997; Pakker et al 1998).

생체 밖에서(in-vitro)의 연구에 의하여 미감염된 성숙한 흉선이 T-림프구 생성을 뒷받침하는 능력을 유지한다는 사실이 설명된 바 있으나(Jamierson et al 1999; Poulin 1999), 조혈모세포 유전자 치료가 HIV-1 복제를 억제하도록 설계된 세포를 가지고, 면역계의 연장된 복구를 유발한다는 사실은 입증된 바 없다. 유전자 치료의 부재와 관련하여, 말초계에서 새로운 흉선 이주자의 출현은,이전에 HAART에 대한 경험이 없는 환자에 대하여 기술된 바 있으나, 이는 바이러스 감염이억제되는 경우에 대해서만 입증되었을 뿐이다(Douek et 1998; Zhang et al 1999). 약물 내성 및 미제어된 바이러스 감염의 환경 하에 있는 더욱 발전된 HIV에 의해 감염된 환자에서, 유사한 반응이 일어나는지 여부에 대해서는 알려진 바 없다. 부가하여, 상기 새로운 흉선 이주자를 발생시키는 모세포의 원천은 해명된 바 없다; 성인에서 HAART 후에 관찰되는 티모포이에시스의 정도를 좌우하는 조혈 전구체가, T-세포 고갈에 대한 응답으로써 골수에서 흉선으로 이동하는지 여부, 또는 HAART 후의 T-림프구의 확대가, 생의 더 이른 시기에 흉선을 이주시킨 T-림프구의 전구체로부터 유래되었는지 여부에 대해서는 알려진 바 없다. 실제로, HIV 환자에 대한 자가 이식성 이식 이후의 T-림프구의 출현은, 내생적인 잔류 T-림프구 전구체로부터 발생하는 T-림프구의 확대에 기인한 것이라 생각될 수 있으므로(Gabarre et al 2000), 활성 HIV 복제의 환경 하에서는, 성숙한 흉선에서 T-림프구의 확대를 행하는 말초혈 모세포의 능력이, 해명된 바 없다. 더구나, 선택된 CD34⁺세포를 사용하여 동종 조혈모세포 이식을 받은 미감염된 성인 환자에서는, 강한 골수 억제 후에 정상 이하의 흉선 활성을 보이면서, 두드러진 지연 및 차선의 T-림프구 회복이 나타난다(Behringer et 1999; Martinez et al 1999). 또한, 조혈모세포의 유전적 조작에 적용되는 방법에 내재하는 잠재적인 인자가, T-림프구 확대를 행하는 그 능력에 영향을 미칠 수 있다는 사실이 고려되어야 한다. 이러한 종전에 확인된 인자에는, 쥐에서 유래된 RNA 종양 바이러스를 사용한 형질 도입 준비 과정에서의, 모세포의 세포 주기로의 유도가 포함되는데(Roe et al 1993), 이는 골수 계통의수임(myeloid lineage commitment)를 초래할 수 있으며, 또한, 상기 인자에는, 모세포 이주, 정착 및 분화의 필요 과정을 방해하는, 구조적으로 발현된 외계 유전자의 존재가 포함된다. 그러므로, 본 발명자들은, 항원에 노출되지 않은 T-림프구를 포함하여, 유전적으로 보호된 T-림프구가 성인 HIV 감염의 환경 하에서 제조될 수 있는지 여부를 결정하려 하였다.

HIV-1 증식에 대한 간섭은 그 복제 주기의 어떤 단계에서도 일어날 수 있다. 세포의 RNA 종양 바이러스성 감염은, 세포 수용체와 바이러스성 글리코프로틴의 상호 작용에 의해 개시된다 (A) (도 1 참조). 흡착 및 코팅의 과정을 거쳐, 바이러스성 RNA는 표적 세포로 들어가며, 비리온 내로 이끌어진 효소, 즉, 역전사 효소의 작용에 의해 cDNA로 전환된다 (B). 상기 cDNA는 환형을 취하게 되고 (C), 이중-가닥 cDNA로 변환되고 나서, 인티그라아제 (D)의 작용에 의해 숙주 세포의 게놈 DNA에 통합된다 (D). 일단 통합되면, 5' LTR 내에 있는 프로모터로부터, 프로바이러스성 cDNA가 전사된다 (E). gag, pol 및 env에 대한 mRNA들을 포함하는 전사된 RNA 및 조절 벡터 tat, rev 및 vpr은 바이러스 단백질을 생성시키기 위해 번역되거나 (F), 초기의 바이러스 RNA 상태로 방치된다. 이러한 바이러스 RNA는, 비리온 내에서 둘러 쌓여지기 위하여 필수적인 Psi 패키지 서열을 함유한다 (G). 일단 비리온이 생성되면, 이는 세포막을 통해 출아함으로써 세포로부터 방출된다 (H). 일반적으로, RNA 종양 바이러스는 숙주 세포의 용해를 초래하지 않는다; HIV는 그 예외이다. 프로바이러스성 cDNA는 숙주 게놈 내에서 안정적으로 통합된 상태로 남아있으며, 아들 세포 역시 프로바이러스를 물려 받도록 하기 위해 숙주 세포 DNA와 함께복제된다. 잠제적인 항바이러스성 제제는 이러한 복제성 조절점의 임의의 점을 표적으로 할 수 있다. 예를 들어, CCR5 수용체의 다운-레귤레이션(down-regulation)은 HIV-1 복제를 억제활 수 있다(Bal et al 2000).

HIV-의 유전자 치료를 위한 본 발명을 가지고 사용될 수 있는, 이와 다른 종류의 접근법에는, 돌연변이 단백질(transdominant protein)의 세포내 발현(예를 들어, Smythe et al 1994), 세포내 항체의 발현(예를 들어, Marasco et al 1998, Shaheen et al 1996), 안티센스 리보헥산(RNA)의 세포내 발현 (예를 들어, Sczakiel and Pawlita 1991), 바이러스성 디코이의 세포내 발현(예를 들어, Kohn et al 1999), 촉매적 리보자임의 세포내 발현(예를 들어, Sarver et al 1990; Sun et al 1996) 및 RNAi의 세포내 발현(예를 들어, Novina et al 2002)이 포함된다.

돌연변이 단백질, 특히, 돌연변이 Rev 또는 Tat 단백질은 HIV RNA 또는 HIV 복제에 요구되는 인자에 결합함으로써 작용한다. 이는 비-돌연변이 단백질의 기능을 저해할 수 있도록, 비-돌연변이 단백질과 비교하여 변경된 기능을 가진다. 이는, 둘 이상의 활성을 결합시킨 융합 단백질로 될 수 있다. 특별한 일실시예에 있어서, 상기 돌연변이 단백질은, 초기의 T-세포에서 HIV-1 복제를 억제하기 위해 나타나는 RevM10 단백질이다(Ranga et al 1998). 제대혈 또는 말초혈에서 분리된, RevM10로 형질 도입된 CD34⁺세포는 쥐의 모델에서 성숙한 티모사이트(thymocyte)를 발생시키고, HIV-1으로부터 T-세포를 보호하였다(Bonyhadi et al 1997). 게다가, CD4⁺세포로의 RevM10에 대한 RNA 종양 바이러스 이송은, HIV-감염된 개인에서 이러한 세포를 보호하였다(Ranga et al 1998).

RNA 종양 바이러스성 구성체 pSLXCMV로부터 생성되고(Shaheen et al 1996), 일반적으로 단일 사슬종인 세포내 항체는, 특정한 바이러스 단백질을 격리시키거나, 결박하여 HIV 라이프 사이클을 억제할 수 있다. 특별한 일실시예에 있어서, 항-역전사효소(RT) 항체 단편은 생체 밖에서(in-vitro) HIV 감염을 억제하였다(Maciejewski et al 1995).

안티센스 RNA는 바이러스 RNA, 게놈 또는 전사 생성물의 양 자 중 하나에 결합할 수 있으며, 상기 RNA를 불안정하게 하거나, 번역과 같은 과정을 억제하거나, 핵으로부터 방출할 수 있다. 초기의 바이러스 RNA에 대한 결합은 또한, 바이러스를 생성하는 비리온 내로의 RNA의 패키징 과정을 억제하도록 작용할 수 있다. 종래에 주지된 바와 같이, 안티센스 분자의 상보적인 지역은 15 뉴클레오티드만큼 짧을 수 있고, 더욱 바람직하게는 30 뉴클레오티드 이상으로 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 100 내지 500뉴클레오티드의 길이로 될 수 있다. HIV-1 복제의 억제는, pol, gag, env, tat, vif 및 psi를 포함하는 바이러스성 구조 및 조절 유전자에 대하여 표적화된, 안티센스 RNA에 대해 해명된 바 있다(Veres et al 1998 참조). 안티센스 tat/rev 유전자를 포함하는 림프구로 치료한 후에, 안티센스 발현이 생체 내에서 렌티바이러스 복제를 억제할 수 있음을 보이면서, 관련된 유인원 면역 결핍 바이러스(SIV)의 복제는 제한되었고, 원숭이의 질병의 진행이 감소하였다(Donahue et al 1998). 특별한 일실시예에서, RNA 종양 바이러스 벡터 HGTV43은, HIV-1 게놈 내에서 tar 및 tat/rev 지역의 분리된 두 부분을 표적으로 한다. 이러한 분자는 시험관내 환경에서 HIV 감염에 대한 보호를 제공하는 것으로 나타난 바 있다.

RRE디코이 및 TAR 디코이와 같은 RNA 디코이 또한, HIV에 대해 세포를 보호하기 위해 사용되어 왔으며(Lee et al 1994, Lisziewicz et al 1993), HIV-1 관련된 단백질과 결합하고 이를 격리하는 능력을 향상시키기 위해, 다량체 형태로써 바람직하게 사용된다.

리보자임은 바이러스 RNA에 결합함으로써 작용할 수 있을 뿐 아니라, 이들을 잘라 내거나 비활성화 시킴으로써 작용할 수 있는며, 따라서 본 발명에 대해 사용하기에 좋다. 상기 리보자임은, 표적 RNA에 상보적인 하나 이상(보통 둘)의 지역과 효소 활성을 제공하는 하나의 촉매 지역으로 구성된다. 리보자임, 특히, 좀 더 긴 혼성화된 팔을 가지는 것은, 안티센스에 의해 사용되는 것과 유사한 작용 기전을 통하여 작용할 수 있다. 가장 널리 사용된 리보자임 모티프는, 미국 특허 제 6,127,114 호 및 제 6,221,661 호에 각각 기술된 바 있는 해머헤드 또는 헤어핀 종류이다. 특별한 일실시예에 있어서, RNA 종양 바이러스 벡터 pTCAG는, RRE 서열의 일부와 융합된 HIV-1 LTR의 U5 지역(위치-캡 부분으로부터 +111/112)을 표적으로 하는 헤어핀 리보자임과, tRNAval 프로모터로부터 발현되는 rev/env 코딩 지역(위치-HXB2 아이솔레이트의 8629-8644)을 표적으로 하는 리보자임을 코딩한다(Gervaix et al 1997).

RNAi 분자는, 서열-특이성 방법으로 숙주 세포 RNA 분해 기작을 일으키는 이중 가닥 RNA 지역을 가진 분자이다. 따라서, 이는 내생적 RNA 또는 HIV-1 RNA와 같은 병원체 RNA를 비활성화 시키기 위해 사용될 수 있다. 각각의 이중 가닥 지역은비교적 짧은데, 예를 들어, 21-25 염기쌍의 길이, 바람직하게는 약 30 염기쌍보다 작은 길이로 되며, 더욱 바람직하게는 19 내지 25 염기쌍의 이중 가닥 지역을 가진다. 각 이중 가닥 지역에는 하나보다 많지 않은 미스매치(이러한 미스매치에는 G:U쌍이 포함되지 않는 것으로 정의된다.)가 있음이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 미스매치가 없게 되고, 가장 바람직하게는 이중 가닥 지역이 완전히 염기쌍이 맞도록 짝지워진다. 표적화된 분자는 가변적이나(예를 들어, HIV-1 RNA), 표적화되는 지역은 보존성이 높아야 한다. RNAi 분자 중 이중 가닥 지역의 어느 하나의 가닥에 하나 이상의 미스매치를 가지지 않는다는 가정하에, 일군의 변체가 표적화될 수 있다. 더 긴 RNAi 분자에 대해서는, 다중 유전자의 표적화를 허용하면서, 몇몇 짧은 이중 구조가 연결될 수 있는데, 이는 더 높은 가변성을 가지는 표적에 대해 바람직하다. 이러한 RNAi 이중 구조는 또한, 접합 수단 또는 자기-절단 수단에 의해, 예를 들어, 상기 이중 구조 사이 또는 그 측면에 자기-절단 리보자임을 도입함으로써, 더 긴 RNA 전사체로부터 생성될 수 있다. RNAi 분자는 전도된 반복 구조를 가지는 DNA 분자로부터 쉽게 형성된다. 선택적으로, RNAi 이중 구조는 상보 지역을 가지는 2 개의 RNA 분자로부터 형성될 수 있다. 30 염기쌍 이상의 이중 가닥 지역을 가지는 RNAi 분자는, 그 분자가 핵으로 집중화되는 경우, 예를 들어, RNAi 분자가 폴리아데닐레이트 서열과 같은 세포질 방출에 대한 신호없이 이루어지는 경우에 사용 가능하다. 최근까지는, RNAi가 인간 세포 내에서 작용하는 것임이 밝혀지지 않았다. 그러나, 최근에 RNAi(iRNA, 또는 짧은 siRNA, 또는 헤어핀 RNA라고도 불림)가 T-림프구 내에서 HIV-1 복저를 억제함이 밝혀졌다(Novina et al 2002). 바이러스성 LTR, 또는 부속 vif 및 nef 유전자를 표적화하는 RNAi 분자는 세포 계통 및 본래의 림프구에서 HIV 복제의 초기 및 말기 단계를 억제하였다(Jacque et al 2002). RNAi는 다른 바이러스도 성공적으로 표적화하여 왔으며(예를 들어, Gitlin et al 2002), 내생 유전자 역시 표적화할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 것으로 본 명세서에 기재된 RNA 제제는 바이러스성 프로모터(예를 들어, RNA 종양 바이러스성 LTR, 시모메갈로바이러스) 또는 높은 수준의 발현을 위해 RNA 폴리머라아제 II를 사용하는 다른 프로모터로부터 발현될 수 있다. RNA 제제는, 예를 들어, 표시 유전자의 3' 미번역된 부분에 있는, 더 긴 전사체로 도입될 수 있다. 이러한 전사체는, 제제의 발생을 위해 자기-절단하도록 설계된다. 상기 RNA 제제는 tRNA 유전자, 아데노바이러스 VA1, U1 및 U6 또는 이와 다른 작은 핵 RNA 유전자로부터 유래된 유전자 구성체를 사용하여, RNA 폴리머라아제 III 프로모터로부터 발현될 수 있다. 더구나, RNA 제제는 표적 분자와 함께 상기 제제를 모이도록 보조하는 신호와 같이 제공될 수 있다(예를 들어, Michienzi et al 2000 참조).

HIV 또는 다른 감염을 치료하기 위하여, 리보자임 또는 다른 유전자를 사용하는 과학적 근거는 도 2에 개략적으로 나타나 있다.

본 발명의 목적은, CD4⁺세포의 증가된 생존과 함께, 흉선으로부터 보호된 T-림프구의 장기간의 출현 및 보호된 면역 요소에 의한 증가된 면역 응답을 가능하게 함으로써, 치료적 잇점을 제공하는 것이다.

조혈

조혈 세포는, 골수에서 발견되는 세포와 같이, 통상적으로 혈액에서 발견되는 세포를 발생시키는 세포 뿐만 아니라, 혈액 내에서 통상적으로 발견되는 세포까지를 포함한다. 이러한 지문에서, "통상적으로"라 함은, 혈액 또는 골수 내의 세포의 수 또는 특성을 바꾸기 위해 치료되는 사람의 경우까지를 포함한다. 조혈 세포의 분화 과정은 도 3에 개략적으로 나타난 바와 같다. 조혈은 혈액 형성계가 유지되는 과정이다. 이러한 과정은 세포의 사멸과 재생 및 새로운 세포의 분화 사이의 균형을 포괄한다.

성숙한 림프구의 생성을 위해서는, 전구체가 골수를 떠나, 흉선 내에서 선택 작용을 거치며, 최초의 세포로써 말초혈 내로 방출될 것이 요구된다. 흉선이 나이에 따라 안으로 감기며, CD4⁺T-림프구 방출의 비율이 이에 따라 쇠퇴하므로, 이러한 과정의 효율은 나이에 관련된다. 활성화된 T-세포 및 메모리 T-세포를 발생시키는 T-림프구의 생존 및 확대는 자연적인 항상성 유지 작용에 좌우된다.

조혈은, 골수 및 림프군 양 쪽 모두의 성숙한 작동체 혈액 세포로 증식, 분화하는 아들 세포를 장기간 동안 발생시키는 동시에, 장기간의 자기 재생 능력을 가지는 다능성 조혈 줄기 세포(pluripotent HS cell)의 풀에 의해 유지된다(Ogawa et al 1993, Orlic and Bodine 1994). HS 세포가 그 효과에 있어서 계속적으로 유지될 수 있도록, 상기 세포의 수는 세포 분열에 의해 유지된다. 적어도 이론적으로는, 전체 조혈계는 단일 HS 세포로부터 재생된다. 다수의 HS 세포가 체내에서 활동하지 않는 상태로 존재한다(Hodgson and Bradley 1979, Jones et al 1990).

조혈모세포(HP cell)는, CD34 세포 표면 항원의 존재와, 골수 및 림프구의 양 쪽 종류에 대한 다중 계통적인 아들 세포를 발생시키는 그 능력에 의해 특징지워진다. 어떤 CD34⁺조혈모세포는 자기 재생 능력을 가지며 진정한 줄기 세포로 간주될 수 있으나, 다른 CD34⁺조혈 세포는 자기 재생 능력을 가지지 못하고, 단지 제한된 능력만을 가질 수 있다. CD34⁺항원은 더 성숙한 조혈 세포에는 존재하지 않는다.

CD34⁺세포는 그 자체로 외래의 것이며(Bertolini et al 1998), 다른 표지, 예를 들어, CD38의 발현에 기초하여, 부차적인 집단으로 분별될 수 있다(Hogan et al 2002). 약 5%의 CD34⁺세포 개체수를 나타내는, 인간 CD34⁺/CD38^-세포는, SCID 쥐 모델에서, CD38⁺세포보다 더욱 우수한 장기간의 재구성 능력을 나타낸다는 사실이 밝혀졌다(Hogan et al 2002). 따라서, 2.5×10⁴CD34⁺/CD38^-(CD34⁺/CD38low) 세포는, 5×10⁵CD34⁺세포와 균등할 것이다. 장기간의 재구성 능력을 가진 세포의 개체수를 풍부하게 하기 위해서 사용될 수 있는 다른 표지에는, Thy-1⁺, CD133⁺, 인간 KDR⁺(VEGF 수용체), 인간 C1QR_P ⁺, HLA-DR^-, 및 로다민 123 또는 호크스트33342(Hoechst 33342)와 같은 생명 염료의 저수준 보유가 포함된다. 최근의 보고는 적어도 일정한 시간 동안 CD34 항원이 결핍된 HS 세포가 있을 수 있음을 나타내고 있다(Halene and Kohn 2000, Dao and Nolta 2000). 쥐에서 유래한 HS 세포에서, CD34가 활성 표지로 작용함을 암시하면서, CD34 표지의 가역 발현이 보여진 바 있다(Sato et al 1999). CD34+ 세포는 다계통 생착을 할 수 있고, CD34⁺세포를 발생시킬 수 있는 것으로 보여진 바 있다(Zanjani et al 1998).

본 발명에 의한 유전자 치료에 의해 변경된, 생착하고, 다계통 분화된 아들 세포를 장기간 발생시키는 HP 세포의 능력은, 본 발명의 중요한 특징이다. 이는 인체 내에서 유전자-변이된 조혈 세포의 지속을 제공한다. 이러한 능력은 골수 절제된 동물(Harrison 1980, Harrison 1988) 또는 바람직하게는 골수 절제된 인간, 또는 더욱 바람직하게는 골수 절제되지 않은 인간에서 조혈계의 재증식 능력에 의해 분석될 수 있다. 더더욱 바람직하게는, 이러한 능력은 HIV-1 감염과 같은 바이러스 감염 환경에서 분석된다.

HP 세포 및 그 분리

인간 HP세포의 분리 및 정제는 최근에 조사되었다(To et al 1997, Huss 2000, Thomas et al 1999, Sadelain et al 2000).

본 발명에 따른 유전자 치료에 사용되는 HP세포는 동원 후의 말초혈, 골수, 또는 제대혈로부터 분리될 수 있다. HP 세포는 조혈 세포를 발생시키는 줄기 세포로부터도 얻을 수 있다.

HP 세포는 바람직하게는 동원 후에 말초혈로부터 얻는다(Huss 2000). 동원이 진행된 말초혈로부터 HP 세포를 분리함에 있어서는 몇 가지의 이점이 있다. 처리될 수 있는 혈액의 양이 상대적으로 많으므로, 골수 또는 제대혈에 비하여 동원 후의 말초혈로부터 더 많은 숫자의 CD34⁺세포를 모을 수 있다. 이러한 과정은 일반적인 마취를 요하지 않으며, 감소된 병원비와 관련된다. 종래에 주지된 바와 같이(예를 들어, Fu and Liesveld 2000), 상기 동원은 하나 이상의 사이토킨으로 처리하고, 선택적으로 시클로포스프아미드와 같은 제제를 가지고 단기간의 화학 요법을 부가함으로써 실행될 수 있다 (Campos et al 1993). HP 세포는 G-CSF(Ho 1993, Lane et al 1995), 컨쥬게이티드 G-CSF, 페질레이티드 G-CSF 및 GM-CSF(Siena et al 1989), 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 말초혈 내로 동원될 수 있다. 이러한 동원은 하나 이상의 상기 사이토킨을 줄기 세포 인자(SCF), Flt-3 리간드(Ho et al 1996 약어로써 Flt3), 또는 인터류킨 3(IL-3; Huhn et al 1996)과 혼합하여 더욱 초진될 수 있다. 상기 동원은, 반작용성 기질 세포-파생 인자 1(SDF-1; Benboubker et al 2001) 또는 동원의 제한에 대해 음성적으로 작용하는 다른 인자에 의해 촉진될 수 있다. HIV-감염된 개체 내에서 G-CSF를 사용한 말초혈 HP 세포의 동원은 Law et al 1999에 의해 해명된 바 있다. 최대의 동원은 G-CSF 투여 후 4일 시점에서 달성된다. HP 세포는 4, 5, 6, 또는 그 이후의 날짜에 혈장 교환에 의해 얻을 수 있다. 혈액 내의 CD34⁺세포의 수준은 약 3일 경과 이후에 모니터되며, 예를 들어, 컴플리트 블러드 카운트(CBCs), 특이형 및 혈소판 산출이, 백혈구 증가의 정도를 평가하기 위하여 사이토킨 투여의 기간 동안 매일 실행될 수 있다. CD34⁺세포 산출량은 혈장 교환 전에 20세포/mm³보다 크게 됨이 바람직하다.

혈장 교환은 코브 스펙트라(Cobe Spectra; Gambra), 헤모네틱스(Hemonetics; Domediac), 아미커스(Amicus; Baxter) 또는 이와 균등한 장치에 의해 진행될 수 있다. 혈장 교환은 단핵 세포 내의 백혈구 개체수를 현저히 풍부하게 하며, 과립구에 대해서는 고갈시키는데, 이는 바람직하다. 처음 일련의 동원/혈장 교환에 의해 불충분한 CD34⁺세포가 얻어지면 동일하거나 변형된 동원 방식을 가지고, 상기 과정을 반복할 수 있다. 선택적으로, 혈장 교환이 반복될 수 있다. 첫 번째 과정의 CD34⁺세포는 극저온 보존되어, 추후의 과정에서 얻어진 CD34⁺세포와 합해질 수 있다.

초기의 HP 세포는 HIV 감염된 환자에서 감소되거나, 상실됨이 밝혀진 바 있다(Marandin et al 1996); 이 때문에 HIV 감염 환경 하에서 충분한 수의 세포를 얻기가 더욱 어렵게 된다.

HP 세포는 또한, 단핵 세포(MNC)를 분리하고, CD34⁺세포를 정제함으로써, 흡입기로 빨려진 골수로부터 분리될 수 있다. HP 세포는 또한, 제대혈로부터 분리될 수 있다(Gluckman 2000). 약 200ml의 제대혈 까지는 태어날 때 얻어질 수 있다. 이러한 세포는 극저온 보존되어 추후에 성공적인 형질 도입 및 이식을 위해 사용될수 있다(Huss 2000). 제대혈로부터의 HP 세포가 말초혈로부터의 세포보다 더욱 쉽게 형질 도입되고, 자기-재생 잠재력이 크다는 증거가 있다(Moore and MacKenzie 1999).

아이솔렉스 300i(Isolex 300i) 또는 이의 균등물을 포함하여, 임상적 사용을 위해 CD34⁺세포를 풍부하게 하는 장치들이 발전되어 왔다. 이들은, HP 세포 및 혈관 내피 세포에서 발현되는 막간 시알로뮤신(transmembrane sialomucin)인, CD34⁺세포 표면 항원에 대한 인식에 기초한다. 그 방법은, CD34 항원에 대해 특이적인 항체를 사용하는 면역 선택적인 방법을 포함하는데, 상기 항원의 항체는 자성 또는 형광성이나 선택을 가능하게 하는 다른 표지에 의해 표시될 수 있다. 세포가 내부적으로 CD34 단백질을 발현할 수 있으나, 이는 면역 선택을 허용하지 아니한다. 항체로의 접근을 허용하면서, 동시에 CD34 항원을 세포 표면에서 발현하는 세포는 단지 CD34⁺세포뿐이다.

CD34⁺세포에 대하여 현저히 풍부하게 된 조혈 세포군은 또한, 예를 들어, CD2, CD3, CD14, CD16, CD19, CD24, CD56 또는 CD 66b 글리코프로틴 A와 같은 계통-특이성 표지를 발현하는 세포군을 선택적으로 고갈시키는 항원-고갈 방법에 의하여, 상술한 원천으로부터 얻을 수 있다. 이러한 종류의 방법은, CD34⁺세포 뿐만 아니라, CD34⁺HS 세포에 대해서도 풍부하게 된 세포군의 분리를 허용한다.CD34⁺세포 또는 계통 고갈된 세포의 풍부화된 풀은 바람직하게는, 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 60% 그리고 가장 바람직하게는 적어도 80%의 세포가 이러한 종류이다. 바람직한 세포에 대한 순도 및 회수 사이의 균형은 때어져야 한다.

샘플에서 CD34⁺세포의 비율은, 예를 들어, Bender et al 1991에 의해 행해진 유세포 분석(flow cytometry) 방법으로 결정될 수 있다. CD34⁺세포의 숫자 및 비율은 표준화된 방법(Barnett et al 1998, Sandhaus et al 1988)으로 결정될 수 있다. 핵 주위로 모여진 세포의 숫자는 헤마토로지칼 애널라이저(hematological analyzer), 또는 더욱 바람직하게는 CD34의 숫자가 단일 유세포 분석으로부터 직접 도출되는 싱글-플랫폼 에세이(single-platform assays)에 의해 결정된다. CD34⁺세포수의 계산 및 사용될 수 있는 장치의 일부는 최근에 조사된 것이다(Reis 1999).

일단 분리되면, CD34⁺세포는 종래에 알려진 것으로, 플라스크 또는 백(bag; 예를 들어, 기체-투과성 폴리프로필렌 백)과 같은 용기에 있는 어떠한 적절한 배지에서도 배양될 수 있다(Giarratana et al 1998).

대부분의 CD34⁺세포가 단기간의 재구성에는 참여하나 장기간의 재구성에는 참여하지 않으며, 모든 CD34⁺세포 중 작은 부분 만이 장기간의 다계통 생착 잠재력을 가진다는 사실에 대한 증가된 증거가 있다(Bertolini et al 1998). 이러한 사실은 초기의 보고에서 CD34⁺세포수의 계산 및 생착 가능성에 대한 걱정을낳았다(Ducos et al 2000). 본 발명자들은 형질 도입된 인간 CD34⁺세포 및 본 발명의 방법이 장기간의 다계통 생착을 제공할 수 있음을 보인 바 있다.

쥐에서 유래된 발암 RNA 종양 바이러스성 벡터를 사용한, 형질 도입을 위한 HP 세포의 처리

쥐에서 유래된 발암 RNA 종양 바이러스성 벡터(예를 들어, MMLV에 기초한 것) 및 다른 RNA 종양 바이러스성 벡터를 가지고, 인간 HP세포에 효과적으로 형질 도입함에 있어서는, 예를 들어 하나 이상의 사이토킨(성장 인자) 세포 주기 조절의 억제제를 가지고, 세포 주기가 유도되어야 한다(Dao and Nolta 1999). 트롬보포이에틴(TPO), Flt-3 리간드(FL) 및 Kit 리간드(KL, SCF로도 알려짐)의 조합이 생체 밖에서(in-vitro) 사용되어 왔다(Murray et al 1999, Ng et al 2002). MGDF, SCF 및 FL의 조합은 영장류에서 재증식 분석에 사용되었다(Wu et al 2000). Amado et al은 MGDF 및 SCF를 가지고 세포를 처리하는 것이, 쥐의 모델에서 다른 인자의 조합보다, 티모사이트 전구체 세포의 생존을 더 잘 뒷받침한다는 사실을 보인 바 있다(Amado et al 1998). IL-3, IL-6, SCF 또는 TPO이나 이들의 조합은 HP 세포의 형질 도입에 긍정적인 효과를 나타낸다는 사실이 보여진 바 있다(Nolta et al 1992, Hennemann et al 1999). FL/SCF/IL-3/IL-6, SCF/G-CSF, FL/SCF/TPO/IL-6, FL/SCF/G-CSF, FL/SCF/TPO 및 FL/SCF/GM-CSF의 조합은 또한, 큰 동물의 모델에서 사용되어 왔다(Richter and Karlson 2001). 그러나, IL-3, IL-6 및 SCF의 조합은생착을 손상시킨다(Peter et al 1996). HP 세포의 주기를 유도하기 위한 다른 접근법에는, 세포 숫자를 늘리기 위하여, p27의(kip1) 억제제(예를 들어, 안티센스 분자 또는 항체)(Dao et al 1998, Cheng et al 2000) 또는 변형 성장 인자 베타-1(Ducos et al 2000, Imbert et al 1998)을 사용하는 것이 포함된다. 그러나, 이러한 임의의 방법으로 자극되고 나서 인간에서 장기간의 생착을 부여하도록 형질도입된 세포의 능력은, 본 발명의 이전에는 알려진 바 없다.

SCF(c-kit 리간드)은 주로 골수 기질 세포에 의해 생성되며, HSC의 생존 및 자기 재생에 있어서 중요한 작용을 한다(Lyman and Jacobsen 1998). 이는 또한 줄기 세포 풀에서 나가 아들 세포로 들어가는 HS 세포의 이동에 코-미토젠(co-mitogen)으로 작용한다. Flt-3 리간드(FL)은, 초기의 조혈 세포에서 발현되는 클래스 III 수용체 타이로신 키나아제에 결합하는 사이토킨이다(Lyman and Jacobsen 1998). FL은 HP 세포의 생존 및 증식에 대하여 SCF와 함께 시너지 효과를 낼 수 있다(Dao et al 1997). 트롬보포이에틴(TPO)은 c-Mpl 수용체에 대한 리간드이고, 거핵구 및 혈소판 형성 뿐만 아니라, 초기의 조혈에도 참여하는 성장 인자이다(Solar et al 1998). MGDF는 TPO의 페질레이트되고 끝이 잘려진 형태이며, TPO와 마찬가지 방식으로 작용한다; 이는 기능적으로 TPO와 균등한 것으로 간주될 수 있다. 이들 사이토킨의 어떤 것도, 균등한 효과를 제공하는 한, 변이되거나, 다르게 조직화되거나 또는 혼성화될 수 있다.

리보자임

리보자임은 특이적으로 RNA를 잘라낼 수 있는 효소 RNA이다(예를 들어, Haseloff and Gerlach 1988). 이는, 촉매적이며, 전도를 나타내므로, 다중 표적 분자를 잘라낸다. 리보자임은 상보적인 서열의 덕으로 특이적인 표적 RNA 리보자임과 쌍을 이루며, RNA의 포스포다이에스테르 백본을 따라 특이적 부분에서의 절단을 유도한다(Haseloff and Gerlach, 1988; Rossi et al., 1992; Hampel et al 1990; Ojwang et al 1992). 해머헤드 리보자임은 작고, 단순하며, 측면에 위치하는 여러 가지 서열 모티프에 도입되는 경우, 부분-특이적인(site-specific) 절단을 유지하는 능력을 가진다(Haseloff and Gerlach, 1988; Rossi et al., 1992). 리보자임에 의한 절단에 요구되는 것은, RNA의 접근 가능한 지역과, 해머헤드 리보자임의 경우, NUH 표적 모티프(N이 임의의 리보뉴클레오티드이고, H가 A, C 또는 U 리보뉴클레오티드이다.)이다. 절단은, NUH 표적 모티프의 3'에 직접 인접하여 이루어진다. 이러한 특징으로 인해, 유전자 억제에 특히 적합한 것으로 된다. 다른 종류의 리보자임에는 소위 헤어핀 리보자임, 헤파티티스 델타 바이러스 리보자임(HDV), RNAse P, 인터비닝 시퀀스 리보자임(IVS) 그룹 I, IVS 그룹 II, 그리고 생체 밖에서(in-vitro)의 선택 방법에 의해 확인된 모티프들이 있다. 이 중, 해머헤드 및 헤어핀 리보자임이 가장 작으며, 가장 널리 사용된다.

Rz2의 기술

수 많은 연구를 통해, 시험관 반응에서의 리보자임 절단 활성, 그리고 HIV-1의 실험적, 임상적 분리체에 대한 조직 배양 시스템의 보호적 효과가 해명되어 왔다(Sarver et al. 1990; Sun et al. 1995; Wang et al 1998). Rz2로 표시된 특별한 해머헤드 리보자임은, tat 유전자의 지극히 보존된 지역에 대해 인도된다(도 4). 상기 tat 유전자는 HIV-1 복제에 있어서 필수적이다; 이는 통합된 HIV-1 프로바이러스의 전사적 활성제인 Tat 단백질을 코딩하고, 생성시킨다. Sun et al(1995)은 생체 밖에서(in-vitro) HIV-1로부터 T-림프구를 보호하기 위하여 Rz2를 사용하였으나, 실제 환자에서의 결과를 기술하지는 않았다. 또한, 위의 연구에서는, 형질 도입된 HP 세포의 최소 숫자가 연장된 생착을 위해 사용되어야 한다거나, 그 최소 숫자가 얼마나 될 것인지에 대해서는 개시하지 않았다. Amado et al(1999)은 HIV-1 감염된 개체 내에서, MoMLV에 기초한 RNA 종양 바이러스 벡터를 가지고, CD34⁺세포에 형질도입한 경우, 그 가능성과 안전성을 결정하기 위한, I 상 임상적 시도를 사용하는 실험 계획서를 일반적인 의미로 기술한 바가 있다. 이러한 연구에서는 그 시도의 결과 또는 장기간의 생착을 위해 최소 숫자의 형질도입된 HP세포가 사용되어야 한다는 사실에 대해서는 기술하지 않았다. 상기 시도의 목적에는, 형질 도입의 효율 및 안정성과을 결정하는 것과, 리보자임이 생체 내의 아들 세포에 대해 생존적 이점(또는 불이익)을 부여할 것인지 여부를 시험하는 것이 포함되었다.

도 4는 Rz2의 구조 및 HIV-1 변종 HXB2 내에서 5833에서 5849 위치에 있는 이의 표적 서열(Genbank 서열 KO3455)을 나타내는데, 상기 표적 서열에서는, 5842의 위치에 있는 트리플렛 GUA 다음에서 절단이 일어난다. 상기 표적 서열은, 참고 변종 HIV-HXB2(Genbank 접근 번호 KO3455)의 뉴클레오티드 5833-5849 (GGAGCCA GUAGAUCCUA), 또는 HIV IIIB(Genbank 접근 번호 XO1762)의 뉴클레오티드 5865-5882 (GGAGCCA GUA GAUCCUA), 또는 다른 HIV 변종으로부터의 해당 지역을 포함한다. Rz2 리보자임에 대응하는 서열 5'-TTA GGA TCC TGA TGA GTC CGT GAG GAC GAA ACT GGC TC-3'을 가지는 DNA 뉴클레오티드는, 플라스미드 pLNL6 내에서 neo^R유전자의 3' 미번역되는 지역 내의 SalI 부분에 삽입되는데, 상기 플라스미드는, 새로운 바이러스. RRz2를 생성하기 위하여 복제-불능의 RNA 종양 바이러스성 벡터 LNL6(Genbank 접근 번호 M63653)을 함유한다. 상기 리보자임 서열은, RRz2 내의 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus; MoMLV) 긴 말단 반복(Long Terminal Repeats; LTR)으로부터, neo^R-리보자임 융합 전사체로써 발현된다.

리보자임 절단부의 주위에 직접 인접하는 뉴클레오티드 서열은 바이러스 표적 RNA 내에서 현저히 보존됨이 바람직하다. 이는 서열 데이터베이스 내에서 사용 가능한 서열의 비교에 의해 쉽게 결정될 수 있거나, 다중-통로 분석(multiple-passage assays)에 의해 실험적으로 테스트될 수 있다(Wang et al 1998). HIV-1에서 Rz2 표적/절단부는, 거의 모든 자연적으로 발생하는 감염성 분리체에서 보존적이다. I 상 임상적 시도에서, 두 개의 서열 변형이, 절단부에 있는 트리플렛 GUA에 대하여 -4 및 +1의 위치에서 관찰되었다. 그러나, 이들 변형은 덜 적합한 슈도타입(pseudotype)이다.

CD4⁺및 CD8⁺T-림프구, 백혈구 및 대식세포는 HIV-1에 가장 감염되기 쉽기 때문에, 이들 세포가 Rz2를 발현하도록 하는 유전적 변이가 HIV 감염의 억제를 이끈다. 바람직하게는, 상기 유전적 변이가 조혈의 초기 단계에서 이루어진다.

벡터.

여러 다른 종류의 벡터가 HP 세포의 형질 도입 또는 변형을 위하여 사용될 수 있다. 이러한 벡터에는 플라스미드 또는 바이러스성 벡터가 포함된다. RNA 종양 바이러스성 벡터, 특히, 쥐에서 유래한 발암 RNA 종양 바이러스의 일종인 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV)에 기초한 벡터는 유전자 치료에서 이제까지 널리 사용되어 왔다(Chu et al 1998). 사용 가능한 다른 종류의 쥐에서 유래한 발암 RNA 종양 바이러스에는, 쥐의 배아 줄기 세포 바이러스(MESV) 및 쥐의 줄기 세포 바이러스(MSCV)에 기초한 벡터가 있다. 쥐에서 유래한 발암 RNA 종양 바이러스에 기초한 벡터는, 높은 효율로 세포에 형질 도입을 하기 위해 사용될 수 있으나, 이들은 세포 분열에서 세포가 활성일 것을 요구한다. 세포질 내로의 진입 및 역전사가 이루어진 후, 통합전 복합체가 핵으로 이동되기 위해서는, 유사 분열 동안에 핵막의 붕괴가 이루어져야 한다. 따라서, 쥐에서 유래한 RNA 종양 바이러스에 기초한 벡터를 가지고 HP 세포의 형질 도입을 하기 위해서는, 세포의 활성이 요구된다.

RNA 종양 바이러스성 벡터의 하위 그룹에 속하는, 렌티바이러스성 벡터(Amado and Chen 1999) 역시 고효율 형질 도입을 위해 사용될 수 있으며(Haas et al 2000, Miyoshi et al 1999, Case et al 1999), 분열되지 않는 세포에 형질 도입할 수 있다(Uchida et al 1998, Sutton et al 1998). 통합전 복합체가 유사 분열 없이 핵의 내부로 진입할 수 있으므로, 렌티바이러스성 형질 도입은 HP 세포가세포 주기로 유도될 것이 요구되지 않는다. 이는 상기 세포가 다능성을 유지할 가능성을 높일 수 있다. HIV-1에 대한 유전자 치료에서의 렌티바이러스성 벡터의 사용은, 조사된 바 있다(Mautino and Morgan 2002).

스푸마바이러스(spumaviruses)와 같은 RNA 종양 바이러스의 다른 그룹, 예를 들어, 포미 바이러스(foamy virus)(Vassilopoulos et al)는 또한, 분열되지 않는 세포에 대해 효과적으로 형질 도입할 수 있다.

본 발명에서 사용 가능한 다른 종류의 바이러스성 벡터에는 아데노 바이러스성 벡터(Fan et al 2000, Knaan-Shanzer et al 2001, Marini et al 2000), 아데노-연관 바이러스(AAV)성 벡터(Fisher-Adams et al 1996), SV40에 기초한 벡터(Strayer et al 2000), 또는 혼성 벡터의 형태(예를 들어, Feng et al, 1997 또는 Lieber et al 1999). 아데노 바이러스성 벡터는 고역가에서 쉽게 생성될 수 있는데, 쉽게 농축될 수 있고(10¹²pfu/ml), 분열하지 않는 세포에 형질 도입할 수 있다. 큰 DNA 삽입물(7-8 kb)이 수용될 수 있다. 생체 내에서 아데노 바이러스에 대한 면역 반응은, 특정한 유전자를 코딩하는 유전자를 제거함으로써 완화될 수 있다.

AAV 벡터는 비-병원균성이고, CD34⁺세포를 포함하여 증식성 및 비증식성 세포 모두에 형질 도입하며, 세포 게놈에 안정적으로 통합된다(Grimm and Kleinschmidt 1999). 더구나, 이들은 숙주 면역 응답을 유도하지 않으며, 별도의 보조제가 없는 계에서, 약 10¹⁰cfu/ml 이상의 높은 역가로 생성될 수 있다. AAV는단일 가닥 DNA 게놈을 가진 비외피성 바이러스이다. AAV 벡터는 약 4 kb 까지의 새로운 DNA를 쉽게 도입할 수 있으며, 다만, 최근의 연구에서 이러한 수치를 확장시켰다. AAV 벡터는 장기간의 배양에서, 효과적으로 CD34⁺세포에 형질 도입할 수 있다(Chatterjee et al 1999).

세포를 환자에 다시 주입한 후에 장기간 유지되는 효과를 얻기 위하여, 도입된 유전자의 세포 유전자로의 통합을 초래하는 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스성 벡터를 포함하는 RNA 종양 바이러스성 벡터 및 AAV 벡터가 바람직하다. 바이러스성 벡터의 통합은 본 명세서에서, 그 게놈 물질의 전부 또는 일부가 세포 게놈으로 통합됨을 초래하는 것으로 정의된다. 상기 벡터에는 RNA 종양 바이러스성 벡터 및 AAV 벡터가 포함된다. 상기 벡터에는 또한, 아데노 바이러스/RNA 종양 바이러스 벡터(예를 들어, Feng et al 1997) 및 아데노바이러스/AAV 벡터(예를 들어, Lieber et al 1999)와 같은 혼성 벡터가 포함된다. 그러나, 에피솜으로써 안정적으로 복제할 수 있는 벡터 역시 사용될 수 있다. 상기 벡터는 세포 계통에서 고역가, 비용 절감적 방법으로 생성될 수 있고, 환자에 대해 최소한의 위험성을 가짐, 예를 들어, 복제 가능한 바이러스를 발생시키지 않음이 바람직하다.

벡터의 생성

RNA 종양 바이러스성 벡터을 구축하고, 생성시키는 방법은 Gambotto et al(2000)에서 조사된 바 있다. 벡터는, 그 자체로 둘러 쌓이는 능력에 결함이 있는보조 벡터를 포함하는, PA317 또는 AM-12 등의 패키지 세포 계통에 의해 둘러 쌓여진다. 매질, 패키지 세포, 채취 및 원심 분리 또는 복합체화(complexation; Le Doux et al 2001)를 통한 농축 방법을 포함하여, 고역가 RNA 바이러스성 벡터 상청액을 생성시키는 방법에 대한 몇 가지의 변형이 기술된 바 있다(Schilz et al 2001). 이들 방법의 어떤 것도 본 발명에 사용될 수 있다.

쥐에서 유래한 암포트로픽 외피(murine amphotropic envelop)에 둘러 쌓인 RNA 종양 바이러스는, 암포트로픽 수용체의 낮은 수준으로 인하여, 초기의 HP 세포에 효과적으로 형질 도입하지 못할 수 있다(Bodine et al 1998). 그러나, 세포 주기 유도는, 유전자 이송의 조화된 증가와 함께, 암포트로픽 수용체의 증가된 발현을 초래함이 밝혀졌다(Orlic et al 1999). 선택 가능한 다른 접근 방법은, 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus; GALV)(Kiem et al 1997, Eglitis and Schneiderman 1997, Relander et al 2002), 소낭성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus; VSV-G 단백질)(Naldini et al 1996, von Laer et al 1998) 또는 고양이 내생 바이러스(feline endogenous virus)(Kelly et al 2002)의 외피 등으로 RNA 종양 바이러스의 슈도타입(pseudotype)화 하는 것이다. 벡터를 슈도타입화 하면, 예를 들어, 원심 분리에 의해 농축이 가능하다.

AAV 벡터는, 패키지 세포 계통 또는 구조적으로 또는 일시적으로 AAV rep 또는 cap 유전자를 발현하는 세포에서 생성될 수 있다. 벡터 생산자 계통의 구축과 보조제 없는 패키지 방법의 전개를 포함하는, AAV 벡터에 대한 생성이 조사된 바 있다(예를 들어, Fan et al 2000).

바이러스 군체의 생물학적 역가는 쉽게 결정될 수 있다(예를 들어, Tavoloni et al 1997).

벡터에서 유전자의 발현

도입된 유전자는, 본 발명에 의한 형질 도입된 인간 HP 세포 또는 프로모터로부터의 아들 세포에서 발현된다. 상기 프로모터는 구조적으로 발현되거나 유도될 수 있고, 예를 들어, 좋은 조건 또는 환경 하에서 우선적으로 발현된다(예를 들어, Chang and Roninson 1996, Saylors et al 1999). 특이한 세포종에 대한 표적화된 발현은 혈색소병 또는 지중해 빈혈과 같은 몇 가지의 유전적 장애에 바람직하다(Grande et al 1999). MoMLV RNA 종양 바이러스 LTR 프로모터와 같은, 바이러스성 벡터의 프로모터/엔핸서(enhancer)는, 발전된 발현을 위해 변이되거나(Robbins et al 1998, Halene et al 1999), 인슐레이터(insulator) (Rivella et al 2000) 또는 골격 부착 지역(scaffold attachment region; SAR) (Murray 2000)과 같은 요소의 삽입에 의해 변이될 수 있다. 폴리아데닐레이션 신호와 같은, 바람직한 프로모터 또는 부가적인 조절 요소는, 유전자 치료 제제가 발현될 세포종(예를 들어 T-림프구)에서 최대한의 발현을 내야만 하는 것이다. 따라서, 예를 들어, HIV-1, HIV-2, HTLV-1 및 HTLV-2는 모두 림프 세포를 감염시키고, 이러한 바이러스에 대한 유전자 치료 제제를 최대한 발현시키기 위하여, 조혈 세포(또는 조직), 특히, 림프 세포(또는 조직)에서 효과적인 발현을 제공하는 전사 조절유닛(프로모터 및 폴리아데닐레이션 신호)이 선택된다. 바람직한 프로모터에는, 선택적으로 성장 호르몬 폴리아데닐레이션 신호와 함께 사용되는, 사이토메갈로바이러스(CMV) 이미디어트 어얼리 프로모터(immediate early promoter)와, 몰로니-MuLV LTR의 프로모터가 있다. LTR 프로모터의 바람직한 특성은, 그 기원이 되는 RNA 종양 바이러스와 같은 조직 향성을 가진다는 것이다. CMV 프로모터는 림프구 내에서 발현된다. 다른 프로모터에는, RNA 폴리머라아제 III에 의존하는 VA1 및 tRNA 프로모터가 포함된다. 메탈로티오닌 프로모터(metallothionein promoter)는 유도 능력의 이점을 가진다. SV40 초기 프로모터(SV40 early promrter)는 생체 밖에서(in-vitro)의 골수 내에서 고수준의 발현을 나타낸다. 조혈 세포-특이성 프로모터가 바이러스성 프로모터 대신 사용될 수 있다(예를 들어, Malik et al 1995).

MoMLV에 기초한 벡터로부터의 몇 가지의 항-HIV 유전자의 발현은, 장기간 유지된다(Austin et al 2000, Su et al 1997). MoMLV 이외의 RNA 종양 바이러스에 기초한 벡터는, 예를 들어, 쥐 줄기 세포 바이러스(MSCV) 벡터(Cherry et al 2000) 또는 FrMLV(Cohen-Haguenauer et al 1998)에 대해 연장된 발현을 나타냄이 밝혀졌다. 렌티바이러스성 벡터의 발현은 또한, 형질 도입된 세포 내에서 유지되는 것으로 보인다(Case et al 1999). RNA 종양 바이러스성 벡터에서 유전자 발현의 상실은, 때때로 쥐에서 유래한 조혈 세포의 형질 도입 이후에 관찰되었으나(Challita and Kohn 1994, Lange and Blankenstein 1997), 인체 내의 형질 도입된 인간 HP 세포에서는 거의 관찰된 바 없다.

형질 도입 방법

쥐에서 유래한 RNA 종양 바이러스성 벡터 중 일부로 형질 도입하는 경우, 인간 HP 세포는 세포 주기의 유도를 위해 성장 인자로 처리되어야 할 필요가 있다(상기의 기재 참조). 이는 다른 RNA 종양 바이러스성 벡터에서는 적용되지 않을 수 있다. 이러한 임의의 처리를 거치고 나서, 상기 세포는 형질 도입 벡토와 접촉할 필요가 있다.

본 발명의 형질 도입 방법에 있어서, 세포와 바이러스성 입자를 함께 모이도록 촉진하고, 형질 도입 빈도를 증가시키는, 세포 밖의 매트릭스 단백질 피브로넥틴(또는 피브로넥틴의 키모트립틱 단편(chymotryptic frangment))을 사용함이 바람직하며(Hanenberg et al 1996, Hanenberg et al 1997, Kramer et al 1999, Williams et al 1999), 더욱 바람직하게는, 재조합 피브로넥틴 단편 CH-296를 사용한다. 헤파린-결합부와 선택적으로 접합된 타입 3 연결 구획 지역을 함유하는, 균등한 단편 역시 사용될 수 있다(Kiem et al 1998). CH-296의 사용은 또한, 쥐의 이종 이식 모델에서 볼 수 있는 바와 같이, HP 세포의 재생 잠재력의 유지에 도움이 될 수 있다(Dao et al 1998). CH-296 및 성장 인자의 조합물의 사용은, 개의 모델에서 적용되었으나(Goerner et al 1999), 이것이 인간데 어떻게 적용될 수 있는지에 대해서는 알려지지 않았다. 폴리브렌(polybrene) 및 프로타민 설페이트와 같은, 세포와 바이러스성 입자를 함께 모이도록 하는 다른 제제 역시 사용될 수 있다. 이러한 제제는 바이러스성 입자의 식별 가능한 역가를 증가시킴으로써 작용한다.

세포와 벡터를 물리적으로 함께 모이도록 하는 것은, 막 필터 상에서 이루어지거나(Hutchings et al 1998), 피브로넥틴-코팅 튜브 내의 원심 분리에 의해 이루어질 수 있다(Schuening 1999).

쥐에서 유래한 벡터-생성 피브로블라스트(fibroblast)의 단일막 상에서 HP 세포를 함께 배양하면, 효과적인 유전자 형질 도입이 이루어질 수 있으나, 이는 쥐에서 유래한 많은 주입 세포에 환자를 노출시키므로, 임상적으로는 유용하지 않다. 반대로, 인간 중간엽 줄기 세포는 충분한 CD34⁺형질 도입을 위한 기질의 뒷받침을 제공할 수 있다(Reese et al 1999).

혈청이 없는 RNA 종양 바이러스성 벡터의 생성 방법이, 인간 HP 세포의 형질 도입을 위해 사용될 수 있다(예를 들어, Glimm et al 1998, Schilz et al 1998). 형질 도입 빈도는, 피브로넥틴 단편의 존재 하에서, 매질을 함유하는 벡터의 농도를 감소시키거나, 벡터를 단독으로 피브로넥틴 단편 상에 가함으로써, 특히, CD34⁺CD38low 세포에 대해 증가될 수 있다(Relander et al 2001). 증가된 형질 도입 빈도는 예를 들어, 양이온성 및 음이온성 중합체를 가지고 바이러스 생성을 강화함으로써 달성될 수 있다(LeDoux et al 2001).

비-바이러스성 수단을 사용한 세포의 트렌스펙션은 양이온성 리포좀, 또는 폴리-리신-DNA 복합체와 같은 DNA-단백질 복합체, 또는 종래에 알려진 다른 수단을 사용하여 이루어질 수 있다.

몇몇 연구자에 의하여, 인간 조혈 세포로의 유전자 이송에 대한 조건이 조사되었다(Moore and MacKenzie 1999, Sadelain et al 2000).

형질 도입 빈도

인간 HP 세포로의 유전자 이송의 빈도는 표준화된 방법, 예를 들어, PCR 또는 형광성 검출에 의해 결정될 수 있다(Gerade et al 1996). 70-100%까지의 형질 도입 빈도가 RNA 종양 바이러스성 벡터를 통하여 얻어질 수 있으나, 이는 상대적으로 작은 세포의 샘플에 대한 것이다(Halene et al 1999). 물질의 상대적인 수준을 높이면, 특히, 장기간의 재구성을 위하여 필요한 더 초기의 HP 세포에 대해, 더 낮은 형질 도입 빈도를 초래한다(예를 들어, 세포와 벡터를 함께 모이도록 하는 제제가 없는 경우, 1-5%의 범위).

생체 밖으로(in-vitro)의 확장에 의해, 더 많은 수의 형질 도입된 인간 HP 세포를 얻을 수 있다는 사실이 제시된 바 있다. 그러나, 이는 세포의 분화 가능성의 상실 및 줄기 세포 손상을 가져올 수 있다(Bunting et al 1999, Briones et al 1999, Takatoku et al 2001). 어떤 배양 조건은, 재증식 잠재력의 상실 없이, HP 세포의 일정한 확장을 허용하기는 하나, 생체 밖으로(in-vitro)의 확장은 최소한으로 유지됨이 바람직하다(Kobari et al 2000, Lewis and Verfaillie 2000, Rosler et al 2000). 예를 들어, Flt3-리간드, SCF 및 트롬보포이에틴(TPO)의 조합이 사용될 수 있다(Ng et al 2002). 더하여 IL-3 및 IL-6의 부가는 바람직하지 않다(Herrera et al 2001). 선택적으로 또는 부가적으로, 형질 도입 후의 세포를 SCF 만을 가지고 2 일 동안 배양하면, 생착 잠재력을 향상시킬 수 있다(Dunbar et al 2001). 형질 도입 후의 세포를 비활성화시키는 처리는 생착 잠재력을 행상시킬수 있다.

제대혈을 처음 극저온 보존한 경우, 제대혈로부터 분리된 인간 HP 세포에 대하여, RNA 종양 바이러스성 벡터를 가지고 형질 도입하면, 그 빈도가 증가되었다(Orlic et al 1999).

형질 도입된 인간 HP 세포는, 세포 표면 리포터(cell-surface reporter)를 코딩하는 것과 같은 표지 유전자를 도입함으로써, 풍부하게 될 수 있으나(예를 들어, Fehse et al 1997 참조), 이는 임상적인 환경에서 바람직하지 않을 수 있다.

형질 도입 빈도는 종래에 알려진 임의의 방법, 예를 들어, PCR, 선택 가능한 표지가 구성체 내에 포함되는 경우 G418과 같은 선택 제제(selective agent)의 존재 하에 군체를 성장시키는 방법, 또는 형광-활성 분류에 의해 측정될 수 있다.

형질 도입 빈도는, 예를 들어, 세포 개체군의 샘플로부터의 총 DNA에 대한 정략적 PCR(예를 들어, 실시간 PCR)에 의하여, 총 개체군에서 실제로 대표적인 세포에 대해 측정됨이 바람직하다. 개체군에서 세포에 의해 생성된, 각 군체에 대한 형질 도입 빈도의 분석은, 배제되는 것은 아니나, 바람직하지 않다.

본 발명자들은 본 발명을 통하여, 연장된 생착을 위해서는 최소 수의 형질 도입 인간 HP 세포가 사용되어야 한다는 사실을 발견하였다. 게다가, 형질 도입된 HP 세포는, 분화된 다계통 백혈구를 발생시키기 위하여 티모포이에시스를 할 수 있어야 한다.

도입되는 유전자의 종류

본 발명에 있어서 어떠한 유전자도 인간 HP 세포로의 형질 도입에 의해 도입될 수 있다. 상기 유전자는, 중증 혼합 면역 결핍을 포함하는, 면역 결핍을 고치기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 아데노신 디아미나아제 유전자, RAG1, RAG2, 또는 SCID의 림프구 결핍증 타입, CD45 유전자에 결함이 있는 재조합/DNA 수리 과정 유전자, 또는 γc, Jak3m IL-7, Rα 유전자가 모두 사용될 수 있다(Cavazzana-Calvo 2001). 인간 리소좀 저장 장애로써 사장 널리 퍼진 고셔병과 같은 리소좀 저장 장애가 치료될 수 있다. MFG-GC RNA 종양 바이러스성 벡터와 같이(Takiyama et al 1998), 글루코세레브로시다아제(glucocerebrosidase; GC) 유전자를 코딩하는 벡터는, 고셔병의 치료를 위해 사용될 수 있다(Dunbar et al 1998a, Dunbar et al 1998b). 만성육아종성질환(CGD)은, 4 개의 구성 요소를 갖는 다중 부차 단위 효소인 NADPH 옥시다아제의 결함으로부터 초래되며, p47phox 유전자 또는 gp91phox 유전자와 같은 적절한 유전자를 가지고 치료될 수 있다. 인체에서 비교적 많이 발생하는, 포도당-6-인산탈수소효소 결핍은 G6PD 유전자를 가지고 치료할 수 있다(Rovira et al 2000). 적어도 8개의 유전자 중 어느 하나의 결함으로부터 초래되는 파코니 빈혈은 적절한 유전자, 예를 들어, 상보군 C 유전자에 의해 치료될 수 있다(Liu et al 1999). 혈색소병은, 글랜즈만 혈소판 무력증(Glanzmann thrombasthenia)(Wilcox et al 2000), 및 파브리 질환(Fabry disease)(Takenaka et al 2000)와 같이, 각각 적절한 유잔로 치료될 수 있다. CD34⁺세포는, 화학 요법 상황이 골수 절제를 초래하는 비-조혈 악성 종양뿐만 아니라, 백혈병, 골수종 및 림프종을 포함하는 조혈 악성 종양에 대한 치료의 일부로써, MDR-1 골수 보호 유전자로 형질 도입될 수 있다(예를 들어, Abonour et al 2000, Michallet et al 2000). 비-골수 절제성 조건은 이러한 경우에 사용될 수 있다(Nagler et al 2000). 바람직하지 않은, HP 세포 기능에 대한 유전자의 발현의 해로운 효과의 가능성이 있는 경우, 유전자의 발현은, 종래에 주지된, 조절 가능한 프로모터에 의해 조절될 수 있다.

형질 도입된 HP 세포 내에서, 구조적으로 발현된 외계 유전자의 존재로 인하여, 줄기 세포의 이주, 정착 및 분화가 방해받을 수 있는지가 고려되어야 한다. 어떤 단백질에 의해 유도된 면역 응답은 또한, 유전자-함유 세포의 제거를 초래한다. 이는 아데노바이러스-매개된 유전자 이송 후에 나타나지만, RNA 종양 바이러스-매개된 유전자 이송 또는 CD34⁺세포로의 유전자 도입 후에는, 일반적으로 일어나지 않는다. neo 유전자 산물에 대한 면역적 반응은 통상적으로 관찰되지 않는다. 본 발명자들은 본 발명을 통하여, 두 가지의 다른 RNA 종양 바이러스성 벡터에서 구조적으로 발현된 외계 유전자의 도입은, 줄기 세포의 이주, 정착 및 분화의 과정을 방해하지 않음을 발견하였다. 게다가, 유전적 질병의 치료를 위한 표적으로써 인간 HP 세포의 사용은, 이러한 세포에서, 이식 유전자 산물에 대한 면역적 내성의 발생이 유도된다는 점에서 유익할 것으로 기대된다(Halene and Kohn 2000).

더구나, 리보자임과 같은 이식 유전자로부터의 RNA 산물은, 무시해도 좋은 면역성을 갖는 것으로 기대된다. 항-HIV 단백질을 발현하는 RevM10 유전자는, SCID쥐에서 형질 도입된 인간 CD34⁺세포의 분화를 억제하지 않았다(Su et al 1997, 또한 Yu et al 1995). INFalpha와 같은 단백질은, NOD/SCID 쥐에서 생착 및 분화에 영향을 미치지 않고, CD34⁺세포 내에서 발현되었다(Quan et al 1999).

더구나, 인간 HP 세포는 생체 내의 어떤 환경에서(예를 들어, Kirby et al 2000), 또는 선택 제제의 존재 하에서(Omori et al 1999, Ragg et al 2000), 선택적 이점이 부여되도록 변이될 수 있다

실시예 1

모든 단계는 클래스 II 생물학적 안전 캐비넷 내에서 무균 상태로 실행되었다.

1.1. DANse 용액

DANse 모액은 CD34⁺극저온 보존 매질의 제조에 사용된다. 1.4ml의 멸균 식염수(멸균 염분 흡입 용액 USP (0.9% NaCl), Dey Corp. NDC# 49502 830)를 1.5ml의 돌려 여는 뚜껑을 가진 멸균 에펜도르프 튜브(Sarstedt, Cat# 72692005) 내의 DANse(DANse I Type IIS, Sigma Cat# D-4513)에 가하고, 부드럽게 교반하여 용해하였다. -20℃에서 저장된다. 1ml의 DANse 원액은, 50ml 극저온 보존된 매질마다에 사용되었다.

1.2 PBMC 극저온 보존 매질(90% FBS + 10% DMSO)

PBMC 극저온 보존 매질은, 기록 보존 및 안전한 시험의 목적으로, PBMC 세포의 극저온 보존을 위해 사용되었다. 상기 매질은 PBMC 세포가 녹았을 때, 최대의 생존 능력을 회복할 수 있도록 구성된다. 이는, 여과 멸균되고, 4ml의 분취관 내에 보관된 90%의 페탈 보빈 세럼(Fetal Bovine Serum)(StemCell Technologies, Cat# HCC-6450) 및 10% DMSO(Sigma Cat# D-2650)를 함유한다. 일단 개방하면, 분취관은 한 환자에 대한 배타적 사용을 위해 보존되었다.

1.3 CD34⁺극저온 보존 매질

이는, 기록 보존 및 안전한 시험의 목적으로 CD34⁺세포의 극저온 보존을 위해 사용되었다. 상기 매질은 CD34⁺세포가 녹았을 때, 최대의 생존 능력을 회복할 수 있도록 구성된다. 하기의 과정은 50ml 극저온 보존 매질의 제조에 적용되는 것이다 :

피펫을 사용하여 하기의 물질을 그 순서대로 멸균 50ml 튜브로 옮겼다 :

31ml IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Gibco BRL, Cat 12440-046).

10ml DMSO (디메틸 술폭사이드; Sigma Cat# D-2650)

8ml Albuminarc25^TM(25% Human Serum Albumin(HSA); 미국 적십자, Cat#451-0513)

15μl 헤파린 용액(헤파린 10,000U/ml; Elkins-Sinn Inc.)

1ml DNAse 모액(10mg/ml), 상기 1. 1. 참조

상기 구성 성분들을 소용돌이치게 하여 완전히 혼합한다. 여과 멸균하기 위해, 상기 혼합물을 코닝 150ml 여과 시스템(코닝 Cat#25932-200)을 사용하여 여과한다. 5ml 멸균 Nunc 튜브 내의 4ml의 분취관에서 -20℃의 온도로 보관되었다.

환자마다 하나의 튜브(4ml)가 기록 보관 샘플 및 공-배양 샘플을 위해 사용되었다. 극저온 보존 매질은, 사용 준비를 위해 해동되어 4℃에서 보관되었다.(DMSO는 더 높은 온도에서 세포에 대해 독성을 나타낸다.)

1.4 MGDF(100μg/ml 재조합 인간 페질레이티드 거핵구 성장 및 발생 인자)

재조합 인간 페질레이티드 거핵구 성장 및 발생 인자는, 세포 성장 및 RNA 종양 바이러스성 형질 도입을 촉진시키기 위하여, 줄기 세포 배양에 사용되었다. 이는 제조되고, 100mg/ml 작용 모액으로 분취되고, 100ng/ml의 최종 농도로 줄기 세포 배양 배지에 가하여 진다.

MGDF 유리병(암젠 Inc., 5% 소르비톨을 함유하는, 1ml 10mM 소디움 아세테이트 내의 500mg/ml 재조합 인간 페질레이티드 MGDF, pH 5)의 내용물 및 어떤 IMDM 배양 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Gibco BRL, Cat# 12440-046)는 실온으로 데워졌다. 무균 테크닉을 사용하여, 1ml의 MGDF 용액을 유리병으로부터꺼내어 멸균 15ml 튜브(프로필렌 원뿔형 튜브; 코닝 Cat# 25319-15 또는 팔콘 Cat# 352097) 로 옮겼다. 100mg/ml 작용 모액을 만들기 위해, MGDF는 4ml의 IMDM으로 희석되어 5ml의 최종 부피로 희석되었다. 작용 모액의 분취물(1ml)을 돌려 여는 뚜껑을 가진 멸균 마이크로 원심분리 튜브(사스테트 Cat# 72692005)로 옮겼다.

일단 제조되면, MGDF 작용 모액은 3일의 제한된 저장 수명을 갖는다. 제조된 MGDF 분취물은, 3일 동안 얼리지 않고 4-8℃에서 저장되었다. MGDF의 1 회분은, CD34⁺세포의 생성 날짜에 각 환자에 대해 신선하게 제조되었다(배양의 당일). 각 환자에 대해, MGDF의 작용 모액 분취물이, 사용 후에 폐기되는 물질의 분리 유리병으로 준비되었다. 적어도 5 개의 세포 배양 배지의 준비를 위해 충분한 분취물이 준비되었다.

1.5 줄기 세포 인자(50μg/ml 재조합 메티오닐 인간 줄기 세포 인자)

재조합 메티오닐 인간 줄기 세포 인자는, 세포 성장 및 RNA 종양 바이러스성 형질 도입을 촉진시키기 위하여, 줄기 세포 배양 배지에 사용되었다. 이는 50mg/ml 모액으로 제조되고, 50ng/ml의 최종 농도로 사용되었다.

SCF 유리병(암젠 Inc., 1875mg의 동결 건조된 재조합 인간 메티오닐 SCF) 및 IMDM 배양 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Gibco BRL, Cat# 12440-046)는 실온으로 데워졌다. 무균 테크닉을 사용하여, 1.25ml의 멸균수가 바늘을 통해 주사기로 빨려져, SCF 유리병 내로 주입되었다. SCF는 흔들지 않고, 소용돌이 치게 됨으로써, 재구성되었다. 깨끗한 바늘 및 주사기를 사용하여, 0.2ml의 SCF 용액을 꺼내어, 5.8ml의 IMDM을 함유하는 15ml 멸균 원뿔형 튜브에 가하였다. 이로써, 50mg/ml 작용 모액의 6ml가 생성된다. 멸균 5ml피펫을 사용하여, SCF 작용 모액의 1ml 분취물을 멸균 마이크로 원심분리 튜브로 옮겼다.

제조된 SCF 분취물은, 3일 동안 얼리지 않고 4-8℃에서 저장되었다. 50mg/ml의 모액이, CD34⁺세포의 생성 날짜에 각 환자에 대해 신선하게 제조되었다(배양의 당일). 각 환자에 대해, 물질의 분리 유리병이 사용되었다. 각각의 분취물은 단 하나의 세포 배양 배지 준비를 위해 단일-사용되었다.

1.6 네비라핀(5mg/ml 네비라핀-비리뮨^TM, 18.7mM)

네비라핀(비리뮨^TM)은 세포 배양 및 RNA 종양 바이러스성 형질 도입의 기간 동안, CD34 줄기 세포 배양에서 HIV의 복제를 억제하기 위하여 사용되었다. 네비라핀은 제조되고, 5mg/ml(18.7mM) 모액으로 분취되고, 500nM의 최종 농도로 세포 배양 배지에 가하여 진다. 네비라핀 작용 모액의 1 회분은, 전체 임상적 시도를 위해 준비되었다. 이러한 모액은, 배양 배지 준비의 각 날짜에, 각 환자당 3개 유리병이 제공되도록 분취되었다.

약 100mg의 네비라핀 무수 분말(뵈링거 인겔하임. Mfr# 43074)을 달아 50ml튜브(블루맥스^TM50ml 멸균 폴리프로필렌 원심 분리 튜브; 팔콘 Cat# 2098)에 넣었다. 에탄올(200 프루프 디하이드레이트 알코올 USP, 격식화된; 퀀텀 케미칼 코포레이션)을 상기 튜브에 가하여 5mg/ml 용액을 만들었다. 5mg/ml 작용 모액의 분취물 0.5ml을, 1.5ml의 돌려 여는 뚜껑을 가진 멸균 마이크로 원심분리 튜브(사스테트 Cat# 72692005)로 옮기고, -20℃에서 저장하였다.

네비라핀 모액은 사용 전에 실온에서 해동되었다. 각 분취물은 매일의 세포 배양 배지 제조를 위해 단일 사용되었다.

1.7 페탈 보빈 세럼

페탈 보빈 세럼은 CD34⁺배양 배지의 성분이며, 20%의 농도로 사용되었다. 형질 도입을 위해 사용되는 바이러스성 상청액은 10% FBS을 함유하므로, CD34 세포의 형질 도입에 사용하기 전에 10% FBS가 보충되었다.

500ml 용기로 공급되는 FBS는, 낭비를 최소화하기 위해 50ml 부피로 분취되었다. 세럼(Fetal Bovine Serum, 500ml; StemCell Technologies HCC-6450)은 37℃의 수조에서 해동되고, 시각적으로 균질화될 때까지 소용돌이 치게 함으로써 혼합되고, 무균적으로 50ml 원심 분리 튜브(블루맥스^TM50ml 멸균 폴리프로필렌 원심 분리 튜브; 팔콘 Cat# 2098) 내의 50ml 부피로 분취되었다. 상기 분취물은 동결 보관되었다. 각 분취물은 매일의 배지 준비를 위해 단일 사용되었다.

1.8 CD34⁺배양 배지의 준비

분리된 CD34⁺세포는, 형질 도입 전 적어도 하루 동안 이러한 배양 배지에서 성장한다. 상기 배지는 모세포의 높은 생존 가능성을 유지하도록 디자인되었다. 하기의 과정은 500ml의 배지를 준비하기 위한 것이다 :

피펫을 이용하여 하기의 물질을 순서대로 여과 깔때기(500ml의 받는 그릇을 가진 0.45μm 여과 플라스크; 넬진 cat# SFCA 162-0045)로 옮겼다 :

400ml IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Gibco BRL, Cat #12440-046).

100ml FBS(Fetal Bovine Serum 2×50ml 상술한 1.2에 따라 분취됨)

500ml SCF(상기 1.5 참조)

500ml MGDF(상기 1.4 참조)

13.3ml 네비라핀(상기 1.6 참조)

반이 통과할때까지 진공이 적용되었으며, 그리고 나서 내용물을 부드럽게 소용돌이 치게 하여 혼합하였다. 여과가 완료되고, 내용물을 다시 소용돌이 치게 하였다.

상기 CD34⁺배양 배지는 요구될 때 신선하게 준비되었다. 이는, 사용하기 약 30분 전까지 빛이 차단된 환경 하에서 실온으로 저장되었으며, 그리고 나서 수조에서 37℃의 온도로 데워졌다. 시급한 요구를 초과하는 배지는 환자 CRF ID#로 표시되었고, 4℃로 보관되었다. 환자의 세포 배양/형질 도입/채취 과정이 완료되면, 이는 다른 환자에 대해 사용하지 않고, 폐기하였다.

1. 9 프로타민 설페이트

프로타민은 바이러스성 조건 매질에서, 표적 CD34⁺세포에 대한 벡터의 결합을 촉진한다.

프로타민 설페이트는, 낭비를 최소화하기 위해 앰플(엘킨스-신, 5ml, 10mg/ml)로부터 분취되었다. 약 0.5ml 분취물이 10×1.5ml의 돌려 여는 뚜껑을 가진 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 분배되어, 각 CD34⁺형질 도입에는 환자당 2 분취물이 사용되었다. 이들은 동결하지 않고 4℃에서 보관되었다. 하나의 유리병은, VCM 형질 도입 혼합물을 준비하기 위하여 형질 도입의 각 날짜에 사용되었다(1일 및 2일째). 분취물은 단일 사용되었으며, 각 날짜의 VCM 준비 후에는 폐기되었다.

1. 10 프로타민 설페이트를 포함하는 VCM 형질 도입 혼합물

배양된 CD34⁺세포는, 마그네타 코포레이션(bIorELIANCE Corp.)에 의해 제조된 바이러스 조건 매질(Virus Conditioned Medium; VCM)을 가지고 형질 도입되었다. 리보자임과 조절 벡터에 대응하는 두 번의 VCM 준비 과정이 있었다. PA317/RRz2 VCM은 PA317/LNL6 VCM 보다 더 낮은 역가를 가지므로, 각 형질 도입에서 감염성 바이러스 입자의 수를 균등화하기 위해 형질 도입마다 300ml의 RRz2와 200ml의 LNL6를 사용하였다.

형질 도입은 2일에 걸쳐 진행되었다. VCM 형질 도입 혼합물을 만들기 위하여, 각 VCM 은 성장 인자 및 세럼이 보충되어 하기와 같이 첫 날의 배양 배지와 대등하게 되도록 하였다.

첫 날에, PA317/LNL6 VCM에 대한 하나의 200ml 용기, PA317/RRz2 VCM에 대한 두개의 200ml 용기 및 페탈 보빈 세럼의 2×30ml 분취물이, 수조에서 37℃의 온도로 완전히 해동되었다. 네비라핀의 분취물은 실온에서 해동되고, 다른 시약은 실온으로 데워졌다 : 프로타민 설페이트 1 분취물, SCF 1분취물, MGDF 1 분취물.

LNL6 혼합물의 준비는 RRz2 혼합물의 준비를 시작하기 전에 완료되었다. LNL6 VCM을 준비하기 위하여, 피펫으로 하기의 물질들을 순서대로 여과 깔때기(500ml의 받는 그릇을 가진 0.45mm 여과 플라스크; 넬지 SFCA 162-0045)로 옮겼다 :

20ml FBS(상술한 내용 참조)

88ml 프로타민 설페이트(하기의 내용 참조)

220ml SCF(상술한 내용 참조)

220ml MGDF(상술한 내용 참조)

6ml 네비라핀(상술한 내용 참조)

200ml PA317/LNL6 (PA317/LNL6-3; 마그네타 코포레이션, 역가 1.4×10⁷ivp/ml).

상기 깔때기는 부드럽게 소용돌이 치도록 처리하여 혼합하고, 혼합물을 여과하기 위해 진공을 적용 한다.

RRz2 VCM은, 하기의 부피가 사용된 것을 제외하고는 상기한 바와 마찬가지 방식으로 준비되었다 :

30ml FBS

132ml 프로타민 설페이트

330ml SCF

330ml MGDF

9ml 네비라핀

300ml PA317/RRz2 (PA317/RRz2-17R'; 마그네타 코포레이션, 역가 0.8×10⁷ivp/ml).

잔류하는 100ml RRz VCM은 CRF#로 표시되었으며, -80℃로 즉시 재동결되었다. 이는 형질 도입의 두 번째 날에 사용되었다.

두 번째 LNL6 및 RRz2 VCM 형질 도입 혼합물을 제조하기 위하여, 두 번째 날에, PA317/RRz2에 대한 하나의 200ml 용기를 사용한 것만을 제외하고는 마찬가지의 과정이 진행되었으며, 첫 번째 날에서 잔류한 100ml가 RRz2 혼합물에 대해 사용되었다.

각 VCM 형질 도입 혼합물은 형질 도입의 각 날짜에 신선하게 준비되었으며, CD34⁺세포가 형질 도입되기 위해 준비될 때까지, 생물학적 안전 캐비넷에 부관되었다.

1.11 레트로넥틴^R의 준비(PBS 내의 25mg/ml 레트로넥틴)

레트로넥틴^R(인간 피브로넥틴 단편 CH-296) 용액은 조직 배양 용기를 코팅하여, CD34⁺세포에 대한 RNA 종양 바이러스성 형질 도입을 촉진하기 위해 사용되었다.

타카라 수조 Co. Ltd.,에서 제조되고, 바이오휘테커(BioWhittaker)에서 주문된, 2500mg의 동결 건조 레트로넥틴^R를 실온으로 데웠다. 2.5ml의 멸균수가 가하여지고, 상기 물질은 부드럽게 소용돌이 치게 처리됨로써 용해되고, 바늘을 가진 주사기로 제거되었다. 상기 혼합물을 밀렉스 필터(밀리포어, cat # SLGV 013 0S)로 여과하여 50ml 튜브(50ml 멸균 조직 배양 튜브; 팔콘 Cat # 2098)로 가하고, 4ml의 PBS로 희석하고, 두 개의 50ml 튜브로 쏟아 넣은 후, 100ml까지의 총 부피로 만들었다. 동시에 최종 산물로써 내독성 시험을 위하여, 200ml를 제거하였으며, 나머지는 4℃에서 보관하였다. 일반적으로, 상기 시약은 즉시 용기에 코팅되었다.

1.12 2% HSA(PBS 내의 인간 세럼 알부민)의 준비

2% HSA는, 조직 배양 용기를 레트로넥틴으로 코팅한 후에 이를 차단하기 위하여 사용되었다. 이는 무균적으로, 8ml의 25% HSA 용액(Albumarc25^TM)을 92ml의 PBS(칼슘 및 마그네슘 없음, 1x 바이러스 코어 랩 또는 JRH 바이오사이언스 Cat #59321-78P)와 혼합함으로써 준비된다. 상기 시약은 일반적으로 즉시 사용된다.

1.13 레트로넥틴-코팅된 용기

레트로넥틴으로 코팅된 플라스크는 몇몇 환자에 대해, RNA 종양 바이러스성 벡터를 가지고 CD34⁺세포를 형질 도입하기 위하여 사용된다.

피펫으로, 25ml의 레트로넥틴 용액(상술한 내용 참조)을 4×175ml 플라스크(박테리아 플라스틱 플라스크 175cm³, 0.2μm 배출구를 가진 마개 포함, 사스테트 83.1812.502)에 옮기고, 실온에서 2 시간동안 방치하였다. 상기 용액을 플라스크로부터 제거하고, 25ml의 2% HSA를 가하였다. 실온에서 30 분 동안 더 방치한 후, 상기 용액을 제거하고, 25ml의 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Gibco BRL, Cat #12440-046)으로 플라스크를 세척하였다. 플라스크를 플라스틱 백으로 봉인하고, 사용하기 2-3 전에 4℃에서 보관하였다.

1.14 VCM 형질 도입 혼합물(레트로넥틴과 함께 사용됨).

레트로넥틴-코팅 플라스크가 형질 도입을 위해 사용될 때, 프로타민 설페이트는 VCM 형질 도입 혼합물에서 생략되었다. 이는 하기의 부피가 사용된다는 점을 제외하고는 1.10.에 기술된 바와 같은 방법으로 준비되었다 :

두 번째 날 아침의 첫 형질 도입에 대하여, 바이러스 조제물의 200ml 분취물이, FBS의 분취물과 마찬가지로, 37℃의 수조에서 해동되었다. LNL6 또는 RRz2 VCM 형질 도입 혼합물(레트로넥틴을 가진 것)은, 하기의 순서대로 여과 깔때기(넬진 250ml의 받는 그릇을 가진 0.45μm 여과 플라스크; 넬지 SFCA 162-0045)로 가함으로써 준비되었다 :

10ml FBS(상술한 내용 참조)

110ml SCF(상술한 내용 참조)

110ml MGDF(상술한 내용 참조)

3ml 네비라핀(상술한 내용 참조)

100ml PA317/LNL6 또는 PA317/RRz2 (상술한 내용 참조).

상기 성분은 부드럽게 소용돌이 치도록 처리됨으로써 혼합되었고, 여과에 의해 멸균되었다. LNL6 혼합물의 준비는 RRz2의 준비를 시작하기 전에 완료되었다.

저녁의 두 번째 형질 도입에 대하여, 잔류하는 100ml의 PA317/LNL6 및 100ml의 PA317/RRz2는 VCM 형질 도입 혼합물을 준비하기 위해 마찬가지 방법으로 사용되었다. 이들은 사용될 때까지 실온에서 보관되었다.

1.15 레트로넥틴과 함께 사용되는 VCM 형질 도입 혼합물(환자 8-10).

환자 8-10에 대한 VCM 형질 도입 혼합물은 그 준비에 사용된 부피가 2 배인 것을 제외하고는, 상기한 바와 같은 방법으로 준비, 사용되었다. 3 주기의 형질 도입이 2 일에 걸쳐 수행되었다. 즉, 첫 날의 저녁, 그리고 두 번째 날의 아침 및 오후에 수행되었다.

1.16 CD34⁺세포 세척 완충액(Ca²⁺및 Mg²⁺를 가진 PBS, + 1% HSA)

1%(최종 농도)의 HSA를 함유하는 CD34⁺세포 세척 완충액은, 형질 도입된 CD34⁺세포의 주입 전에 세포의 세척을 위하여 사용되었다. 환자당 1L의 세척 완충액이 사용되었으며, 신선하게 준비되거나 몇 일 전에 미리 준비되었다.

PBS의 새로운 1L 용기로부터, 40ml의 PBS가 멸균 25ml로 제거되어, 약 960ml가 잔류되도옥 하였다. 40ml의 25% HSA 용액(25% HSA 용액, 알부마크^TM)은, 18게이지 바늘을 가지는 50 ml 주사기를 사용하여 무균적으로 PBS 용기로 옮겨졌으며, 흔들지 않고 소용돌이 치도록 함으로써 혼합되었다. 상기 세척 완충액은 4℃에서 저장되고 사용 전에 37℃로 데워졌다. 1L의 1 회분은 한 환자에 대해 배타적으로 사용되었고, 다만 단일-사용되었으며, 모든 잔류물은 폐기되었다.

1.17 CD34⁺주입 완충액(RPMI. 페놀 레드 없음, + 5% 인간 세럼 알부민).

CD34⁺주입 완충액은, 형질 도입도리 때까지 형질 도입된 CD34⁺세포 채취물의 생존 가능성을 유지하도록 디자인된다. RPMI는, 환자에 대한 직접적인 주입을 위해 사용되므로, 페놀 레드를 포함하지 않도록 하였다. 이는, 5%의 최종 농도로 인간 세럼 알부민을 포함한다.

세척 후에 채취된 세포의 각 1 회분의 현탁을 위해, 100ml가 사용되었다. 이러한 완충액은 채취/주입의 각 날짜에 신선하게 제조되거나, 몇 일 전에 미리 준비될 수 있다.

20ml 멸균 피펫을 사용하여, 80ml의 페놀 레드가 없는 RPMI(페놀 레드 없음, Gibco-BRL, Cat 118-030)를 250ml의 원뿔형 원심 분리 튜브로 옮겼다. 20ml의 25% HSA 용액(알부마크25^TM), 미국 적십자, 을 21 게이지 바늘이 부착된 25cc 주사기를 가지고 가하였다. 상기 혼합물은 부드럽게 소용돌이 치도록 처리되었다. 상기 시약이 미리 준비되면, 이는 4℃에서 보관되었으나, 채취의 날짜에 신선하게 준비되면, 사용시까지 실온에서 보관되었다. 상기 혼합물을 사용 전에 미리 37℃로 데웠다. 100ml의 1 회분은 한 환자에 대해 배타적으로 사용되었고, 단일-사용 만이 되었다.

1.18 FACS PBS의 준비(PBS, CA²⁺및 Mg²⁺없음, +2% 페탈 보빈 세럼 + 0.1% NaN₃).

FACS PBS는, FACS 착색 과정 동안 세포를 세척하는 세척 완충액이다. 부가적으로, FACS 분석이 착색 후 즉시 수행되면(즉, 4-6 시간 내에), 이는 착색된 세포를 재부유 시키는데 사용된다.

아자이드(azide) 모액(10%)은 4g의 소디움 아자이드를 증류수의 50ml 튜브에 용해시킴으로써 준비된다. 상기 FACS PBS 용액은 50ml 튜브 내에, 48.5ml의 PBS, 1ml의 페탈 보빈 세럼 및 0.5ml의 소디움 아자이드 모액을 가함으로써 준비되었다. 상기 용액은 4℃에서 저장되었다. 아자이드 모액은 제한되지 않은 저장 수명을 가지며, FACS PBS는 1년의 저장 수명을 가진다. FACS PBS는 차갑게 사용된다.

1.19 FACS 차단제의 준비(PBS 내의 5% 인간 AB 세럼, CA²⁺및 Mg²⁺없음)

이는 FACS 항체 착색 반응에서, 세포의 비-특이성 배경 착색을 감소시키는데 사용되었다. 이는, 멸균 PBS(칼슘 및 마그네슘 없음, 1x 바이러스 코어 랩 또는 JRH 바이오사이언스 cat #59321-78P)로 희석된 5% 인간 AB 세럼(시그마 cat #H-4522, -20℃에서 저장, 37℃ 수조에서 해동)을 함유하였다. 이를 아크로디스크 0.45μm 필터(젤만 #4184)로 여과 멸균하고, -20℃에서 1ml의 분취물로써 저장하였다.

1.20 FACS 파라포름알데히드 고정제의 준비(PBS, Ca 및 Mg 없음, 2% 파라포름알데히드)

FACS 파라포름알데히드는, FACS 분석을 위한 항체 착색 후에, 세포를 유지하기 위한 고정제 용액이다. FACS 착색 후에, 세포를 재부유시키기 위해 1%의 농도로 사용되어, 상기 항체 착색이 약 3 일 경과시까지 안정하게 유지된다. 상기의 시간이 경과한 이후에는, 형광 항체로부터의 배경 신호가 증가할 수 있다. 이는 40ml의 PBS와 혼합된 10ml의 10% 파라포름알데히드(폴리사이언스 #04018)를 함유하고, 4℃에서 저장된다. 세포는 200μl의 PBS 내에서 현탁되고 나서, 이러한 완충액의 200μl를 가지고 고정됨으로써 1%의 작용 농도로 된다.

1.21 우레아 용해 완충액

우레아 용해 완충액은, DNA의 페놀 추출을 위한 세포 리세이트(lysates)를 준비하기 위하여 사용되었다. 이는, 최종 부피 20ml로써, 물에 용해된 84g의 우레아(뵈링거-만하임 1685 899), 4g SDS (USB 21651), 1ml 0.2M EDTA, 1ml 1M 트리스염, 1ml 1M 트리스 염산, 14ml 5M 염화나트륨을 함유한다. 이러한 용액은 0.45μ 필터로 여과되고, 실온에서 저장되었다.

실시예 2 : 1상 임상적 시도

본 발명자들은 i) 항-HIV-1 리보자임의 순환 조혈모세포로의 도입이 벡터 서열을 지니는 흉선 이주자를 출현을 초래할 수 있는지 여부, ii) T-림프구가 유전적으로 변이된 세포에서도 정상적으로 성숙될수 있는지 여부, iii) 벡터의 존재 및 발현이 장기간 지속될 수 있는지 여부, 및 iv) 리보자임이 HIV-1에 취약한 세포에게 생존적인 도움을 주는지 여부를 조사하기 위하여 1상 유전자 치료 임상적 연구를 했다.(Amado et al, 1999).

리보자임 유전자에 의한 세포의 형질도입을 위하여, RRz2를 사용했다. RRz2는 해머헤드 리보자임 Rz2를 코딩하는 것으로서, HIV-1의tat유전자의 현저히 보존된 영역에 반대 방향이다. RRz2를 만들기 위해, Rz2를 코딩하는 DNA 서열은 pLNL6(Bender et al, 1987)에서 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neo ^R ) 유전자의 번역되지 않는 영역내에 있는 Sal-I 부위로 서브 클로닝되었다. 리보자임은 RRz2에서 MoMLV LTR로부터의neo-리보자임 전사체로서 발현되었다. 모세포 생착 및 T-림프액 발생에 대한 잠재적인 리보자임-특이적인 효과를 조절하기 위하여, 그리고 Rz2에 의해 부여된 T-림프구 생존에 대한 잠재적인 영향을 연구하기 위하여, 모세포 또한 조절용 RNA 종양바이러스 벡터 LNL6로 형질도입되었다.

이러한 연구에서, 10,000 카피/ml 이하의 바이러스 감염이 있고 CD4 수가 300~400세포/㎣ 인 HIV-1으로 감염된 환자들은 6일 동안 사이토카인 호중구 집락 자극 인자(G-CSF)에 의하여 말초혈 조혈모세포(PBPC)가 동원되었다. 환자들은 6일동안 10㎍/kg의 투여량으로 호중구 집락 자극 인자(G-CSF)가 피하 투여되었다. PBPC는 COBE^R스펙트럼 혈장교환 시스템(Gambro BCT, Lakewood, CO)을 사용해서 G-CSF 처리한지 5 일 및 6일이 되는 날에 혈액용량 혈장교환을 수행함으로써 조달되었다. CD34⁺세포 분리는 세프레이트 SC 줄기 세포 농축 시스템(CEPRATE^RSC Stem Cell Concentration System; CellPro Inc. Bothell, WA) 및 아이솔렉스 300i(Isolex 300i) 세포 분리 시스템(Nexell Therapeutics, Irvine, CA) 을 사용해서 행해졌다(환자 8~10). CD34 표면 표지의 발현을 위한 PBPC의 정제 이후에, 거핵구 성장 및 발생 인자(MGDF: megakaryocyte growth and development factor) 및 줄기 세포 인자(SCF: stem cell factor)(Amado et al 1998)의 사이토카인 조합을 사용해서 세포 주기로의 유도를 위해 CD34 배양 배지에서 단 하루 동안 배양되었다. MGDF 및 SCF는 Amgen Inc.(Thousand Oaks, CA)에 의해 공급되었고 각각 100ng/ml 및 50ng/ml의 농도로 사용되었다.

대략, 동일한 수의 CD34⁺세포가 독립적으로 RRz2 및 LNL6 벡터에 의하여 형질 도입되었다. LNL6 및 RRz2 프로듀서 세포 라인(producer cell lines)은 cDNA 구성체인, pLNL6 또는 pRRz2를 에코트로픽 복제-불능 바이러스의 2 개체군을 생산하기 위하여 psi2 패키징 세포 라인으로 트랜스펙션시킴으로써 두 단계 과정으로 준비되었다. 그리고 나서 이러한 두개의 개체군은 PA317 암포트로픽 패키징 세포 라인(Miller 및 Buttimore 1986)을 감염시키기 위해 사용되었다. G418에서 연속되는 분리에 의해 유도된 클론의 프로듀서 세포 라인은, 구성체의 통합성에 대하여 조사되었고 마스터 세포 은행의 제조 및 연속되는 안정성 테스트과 함께 GMP 바이러스의 제조를 위하여 바이오릴라이언스 코포레이션(BioReliance Corporation; Rockville, MD)으로 보내졌다. RNA 종양 바이러스의 상청액(LNL6 및 RRz2)의 모든 1 회분(batch)은 바이오릴라이언스 코포레이션에 의하여 무균성, 복제-가능 RNA 종양 바이러스 및 일반적인 안정성을 위하여 테스트되었다. 바이러스의 역가는 연속 희석하고 G418 저항을 측정하여 NIH 3T3 세포 라인을 감염시킴으로써 확인되었다. LNL6 및 RRz2 역가는 각각 1.4×10⁷및 0.8×10⁷감염성 바이러스 입자/ml 이었다. RNA 종양 바이러스 상청액(VCM Transduction Mix)이 2일 동안 환자 1~3에 대하여 매일 한번씩, 환자 4-7에 대하여 하루에 두 번씩, 그리고 환자 8~10에 대하여 2일에 걸쳐 3회 첨가되었다. 환자 4~10에 대하여, 형질 도입은 인간 피브로넥틴(RetroNectin^TM, Takara Shuzo, BioWhittaker, Inc. Walkersville, MD로 부터 입수)의 CH296 단편으로 코팅된 플라스크에서 행해졌다. 생체외에서의 잠재적인 HIV 복제를 방지하기 위하여, CD34⁺세포 배양 및 형질도입은 500nM 농도의 Neverapine(Boehringer Ingelheim, Ridgefield, CT) 존재하에서 수행되었다. HIV 복제가 없다는 것은 최종 주입제(모든 10 샘플이 검출될 수 없는 p24 레벨이었다.)에서 ELISA법에 의해 p24 항원을 측정함으로써 확인되었다. 내독소 분석뿐 아니라 균, 박테리아 및 마이코플라즈마 배양액은 모든 10명의 환자에 대한 최종 세포 산물에서 음성이었다.

형질도입에 이어, 세포가 풀(pool)화되고, 무균성, 세포수, 생존능력,CD34/CD38 표현형, p24, 및 내독성을 위해 테스트되었고, 그리고 나서 세척 되었고 골수 절제 없는 자가 이식성 수용 환자(autologous recipient patients)에게 주입되었다. 이 처리 도식은 도 5에서 도해되었다. 샘플은 이후의 형질 도입 효율에 대한 CFC 분석, RCR 분석 및 PCR 분석에서의 테스트를 위해 따로 보관되었다.

10명의 환자들이 이 연구를 위하여 등록되었다(표 1). 연령의 중앙값은 42세이었다(32~59세 범위). 사용된 항-RNA 종양 바이러스 투여 횟수의 중앙값은 3이었다 (1~6회 범위). 투여되는 CD34⁺세포의 총 수는 체중(kg)의 킬로그램당 1.3~ 10.1×10⁶세포의 범위였다(중앙값 3.2+/-1.1×10⁶세포/kg). 프로타민 설페이트 (protamine sulphate)의 존재 하에서 수행된, 첫 3명의 환자들에 대한 형질 도입 효율은 0.01~0.08×10⁶세포/kg 범위로 주입된 형질 도입된 CD34⁺의 수를 설명하는 것으로서(표 1), 낮았다(범위 < 1%~4%). 변이 유전자를 지니는 세포는 환자 1(골수 및 말초혈 단핵 세포(PBMC)에서의 리보자임, 과립구에서 LNL6)에서 6개월까지, 환자 2(PBMC에서 RRz2)에서 9개월 까지 및 환자 3(PBMC에서 LNL6 및 백혈구에서 RRz2)에서 12개월까지 검출되었다.

표 1.환자들 및 CD34 ⁺ 세포 주입 산물의 특성.

표는 환자들의 연령, 성별, 이전의 항 RNA 종양 바이러스성 방법(ART)의 수, 형질 도입을 지지하기 위한 레트로넥틴(retronectin)의 사용, CD34⁺의 순도, 주입된CD34⁺세포의 수, 형질 도입의 백분율, 및 주입된 형질 도입 CD34⁺세포의 수를 나타낸다.

환자	연령	성별	ART	레트로넥틴	CD34+의 순도(%)	주입된 CD34+세포(×106/kg)	형질도입..(%)	형질도입 CD34+세포(×106/kg)
01	59	M	1	No	65	3.38	0.4	0.01
02	44	M	4	No	80	2.08	4	0.08
03	40	M	4	No	66	2.98	2	0.06
04	44	M	6	Yes	67	1.29	10	0.13
05	37	M	6	Yes	94	10.01	7	0.70
06	32	M	3	Yes	90	1.63	32	0.52
07	41	M	3	Yes	96	8.45	48	4.06
08	46	M	2	Yes	98	9.37	57	5.34
09	48	M	3	Yes	93	1.64	36	0.59
10	38	F	1	Yes	95	5.07	28	1.42

형질 도입 효율을 향상시키기 위하여, 이어서 7명의 환자들이 인간 피브로넥틴 (Hanenberg et al 1997; Hanenberg et al 1996)의 CH296 단편 존재하에서 형질 도입된 자가 이식성 CD34⁺세포를 투여받았다. 이러한 환자들에게서, 형질 도입 효율이 32% +/- 6.9( 7%~57% 범위)(도 6)의 중앙값 레벨로 증가되었다. 형질 도입 효율은 형질 도입된 CD34⁺세포(Knop et al 1999)에서 경쟁적 PCR을 수행함으로써 계산되었다. 효율은 또한 최종 형질 도입된 CD34⁺세포 산물로부터 성장된 단일 군체에서 벡터 서열을 위한 PCR을 수행함으로써 결정되었다.

평균적으로, LNL6에 대한 형질도입 효율은 RRz2에 대하여 얻은 것에 비하여 1.6배 더 높았는데, 이는 아마도 벡터 역가에서 차이를 반영하는 것으로 보인다. 30 개월이란 중간값(12~36 개월 범위)의 속행후에, 변이 유전자는 여러 시점에서그리고 여러 조혈 계통에서 모든 환자들에게서 검출되었다. 평균적으로, 유전자의 존재는 분석된 PBMC의 0.1~0.01%에서 발견되었다.

도 7은 한 명의 대표 환자에게서 장기간의 다계통 유전자의 존재를 보여준다. 도 7a는 형질도입된 CD34⁺세포를 주입한지 2년 경과후에 환자 5에게서의 말초혈 단핵 세포(PBMC), 골수 단핵 세포(BMMC), T-림프구 및 백혈구에서 LNL6 및 RRz2 벡터 서열을 보여준다. T-림프구 및 백혈구는 유세포 분석(flow cytometry)에 의하여 확인되어, PBMC로부터 순도>90%로 선별되었다. 각 세포 형태를 위하여, 샘플 중 하나의 풀의 4 개의 복제물 보여진다.

본 발명자들은 또한 RT-PCR을 사용해서 PBMC에서 유전자 구성체의 발현을 분석했다. RNA는 Qiagen RNeasy 키트(Valencia, California)를 사용해서, 제조자의 지시에 따라, 혈액 샘플의 Ficoll-Hypaque 원심분리에 의하여 선별된 PBMC로부터 준비되었다. 잔류 DNA는 DNase 분해에 의해 제거되었다. RNA는 각 샘플의 7개의 사본들로 집코 슈퍼스크립트 역전사 효소(Gibco Superscript Reverse Transcriptase; Carlsbad, California)를 사용해서 역전사되었다. 그리고 나서, 샘플들은 풀화되었고, cDNA 증폭이 10개의 복제물에 대하여 이루어졌다. 1 라운드 핫 스타트 PCR은 프로메가 타크 비드(Promega Taq bead; Madison, WI)를 사용해서 행해졌다. 2 라운드는 퍼킨 엘머 앰플리왁스 젬(Perkin Elmer Ampliwax gem; Boston, MA)을 사용해서 행해졌다. 도 7b는 방사성 동위 원소로 표지된 프라이머를 사용해서 3인의 대표 환자들에게서 주입후 2년 뒤까지 PBMC에서 LNL6 및 RRz2 양 자의 단기 및 장기 벡터 발현을 보여준다. 각 샘플에 대하여, 역전사효소(-RT)를 포함하지 않은 반응이 포함되었다.

형질 도입된 CD34⁺세포가 HIV-감염 환자들에게서 T-림프구 발생을 겪는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 항원에 노출되지 않은 T-림프구(Sanders et al 1988; Tedder et al 1985; Kansas 1996; Picker et al 1993)를 특징짓는 것으로서, CD45RA 및 CD62L 표면 표지 발현을 위하여 말초혈 CD4⁺및 CD8⁺세포를 선별했으며, LNL6 및 RRz2 의 존재에 대한 이러한 T-림프구 소집단을 분석했다.

반정량 PCR 분석은 RRz2에서 Rz2의 서열을 겹치게 하는 neo^R유전자에 반대 방향을 향하는 프라이머를 사용해서 백혈구 소집단에서 수행되었다. PCR 검출을 위하여, DNA는 엑세스트 중합체 추출법(Acest Polymer extraction metho; Ward et al 1998)을 사용해서 세포군으로부터 추출되었다. DNA 비율 조절은 PBL(네거티브)DNA의 백그라운드에서 0.005% 표시된 세포의 농도까지 1:5(여기서 LNL6=1)의 비율로 LNL6 & RRz2로 형질도입된 CEM T4 세포로부터 DNA를 희석함으로써 구성되었다. 네스티드(hot start) PCR은 50㎕의 PCR 반응 혼합물에서 행해졌다. 사용된 프라이머는 5L1A: CAC TCA TGA GAT GCC TGC AAG; 3L2A: GAG TTC TAC CGG CAG TGC AAA; 5Nes1: GAT CCC CTC GCG AGT TGG TTC A(프라이머 라운드 #1: 5Nes1& 3L2A, 라운드 #2: 3L2A 및 라벨된 것: 5L1A). 샘플당 10 복제물이 68℃에서의 어닐링 및 94℃에서의 변성이라는 17 사이클 PCR 라운드 1에 포함되었다. 복제물 샘플들은 그리고 나서 풀화되었고 68℃에서의 어닐링 온도 및 94℃에서의 변성 온도로 35 사이클PCR 라운드 2를 위한 주형으로서 사용되었다. 4배의 산물 샘플들은 5% PAGE 변성 젤 상에서 분해되었고, Molecular Dynamics Imagequant 소프트웨어를 사용해서 정량되었다. LNL6 및 RRz2에 대한 PCR 산물은 각각 174 및 216 염기쌍이었고, neo^R유전자의 번역되지 않는 말단의 한 영역을 포함한다. 결과는 비율 조절이 허용가능한 한계(0.005% 벡터 포함 샘플에서 LNL6 : RRz2 1:3.5의 비율에 대하여, 허용되는 범위는 1:1.1~1:6.9였다)내라면 포함된다.

도 7c는 항원에 노출되지 않은 T-림프구에서 벡터 서열의 검출을 나타낸다. 젤은 CD4⁺및 CD8⁺T-림프구, 및 형질 도입된 CD34⁺세포가 투여된지 2년 이후에 환자 7에게서의 말초혈로부터 선별된 항원에 노출되지 않은 T-림프구 소집단에서 LNL6 및 RRz2 벡터 서열에 대한 PCR 분석을 나타낸다. 항원에 노출되지 않은 T-림프구 군은 CD4 및 CD8 선별된 군으로부터 순도>90%까지 선별되었다. T-림프구 및 백혈구는 CD3 및 CD14 MACS MicroBeads(Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA)를 사용해서 PBMC로부터 선별되었다. 항원에 노출되지 않은 T-림프구는 항-FITC Muktisirt 키트(Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA)를 사용한 선별법에 다라 FITC-접합 모노클론의 IgG₁항-CD45RA 항체(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)로 염색함으로써 선별되었다. 그 다음에, CD62L 선별은 쥐 매개의 IgG_2a항-CD62L 항체(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 사용해서 행해졌고, 이어서 래트 항-마우스 IgG_a+bMicrobeads로 선별되었다(Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA)

도7(D)는 2.5년에 환자 5에게서 항원에 노출되지 않은 T-세포 소집단에서 검출된 벡터 서열을 보여준다.

도 7(E)는 2년에 환자 5에게서 항원에 노출되지 않은 T-세포 소집단에서 검출된 벡터 서열을 보여준다.

도 7(F)는 투여 4주후 환자 8에게서 항원에 노출되지 않은 T-세포 소집단에서 검출된 벡터 서열을 보여준다.

도 8은 투여 3년후까지 모든 10명의 환자에게서 골수 단핵 세포(BMMC), PBMC, 과립구, T-림프구 및 백혈구에서 반정량 PCR에 의한 리보자임과 조절 벡터 전이 유전자 양자의 검출에 대한 요약을 보여준다.

모든 10명의 환자에게서, 바이러스 상청액 및 배양 CD34⁺풍부세포 양자를 사용하여 형질도입의 끝에 복제 가능 RNA 종양바이러스(RCR)에 대한 생물학적 정량은 네거티브였다. 최종 세포 주입제의 RCR 테스트는Mus dunni세포 라인에서 2번의 증폭 단계를 사용해서 공동배양에 의해 형질도입된 CD34⁺세포의 1% 상 뿐아니라 형질도입의 끝에 배양 상청액의 5% 상에서 수행되었다. 결과적인Mus dunni세포 배양 상청액은 그리고나서 PG4 S+L- 초점시험법(focus assay)를 사용해서 감염성 RNA 종양바이러스에 대하여 테스트되었다. CD34⁺세포 투여 6개월 및 1년이후에 RCR을 위해 PCR에 의해 분석된 환자의 PBMC 샘플은 RCR에 대한 어떤 증거도 밝히지 못했다. 환자 세포에서 RCR 검출을 위해서, 형질도입된- CD34⁺세포 투여 6개월 및1년 이후에 PBMC로부터 추출된 DNA는 다음 프라이머를 사용해서 앰포트로픽 외막 서열의 존재를 위하여 분석되었다: 5'-CTA TGT GAT CTG GTC GGA GA-3' 및 5'-CCA CAG GCA ACT TTA GAG CA-3'. 정량분석은 앰포트로픽 리셉터를 통한 세포의 감염을 위하여 필요한 것으로서, 외막 유전자의 호스트-결정 영역 부분을 코딩하는 잘 보존된 영역을 증폭함으로써 복제 가능 RNA 종양바이러스의 검출을 허용한다. 증폭된 영역은 289 염기쌍 길이이다. 정량분석의 감도는 10⁵네거티브 세포의 백그라운드에서 1 포지티브 세포이다. 포지티브 조절로서, pa317-패키지 세포 라인이 각 정량 분석에서 사용되었다. PCR 산물은 2.5% NuSieve 겔 상에서 분해되었다.

양 벡터에 대하여, 본 발명자들은 PBMC(LNL6 p=0.021; RRz2 p=0.034) 및 T-림프구(LNL6 및RRz2 양자에 대하여 p<0.0001) 양자에서 형질도입된 CD34⁺세포의 수 및 투여 2년후에 유전자 검출의 지속성 사이에 강한 선형 상관관계를 발견했다. 스피어만 순위 상관 기법(Spearman rank correlation)은 재도입된 형질도입된 세포 수 및 그 다음의 자손 PBMC 및 T-림프구의 표지 사이의 관계를 분석하기 위해 사용되었다. 분석은 각 환자에 대하여 세포/kg 으로 주어진 값에 기초한다. 이러한 분석에서, LNL6 표지는 재도입된 LNL6-형질도입된 세포의 양과 상관되고, RRz2 표지는 재도입된 RRz2-형질도입된 세포의 양과 상관된다. 1년 이상의 표지의 결과를 가져오는 형질도입된 CD34⁺세포의 최소 수는 0.5×10⁶세포/kg이었다.

벡터 서열은 투여 2.5년 후까지(평가된 최후 시점) 항원에 노출되지 않은 세포에서 검출되었다. 예를 들면, 도 7c는 한 명의 대표 환자에게서 아주 풍부한 항원 비노출 세포에서 벡터 서열의 존재를 보여준다.

벡터 서열은 투여 3년 후까지(평가된 최후 시점) 항원에 노출되지 않은 세포에서 검출되었다. 도 7D-F는 3명의 환자에게서 투여 4~130주 이후에 아주 풍부한 항원 비노출 및 메모리 세포에서 벡터 서열을 보여준다. 항원에 노출되지 않은 T-림프구가 검출가능한 벡터 서열을 가진 환자들의 평균 연령 및 바이러스 수는 각각 41세( 32~48세 범위) 및 3,680 카피/ml(범위: 22,628 카피/ml까지 검출 불가능)이었다. 항원에 노출되지 않은 T-림프구에서의 벡터 검출의 요약 및 검출시간에서의 바이러스 수는 표 2에서 보여진다. 본 발명자들은 또한 벡터 서열의 존재에 대해서 4명의 환자로부터 림프절의 미세 바늘 흡인물(fine needle asperates)을 분석했다. LNL6 및 RRz2 양자는 4명 중 2명의 환자에게서 검출되었다(투여 2.5년 뒤의 환자 7 및 투여 1년후의 환자 10).

표 2- 항원에 노출되지 않은 T-세포 벡터 검출 요약.

순환 항원에 노출되지 않은 T-림프구 군은 CD4 및 CD8 선별된 군으로부터 순도>85% 까지 선별되었다. 세포들은 PCR에 의하여 분석되었다. 벡터 분석의 시점에서 바이러스 수는 각 심볼하에서 보여진다, ND: 결정되지 않음. 두 개의 값은 두 번의 확인이 시간 간격으로 부터 이용가능하다는 것을 나타낸다. NT: 테스트 되지 않음; (+): LNL6, RRz2 또는 CD4⁺CD5⁺cd62L⁺또는 CD8⁺CD45⁺CD62L⁺(항원 비노출) T 림프구; (-): CD4 또는 CD8 항원비노출 T-세포에서 어떠한 벡터도 검출되지 않았다.

환자 번호	<3 개월	3~6 개월	6~12 개월	12~24 개월	>24 개월
1	NT	NT	+660	NT	NT
2	NT	NT	+12,893	NT	NT
3	NT	NT	-782	_ND	NT
4	+590	NT	+22,628	NT	NT
5	NT	NT	+3,183	+3,899	++130/15,800
6	NT	++368/606	-2,905	_	NT
7	+4,509	NT	+ND	+12,496	+ND
8	+ND	NT	NT	NT	NT
9	+ND	NT	+ND	+ND	NT
10	NT	+925	+1,384	+4,562	NT

CD4⁺세포에서 항-HIV-1 리보자임의 존재가 HIV 감염에 대항하여 보호작용을 부여하는지 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 시간에 따라 다른 세포 형에서 PCR에 의한 LNL6 및 RRz2 벡터 카피수를 측정했다. 표지 감소율의 구성 체내 비교는 복합 효과 회귀선(Miller, 1986)으로 나타났다. 표지 강도는 (a) 투여 이래의 (log) 시간, (b) 세포 형태의 반응 지시약, 및 (c)시간 x 세포 형태 상호작용 기간 (증식성 산물)에서 퇴보되었다.

복합 선형 모델 분석은 평가 알고리즘이 끊임없이 집중되었기 때문에(모델은 SAS PROC MIXED에서 적합하다), 이러한 데이터를 위해서 수행될 수 있었다. 표지 강도의 시험 대상 내에서의 상관관계는 데이터에 대한 "반복 측정" 차단 구조를 사용해서 모델화되었다. 이러한 분석들을 통해서, 본 발명자들은 잔유물에 대해 구조화되지 않은 분산-공분산 매트릭스를 사용하거나 혼성 대칭 매트릭스를 취함으로써 모델을 적합하게 했다. 중요한 동일 변수 측정 및 중요 시험이 분석의 각 형태로부터 발생했다.

HIV-유도 고갈 하에 있지 않는 세포 형태에서 보다 HIV 취약 세포 타입에서의 RRz2 표지의 더욱 오랜 지속 레벨은, RRz2-형질도입된 세포에 대한 선택 생존 혜택을 제공하는 Rz2-유도 보호작용과 일치한다.

도 9a에서 나타난 것처럼, RRz2 표지는 BMMC(T-림프구에 대한 로그-위크 당 -0.091 세포 vs. 로그-위크 당 BMMC에 대하여 -0.643 세포, 차이 p=0.0095)에서 보다 말초혈 T-림프구에서 대략 1/8 비율로 감소된다. RRz2-포함 BMMC의 감소율과는 달리, RRz2-포함 T-림프구의 감소율은 제로와는 상당히 다르고, 양 속도사이의 차이는 상당하다(BMMC에 대하여 p<0.0001, T-림프구에 대하여 p=0.55, 양 세포 형태 사이에서 RRz2-포함 세포의 감소율을 비교하는 통계 시험에 있어서 p=0.009). 이러한 결과는 세포 형태 사이에서 고유 감소율 차이에 기인한다는 가능성을 배제하기 위하여, LNL6 표지가 도 9b에서 보여진다. 이 분석은 T-림프구에 대한 -0.716 및 BMMC에 대한 -0.725의 LNL6 카피의 감소율을 보여줬다. 양 곡선은 제로 감소율 곡선( T-림프구 및 골수 각각에 대한 p값 0.0019 및 0.004)과는 상당히 달랐다. 양 세포 형태 사이에서 RRz2의 감소율 비교를 위한 통계 시험에 대한 p값은 LNL6 벡터에 대한 동일 감소 동역학에 가까운 것을 반영하여 0.97이었다. 이러한 비교는 복합 효과 회귀 모델(Miller 1986)로서 나타났다. LNL6에 의해 부여된 HIV 대항 보호 작용의 부족에 일치하여, 이러한 두 세포 형태사이에서 LNL6 표지에 대한 어떠한 특이한 감소도 관찰되지 않았다(p=0.9781),(도 9b). 이러한 결과는 두 벡터 사이에서 표지 감소율에서 통계적으로 중요한 차이가 PBMC 및 T-림프구에서 RRz2를 위하여 관찰되지만, BMMC 및 과립구의 경우에 벡터들 사이에서는 동일한 감소율이 관찰된다는 것을 보여준다. 더욱이, LNL6 포함하는 것이 감소되는 반면에(RRz2 및 LNL6 각각에 대한 로그 위크당 +0.145 vs. -0.240, 차이 p=0.033) 시간에 따라 RRz2를 포함하는 항원 비노출 T-림프구는 증가했다. 이러한 결과는 HIV-1 감염된 환자에게서, 최근 흉선 이주자를 포함하여, RRz2가 HIV-취약 세포에 선택 생존 혜택을 부여한다는 것을 나타낸다.

본 발명자들은 다음으로 LNL6 및 RRz2를 포함하는 T-림프구 사이에서 특이 감소의 정도가 각 환자가 투여받은 RRz2-형질전환된 CD34⁺세포의 수와 상관되어 있는지 여부를 확인하려고 노력했다. 이 때문에, 각 환자에 대한 양 벡터 사이의 감소 기울기의 차이는 투여된 RRz2-형질도입된 CD34⁺세포수와 상관관계가 있다. LNL6 및 RRz2 표지에 대한 환자-특이 감소 기울기는 회귀 직선에 의해 계산되었고, 기울기에서의 차이(RRz2- LNL6)는 RRz2-매개 보호작용에 대한 검출용으로서 채택되었다. 스피어만 순위 상관 기법은 특이 감소율 및 투여된 형질도입 CD34⁺세포의 수 사이의 관계를 조사하기 위하여 사용되었다.)

T-림프구 및 PBMC 감소 기울기에 대한, 이러한 관계를 설명하는 플롯이 각각 도 9c&d에서 보여진다. 이러한 분석은 투여된 형질 도입 CD34⁺세포 수와 PBMC 및T-림프구 양자에서 LNL6 vs. RRz2의 특이 감소의 정도 사이의 강한 선형 관계를 설명한다. 재투여된 RRz2-형질 도입 CD34⁺세포 수가 회귀 분석에서 시간에 따른 표지의 특이 감소를 묘사하는 계속 변수로서 사용될때, 결과는 통계적으로 p< .0001에 상당한다((log) 타임, 투여된 세포 수, 및 산물-기간 상호작용에서 특이 표지(RRz2-LNL6)의 회귀에서의 상호작용 기간동안 회귀 계수 t 통계치). 이러한 데이터는 보호되는 및 보호되지 않는 HIV-1-취약 세포사이에서 특이 생존에 대해 기대하지 않은 복용량 의존 효과가 있다는 것, 및 조혈모세포 유전자 치료 방법을 사용하여 임상적인 이익이 환자에게 투여되는 형질 도입 전구체의 복용량에 의존한다는 것을 나타낸다.

1기 연구에서의 모든 환자들은 항-RNA 종양 바이러스성 치료를 현재까지 받았고 그 중 어느 누구도 면역체계가 약해져서 발생하는 감염은 없었다. CD4⁺세포수 및 바이러스 수의 동역학은 도 10에서 설명된다. 바이러스 수에서의 초기 증가가 동원기간동안 항-RNA 종양 바이러스성 치료가 불연속적이었던 일부 환자에게서 투여 하루만에 관찰되었다. 형질 도입 동안 MMLV 역전사 효소의 잠재적인 억제를 막기 위해서 약품 중단 또는 비뉴클레오사이드 역전사효소 억제제 또는 프로테아제 억제제에 대한 뉴클레오사이드 역전사효소 억제제의 치환은 프로토콜에 포함되었다(H. Bazin, et al 1989). 바이러스 감염의 우발적 상승은 항 RNA 종양바이러스 치료의 변형에 대응한다.

초기에서 3년까지 CD4⁺T-림프구 수에서의 평균 변화는 ㎣당 10 세포( -40~+80 범위)의 증가였다. 바이러스 수는 6명의 환자에게서 2.25 로그의 평균으로 감소했고(0.35~3.9 범위), 3명의 환자에게서 검출되지 않았으며, 1명의 환자에게서 1 로그만큼 상승했다. 이러한 변화는 어떤 세포 형태에서 벡터 검출 또는 벡터 발현의 정도 또는 지속성과는 상관되어 있지 않았으며, 항-RNA 종양 바이러스성 치료에 대한 개개의 바이러스 민감성에 의해 영향받는다고 생각되었다.

바이러스의 유전자형은 모든 환자에게서 다수의 약품 저항성을 설명했다(데이트는 나타내지 않았다). 본 발명자들은 또한 모든 환자에게서 연구 초기에 HIV의 Rz2 결합/절단 영역의 유전자형 분석을 행했고, 치료 12, 24, 52 및 104주 후에 리보자임 절단 부위 분석이 사소한 수정과 함께, 앞에 기술된 것처럼 행해졌다(Wang et al.1998). 간단하게, 바이러스 RNA가 추출되었고 48℃에서 45분 동안 프라이머 1(TGGCAATGAAAGCAACACT)을 사용해서 Access RT-PCR 키트로 역전사되었다. 결과적인 cDNA는 25사이클( 20초 동안 94℃, 30초 동안 55℃, 30초 동안 68℃) 동안 프라이머 2(TTTAGAGGAGCTTAAGAATGA)의 추가에 의해 PCR 증폭되었다. 사이클 서열을 위한 단일-가닥 DNA는 AmpliTaq(Perkin-Elmer) 및 프라이머 3(AGTTTTAGGCTGACTTCCTGG)을 사용하여 20초 동안, 30초 동안 55℃, 및 30초 동안 68℃에서 25 사이클 동안의 두번째 PCR 단계에 의해 생산되었다. 서열 결정은 AmpliTaq DNA 폴리머라제(Perkin-Elmer)로 자동 DNA 시퀀서(ABI Model 377, Applied Biosystems, Foster City, CA)상에서 프라이머 4(TGGAAGCCATAATAAGAAT)를 사용해서 ABI PRISM Dye 종결 사이클 서열결정 Ready Reaction 키트로 정제된 PCR 산물에 대해 행했다. 서열 정렬은 Sequence Navigator 소프트웨어(Perkin-Elmer)로 행했고 수동으로 교정 및 수정했다. 결과적인 서열은 HXB2 계통 B HIV-1 참조 가닥과 비교되었다.

10명의 환자중 6명은 서열 결정이 허용되는 바이러스 수를 가졌다. 환자 1,2,5 및 6은 야생형 서열을 가졌다. 환자 4는 GUA 타겟 트리플렛에서 -1위치에서 A가 C로 전이되었다. 환자 7은 GUA 타겟 트리플렛에서 -4위치에서 G가 T로 전이되었다. 증거는 돌연변이체 RNA가 리보자임에 의해 제거되었다는 것을 나타낸다. 이러한 환자들 둘다에서 검출된 돌연변이는 치료이전에 존재했다; 고로 그들은 구성체에서 효능-유도 저항성의 결과로서 발생하지 않았다.

여기에서 기술된 연구는 골수 절제 없이 행해졌으므로, 조작된 CD34⁺세포가 키메라 조혈 시스템을 형성하기 위해 기여했다. 형질도입된 CD34⁺세포는 조혈 재구성체에 대하여 내생 줄기 세포와 경쟁해야 한다. 실로 본 발명의 결과는 세포 복용량 및 형질 도입된 세포의 생착 기간 간의 상관관계를 나타낸다. 어떠한 생존 혜택도 형질도입된 CD34⁺세포의 수준에서 발생한다고는 기대되지 않기 때문에, 미래의 연구는 투여된 유전자 변형 세포의 수를 증가시키도록 목표를 설정할 것이다. 최근에, 인간의 심각한 복합 면역결핍(SCID)-X1 증을 특징짓는 γc 사이토카인 리셉터 결핍에서 유전적 교정이 기능성 면역 시스템의 발달을 유도한다는 것이 보고되었다(Cavazzana-Calvo et al. 2000). 유전자 교정 전략의 적용에 있어서, HIV감염 모델은 SCID-X1 모델과는 다르다. 형질도입된 및 형질도입되지 않은 CD34⁺세포가 thymopoiesis에 기여할 수 있는, HIV/AIDS의 세팅과는 달리, 결과적인 기능리셉터가 생존 신호를 전달하는 SCID-X1의 경우에는, thymopoiesis가 단지 외생의 유전자를 포함하는 CD34⁺세포로부터 유래한다. 그래서, HIV 감염에서, 이러한 리보자임-운반 세포의 확장의 결과를 가져오는 CD34⁺T-림프구의 수준에서 생존 혜택은 아마도 HIV 복제의 존재하에서 일어날 것이다. 이 경우에, 보호되지 않는 세포는 취약한 상태로 남게 되므로, 바이러스는 선택 생존 압력을 제공한다. 이 가설은 본 발명자들의 환자들이 항RNA 종양바이러스 치료를 받고 있었기 때문에, 본 발명의 연구에서 실험되지 않았다. 선택 생존의 더 큰 정도가 조절되지 않은 바이러스 복제하에서 발생될 것이다.

이러한 연구는 유전자 구성체가 CD34⁺조혈모세포로 RNA 종양바이러스에 의해 도입될 수 있다는 것, 및 이러한 세포가 HIV-감염된 환자에게서 다계통 조혈에 대해 장기간 공헌할 수 있다는 것을 보여줬다. 본 발명의 연구는 HIV 감염에서 줄기세포 유전자 치료 시도에 관한 두 번째의 보고이다. 소아과 환자에게 rev-반응성 인자 미끼 유전자를 포함하는 RNA 종양 바이러스성 벡터를 채용한 이전의 시도는 세포 투여 하루 후 단지 어느 때 4 명의 환자 중 2 명에게서 항-HIV 유전자가 검출되었다. 조절 벡터는 투여후 250 및 330일 후에 1명의 환자에게서, 90일후 3명의 환자에게서, 30일후 모든 4명의 환자에게서 낮은 수준으로 검출되었다(Kohn et al. 1999). 이러한 결과는 본 발명자들의 장기간의 재구성체 결과와 대비된다. 본 발명자들의 결과에 기초하여, 이전의 보고에서 관찰된 단기간의 표지는 투여된 형질도입된 CD34 세포의 낮은 복용량에 적어도 부분적으로 기인하는 것 같다. 형질도입된T-림프구를 사용한 이전의 HIV 유전자 치료 연구는 투여 1년 이후까지 조절 벡터와 비교하여 치료 벡터의 더 오랜 지속율을 보여주는 반면에, 본 발명에 의한 것은 HIV 감염된 환경에서 유전적으로 변형된 조혈모세포로부터 T-림프구가 장기간 발달한다는 것을 나타내고, HIV-유도 감소에 대항하여 항원 비노출 및 메모리 T-림프구의 세포 보호의 증거를 보여주는 첫 보고이다. 항원 비노출 티모사이트가 HIV에 의해 감염된 사실이 알려지고(Ostrowski et al. 1999), 흉선이 T-림프구의 분화 동안 HIV-1 잠복의 원천으로써 작용할 수 있다면(Brooks et al 2001), 변이 유전자-포함 항원 비노출 T-림프구의 지속적인 생성이, 검출가능한 바이러스 감염이 있는 환자에게서 조차 일어난다는 발견은 중요하다. 티모포이에시스는 성인 환자에서 계속되기 때문에, 바이러스 복제를 효과적으로 억제하도록 설계된, 상기 항원 비노출 T-림프구에 기초하는 잠복 풀의 치환은, 보호된 면역 세포의 부활 및 항-RNA 종양 바이러스성 치료의 중단에 수반되거나, 약물 내성의 증가 후에 일어나는 바이러스성 재발생의 억제를 초래할 수 있다. 백혈구 등의 다른 바이러스성 숙주 내의 리보자임 서열의 존재는 또한, 이러한 환경에서 바이러스의 조절에 기여할 수 있다. 이러한 결과는, 항-HIV 치료의 일 형태로써, 항-HIV 줄기 세포 유전자 전이의 더 심도있는 개발에 대한 정당성을 입증한다.

실시예 3 : 사용된 특이적 방법

3.1 마이코플라즈마 분석

배양과 형질도입에 이어, 회수한 세포배양을 마이코플라즈마로 실험하였다.사용된 방법은 PCR 에 의한 마이코플라즈마-특이적 DNA 서열의 증폭과 ELISA 에 의한 엠플리콘의 연속적 검출에 기초하는 것으로, 마이코플라즈마 PCR ELISA 테스트 키트(Boehringer Mannheim, Cat #1 663 925)를 사용하였다. 마이코플라즈마를 침전시키기 위하여, 실험 샘플(1 sample per donor) 과 음성적 대조샘플(인간 세럼 알부민 5%를 포함하는 신선한 RPMI 배양약 1 ml aliquot)을 마이크로 원심 분리 튜브에서 10분동안 4 ℃에서 최대속도로 원심분리하였다. 펠렛을 용해시키기 위하여, 10 μl의 살균된 물과 10 μl 의 라이시스 시약(solution 1 of the kit)를 첨가하였다. 그 다음은 키트의 안내 방법에 따라서 실시되었다. PCR 진행에 있어서 샘플과 시약의 교차오염을 방지하기 위하여, 모든 피펫팅 단계에 있어서 에어로졸 팁을 사용하였다. 각 실험은 두개의 음성적 대조군과 하나의 양성적 분석 대조군을 포함하였다. PCR 증폭은 95℃ 에서 5분의 1 사이클, 94℃ 에서 30초; 62℃ 에서 30초; 72℃ 에서 1분, 마지막으로 72℃ 에서 10분으로 39 사이클 하였다. 제조사의 지시에 따른 ELISA 단계 후에, 분석이 반복되지 않는다면, 0.25 A₄₅₀-A₆₉₀-units 보다 낮은 경우 음성적 대조군이 받아들여 졌다. 양성적 분석 대조군은, 1.2 A₄₅₀-A₆₉₀-units 보다 높은 경우, 더 낮은 분석이 반복되지 않는 경우에 받아들여졌다. 샘플은 음성적 대조군보다 0.2 A₄₅₀-A₆₉₀-units 더 높은 것 이상의 흡광도를 나타내는 경우에 마이코플라즈마오염에 있어 양성적인 것으로 간주되었다.

3.2 내독소 분석

배양과 형질도입 후의 세포배양에 있어서, 내독소의 존재는 다음 두가지 이유에 의해 결정되었다. 배양에서의 낮은 수준의 내독소의 존재는, 그람 음성적 미생물에 의한 앞선 가능한 오염을 나타내며, 두번째로, 높은 수준의 내독소는 배양되는 세포에 독소로 작용한다. 이 분석은, 주입 전, 형질도입 후 회수한 날에 실시되었으며, 제조사의 지시에 따라 QCL-1000 Limulus Amebocyte Lysate kit(BioWhittaker # 50-647U)를 사용하였다. 25% 빙초산으로 이루어진 종결 용액는, 바이오휘테커 키트(BioWhittaker kit)에 함께 제공되지 않았기 때문에 따로 준비하였다. 1개의 키트가 5개의 환자 배양에 충분하였다. 결과는 Softmax 소프트웨어로 분석되었다. 희석된 주입 샘플 또는 희석된 VCM 샘플의 결과가 5 EU/ml 보다 큰 경우에는, 주입이 진행되지 않았다. 희석되지 않은 주입 샘플 또는 희석되지 않은 VCM 샘플의 결과가 0.3 EU/ml 보다 큰 경우에는, 주입 백에서의 박테리아에 의한 가능한 오염을 확인하기 위해 그람 착색 결과를 언급하였다. 그렇지 않은 경우에는, 주입을 실시하였다.

3.3 그람 착색(Gram Stain)

주입 전, 세포배양에 있어서의 그람양성균과 그람음성균 테스트를 위하여 그람 착색법이 사용되었다. 합쳐진 양성과 음성 대조군을 갖는 슬라이드(Fisherbran Gramv QC Slides cat #08-80)와 Fisher 진단 그람 착색 세트(Cat #SG 100D)를 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 각 주입 혼합물의 5μl 샘플을 슬라이드 위에 고르게 펴 바르고, 착색 후, 유침유를 사용하여 100×배율로 슬라이드를 관찰하였다.어두운 자주색 둥근 점으로 보이는 그람양성Staph.aureus를 포함하는, "+"로 표시된 첫번째 컬럼의 면적을 대조 표준으로 구하였다. 붉은 핑크 막대로 보이는 그람음성E. coli를 포함하는, "-"로 표시된 첫번째 컬럼의 면적을 대조 표준으로 구하였다. 대조표준이 이와 같지 않을 경우에는, 착색을 다시 실시하였다. 주입 샘플이 대조 표준과 같은 것을 포함하지 않은 경우에는 주입을 실시하지 않았다. 배양된 세포는 상대적으로 큰 것으로서 나타났으며, 세포막은 엷은 성긴 조각단편으로 나타났다.

3.4 공생배양과 PCR 테스트를 위한 증폭 샘플의 준비

RNA 종양 바이러스-형질 도입된 세포와 형질 도입된 세포 배양 상청액 (supernatant)을 RCR(replication competent retrovirus)로 실험하였다. FDA(U.S. Food & Drug Administration)의 요구에 따라, 각 환자에 대하여 전체 형질도입된 환자의 세포의 1% 또는 10⁸(이들 중 적은 것)은Mus dunni공생배양법(co-cultivation assay)으로, 형질 도입된 세포 배양 상청액은Mus dunni증폭법(amplification assay)으로 실험하였다. 상기 실험은 BioReliance Corp.(Rockville, Maryland, USA 에 위치하는 전 MA BioServices)에서 실시하였다. 세포회수와 주입을 위한 준비시간에 샘플을 채취하였으며, 모든 형질도입/회수 공정이 끝날 때까지 보관한 후, 실험을 위해 선적하였다.

증폭 RCR 샘플은 다음과 같이 보관을 위하여 준비하였다. 최종 회수된 CD34⁺세포로 부터의 상청액 샘플을 3개씩 준비하고 정제된 상청액의 alignots으로 이루어지도록 하였다(5% total volume per tube). 이들을 최종 형질도입된 환자의 증폭 샘플이 수거될 때까지 -80 ℃에 저장하였다. 샘플 당 2%의 각각의 CD34⁺세포 1 1 회분을 사용하여, 복제 RCR 공생 배양 샘플을 준비하여, 냉동보존액에 다시 현탁시켰다. 선적될 때까지 샘플을 액체 질소에 저장하였으며, BioReliance Corp. 실험실에서 샘플이 해동되었을 때, 필요한 생존 세포의 수(1%)를 보장하기 위하여 충분한 세포가 포함되도록 하였다.

3.5 플라즈마 / PBMC /골수 분리

주입 후 적어도 3년까지의 다양한 시점에서, 주입 전 선발된 환자로부터 혈액 샘플과 골수 샘플을 수집하였다. 혈액은, 요구되는 실험에 따라 적절한 양을 10ml ACD 튜브에 수집하였다. 이러한 혈액 샘플로부터, 플라즈마를 수집하였으며, PBMC를 세포 펠렛 또는 냉동 보존된 샘플로서 준비하였다. BBMC 는 골수로부터 준비되었으며, CFC assay 를 위하여 사용하고, 나머지는 냉동보존 하였다. 준비 절차는 다음과 같다.

플라즈마의 수집: 혈액 튜브(10ml, ACD-A vacutainers)를 2000rpm으로 10분 동안 원심분리 하였다. 각 튜브로 부터의 플라즈마 분획을 조심스럽게 수집하여, 50 ml의 살균된 튜브에 모이게 하였다. 2 ml 의 플라즈마를 aliquot 하여 -80 ℃ 에 보관하였다.

PBMC 의 준비: 플라즈마 수집 후, 적혈구/백혈구 세포 펠렛을 사용하여, 상기 세포를 Wash Buffer 로 처음 부피의 3배로 희석하고, 50 ml 원심분리 튜브에 30 ml 로트로 분배하였다. 각 희석된 세포 현탁액을 10 ml Ficoll-Paque(Pharmacia Cat#17-0849-03)에 넣고 진동하는 버켓 로터(bucket rotor)에서 2000 rpm으로 20분 동안 20℃ 에서 원심분리하였다. 상층을 흡입제거하고, 교란되지 않은 간기(interphase)의 단핵 세포층을 남겨놓는다. 간기 세포를 새로운 50 ml 튜브에 옮기고, wash buffer 로 세척한 후, 1500 rpm 으로 15분 동안 원심분리한 다음, 그 펠렛을 5-10 ml 의 Wash buffer 에 재현탁시켰다.

Hemacytometer 와 Trypan Blue(1:25 희석)를 사용하여, 50 μl의 세포 혼합물의 생존 세포의 수를 결정하였다. 세포들을 튜브당 1-2 ×10⁶세포로 하여 aliquot 시킨 후, 필요한 경우 냉동 보관시키고, 140 μl 의 Urea Lysis Buffer로 lysed 시킨다. 냉동 보존을 위하여, ml 당 1-5 ×10⁶cells 로 하여, PBMC 냉동보존액에 재현탁시키고, 보관을 위해 액체 질소에서 서서히 냉각시켰다.

골수단핵세포(BMMC)의 준비: 골수를 Wash Buffer로 1:1 희석하고, 30 ml의 샘플을 Ficoll-Paque를 사용하여 PBMC 를 위하여 상기와 같이 처리한다. 30 μl 샘플에 대한 생존 세포 수를 정하고, CFC assay(2.5-3 ×10⁶cells)을 위해 요구되어지는 양을 남겨 놓는다. 모든 잔여 BMMC 는 CD34⁺냉동보존액의 ml 당 1 ×10⁷cells로 하여 냉동보존한다.

3.6 스크린 샘플 골수의 CFU 분석(Screening Sample Bone Marrow CFU Assay)

주입 전 환자들로부터 수집한 골수에 대하여 CFU assay를 실시하여, 주입 후의 실시되는 다른 모든 군체 분석(colony assays)에 대한 기준선 또는 대조표준을 얻었다. 모든 진행은 생안전 후드(biocontainment hood) 에서 실시되었으며, 항상 무균 기법이 적용되었다.

상기와 같이 준비된 BMMC 를 세 개의 1.5 ml의 살균된 마이크로퓨지 튜브(microfuge tube)에 각 튜브 당 1.5 ×10⁶cells, 7.5 ×10⁵cells, 3 ×10⁵cells 로 분취하였다. 샘플을 2500 rpm 으로 2분 동안 원심분리하고, 배양액을 흡입한 후, 세포 펠렛을 300 μl의 RPMI(Gibco BRL, Cat #118-030) + 1%FBS(Stem Cell technologies, Cat# HCC-6450)에 완전히 재현탁시겼다. 각각 3ml 의 Methocult GFH4434 (Stem Cell technologies, Cat# HCC-4434)을 포함하는 튜브( 6ml polystyrene Falcon. Cat#2058)들에 세포 혼합물을 피펫팅하였다. 내용물을 적어도 15초 동안 완전히 혼합하고 거품을 가라앉힌 뒤, 패트리 디쉬 안에 정렬된 그리드 디쉬(Nunc Cat# 174926) 위에 1.1 ml 분취물을 층상 형성시켰다. 페트리 디쉬는 살균수를 담는 부가적인 그리드 디쉬를 가지며, 배양하는 동안 습도 유지를 위하여 열어두었다. 그리드 디쉬를 갖는 페트리 디쉬를 습도 조절된 인큐베이터에 37℃로 보관하였으며, 10-14 일 후에 군체를 관찰하였다.

3. 7 주입 후의 CFC 분석

주입 후 CFC(Colony Forming Cell) 분석은G418가 존재하는 또는 존재하지 않는 배양 모두를 포함하였다. 이는 후에 주입되는 형질 도입된 모세포 분화를 측정하기 위하여 사용되었다. 최적 밀도의 군체를 위하여 두개의 세포 수/dish 를 사용하였다.

상기와 같이 BMMC 가 준비되었으며, 살균된 microfuge 튜브에 6 ×10⁵또는 1.5 ×10⁶cells 로 분취하였다. 세포는 2분동안 2500 rpm으로 펠렛화 되었다. 배양액은 흡입하고, 세포펠렛을 600 μl의 RPMI + 1%FBS 에 완전히 재현탁 시켰다. 300 μl의 각 세포 혼합물을, 한개는 3 ml 의 Methocult GFH4434 (StemCell technologies, Cat# HCC-4434)와 0.9 mg/ml의 +G418 (G418, crystallinegeneticin, Gibco-BRL Cat # 11811-031)를 포함하는, 또 다른 하나는 G418을 포함하지 않는 튜부에 각각 첨가하였다. 샘플을 진동 혼합시키고, 스크린 샘플 골수의 CFU 분석을 위해 상기한 바와 같이 더 처리하였다.

3.8 혈액으로 부터의 T-세포, 백혈구, 과립구의 준비

주입 후의 몇몇 시점에서 환자의 혈액으로부터 백혈구를 분리시켰다. 이들 세포를 3개의 타입( T-세포, 대식세포, 과립구 계통)으로 분획시켰다. 혈액은 먼저, 1-스텝 다형핵백혈구에 대하여 적혈구,과립구, 말초혈 단핵 세포(PBMCs; peripheral blood mononuclear cells)로 분리시켰다. 상기 PBMCs를 두 개의 컬럼에 더 분획하였다: 림프구에 대한 CD3과 백혈구에 대한 CD14 컬럼. 과립구 분획의 순도 측정을 위하여 김자착색(Gimsa stain) 을 하였으며, 림프구와 백혈구 분획의 순도 측정을 위하여 FACS 착색을 하였다. 모든 분획은, 나중의 DNA 추출과 PCR 분석을 위하여 세포 리세이트가 준비되도록 처리하였다.

모든 실험 절차는 클래스 II 생물학적 안전 캐비넷(Class II Biological Containment cabinet)안에서 진행되었다. 10 ml 튜브에 2시간 이전에 채취하여 상온에서 보관한 5 ml의 신선한 ACD 응고 방지된 인간 혈액을, 3.5 ml의 1-스텝 다형핵백혈구(Accurate Chemical& scientific Corporation, Cat# AN221710, 일광을 차단하고 실온에서 보관) 위에 오버레이 하였다.

30분 동안 1650 rmp으로 상온에서 버켓 로터로 튜브를 원심분리 하였다. 원심분리 후, 두 개의 백혈구 밴드가 관찰되었다. 플라즈마/1-스텝 계면에서의 위쪽의 밴드는 단핵세포로 구성되어 있었으며, 아래쪽 밴드는 PMN 세포(과립구)로 구성되어 있었다. 적혈구는 펠렛화 되었다. 대략 1 ml의 플라즈마를 제외하고는 도무 흡입하고, 계면에서 교란되지 않은 단핵세포 층만 남겨놓은 채, "플라즈마" 튜브에 옮겨 담았다. 모든 수집된 플라즈마를 각 환자에 대해 모아놓고, 2 ml 라트로 aliquot 한 후, 나중의 과립구 착색을 위하여 보관하였다. PBMC 계면 세포는, 아래쪽의 밴드가 따라지지 않게 조심하면서 "PBMC" 튜브에 옮겨 놓았다. 각 환자에 대하여 수집된 모든 PBMC 를 모아두었다. 아래쪽의 밴드는 "과립구"튜브에 옮기고, 모두 모아드었다. 동량의 하이포토닉 PBS를 과립구 튜브에 첨가하였다. "PBMC"와 "과립구" 튜브 모두를 Wash Buffer 로 50ml 까지 채운 후, 혼합하여 실온에서 1500 rmp 으로 15분 동안 원심분리하였다. 펠렛화 한 후, 세포를 10 ml 의 PBS 에 재현탁하였다. 세포 카운트를 실시하였다.(PBMC 세포 현택액은 1:20 희석, 과립구 현택액은 1:5 희석)

과립구 펠렛/리세이트 준비와 페노타이핑(phenotyping): 원 현탁액 또는 세포 펠릿을 최종 농도 1 ×10⁷cells/ml 로 현탁하고, 필요한 경우 세포를 다시 펠릿화 하였다. 페노타입 착색을 위하여, 100 μl를 microfuge 튜브에 옮겨 넣었다. 이들 세포를 1분 동안 ∼3000 rmp으로 마이크로퓨지에서 펠렛화하고, 10 μl의 플라즈마 분획에 현탁시킨 후, 이 농축된 현탁액 5 μl를 두개의 현미경 슬라이드에 각각 도포하였다. 이 슬라이드를 자연 건조시키고, 김자착색으로 30분 동안 착색 한 후, 증류수로 린스한 후, 자연건조 시켰다. 이들을 20 ×배율로 관찰하고, 과립구의 분획을 카운트하였다. 과립구 세포의 나머지는, 나중의 DNA 추출을 위하여 2분 동안 ∼3000 rmp으로 마이크로퓨지에서 펠릿화하였다.

3.9 세포로부터의 DNA 준비(Vacutainer-phenoling DNA)

DNA 추출을 위하여 베큐테이너(Hemogard, SerumSep, 6 ml. Cat# 369789)를 사용하였다. 이는 CD34 세포, 메틸셀룰로오즈 군체, 환자의 PBMCs 로 부터 게놈 DNA 를 추출하기 위한 가장 빠른 방법이었다. 1.5 ml 마이크로퓨지 튜브 안에 있는 1-2 백만개의 세포를 초원심분리기로 3000 rpm 으로 3분 동안 펠렛화하고, 1 ml 의 PBS 로 한번 세척한 후, 70 μl의 물로 분산시켰다. 우레아 라이시스 버퍼 140 μl 를 각 튜브에 첨가하고, 5-8 번 정도 보텍스(vortex)로 상을 완전히 혼합시켰다.이들 튜브는 -70 ℃ 에서 무기한으로 동결 보존 될 수 있다. 각 샘플에 대하여, 0.5 ml의 페놀 용액(Tris equilibrated United States Biochemical #20083, 400 ml 당 0.4g의 히드록시퀴놀린 헤미설페이트 첨가)를 첨가하고, 그 혼합물을 23 또는 25 G 바늘을 가진 1ml 주사기를 사용하여 2-3번 펌핑한 후, 210 μl의 물을 포함하고 있는 베큐테이너에 주사하고, 15 μl의 클로로포름을 각 베큐테이너에 첨가하였다. 캡을 씌워, 2400rpm 으로 5분 동안 원심분리 한 후, 0.5 ml의 페놀/클로로포름을 첨가하였다. 30초 동안 잘 흔든 후, 2000 rpm 으로 3분 동안 다시 원심분리 하였다. 페놀/클로로포름 추출을 반복하고 나서, 클로로포름/이소아밀 알콜로 두번 추출하였다. 에어오졸-레지스탄트 팁이 있는 마이크로퓨즈 튜브로 상기 추출액의 400μl를 옮기고, 25 μl의 5 M NaCl 과 850 μl의 순수 에탄올을 사용하여 -20℃ 에서 DNA 를 침전시켰다. 원심분리로 DNA 를 회수하고, 70% 에탄올로 한번 세척하여, 자연건조 시킨 후, 50 μl 의 물 또는 pH 9의 5mL Tris 에 재현탁시켰다. PBMC 분획 또는 골수 샘플에 있어서는, 각각의 10⁶세포에 대하여 20μl 를 사용하였다. 준비된 DNA 는 -70℃ 에서 보관하였다. 군체로부터의 샘플에 대하여, 210μl의 베큐테이너의 물은 캐리어로서 10 μg의 tRNA 를 포함하였다.

DNA 는 "어세스트 프로토콜(Acest protocol)"을 이용하여 세포로부터 준비되었고, 경쟁적 PCR(competitive PCR)과 PCR-RCR assay 를 사용하였다. 마이크로퓨지 튜브에 있는 대략 5 ×10⁶cells의 셀 펠렛을 300 μl 의 라이시스 버퍼(10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 3mM CaCl₂, 0.4% Triton ×100, pH 8.0, filter sterilized)에 재현탁시키고, 3 μl의 preTaq (Boehringer Mannheim Cat #1696491) 을 첨가하였으며, 샘플을 5분 동안 끊인 후, 13000 rpm 으로 2분 동안 원심분리하였다. 스크루 캡이 달린 1.5 ml의 깨끗한 튜브에 그 상청액을 따른 다음, 100 μl의 ACES Buffer (2.28 Aces(Sigma Cat. No. A-7949), 0.5M NaOH 12.5ml, Tween-20 12.5 ml, pH 6.8, 전체 부피 50ml, filter sterilized)와 25 μl의 중합체(Ward et al 1998)를 첨가하고, 샘플을 잠시동안 vortex 를 이용하여 혼합한 후, 13000rpm 에서 2분 동안 원심분리 하였다. 50 μl의 20 mM NaOH 에 펠렛을 재현탁하고, 완전히 녹을 때 까지 실온에 방치하였다. 샘플을 5분 동안 끓인 후, 260nm 에서 광학밀도를 측정함으로써 DNA 농도를 결정하였다. 주입 후의 세포로부터의 추출은, HIV 존재로 인하여 PC3 containment 아래에서 실시하였다.

3.10 PCR

세포 또는 세포 군체의 LNL6 또는 RRz2 서열의 검출을 위하여, 셀룰라 DNA 의 PCR 분석을 실시하였다. PCR 생성물의 정량적 검출을 위하여, PCR 프라이머를 P32 로 라벨링 하였다. 상기 라벨링은 γ³²P-APT(ICN # 3502005) 와 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제 (GIBCO-BRL Cat# 18004-010)로 실시하였다. G25 Sephadex 스핀 컬럼을 사용하여 결합되지 못한 여분의 라벨을 제거하였다. PCRs 을 위하여, 250ml Tris, MgCl₂50mM, NaCl 500mM, dATP, dCTP, dGTP, TTP(Gibco BRL 10297-018) 각각 2.5mM, 1.0mg/ml BSA(Sigma A-4378, 100mg/ml)을 포함하는 pH 8.0 의 10× 버퍼를사용하였다.

pLNL6 와 pRRz2 DNA 의 표준을 pH 9 의 5mM Tris 에 희석하여, 캐리어로서는 휴먼 리버 DNA를 이용하여 μl 당 1,000 - 100,000 복제를 하였으며, 연속적으로 5μl의 샘플 당 5 - 5000 복제의 범위로 희석하였다. 휴먼 베타 글로빈 분석을 위하여, 1mg/ml 스톡으로부터 휴먼 DNA 표준을 만들어 μl 당 10,000, 3000, 1000, 300, 100 유전자 복제로 희석화 시켰다.

LNL6/RRz2 "High copies" : DNA 준비시 상대적으로 높은 수준의 LNL6와 RRz의 정량화를 위하여 사용되는 방법.

그러한 DNA 는 CD34 세포와 조혈 군체에서 유래하였다. 이러한 프로토콜에 있어서의 PCR 반응은, 휴먼 게놈의 10⁴복제를 넘지 않는 25 μl 이었다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 Fisher 사로 부터의 5L1A, 3L1D와 Taq 폴리머라아제 였다. MJ Research Programmable Thermal Controller를 사용하여, 94℃ 에서 3분, 68℃ 에서 1분 동안 실시 한 후, 94 ℃ 에서 1분 동안 27 사이클, 68℃ 에서 1분 동안 실시하였다. 모두 휴먼 게놈의 5000 copies 존재하에서, RRz2의 5000, 1000, 500, 100, 50, 10, 5, 0, 0, 0 copies 와 LNL6의 0, 0, 0, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 copies 를 포함하여 각각 10개의 표준 샘플을 사용하였다.

LNL6/RRz2 "낮은 카피(Low copies)" : DNA 준비시 상대적으로 낮은 수준의 LNL6와 RRz의 정량화를 위하여 사용되는 방법.

그러한 DNA는 말초혈 세포(림프구, 대식세포, 과립구)에서 유래하였다. 이러한 프로토콜에 있어서의 PCR 반응은, 대략 휴먼 게놈의 10⁶copies 에서 50 μl의 샘플로 진행되었다. 프라이머 5L1A와 3L1D(one labeled), 완충액과 폴리머라아제를 포함하는 30 μl를 DNA 샘플 20 μl와 혼합한 후, 94℃ 단계에서 90초 동안 처리한 것을 제외하고는 상기의 "높은 카피(High copies)"와 동일하게 처리하였다. 표준 샘플은 휴먼 게놈의 10⁶copies 의 존재하에서 하였다.

증폭된 샘플은 전기 영동법에 의한 5% 또는 6% 폴리아크릴아미드 겔 위에서 Tris-Borate-EDTA 완충액(10×TBE, 0.89M Tris borate pH 8.3 + 20mM EDTA)를 사용하였으며, AMBIS 4000 radioimager을 사용하여 밴드의 방사능을 정량화하였다.

부가적 표준으로서, DNA 준비에 있어서 베타 글로빈 DNA를 정량화 하였으며, 이 때, 인간 게놈의 복제 수는 10000 이었다. 그러한 DNA 는 CD34⁺세포, 조혈 군체와 환자의 PBMCs, T-세포, 골수에서 유래하였다. 증폭은 올리고뉴클레오타이드 프라이머 LX1과 LA2로, 94℃ 에서 1분 동안 25 사이클, 65℃ 에서 2분 동안 실시하였다.

대략 0.01%의 세포가 포함하는 또는 구성하고 있는 위치를 표시하는 LNL6:RRz2의 비를 계산하기 위하여 네스티드 방사선 PCR 방법을 사용하였다. 두개의 PCR 라운드는 감도를 증가시키고, 방사선 표지의 결합은 Imagequant 소프트웨어를 사용하는 정량을 가능하게 하였다. 교차오염을 피하기 위하여 조심스럽고 세심하게 진행되었으며, 적절한 조절이 실시되었다. PCR의 첫번째 라운드는, 1 μl의 주형 DNA, 프라이머 5Nes1과 3L2A, 2mM MgC12 를 갖는 완충액 II(Perkin Elmer Cat#N808-0010), dNTP 와 Taq DNA 폴리머라아제(Perkin Elmer Cat #N801-0060)을 taqbead(Perkin Elmer Cat #N808-0100)를 가진 50μl 부피로 사용하였다. 증폭은, Thermofast 96 PCR 플레이트(Advanced Biotechnologies, Cat #AB0600)에서 94℃ 1 사이클, 30초/68℃에서 17 사이클, 30초/94℃, 4℃로 냉각시켜, 각 샘플의 10개의 복제물에 대해 실시하였다. 10개의 복제물로부터의 생성물을 모아 5μl의 모인 샘플을 각각의 두번째 라운드 증폭 반응에 사용하였다. 사용된 두번째 라운드 PCR에서는, 35사이클의 증폭을 실시한 것을 제외하고는 첫번째 라운드와 동일한 조건하에서 프라이머 5L1A 와 프라이머 3L2A를 라벨링하였다. 생성물은 폴리아크릴아미드 겔 위에서 분석되었다. 216 bp생성물은 RRz2에, 174 bp 생성물은 LNL6 에 해당하였다.

3. 11 RCR-PCR

RCR-PCR 법은,env유전자의 매우 잘 보존된 영역을 증폭시킴으로써 항체반응을 일으키는 RNA 종양바이러스 복제를 감지할 수 있게 한다. 증폭된 서열은, 암포트로핀 수용체를 통한 세포의 감염에 있어 요구되어지는 E단백(envelope protein)의 host-determining 영역의 부분을 코딩한다. 증폭된 영역은 289bp 이며, 백만 음성세포(10^-6)에 대하여 1개의 양성 세포 정도의 감도를 갖는다.

PCR 반응은, 7 μl의 DNA 샘플과, 프라이머 5RCR6 = 5'-CTA TGT GAT CTG GTC GGA GA-3'과 3RCR6 = 5'-CCA CAG GCA ACT TTA GAG CA-3', 버퍼 II(Perkin ElmerCat #N808-0010)과 Mg²⁺(Perkin Elmer Cat #N808-0010), 0.25 mM 의 dNTPs(Gibco BRL 10297-018)와 Taq 폴리머라아제 (Taqbead ^TMDNA Polymerase, Promega, Cat #M5661)을 사용하였다. 증폭은, 94℃ 에서 3분, 30초/94℃에서 45 사이클, 30초/63℃, 30초/72℃로 실시하였다. 증폭된 샘플은 2.5% NuSieve 겔에서 분석되었다. 289bp 밴드의 존재는 RCR의 존재를 나타내었다.

어떠한 시약에 대해서도 오염이 없음을 증명하기 위하여, 각 PCR 실험에 있어서 DNA 샘플 대신 물을 포함하는 "DNA 없음(no DNA)" 조절을 실시하였다. 음성적 조절(CEMT4 DNA)는 생성된 엠플리콘의 특이성을 확인하기 위해 실시되었으며, 양성적 조절(10^-5PA317)은 각각의 PCR에 있어서 PCR 의 감도가 100,000 음성적 세포에 대해 적어도 1개의 양성을 나타냄을 증명하기 위하여 실시되었다. 복제 PCR 튜브의 모든 실험 샘플에 대한 각 실험에 있어서, 또한, "PA317 스파이크가 있는(spiked)"샘플, 즉 20ng/ml 에서의 10^-3PA317 '스파이크(spiking)' DNA 10μl의 첨가가 포함되어 있었다.이러한 양성의 10^-3PA317 DNA의 첨가는, 음성적 PCR 결과가 증폭될 수 없는 DNA에 기인하는 잘못된 음성적 결과가 아니라, RCR 에 대해 실제로 음성적임을 증명하는 것이다. 교차 오염을 피하기 위하여 모든 조작은 조심스럽고 세심하게 진행되었으며, 예를 들면, 벤치와 피펫은 0.1M 소디움 히드록사이드로 세척하고, 글로브를 자주 교환하였으며, 에어로졸 베리어 팁을 사용하였다.

3.12 CFC 분석 에서의 군체 분리

CFC 분석을 환자의 골수세포, 분리 반출법에 의한 CD34⁺세포와 최종 형질도입된 생성물에 대하여 실시하였다. 군체를 상기한 바와 같이 LNL6와 RRz2 유전자에 대하여 PCR 로 분석하였다. 메토셀룰로우즈 배양액에서 14일간 성장한 군체로부터의 세포를 분리하고 다음과 같이 용해(lyse)하였다. 현미경 하에서, P200 에어로졸-레지스턴트 팁으로 흡입하여, 마이크로퓨지 튜브로 흘려 넣었다. 모든 메타셀룰로오즈를 제거하기 위하여 PBS 로 팁을 세척하였다. 쉬어링 셀(shearing cell)이 없이 메타셀룰로오즈를 용해시키기 위하여 15초 동안 중간 속도로 샘플을 vortex 하였다. 상기한 바와 같이 용해 후에 세포로부터 DNA를 분리하였다.

3.13 RNA 추출과 RT-PCR 분석

다음과 같은 제조사의 지시에 따라, QIAmp RNA Blood Mini Kit(Qiagen Cat NO 52304)를 사용하여 환자의 샘플로부터 RNA 를 추출하였다. RNA 는 1-5×10⁶cell로 부터 추출하였으며, RNase-없는 물 50μl 에 재현탁하였다. cDNA 합성은, RQ-1 DNasw(Promega, Cat No. M6101)를 사용하여 준비된 RNA 를 DNase 처리한 후에, 반응당 대략 700-1000ng 의 RNA, 프라이머 3L2A, 효소 Superscript RNase H minus RT(Gibco Cat No. 18053-017)을 사용하여 45분 동안 37℃ 에서 실시하였다. 각 RNA 샘플에 대하여 7개의 복제를 실시하였으며, 상기의 네스티드 PCR 방법에서 주형으로 사용하기 전에 생성물을 수집하였다.

실시예 4

HP 세포는 하기와 같이 채취되고, 형질 도입되고, 재주입된다. 이러한 방법은 하기의 단계를 포함한다 :

인체의 골수로부터 말초혈로의HP 세포 동원;

동원된 HP 세포를 얻기 위한 각 개인의 말초혈의혈장 교환;

세척 단계 #1; 부피 축소를 위한 준비로써 세포 세척기를 사용하여 미정제된 말초혈 단핵 세포를 세척;

부피 축소 단계; 과잉의 적혈구 세포, 과립구, 혈소판 및 T-림프구를 제거하기 위함;

세척 단계 #2; 세포 세척기를 사용하여 풍부하게 된 HP 세포를 세척;

HP 세포 개체군으로부터CD34 ⁺ 세포 선택또는 항원 양성 세포 고갈;

세척 단계 #3; 세포 세척기를 사용하여 정제된 HP 세포의 세척;

상기 정제된 HP 세포를 사이토킨/성장 인자를 가지는 배양 배지에 위치시킴으로써세포 배양;

형질 도입-촉진 제제의 존재 하에, 유전자 구성체를 함유하는 RNA 종양 바이러스성 벡터를 사용함으로써, 바람직하게는 도입된 바이러스성 벡터를 세포 세척기를 사용하여 도입함으로써, HP 세포의형질 도입 과정 진행;

세포 산물의 채취및 세포 세척기로, 형질 도입된 HP 세포를 포함하는 HP 세포의 세척;

주입 산물의 준비,HP 세포를 주입 백에 위치시키고, 산물의 안전성 방출 트스트를 수행; 그리고

환자에 주입,상기 세포를 동일한 개체 내로 이송.

하기에 이러한 단계들에 대한 더욱 상세한 실시예 및 다른 변형예에 대해 기술하기로 한다 :

1 단계 - HP 세포 동원

상기 과정의 첫 번째 단계에서는 골수로부터 말초혈로, HP 세포를 동원하기 위한 제제를 사용한다. 이러한 단계의 일례에서는, 환자에 대해, 5 일 동안 연속하여 하루에 한번, 적어도 10μg/kg/day로, 바람직하게는 30μg/kg/day로 피하 투여되는 호중구 집락 자극 인자(G-CSF, 뉴포젠^TM)를 사용한다. 컴플리트 블러드 카운트(CBCs), 특이형 및 혈소판 산출이, 백혈구 증가의 정도를 평가하기 위하여 G-CSF 투여의 기간 동안 매일 실행된다. 혈장 교환의 개시 전에, 말초혈 CD34⁺산출량이 20세포/mm³보다 크게 되도록 보증하기 위하여, G-CSF의 투여 3일 경과 시에 CD34⁺산출을 위한 혈액 샘플을 취하였다. 그러나, 이러한 CD34⁺세포수에 도달하지 못하면, G-CSF 투여 후 4, 5 및 6일 경과시에 혈장 교환을 행한다.

2 단계 - 혈장 교환

혈장 교환은 말초혈의 단핵 세포 부분을 얻기 위한 "혈액 여과"의 방법이다.상기 혈장 교환은, 적어도 분리된 2 회에 걸쳐(바람직하게는, 1 일이 유도된 동원을 행하는 첫 날인 경우, 이러한 동원 후 4, 5 또는 6일에 진행.), 코브 스펙트라(Gambra), 헤모네틱스(Domediac) 또는 아미커스(Baxter) 장치로 진행된다. 다만, 다른 예에서는 말초혈 CD34⁺산출량이 5세포/mm³보다 크게 되는 날, 또는 더욱 바람직하게는 10세포/mm³보다 크게 되는 날, 그리고 가장 바람직하게는 20세포/mm³보다 크게 되는 날을 결정함으로써, 이보다 빠르거나 늦은날에, 혈장 교환이 진행될 수 있다. 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 혈장 교환에서는, 통과하는 혈류의 약 5리터(L)에서 세포 산물을 산출할 수 있으나, 바람직하게는 5-10L에서 산출하며, 더욱 바람직하게는 10-20L에서 산출하고, 좀 더 바람직하게는 20L이상에서 산출한다. 각 혈장 교환의 산물은 각각 처리되거나, 바람직한 실시예에서는, 두 번째 혈장 교환 후에 모이도록 한다. 총 세포 산출량, 그리고 CD34⁺세포의 총 수가 기록된다. 상기 1 및 2 단계의 진행은 5×10⁶이상의 HP 세포/kg, 바람직하게는 2×10⁷이상의 HP 세포/kg, 더욱 바람직하게는 4×10⁷이상의 HP 세포/kg(CD34에 의해 양성적으로 측정)까지를 생산할 것이다.

3 단계 - 세척 단계 #1(바람직하게는 혈장 교환일에 진행)

모여진 세포는 세척된다. 이는 세포 원심 분리에 의해 진행되고, 더욱 바람직하게는 자동화된 세포 세척기를 사용하여 진행되며, 일례에서 이러한 세포 세척은 넥셀 사이토메이트 세척기(Nexell CytoMate washer)로 진행된다.

4 단계 - 부피 축소 단계

일 실시예에 있어서, 혈장 교환으로부터 얻어진 상기 세포는, 차터 메디칼 DACS-SC^TM시스템(Charter Medical DACS-SC^TMsystem)과 같은 장치로 "부피 축소"된다. 두 번째 날의 산물과 함께 모으기 위해, 첫 번째 날의 산물을 밤새 보관하는 일 실시예에 있어서, 두 번에 걸친 혈장 교환의 산물은 채집된 날에 바로 부피 축소되고, 첫 번째 산물은 두 번째 산물이 부피 축소될 때까지 저장된다.

5 단계 - 세척 단계 #2(바람직하게는 6 일에 진행)

상기 세포를 취하여 모으고 나서(두 번에 걸친 산물이 있는 경우의 실시예에서), 원심 분리하거나, 넥셀 사이토메이트 장치 또는 이와 유사한 장치를 사용함으로써, 상기 세포가 세척된다. (두 번 이상에 걸친 산물이 있는 경우, 최후 시점에서 모두 모은다.)

6 단계-CD34 ⁺ 세포 선택(바람직하게는 6 일에 진행)

CD34⁺세포는, 아이솔렉스 300i(Isolex 300i), 밀테니(Miltenyi)를 사용하거나, 세포 발현 표지(예를 들어, CD2, CD3, CD14, CD16, CD19, CD24, CD56, CD66b 글리코프로틴 A, 스탬셉)의 계통 고갈 방법을 사용함으로써, 세척 후의 산물로부터 선택된다. CD34⁺가 풍부화된 풀 또는 계통 고갈된 세포는, 바람직하게는 약 40%, 더욱 바람직하게는 약 60%, 가장 바람직하게는 80%의 세포가 이러한 종류이다.

7 단계 - 세척 단계 #3(바람직하게는 6 일에 진행)

상기 세포는 원심 분리 또는 넥셀 사이토메이트 장치 또는 이와 유사한 장치를 사용함으로써 세척된다.

8 단계 - 세포 배양(바람직하게는 6-9일에 진행)

상기 세포는 산출되어, 바람직하게는 1×10⁵내지 5×10⁶세포/ml로, 세포 배양 플라스크, 세포 배양 백에 위치되거나, 바람직한 실시예에 있어서는, 1000ml(390cm²) 넥셀 라이프셀 X-폴드 배양 백(Nexell Lifecell X-Fold Culture Bag), 또는 사이토킨/성장 인자를 함유하는 이소코브 모디파이드 둘베코 매질(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 플러스 10% 페탈 보빈 세럼(FBS)을 가지는 동일물에 위치된다. 바람직한 일 실시예에 있어서, 상기 사이토킨/성장 인자 혼합물은 줄기 세포 인자(50ng/ml) 및 거핵구 성장 및 발생 인자(100ng/ml)으로 구성된다. 3-9 단계는 kg 당 12×10⁷또는 그 이상까지의 HP 세포(CD34에 의해 양성적으로 평가)를 발생시킬 것이다.

9 단계 - 형질 도입 과정(바람직하게는 8 일에 진행)

상기 세포는, 라이프셀 배양 백 또는 이의 균등물의 바람직한 일실시예를 포함하는, 첫 번째 플라스크, 조직 배양 백으로부터 채취되고, 사이토메이트 장치 또는 이의 균등물을 사용하여, RNA 종양 바이러스성 상청액(예를 들어, 이는 200ml 분취물이다.)에 재부유되며, 두 번째 조직 배양 컨테이너로 옮겨지는데, 상기 컨테이너의 한 종류가 RNA 종양 바이러스성 형질 도입 촉진제를 가지는 라이프셀 X-폴드 배양 백이다. 이러한 제제에는 폴리브렌, 프로타민 설페이트, 양이온성 리피드가 포함되며, 또는 바람직한 일실시예에 있어서는, 조직 배양 컨테이너 내에 1-4mcg/cm²의 레트로넥틴이 미리 코팅된다. 4-10 시간 이후 또는 24 시간까지, 상기 사이토메이트 또는 균등물이 사용되어 상기 이송 과정이 반복될 것이다; 이러한 두 번째 형질 도입을 위하여, 세포는 새로운 조직 배양 컨테이너(폴리브렌, 프로타민 설페이트)로 이송되거나, 세포들이 처음 있던 곳과 동일 또는 유사한 레트로넥틴-코팅 컨테이너로 돌아간다. 바람직한 일 실시예에 있어서, 이는 RNA 종양 바이러스성 상청액의 신선한 분취물 내에서 행해지며, 밤새 배양된다. 다른 실시예에 있어서, 이는 행하여지지 않거나, 같은 기간 동안 반복된다. RNA 종양 바이러스성 상청액의 분취물은 멸균 테스트(sterility test)를 위해 모집된다. 이는 kg 당 6×10⁷또는 그 이상까지의 유전자 함유 HP 세포(CD34에 의해 양성적으로 평가)를 발생시킨다. 이러한 숫자는 정량적 분석에 의해 결정된다. 형질 도입 효율은 적어도 20%, 바람직하게는 30-50%, 더욱 바람직하게는 50%보다 크게 될 것이다.

10 단계 - 세포 산물의 채취

9 일의 아침에, 세포가 채취되고, 표준 세포 원심 분리 또는 세포 배양의 사이토메이트 샘플과 같은 자동화된 시스템을 사용하여 세척된다. 이는 kg 당 5.7×10⁷또는 그 이상까지의 유전자 함유 HP 세포(CD34에 의해 양성적으로 평가)를 산출한다.

11 단계 - 주입 산물

세포는, 5% 인간 세럼 알부민 또는 담체와 같은 그의 균등물을 함유하는 생리학적 주입 완충액 내에 재부유된다. 분취물 샘플은 멸균 제거된다(호기성 세균, 혐기성 세균, 균, 미코플라즈마). 주입 산물은 내독성(LAL) 및 그램 착색 테스트(Gram Stain Testing)의 결과가 도출될 때까지는 방출되지 않는다.

12 단계 - 환자에 주입

CD34⁺세포 제제는 적절하게 미리 조정된 환자에게 투여된다. 바람직한 일 실시예에 있어서, 5% 인간 세럼 알부민 또는 담체와 같은 그의 균등물을 함유하는 생리학적 주입 완충액 내의 형질 도입된 CD34⁺세포를, 체중 킬로그람 당 0.5-6×10⁷(세포/kg)으로 환자에게 단일 주입한다. 환자 당 형질 도입된 CD34⁺세포의 복용량은, 동원, 혈장 교환, 분리, 배양 및 형질 도입 과정의 각 단계에 대한 효율에 의존한다. CD34⁺세포의 총 수(형질 도입된거나 형질 도입 되지 않은 것 모두 포함)는, 세포 산출 및 유세포 분석에 의해 결정될 수 있다. 도입된 유전자-함유 HP 세포는, 골수 내에 소정 비율의 유전자-함유 HP 세포가 있는 가상의 조혈계를 발생시킨다. HIV/AIDS를 치료하기 위한 바람직한 일 실시예에 있어서, 유전자-함유 HP 세포의 비율은 적어도 5%, 바람직하게는 10%보다 크게 되며, 가장 바람직하게는 20% 보다 크게 된다.

실시예 5 . HIV-1 복제를 억제하기 위한 다중-표적 능력을 가진 RNAi의 사용

HIV-1에 대해 다중 표적 능력을 가진 RNAi 구성체는, 하기와 같이 디자인된다. 1B, 2B 및 3B가 그 서열에 있어서 1A, 2A 및 3A과 상보적으로 되도록 형성된, 센스 방향(1A, 2A, 3A) 및 안티센스 방향(1B, 2B, 3B)으로(도 14 참조), HIV-1에 대응하는 19-25 뉴클레오티드 단편을 각각 가지는 3 개의 RNAi 유닛을 포함하게, 카셋이 형성된다. 상기 서열 1A, 2A 및 3A는 대부분의 HIV-1 계통에서 현저히 보존되는 것, 예를 들어, 변종 HXB2 또는 다른 변종의 대응하는 지역 내의, 5831-5849 위치의 서열(atggagccagtagatccta), 5852-5870 위치의 서열(ctagagccctggaagcatc) 및 5971-5989 위치의 서열(tggcaggaagaagcggaga)로 선택되어야 한다. 상기 서열은 하기의 웹 사이트에 위치하는 서비스를 사용하여 계산되었다 :http://hiv-web.lanl.gov/cotent/hiv-db/NUM-HXB2/HXB2.Nuc.html.상기 서열 1A, 2A 및 3A는 바람직하게는, 대부분의 HIV-1 계통 내에서 대응되는 서열과 비교하여, 많아야 1 뉴클레오티드가 다르다. 상술한 19 뉴클레오티드 서열의 각각은, 많은 HIV 아종에 걸쳐 tat 유전자 내에서 상당히 보존적이며, 아종 B 내에 매우 잘 보존된다. 이러한 19 뉴클레오티드 서열의 각각은, 아종 B 내에서 컨센서스 서열과의 차이가 많아야 1 염기쌍에 불과하다. 첫 번째 서열은 Rz2에 대한 표적을 포함한다. 상기 서열들의 말단에 근접한 차이는 좀 더 허용될 수 있다. RNAi 유닛은, 3-7 뉴클레오티드 길이의 스페이서에 의해 분리된다. 예를 들어, RNAi 유닛의 세포질 정착을 돕기 위한 인트론 서열이 포함된 경우, 스페이서는 좀 더 길 수 있다. 상기 카셋은 자기 절단 리보자임 서열이 측면에 위치하여, 다중 RNAi 분자의 방출을 허용한다. 예를 들어, 촉매부가 미국 특허 제 6,127,114 호에 따라 디자인된 해머헤드 리보자임에의해 5' 말단이 처리될 수 있으며, 미국 특허 제 5,856,188 호에 따라 디자인된 자기촉매적 헤어핀 리보자임에 의해 5' 말단이 처리될 수 있다. 이러한 배치는 잉여의 염기 없이(물론, 잉여의 염기가 허용되는 것이기는 하나), 염기쌍으로 끝나는 말단(블런트 말단)을 가능하게 한다. 자기촉매적 절단은 화살표 표시된 부분(도 14)에서 일어나서, 3 RNAi 함유 분자를 방출한다. 1/2 및 2/3 스페이서는 절단 가능한 서열, 예를 들어, 해머헤드 또는 헤어핀 리보자임이나 부가적인 리보자임 유닛에 의해 절단될 수 있는 서열을 포함하여, RNAi 유닛을 분리시킬 수 있다. 명백하게, 단일 RNAi 유닛은 사용될 수 있으며, 또는 6 또는 그 이상의 유닛이 결합된 다중체 역시 사용될 수 있다.

상기 카셋은 서냉 복원된 올리고뉴클레오티드를 중복시키는 것으로부터 DNA 분자로써 조립되고, T7 프로모터의 조절 하에 플라스미드 벡터 내로 삽입된다. 전도된 반복 서열을 가지는 플라스미드의 안정적인 복제를 허용하는, 종래에 주지된 재조합-결핍 E. coli 변종은, 클로닝 숙주로써 사용된다. 좀 더 긴 스페이서(예를 들어, 인트론) 역시 이러한 면에서 보조한다. DNA 삽입의 뉴클레오티드 서열은 DNA 시퀀싱(sequencing)에 의해 확인된다. T7 RNA 폴리머라아제는 방사선 표지된 UTP의 존재 하에, 시험관 내에서(in vitro)DNA를 전사하기 위해 사용되며, 리보자임 유닛의 자기-절단 능력은 폴리아크릴아마이드 겔 하에서의 전사 산물에 대한 전기 영동 및 자기 방사선 표지법(autoradiography)에 의해 분석된다. 자기 절단은 37℃에서 1 시간의 전사 동안 90% 보다 큰 효율로 일어난다. 리보자임 영역의 가지와 고리에 대한 길이 및/또는 서열은, 절단이 바람직한 것보다 덜 효과적인 경우에, 조절될 수 있다.

상기 카셋은, RNA 폴리머라아제 II-의존성 프로모터의 조절 하에 pLNL6와 같은 RNA 종양 바이러스성 벡터의 플라스미드 형태 내로 삽입된다. 선택적으로, RNA 폴리머라아제 III-의존성 프로모터가 사용될 수 있다. 카셋은 적절한 방향으로 벡터 내의 제한부(restriction site)에 삽입된다. 결과적으로 생긴 플라스미드는, AM-12 계통과 같은 패키지 세포 계통 내로 도입되고, 안정적으로 트랙스펙션된 세포가 RNA 바이러스성 벡터를 제조하기 위해 사용된다. CemT4 세포 계통 또는 PBLs는 RNA 종양 바이러스성 벡터로 형질 도입되고, RNAi 구성체의 발현은, 주지된 바와 같이, RNAse 보호 분석 또는 역전사-PCR에 의해 결정된다. 형질 도입된 세포의 현저한 보호는 몇 가지의 HIV-1 변종 중 임의의 종에 의한 감염 후에 관찰된다. 대조군(RNAi 카셋 없는 벡터)과 비교하여, 감소된 HIV-1 복제를 나타내면서, 90% 이상의 p24 생성의 감소가 관찰된다.

CD34⁺세포는, 환자로부터 얻어지고, 본 발명의 상술한 방법에 따라 레트로넥틴의 존재 하에 RNA 종양 바이러스성 벡터로 형질 전환된다. (환자의 체중) kg 당 1.63×10⁶이상의 CD34⁺세포를 가지는 총 세포 개체군 중에 있는, kg 당 적어도 0.5×10⁶의 형질 도입된 CD34⁺세포가 주입에 의해 환자에 투여된다. 바람직하게는, kg 당 5×10⁶이상의 형질 도입된 CD34⁺세포가 투여된다. 이러한 세포는 환자의 골수에 생착하고, 주입 후 3년 이상 동안 보호된 T-림프구 및 대식세포/백혈구를 생성시킨다. 이러한 세포는 상대적으로 HIV-1 감염에 대해 보호되며, 향상된 면역 기능에 공헌한다.

결론의 토의

상술한 바와 같은 임상적 시도에 있어서, 항-HIV 제제를 발현하기 위한 유전자를 생체 외에서 CD34⁺세포로 도입하고, 이러한 세포를 자기 이식 환자에게 주입하는 것은, 기술적으로 실행 가능하며 안전한 것으로 밝혀졌다. 말초혈 림프구 및 골수 세포 내에서의 리보자임 구성체의 존재 및 발현은, 적어도 3년 동안 발견되었다. 본 연구에서 치료된 10 환자에서 세포 표지의 정도는 다양하였으며, 이는 하기의 결론을 허용한다. 세포 표지의 정도에 관련된 매개 변수는-CD34⁺세포 형질 도입의 비율, 주입된 형질 도입 CD34⁺세포의 숫자, 그리고 주입된 CD34⁺세포의 총 수인 것으로 밝혀졌다. 형질 도입된 세포의 실제적인 숫자는 중요한 것으로 밝혀졌다. 비-형질 도입된 세포는, 말초혈 및 간과 같은 기관(이들이 골수 구획에 정착하기 때문) 내에서 형질 도입된 세포의 생존을 증가시키는데 역할을 할 수 있었다. 형질 도입된 CD34⁺조혈 세포의 연장된 생착을 위해서는, 골수 절제가 미리 행해지지 않은 조건 하에서, 적어도 1.63×10⁶이상의 총 CD34⁺세포 개체군 중에 있는 0.52×10⁶의 형질 도입된 세포의 최소 복용량이 요구되었다. 상대적으로 낮은 선택수준 하에서도, 대조군 림프구에 대한 리보자임-함유 림프구의 우수한 생존이 있었다. 우수한 생존의 정도는, 기대 밖으로 CD34⁺세포의 복용량에 의존적이었다. 즉, 주입된 형질 도입 세포의 수와 긍정적으로 상호 관련되었다. 더 높은 선택 수준에서는, 리보자임-보호된 림프구의 훨씬 더 우수한 생존이 합리적으로 기대되며, 더 높은 세포 복용량에서는 더 높은 치료적 효과가 합리적으로 기대될 수 있다.

이는, AIDS/HIV 감염 및 다른 여러 질병에 대한, 조혈 세포의 효과적인 유전자 치료를 위한 기초를 제공한다. 이는 임상적인 환경에서, 과정의 질에 대한 효과적인 보증 및 평가를 위한 중요한 지식을 제공한다.

참고 문헌

Claims (42)

1. 약학적으로 허용 가능한 담체와 투여 대상 인체의 체중 kg 당 적어도 1.63×10⁶의 CD34⁺조혈 세포를 포함하며, 적어도 0.52×10⁶의 상기 CD34⁺조혈 세포가 항-HIV 제제를 발현하는 바이러스성 구성체에 의해 형질 도입되는 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 인체의 체중 kg 당 적어도 9.37×10⁶의 CD34⁺조혈 세포를 포함하고, 적어도 5×10⁶의 상기 CD34⁺조혈 세포가 형질 도입되는 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 항-HIV 제제가 RNA인 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 항-HIV 제제가 RNAi 분자인 조성물.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 항-HIV 제제가 안티센스 분자인 조성물.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 항-HIV 제제가 리보자임인 조성물.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 항-HIV 제제는 5' - UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC - 3'의 서열을 가지는 뉴클레오티드를 포함하는 리보자임인 조성물.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 바이러스성 유도체는 RNA 종양 바이러스성 유도체인 조성물.
9. 제 1 항에 있어서, 실질적으로 사이토킨이 없는 조성물.
10. 제 1 항에 있어서, 실질적으로 바이러스가 없는 조성물.
11. 제 1 항에 있어서, 상기 형질 도입된 CD34⁺세포는 생착이 가능하며, 인체 내에서 적어도 12 개월 동안 아들 세포을 발생시킬 수 있는 조성물.
12. 약학적으로 허용 가능한 담체와 투여 대상 개체의 체중 kg 당 적어도 1.63×10⁶의 CD34⁺조혈 세포를 포함하며, 적어도 0.52×10⁶의 상기 CD34⁺조혈 세포가 항-HIV 제제를 발현하는 바이러스성 구성체에 의해 형질 도입되는 조성물로써,

    a) CD34⁺조혈 세포를 개체로부터 분리하는 단계;

    b) CD34⁺조혈 세포를 적어도 하나의 사이토킨으로 배양하는 단계;

    c) 상기 CD34⁺조혈 세포와 바이러스성 구성체를 함께 모이도록 유도하는 제제의 존재 하에, 항-HIV 제제를 발현하는 바이러스성 구성체를 가지고 CD34⁺조혈 세포에 형질 도입하는 단계;

    d) 상기 CD34⁺조혈 세포를 세척하는 단계; 및

    e) 상기 CD34⁺조혈 세포를 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여, 조성물을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 조성물.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 배양 단계 (b)는 적어도 두 종류의 사이토킨의 존재 하에 수행되는 조성물.
14. 제 12 항에 있어서, 상기 배양 단계 (b)는 두 종류의 사이토킨의 존재 하에 수행되는 조성물.
15. 제 12 항에 있어서, (c) 단계에서 세포의 형질 도입은 재조합 피브로넥틴 단편의 존재 하에 수행되는 조성물.
16. 약학적으로 허용 가능한 담체와 투여 대상 인체의 체중 kg 당 적어도 1.63×10⁶의 CD34⁺조혈 세포를 포함하며, 적어도 0.52×10⁶의 상기 CD34⁺조혈 세포가, 형질 전환 전의 CD34⁺세포에서는 발견되지 않던 소정의 유전자에 의해 형질 전환되는 조성물.
17. 제 16 항에 있어서, 인체의 체중 kg 당 적어도 9×10⁶의 CD34⁺조혈 세포를 포함하고, 적어도 5×10⁶의 상기 CD34⁺조혈 세포가 형질 도입되는 조성물.
18. 제 16 항에 있어서, 상기 소정의 유전자는 RNA 제제를 발현하는 조성물.
19. 제 16 항에 있어서, 상기 인체는 성인인 조성물.
20. 약학적으로 허용 가능한 담체와 투여 대상 인체의 체중 kg 당 적어도 1.63×10⁶의 CD34⁺조혈 세포를 포함하며, 적어도 0.52×10⁶의 상기 CD34⁺조혈 세포가, 형질 전환 전의 CD34⁺세포에서는 발견되지 않던 소정의 유전자에 의해 형질 전환되는 조성물로써,

    a) CD34⁺조혈 세포를 상기 인체로부터 분리하는 단계;

    b) CD34⁺조혈 세포를 적어도 하나의 사이토킨으로 배양하는 단계;

    c) 상기 CD34⁺조혈 세포와, 소정의 유전자를 코딩하는 벡터를 함께 모이도록 유도하는 제제의 존재 하에, 상기 벡터를 가지고 CD34⁺조혈 세포를 형질 전환하는 단계;

    d) 상기 CD34⁺조혈 세포를 세척하는 단계; 및

    e) 상기 CD34⁺조혈 세포를 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여, 조성물을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 조성물.
21. 하기의 단계를 포함하는, 소정의 유전자를 인체의 조혈 세포에 삽입하는 방법 :

    a) CD34⁺조혈모세포를 인체의 혈액 내로 동원하는 단계;

    b) 혈장 교환에 의해 인체의 혈액으로부터 백혈구를 분리하는 단계;

    c) 면역 선택적인 방법에 의해, 상기 분리된 백혈구로부터 CD34⁺조혈 세포를 분리하는 단계;

    d) 형질 도입 벡터와 함께 CD34⁺조혈 세포를 모이도록 하는 제제의 존재 하에, 소정의 유전자를 가지고 상기 c) 단계의 CD34⁺조혈 세포에 대해 형질 도입 과정을 진행하는 단계;

    e) 상기 d) 단계 후에 CD34⁺조혈 세포의 총 수를 결정하고, 상기 총 수가인체의 체중 kg 당 적어도 1.63×10⁶이면, 하기의 f) 단계를 진행하며, d) 단계 후의 CD34⁺조혈 세포의 총 수가 인체의 체중 kg 당 1.63×10⁶보다 작으면, 적어도 b)-d) 단계를 진행한 후 CD34⁺조혈 세포를 합하는 단계; 및

    f) 인체에 상기 CD34⁺조혈 세포를 이송함으로써, 인체의 조혈 세포에 소정의 유전자를 삽입하는 단계.
22. 제 21 항에 있어서, 형질 도입 벡터와 함께 상기 세포를 모이도록 하는 상기 제제는 피브로넥틴 단편인 방법.
23. 제 21 항에 있어서, 상기 f) 단계는 골수 절제없이 수행되는 방법.
24. 제 21 항에 있어서, 인체 내에서 조혈모세포를 동원하는 단계는, 조혈모세포를 동원하기에 충분한 다량의 사이토킨을 인체에 투여함으로써 수행되는 방법.
25. 제 21 항에 있어서, 인체의 혈액으로부터 백혈구를 분리하는 단계에서, 혈장 교환은 적어도 두번 수행되는 방법.
26. 제 21 항에 있어서, 소정의 유전자를 가지고 CD34⁺조혈 세포에 대해 형질 도입 과정을 진행하는 단계는, 재조합 피브로넥틴 단편의 존재 하에 수행되는 방법.
27. 제 21 항에 있어서, 적어도 두 종류의 사이토킨의 존재 하에 상기 c) 단계의 분리된 CD34⁺조혈 세포를 배양하는 단계를 부가적으로 포함하는 방법.
28. 제 21 항에 있어서, 상기 인체는 성인 인체인 방법.
29. 제 21 항에 있어서, 상기 소정의 유전자는 항-HIV 제제를 코딩하는 방법.
30. 제 29 항에 있어서, 상기 항-HIV 제제는 RNA인 방법.
31. 제 29 항에 있어서, 상기 항-HIV 제제는 안티센스 분자인 방법.
32. 제 29 항에 있어서, 상기 항-HIV 제제는 리보자임인 방법.
33. 제 32 항에 있어서, 상기 항-HIV 제제는 5' - UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC - 3'의 서열을 가지는 뉴클레오티드를 포함하는 리보자임인 방법.
34. 제 21 항에 있어서, e) 단계에서는, d) 단계 후의 CD34⁺조혈 세포의 총 수가 인체의 체중 kg 당 1.63×10⁶보다 작으면, 상기 d) 단계에서의 CD34⁺조혈 세포를 극저온으로 저장하는 단계를 부가적으로 포함하고, a)-d) 단계를 반복하며, 그리고 나서, 극저온으로 저장된 세포를 d) 단계 후의 세포와 합하는 방법.
35. 하기의 단계를 포함하는, 소정의 유전자를 인체의 조혈 세포에 삽입하는 방법을 제공한다 :

    a) CD34⁺조혈모세포를 인체의 혈액 내로 동원하는 단계;

    b) 혈장 교환에 의해 인체의 혈액으로부터 백혈구를 분리하는 단계;

    c) 면역 선택적인 방법에 의해, 상기 분리된 백혈구로부터 CD34⁺조혈 세포를 분리하는 단계;

    d) 상기 c) 단계 후에 CD34⁺조혈 세포의 총 수를 결정하고, 상기 총 수가 인체의 체중 kg 당 적어도 1.63×10⁶이면, 하기의 e) 단계를 진행하며, c) 단계 후의 CD34⁺조혈 세포의 총 수가 인체의 체중 kg 당 1.63×10⁶보다 작으면, 적어도 b)-c) 단계를 진행한 후 CD34⁺조혈 세포를 합하는 단계;

    e) 형질 도입 벡터와 함께 CD34⁺조혈 세포를 모이도록 하는 제제의 존재 하에, 소정의 유전자를 가지고 상기 c) 단계의 CD34⁺조혈 세포에 대해 형질 도입 과정을 진행하는 단계; 및

    f) 인체에 상기 CD34⁺조혈 세포를 이송함으로써, 인체의 조혈 세포에 소정의 유전자를 삽입하는 단계.
36. 제 35 항에 있어서, 형질 도입 벡터와 함께 상기 세포를 모이도록 하는 상기 제제는 피브로넥틴 단편인 방법.
37. 하기의 단계를 포함하는, 인체의 조혈 세포에 5' - UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC - 3'의 서열의 뉴클레오티드를 포함하는 리보자임을 발현하는 유전자를 삽입하는 방법 :

    a) CD34⁺조혈모세포를 동원하기에 충분한 다량의 사이토킨을 인체에 투여함으로써, 상기 조혈모세포를 인체의 혈액 내로 동원하는 단계;

    b) 적어도 두 번에 걸쳐 수행되는 혈장 교환에 의해 인체의 혈액으로부터 백혈구를 분리하는 단계;

    c) 면역 선택적인 방법에 의해, 상기 분리된 백혈구로부터 CD34⁺조혈 세포를 분리하는 단계;

    d) 사이토킨의 존재 하에서, 상기 단계 c)에서 분리된 CD34⁺조혈 세포를 약 1 일 동안 배양 배지에서 배양하는 단계;

    e) 재조합 피브로넥틴 단편의 존재 하에, 5' - UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC - 3'의 서열의 뉴클레오티드를 포함하는 리보자임을 세포 내에서 발생시키는 벡터를 포함하는 RNA 종양 바이러스를 가지고, 상기 c) 단계의CD34⁺조혈 세포에 대해 형질 도입 과정을 진행하는 단계;

    f) 상기 e) 단계 후에 CD34⁺조혈 세포의 총 수를 결정하고, 상기 총 수가 인체의 체중 kg 당 적어도 1.63×10⁶이면, 하기의 g) 단계를 진행하며, e) 단계 후의 CD34⁺조혈 세포의 총 수가 인체의 체중 kg 당 1.63×10⁶보다 작으면, 다시 b)-e) 단계를 진행한 후 CD34⁺조혈 세포를 합하는 단계; 및

    g) 인체에, 골수 절제 없이, 상기 CD34⁺조혈 세포를 이송함으로써, 인체의 조혈 세포에 리보자임을 발현하는 유전자를 삽입하는 단계.
38. 하기의 단계를 포함하는, 제 1 항의 조성물의 제조 방법 :

    a) CD34⁺조혈 세포를 인체의 혈액 내로 동원하는 단계;

    b) 혈장 교환에 의해 인체의 혈액으로부터 백혈구를 분리하는 단계;

    c) 면역 선택적인 방법에 의해, 상기 분리된 백혈구로부터 CD34⁺조혈 세포를 분리하는 단계;

    d) 형질 도입 벡터와 함께 CD34⁺조혈 세포를 모이도록 하는 제제의 존재 하에, 소정의 유전자를 가지고 상기 c) 단계의 CD34⁺조혈 세포에 대해 형질 도입 과정을 진행하는 단계; 및

    e) 상기 d) 단계 후에 CD34⁺조혈 세포의 총 수를 결정하고, d) 단계 후의 CD34⁺조혈 세포의 총 수가 인체의 체중 kg 당 1.63×10⁶보다 작으면, 다시 b)-d) 단계를 진행한 후 CD34⁺조혈 세포를 합하는 단계.
39. 약학적으로 허용 가능한 담체와 투여 대상 인체의 체중 kg 당 적어도 1.63×10⁶의 CD34⁺조혈 세포를 포함하며, kg 당 적어도 0.52×10⁶의 상기 CD34⁺의 세포가 항-HIV 제제를 발현하는 바이러스성 구성체에 의해 형질 도입되는 조성물을, HIV에 의해 감염된 인체의 치료를 위한 약품을 제조하기 위하여 사용하는 방법.
40. 제 35 항의 방법을 수행하는데 사용되는 구성 요소를 포함하는 키트.
41. a) 인체 내에서 조혈 모세포를 동원할 수 있는 제제의 상당량;

    b) CD34⁺조혈 세포를 배양하기에 적합한 사이토킨을 적어도 하나 포함하는배양 배지;

    c) 5' - UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC - 3'의 서열을 가지는 리보자임을 세포 내에서 발생시키는, 서열을 가지는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA 종양 바이러스성 벡터; 및

    d) 그 내부가 재조합 피브로넥틴 단편으로 코팅된 조직 배양 용기를 포함하는 키트.
42. 제 41 항의 키트와 그 사용 설명서를 포함하는 패키지.