JP2005528319A - 造血前駆細胞を遺伝的に改変する方法及び改変された細胞の使用 - Google Patents

造血前駆細胞を遺伝的に改変する方法及び改変された細胞の使用 Download PDF

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Abstract

【課題】
【解決手段】遺伝子治療、特に造血前駆（ＨＰ）細胞に適用される遺伝子治療、形質導入細胞及びそれらを得る方法、並びにヒト患者中で改変造血細胞の長期の生着を与えるためにそれらを使用する方法に関する組成物及び方法が記載されている。本発明は、とりわけ、ＨＩＶ感染を治療又は予防するためのＨＰ細胞のエキソビボ遺伝子治療に関する。

Description

発明の分野
本出願は、2001年7月10日に出願された米国特許仮出願第60/304127号、2001年7月10日に出願された米国特許仮出願第60/304283号、2001年12月21日に出願された米国特許仮出願第60/343484号、2002年6月4日に出願された米国特許仮出願第60/386063号の利益を主張し、これらの全ての内容を本明細書に参考文献として援用する。
この出願を通じて、様々な出版物を括弧に入れて参照する。これらの引用出版物をまとめてアルファベット順に列挙したものは、明細書の最後、クレームの直前に見いだすことができる。本発明に関係する従来技術をより完全に説明するために、これらの出版物の開示は全体を本出願に参考文献として援用する。
本発明は、遺伝子治療、特に造血前駆（ＨＰ）細胞に適用される遺伝子治療、形質導入細胞及びそれらを得る方法、並びに使用方法に関する。
発明の背景
遺伝子治療とは、遺伝子配列の使用、及び遺伝子配列を細胞内に導入してその細胞の遺伝子構造を改変することにより、それらの細胞の特性又は機能を変更することである。例えば、所望のように機能する十分なコピーの遺伝子を細胞にもたらすことによって遺伝子の欠陥を修正するために、又は所望しない細胞活性又は病原活性を阻害するＲＮＡ又はタンパク質をコードする遺伝子をもたらすために、遺伝子治療を使用することが可能である。
遺伝子治療は、遺伝子的側面を孕んだ様々な疾患のいずれを標的とすることも可能である。造血細胞は患者から収集することが比較的容易で、エキソビボ手法を使用することが可能なので、特に血液又は免疫系の疾患は興味深い。これらには、異常血色素症、白血球の産生又は機能の欠損、免疫不全、リソソーム蓄積症及びファンコーニ貧血などの幹細胞疾患、慢性肉芽腫性疾患、ゴーシェ疾患、Ｇ６ＰＤ欠乏症などが含まれる。これらの疾患の多くの治療は、同種骨髄細胞移植によって成功してきた（Parkman 1986）。しかし、免疫抑制の必要性又は移植片拒絶反応などの免疫効果の発生が同種骨髄細胞移植の欠点である。造血幹細胞の遺伝子治療は、ヒトの造血系に影響を及ぼす疾患の代替治療手段である。
ヒトでの遺伝子治療の成功はかねてから有望視されてきたが、過去１０年間のたゆみない努力にもかかわらず、臨床的に成功させることは非常に困難であった（Mountain、2000）。これは、遺伝子輸送効率が低いこと、十分な細胞を変更することが不可能であること、適切な細胞種を標的とすることが不可能であること、及びヒトの患者において所望する効果を維持することが不十分であることが原因の一つである。
ヒト造血幹（ＨＳ）細胞の遺伝子治療は、現実に実施することは困難であることが明らかとなってきた（Kohn et al 1998、Halene and Kohn 2000、Kume et al 1999）。ヒトでの試験の多くは、遺伝子を含有する末梢血リンパ球の濃度が低く、且つこれらは短命で、再構成したＨＳ細胞の導入は失敗に終わることが示唆された（Bordignon et al 1995、Kohn 1995、Kohn et al 1998、Dunbar et al 1995、Hoogerbrugge et al 1996）。これは、一部には体内においてＨＳ及び造血前駆（ＨＳ）細胞が比較的少なく（Bertolini et al 1998、Reis 1999）、形質導入用にいくつかのマウスレトロウイルスベクターを使用したとき、細胞を活性化させる必要があることが関係する。これには、静止状態のＨＳ細胞におけるアンホトロピック受容体の濃度が低いことが関係する（Bodine et al）。ヒトのＨＳ細胞のほとんどは静止状態で、刺激に対する応答は比較的遅く（Hao et al 1996、Gothot et al 1998）、分割を誘導すると長期間の再生能力が失われる傾向がある（Traycoff et al 1988）。ヒトにおいてＨＳ細胞を使用した遺伝子治療の試みのほとんど全ては、未だにこれら２つの基本的な問題を抱えている。すなわち、全能性で長期間の生着が可能なＨＳ細胞が治療効果を有するには不十分な量で形質導入されていたこと、第２に、形質導入した細胞が、改変造血細胞を長期間提供するほど維持されないことである。
ヒトＨＰ細胞への最も有望な遺伝子治療はＸ連鎖重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）の子供への遺伝子の輸送に関して試みられ、遺伝子含有Ｔリンパ球で免疫系の再構成を引き起こした（Cavazzana-Calvo et al 2000、Hacein-Bey-Abina et al 2002）。この試みでは、小児患者（１２ヶ月未満）の骨髄のＣＤ３４＋細胞を使用し、１ｋｇ当たり１０６個を上回る形質導入細胞を導入した。小児、特に低体重の小児から単離できる（体重１ｋｇ当たりの）ＣＤ３４＋細胞の数は成人よりもずっと多い。胸腺形成も小児では活発である。さらに、ＳＣＩＤ−ＸＩ状態で胸腺形成が外来性遺伝子を含有するＣＤ３４＋細胞のみから行われる場合は、このような研究は希である（Cavazzana-Calvo et al 2001）。ある意味で、このような研究は、ＳＣＩＤ患者の占有されていない生理学的空間を注入細胞が充填することができる点で、骨髄切除を実施する研究に類似している。骨髄切除されていない患者では、主としてレシピエントＨＳ細胞が継続的に存在するために、ＨＳ細胞移植は維持されないことが初期の同種骨髄移植研究で示された（Parkman）。したがって、除去状態でヒトＨＳ細胞を使用した従来の生着研究から得られた結論を、非除去系に単純に当てはめることはできない。
ヒトにおいて造血前駆細胞の遺伝子治療を臨床的に試みたその他の報告は、あまり芳しくない。Kohn et al 1999では、抗HIV RRE decoy（ＲＮＡ分子）をコードする遺伝子を形質導入した小児患者（８〜１７歳）から得られた骨髄由来ＣＤ３４＋細胞を使用した臨床試験が報告されている。この試験では、前駆細胞の有意な形質導入及び生着は達せられなかった。他の試験では、乳癌又は卵巣癌の患者を骨髄切除した後、マーカー遺伝子を形質導入した後のＨＰ細胞で処理したが、マークした細胞が一過的に存在することが認められたにすぎなかった（Bagnis et al 2002）。ゴーシェ病患者３人を含む臨床試験では、注入後３ヶ月まで末梢血及び骨髄に遺伝子含有ベクターの存在が認められたが、濃度は非常に低かった（Dunbar et al 1998）。他の例では、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）の患者５人に試験を実施したところ、ｐ４７ｐｈｏｘ遺伝子が末梢血のＣＤ３４＋細胞に導入された。注入後最初の２、３ヶ月の間は末梢血中に改変好中球が認められたが、注入６ヶ月後には検出不可能になった（Malech et al 1997）。さらに、ファンコーニ貧血を治療するために相補的Ｃ群遺伝子をＣＤ３４＋細胞に挿入する試験では、注入後患者の中に、遺伝子が一過的に検出されたにすぎなかった（Liu et al 1999）。
これらの試験で十分な結果が得られないのは、Ｘ連鎖ＳＣＩＤの場合とは対照的に、未修正細胞と比較して、修正細胞が生存面での有利性を欠いているためであろう。さらに、これらの例のほとんどでは、骨髄切除を行わずに、又は一部だけ行って、操作細胞集団を患者に投与しているので、形質導入細胞は内在幹細胞と競争する必要がある。
さらに、他の要因も作用している可能性がある。ＨＳ細胞数は、ＨＩＶ感染患者中で減少している可能性があり（Marandin et al 1996）、このような細胞を十分数得ることがより困難でなる。さらに、ＨＩＶ感染患者のＨＳ細胞の複製能及びコロニー形成能は損なわれており、アポトーシスする傾向が高まっていることが示された（Vignoli et al 1998、Zauli et al 1996）。ＨＩＶ感染患者では顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を使用した末梢血ＨＰ細胞の動員が示された（Law et al 1999）。Ｇ−ＣＳＦ投与後４日目に、最大限の動員が実現した。白血球除去産物は、１ｋｇ当たり約３ｘ１０６個のＣＤ３４＋細胞を含有していた。Ｌａｗらは、単離したＣＤ３４＋細胞を形質導入しておらず、単離されたＣＤ３４＋細胞が患者に長期間生着可能であることも示していない。Ｌａｗらは、ＨＰ細胞の遺伝子治療によってＨＩＶ感染を治療し得るのではないかと推測したにすぎない。Ｌａｗらは、遺伝的に改変した細胞の生着能力、化学療法の必要性、骨髄切除の必要性の有無、細胞注入のためのニッチェ（niche）の確立、及び細胞注入後のＡＩＤＳ患者の骨髄中での微小環境の未知なる応答を含む多くの不確定要素のために、ＡＩＤＳの遺伝子治療に必要な幹細胞の数についての考察は不十分であると述べている。
骨髄切除した状態で、造血系を効果的に回復させるのに（特に血小板を回復させるのに）必要とされる末梢血由来のＣＤ３４＋細胞の最小数は、患者の体重１ｋｇ当たり２．０ｘ１０６細胞であると示唆されていた（Zimmerman 1995）。しかし、骨髄切除を実施しない場合に、効率的な生着に要する数は、本発明以前には不明であった。「ニッチェ」を注入細胞に対して確立しなければならない（すなわち、骨髄中の競合する常在細胞の効果）かどうかは不明であった。前述のように、ＨＩＶ感染状態には、特にこのことが当てはまった。
多くの研究では、形質導入方法を改善し、移植を増大させるためにモデル動物系、特にマウスを使用してきた。しかし、マウスＨＳ細胞はレトロウイルスベクターで効果的に形質導入することができるが、マウス系の結果をヒトＨＳ細胞に適用しようと努力したところ、重大な困難が明らかになった（Halene and Kohn 2000、Richter and Karlson 2001）。
遺伝子治療を治療に適用するためのさらなる困難性は、十分な数の形質導入細胞を得るために規模を拡大する手法にある（Schilz et al、2000）。Ｓｃｈｉｌｚらは、マウスモデルにおける形質導入及び移植の効率を測定したが、この結論をどのようにヒト患者に適用するかは明確ではない。
本発明は、これらの各要因について取り組むものである。
発明の概要
本発明は、ヒト患者への投与に適した組成物であって、薬学的に許容される担体と、組成物を投与すべきヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも１．６３×１０６のＣＤ３４＋造血細胞とを備え、少なくとも０．５２×１０６のかかるＣＤ３４＋造血細胞に抗ＨＩＶ因子を発現するウイルス構築物が形質導入されている組成物を提供する。
本発明は、ヒト患者の造血細胞中に目的の遺伝子を挿入する方法であって、
ａ）前記ヒト患者の血液中にＣＤ３４＋造血前駆細胞を動員することと、
ｂ）血漿交換によって前記患者から白血球を単離することと、
ｃ）免疫選択的な方法によって前記単離された白血球からＣＤ３４＋造血細胞を単離することと、
ｄ）前記細胞を形質導入ベクターと同所局在させる因子の存在下で、工程ｃ）の前記ＣＤ３４＋造血細胞を目的の遺伝子による形質転換工程に供することと、
ｅ）工程ｄ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数を測定することと、総数がヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも１．６３×１０６細胞であれば、次いで、工程ｆ）に進み、工程ｄ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数がヒト患者のｋｇ体重当り１．６３×１０６細胞未満であれば、少なくとも工程ｂ）−ｄ）を実施して、ＣＤ３４＋造血細胞を合流させることと、
ｆ）前記ＣＤ３４＋造血細胞を前記患者に送達することによって、前記ヒト患者の造血細胞中に目的の遺伝子を挿入することと、
を備えた方法も提供する。
さらに、本発明は、薬学的に許容される担体と、組成物を投与すべきヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも１．６３×１０６のＣＤ３４＋造血細胞とを備え、少なくともｋｇ当り０．５２×１０６のかかるＣＤ３４＋細胞に抗ＨＩＶ因子を発現するウイルス構築物が形質導入されている組成物の使用であって、ＨＩＶに感染したヒト患者を治療するための医薬を製造するための前記組成物の使用を提供する。
さらに、本発明は、
ａ）ヒト患者中に造血前駆細胞を動員することができる量の因子と、
ｂ）ＣＤ３４＋造血細胞を培養するのに適合した少なくとも１つのサイトカインを含む培地と、
ｃ）細胞中に配列５’−ＵＵＡ ＧＧＡ ＵＣＣ ＵＧＡ ＵＧＡ ＧＵＣ ＣＧＵ ＧＡＧ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＵ ＧＧＣ ＵＣＣ−３’を有するヌクレオチド（Ｒｚ２）を備えるレトロウイルスベクターと、
ｄ）内側が組換えフィブロネクチン断片で被覆された組織培養容器と、
を備えたキットを提供する。前記キットと該キットを使用するための使用書とを備えたパッケージも本発明によって提供される。
発明の詳細な説明
本発明は、薬学的に許容される担体と、組成物を投与すべきヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも１．６３×１０６のＣＤ３４＋造血細胞とを備え、少なくとも０．５２×１０６のかかるＣＤ３４＋造血細胞に抗ＨＩＶ因子を発現するウイルス構築物が形質導入されている組成物を提供する。あるいは、前記組成物は、ｋｇ当り少なくとも約１．７×１０６のＣＤ３４＋造血細胞を備え、少なくともｋｇ当り約０．５×１０６のかかる細胞にウイルス構築物が形質導入される。前記組成物は、ヒト患者への投与に適している。ヒト患者は、成人であり得る。
ウイルス構築物は、レトロウイルス構築物であり得る。前記組成物は、実質的にサイトカインを含まないか、又は実質的にウイルスを含まないことがある。
本発明は、組成物を投与すべきヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも５×１０６のかかるＣＤ３４＋造血細胞が形質導入されている組成物、又はヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも９．３７×１０６のＣＤ３４＋造血細胞を備え、少なくとも５×１０６のかかるＣＤ３４＋造血細胞が形質導入されている組成物、又はｋｇ体重当り少なくとも約１０×１０６のＣＤ３４＋造血細胞を備え、少なくとも５×１０６のかかる細胞が形質導入されている組成物、又は前記抗ＨＩＶ因子がＲＮＡ分子である組成物、又は前記抗ＨＩＶ因子がＲＮＡｉ分子である組成物、又は前記抗ＨＩＶ因子がアンチセンス分子である組成物、又は前抗ＨＩＶ因子がリボザイムである組成物も提供する。前記リボザイムは、配列５’ＵＵＡ ＧＧＡ ＵＣＣ ＵＧＡ ＵＧＡ ＧＵＣ ＣＧＵ ＧＡＧ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＵ ＧＧＣ ＵＣＣ−３’（Ｒｚ２）を有するヌクレオチドを備え得る。
前記組成物において、前記形質導入されたＣＤ３４＋細胞は生着（engraftment）することができ、且つ前記患者の中で子孫細胞を少なくとも１２ヶ月間生み出すことができる。前記細胞は、初代細胞培養物であり得る。
薬学的に許容される担体と、組成物を投与すべき患者のｋｇ体重当り少なくとも１．６３×１０６のＣＤ３４＋造血細胞とを備え、少なくとも０．５２×１０６のかかるＣＤ３４＋造血細胞に抗ＨＩＶ因子を発現するウイルス構築物が形質導入されている組成物であって、
（ａ）前記患者からＣＤ３４＋造血細胞を単離する工程と、
（ｂ）少なくとも１つのサイトカインとともに前記ＣＤ３４＋造血細胞を培養する工程と、
（ｃ）前記細胞と前記ウイルス構築物の同所局在を増大させる因子の存在下で、前記ＣＤ３４＋造血細胞に前記抗ＨＩＶ因子を発現するウイルス構築物を形質導入する工程と、
（ｄ）前記ＣＤ３４＋造血細胞を洗浄する工程と、
（ｅ）前記ＣＤ３４＋造血細胞を薬学的に許容される担体と混合することによって、前記組成物を取得する工程と、を備えた方法によって製造される組成物も開示される。該組成物は、ヒト患者への投与に適している。
前記組成物において、工程（ｂ）の培養は、少なくとも１つのサイトカイン、少なくとも２つのサイトカイン、又は２つのサイトカインのみの存在下で行うことができる。工程（ｃ）は、組換えフィブロネクチン断片の存在下で行うことができる。
本発明は、薬学的に許容される担体と、組成物を投与すべきヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも１．６３×１０６のＣＤ３４＋造血細胞とを備え、少なくとも０．５２×１０６のかかるＣＤ３４＋造血細胞が形質転換前にＣＤ３４＋細胞中に存在しない目的の遺伝子によって形質転換されている組成物も提供する。該組成物は、ヒト患者への投与に適している。該組成物では、細胞の数は、上述した数であり得る。前記患者は、成人であり得る。該組成物では、目的の遺伝子は、ＲＮＡ因子を発現し得る。
さらに、本発明は、薬学的に許容される担体と、組成物を投与すべきヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも１．６３×１０６のＣＤ３４＋造血細胞とを備え、少なくとも０．５２×１０６のかかるＣＤ３４＋造血細胞が形質転換前にＣＤ３４＋細胞中に存在しない目的の遺伝子で形質転換されている組成物であって、
（ａ）前記患者からＣＤ３４＋造血細胞を単離する工程と、
（ｂ）少なくとも１つのサイトカインとともに前記ＣＤ３４＋造血細胞を培養する工程と、
（ｃ）前記細胞とベクターとの同所局在を増大させる因子の存在下で目的の遺伝子をコードするベクターで前記ＣＤ３４＋造血細胞を形質転換する工程と、
（ｄ）前記ＣＤ３４＋造血細胞を洗浄する工程と、
（ｅ）前記ＣＤ３４＋造血細胞を薬学的に許容される担体と混合することによって、前記組成物を取得する工程と、を備えた方法によって製造される組成物も提供する。該組成物は、ヒト患者への投与に適している。該組成物では、細胞の数は、上述した数であり得る。前記患者は、成人であり得る。該組成物では、目的の遺伝子は、ＲＮＡ因子を発現し得る。
さらに、本発明は、ヒト患者の造血細胞中に目的の遺伝子を挿入する方法であって、
ａ）前記ヒト患者の血液中にＣＤ３４＋造血前駆細胞を動員することと、
ｂ）血漿交換によって前記患者の血液から白血球を単離することと、
ｃ）免疫選択的な方法によって前記単離された白血球からＣＤ３４＋造血細胞を単離することと、
ｄ）前記細胞を形質導入ベクターと同所に局在させる因子の存在下で、工程ｃ）の前記ＣＤ３４＋造血細胞を目的の遺伝子による形質導入工程に供することと、
ｅ）工程ｄ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数を測定することと、総数がヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも１．６３×１０６細胞であれば、次いで、工程ｆ）に進み、工程ｄ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数がヒト患者のｋｇ体重当り１．６３×１０６細胞未満であれば、少なくとも工程ｂ）−ｄ）を実施して、ＣＤ３４＋造血細胞を合流させることと、
ｆ）前記ＣＤ３４＋造血細胞を前記患者に送達することによって、前記ヒト患者の前記造血細胞中に目的の遺伝子を挿入することと、
を備えた方法を提供する。前記ヒト患者は、成人であり得る。
該方法では、前記細胞を形質導入ベクターと同所に局在させる前記因子はフィブロネクチンの断片であり得る。
該方法では、工程ｆ）は骨髄切除（myeloablation）せずに行うことができる。前記患者に造血前駆細胞を動員する工程ａ）は、前記造血前駆細胞を動員するのに十分な量のサイトカインを前記患者に投与することによって行うことができる。前記患者の血液から白血球を単離する工程では、血漿交換を少なくとも２回行ってもよい。
該方法では、目的の遺伝子による形質導入工程に前記ＣＤ３４＋造血細胞を供する工程は、組換えフィブロネクチン断片（組換えフィブロネクチン断片ＣＨ−２９６でもよい）の存在下で行われる。
該方法では、前記目的の遺伝子は、抗ＨＩＶ因子をコードし得る。前記抗ＨＩＶ因子は、ＲＮＡ分子、又はＲＮＡｉ分子、又はアンチセンス分子、又はリボザイムであり得る。前記リボザイムは、配列５’−ＵＵＡ ＧＧＡ ＵＣＣ ＵＧＡ ＵＧＡ ＧＵＣ ＣＧＵ ＧＡＧ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＵ ＧＧＣ ＵＣＣ−３’（Ｒｚ２）を有するヌクレオチドを備え得る。
前記方法のある実施態様では、工程ｅ）において、工程ｄ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数がヒト患者のｋｇ体重当り１．６３×１０６細胞未満であれば、工程ｄ）で得たＣＤ３４＋造血細胞を低温で保存し、工程ａ）−ｄ）を繰り返し、低温で保存したあらゆる細胞と工程ｄ）で得た前記細胞とをまとめる工程をさらに包含する。取得すべき細胞の具体的な数は、上記のように増加し得る。
前記方法では、工程ｅ）のＣＤ３４＋造血細胞の全て又は殆ど全て（例えば、総数の少なくとも９０％）が前記患者に送達される。
前記方法は、少なくとも２つのサイトカイン又はサイトカイン混合物の存在下で、工程ｃ）の単離されたＣＤ３４＋造血細胞を培養する工程をさらに備えてもよい。
前記サイトカイン混合物は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、巨核球成長発育因子（ＭＧＦＤＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ、Ｆｌｔ−３という略号を用いることもある）、インターロイキン ３（ＩＬ−３）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及びトロンボポエチン（ＴＰＯ）からなる群から選択される１以上のサイトカインを備え得る。さらに、前記サイトカイン混合物は、インターロイキン １（ＩＬ−１）、インターロイキン ４（ＩＬ−４）、インターロイキン ５（ＩＬ−５）、インターロイキン ６（ＩＬ−６）、インターロイキン ７（ＩＬ−７）、インターロイキン ９（ＩＬ−９）、インターロイキン １１（ＩＬ−１１）、インターロイキン １２（ＩＬ−１２）、インターロイキン １５（ＩＬ−１５）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、マクロファージ抑制タンパク質１（ＭＩＰ−１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、及び間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）からなる群から選択される１以上のサイトカインを備え得る。
該方法のさらなる実施態様では、前記サイトカイン混合物は、第一のグループから選択されるあるサイトカインと第二のグループから選択されるあるサイトカインとを備え得る。前記第一のグループは、ＳＣＦ、ＭＧＤＦ、ＦＬ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＬＩＦ、ＴＧＦ−β、ＭＩＰ−１、ＴＮＦ、及びＳＤＦ−１からなり、前記第二のグループは、ＭＧＤＦ、ＦＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＬＩＦ、ＴＧＦ−β、ＭＩＰ−１、ＴＮＦ、及びＳＤＦ−１からなる。
さらに、本発明は、ヒト患者の造血細胞中に目的の遺伝子を挿入する方法であって、
ａ）前記患者の血液中にＣＤ３４＋造血前駆細胞を動員することと、
ｂ）血漿交換によって前記患者の血液から白血球を単離することと、
ｃ）免疫選択的な方法によって前記単離された白血球からＣＤ３４＋造血細胞を単離することと、
ｄ）工程ｃ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数を測定することと、総数がヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも１．６３×１０６細胞であれば、次いで、工程ｅ）に進み、工程ｃ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数がヒト患者のｋｇ体重当り１．６３×１０６細胞未満であれば、工程ｂ）−ｃ）を実施して、ＣＤ３４＋造血細胞を合流させることと、
ｅ）前記細胞を形質導入ベクターと同所に局在させる因子の存在下で、工程ｃ）の前記ＣＤ３４＋造血細胞を目的の遺伝子による形質転換工程に供することと、
ｆ）前記ＣＤ３４＋造血細胞を前記患者に送達することによって、前記ヒト患者の前記造血細胞中に目的の遺伝子を挿入することと、
を備えた方法を提供する。該方法の関連する細目は、先述した方法について記載したとおりに変更することができる。
さらに、本発明は、配列５’−ＵＵＡ ＧＧＡ ＵＣＣ ＵＧＡ ＵＧＡ ＧＵＣ ＣＧＵ ＧＡＧ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＵ ＧＧＣ ＵＣＣ−３’を有するヌクレオチドを備えるリボザイム（Ｒｚ２）を発現する遺伝子をヒト患者の造血細胞中に挿入する方法であって、
ａ）前記造血前駆細胞を動員するのに十分な量のサイトカインを前記患者に投与することによって、前記患者の血液中にＣＤ３４＋造血前駆細胞を動員することと、
ｂ）血漿交換を少なくとも２回行うことによって前記患者の血液から白血球を単離することと、
ｃ）免疫選択的な方法によって前記単離された白血球からＣＤ３４＋造血細胞を単離することと、
ｄ）サイトカインの存在下において、培地中で、工程ｃ）の単離されたＣＤ３４＋造血細胞を約１日間培養することと、
ｅ）組換えフィブロネクチン断片の存在下で、前記細胞中に配列５’−ＵＵＡ ＧＧＡ ＵＣＣ ＵＧＡ ＵＧＡ ＧＵＣ ＣＧＵ ＧＡＧ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＵ ＧＧＣ ＵＣＣ−３’を有するヌクレオチドを備えるリボザイム（Ｒｚ２）を生じさせるベクターを備えたレトロウイルスによる形質導入工程に、工程ｄ）のＣＤ３４＋造血前駆細胞を供することと、
ｆ）工程ｅ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数を測定することと、総数がヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも１．６３×１０６細胞であれば、次いで、工程ｇ）に進み、工程ｅ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数がヒト患者のｋｇ体重当り１．６３×１０６細胞未満であれば、工程ｂ）−ｅ）を実施して、ＣＤ３４＋造血細胞を合流させることと、
ｇ）骨髄切除せずに、前記ＣＤ３４＋造血細胞を前記患者に送達することにより、前記リボザイムを発現する遺伝子を前記ヒト患者の造血細胞中に挿入することと、
を備えた方法を提供する。該方法の関連する細目は、先述した方法について記載したとおりに変更することができる。
上記の組成物を調製する方法であって、
ａ）前記患者の血液中にＣＤ３４＋造血細胞を動員することと、
ｂ）血漿交換によって前記患者の血液から白血球を単離することと、
ｃ）免疫選択的な方法によって前記単離された白血球からＣＤ３４＋造血細胞を単離することと、
ｄ）前記細胞を形質導入ベクターと同所に局在させる因子の存在下で、工程ｃ）の前記ＣＤ３４＋造血細胞を目的の遺伝子による形質転換工程に供することと、
ｅ）工程ｄ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数を測定することと、工程ｄ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数がヒト患者のｋｇ体重当り１．６３×１０６細胞未満であれば、工程ｂ）−ｄ）を再度実施して、ＣＤ３４＋造血細胞を合流させることと、
を備えた方法も提供される。
薬学的に許容される担体と、組成物を投与すべきヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも１．６３×１０６のＣＤ３４＋造血細胞とを備え、ｋｇ当り少なくとも０．５２×１０６のかかるＣＤ３４＋造血細胞に抗ＨＩＶ因子を発現するウイルス構築物が形質導入されている組成物の使用であって、ＨＩＶに感染したヒト患者を治療するための医薬を製造するための使用も提供される。
前記方法を実施する上で使用するための要素（element）を備えたキットも提供される。キットの具体的な実施態様は、
ａ）ヒト患者中に造血前駆細胞を動員することができる量の因子と、
ｂ）ＣＤ３４＋造血細胞を培養するのに適合した少なくとも１つのサイトカインを含む培地と、
ｃ）前記細胞中に配列５’−ＵＵＡ ＧＧＡ ＵＣＣ ＵＧＡ ＵＧＡ ＧＵＣ ＣＧＵ ＧＡＧ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＵ ＧＧＣ ＵＣＣ−３’を有するリボザイム（Ｒｚ２）を生じさせる配列を有するヌクレオチドを備えるレトロウイルスベクターと、
ｄ）内部が組換えフィブロネクチン断片で被覆された組織培養容器と、
を備える。
さらに、上記キットと該キットを使用するための使用書とを備えたパッケージも提供される。
前記方法のさらなる実施態様では、ＣＤ３４＋造血細胞を培養し形質導入する工程に費やす合計時間は、約３日を超えない。すなわち、（正常レベルの）添加したサイトカインの存在下で、前記細胞が３７℃の培地中に存在する時間は、約３日を超えない。あるいは、２以上のサイトカインの存在下で、前記細胞が培地中に存在する時間は、３日を超えない。前記細胞の形質導入は、組換えフィブロネクチン断片ＣＨ−２９６又は均等な因子の存在下で行うことができる。
本発明の組成物と方法は、遺伝的な側面が存在する様々なあらゆる疾病を治療するために使用することができる。特に興味深いのは、血液又は免疫系の疾病である。これらには、異常血色素病、癌を含む白血球産生又は機能の欠損、ＨＩＶ等の免疫不全少、ウイルス感染症、ファンコーニ貧血等のライソゾーム性蓄積症及び幹細胞欠損、慢性肉芽腫性疾患、ゴーシェ病、Ｇ６ＰＤ欠損症等が含まれる。それらには、ＡＩＤＳ／ＨＩＶ感染等の感染性疾患又は癌若しくは心血管疾患等の後天性疾患も含まれる。
本発明は、遺伝子治療（特に、造血前駆（ＨＰ、hematopoietic progenitor）細胞に適用されるもの）、形質導入された細胞及びそれらを得る方法、並びに、それらを用いて、改変された造血細胞をヒト患者内で長期間生着させる方法に関する。本発明は、特に、ＨＩＶ感染を治療又は予防するためのＨＰ細胞のエキソビボ遺伝子治療に関する。
本発明は、治療上の有益性を与え得る十分な数の全能細胞を備える被形質導入ＨＰ細胞の組成物を提供する。ある実施態様では、本発明は、被形質導入ヒトＨＰ細胞の組成物、保護されたＴ−リンパ球をヒト患者中で生じさせるための抗ＨＩＶ遺伝子治療の方法を提供する。
ウイルス感染、特にＨＩＶ感染との関連では、ヒト患者内で改変Ｔリンパ球がさらに長期間生存することによって、Ｔリンパ球の数が増加し、免疫機能が改善されて、ウイルス複製とウイルス量の低下をもたらすことを通じて、本発明によって多大な治療上の有益性が得られる。
さらなる実施態様では、前記組成物又はシステムの被形質導入ヒトＨＰ細胞は、患者に注入したときに長期間生着することができ、少なくとも注入後１２ヶ月間、好ましくは少なくとも２４ヶ月間、より好ましくは注入後少なくとも３０ヶ月間、分化した造血細胞を生じる。さらなる実施態様では、前記被形質導入ヒトＨＰ細胞は、自家患者中に注入したときに、長期間生着することができる。さらなる実施態様では、前記被形質導入ヒトＨＰ細胞は、患者中に注入したときに、骨髄切除を長期間生着することができる。
別の実施態様は、ヒト患者中に送達されたときに、例えば、生検によって、少なくとも１つの細胞種の少なくとも０．０１％の遺伝子改変細胞が血液又は骨髄中に検出できるレベルで長期の生着を与える十分な数の被形質導入ヒトＨＰ細胞を備えた組成物又はシステムを提供する。細胞種はＴリンパ球又はマクロファージ／単球であることが好ましい。好ましくは、遺伝子改変細胞のレベルは少なくとも０．１％、より好ましくは少なくとも１％、最も好ましくは少なくとも１０％である。前記被形質導入細胞は、自家患者中に送達することが好ましい。前記被形質導入細胞は、骨髄切除の不存在下で送達されることが好ましい。長期生着は、少なくとも１２ヶ月、より好ましくは少なくとも２４ヶ月、さらに好ましくは少なくとも３０ヶ月、生じることが好ましい。前記被形質導入遺伝子は、ＳＣＩＤ以外の疾病、例えば、癌や感染性疾患の治療用であることが好ましい。前記被形質導入遺伝子は、ＨＩＶ感染の治療又は予防用であることがさらに好ましい。
形質導入用のＨＰ細胞は、好ましくは、１人の患者から取得する。前記被形質導入ヒトＨＰ細胞のＣＤ３４＋純度（％ＣＤ３４＋）は、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％とすべきである。パーセント形質導入は、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは約５０％とすべきである。
さらなる実施態様では、前記被形質導入ヒトＨＰ細胞は、ＨＰ細胞が末梢血中に動員された後に、ヒト患者の血液から単離されたＣＤ３４＋細胞に由来する。動員は、好ましくは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）抱合されたＧ−ＣＳＦ、ＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦ、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群から得られる１以上のサイトカインを用いることによって達成することができる。前記サイトカインは、さらに、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、又は間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１、Lataillade et al 2000）、又は同じような作用のサイトカインを備えてもよい。動員は、シクロホスファミド等の薬剤による短期間の化学療法を用いることによって補助してもよい。より好ましくは、動員は、Ｇ−ＣＳＦ又はＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦを用いて行われる。サイトカインは、患者のｋｇ体重当り少なくとも約１０μｇ、より好ましくは、ｋｇ当り約３０μｇの量で、毎地に投与することができる。ＣＤ３４＋細胞は、サイトカイン治療を開始した後、３、４、５、６日後、又はそれ以降に、血漿交換によって採集し得る。
好ましくは、血漿交換は、少なくとも２回行われる。ＣＤ３４＋細胞は、Isolex 300i細胞選択システムやCEPRATE SC幹細胞濃縮システム等の本分野において公知である任意の臨床用品質の装置によって選択することができる。
さらなる実施態様では、細胞周期の開始を誘導するために、それぞれ、約１００ｎｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬの濃度で、サイトカイン混合物、好ましくは、ＭＧＤＦとＳＣＦを含むサイトカイン混合物、又は実質的にＭＧＤＦとＳＣＦを含むサイトカイン混合物を形質導入する前に、ＣＤ３４＋細胞を処理する。細胞周期の誘導は、添加したサイトカインＩＬ−３、ＩＬ−６、若しくはＳＣＦ又はこれら３つの組み合わせの不存在下で起こることが好ましい。
前記被形質導入ヒトＨＰ細胞は、１以上のタンパク質又はＲＮＡ分子（例えば、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子、擬似ＲＮＡ（RNA decoy）、又はリボザイムＲＮＡ（すなわち、ＲＮＡ因子））をコードし得る被導入遺伝子を含有する。前記被導入遺伝子は、コードされるタンパク質若しくはＲＮＡ又はその両方が、非形質導入ＨＰ細胞と比べて、被形質導入ヒトＨＰ細胞の特性を所望の態様で改変すれば、いかなる被導入遺伝子であってもよい。ある実施態様では、前記被導入遺伝子は、発現したときに、被形質導入ＨＰ細胞に、又はこれらの細胞の分化した子孫にウイルス感染に対する耐性（好ましくは、ＨＩＶ感染に対する耐性）を与える。より好ましくは、前記被導入遺伝子は、細胞中でのＨＩＶ−１複製を阻害することができるアンチセンス又はリボザイムＲＮＡをコードする。
ＨＩＶ−１感染等のウイルス感染又は非ウイルス疾患に対して誘導され得るリボザイムの種類は、ハンマーヘッド、ヘアピン、RNAse P、肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）、グループＩ若しくはグループＩＩタイプの介在配列リボザイム、又はインビトロ選択法によって選択した触媒性モチーフが含まれる。前記リボザイムは、好ましくは、ハンマーヘッド又はヘアピンリボザイムであり、より好ましくは、ハンマーヘッドリボザイムである。このようなリボザイムは、疾病に関連するＲＮＡ分子を切断することができる。
多重リボザイム（multiple ribozyme）（例えば、Ramezani et al 2002）、例えば、複数の触媒ドメインを有するリボザイム、又は複数種のリボザイムの組み合わせを用いることも本発明に含まれる。
これによって、ウイルス感染の治療の場合におけるウイルス耐性の可能性が減少するはずである。前記リボザイム切断部位は、Ｒｚ２切断部位の場合のように、ウイルス標的ＲＮＡの中で高度に保存されていることも好ましい。上記のあらゆる組み合わせも可能であり、２以上の効果機序を与えるであろう。
前記組成物又はシステムの被形質導入ヒトＨＰ細胞は、ＤＮＡ又はプラスミド又はウイルス導入ベクターによって形質導入される。前記被導入遺伝子は、適切であれば、逆転写の後に、細胞ゲノム中に組み込まれることが望ましい。好ましくは、前記細胞には、レトロウイルスベクター、例えば、マウスレトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターが形質導入される。より好ましくは、前記レトロウイルスベクターは、ＬＮＬ６（Bender et al.1987）又は他のオンコレトロウイルスベクターから誘導される。ある実施態様では、前記細胞には、ＲＲｚ２が形質導入される。
前記被導入遺伝子は、被形質導入ヒトＨＰ細胞又は子孫細胞中でプロモータから発現される。プロモータは、構成的に発現されてもよいし、誘導性であってもよく、例えば、好ましい条件又は環境下で優先的に発現される。前記遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（RNA pol IIプロモーター）又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写され得る。
本発明の別の実施態様では、前記組成物は、ヒト患者中に容易に送達されるように調合される。細胞の大多数（例えば、９５％超、好ましくは９８％超）は、生存できなければならない。前記組成物の容量は、好ましくは約１０ｍＬ乃至約１００ｍＬであり、より好ましくは約１００ｍＬ乃至約５００ｍＬである。前記組成物は、好ましくは、アルブミン又はゼラチン等のタンパク性物質及び／又はグルコース等の糖質であって前記細胞を安定化する作用を示し得る物質を含む緩衝化された塩溶液である薬学的に許容される担体を含む。前記担体は、クエン酸ナトリウム等の抗凝固物質を含有してもよい。前記担体は、本分野で周知の血漿増量剤を含んでもよい。さらなる側面では、前記組成物は無菌（細菌、真菌、マイコプラズマ）であり、細菌、エンドトキシン、マイコプラズマ、ＨＩＶ ｐ２４抗原若しくは複製能のあるレトロウイスルが検出されず、遊離の形質導入ベクター、又はこれらのあらゆる組み合わせを実質的に含まない。さらなる側面では、前記組成物は、添加されたサイトカインを実質的に含まない。前記組成物は、非経口的手段によって、好ましくは、１以上の時点で注入又は注射によって、前記患者に投与される。
本発明は、本明細書に記載されている組成物を用いた、造血細胞、特に造血前駆細胞の遺伝子治療法も提供する。本発明は、遺伝性疾患又は感染性疾患（例えば、ＨＩＶ感染）を治療又は予防する方法も提供する。該方法は、ヒトフィブロネクチンのＣＨ−２９６断片（RetroNectinTM）若しくは均等物を用いること、又は望ましくない細胞を除去するために１以上の減量工程（debulking step）を用いること、又は１以上の洗浄工程を用いることを備えてもよい。
遺伝子治療は、エキソビボ又はインビボで行うことができる。本明細書に記載した前記方法は、エキソビボアプローチに適用することが好ましいが、インビボアプローチに適用することもできる（例えば、NewBound et al.,2001）。本発明は、既に疾病を有する患者に対して行うこともできるし、発症を軽減し又は疾病を予防するために予防的に行うこともできる。
本発明の方法に使用するためのＨＰ細胞は、末梢血、骨髄、臍帯血、又は造血細胞を生じる幹細胞から取得することができる。これらは、好ましくは、動員（mobilization）後に、末梢血から取得することが好ましい。ＨＰ細胞は、化学療法剤を投与して又は投与せずに、１以上のサイトカインを投与することによって、末梢血中に動員することができる。前記サイトカインは、Ｇ−ＣＳＦ、ＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦ、抱合されたＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及び上記したもののあらゆる組み合わせからなる群から選択することができる。前記サイトカインは、さらに、ＳＣＦ、ＦＬ、及びＩＬ−３からなる群から選択される１以上のものを含むこともできる。
本発明の方法は、骨髄切除の不存在下で、少なくとも０．０１％の遺伝子改変された造血細胞を患者に長期間提供することができる。
上述した各実施態様のパラメーターと特徴は、互いに適用可能な場合には互換性があり、したがって、繰り返さない。このため、例えば、前記第一の実施態様のあらゆるパラメーター又は特徴を本発明の別の実施態様で使用し得る。
定義
本明細書で使用する造血細胞は、血液中に通常存在する細胞及び血液中に通常存在する細胞を生じる細胞（骨髄中に存在する細胞等）を意味する。この点に関して、「通常（normally）」には、ある者が血液又は骨髄中に存在する細胞の数又は量を変化させるための処置を受けている状況が含まれる。
本明細書において、ウイルスベクターとは、ウイルスゲノムの全部又は一部を備え、細胞中に導入されて発現されることが可能なベクターを意味するために用いられる。このようなウイルスベクターには、野生型のウイルス（native virus）、変異ウイルス、又は組換えウイルスが含まれる。このようなウイルスは、ＲＮＡ又はＤＮＡゲノムを有し得る。適切なウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びハイブリッドベクターが含まれる。
レトロウイルスベクターとは、前記ウイルスがレトロウイルス科に由来するウイルスベクターである。
「構築物（construct）」とは、特定のヌクレオチド配列を発現させるために作製された又は他の組換え核酸の構築に使用すべき組換え核酸（組換えＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり得る）を意味するために用いられる。一般に、本明細書では、単離された組換えＤＮＡ、又はＲＮＡ分子を表すために「構築物」を使用する。
本明細書で使用する「抗ＨＩＶ因子（anti-HIV agent）」とは、哺乳類細胞が発現することができ、ＨＩＶの複製を阻害し又は哺乳類細胞中へのＨＩＶの侵入を阻害する任意の物質を意味する。このような因子は、核酸又はポリペプチドであり得る。
本明細書において、「生着（engraftment）することができる」という用語は、長期間（例えば、少なくとも１年）にわたって、造血細胞が骨髄中に移植（implant）できることを表すために用いられる。移植は、直接（例えば、生検によって）検出してもよいし、血液中への子孫細胞の産生によって検出してもよい。
本明細書において、「動員する」及び「動員された」という用語は、骨髄中の組織の蓄えから造血細胞が末梢血中に移動することを表すために使用する。
「サイトカイン」という用語は、様々なタイプの細胞によって分泌されるか組換えられているかを問わず、細胞増殖又は細胞機能（例えば、細胞−細胞間のコミュニケーション）の強度及び持続時間を制御する任意の数のホルモン様低分子量タンパク質を表すために使用する。サイトカインは、例えば、免疫、アレルギーの媒介に関与しており、細胞の成熟及び増殖の制御に関与している。
本明細書において、「成人（adult）」とは、完全に成長し且つ肉体的に成熟したヒト患者を表すために使用する。ヒトの「成人」として一般に受け入れられている年齢は、１８歳以上である。
形質導入（transduction）は、ウイルスベクターを用いることによって、細胞中に遺伝物質を導入することを表すために使用する。
本明細書において使用する被形質導入細胞は、形質導入工程から得られ、形質導入工程の前には被形質導入細胞が含有していなかった遺伝物質を含有する（安定的に組み込まれているか否かを問わない）。いくつかの従来技術で使用されているように（但し、本明細書では使用しない）、「被形質導入細胞」は、形質導入工程から得られる細胞の集団であって、遺伝物質を含有する細胞と遺伝物質を含有しない細胞（安定的に組み込まれると否とを問わない）とを含んだ集団を表すこともある。
トランスフェクション（transfection）は、ウイルスベクターを用いずに、細胞中に遺伝物質を導入することを表す。トランスフェクションの例には、「裸のＤＮＡ（naked DNA）」又はリポソーム中のＤＮＡ（すなわち、ウイルスコート又はエンベロープが存在しない）を挿入することが含まれる。
骨髄切除（myeloablation）とは、患者の骨髄区画（造血前駆細胞を含む）の少なくとも重要な一部を破壊する処理（一般には、化学的又は放射性処理）を表す。骨髄切除には、骨髄区画の細胞の微小な破壊又は非本質的な破壊のみを引き起こし得る調節処理（conditioning treatment）は含まれない。
「薬学的に許容される担体」という用語は、任意の標準的な薬学的に許容される担体を意味するために使用される。例としては、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水、及び水が含まれるが、これらに限定されない。
「組換えフィブロネクチン断片」は、形質導入過程中に細胞をベクターと同所に局在させる（colocalize）役割を果し、フィブロネクチンの活性に依拠する物質を意味するために使用される。例えば、RetroNectinTM、TaKaRa Shuzo Co. Ltd.は、３つのドメイン（インテグリンＶＬＡ−５に結合する中央細胞結合ドメイン、プロテオグリカンを結合する高親和性へパリン結合ドメイン、及びインテグリンＶＬＡ−４を結合する、選択的スプライスされるＩＩＩＣＳ領域中に存在するＣＳ−１部位）を含有する組換えフィブロネクチン断片である（Williams 1999）。均等なレトロネクチンは、RetroNectinTMと機能的に等価な３つのドメインを含有するのに対して、RetroNectinTMに類似する同所局在化物質（colocalization agent）は、機能的に等価な少なくとも２つのドメインを含有する。
本明細書において用いる「核酸配列」とは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、及びそれらの断片又は一部、並びにゲノム又は合成由来のＤＮＡ又はＲＮＡ（一本鎖又は二本鎖であり得、センス鎖又はアンチセンス鎖に相当し得る）を表すために使用される。同様に、本明細書で使用する「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列、及びそれらの断片又は一部を表し、並びに天然又は合成の分子を表す。
本明細書で使用する「アンチセンス」という用語は、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を表す。「アンチセンス鎖」という用語は、「センス」鎖に相補的な核酸鎖を表すために使用される。アンチセンス分子は、相補鎖の合成を可能とするプロモータとは逆方向に、対象遺伝子を連結することによって合成することを含む任意の方法によって作製することができる。いったん細胞中に導入されると、この転写された鎖は、細胞によって産生された天然の配列と結合して、二本鎖を形成する。これらの二本鎖は、次いで、さらなる転写又は翻訳を遮断する。このように、変異した表現型を作り出すことができる。アンチセンス鎖を表すために「ネガティブ」という表記が使用され、センス鎖を表すために「ポジティブ」という表記が使用されることがある。
本明細書を通じて、「備える（comprise）」、又はその変形である「備える（comprises）」若しくは「備えている（comprising）」という語は、表記されている要素、整数、若しくは工程、又は要素、整数、若しくは工程の集まりを含むが、他のあらゆる要素、整数、若しくは工程、又は要素、整数、若しくは工程の集まりを除外しないことを意味するものとして理解しなければならない。
本発明の原理を証明するモデル
本発明の原理を証明するために選択したモデルは、ＨＩＶに感染したヒトである。ヒト患者のＨＩＶ感染を効果的に長期且つ実用的に治療し、又は根絶し、又は予防することは、達成が困難な目標である。このため、本発明の利点は、極めて複雑な問題、すなわち、ヒト患者のＨＩＶ感染に対する治療に関連して例示されている。
しかし、以下の記載から明らかなように、本発明の組成物又は方法を用いて、任意の血液又は免疫系を含む様々な疾病を治療することができる。これらには、異常血色素症、白血球の産生又は機能の欠陥、免疫不全症、リソソーム蓄積症及びファンコーニ貧血などの幹細胞疾患、慢性肉芽腫性疾患、ゴーシェ病、Ｇ６ＰＤ欠乏症などが含まれる。これらの疾患の多くは、同種ＨＰ細胞移植による治療が成功している（Parkman 1986）。しかし、免疫抑制の必要性又は移植片の拒絶若しくは移植片対宿主病などの免疫効果の発生が同種骨髄細胞移植の欠点である。本発明は、自家ＨＰ細胞を用いることの利点を与える。本発明は、ＨＰ細胞又はそれらの子孫に骨髄抑制効果に対する耐性を与えるために使用することもできる。
本発明は、先に例示したＡＩＤＳ又はＨＴＬＶ−１等のその他のウイルス感染（Bunnel and Morgan 1998）、又は心血管疾患（例えば、Orlic et al 2001を参照）若しくは癌等の後天的疾患等の感染性疾患を治療するために使用することもできる。癌に関して言えば、主に造血系の癌を含む様々な癌に対して、骨髄移植技術が用いられている。造血細胞に抗癌剤に対する保護を付与して（Carpinteiro et al., 2002）、より効果的な治療を可能とする（Brenner 2001の総説参照）ことには利点が存在する。使用することができる遺伝子には、アンスラサイクリン、ビンカアルカロイド、ポドフィリン、及びタキソールに耐性を与える多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子、並びにメトトレキサート又はトリメトレキサートに対する耐性を与える変異型ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ｍＤＨＦＲ）遺伝子、並びにアルキル化剤に対する耐性を与えるＯ−アルキルグアニン−ＤＮＡ−アルキルトランスフェラーゼに対する遺伝子が含まれる。本発明の遺伝子治療法は、癌細胞に対する免疫反応を変化させることによって、又は単に従来の治療法の効力をモニターするために細胞にマーキングを施すことによって（Cornetta et al 1996）、悪性腫瘍の治療にも使用することができる。悪性腫瘍を治療する場合、造血細胞の遺伝子治療も実施され、改変細胞を導入するに先立って、部分的又は完全な骨髄切除を行うことが多いと思われる。
ＨＩＶ−１の遺伝子治療
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）群には、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の種類が含まれる。ＨＩＶ−１の複製は、現在では、十分に理解されている。現在の標準的な治療では、抗レトロウイルス薬剤の組み合わせ（多くの場合、３つ以上）を使用し、ＨＩＶ複製を短期間抑制することができるが、薬物毒性、ウイルス耐性、煩わしい投薬計画、及び治療の費用等のマイナスの要素を伴うことが多い。
形質導入の標的として造血前駆細胞を用いて、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの遺伝子治療は、ウイルス複製を阻害するように改変された細胞によって、ＨＩＶ感染細胞のプールを一部置き換えることを目標としている。この戦略は、ＣＤ４＋細胞を保護し、保護を受けた免疫要素が媒介する抗ウイルス応答を確立させることによって、ウイルスを根絶するのに寄与できる可能性を有している。これらの戦略がＨＩＶ感染の進行に対してプラスの影響を有するためには、ｉ｝ＨＩＶ感染状態下で免疫の再構築がある程度起こること、ｉｉ｝再構築された免疫系がＨＩＶによる減少から保護されて、抗原を認識し、病原体に対して宿主を保護できるようになることが不可欠である。この戦略は、ウイルス量（viral load）に対して影響を与えることが望ましい。ＨＩＶ感染時の免疫再構築の可能性に関しては、いくつかの報告が、免疫系に対する高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）の効果を記載している（Ho et al 1995; Zhang et al 1998）。主としてＨＡＡＲＴの最初の４ヶ月中に記憶細胞が増大するために、ＨＡＡＲＴにはＣＤ４＋細胞の数の増加が伴う。これに引き続いて、ＣＤ４活性化マーカーの減少を伴ったナイーブＣＤ４＋細胞の増加とリコール抗原に対する増殖反応の増加が起こる（Autran et al 1997; Pakker et al 1998）。
インビトロ実験では、成人の非感染胸腺は、Ｔリンパ球産生を補助する能力を維持しているが（Jamieson et al 1999; Poulin 1999）、造血前駆細胞遺伝子治療によって、ＨＩＶ−１複製を阻害するように改変された細胞が免疫系に長時間復元することが可能であるかは、これまで明らかになっていなかった。遺伝子治療の欠如に関しては、以前にはＨＡＡＲＴナイーブであった患者の末梢中にＲＴＥ（recent thymic emigrant）が出現することが報告されているが、ウイルス血症が抑えられている間しか維持されなかった（Douek et al 1998;Zhang et al 1999）。薬物耐性と制御を受けていないウイルス血症についても、さらに進行したＨＩＶ感染を有する患者で同様の反応が起こり得るかどうかについては不明である。さらに、これらのＲＴＥを生じる前駆細胞源も明らかになっておらず、ＨＡＡＲＴの後に成人で観察される一定の胸腺形成に必要な造血前駆細胞が、Ｔ細胞の減少に対する応答として、骨髄から胸腺へと移動するのか、あるいは、ＨＡＡＲＴ後のＴリンパ球の発育は、幼時に胸腺でコロニーを形成していたＴリンパ球前駆細胞に由来するのかどうかは明らかでない。実際に、ＨＩＶ患者の自家移植後におけるＴリンパ球の発生は、内在性の残存Ｔリンパ球前駆体から生じたＴリンパ球の発育に起因するものであり得るので（Gabarre et al 2000）、ＨＩＶ複製が活発な条件下において、末梢血前駆細胞が成人胸腺中でＴリンパに成長できる能力を有していることはこれまで明らかにはなっていなかった。さらに、選別したＣＤ３４＋細胞を用いて同種造血前駆細胞移植を受けた非感染成人患者では、著しい遅延を示し、Ｔリンパ球の回復は最適状態には至らず、骨髄を強く抑制した後には、胸腺活性が正常状態を下回っていることを示唆している（Behringer et al 1999、Martinez et al 1999）。造血前駆細胞の遺伝子操作で用いられる方法に存在する可能性がある固有の要因によって、造血前駆細胞がＴリンパ球に発育する能力が影響を受ける可能性があることも検討しなければならない。既に明らかとなっているこれらの要因には、マウスレトロウイルスによる形質導入に備えた細胞周期への前駆細胞の誘導（これによって、骨髄系列の拘束（commitment）がもたらされ得る）（Roe et al 1993）と、前駆細胞の移動、ホーミング、及び分化に必要とされるプロセスを妨害し得る構成的に発現される外来遺伝子の存在とが含まれる。このため、本発明者らは、成人ＨＩＶ感染の場合にも、遺伝的に保護が与えられたＴリンパ球（ナイーブＴリンパ球を含む）が産生され得るかどうかを決定することを目指した。
ＨＩＶ−１増殖の妨害は、ＨＩＶ−１複製サイクルのあらゆる段階で起こり得る。細胞のレトロウイスル感染は、細胞の受容体がウイルスの糖タンパク質と相互作用することによって開始される（図１参照）（Ａ）。吸着と脱外被を経て、ウイルスのＲＮＡは標的細胞に侵入し、ビリオン中に持ち込まれた酵素である逆転写酵素の作用によってｃＤＮＡに転換される（Ｂ）。ｃＤＮＡは環状形態となり（Ｃ）、二本鎖ｃＤＮＡに変換された後、インテグラーゼの作用によって、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込まれる（Ｄ）。一度組み込まれると、プロウイルスｃＤＮＡは、５’ＬＴＲ中のプロモータから転写される（Ｅ）。ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖのｍＲＮＡ並びに制御因子ｔａｔ、ｒｅｖ、及びｖｐｒのｍＲＮＡを含む転写されたＲＮＡは、翻訳されてウイルスタンパク質を産生するか（Ｆ）、新生ウイルスＲＮＡとして残る。このウイルスＲＮＡは、ビリオンへのパッケージングに不可欠であるＰｓｉパッケージング配列を含有している（Ｇ）。一旦ビリオンが産生されると、形質膜からの出芽により、ビリオンは細胞から放出される。一般に、レトロウイルスは宿主細胞の溶解を引き起こさないが、ＨＩＶはこの例外である。プロウイルスｃＤＮＡは、宿主ゲノム中に安定に組み込まれた状態を保ち、宿主ＤＮＡとともに複製され、子孫細胞もプロウイルスを受け継ぐことになる。抗ウイルス剤となり得る薬剤は、これらの複製調節点のいずれかを標的とすることができる。例えば、ＣＣＲ５受容体のダウンレギュレーションは、ＨＩＶ−１複製を阻害することができる（Bai et al 2000）。
ＨＩＶに対する遺伝子治療のために本発明とともに使用することができる様々なタイプのアプローチには、トランス優性タンパク質（例えば、Smythe et al. 1994）、細胞内抗体（例えば、Marasco et al. 1998，Shaheen et al 1996）、アンチセンスリボ核酸（ＲＮＡ）、（例えば、Sczakiel and Pawlita 1991）、擬似ウイルス（virus decoy）（例えば、Kohn et al. 1999）、触媒性リボザイム（例えば、Sarver et al. 1990; Sun et al. 1996）、及びＲＮＡｉ（例えば、Novina et al 2002）の細胞内発現が含まれる。
トランス優性（変異）タンパク質、とりわけ、変異Ｒｅｖ又はＴａｔタンパク質は、ＨＩＶ複製に必要とされるＨＩＶのＲＮＡ又は因子に結合することによって作用する。トランス優性（変異）タンパク質は、非変異タンパク質に比べて、非変異タンパク質の機能を妨害するように機能が変化している。トランス優性（変異）タンパク質は、２以上の活性を組み合わせた融合タンパク質であってもよい。ある実施態様では、初代Ｔ細胞中でのＨＩＶ−複製を阻害することが示されている前記トランス優性タンパク質は、ＲｅｖＭ１０タンパク質である（Ranga et al 1998）。ヒト臍帯血又は末梢血から単離されたＲｅｖＭ１０被形質導入ＣＤ３４＋細胞は、マウスモデルで成熟な胸腺細胞とＨＩＶ−１に対して保護されたＴ細胞とを生じる（Bonyhadi et al 1997）。さらに、ＲｅｖＭ１０がレトロウイルスによってＣＤ４＋細胞に運ばれると、ＨＩＶ感染個体中でこれらの細胞が保護される（Ranga et al 1998）。
レトロウイルス構築物ｐＳＬＸＣＭＶから産生されるもの（Shaheen et al 1996）などの細胞内抗体（一般的には、一本鎖タイプのもの）は、特異的なウイルスタンパク質を結合又は隔離することによって、ＨＩＶのライフサイクルを阻害することができる。ある実施態様では、抗逆転写酵素（ＲＴ）抗体断片は、インビトロでのＨＩＶ感染を阻害した（Maciejewski et al 1995）。
アンチセンスＲＮＡは、ウイルスＲＮＡ（ゲノム産物又は転写産物のいずれも）に結合して、ＲＮＡを不安定化させるか、又は翻訳若しくは核からの搬出等のプロセスを阻害することができる。新生ウイルスＲＮＡへの結合は、生産力を有するビリオンへＲＮＡをパッケージングするのを防ぐように作用する場合もある。本分野でよく知られているように、アンチセンス分子の相補領域は、１５ヌクレオチドの短さであり得、より好ましくは３０ヌクレオチド超、最も好ましくは、１００乃至５００ヌクレオチドの長さであり得る。ＨＩＶ−１複製の阻害は、ｐｏｌ、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｖｉｆ、及びｐｓｉを含むいくつかのウイルス制御遺伝子及び構造遺伝子を標的とするアンチセンスＲＮＡについて実証されている（Veres et al 1998参照）。アンチセンスｔａｔ／ｒｅｖ遺伝子を含有するリンパ球で処理すると、類縁のサル免疫不全ウイルスの複製が制約され、疾病の進行がサルで弱められ（Donahue et al 1998）、アンチセンス発現がインビボでレンチウイルスの複製を阻害できることを示している。ある実施態様では、前記レトロウイルスベクターＨＧＴＶ４３は、ｔａｒ及びＨＩＶ−１ゲノム中のｔａｔ／ｒｅｖ領域という２つの別個の部位を標的とするアンチセンス分子をコードする。この分子は、インビトロでＨＩＶ感染に対する保護を与えることが示されている。
擬似ＲＲＥ及び擬似ＴＡＲ等の擬似ＲＮＡも、ＨＩＶに対して細胞を保護するために使用されており（Lee et al 1994、Lisziewicz et al 1993）、ＨＩＶ−１関連タンパク質を結合し、隔離する能力を増大させるために、ポリマー型で使用することが好ましい。
リボザイムは、ウイルスＲＮＡを結合することによって作用するのみならず、ウイルスＲＮＡを切断し不活性化することによっても作用し得るので、本発明とともに使用するのに適する。リボザイムは、標的ＲＮＡに対して相補的な１以上（通常２つ）の領域と酵素活性を与える触媒領域とからなる。リボザイム、特に、長いハイブリダイジングアームを有するリボザイムは、アンチセンス分子が使用する機序と類似の機序を通じて作用することもある。最も広く用いられているリボザイムのモチーフは、ハンマーヘッドタイプとヘアピンタイプであり、それぞれ、米国特許第6,127,114号及び米国特許第6,221,661号に記載されている。ある実施態様では、前記レトロウイルスベクターｐＴＣＡＧは、ＲＲＥ配列の一部に融合されたHIV-1 LTRのＵ５領域（キャップ部位から＋１１１／１１２の位置）を標的とするヘアピンリボザイムと、ｔＲＮＡｖａｌプロモータから発現されるｒｅｖ／ｅｎｖコード領域（ＨＸＢ２単離株の８６２９−８６４４位）を標的とするリボザイムとをコードする（Gervaix et al 1997）。
ＲＮＡｉ分子は、配列特異的な態様で、宿主細胞のＲＮＡ分解の引き金を引く二本鎖ＲＮＡ領域を有する分子である。したがって、ＲＮＡｉ分子は、内在性ＲＮＡ又はHIV-1 RNA等の病原性ＲＮＡを不活性化させるために使用し得る。各二本鎖領域は、比較的短くてもよく、例えば、２１−２５塩基対の長さ、好ましくは、約３０塩基対未満の長さ、より好ましくは、１９乃至２５塩基対の二本鎖領域を有する。２以上のミスマッチ（ミスマッチは、Ｇ：Ｕ対を含まないことと定義される）が各二本鎖領域中に存在しないことが好ましく、より好ましくは、ミスマッチがなく、二本鎖領域は完全にマッチすることが最も好ましい。標的となる分子が一定しない場合（例えば、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ）には、保存度が高い領域を標的とすべきである。ＲＮＡｉ分子の二本鎖領域のストランドのうちいずれかと２以上のミスマッチを有していなければ、一群のバリアントを標的とすることもできる。より長いＲＮＡｉ分子の場合、短い二本鎖を幾つか連結して、複数遺伝子を標的とするようにしてもよく、これは、変化が大きな標的の場合に好ましい。ＲＮＡｉ二本鎖は、スプライシング又は自己切断手段によって（例えば、前記二本鎖領域の間に又は二本鎖領域に隣接させて自己切断リボザイムを取り込ませることによって）、より長いＲＮＡ転写物から作製することもできる。ＲＮＡｉ分子は、逆方向反復構造を有するＤＮＡ分子から容易に形成される。あるいは、ＲＮＡｉ二本鎖は、相補的な領域を有する２つのＲＮＡ分子から形成することもできる。核に局在すれば（例えば、ポリアデニル化配列等の細胞質への搬出用シグナルを持たずに作製されれば）、３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡｉ分子を使用することもできる。最近まで、ＲＮＡｉは、ヒトの細胞中で機能することが示されていなかった。しかし、最近になって、ＲＮＡｉ（ｉＲＮＡ、又はショートｓｉＲＮＡ、又はヘアピンＲＮＡとも称される）は、Ｔリンパ球の中でＨＩＶ−１複製を阻害することが示された（Novina et al 2002）。ウイルスＬＴＲに誘導されたＲＮＡｉ分子、又はアクセサリーｖｉｆ及びｎｅｆ遺伝子は、細胞株及び一次リンパ球中でのＨＩＶ複製の初めと終わりの段階を阻害した（Jacque et al 2002）。ＲＮＡｉは、他のウイルス（例えば、Gitlin et al 2002）を標的とすることもでき、内在性遺伝子に対して誘導されることも可能である。
本明細書に開示された本発明に使用するためのＲＮＡ因子は、高いレベルで発現させるために、ウイルスのプロモータ（例えば、レトロウイルスのＬＴＲ、サイトメガロウイルス）、又はＲＮＡポリメラーゼＩＩを用いる他のプロモータから発現させることもできる。前記ＲＮＡ因子は、さらに長い転写物に（例えば、マーカー遺伝子の３’未翻訳領域中に）取り込ませることもできる。前記転写物は、前記因子を放出するために自己切断するように加工してもよい。前記ＲＮＡ因子は、ｔＲＮＡ遺伝子、アデノウイルスＶＡ１、Ｕ１及びＵ６に由来する遺伝子構築物又はその他の小さな核ＲＮＡ遺伝子を用いて、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータから発現させてもよい。さらに、前記ＲＮＡ因子は、前記因子を標的分子と同所に局在させるのを補助するシグナルとともに与えることもできる（例えば、Michienzi et al 2000参照）。
リボザイム又はその他の遺伝子をＨＩＶ又はその他の感染症を治療するために使用する科学的根拠は、図２に模式的に示されている。
本発明の目的は、保護を受けたＴリンパ球を胸腺から長期間発生させて、ＣＤ４＋細胞の生存性を増大させ、保護を受けた免疫要素により免疫応答の増強を確立することによって、治療上の利益を与えることである。
造血
造血細胞には、血液中に通常存在する細胞及び血液中に通常存在する細胞を生じる細胞（骨髄中に存在する細胞等）が含まれる。この点に関して、「通常（normally）」には、ある者が血液又は骨髄中に存在する細胞の数又は量を変化させるための処置を受けている状況が含まれる。造血細胞の分化のプロセスは、図３に模式的に示されている。造血とは、血液形成システムを維持するプロセスである。このプロセスには、細胞死と新しい細胞の再生及び分化とのバランスが関係している。
成熟リンパ球の産生には、前駆体が骨髄を離れ、胸腺中の選別機構を通過し、末梢血中にナイーブ細胞として搬出されることが必要である。胸腺は年齢とともに退縮し、その結果、胸腺のＣＤ４＋Ｔリンパ球搬出速度は低下するので、このプロセスの効率は、年齢に相関がある。活性化及びメモリーＴ細胞を生じるためのＴリンパ球の生存及び増殖は、自然のホメオスタシス機構に依存している。
骨髄及びリンパの両集団の成熟エフェクター血液細胞へと増殖し分化する子孫を生じるとともに、長期にわたって自己再生能を有する多能性造血幹（ＨＳ）細胞のプールによって、造血は維持される（Ogawa、et al 1993、Orlic and Bodine 1994）。ＨＳ細胞の数は、これらの細胞が効果的に不死化されるように、細胞分裂によって維持される。少なくとも理論的には、全造血系が単一のＨＳ細胞から再生され得る。ＨＳ細胞の多くは、身体中では静止状態にある（Hodgson and Bradley 1979、Jones et al 1990）。
造血前駆（ＨＰ）細胞は、ＣＤ３４細胞表面抗原が存在すること、並びに骨髄及びリンパ両タイプの多系列子孫（multilineage progeny）を生じ得ることを特徴とする。ＣＤ３４＋造血前駆細胞の中には、自己再生能を有し、真の幹細胞と考え得るものもあるが、自己再生能を有さないか、限定的な自己再生能力しか有しない他のＣＤ３４＋造血細胞もあり得る。ＣＤ３４＋抗原は、さらに成熟した造血細胞上には存在しない。
ＣＤ３４＋細胞は、それ自身不均一であり（Bertolini et al 1998）、他のマーカー（例えば、ＣＤ３８）の発現に基づいて、下位集団に分画することができる（Hogan et al 2002）。ＣＤ３４＋細胞集団の約５％を占めるヒトＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞は、ＳＣＩＤマウスモデル中で、ＣＤ３８＋細胞に比べて優れた長期の再構築能を有することが示された（Hogan et al 2002）。このため、２．５×１０４個のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８低）細胞は、５×１０５個のＣＤ３４＋細胞に等しいであろう。長期再構築能を有する細胞を細胞集団中に増大させるために用いることができる他のマーカーには、Ｔｈｙ−１＋、ＣＤ１３３＋、ヒトＫＤＲ＋（ＶＥＧＦ受容体）、ヒトＣ１ＱＲＰ ＋、ＨＬＡ−ＤＲ−、及びローダミン１２３又はヘキスト３３３４２等のバイタル色素の保持が低レベルであることが含まれる。
最近の報告は、少なくとも一時的にＣ３４抗原を欠いたＨＳ細胞が存在する可能性を示唆している（Halene and Kohn 2000, Dao and Nolta 2000）。マウスＨＳ細胞上にＣＤ３４マーカーが可逆的に発現されることが示されており、ＣＤ３４が活性化マーカーとしての役割を果すことを示唆している（Sato et al 1999）。ＣＤ３４−細胞は多系列な生着を行うことができ、ＣＤ３４＋細胞を生じることが示されている（Zanjani et al 1998）。
ＨＰ細胞（本発明の遺伝子治療によって改変される）が生着し、多系列分化した子孫を長期間生じ得ることは、本発明の重要な特徴である。これによって、遺伝子改変された造血細胞がヒト患者中で持続する。この能力は、骨髄破壊を行った動物（Harrison 1980、Harrison 1988）、又は好ましくは骨髄破壊を行ったヒト、又はより好ましくは骨髄破壊を行っていないヒトの造血系を再増殖（repopulate）させる能力によって評価し得る。さらに好ましくは、この能力は、ＨＩＶ−１感染等のウイルス感染に関してアッセイされる。
ＨＰ細胞とそれらの単離
ヒトＨＰ細胞の単離と精製が、最近、総説として報告された（To et al 1997、Huss 2000、Thomas et al 1999、Sadelain et al 2000）。
本発明の遺伝子治療に使用するためのＨＰ細胞は、動員後の末梢血、骨髄、又は臍帯血から単離することができる。ＨＰ細胞は、造血細胞を生じる幹細胞から得ることもできる。
ＨＰ細胞は、動員後に、末梢血から取得することが好ましい（Huss 2000）。動員された末梢血からＨＰ細胞を単離する上で利点が幾つか存在する。処理可能な血液が比較的大量に存在するために、骨髄又は臍帯血に比べて、動員後の末梢血からは、より大きな絶対数のＣＤ３４＋細胞を集めることができる。この操作には、全身麻酔は不要であり、入院費用が少なくて済む。本分野で十分に理解されているように（例えば、Fu and Liesveld 2000）、動員は、サイクロホスファミド等の薬剤を用いた短期間の化学療法を必要に応じて追加しながら、１以上のサイトカインを用いた処理によって行うことができる（Campos et al 1993）。ＨＰ細胞は、Ｇ−ＣＳＦ（Ho 1993, Lane et al 1995）、ＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦ、抱合されたＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ（Siena et al 1989）、又はこれらのあらゆる組み合わせを用いて、末梢血中に動員することができる。１以上のこれらのサイトカインを幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ho et al 1996、Ｆｌｔ３と略称される）、又はインターロイキン３（ＩＬ−３、Huhn et al 1996）等の他のサイトカインと組み合わせて、動員を増強することができる。動員は、間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１、Benboubker et al 2001）、又は動員を制約するように作用するその他の因子を弱めることによって増強してもよい。ＨＩＶ感染個体中でＧ−ＣＳＦを用いて末梢血ＨＰ細胞を動員することは、Ｌａｗら１９９９によって実証されている。最大の動員が達成されるのは、Ｇ−ＣＳＦを投与してから４日後であった。ＨＰ細胞は、血漿交換によって、４日、５日、６日、又はそれ以降に得ることができる。血中のＣＤ３４＋細胞のレベルは、約３日先から、例えば、総血球数（ＣＢＣ）をモニターすることができ、白血球増多の程度を評価するために、サイトカイン投与中に、分画及び血小板数の計測を毎日行ってもよい。ＣＤ３４＋細胞数は、血漿交換を開始する前に、２０細胞／ｍｍ３を超えることが好ましい。
血漿交換は、Cobe Spectra（Gambra）、Hemonetics（Domediac）、Amicus（Baxter）、又は均等な装置を用いて実施することができる。血漿交換は、単核球が高度に濃縮されて、顆粒球が減少した白血球集団をもたらし、それが望ましい。第一回目の動員／血漿交換から得られたＣＤ３４＋細胞が不十分であれば、同一又は修正した動員計画を用いて、操作を繰り返してもよい。
あるいは、血漿交換を繰り返してもよい。第一の操作から得られたＣＤ３４＋細胞は、低温保存し、その後の操作から得たＣＤ３４＋細胞と合流させてもよい。
ＨＩＶに感染した患者では、原始的なＨＰ細胞が減少又は喪失していることが示されており（Marandin et al 1996）、これにより、ＨＩＶ感染においては、十分な数の細胞を得ることがさらに難しくなる。
単核球（ＭＮＣ）を単離し、ＣＤ３４＋細胞を精製することによって、吸引した骨髄からＨＰ細胞を単離することもできる。ＨＰ細胞は、臍帯血から単離することもできる（Gluckman 2000）。出生時に、最大約２００ｍＬの臍帯血を得ることができる。このような細胞は、凍結保存して、後に形質導入と移植を首尾よく行うために使用することができる（Huss 2000）。臍帯血から得られたＨＰ細胞は、末梢血から得られるＨＰ細胞より、形質導入が容易であり、より大きな自己再生能を有するという証拠が存在する（Moore and MacKenzie 1999）。
臨床用にＣＤ３４＋細胞を濃縮させる装置（Isolex 300i又は均等物を含む）が開発されている。これらは、ＨＰ細胞及び血管内皮細胞上に発現されている膜貫通シアロムチンであるＣＤ３４＋細胞表面抗原の認識に基づいている。前記方法には、ＣＤ３４抗原に対する特異性を有する抗体（抗体には選択を可能にする磁気又は蛍光又はその他のタグを付加することができる）を用いる免疫選択的方法が含まれる。細胞は、内部にＣＤ３４タンパク質を発現していることもあるが、これによって、免疫選択を行うことはできないであろう。同じ時に細胞表面上にＣＤ３４抗原を発現しており、抗体へのアクセスが可能な細胞のみがＣＤ３４＋とみなされる。
ＣＤ３４＋細胞が高度に濃縮された造血細胞の集団は、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ５６、又はＣＤ６６ｂ糖タンパク質Ａ等の系列特異的なマーカーを発現する細胞の集団を選択的に減少させる抗原減少法によって上記の採取源から取得することもできる。この種の方法によって、ＣＤ３４＋細胞に加え、ＣＤ３４−ＨＳ細胞が濃縮された細胞集団を単離することが可能となる。ＣＤ３４＋を濃縮したプール又は系列を減少させた細胞は、好ましくは、このタイプの細胞を少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは、少なくとも８０％備える。所望の細胞の純度と回収率とバランスを図らなければならない。
サンプル中のＣＤ３４＋細胞の割合は、フローサイトメトリ法（例えば、Bender et al 1991によって行われたもの）、又は免疫的方法によって決定することができる。ＣＤ３４＋細胞の絶対数と割合は、標準化された操作によって決定することができる（Barnett et al 1998、Sandhaus et al. 1998）。有核細胞の絶対数は、血液分析装置によって決定することができ、より好ましくは、ＣＤ３４の絶対数が単一のフローサイトメトリ分析から直接得られるシングルプラットフォームアッセイで決定することができる。ＣＤ３４＋細胞の一覧表及び使用可能な装置のいくつかが、最近総説にまとめられた（Reis 1999）。
一旦単離された後には、ＣＤ３４＋細胞は、フラスコ又はバッグ（例えば、気体透過性ポリプロピレンバッグ（Giarratana et al 1998））等の容器中において、本分野で周知の任意の適切な培地中で培養することができる。
ＣＤ３４＋細胞の多くは、長期の再構築ではなく短期の再構築に関わっており、全ＣＤ３４＋細胞のうち少数のみが長期の多系列生着能（multilineage engraftment potential）を有するという証拠が増加している（Bertolini et al 1998参照）。このことは、初期の報告におけるＣＤ３４＋数の一覧及び生着能に関する疑義を提起する（Ducos et al 2000）。本発明者らは、本明細書において、本発明の被形質導入ヒトＣＤ３４＋細胞及び方法が、長期の多系列の生着を与え得ることを示した。
マウスのオンコレトロウイルスベクターを用いた形質導入のためのＨＰ細胞の処理
マウスオンコレトロウイルスベクター（例えば、ＭＭＬＶに基づくベクター）や他のいくつかのレトロウイルスベクターを用いたヒトＨＰ細胞の効率的な形質導入には、例えば、１以上のサイトカイン（増殖因子）（Dao and Nolta 1999）又は細胞周期制御の阻害剤を用いて、細胞周期を誘導することが必要である。インビトロでは、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ−３ リガンド（ＦＬ）、及びＫｉｔリガンド（ＫＬ、ＳＣＦとしても知られる）の組み合わせが用いられてきた（Murray et al 1999, Ng et al 2002）。霊長類の再増殖アッセイ（repopulation assay）では、ＭＧＤＦ、ＳＣＦ、及びＦＬの組み合わせを用いた（Wu et al 2000）。Ａｍａｄｏらは、ＭＧＤＦ及びＳＣＦで細胞を処理すると、他の因子の組み合わせより、胸腺細胞前駆細胞の生存の補助が良好であることをマウスモデルで示した（Amado et al 1998）。ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、若しくはＴＰＯ、又はそれらの組み合わせは、ＨＰ細胞形質導入に対して有益な効果を有することが示された（Nolta et al 1992, Hennemann et al 1999）。大きな動物モデルでは、ＦＬ／ＳＣＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−６、ＳＣＦ／Ｇ−ＣＳＦ、ＦＬ／ＳＣＦ／ＴＰＯ／ＩＬ−６、ＦＬ／ＳＣＦ／Ｇ−ＣＳＦ、ＦＬ／ＳＣＦ／ＴＰＯ、及びＦＬ／ＳＣＦ／ＧＭ−ＣＳＦという組み合わせも使用されている（Richter and Karlson 2001）。しかし、ＩＬ−３、ＩＬ−６、及びＳＣＦという組み合わせは生着を損なうこともあり得るという証拠が存在している（Peters et al 1996）。ＨＰ細胞のサイクルを誘導する他のアプローチには、細胞数を増加させるために、ｐ２７（ｋｉｐ１）の阻害剤（例えば、アンチセンス分子又は抗体）（Dao et al 1998、Cheng et al 2000）又はトランスフォーミング増殖因子β−１（Ducos et al 2000, Imbert et al 1998）を使用することが含まれる。しかし、これらのうちいずれかの方法で細胞を刺激した後に、ヒトに長期の生着を与えるために形質導入できることは、本発明以前には公知でなかった。
ＳＣＦ（ｃ−キットリガンド）は、主に骨髄幹細胞（marrow stromal cell）によって産生されるサイトカインであり、ＨＳＣの生存と自己再生において重要な役割を有している（Lyman and Jacobsen 1998）。ＳＣＦは、ＨＳ細胞が幹細胞プールから子孫へと移行する際の共同分裂促進因子（co-mitogen）としても作用する。Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）は、原始的な造血細胞上に発現されるクラスＩＩＩ受容体チロシンキナーゼに結合するサイトカインである（Lyman and Jacobsen 1998）。ＦＬは、ＳＣＦとともに、ＨＰ細胞の生存と増殖に対して相乗的な作用を有する（Dao et al 1997）。トロンボポエチン（ＴＰＯ）は、ｃ−Ｍｐｌ受容体に対するリガンドであり、巨核球と血小板の形成及び初期の造血に関与する増殖因子である（Solar et al 1998）。ＭＧＤＦは、ＰＥＧ化及び末端切断された型のＴＰＯであり、ＴＰＯと類似の様式で作用し、ＴＰＯの機能的均等物とみなすことができる。これらのサイトカインはいずれも、なお均等な効果を与えるのであれば、修飾を施し、異なった処方を行い、又は抱合させてもよい。
リボザイム
リボザイムは、ＲＮＡを特異的に切断することができる、酵素作用を持ったＲＮＡである（例えば、Haseloff and Gerlach、1988）。触媒能を有するので、リボザイムはターンオーバーして、複数の標的分子を切断することができる。相補的な配列のために、リボザイムは特異的な標的ＲＮＡと対を成し、ＲＮＡのホスホジエステル骨格上の特異的な部位での切断を誘導する（Haseloff and Gerlach、1988; Rossi et al.,1992;Hampel et al 1990;Ojwang et al 1992）。ハンマーヘッドリボザイムは、小さくて、単純であり、様々な隣接する配列モチーフ中に取り込まれたときにも、部位特異的な切断を維持することができる（Haseloff and Gerlach、1988; Rossi et al.,1992）。リボザイムによる切断には、アクセス可能なＲＮＡ領域が必要とされ、ハンマーヘッドリボザイムの場合には、ＮＵＨターゲットモチーフが必要とされる（ここで、Ｎは任意のリボヌクレオチドであり、ＨはＡ、Ｃ，又はＵリボヌクレオチドである）。切断は、ＮＵＨ標的モチーフのすぐ３’側に起こる。これらの特徴のために、ハンマーヘッドリボザイムは、遺伝子抑制に極めて適する。その他のタイプのリボザイムには、いわゆるヘアピンリボザイム、肝炎デルタウイルスリボザイム（ＨＤＶ）、RNAse P、介在配列（ＩＶＳ）グループＩ、ＩＶＳグループＩＩ、及びインビトロでの選択法によって同定されるモチーフが含まれる。ハンマーヘッド及びヘアピンタイプは最も小さく且つ最も広く用いられている。
Ｒｚ２の説明
数多くの研究によって、試験管反応中でのリボザイムの切断活性と、組織培養系でのＨＩＶ−１の実験室分離株及び臨床分離株に対する保護効果とが実証されている（Sarver et al. 1990; Sun et al. 1995 ; Wang et al. 1998）。Ｒｚ２と表記されるハンマーヘッドリボザイムは、ｔａｔ遺伝子の高度に保存された領域に対して生じたリボザイムである（図４）。ｔａｔ遺伝子は、ＨＩＶ−１複製に不可欠であり、組み込まれたＨＩＶ−１プロウイルスの転写活性因子であるＴａｔタンパク質をコードし産生する。Sun et al(1995)は、Ｒｚ２を用いて、Ｔリンパ球をインビトロでＨＩＶ−１から保護したが、患者での結果については記載しなかった。Sunらは、最低数の被形質導入ＨＰ細胞を長期生着に使用しなければならないこと、又はその数がどの程度であるかについても開示しなかった。Amadoら(1999)は、ＨＩＶ−１に感染した個体に、ＭｏＭＬＶを基礎とするレトロウイルスベクターを用いて、ＣＤ３４＋細胞を形質導入することの実施可能性と安全性を決定する第Ｉ相臨床試験で用いるプロトコールを一般的な表現で記載している。Amadoらは、試験結果も記載していないし、長期生着に、最低数の被形質導入ＨＰ細胞を用いるべきであることも記載しなかった。試験の目的には、形質導入の効率性と安全性を決定することが含まれ、リボザイムによって子孫細胞にインビボで生存上の有利性（又は不利益性）が与えられるかどうかをテストすることが含まれた。
図４は、Ｒｚ２とその標的配列（ＨＩＶ−１株ＨＸＢ２（Genbank配列K03455）内の５８３３乃至５８４９位、切断は５８４２位のＧＵＡトリプレットの後で起こる）の構造を示している。標的配列には、参考株ＨＩＶ−ＨＸＢ２（Genbank受託番号K03455）のヌクレオチド５８３３−５８４９（ＧＧＡＧＣＣＡ ＧＵＡ ＧＡＵＣＣＵＡ）又はＨＩＶ ＩＩＩＢ（Genbank受託番号X01762）のヌクレオチド５８６５乃至５８８２（ＧＧＡＧＣＣＡ ＧＵＡ ＧＡＵＣＣＵＡ）、又は他のＨＩＶ株の対応する領域が含まれる。配列５’−ＴＴＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＧＡ ＴＧＡ ＧＴＣ ＣＧＴ ＧＡＧ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＴ ＧＧＣ ＴＣ−３’を有するＲｚ２リボザイムに対応するＤＮＡヌクレオチドを、新しいウイルスＲＲｚ２を作出するために複製能を欠くレトロウイルスベクターＬＮＬ６（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｂ６３６５３）を含有するプラスミドｐＬＮＬ６内のｎｅｏＲ遺伝子の３’未翻訳領域中のＳａｌＩ部位に挿入した。ＲＲｚ２中のモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）末端反復配列（ＬＴＲ、Long Terminal Repeat）から、ｎｅｏＲ−リボザイム融合転写物として、前記リボザイム配列を発現させた。
前記リボザイム切断部位のすぐ周囲のヌクレオチド配列は、ウイルス標的ＲＮＡ中で高度に保存されていることが好ましい。これは、配列データベースで入手できる配列の比較によって容易に決定し、あるいは、多数継代アッセイ（Wang et al 1998）によって実験的に調べることができる。ＨＩＶ−１中のＲｚ２標的／切断部位は、殆ど全ての天然の感染性分離株中で保存されている。第Ｉ相臨床試験では、切断部位に位置するＧＵＡトリプレットに対して−４及び−１の位置に２つの配列バリアントが観察された。しかしながら、これらのバリアントは、適正の劣る偽型に相当する可能性がある。
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球、単球、及びマクロファージは最もＨＩＶに感染しやすいので、これらの細胞がＲｚ２を発現するように遺伝的に改変を施すと、ＨＩＶ感染の阻害がもたらされる。遺伝的改変は、造血の初期段階の間に達成されるのが好ましい。
ベクター
ＨＰ細胞の形質導入又は形質転換には、様々なタイプのベクターを用いることができる。これらには、プラスミドベクター又はウイルスベクターが含まれる。レトロウイルスベクター、特にマウスオンコレトロウイルスの一員であるモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）に基づくベクターは、これまで遺伝子治療において広く用いられてきた（Chu et al 1998）。用いることができる他のマウスレトロウイルスベクターには、マウス胚性幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）及びマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）に基づくベクターが含まれる。マウスオンコレトロウイルスに基づくベクターは、細胞の高効率形質導入に用いることができるが、細胞が活発に細胞分裂を行っている必要がある。細胞の細胞質への侵入と逆転写の後、核への前組み込み複合体の輸送には、有糸分裂中に核膜が破壊されることが必要である。マウスレトロウイルスを基礎とするベクターによるＨＰ細胞の形質導入には、したがって、細胞の活性化が必要である。
レトロウイルスベクターのサブクラスであるレンチウイルスベクター（Amado and Chen 1999)も、高効率の形質導入に用いることができ（Haas et al 2000, Miyoshi et al 1999, Case et al 1999）、分裂していない細胞を形質導入することが可能である（Uchida et al 1998, Sutton et al 1998）。前組み込み複合体（preintegration complex）は、有糸分裂なしに核に入ることができ、したがって、レンチウイルスの形質導入には、ＨＰ細胞が細胞周期に誘導されることが必要でない。これによって、細胞が多能性のまま残存する可能性が増大する。抗ＨＩＶ−１遺伝子治療におけるレンチウイルスベクターの使用の総説が報告されている（Mautino and Morgan 2002）。スプマウイルス属（例えば、泡沫状ウイルス（Vassilopoulos et al 2001））のような他のレトロウイルスのグループも、分裂していない細胞に効率的に形質導入することができる。
本発明で使用することができるその他のタイプのウイルスベクターには、アデノウイルスベクター（Fan et al 2000、Knaan-Shanzer et al 2001、Marini et al 2000）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Fisher-Adams et al 1996）、ＳＶ４０を基礎とするベクター（Strayer et al 2000）、又はハイブリッドベクターの形態（例えば、Feng et al, 1997又はLieber et al 1999）が含まれる。アデノウイルスベクターは、高力価で容易に製造し、容易に濃縮し（１０１２ｐｆｕ／ｍＬ）、分裂していない細胞を形質導入することができる。巨大なＤＮＡインサートを収容することができる（７−８ｋｂ）。インビボでのアデノウイルスに対する免疫反応は、ある種のタンパク質をコードする遺伝子を除去することによって緩和することができる。
ＡＡＶベクターは非病原性であり、ＣＤ３４＋細胞を含む増殖及び非増殖細胞の両者を形質導入し、細胞ゲノム中に安定に組み込まれる（Grimm and Kleinschmidt 1999）。さらに、ＡＡＶベクターは、宿主の免疫応答を誘導せず、約１０１０ｃｆｕ／ｍＬの高力価になるように、無ヘルパー系の中で製造することができる。ＡＡＶは、一本鎖のＤＮＡゲノムを有するエンベロープのないウイルスである。ＡＡＶベクターは、最大約４ｋｂの新しいＤＮＡを容易に取り込むことができるが、最近の研究によってさらに大きくなった。ＡＡＶベクターは、長期培養物中で、ＣＤ３４＋細胞を効果的に形質導入することができる（Chatterjee et al 1999）。
患者に細胞を戻した後に長時間持続する効果を得るために細胞ゲノム中に被導入遺伝子を組み込ませるベクター（例えば、レンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベクター、及びＡＡＶベクター）が好ましい。本明細書では、ウイルスベクターの組み込みを、細胞ゲノム中にウイルスベクターの遺伝物質の全部又は一部が組み込まれることと定義する。それらには、レトロウイルス及びＡＡＶベクターが含まれる。それらには、アデノウイルス／レトロウイルスベクター（例えば、Feng et al 1997）、及びアデノウイルス／ＡＡＶベクター等のハイブリッドベクターも含まれる（例えば、Lieber et al 1999）。しかし、エピソームとして安定に複製されるベクターも使用することができる。ベクターを細胞株中において高力価で、安価に製造することができ、患者へのリスクが最小であること（例えば、複製能を有するウイルスを生じないこと）も望まれる。
ベクターの製造
レトロウイルスベクターを構築し、製造する方法は、Gambottoら(2000)の総説に記載されている。ベクターは、それ自体はパッケージング能を欠損しているヘルパーベクターを含有するＰＡ３１７又はＡＭ−１２細胞株等のパッケージング細胞株中でパッケージングされる。高力価のレトロウイルス上清を作製する方法の変法が幾つか報告されている（Schilz et al 2001）、培地、パッケージング細胞、収穫の温度、遠心又は複合体形成による濃縮法の変形が含まれる（Le Doux et al 2001）。これらの方法はいずれも、本発明と共に使用することができる。
マウスの広宿主性エンベロープ（amphotropic envelope）中にパッケージングされたレトロウイルスは、広宿主性受容体のレベルが低いために、原始的なＨＰ細胞を効率的に形質導入できない可能性がある（Bodine et al 1998）。しかしながら、細胞周期の誘導は、広宿主性受容体の発現の増加と遺伝子導入の一貫した増加をもたらすことが示されている（Orlic et al(1999)）。別のアプローチは、テナガザウ白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）（Kiem et al 1997、Eglitis and Schneiderman 1997、Relander et al 2002）、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇタンパク質）、（Naldini et al 1996, von Laer et al 1998）、又はネコ内在性ウイルス（feline endogenous virus）（Kelly et al 2002）から得られるエンベロープ等を用いて、レトロウイルスベクターを偽型化することである。偽型化ベクターは、例えば、遠心によって濃縮してもよい。
ＡＡＶベクターは、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を構成的に又は一過性に発現しているパッケージング細胞株又は細胞中で作製することができる。ヘルパーフリーのパッケージング法の開発及びベクター産生株の確立を含む、ＡＡＶベクターの製造が総説に記載されている（Grimm and Kleinschmidt 1999）。アデノウイルスベクターは、標準的な方法に従って、製造し、精製することができる（例えば、Fan et al 2000参照）。
ウイルス株の生物学的力価は、容易に決定することができる（例えば、Tavoloni et al 1997）。
ベクター中の遺伝子の発現
導入された前記遺伝子は、本発明の被形質導入ヒトＨＰ細胞又は子孫細胞の中で、プロモータから発現される。プロモータは、構成的に発現されてもよいし、誘導性であってもよく、例えば、好ましい条件又は環境下で優先的に発現される（例えば、Chang and Roninson 1996、Saylors et al 1999）。異常血色素症又はサラセミア等のいくつかの遺伝病については、発現を特定のタイプの細胞に誘導することが、好ましいかもしれない（Grande et al 1999）。ＭｏＭＬＶレトロウイルスＬＴＲプロモータ等のウイルスベクターのプロモータ／エンハンサーは、発現が向上されるように改変してもよいし（Robbins et al 1998、Halene et al 1999）、あるいは、インスレーター（Rivella et al 2000）若しくは足場付着領域（ＳＡＲ、scaffold attachment regions）等のエレメント（Murray 2000）を挿入することによって改変してもよい。好ましいプロモータ及びその他の制御エレメント（ポリアデニル化シグナル等）は、その中で遺伝子治療因子を発現させるべき細胞種（例えば、Ｔリンパ球）において最大の発現を与えるはずのものである。このため、例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１、及びＨＴＬＶ−２は全てリンパ球に感染し、これらのウイルスに対する遺伝子治療因子を効率的に発現するために、造血細胞、特にリンパ球（lymphoid cell）（又は組織）中で効率的な発現を与える転写調節ユニット（プロモータやポリアデニル化シグナル）が選択される。好ましいプロモータは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の即時型プロモータであり、必要に応じて、成長ホルモンのポリアデニル化シグナル、及びテナガザル−MuLV LTRのプロモータとともに使用される。ＬＴＲプロモータの望ましい特徴は、その起源となるウイルスと同じ組織指向性を有することである。ＣＭＶプロモータは、リンパ球の中で発現される。他のプロモータには、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩに依存するＶＡ１とｔＲＮＡプロモータが含まれる。メタロチオネインプロモーターには、誘導能（inducability）を有するという利点がある。ＳＶ４０即時型プロモータは、インビトロにおいて、骨髄細胞中で高レベルの発現を示す。造血細胞特異的なプロモータは、ウイルスプロモーターの代わりに用いることができる（例えば、Malik et al 1995）。
ＭｏＭＬＶを基礎とするベクター得られる数種の抗ＨＩＶ遺伝子の発現は、長期間持続した（Austin et al 2000、Su et al 1997）。ＭｏＭＬＶ以外のレトロウイルスを基礎とするベクター、例えば、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ベクター（Cherry et al 2000）又はＦｒＭＬＶ（Cohen-Haguenauer et al 1998）は、長期の発現を示した。レンチウイルスベクターからの発現も、被形質導入細胞中で持続するものと思われる（Case et al 1999）。レトロウイルスベクターからの遺伝子発現の喪失が、マウス造血細胞の形質導入後に観察されることが時折ある（Challita and Kohn 1994、Lange and Blankenstein 1997）が、ヒトでは、被形質導入ヒトＨＰ細胞において観察されたことはほとんどない。
形質導入の方法
ある種のマウスレトロウイルスベクターを用いて形質導入する場合には、ヒトＨＰ細胞は、細胞周期を誘導するために、成長因子で処理する必要があるかもしれない（上記参照）。他のレトロウイルスベクターの場合には、この限りではないかもしれない。このような処理を経た後、細胞は形質導入ベクターに接触させる必要がある。
本発明の形質導入法では、細胞とウイルス粒子の同所局在を増大させ且つ形質導入の頻度を増加させる細胞外マトリックスタンパク質フィブロネクチン（又はフィブロネクチンのキモトリプシン断片）（Hanenberg et al 1996、Hanenberg et al 1997、Kramer et al 1999、Williams et al 1999）、より好ましくは、組換えフィブロネクチン断片ＣＨ−２９６を用いることが好ましい。へパリン結合ドメインを含有する均等な断片及び選択的にスプライシングされる３型連結セグメント領域（type 3 connecting segment region）も使用することができる（Kiem et al 1998）。ＣＨ−２９６の使用は、マウスの異種移植モデルで示されたように、ＨＰ細胞の再生能を維持する上でも役立つかもしれない（Dao et al 1998）。イヌのモデルでは、ＣＨ−２９６と成長因子の組み合わせが使用されているが（Goerner et al 1999）、いかにしてこれをヒトに適用するかについては不明であった。ポリブレンとプロタミン硫酸等の他の同所局在化因子（colocalization agent）を使用することもできる。これらの因子は、ウイルス粒子の見かけの力価を増加させることによって作用する。
膜フィルター（Hutchings et al 1998）の上で、又はフィブロネクチンでコートした管の中で遠心することによって（Sanyal and Schuening 1999）、細胞とベクターを物理的に同所に局在させることもできる。
ベクターを産生するマウスの繊維芽細胞の単層上でＨＰ細胞を共培養すると、効率的な遺伝子形質導入がもたらされるが、大量の注入されたマウスの細胞に患者を暴露すると思われるので、臨床的には有用ではない（Halene and Kohn 2000）。これに対して、ヒト間葉幹細胞は、効率的なＣＤ３４＋の形質導入のために間質性の支持を与えることができる（Reese et al 1999）。
ヒトＨＰ細胞を形質導入するためのレトロウイルスベクターを調製する無血清法を用いることができる（例えば、Glimm et al 1998、Schilz et al 1998）。形質導入頻度は、（特にＣＤ３４＋Ｃ３８低細胞については）、培地を含有するベクターの濃度を減らすことによって又はフィブロネクチン断片上にベクターのみを予め載せることによって、フィブロネクチンの存在下で増加させることができる（Relander et al 2001）。例えば、陽イオンと陰イオンポリマーを用いてウイルス調製物を濃縮することによって、形質導入頻度の増加を達成することもできる（LeDoux et al 2001）。
非ウイルス手段による細胞のトランスフェクションは、陽イオン性リポソーム、又はポリリジン−ＤＮＡ複合体等のＤＮＡタンパク質複合体、又は本分野で公知のその他の手段を用いることによって達成することができる。
何人かの著者が、ヒト造血細胞中に遺伝子導入するための条件についての総説を記している（Moore and MacKenzie 1999、Sadelain et al 2000）。
形質導入の頻度
ヒトＨＰ細胞中に遺伝子が導入される頻度は、標準的な方法、例えば、ＰＣＲ又は蛍光検出によって測定することができる（Gerard et al 1996）。最大７０−１００％の形質導入頻度がレトロウイルスベクターを用いて得られているが、これは、比較的小さな細胞サンプルについてのものであった（Halene et al 1999）。とりわけ、長期の再構築に必要とされるさらに原始的なＨＰ細胞の場合には、臨床的に適切なレベルの物質まで規模を増大させると、一般的には形質導入の頻度が低下する（例えば、同所局在化因子なしの場合、１−５％の範囲）。
インビトロで増殖させることによって、より多数の被形質導入ヒトＨＰ細胞を取得できることが示唆されている。しかし、これによって、細胞の全能性の喪失と幹細胞の損傷がもたらされることがある（Bunting et al 1999、Briones et al 1999、Takatoku et al 2001）。培養条件によっては、再増殖能を失わせずに、ＨＰ細胞をある程度増殖させることができるが、インビトロでの増殖は最小限に保つことが好ましい（Kobari et al 2000、Lewis and Verfaillie 2000、Rosler et al 2000）。例えば、サイトカインＦｌｔ３−リガンド、ＳＣＦ、及びトロンボポエチン（ＴＰＯ）の組み合わせを使用することができる（Ng et al 2002）。さらに、ＩＬ−３とＩＬ−６の添加は好ましくなかった（Herrera et al 2001）。これに代えて又はこれに加えて、形質導入後に細胞をＳＣＦのみと２日間培養すると、生着能を向上させることができる（Dunbar et al 2001）。形質導入後に細胞を脱活性化させる処理は、生着能を向上させる可能性がある。
臍帯血から単離したヒトＨＰ細胞がレトロウイルスベクターで形質導入される頻度は、まず臍帯血を凍結保存すると増加した（Orlic et al 1999）。
細胞表面レポーター（例えば、Fehse et al 1997参照）をコードする遺伝子等のマーカー遺伝子を導入することによって、被形質導入ヒトＨＰ細胞を濃縮することも可能であるが、臨床の条件では、これは望ましくないかもしれない。
形質導入頻度は、本分野において周知の任意の方法によって（例えば、ＰＣＲによって、構築物中に選択可能なマーカーが含まれているときには、Ｇ４１８等の選択的な物質の存在下でコロニーを増殖させることによって、又は蛍光活性化ソーティングによって）測定することができる、形質導入の頻度は、例えば、細胞集団の標本から得られた総ＤＮＡに対して定量的なＰＣＲ法（例えば、リアルタイムＰＣＲ）を行うことによって、総集団からの細胞を真に代表する標本に対して測定することが好ましい。集団中の細胞から生じた各コロニーに対する形質導入頻度を解析することは好ましいとはいえないが、禁じられるものではない。
本発明者らは、本発明において、長期の生着のためには、最低数の被形質導入ヒトＨＰ細胞を用いなければならないことを見出した。さらに、被形質導入ＨＰ細胞が、分化した多系列白血球を生じるためには、胸腺形成（thymopoiesis）を経ることが可能でなければならない。
導入される遺伝子の種類
本発明では、任意の遺伝子をヒトＨＰ細胞中に形質導入によって導入することができる。前記遺伝子は、重症の複合免疫不全を含む免疫不全を治すために使用することができる。例えば、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、リンパ球増加症タイプのＳＣＩＤで欠損しているＲＡＧ１、ＲＡＧ２若しくは組換え／ＤＮＡ修復過程の遺伝子、ＣＤ４５遺伝子、又はＹｃ、Ｊａｋ３、ＩＬ−７ Ｒα遺伝子を発現するベクターを全て使用することができる（Cavazzana-Calvo 2001）。ヒトリソソーム蓄積症の中で最も多いゴーシェ病等のリソソーム蓄積症を治療することができる。ＭＦＧ−ＧＣレトロウイルスベクター等のグルコセレブロシダーゼ（ＧＣ）遺伝子をコードするベクター（Takiyama et al 1998）は、ゴーシェ病の治療に使用することができる（Dunbar et al 1998a、Dunbar et al 1998b）。
慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（４つの成分を有するマルチサブユニット酵素）の欠陥から生じ、ｐ４７ｐｈｏｘ遺伝子又はｇｐ９１ｐｈｏｘ遺伝子等の適切な遺伝子を用いて治すことができる。比較的ヒトに多いグルコース−６−リン酸脱水素酵素欠損症は、Ｇ６ＰＤ遺伝子を用いて治療することができる（Rovira et al 2000）。少なくとも８つの遺伝子のうちいずれの１つの欠損によっても生じるファンコーニ貧血は、適切な遺伝子（例えば、相補的Ｃ群遺伝子）を用いて、治すことができる（Liu et al 1999）。それぞれ適切な遺伝子を用いて、血小板無力症（Wilcox et al 2000）、及びファブリー病（Takenaka et al 2000）を治すことができるように、異常血色素症を治すことができる。化学療法が骨髄破壊をもたらすと予測される非造血性悪性腫瘍の他に、白血病、骨髄腫、及びリンパ腫を含む造血性悪性腫瘍の治療の一部として、ＭＤＲ−１等の骨髄保護能のある遺伝子によって、ＣＤ３４＋細胞も形質導入することができる（例えば、Abonour et al 2000、Michallet et al 2000）。このようなケースでは、非骨髄破壊的な条件設定を用いることができる（Nagler et al 2000）。遺伝子の発現がＨＰ細胞の機能に対して有害な効果を与える可能性が存在し、これが望ましくなければ、制御可能なプロモータによって遺伝子の発現を調節できることが、本分野において周知である。
被形質導入ＨＰ細胞中に構成的に発現される外来遺伝子が存在することによって、幹細胞の遊走、ホーミング、及び分化の過程を妨害する可能性があることを考慮しなければならない。タンパク質に対して誘導された免疫応答は、遺伝子を含有する細胞の排除ももたらすかもしれない。これは、アデノウイルスによって媒介される遺伝子送達の後に見られるが、レトロウイルスによって媒介される遺伝子送達又は遺伝子のＣＤ３４＋細胞中への導入後には、生じないのが通常である。ｎｅｏ遺伝子産物に対する免疫反応は、一般的には観察されていない。本発明者らは、構成的に発現される外来遺伝子を２つの異なるレトロウイルスベクター中に導入しても、幹細胞の遊走、ホーミング、及び分化工程を妨害しないことを本発明で見出した。さらに、遺伝病を治すための標的として、ヒトＨＰ細胞を使用することは、導入遺伝子産物に対する免疫寛容の出現がこのような細胞で誘導されえる点で、有利であると予想される（Halene and Kohn 2000）。
さらに、導入遺伝子から得られるリボザイム等のＲＮＡ産物は、免疫原性が無視できるものと思われる。抗ＨＩＶタンパク質をコードするＲｅｖＭ１０遺伝子は、ＳＣＩＤマウス中で、被形質導入ヒトＣＤ３４＋細胞の分化を阻害しなかった（Su et al 1997、併せて、Yu et al 1995）。ＩＦＮα等のタンパク質は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス中で、生着と分化に影響を与えずに、ＣＤ３４＋細胞中で発現されている（Quan et al 1999）。
さらに、ヒトＨＰ細胞は、ある種の環境下で（例えば、Kirby et al、Ragg et al 2000）又は選択的な物質の存在下において、（Omori et al 1999、Ragg et al 2000）インビボで選択面における有利さを有するように改変することができる。
実験例１
：試薬
段階は全て、クラスＩＩ生物学的安全キャビネット内で無菌的に実施した。
１．１ ＤＮＡ分解酵素溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）
ＤＮＡ分解酵素保存溶液をＣＤ３４＋凍結保存培地の調製に使用した。滅菌生理食塩水溶液（滅菌生理食塩水吸入溶液ＵＳＰ（０．９％ＮａＣｌ）、Dey Corp. NDC#49502 830）１．４ｍＬを１．５ｍＬ滅菌スクリューキャップ付きエッペンドルフ管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、カタログ番号７２６９２００５）内でＤＮＡ分解酵素（ＤＮＡ分解酵素Ｉ型ＩＩＳ、Ｓｇｉｍａカタログ番号Ｄ−４５１３）に添加し、ゆっくり攪拌することによって溶解した。−２０℃で保存した。ＤＮＡ分解酵素保存液１ｍＬを凍結保存培地５０ｍＬそれぞれに使用した。
１．２ ＰＢＭＣ凍結保存培地（９０％ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ）
永久保存用及び安全性試験目的用にＰＢＭＣ細胞を凍結保存するためにＰＢＭＣ凍結保存培地を使用した。凍結時に最大限の生ＰＢＭＣ細胞の回収をもたらようにこの培地は構成されている。９０％ウシ胎児血清（StemCell Technologies、カタログ番号ＨＣＣ−６５４０）及び１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ−２６５０）を含有しており、滅菌濾過して、４ｍＬずつ分割して保存する。一旦開封したら、その一定量を１患者専用に使用する。
1.3 ＣＤ３４＋凍結保存培地
これは、永久保存用及び安全性試験目的用にＰＢＭＣ細胞を凍結保存するために使用した。凍結時に最大限の生ＣＤ３４＋細胞の回収をもたらすようにこの培地は構成されている。５０ｍＬの凍結保存培地調製用にこの手順を使用した。
以下を順番通りに滅菌５０ｍＬ試験管にピペットで入れた。
ＩＭＤＭ ３１ｍＬ（イスコフ改変ダルベッコ培地、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１２４４０−０４６）
ＤＭＳＯ １０ｍＬ（ジメチルスルホキシド、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ−２６５０）
Albuminarc25TM８ｍＬ（２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、アメリカ赤十字、カタログ番号４５１−０５１３）
ヘパリン溶液 １５μＬ（ヘパリン １０、０００Ｕ／ｍＬ、Elkins-Sinn Inc.）
ＤＮＡ分解酵素保存溶液 １ｍＬ（１０ｍｇ／ｍＬ）、前記の１参照
これらの成分を回転によって徹底的に混合した。濾過滅菌するために、この混合物をＣｏｒｎｉｎｇ １５０ｍＬフィルター系で濾過した（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号２５９３２−２００）。４ｍＬずつ５ｍＬ滅菌Ｎｕｎｃ試験管に分割して、−２０℃で保存した。
保存試料及び共培養試料用に、患者１人当たり１試験管（４ｍＬ）を使用した。凍結保存培地を解凍し、準備が整うまで４℃で維持した（高温ではＤＭＳＯは細胞に対して毒性である）。
1.4 ＭＧＤＦ（１００μｇ／ｍＬ ＰＥＧ化したヒト組換え巨核球増殖分化因子
ＰＥＧ化したヒト組換え巨核球増殖分化因子を幹細胞培養のために使用して、細胞増殖及びレトロウイルス形質導入を促進した。作業用保存溶液として１００ｍｇ／ｍＬに調製し、分割して、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬで幹細胞培養培地に添加した。
ＭＧＤＦバイアルの内容物（Amgen Inc.、５％ ソルビトールを含有する１０ｍＭ 酢酸ナトリウム溶液１ｍＬに溶かした５００ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ化したヒト組換えＭＧＤＦ、ｐＨ５）及びいくらかのＩＭＤＭ培養培地（イスコフ改変ダルベッコ培地、Gibco BRL カタログ番号１２４４０−０４６）を室温まで暖めた。無菌技術を使用して、ＭＧＤＦ溶液１ｍＬをバイアルから取り出し、滅菌した１５ｍＬの試験管に移した（ポリプロピレンコニカル試験管、コーニング カタログ番号２５３１９−１５又はＦａｌｃｏｎ カタログ番号３５２０９７）。ＭＧＤＦをＩＭＤＭ４ｍＬで最終量５ｍＬまで希釈し、１００ｍｇ／ｍＬ作業用保存溶液を作製した。作業用保存溶液の一定量（１ｍＬ）を滅菌スクリュー付き微量遠心管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ カタログ番号７２６９００５）に移した。
一旦調製したら、ＭＧＤＦ作業用保存溶液の貯蔵寿命は３日間に限定された。調製し分割したＭＧＤＦは凍結せずに３日間までは４℃〜８℃で保存した。ＭＧＤＦのバッチは、各患者用にＣＤ３４＋細胞を調製した日（培養０日目）に新たに調製した。患者毎に、作業用保存ＭＧＤＦ一定量を別の材料バイアルから調製し、使用後は廃棄した。少なくとも５人の患者の細胞培養培地調製用に十分な一定量を準備した。
1.5 幹細胞因子（組換えメチオニル化ヒト幹細胞因子５０μｇ／ｍＬ）
組換えメチオニル化ヒト幹細胞因子は、細胞増殖及びレトロウイルス形質導入を促進するために、幹細胞培養培地において使用した。保存溶液として５０ｍｇ／ｍＬで調製し、最終濃度５０ｎｇ／ｍＬで使用した。
ＳＣＦバイアル（Amgen Inc.、凍結乾燥組換えメチオニル化ヒトＳＣＦ １８７５ｍｇ）のバイアル及びＩＭＤＭ培養培地（イスコフ改変ダルベッコ培地、Gibco BRL カタログ番号12440-046）を室温まで暖めた。無菌技術を使用して、滅菌水１．２５ｍＬを針でシリンジ内に取り、ＳＣＦバイアル中に注射した。このＳＣＦは、振盪せずに回転することによって溶解した。新しい針及びシリンジを使用して、ＳＣＦ溶液０．２ｍＬを抜き取り、ＩＭＤＭ ５．８ｍＬを含有した１５ｍＬ無菌コニカル試験管に添加した。これによって、５０ｍｇ／ｍＬの作業用保存溶液６ｍＬを作製した。滅菌した５ｍＬピペットを使用して、ＳＣＦ作業用保存溶液の一定量１ｍＬを無菌微量遠心管に移した。
調製し分割したＳＣＦを凍結せずに３日間までは４℃〜８℃で保存した。５０ｍｇ／ｍＬ保存液は、各患者用にＣＤ３４＋細胞を調製した日（培養０日目）に新たに調製した。患者毎に、別の材料バイアルを使用した。毎日の細胞培養培地調製のために各分割量を１回のみ使用した。
1.6 ネビラピン（ネビラピン−ビラミューンＴＭ５ｍｇ／ｍＬ、１８．７ｍＭ）
ネビラピン（ネビラピン−ビラミューンＴＭ）を使用して、細胞培養及びレトロウイルス形質導入期間中のＣＤ３４幹細胞培養物におけるＨＩＶ複製を阻害した。ネビラピンを調製して、５ｍｇ／ｍＬ（１８．７ｍＭ）保存溶液として分割し、最終濃度５００ｎＭで細胞培養培地に添加した。ネビラピン作業用保存液の１バッチを全臨床試験用に調製した。この保存液を分割して、培養培地調製日毎に患者当たり３個のバイアルを使用した。
無水ネビラピン粉末（Boehringer Ingelheim．Ｍｆｒ＃ ４３０７４）約１００ｍｇを５０ｍＬ試験管（BluemaxTM５０ｍＬ滅菌ポリプロピレン遠心管、Ｆａｌｃｏｎ カタログ番号２０９８）に計量した。エタノール（１００％無水アルコールＵＳＰ、Punctilious、Quantum Chemical Corp）を試験管に添加して、５ｍｇ／ｍＬ溶液を作製した。５ｍｇ／ｍＬ作業用保存溶液の一定量０．５ｍＬを１．５ｍＬ滅菌スクリューキャップ付き微量遠心管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ カタログ番号７２６９２００５）に移し、−２０℃で保存した。
ネビラピン保存溶液を使用前に室温で解凍した。毎日の細胞培養培地調製のために各分割量を１回のみ使用した。
1.7 ウシ胎児血清
ウシ胎児血清は、ＣＤ３４＋培養培地の構成成分で、２０％の濃度で使用した。形質導入用に使用したウイルス上清には１０％ＦＢＳが含まれており、したがってＣＤ３４細胞の形質導入で使用する前に１０％ＦＢＳを補給した。
５００ｍＬ瓶入りのＦＢＳを５０ｍＬ量に分割して、無駄を最小限に抑えた。血清（ウシ胎児血清、５００ｍＬ、Stem Cell Technologies ＨＣＣ−６４５０）を３７℃の水槽で解凍し、均一に見えるようになるまで振盪せずに回転によって混合し、無菌的に５０ｍＬ遠心管（Bluemax（登録商標） ５０ｍＬ滅菌ポリプロピレン遠心管、Falcon カタログ番号２０９８）中に５０ｍＬ量ずつ分割した。この分割液を凍結保存した。毎日の培地調製のために各分割量を１回のみ使用した。
1.8 ＣＤ３４＋培養培地の調製
単離したＣＤ３４＋細胞は、形質導入する前に少なくとも１日間この培養培地中で増殖させた。この培地は、前駆細胞の生存度を高く維持するように考案されている。この手順は、培地５００ｍＬ調製用である。
以下のものを順番通り濾過漏斗（５００ｍＬの容器を備えた０．４５μｍ濾過漏斗、Ｎａｌｇｅｎ カタログ番号ＳＦＣＡ １６２−００４５）にピペットで移した。
ＩＭＤＭ ４００ｍＬ（イスコフ改変ダルベッコ培地、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号１２４４０−０４６）
ＦＢＳ １００ｍＬ（ウシ胎児血清 前記１．２に従って２ｘ５０ｍＬに分割）
ＳＣＦ ５００ｍＬ（前記の１．２参照）
ＭＧＤＦ ５００ｍＬ（前記の１．４参照）
ネビラピン １３．３ｍＬ（前記の１．６参照）
半分が通過するまで真空にして、次に内容物をゆっくり回転させて混合した。完全に濾過して、内容物を再度回転させた。
必要に応じてＣＤ３４＋培養培地を新たに調製した。遮光環境で使用する約３０分前まで室温で保存し、次に水槽で３７℃まで暖めた。直接必要な量を上回る培地に患者のＣＲＦ ＩＤ番号を標識して、４℃で保存した。他のいかなる患者にも使用せず、患者の細胞培養／形質導入／採集手順が完了したら廃棄した。
1.9 硫酸プロタミン
プロタミンは、ウイルス調製培地中のベクターが標的ＣＤ３４＋細胞に結合するのを容易にする。
アンプルから硫酸プロタミン（Elkin-Sinn、５ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）を分割して無駄を最小限に抑えた。ＣＤ３４＋の形質導入毎に患者１人当たり２アンプルを使用して、一定量約０．５ｍＬずつを１０ｘ１．５ｍＬ滅菌スクリューキャップ付き微量遠心管に分注した。これらを凍結しないで４℃で保存した。バイアル１本を毎日の形質導入（１日目及び２日目）で、ＶＣＭ形質導入混合物を調製するために使用した。分割量は１回使用し、毎日ＶＣＭ調製後に廃棄した。
1.10 硫酸プロタミンを含むＶＣＭ形質導入混合物
培養したＣＤ３４＋細胞をＧＭＰ条件下でMagenta Corporation（bIOrELIANCE Corp.）によって作製されたウイルス調整培地（ＶＣＭ）で形質導入した。リゾチーム及び対照ベクターに対応して、２種類のＶＣＭ調製物がある。ＰＡ３１７／ＲＲｚ２ ＶＣＭの力価は、ＰＡ３１７／ＬＮＬ６ ＶＣＭより低く、したがって形質導入当たりＲＲｚ２を３００ｍＬか、又はＬＮＬ６を２００ｍＬ使用し、各形質導入における感染ウイルス粒子の数を等しくした。
形質導入は、２日間継続して行った。ＶＣＭ形質導入混合物を作製するために、各ＶＣＭに増殖因子及び血清を補給して、１日目の培養培地を以下の通りに合わせた。
１日目に、２００ｍＬ瓶入りＰＡ３１７／ＬＮＬ６ ＶＣＭ１本、２００ｍＬ瓶入りＰＡ３１７／ＲＲｚ２ ＶＣＭ２本及びウシ胎児時血清２ｘ３０ｍＬ分割液を３７℃の水槽で完全に解凍した。ネビラピンの一定量を室温で解凍し、その他の試薬、一定量の硫酸プロタミン、一定量のＳＣＦ、一定量のＭＧＤＦを室温まで暖めた。
ＲＲｚ２の混合を開始する前にＬＮＬ６混合物の調製を完了した。ＬＮＬ６ ＶＣＭを調製するために、以下のものを順番通り濾過漏斗（５００ｍＬの容器を備えた０．４５ｍｍ濾過漏斗、Ｎａｌｇｅｎ カタログ番号１６２−００４５）にピペットで移した。
ＦＢＳ ２０ｍＬ（前記参照）
硫酸プロタミン ２２０ｍＬ（前記参照）
ＭＧＤＦ ２２０ｍＬ（前記参照）
ネビラピン ６ｍＬ（前記参照）
ＰＡ３１７／ＬＮＬ６ ２００ｍＬ（ＰＡ３１７／ＬＮＬ６−３、Magenta Corporation、力価１．４ｘ１０7ｉｖｐ／ｍＬ）。
この漏斗をゆっくり回転させて混合し、混合物を濾過するために真空にした。
以下の量を使用する以外は同様の方法でＲＲｚ２ ＶＣＭを調製した。
ＦＢＳ ３０ｍＬ
プロタミン硫酸 １３２ｍＬ
ＳＣＦ ３３０ｍＬ
ＭＧＤＦ ３３０ｍＬ
ＰＡ３１７／ＲＲｚ２ ３００ｍＬ（ＰＡ３１７／ＲＲｚ２−１７Ｒ′、Magenta Corporation、力価０．８ｘ１０7ｉｖｐ／ｍＬ）。
残りのＲＲｚ２ ＶＣＭ１００ｍＬをＣＲＦ＃で標識して、すぐに−８０℃で再凍結した。形質導入２日目にこれを使用した。
第２日目のＬＮＬ６及びＲＲｚ２ ＶＣＭ形質導入混合物の調製では、２００ｍＬ瓶入りＰＡ３１７／ＲＲｚ２１本及び１日目の残りの１００ｍＬをＲＲｚ２混合のために使用すること以外は同様の方法に従った。
ＶＣＭ形質導入混合物それぞれを形質導入日毎に新たに調製し、ＣＤ３４＋細胞が形質導入のために準備できるまで生物学的安全キャビネットで保存した。
1.11 レトロネクチン（登録商標）（レトロネクチンのＰＢＳ溶液２５ｍｇ／ｍＬ）の調製
レトロネクチン（登録商標）（ヒトフィブロネクチン断片 ＣＨ−２９６）溶液を使用して、組織培養用容器をコーティングして、ＣＤ３４＋細胞のレトロウイルスによる形質導入を容易にした。
BioWhittakerで注文したTakara Shuzo Co.Ltd.コード番号 Ｔ１００Ｂの凍結乾燥レトロネクチン（登録商標）２５００ｍｇを含有する１バイアルを室温まで暖めた。滅菌水２．５ｍＬを添加して、ゆっくり回転させることによって材料を溶解し、針付きシリンジで取り出した。この混合物をＭｉｌｌｅｘフィルター（Millipore、カタログ番号SLGV 013 0S）で５０ｍＬ試験管（５０ｍＬ 滅菌組織培養用試験管、Falcon カタログ番号2098）に濾過して、ＰＢＳ４ｍＬで希釈して、２本の５０ｍＬ試験管に分け、全量を１００ｍＬにした。内毒素試験用に最終生成物として同時に２００ｍＬを取り出し、残りを４℃で保存した。一般的に、試薬はすぐに容器にコーティングした。
1.12 ２％ＨＳＡの調製（ヒト血清アルブミンのＰＢＳ溶液）
組織培養容器をレトロネクチンでコーティングした後、２％ＨＳＡを使用して容器をブロックした。無菌的に２５％ＨＳＡ溶液（Albumarc25TM）８ｍＬとＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムを含まない、１ｘ、Virus Core Lab or JRH Biosciences カタログ番号５９３２１−７８Ｐ）９２ｍＬとを混合することによって調製した。この試薬は通常すぐに使用した。
1.13 レトロネクチンコーティング容器
レトロネクチンでコーティングしたフラスコを使用して、数人の患者のＣＤ３４＋細胞をレトロウイルスベクターで形質導入した。
レトロネクチン溶液（前記参照）２５ｍＬを４ｘ１７５ｍＬのフラスコ（０．２μｍ 通気性の閉じ蓋を備えた細菌用プラスティックフラスコ１７５ｃｍ2、Ｓａｒｓｔｅｄｔ ８３．１８１２．５０２）にピペットで入れ、室温で２時間静置した。この溶液をフラスコから除去し、２％ ＨＳＡ ２５ｍＬを添加した。さらに室温で３０分した後、この溶液を除去して、フラスコをＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地、GIBCO BRL、カタログ番号１２４４０−０４６）２５ｍＬで洗浄した。このフラスコをプラスティックの袋で密閉して、４℃で保存して、２〜３日以内に使用した。
1.14 ＶＣＭ 形質導入混合物（レトロネクチンと共に使用）
レトロネクチンでコーティングしたフラスコを形質導入用に使用したとき、硫酸プロタミンンをＶＣＭ形質導入混合物から排除した。これらは、以下の量を使用すること以外は前記の１．１０で説明した方法と同様に調製した。
２日目の朝に１回目の形質導入を行うために、ＦＢＳの一定量のように、ウイルス調製物の一定量２００ｍＬを３７℃の水槽で解凍した。ＬＮＬ６又はＲＲｚ ＶＣＭ形質導入混合物（レトロネクチンを含む）は、濾過漏斗（２５０ｍＬ容器を備えたＮａｌｇｅｎｅ ０．４５μｍ濾過フラスコ、Ｎａｌｇｅ ＳＦＣＡ １６２−００４５）にこの順番通り添加することによって調製した。
ＦＢＳ １０ｍＬ（前記参照）
ＳＣＦ １１０ｍＬ（前記参照）
ＭＧＤＦ １１０ｍＬ（前記参照）
ネビラピン ３ｍＬ（前記参照）
ＰＡ３１７／ＬＮＬ６ １００ｍＬ又はＰＡ３１７／ＲＲｚ２ １００ｍＬ（前記参照）
この成分をゆっくり回転させることによって混合し、濾過によって滅菌した。ＬＮＬ６混合物の調製は、ＲＲｚ２の混合を開始する前に完了させた。
夜に行う２回目の形質導入のために、残りのＰＡ３１７／ＬＮＬ６ １００ｍＬ及びＰＡ３１７／ＲＲｚ２ １００ｍＬを同様の方法で使用して、ＶＣＭ形質導入混合物を調製した。これらは、使用するまで室温で保存した。
1.15 ＶＣＭ形質導入混合物はレトロネクチンと共に使用した（患者８〜１０）。患者番号８〜１０用のＶＣＭ形質導入混合物は、調製で使用した量を２倍にすること以外は同様の方法で調製し、使用した。３回の形質導入は、２日間に渡って、すなわち１日目の夜と２日目の朝及び午後に実施した。
1.16 ＣＤ３４＋細胞洗浄緩衝液（Ｃａ2+＆Ｍｇ2+を含んだＰＢＳ、＋１％ＨＳＡ）
１％（最終濃度）ＨＳＡを含有するＣＤ３４＋洗浄緩衝液は、形質導入したＣＤ３４＋細胞を注入する前に細胞を洗浄するために使用した。１患者当たり洗浄緩衝液１Ｌを使用し、新たに、又は予め数日前に調製した。
新しいＰＢＳの１Ｌ瓶から、約９６０ｍＬが残存するように、ＰＢＳ４０ｍＬを滅菌した２５ｍＬピペットで取り出した。２５％ＨＳＡ溶液（２５％ＨＳＡ溶液、Ａｌｂｕｍａｒｃ２５TM）４０ｍＬを無菌的に１８ゲージ針を装着した５０ｍＬシリンジを使用してＰＢＳ瓶に移し、振盪せず、回転させることによって十分に混合した。この洗浄緩衝液は４℃で保存し、使用前に３７℃まで暖めた。１Ｌバッチを１人の患者専用とし、１回のみ使用し、残りは廃棄した。
1.17 ＣＤ３４＋注入緩衝液（ＲＰＭＩ、フェノールレッド無し、＋５％ヒト血清アルブミン）
ＣＤ３４＋注入緩衝液は、輸液するまで形質導入したＣＤ３４＋細胞の生存度を維持するために考案されている。このＲＰＭＩは、患者に直接注入して使用するので、フェノールレッドは含まれていない。ヒト血清アルブミンを最終濃度５％で含有した。
洗浄後、採集した細胞の各バッチを懸濁するために１００ｍＬを使用した。この緩衝液は、採集／注入の日に新たに作製するか、又は前もって数日前に調製することができる。
２５ｍＬ滅菌ピペットを使用して、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ（フェノールレッド無し、Gibco-BRL、Cat 118-030）８０ｍＬを２５０ｍＬコニカル遠心管に移した。アメリカ赤十字の２５％ＨＳＡ溶液（Albumarc25TM）２０ｍＬを、２１ゲージ針を装着した２５ｃｃシリンジを使用して無菌的に添加した。この混合物をゆっくり回転させた。この試薬を前もって調製した場合は、４℃で保存したが、採集の日に新たに調製した場合は、使用するまで室温で保存した。この混合物は使用前に３７℃まで予め暖めた。１００ｍＬのバッチを１人の患者専用とし、１回のみ使用した。
1.18 ＦＡＣＳ ＰＢＳ（ＰＢＳ、Ｃａ2+＆Ｍｇ2+無し、＋２％ウシ胎児血清＋０．１％ＮａＮ3）の調製
ＦＡＣＳ ＰＢＳは、ＦＡＣＳ染色方法の間に細胞を洗浄するために使用した洗浄緩衝液である。さらに、ＦＡＣＳ分析を染色後すぐに実施する場合（すなわち、４〜６時間以内）、染色した細胞を再懸濁するために使用した。
アジド保存溶液（１０％）は、アジ化ナトリウム４ｇを５０ｍＬ試験管内で蒸留水に溶解することによって調製した。ＦＡＣＳ ＰＢＳ溶液は、５０ｍＬ試験管内で、ＰＢＳ ４８．５ｍＬにウシ胎児血清 １ｍＬ及びアジ化ナトリウム溶液 ０．５ｍＬを添加することによって調製した。この溶液は４℃で保存した。このアジド保存溶液の貯蔵寿命は期限がなく、ＦＡＣＳ ＰＢＳの貯蔵寿命は１年である。ＦＡＣＳは、冷やして使用した。
1.19 ＦＡＣＳブロッカーの調製（５％ヒトＡＢ血清のＰＢＳ溶液、Ｃａ2+＆Ｍｇ2+無し）
これは、ＦＡＣＳ抗体染色反応で細胞の非特異的バックグラウンド染色を減少させるために使用した。滅菌ＰＢＳ（カルシウム＆マグネシウム無し、１ｘ、Virus Core Lab or JRH Biosciences カタログ番号59321-78P）で希釈した５％ヒトＡＢ血清（Sigma カタログ番号H-4522、−２０℃で保存、３７℃の水槽で解凍）を含有した。Ａｃｒｏｄｉｓｃ ０．４５μｍフィルター（Ｇｅｌｍａｎ ＃４１８４）で滅菌濾過して、１ｍＬずつ−２０℃で保存した。
1.20 ＦＡＣＳパラホルムアルデヒド固定液（ＰＢＳ、Ｃａ＆Ｍｇ無し、２％パラホルムアルデヒド）の調製
ＦＡＣＳパラホルムアルデヒドは、ＦＡＣＳ分析のために抗体染色した後、細胞を保存する固定溶液である。ＦＡＣＳ染色後、細胞を再懸濁するために濃度１％で使用すると、抗体の染色は少なくとも３日間安定に保持される。この後は、蛍光抗体によるバックグラウンドシグナルが増加する可能性がある。ＰＢＳ４０ｍＬと混合した１０％パラホルムアルデヒド（Polysciences ＃０４０１８）１０ｍＬを含有しており、４℃で保存した。細胞をＰＢＳ２００μＬに懸濁し、次にこの緩衝液２００μＬで固定して、作業濃度１％とした。
1.21 尿素細胞溶解緩衝液
尿素細胞溶解緩衝液は、ＤＮＡフェノール抽出用に細胞溶解物を調製するために使用した。水２００ｍＬに最終量として尿素（Boehringer-Mannheim 1685 899）８４ｇ、ＳＤＳ（USB 21651）４ｇ、０．２Ｍ ＥＤＴＡ １ｍＬ、１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基 １ｍＬ、１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ １ｍＬ、５Ｍ ＮａＣｌ １４ｍＬが含まれた。この溶液を０．４５μｍフィルターで濾過して、室温で保存した。
実験例２

第Ｉ相臨床試験
本発明者らは、ｉ）抗ＨＩＶ−１リボザイムを循環造血前駆細胞に導入することによって、ベクター配列を有する移植胸腺の発生がもたらされ得るかどうか、ｉｉ）正常なＴリンパ球の成熟が遺伝的に変更された細胞で行われるかどうか、ｉｉｉ）ベクターの存在及び発現が長期間続くかどうか、及びｉｖ）リボザイムによってＨＩＶ−１に敏感な細胞が優位に生存するかどうか（Amado et al. 1999）を調べるために、第Ｉ相遺伝子治療臨床研究を実施した。
細胞をリボザイム遺伝子で形質導入するために、ＲＲｚ２を使用した。ＲＲｚ２は、ＨＩＶ−１のｔａｔ遺伝子の保存性の高い領域を標的とするハンマーヘッド型リボザイムＲｚ２をコードする。Ｒｚ２をコードするＤＮＡ配列をｐＬＮＬ６（Bender et al 1987）のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏR）遺伝子の非翻訳領域内のＳａｌ−Ｉ部位にサブクローニングしてＲＲｚ２を作製した。このリボザイムは、ＲＲｚ２内のＭｏＭＬＶ ＬＴＲからｎｅｏ−リボザイム転写物として発現する。前駆細胞移植及びＴリンパ球分化に対する潜在的なリボザイム特異的効果を制御し、且つＲｚ２によってもたらされたＴリンパ球生存度に対する潜在的効果を研究するために、前駆細胞は又、対照レトロウイルスベクターＬＮＬ６で形質導入した。
この研究では、１０、０００コピー／ｍＬ未満のウイルス血症で、ＣＤ数が３００細胞／ｍｍ3と７００細胞／ｍｍ3との間であるＨＩＶ−１感染患者において、サイトカイン顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）で６日間末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）の動員を行った。患者に顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を毎日１０μｇ／ｋｇの用量で６日間皮下注射した。ＣＯＢＥ（登録商標）ＳｐｅｃｔｒａTM血漿交換システム（Gambrel BCT、Lakewood、CO）を使用してＧ−ＣＳＦ処理５日目及び６日目に１血液量の血漿交換を実施することによって、ＰＢＰＣ獲得を行った。ＣＥＰＲＡＴＥ（登録商標）ＳＣ 幹細胞濃縮システム（Cellar Inc. Bothell、WA）（患者１から患者７）及びIsolex 300i細胞選択システム（Noxell Therapeutics、Irvine、CA）（患者８から患者１０）を使用して、ＣＤ３４＋細胞の選択を実施した。ＣＤ３４表面マーカー発現のためにＰＢＰＣを精製した後、周期に導入するために巨核球増殖分化因子（ＭＧＤＦ）と幹細胞因子（ＳＣＦ）とのサイトカインの組み合わせを使用して細胞をＣＤ３４培養培地で一日だけ培養した（Aledo et al 1998）。ＭＧＤＦ及びＳＣＦはAmeg Inc.（Thousand Oaks、CA）から入手し、ＭＧＤＦは１００ｎｇ／ｍＬで、ＳＣＦは５０ｎｇ／ｍＬで使用した。
ほぼ等しい数のＣＤ３４＋細胞をＲＲｚ２及びＬＮＬ６ベクターで独立して形質導入した。ＬＮＬ６及びＲＲｚ２産生細胞株は、ｃＤＮＡ構築物、ｐＬＮＬ６又はｐＲＲｚ２をｐｓｉ２パッケージング細胞株にトランスフェクトすることによって２段階方法で調製し、２種類のエコトロピックな複製能のないウイルス集団を作製した。次にこれら２種類の集団を使用して、ＰＡ３１７アンホトロピックパッケージング細胞株に感染させた（Miller and Baltimore 1986）。Ｇ１４８で選択後に得られたクローン産生細胞株の構築物の強度を調べ、マスターセルバンクの作製、その後のＧＭＰグレードウイルスの作製及び安全性試験のためにBioReliance Corporation(Rockville、MD）に送った。レトロウイルス上清（ＬＮＬ６及びＲＲｚ２）のバッチ全ての繁殖不能性、複製能のあるレトロウイルス及び一般的安全性についてはBioReliance Corporationで調べられた。連続希釈を使用してＮＩＨ ３Ｔ３細胞株に感染させ、Ｇ４１８耐性を評価することによってウイルス力価を確かめた。ＬＮＬ６の力価は１．４ｘ１０7感染ウイルス粒子／ｍＬ、ＲＲｚ２の力価は０．８ｘ１０7感染ウイルス粒子／ｍＬであった。レトロウイルス上清（ＶＣＭ 形質導入混合物）を患者１から３には毎日１回２日間、患者４〜７には１日２回、患者８から１０には２日間かけて３回投与し、形質導入はヒトフィブロネクチンのＣＨ２９６断片（RetroNectinTM、Takara Shuzo、BioWhittaker、Inc. Walkersville、 MDから入手）でコーティングしたフラスコで実施した。インビトロでのＨＩＶ複製能を阻害するために、ＣＤ３４＋細胞の培養及び形質導入は、濃度５００ｎＭのネビラピン（Boehringer Ingelheim、Ridgefield、CT）の存在下で実施した。ＨＩＶが複製しないことは、最終的輸液においてＥＬＩＳＡでｐ２４抗原を測定することによって確認した（１０個の試料すべてについてｐ２４は検出不可能な濃度であった）。患者１０人全ての最終細胞生成物における真菌、細菌及びマイコプラズマ培養、並びに内毒素のアッセイは陰性であった。
形質導入の後、細胞を収集し、繁殖不能性、細胞数、生存度、ＣＤ３４／ＣＤ３８表現型、ｐ２４、及び内毒素を試験し、次に洗浄して骨髄抑制せずに自己受容患者に注入した。この処理計画を図５に例示する。試料は、その後ＣＦＣアッセイ、ＲＣＲ分析及びＰＣＲ分析で形質導入効率を試験するまでとっておいた。
１０人の患者をこの研究に登録した（表１）。年齢中央値は４２歳であった（範囲は３２歳から５９歳）。使用した抗レトロウイルス療法数の中央値は３であった（範囲は１から６）。注入したＣＤ３４＋細胞の総数は、体重１キログラム（ｋｇ）当り１．３から１０．１ｘ１０6個の範囲であった（中央値３．２＋／−１．１ｘ１０6細胞／ｋｇ）。硫酸プロタミンの存在下で実施した最初の３人の患者の形質導入効率は低く（＜１％から４％の範囲）、注入された形質導入ＣＤ３４＋細胞の数が０．０１から０．０８ｘ１０6細胞／ｋｇの範囲であった（表１）。導入遺伝子を有する細胞は患者１において６ヶ月まで検出され（骨髄及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるリボザイム、顆粒球におけるＬＮＬ６）、患者２では９ヶ月まで（ＰＢＭＣにおけるＲＲｚ２）及び患者３では１２ヶ月まで（ＰＢＭＣ中におけるＬＮＬ６及び単球におけるＲＲｚ２）検出された。
表１．患者及び注入したＣＤ３４＋細胞生成物の特徴。この表は、患者の年齢、性別、数、事前の抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）の数、形質導入を支持するレトロネクチンの使用、ＣＤ３４＋の純度、注入したＣＤ３４＋細胞の数、形質導入の割合、注入した形質導入ＣＤ３４＋細胞の数を示す。
Figure 2005528319
形質導入の効率を高めるために、その後の７人の患者にはヒトフィブロネクチンのＣＨ２９６断片の存在下で形質導入自己ＣＤ３４＋細胞を投与した（Hanenberg et 1997、Hanenberg et al 1996）。これらの患者では、形質導入効率の程度は中央値３２％＋／−６．９（範囲は７％から５７％）まで増加した（図６）。形質導入効率の計算は、形質導入したＣＤ３４＋細胞で競合ＰＣＲを実施することによって行った（Knop et al 1999）。効率は、最終的な形質導入ＣＤ３４＋細胞生成物から増殖した１個のコロニーのベクター配列についてＰＣＲを実施することによっても測定した。
平均して、ＬＮＬ６の形質導入効率はＲＲｚ２で得られた効率の１．６倍で、おそらくベクター力価の違いが反映されている。中央値で３０ヶ月（１２ヶ月から３６ヶ月の範囲）の追跡調査の後、全ての患者で複数の時点で複数の造血系統において導入遺伝子が検出された。平均して、分析したＰＢＭＣの０．１％から０．０１％において遺伝子の存在が認められた。
図７は、代表的な患者における長期間の多系列遺伝子の存在を示す。図７ａは、形質導入ＣＤ３４＋細胞を注入して２年後の患者５の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、骨髄単核球細胞（ＢＭＭＣ）、Ｔリンパ球及び単球におけるＬＮＬ６及びＲＲｚベクター配列を示す。Ｔリンパ球及び単球は、フローサイトメトリによって確認したところ、ＰＢＭＣから純度＞９０％で選択された。それぞれの細胞種の試料収集物を４連で示す。
本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＰＢＭＣにおける遺伝子構築物の発現も分析した。ＲＮＡは、Qiagen RNeasyキット（Valencia、California）を使用して、製造元の指示に従って、血液試料をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心することによって選択したＰＢＭＣから調製した。残存するＤＮＡをＤＮアーゼ消化によって除去した。ＲＮＡはGibco Superscript Reverse Transcriptase（Carlsbad、Calfornia）を使用して各試料について７連で逆転写した。次に試料を収集し、ｃＤＮＡ増幅を１０連で実施した。Promega Taqビーズ（Madison、WI）を使用して１回目のホットスタートＰＣＲを実施した。Perkin Elmer Ampliwax gem（Boston、MA）を使用して２回目を実施した。図７ｂは、放射標識プライマーを使用して、代表的な３人の患者にＬＮＬ６及びＲＲｚ２の両方を注入して２年後までのＰＢＭＣにおける短期及び長期のベクター発現を示す。試料それぞれについて、逆転写酵素を含有しない反応（−ＲＴ）を含めた。
形質導入されたＣＤ３４＋細胞がＨＩＶ感染患者においてＴリンパ球分化ができるかどうかを決定するために、末梢血ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞を未処置Ｔリンパ球の特徴であるＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌ表面マーカー発現について選択して、これらのＴリンパ球亜集団におけるＬＮＬ６及びＲＲｚ２の存在を分析した。
Ｒｚ２ベクター内のＲｚ２配列と重複するｎｅｏR遺伝子を標的とするプライマーを使用して、半定量ＰＣＲ分析を白血球サブセットで実施した。ＰＣＲ検出のために、Acest Polymer抽出方法（Ward et al 1998）を使用して細胞集団からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ比率の対照は、ＰＢＬ（陰性）ＤＮＡをバックグラウンドとしてＬＮＬ６＆ＲＲｚ２を１：５（ＬＮＬ６＝１）で形質導入したＣＥＭ Ｔ４細胞のＤＮＡをマーク細胞０．００５％の濃度まで希釈することによって構成した。次に、ネステッド（ホットスタート）ＰＣＲを５０μＬ ＰＣＲ反応混合物中で実施した。使用したプライマーは５Ｌ１Ａ：ＣＡＣ ＴＣＡ ＴＧＡ ＧＡＴ ＧＣＣ ＴＧＣ ＡＡＧ、３Ｌ２Ａ： ＧＡＧ ＴＴＣ ＴＡＣ ＣＧＧ ＣＡＧ ＴＧＣ ＡＡＡ、５Ｎｅｓｌ： ＧＡＴ ＣＣＣ ＣＴＣ ＧＣＧ ＡＧＴ ＴＧＧ ＴＴＣ Ａ（１回目のプライマー、５Ｎｅｓ１＆３Ｌ２Ａ、２回目、３Ｌ２Ａ、及び標識済み、５Ｌ１Ａ）であった。６８Ｃでのアニーリング及び９４Ｃでの変性を１７回行う１回目のＰＣＲを１試料当たり１０回行った。次に、１０回分の試料を収集し、温度６８Ｃでのアニーリング及び温度９４Ｃでの変性を３５回行う２回目のＰＣＲの鋳型として使用した。４種類の生成物試料を５％変性ＰＡＧＥゲルに溶解し、Molecular Dynamics Imagequantソフトウェアを使用して定量した。ＬＮＬ５及びＲＲｚ２のＰＣＲ生成物はそれぞれ１７５塩基対及び２１６塩基対で、ｎｅｏR遺伝子の非翻訳末端部分が含まれる。比対照が許容限界内であれば、結果を含めた（０．００５％ベクター含有試料では、ＬＮＬ６：ＲＲｚ２の比は１：３．５、許容範囲は１：１．１から１：６．９であった）。
図７ｃは、未処理Ｔリンパ球において検出されたベクター配列を示す。このゲルは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球、及び形質導入ＣＤ３４＋細胞を注入して２年後の患者７人の末梢血から選択された未処理Ｔリンパ球サブセットにおけるＬＮＬ６及びＲＲｚ２ベクター配列のＰＣＲ分析を示す。未処理Ｔリンパ球集団をＣＤ４及びＣＤ８選択集団から純度＞９０％まで選択した。ＣＤ３及びＣＤ１４ MACS MicroBeads（Miltenyi Biotec Inc.、Auburn、CA）を使用して、ＰＢＭＣからＴリンパ球及び単球を選択した。未処理Ｔリンパ球は、ＦＩＴＣ複合モノクローナルＩｇＧ1抗ＣＤ４５ＲＡ抗体（Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ）で染色し、抗ＦＩＴＣ Multisort キット（Miltenyi Biotec Inc.、Auburn、CA）を使用して選択することによって選択した。その後、ＣＤ６２Ｌの選択は、マウスＩｇＧ2a抗ＣＤ６２Ｌ抗体（Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ）を使用し、ラット抗マウスIgGa+b MicroBeads（Miltenyi Biotec Inc.、Auburn、CA）で選択することによって実施した。
図７（Ｄ）は、患者５の２．５年後の未処理Ｔ細胞サブセットで検出されたベクター配列を示す。
図７（Ｅ）は、患者７の２年後の未処理Ｔ細胞サブセットで検出されたベクター配列を示す。
図７（Ｆ）は、患者８に注入して４週間後の未処理Ｔ細胞サブセットで検出されたベクター配列を示す。
図８は、注入して３年後までの１０人の患者全ての骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）、ＰＢＭＣ、顆粒球、Ｔリンパ球及び単球における半定量ＰＣＲによるリボザイム及び対照ベクター導入遺伝子の検出をまとめて示す。
１０人の患者全員に、形質導入終了時にウイルス上清及び培養したＣＤ３４＋に富んだ細胞の両方を使用して、複製可能レトロウイルス（ＲＣＲ）の生物学的アッセイを行ったところ、陰性であった。最終的な細胞輸液のＲＣＲ試験は、形質導入終了時に培養上清の５％に対して、及び形質導入したＣＤ３４＋細胞の１％に対して、Ｍｕｓ ｄｕｎｎｉ細胞株で共培養して、２継代増幅段階を用いて実施した。次に、得られたＭｕｓ ｄｕｎｎｉ細胞培養上清の感染性レトロウイルスについて、ＰＧ４ Ｓ＋Ｌ−フォーカスアッセイを使用して試験した。ＣＤ３４＋細胞注入して６ヶ月後及び１年後のＲＣＲについて患者ＰＢＭＣ試料をＰＣＲ分析したところ、ＲＣＲの証拠はないことが明らかになった。患者細胞でＲＣＲを検出するために、形質導入ＣＤ３４＋細胞を注入して６ヶ月後及び１年後にＰＢＭＣから抽出したＤＮＡに存在するアンホトロピックエンベロープ配列を以下のプライマー、５’−ＣＴＡ ＴＧＴ ＧＡＴ ＣＴＧ ＧＴＣ ＧＧＡ ＧＡ−３’及び５’−ＣＣＡ ＣＡＧ ＧＣＡ ＡＣＴ ＴＴＡ ＧＡＧ ＣＡ−３’を使用して分析した。このアッセイによって、アンホトロピック受容体による細胞感染に必要なエンベロープ遺伝子の宿主決定領域の一部をコードする高度に保存された領域を増幅することによって、複製可能レトロウイルスの検出が可能になる。増幅された領域の長さは、２８９塩基対である。このアッセイは、１０5陰性細胞のバックグラウンドにおいて１個の陽性細胞に対する感度を有する。陽性対照として、アッセイそれぞれにＰＡ３１７パッケージング細胞株を含めた。ＰＣＲ生成物は、２．５％Ｎｕｓｉｅｖｅゲルに溶解した。
両ベクターについて、注入した形質導入ＣＤ３４＋細胞の数とＰＢＭＣ（ＬＮＬ６ ｐ＝０．０２１、ＲＲｚ２ ｐ＝０．０２４）及びＴリンパ球（ＬＮＬ６及びＲＲｚ２の両方についてｐ＜０．００１）に注入して２年後の遺伝子検出における保持との間には強い線形相関が認められた。スピアマンの順位相関を使用して、再導入された形質導入細胞の数と子孫ＰＢＭＣ及びＴリンパ球のその後のマーキングとの間の関係を明示した。分析は、各患者の細胞／ｋｇで与えられた値に基づいた。これらの分析において、ＬＮＬ６マーキングは再導入されたＬＮＬ６形質導入細胞の量と相関しており、ＲＲｚ２マーキングは再導入したＲＲｚ２形質導入細胞の量と相関していた。１年以上マーキングをもたらす形質導入ＣＤ３４＋細胞の最低数は、０．５ｘ１０6細胞／ｋｇであった。
ベクター配列は未処理細胞に注入して２．５年後まで検出された（評価した最終時点）。例えば、図７ｃは代表的患者において非常に富んだ未処理細胞におけるベクター配列の存在を示す。
ベクター配列は、未処理細胞に注入してから最長３年検出された。（評価した最終時点）。図７Ｄ〜Ｆは、３人の患者に注入して４から１３０週後の非常に富んだ未処理記憶細胞におけるベクター配列の存在を示す。未処理Ｔリンパ球が検出可能なベクター配列を有する患者の平均年齢は４１歳（３２歳から４８歳の範囲）で、患者へのウイルス添加量は３６８０コピー／ｍＬ（範囲：検出不可能量から２２６２８コピー／ｍＬ）であった。ベクター検出の概要はナイーブＴリンパ球であり、検出時のウイルス量が表２に示されている。また、４人の患者のリンパ節から微小針で吸引して、ベクター配列の存在を分析した。ＬＮＬ６及びＲＲｚ２の両方が４人の患者のうち２人で検出された（患者７では注入して２．５年後、患者１０では注入して１年後）。
表２−未処理Ｔ細胞ベクター検出の概要
循環未処理Ｔリンパ球集団は、ＣＤ４及びＣＤ８選択集団から＞８５％の純度まで選択した。細胞は、ＰＣＲによって分析した。ベクター分析時点で負荷されているウイルス量は、それぞれの印の下に示す。ＮＤ：測定せず。２個の値は、時間を空けて２個の測定値が得られたことを示す。ＮＴ：試験せず。（＋）：ＬＮＬ６、ＲＲｚ２又はその両ベクターはＣＤ４＋ＣＤ４５＋ＣＤ６２Ｌ＋又はＣＤ８＋ＣＤ４５＋ＣＤ６２Ｌ＋（未処理）Ｔリンパ球で検出された。（−）：ＣＤ４又はＣＤ８未処理Ｔ細胞ではいずれのベクターも検出されなかった。
Figure 2005528319
ＣＤ４＋細胞中に抗ＨＩＶ−１リボザイムが存在するとＨＩＶ感染に対する防御が得られるかどうかを決定するために、様々な細胞種で時間を追ってＰＣＲでＬＮＬ６及びＲＲｚ２ベクターのコピー数を測定した。構造間でマーキング減衰速度の比較を混合効果回帰として実施した（Miller、1986）。マーキング強度と（ａ）注入からの（ｌｏｇ）時間、（ｂ）細胞種の指標、及び（ｃ）時間ｘ細胞種相互作用期間（増殖生成物）とは回帰関係にある。推定アルゴリズムは一貫して収束したので、これらのデータに対して混合線形モデル分析を実施した（モデルはSAS PROC MIXEDにフィットさせる）。マーキング強度の患者間の相関は、データの「対応のある」ブロッキング構造を使用してモデル化した。これらの分析を通して、残差に対して非構造分散共分散行列を使用するか、又は複合対称行列を仮定してモデルを当てはめた。実質的に同一な変数を推定して、それぞれの種類の分析から有意性検定を明らかにした。
ＨＩＶに感染しやすい細胞種において、ＨＩＶ誘導性欠失を受けていない細胞種よりＲＲｚ２マーキングの保持濃度が高いことは、ＲＲｚ２形質導入細胞を選択的に優位に生存させるＲｚ２によって誘導される保護と一致している。
図９ａで示したように、ＲＲｚ２マーキングはＢＭＭＣよりも末梢血Ｔリンパ球において約８分の１の速度で減衰する（Ｔリンパ球ではｌｏｇ−週当たり−０．０８１細胞であるのに対してＢＭＭＣではｌｏｇ−週当たり−０．６４３細胞、差ｐ＝０．００９５）。ＲＲｚ２含有ＢＭＭＣの減衰速度とは異なり、ＲＲｚ２含有Ｔリンパ球の減衰速度はゼロと有意には異なっておらず、両速度の差は有意であった（ＢＭＭＣではｐ＜０．０００１、Ｔリンパ球ではｐ＝０．５５、両細胞種間のＲＲｚ２含有細胞の減衰速度を比較する統計試験ではＰ＝０．００９）。これらの結果が細胞種間の内因的減衰速度の差によるものであることを排除するために、ＬＮＬ６マーキングを図９ｂに示す。この分析によって、ＬＮＬ６コピーの減衰速度はＴリンパ球では−０．７１６で、ＢＭＭＣでは−０．７２５であることが示された。両曲線は、ゼロ減衰速度曲線と有意に異なっていた（Ｔリンパ球のｐ値は０．００１９で、骨髄のｐ値は０．００４であった）。両細胞種の間のＲＲｚ２減衰速度を比較した統計学試験のｐ値は０．９７で、ＬＮＬ６ベクターの減衰キネティックスに近似していることを反映している。これらの比較は、混合効果回帰モデル（Miller 1986）として実施した。ＬＮＬ６によってＨＩＶに対する防御活性が与えられないことと一致して、これらの細胞種の間ではＬＮＬ６マーキングの減衰には差が認められなかった（ｐ＝０．９７８１）、（図９ｂ）。これらの結果は、ＰＢＭＣ及びＴリンパ球でＲＲｚ２では２種類のベクターの間でマーキング減衰の統計学的有意な差が認められたが、ＢＭＭＣ及び顆粒球の場合、ベクター間では同等の減衰速度が認められたことを示す。さらに、ＲＲｚ２含有無処理Ｔリンパ球は時間につれて増加したのに対して、ＬＮＬ６含有Ｔリンパ球は減退した（ＲＲｚ２及びＬＮＬ６はそれぞれｌｏｇ週当たり＋０．１４５対−０．２４０、差ｐ＝０．０３３）。これらの結果によって、最近の胸腺移植を含めて、ＲＲｚ２はＨＩＶ−１感染患者においてＨＩＶに敏感な細胞を選択的に優位に生存させることを示唆している。
次に、ＬＮＬ６及びＲＲｚ２を含有するＴリンパ球の間で異なる減衰の大きさが各患者に投与したＲＲｚ２−形質導入ＣＤ３４＋細胞の数と相関するかどうかを測定しようと努めた。この目的のために、各患者の両ベクター間の減衰勾配の差は、注入したＲＲｚ２−形質導入ＣＤ３４＋細胞の数と相関した。ＬＮＬ６及びＲＲｚ２マーキングの患者特異的減衰勾配は、直線回帰によって算出し、勾配の差（ＲＲｚ２−ＬＮＬ６）はＲＲｚ２による防御の指標とした。スピアマンの順位相関を使用して、減衰速度の差と注入した形質導入ＣＤ３４＋細胞の数との関係を調べた。）。
このＴリンパ球及びＰＢＭＣと減衰勾配との関係を示すプロットをそれぞれ図９ｃ＆ｄに示す。これらの分析によって、注入した形質導入ＣＤ３４＋細胞の数とＰＢＭＣ及びＴリンパ球の両方におけるＬＮＬ６対ＲＲｚ２の減衰の差の大きさとの間には強い直線関係があることが示された。再注入したＲＲｚ２形質導入ＣＤ３４＋細胞数を連続的に変化させると、回帰分析によって時間につれてマーキング減衰が異なることが予測され、結果はｐ＜．０００１で統計学的に有意であった（（対数）時間、注入した細胞数、及びそれらの生成物項の相互反応とマーキングの違い（ＲＲｚ２−ＬＮＬ６）との回帰分析における相互作用項の回帰係数ｔ統計量）。これらのデータは、防御されたＨＩＶ−１に敏感な細胞と防御されていないものとの間の生存の違いに対して、予期しない用量依存性効果があること、及び造血前駆細胞遺伝子治療計画を使用した臨床上の利益が患者に投与した形質導入前駆体の用量に依存することを示している。
この第Ｉ相試験の患者は全て、抗レトロウイルス治療を受けており、今までどの患者も日和見感染は発症していなかった。ＣＤ３４＋細胞数及びウイルス負荷量のキネティックスを図１０に示す。動員期間中に抗レトロウイルス治療を中断した患者の中には、注入１日後に初期のウイルス添加量の増加が認められた。薬物の中断又は非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤又はプロテアーゼ阻害剤とヌクレオシド逆転写酵素阻害剤との置換を、形質導入中のＭＭＬＶ逆転写酵素の阻害能を妨害する実験計画に含めた（H.Bazin、et al.、1989）。抗レトロウイルス治療の変更に応答してウイルス血症の発生が時折生じた。
開始から３年までのＣＤ４＋Ｔリンパ球数の平均変化は、ｍｍ3当たり１０細胞（−４０から＋８０の範囲）の増加であった。ウイルス負荷量は６人の患者で平均２．２５ｌｏｇ減少し（０．３５から３．９の範囲）、３人の患者では検出不可能なままであり、１人の患者で１ｌｏｇ増加した。これらの変化は、任意の細胞種におけるベクター検出の程度又はベクター発現の持続とは相関せず、個々の患者の抗レトロウイルス治療に対するウイルス感受性によって影響を受けるものと考えられる。
ウイルスの遺伝子型同定によって、患者全ての多剤耐性変異が示された（データは示さず）。本発明者らは、研究開始時及び処理して１２、２４、５２、及び１０４週間後にＨＩＶのＲｚ２結合／切断領域の遺伝子同定分析も患者全員に対して実施した。リボザイム切断部位の分析は、既に記載された通りではあるが少し変更を加えて実施した（Wang et al. 1998）。簡単に説明すると、ウイルスＲＮＡを抽出し、Access RT-PCRキット（Promega、Madison、WI）でプライマー１（ＴＧＧＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＣＡＣＴ）を使用して４８℃で４５分間逆転写した。得られたｃＤＮＡにプライマー２（ＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＣＴＴＡＡＧＡＡＴＧＡ）を添加して２５回（９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で３０秒）ＰＣＲ増幅した。サイクルシークエンシング用の１本鎖ＤＮＡは、ＡｍｐｌｉＴａｑ（Perkin-Elmer）及びプライマー３（ＡＧＴＴＴＴＡＧＧＣＴＧＡＣＴＴＣＣＴＧＧ）を使用して９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で３０秒を２５回繰り返す第２ＰＣＲ段階によって生成した。精製したＰＣＲ生成物の配列決定は、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer）を備えたABI PRISM Dye termination cycle sequencing Ready Reactionキットで、自動化ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ モデル ３７７、Applied Biosystems、Foster City、CA）で、プライマー４（ＴＧＧＡＡＧＣＣＡＴＡＡＴＡＡＧＡＡＴ）を使用して実施した。配列比較は、Sequence Navigatorソフトウェア（Perkin-Elmer）を使用して実施し、手動で校正編集した。得られた配列をＨＸＢ２クレードＢ ＨＩＶ−１参照株と比較した。
１０人の患者のうち６人は、配列決定を可能にするウイルスが負荷されていた。患者１、２、５及び６は、野生型配列を有していた。患者４はＧＵＡ標的３配列から−１の位置にＡからＣへの変異があった。患者７は、ＧＵＡ標的３配列から−４の位置にＧからＴへの変異があった。証拠が示すところによると、変異ＲＮＡはリボザイムによって明らかになる。これらの両患者で検出された変異は、処理前に存在していた。したがって、効力によってこれらは構造に誘導された耐性の結果として生じたのではなかった。
ここで説明した研究は、骨髄抑制しないで実施されたので、操作したＣＤ３４＋細胞はキメラ造血系の形成に関与した。形質導入ＣＤ３４＋細胞は、造血再構成のために内在する幹細胞と競争しなければならない。実際に、本発明者らの結果は、細胞投与量と形質導入細胞の移植期間との間に相関があることを示している。形質導入ＣＤ３４＋細胞の濃度によって生存上の利点が生じることは期待できないので、注入したＣＤ３４＋細胞の数に対する生存の相関が確立されたので、将来の研究は投与する遺伝子変更細胞の数を増加させることを目的とする。近年、ヒト重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）−Ｘ１疾患の特徴であるγｃサイトカイン受容体欠如を遺伝子的に修正することによって、免疫機能系の発達がもたらされることが報告された（Cavazzana-Calvo et al. 2000）。遺伝子による修正計画の適用に関して、ＨＩＶ感染モデルは、ＳＣＩＤ−Ｘ１とは異なっている。形質導入ＣＤ３４＋細胞及び非形質導入ＣＤ３４＋細胞の両方が胸腺形成に関与することができるＨＩＶ／ＡＩＤＳの設定とは異なり、ＳＣＩＤ−Ｘ１の場合では、生じた機能受容体は生存シグナルを媒介し、胸腺形成は外因性遺伝子を含有するＣＤ３４＋細胞のみから得られる。したがって、ＨＩＶ感染では、これらのリボザイムを有する細胞の増大をもたらすＣＤ４＋Ｔ−リンパ球の濃度では、おそらくＨＩＶ複製の存在下で優位な生存が引き起こされるだろう。この場合、防御されていない細胞は敏感なままなので、ウイルスは生存選択圧をもたらす。患者等は抗レトロウイルス治療を続けていたので、本研究ではこの仮説を試験しなかった。ウイルスの複製を制御しないと、より優先度の高い生存が生じる可能性がある。
これらの研究によって、遺伝子構築物はレトロウイルスによってＣＤ３４＋造血前駆細胞に導入されることが可能で、これらの細胞はＨＩＶ感染患者において長期間の複数系統造血に関与することが示された。本発明者らの研究は、ＨＩＶ感染における幹細胞遺伝子治療試験の２番目の報告である。小児患者においてｒｅｖ−反応性要素デコイ遺伝子を含有するレトロウイルスベクターを使用した以前の試験では、細胞注入１日目の時のみに４人の患者のうち２人において抗ＨＩＶ遺伝子が検出された。対照ベクターは、注入後３０日目に４人の患者全てにおいて低濃度で検出され、９０日目では３人の患者に、２５０日目及び３３０日目には患者１人で検出された（Kohn et al. 1999）。これらの結果は、我々の長期の再構成の結果と対照的である。我々の結果に基づいて、以前の報告で認められたマーキングが短期であるのは、少なくとも部分的には投与した形質導入ＣＤ３４細胞の用量が少ないためであると考えられる。形質導入Ｔリンパ球を使用した以前のＨＩＶ遺伝子治療研究では、対照ベクターと比較して治療用ベクターが注入後１年までの長い間保持されることが示されたが、我々の報告はＨＩＶ感染の状況では遺伝子的に変更した造血前駆からＴリンパ球の分化が長期間続くことを示し、且つＨＩＶ誘導性欠如に対する未処理記憶Ｔリンパ球の細胞防御の証拠を示した最初の報告である。未処理胸腺はＨＩＶによって感染することが知られており（Ostrowski et al. 1999）、この胸腺はＴリンパ球の分化中にＨＩＶ−１潜伏源として働き得るとするならば（Brooks et al. 2001）、導入遺伝子含有未処理Ｔリンパ球の持続産生がウイルス血症の検出され得る患者であっても生じるという発見は重要である。胸腺形成は成人患者でも継続するので、この未処理Ｔリンパ球をベースとした潜伏収集物をウイルス複製を効果的に阻害するように操作された細胞と置換すると、防御免疫細胞の回復及び抗レトロウイルス治療を中止した後、又は薬剤耐性が生じた後のウイルスの反動の阻害が引き起こされる。単球などのその他のウイルス貯蔵場所にリボザイム配列が存在すると又、これらの設定においてウイルス複製の制御に関与することが可能である。このような結果によってさらに、抗ＨＩＶ治療の形態としての抗ＨＩＶ幹細胞遺伝子輸送の探索の正当性が証明される。
実験例３
：使用した特異的方法
３．１ マイコプラズマアッセイ
培養して形質導入した後、採集した細胞培養物のマイコプラズマを試験した。使用した方法は、ＰＣＲによるマイコプラズマ特異的ＤＮＡ配列の増幅及びその後のＥＬＩＳＡによる単位複製配列の検出に基づいている。この方法では、Mycoplasma PCR ELISA試験キット（Boehringer Mannheim、カタログ番号1 663 925）を使用した。試験試料（１ドナー当たり１試料）及び陰性対照試料（５％ヒト血清アルブミンを含有する新鮮ＲＰＭＩ培養培地１ｍＬ）を４℃で微量遠心管で最大限の速度で１０分間遠心して、いかなるマイコプラズマも沈降させた。ペレットを溶解するために、滅菌水１０μＬ及び細胞溶解試薬（キットの溶液１）１０μＬを添加した。キットの指示に従ってさらに加工を実施した。ＰＣＲ方法における試料及び試薬の相互汚染は、ピペット操作段階全てに新しいエアロゾルチップを使用することによって回避した。各実験には２種類の陰性対照及び陽性アッセイ対照を含めた。ＰＣＲ増幅では、９５℃で５分を１回、９４℃で３０秒、６２℃で３０秒、７２℃で１分を３９回、最後に７２℃で１０分を使用した。製造元の指示に従ったＥＬＩＳＡ段階の後、もし陰性対照のＡ450〜Ａ690単位が０．２５より低く、アッセイを反復しないならば、その陰性対照を受容した。もし陰性対照よりも吸光度Ａ450〜Ａ690単位が０．２よりも高ければ、試料はマイコプラズマ汚染の陽性対照としてみなした。
３．２ 内毒素アッセイ
培養物中に存在する内毒素の濃度が低いとグラム陰性微生物によって既に汚染されている可能性を示しており、第２に高濃度の内毒素は培養細胞に毒性であるという２つの理由のために、内毒素の存在は、培養及び形質導入後の細胞培養物中で測定した。このアッセイは、形質導入後、注入の前の収集の日に実施した。アッセイはQCL-1000 Limulus Amebocyte Lysateキット（BioWhittaker #50-647U）を使用して、製造元の指示に従って実施した。２５％氷酢酸から成る停止溶液は、BioWhittakerキットに入っていないので調製した。１キットは5人の患者の培養物に十分であった。結果は、Softmaxソフトウェアで分析した。希釈した注入試料又は希釈したVCM試料の結果が５ＥＵ／ｍＬより大きい場合、注入を続行した。希釈していない注入試料又は希釈していないVCM試料の結果が０．３ＥＵ／ｍＬより大きい場合、注入バッグ内での細菌による汚染の可能性の確証を得るために、グラム染色の結果を参照した。それ以外は注入を続けた。
３．３ グラム染色
グラム染色を使用して、注入前の細胞培養物中のグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌を試験した。陽性対照及び陰性対照を組み入れた品質管理したスライド（Fisherbrand Gramv QCスライド カタログ番号08-80）及びFisher diagnositcs Gram Stain Set（カタログ番号ＳＧ １００Ｄ）は、製造元の指示に従って使用した。それぞれの注入混合物の試料５μＬをスライド上に均一に塗った。染色後、浸漬油を使用してスライドを対物１００ｘで調べた。グラム陽性Staph.aureusを含有する「＋」と印した第１のカラムの対照の四角内には、暗紫色の丸い点が出現した。グラム陰性Ｅ．ｃｏｌｉを含有する「−」と印された第１のカラムの対照の四角内には、赤みを帯びたピンク色の点が出現した。これらの対照がこのようにならなければ、染色を繰り返した。注入試料が対照のように見える物体を含有していれば、注入は行わなかった。培養細胞は、比較的大きな対象物として表れ、細胞膜は青白い薄い断片として表れた。
３．４ ＲＣＲ試験用の共培養、増幅試料の調製
患者のレトロウイルス形質導入細胞及び形質導入した細胞の培養上清の複製可能なレトロウイルス（ＲＣＲ）を試験した。米国食品医薬品庁（ＦＤＡ）の要請に従って、それぞれの患者につき形質導入した患者細胞総数の１％又は１０8（いずれも少ない）をMus dunni共培養アッセイで試験して、形質導入細胞の培養上清の５％をMus dunni増幅アッセイで試験した。これらのアッセイは、BioReliance Corp.（以前は、MA BioServices Rockville、Maryland、USA）で実施した。これらのアッセイ用の試料は注入用に細胞を採集及び調製したときに採取し、全ての患者の形質導入／収集方法が完了するまで保存し、その後試験のために送付した。
増幅したＲＣＲ試料は、以下の通りに保存用に調製した。最終的に採集したＣＤ３４＋細胞の上清試料は３連で調製し、透明な上清の部分から構成された（試験管当たり総量の５％）。最終的な患者増幅試料を収集するまで、−８０℃で保存した。試料当たり各ＣＤ３４＋細胞バッチの２％を使用して、２連のＲＣＲ共培養試料を保存用に調製し、凍結保存培地に再懸濁した。次に、送付するまで試料を液体窒素で保存した。BioReliance Corp.laboratoriesで正確な数の生細胞で試料の解凍を実施するために十分な数の細胞を含めた。
３．５ 血漿／ＰＢＭＣ／骨髄の単離
注入前及び注入後少なくとも３年までの様々な時点でのスクリーニング時に、血液試料及び骨髄試料を患者から収集した。血液を１０ｍＬＡＣＤ試験管に収集し、必要な試験に応じて量を収集した。これらの血液試料から、血漿を収集し、ＰＢＭＣを細胞ペレット又は凍結保存試料として調製した。ＢＭＭＣを骨髄から調製して、ＣＦＣアッセイ用に新たに使用し、残りを凍結保存した。使用した方法は以下の通りである。
血漿の収集：採血管（１０ｍＬ、ACD-A vacutainer）を１０分間２０００ｒｐｍで遠心した。各試験管の血漿画分を注意深く収集し、５０ｍＬ滅菌試験管に集めた。血漿を２ｍＬ量ずつ分割して、−８０℃で保存した。
ＰＢＭＣの調製：血漿収集後の赤血球／白血球細胞ペレットを使用して、洗浄緩衝液で細胞を最初の開始量の３倍まで希釈し、５０ｍＬ遠心管に３０ｍＬロットずつ分注した。各希釈細胞懸濁液にFicoll-Paque（Pharmacia カタログ番号17-0849-03）を入れ、スイングバケットロータで２００ｒｐｍで２０℃で２０分間遠心した。上層を吸引して、界面に単核球細胞層が攪乱しないように残した。この界面の細胞を新たな５０ｍＬ試験管に移し、適切ならば集めて、洗浄緩衝液で洗浄して、１５００ｒｐｍで１５分間遠心して、洗浄緩衝液５〜１０ｍＬにペレットを再懸濁した。生細胞の計数は、血球計数器及びトリパンブルー（１：２５に希釈）を使用して細胞混合物５０μＬについて実施した。細胞を試験管当たり１〜２ｘ１０6細胞に分割して、必要であれば凍結保存し、尿素細胞溶解緩衝液１４０μＬで細胞溶解した。凍結保存のため、細胞をＰＢＭＣ凍結保存培地１ｍＬ当たり１〜５ｘ１０6細胞で再懸濁して、保存のために液体窒素でゆっくり冷却した。
骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）の調製：骨髄を洗浄緩衝液で１：１に希釈して、３０ｍＬ試料にＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを添加し、ＰＢＭＣ用に前述のように処理した。生細胞の計数は、３０μＬ試料について実施し、ＣＦＣアッセイに必要な量（２．５〜３ｘ１０6細胞）をアッセイ用に取っておいた。残りのＢＭＭＣは全てＣＤ３４＋凍結保存培地１ｍＬ当たり１ｘ１０7細胞で凍結保存した。
３．６ スクリーニング試料骨髄ＣＦＵアッセイ
注入前に患者の骨髄についてＣＦＵアッセイを実施し、それによって注入後に実施するその他のコロニーアッセイ全ての基準又は対照とした。細胞は遺伝子による治療又は制御に曝露されていないので、Ｇ４１８では選択しなかった。全ての操作は生物学的封じ込めフード内で実施され、あらゆる時点で無菌技術を適用した。
前述のように調製したＢＭＭＣを分割して、３本の１．５ｍＬ滅菌微量遠心管それぞれに遠心管当たり１．５ｘ１０6細胞、７．５ｘ１０6細胞、及び３ｘ１０5細胞入れた。この試料を２５００ｒｐｍで２分間遠心して、培地を吸引し、細胞ペレットをＲＰＭＩ（Gibco BRL、カタログ番号118-030）＋１％ＦＢＳ（Stem Cell technologies、カタログ番号ＨＣＣ−６４５０）３００μＬに十分に再懸濁させた。この細胞混合物をそれぞれMethocult GFH4434（Stem Cell technologies、カタログ番号HCC-4434）３ｍＬを含有する遠心管（６ｍＬポリスチレン Falcon、カタログ番号2058）にピペットで入れた。この内容物を少なくとも１５秒間十分にボルテックスして、泡が落ち着くまで静置し、１．１ｍＬずつペトリ皿内に配置した格子付き皿（Nunc カタログ番号174926）に注意深く入れた。このペトリ皿にはさらに、培養中湿度を維持するため蓋をあけた滅菌水を含有する格子付き皿を入れた。格子付き皿を入れたペトリ皿を加湿インキュベータ内で３７℃でインキュベートすると、１０〜１４日後にコロニーが認められた。
３．７ 注入後のＣＦＣアッセイ
注入後のコロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイには、Ｇ４１８を有する、及び有さない培養物を含めた。これを使用して、注入後の形質導入前駆細胞の分化を調べた。２種類の細胞数／皿を使用して、採取時に最適なコロニー密度を確保した。
ＢＭＭＣは前述のように調製し、６ｘ１０5個又は１．５ｘ１０6個の細胞を滅菌微量遠心管に分割した。この細胞を約２５００ｒｐｍで２分間遠心してペレットにした。培地を吸引し、細胞ペレットをＲＰＭＩ＋１％ＦＢＳ６００μＬに十分に再懸濁させた。各細胞混合物３００μＬをMethocult GFH4434（Stem Cell Technologies、カタログ番号ＨＣＣ−４４３４）３ｍＬを含有する試験管に添加し、１本にはＧ４１８（Ｇ４１８、結晶化ジェネテシン、Gibco-BRL カタログ番号11811-031）を０．９ｍｇ／ｍＬで添加し、もう１本にはＧ４１８を添加しなかった。次に、試料をボルテックスして、さらにスクリーニング試料骨髄ＣＦＵアッセイのために前述のように処理した。
３．８ 血液からのＴ細胞、単球及び顆粒球の調製
注入後様々な時点で患者の血液から白血球を単離した。これらの細胞を３種類（Ｔ細胞、マクロファージ及び顆粒球系列）に分画し、ＲＲｚ２又はＬＬＮ６の存在及びＨＩＶ濃度を調べた。血液はまず１段階Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｓで赤血球、顆粒球、及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に分離した。ＰＢＭＣはさらに、２本のカラムで分画した。ＣＤ３カラムからは、リンパ球が得られ、ＣＤ１４カラムからは単球が得られた。顆粒球画分の純度をギムザ染色で評価し、リンパ球及び単球画分はＦＡＣＳ染色することによって純度を評価した。その後のＤＮＡ抽出及びＰＣＲ分析用の細胞溶解物を調製するために、全画分を処理した。
方法は全て第ＩＩ相生物学的封じ込めキャビネット内で実施した。１０ｍＬの試験管にＡＣＤで血液凝固阻止した新鮮なヒト血液５ｍＬを収集して、室温で維持し、２時間以内に１段階Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｓ（Accurate Chemical & Scientific Corporation、カタログ番号ＡＮ２２１７１０、室温で保存し、遮光する）３．５ｍＬに添加した。
これらの試験管をスウィングバケットロータで室温で１６５０ｒｐｍで３０分間遠心した。遠心後、２本の白血球のバンドが認められた。血漿／１段階界面にある上部バンドは、単核細胞から成り、下部バンドはＰＭＭ細胞（顆粒球）から成っていた。赤血球はペレットになった。約１ｍＬを除く全ての血漿を吸引して、「血漿」試験管に移して、界面に攪乱しないように単核細胞層を残した。収集した血漿を全て患者毎に集めて、２ｍＬロットずつに分割して、後の顆粒球染色調製用に取っておいた。下部バンドを採取しないように注意して、界面のＰＢＭＣ細胞を注意深く「ＰＢＭＣ」試験管に移した。収集したＰＢＭＣ全てを患者毎に集めた。下部バンドを「顆粒球」試験管に移して、収集した。等量の低張ＰＢＳを顆粒球試験管に添加した。「ＰＢＭＣ」及び「顆粒球」の両試験管に洗浄緩衝液を５０ｍＬまで充填して、混合して、室温で１５００ｒｐｍで１５分間遠心した。上清を吸引して、細胞を１回洗浄緩衝液５０ｍＬで洗浄した。ペレットにした後、細胞をＰＢＳ１０ｍＬに再懸濁した。細胞の計数を実施した（ＰＢＭＣ細胞懸濁物は１：２０に希釈し、顆粒球懸濁物は１：５に希釈した）。
顆粒球細胞ペレット／溶解物の調製及び表現型決定：元の懸濁物又は細胞ペレットを最終濃度１ｘ１０7細胞／ｍＬに再懸濁して、必要であれば細胞をまず再度ペレットにした。１００μＬを表現型染色用に微量遠心管に移した。これらの細胞を微量遠心管で１分間約３０００ｒｐｍでペレットにし、血漿画分１０μＬに懸濁して、この濃縮懸濁物５μＬを２枚の顕微鏡スライドそれぞれに塗った。このスライドを空気乾燥して、ギムザ染色で３０分間染色して、蒸留水で洗浄して、空気乾燥した。対物２０ｘで調べて、顆粒球画分を計数した。残りの顆粒球細胞は後でＤＮＡ抽出するために微量遠心管で約３０００ｒｐｍで２分間ペレットにした。
３．９ 細胞からのＤＮＡ調製（採血管−フェノール ＤＮＡ）
採血管（Hemogard、SerumSep、６ｍＬ。カタログ番号369789）をいくつかのＤＮＡ抽出用に使用した。これは、ＣＤ３４選択細胞、メチルセルロースコロニー及び患者ＰＢＭＣからゲノムＤＮＡを抽出する迅速な方法である。微量遠心を用いて、１．５ｍＬ微量遠心管に入れた１００万又は２００万の細胞を３０００ＲＰＭで３分間沈降させ、ＰＢＳ１ｍＬで１回洗浄し、次に水７０μＬで分散させた。尿素細胞溶解緩衝液１４０μＬを各遠心管に添加して、遠心管を５回から８回ボルテックスすることによって十分に相混合した。これらの遠心管は、−７０℃で無期限に凍結維持することができる。それぞれの試料について、フェノール溶液０．５ｍＬ（トリス平衡化United States Biochemical ＃20083，４００ｍＬ当たりヒドロキシキノリン半硫酸塩０．４ｇを添加）を添加して、この混合物を２３又は２５Ｇ針を付けた１ｍＬシリンジを使用して２又は３回ポンピングし、次に水２１０μＬを含有したヴァキュテイナーに噴出した。次にクロロホルム１５μＬを各ヴァキュテイナーに添加した。これらにキャップをして、２４００ｒｐｍで５分間遠心して、次にフェノール／クロロホルム０．５ｍＬを添加した。これらを３０秒間振盪して、２０００ｒｐｍで３分間再遠心した。フェノール／クロロホルム抽出を繰り返して、次にクロロホルム／イソアミルアルコールで２回抽出した。栓の上の抽出物４００μＬをエアロゾール耐性チップ付き微量遠心管に移して、ＤＮＡを５Ｍ ＮａＣｌ ２５μＬ及び無水エタノール８５０μＬで−２０℃で沈殿させた。このＤＮＡを遠心によって回収して、エタノール７０％で１回洗浄して、空気乾燥して、水５０μＬ又は５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ９で再懸濁した。ＰＢＭＣ画分又は骨髄試料の場合、１０6細胞毎に２０μＬを使用した。ＤＮＡ調製物は−７０℃で保存した。コロニーの試料の場合、ヴァキュテイナー中の水２１０μＬに、ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ Ｒ９００１）１０μｇを担体として含めた。
ＤＮＡはまた、「Acest Protocol」を使用して細胞から調製し、競合ＰＣＲ及びＰＣＲ−ＲＣＲアッセイで使用した。微量遠心管内の約５ｘ１０6細胞の細胞ペレットを細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＣａＣｌ2、０．４％ Ｔｒｉｔｏｎｘ１００、ｐＨ８．０、濾過滅菌済み）３００μＬに再懸濁して、ＰｒｅＴａｑ（Boehringer Mannheim カタログ番号1696491） ３μＬを添加して、試料を５分間煮沸して、13000rpmで２分間遠心した。この上清を清潔なスクリュー栓付き１．５ｍＬ試験管に移して、ＡＣＥＳ緩衝液（２．２８ Ａｃｅｓ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ａ−７９４９）、０．５Ｍ ＮａＯＨ １２．５ｍＬ、Ｔｗｅｅｎ−２０ １２．５ｍＬ、ｐＨ６．８、全量５０ｍＬ、濾過滅菌済み）１００μＬ及びポリマー（Ward et al 1998）２５μＬを添加して、この試料を素早くボルテックスして、次に１３０００ｒｐｍで２分間遠心した。ペレットを２０ｍＭ ＮａＯＨ ５０μＬに再懸濁して、完全に溶解するまで室温に静置した。この試料を５分間煮沸して、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによってＤＮＡ濃度を測定した。注入後の細胞の抽出は、ＨＩＶが存在するのでＰＣ３封じ込め下で実施した。
３．１０ ＰＣＲ
細胞又は細胞コロニーにおけるＬＮＬ６又はＲＲｚ２配列の検出のために、細胞ＤＮＡのＰＣＲ分析を実施した。ＰＣＲプライマーをＰ３２で標識して、ＰＣＲ生成物の定量的検出を可能にした。標識は、推奨方法によってγ32Ｐ−ＡＴＰ（ＩＣＮ ＃３５０２００５）及びＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（GIBCO-BRL カタログ番号18004-010）によって実施した。取り込まれなかった過剰な標識は、Ｇ２５セファデックススピンカラムを使用して除去した。ＰＣＲには、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ2 ５０ｍＭ、ＮａＣｌ ５００ｍＭ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ １０２９７−０１８）それぞれ２．５ｍＭ、ＢＳＡ １．０ｍｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ Ａ−４３７８、原液１００ｍｇ／ｍＬ）、ｐＨ８．０を含有する１０ｘ緩衝液を使用した。
ｐＬＮＬ６及びｐＲＲｚ２ ＤＮＡの標準物を５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９で希釈して、ヒト肝ＤＮＡを担体として使用して１μＬ当たり１０００及び１０００００コピーを入れ、その後試料５μＬ当たり５〜５０００コピーとなるように希釈した。ヒトベータグロビン分析用に、標準ヒトＤＮＡとして、１ｍｇ／ｍＬ保存液から１μＬ当たり１００００、３０００、１０００、３００及び１００遺伝子コピーの希釈液を作製した。
ＬＮＬ６／ＲＲｚ２「コピー数大」。ＤＮＡ調製物中の比較的高濃度のＬＮＬ６及びＲＲｚの定量に使用した方法。このようなＤＮＡは、ＣＤ３４細胞及び造血コロニーから得られた。この方法では、ＰＣＲ反応はヒトゲノム１０4コピー以下を有する２５μＬで実施した。オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｆｉｓｈｅｒの５Ｌ１Ａ、３Ｌ１Ｄ、Ｔａｑポリメラーゼであった。増幅は、MJ Research Programmable Thermal Controllerを使用して９４℃１分及び６８℃１分を２７回繰り返して実施した。ＲＲｚ２を５０００、１０００、５００、１００、５０、１０、５、０、０及び０コピーとＬＮＬ６を０、０、０、５、１０、５０、１００、５００、１０００及び５０００コピーそれぞれ含有する１０種類の標準（対照）試料全てもまた、ヒトゲノム５０００コピーの存在下で処理した。
ＬＮＬ６／ＲＲｚ２「コピー数小」。ＤＮＡ調製物中の比較的低濃度のＬＮＬ６及びＲＲｚの定量に使用した方法。このようなＤＮＡは、末梢血細胞（リンパ球、マクロファージ、及び顆粒球）から得られた。この方法では、反応はヒトゲノムを約１０6コピー含む試料５０μＬで実施した。ＤＮＡ試料２０μＬをプライマー５Ｌ１Ａ及び３Ｌ１Ｄ（１標識）、緩衝液及びポリメラーゼを含有する３０μＬと混合して、９４℃の段階を９０秒間にすること以外は「コピー数大」の場合と同様に処理した。この標準試料は、ヒトゲノム１０6コピーの存在下においた。
増幅した試料を５％又は６％ポリアクリルアミドゲルで、Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｘＴＢＥ、トリスホウ酸 ０．８９Ｍ ｐＨ８．３＋ＥＤＴＡ ２０ｍＭ）を使用して電気泳動分析して、AMBIS 4000 Radiometerを使用してバンドの放射活性を定量した。
他の標準物として、ヒトゲノムコピー数が１００００のＤＮＡ調製物でベータグロビンＤＮＡを定量した。このようなＤＮＡはＣＤ３４＋細胞及び造血コロニー、並びに患者のＰＢＭＣ、Ｔ細胞、及び骨髄から得た。増幅は、オリゴヌクレオチドプライマーＬＸ１及びＬＡ２を使用して、９４℃１分、６５℃２分を２５回繰り返して実施した。
ネステッド放射活性ＰＣＲ法はまた、約０．０１％未満の細胞がいずれかの構築物を含有する場合にＬＮＬ６：ＲＲｚ２マーキングの比を算出するために使用した。２回のＰＣＲによって感受性が増大して、放射活性標識が容易に取り込まれ、Ｉｍａｇｅｑｕａｎｔソフトウェアを使用した定量が可能になった。綿密な研究技術を駆使して、相互汚染を回避し、適切な制御を実施した。最初のＰＣＲでは、ｔａｑｂｅａｄｓ（Perkin Elmer カタログ番号N808-0100）を入れた５０μＬ中で鋳型ＤＮＡ １μｇ、プライマー ５Ｎｅｓ１及び３Ｌ２Ａ、ＭｇＣｌ２ ２ｍＭ、ｄＮＴＰ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer カタログ番号N801-0060）を含む緩衝液ＩＩ（Perkin Elmer カタログ番号808-0010）を使用した。増幅は、それぞれの試料について１０連で、Ｔｈｅｒｍｏｆａｓｔ ９６ＰＣＲプレート（Advanced Biotechnologies、カタログ番号AB0600）で、９４℃を１回、３０秒／６８℃及び３０秒／９４℃を１７回繰り返し、４℃まで冷却して実施した。１０連の生成物を集めて、集めた試料５μＬをそれぞれ第２回目の増幅反応で使用した。第２回目のＰＣＲでは、増幅３５回を実施すること以外は１回目と同様の条件下で、標識プライマー５Ｌ１Ａ及びプライマー３Ｌ２Ａを使用した。生成物はポリアクリルアミドゲルで分析した。２１６ｂｐの生成物はＲＲｚ２に対応し、１７４ｂｐ生成物はＬＮＬ６に対応した。
３．１１ ＲＣＲ−ＰＣＲ
ＲＣＲ−ＰＣＲアッセイによって、ｅｎｖ遺伝子の高度に保存された領域を増幅することによって複製能のあるレトロウイルスを検出することが可能であった。増幅された配列は、アンホトロピック受容体による細胞感染に必要なエンベロープタンパク質の宿主決定領域の一部をコードする。増幅領域の長さは２８９ｂｐであった。このアッセイは、百万個の陰性細胞（１０-6）のバックグラウンドで１個の陽性細胞に対して感受性を示した。
ＰＣＲ反応には、ＤＮＡ試料７μＬ及びプライマー５ＲＣＲ６＝５′−ＣＴＡ ＴＧＴ ＧＡＴ ＣＴＧ ＧＴＣ ＧＧＡ ＧＡ−３′及び３ＲＣＲ６＝５′−ＣＣＡ ＣＡＧ ＧＣＡ ＡＣＴ ＴＴＡ ＧＡＧ ＣＡ−３′及び緩衝液ＩＩ（Perkin Elmer、カタログ番号808-0010）、及びＭｇ2+（Perkin Elmer、カタログ番号N808-0010）、ｄＮＴＰ（Gibco BRL 10297-018）０．２５ｍＭ、及びＴａｑポリメラーゼ（ＴａｑｂｅａｄTM ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｍ５６６１）を使用した。増幅は９４℃で３分、その後９４℃で３０秒、６３℃で３０秒及び７２℃で３０秒を４５回繰り返して実施した。増幅試料は、２．５％ＮｕＳｉｅｖｅゲルで分析した。２８９ｂｐのバンドの存在によって、ＲＣＲの存在が示された。
試料ＤＮＡの代わりに水を含有する「非ＤＮＡ」対照物をそれぞれのＰＣＲ実験で実施して、いかなる試薬の汚染もないことを確認した。陰性対照（ＣＥＭＴ４ ＤＮＡ）もまた実施して、生じた単位複製配列の特異性を確認した。陽性対照（１０-5ＰＡ３１７）をそれぞれのＰＣＲで実施して、ＰＣＲが少なくとも１０００００陰性細胞において陽性細胞１個に対して感受性であることを確認した。１０-3ＰＡ３１７「スパイクした」ＤＮＡ２０ｎｇ／ｍＬを１０μＬ添加することを意味する「スパイクしたＰＡ３１７」試料もまた、それぞれの実験で何連ものＰＣＲ試験管の全ての試験試料に含めた。この陽性の１０-3ＰＡ３１７ ＤＮＡの添加によって、ＰＣＲの結果が陰性であればＲＣＲが実際に陰性であり、増幅されていないＤＮＡによる偽陰性ではないことが確かめられた。全ての操作は、相互汚染を回避するために綿密な研究室技術、例えば水酸化ナトリウム０．１Ｍによる作業台及びピペットの洗浄、手袋の頻繁な交換及びエアロゾールで遮蔽したチップの使用が必要である。
３．１２ ＣＦＣアッセイにおけるコロニー単離
ＣＦＣアッセイを患者の骨髄細胞、血漿交換によるＣＤ３４＋に富んだ細胞、最終的に形質導入した生成物で実施した。アッセイから得られたコロニーを前述のようにＬＮＬ６及びＲＲｚ２遺伝子用のＰＣＲによって分析した。メトセルロース培地で１４日間増殖させたコロニーの細胞を単離して、以下の通りに細胞溶解した。顕微鏡下で、個々のコロニーをＰ２００エアロゾール耐性チップで吸引し、微量遠心管に注入した。この試料を１５秒間中程度の速度でボルテックスして、細胞を剪断せずにメトセルロースを溶解した。前述したとおりに細胞溶解後に細胞からＤＮＡを単離した。
３．１３ ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ分析
ＲＮＡは、QIAmp RNA Blood Miniキット（Qiagen カタログ番号52304）を使用して製造元の指示に従って患者試料から抽出した。ＲＮＡは、１〜５ｘ１０6細胞から抽出して、ＲＮＡ分解酵素を含まない水５０μＬに再懸濁した。ＲＱ−１ ＤＮＡ分解酵素（Promega、カタログ番号M6101）を使用して、ＲＮＡ調製物をＤＮＡ分解酵素処理した後、反応当たりＲＮＡ約７００〜１０００ｎｇ、プライマー３Ｌ２Ａ、及び酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＲＮＡ分解酵素 ＨマイナスＲＴ（Gibco カタログ番号18053-017）を使用して、３７Ｃで４５分間ｃＤＮＡの合成を実施した。各ＲＮＡ試料について７連で実施して、生成物を収集した後、前述のネステッドＰＣＲ法で鋳型として使用した。
実験例４
ＨＰ細胞は、以下の通りに採集して、形質導入して再注入した。この方法には、以下の段階が含まれる。
ヒト患者の骨髄から得られたＨＰ細胞の末梢血への動員、
動員したＨＰ細胞を得るための個々の末梢血の血漿交換、
洗浄段階１；減量用の調製において細胞洗浄液使用による未精製末梢血単核細胞の洗浄、減量段階、過剰な赤血球、顆粒球、血小板、及びＴリンパ球の除去、
洗浄段階２；細胞洗浄液を使用した濃縮ＨＰ細胞の洗浄、ＨＰ細胞集団からのＣＤ３４＋細胞の選択又は抗原陽性細胞の除去、
洗浄段階３、細胞洗浄液を使用した精製ＨＰ細胞の洗浄、
精製ＨＰ細胞をサイトカイン／成長因子と共に培養することによる細胞培養、
形質導入を容易にする薬剤存在下での遺伝子構築物を含有するレトロウイルスベクターを使用することによる、好ましくは細胞洗浄液を使用してウイルスベクターを導入することによるＨＰ細胞の形質導入操作、
細胞洗浄液を使用したＨＰ細胞の形質導入を含めた細胞生成物の採集及びＨＰ細胞の洗浄、
注入生成物の調製、
ＨＰ細胞を注入バッグへ入れ、生成物を安全に放出する試験の実施、及び患者への注入、細胞を同患者に戻す。
これらの工程は、以下の例及びその他の変更を用いてさらに詳細に説明する。
工程１−ＨＰ細胞動員
この方法の第１工程では、ＨＳ細胞を骨髄から末梢血に動員する試薬を使用する。ここでは一例として、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、ＮｅｕｐｏｇｅｎTM）を使用し、患者の皮下に、少なくとも１０μｇ／ｋｇ／日、好ましくは３０μｇ／ｋｇ／日で、一日１回、５日間まで連続して投与する。全血球計算値（ＣＢＣ）、百分率及び血小板算定はＧ−ＣＳＦ投与中は毎日実施し、白血球増多症の程度を調べる。ＣＤ３４＋細胞計数用の血液試料をＧ−ＣＳＦ投与後３日目に採取し、末梢血ＣＤ３４＋数が血漿交換開始前の２０細胞／ｍｍ3を上回っていることを確かめる。しかし、このＣＤ３４＋細胞数に達成しない場合でも、Ｇ−ＣＳＦ投与後４、５及び６日目の血漿交換の妨げとはならない。
工程２−血漿交換
血漿交換は、末梢血の単核細胞画分を得るための「血液濾過」方法である。Ｃｏｂｅ Ｓｐｅｃｔｒａ（Ｇａｍｂｒａ）、Ｈｅｍｏｎｅｔｉｃｓ（Ｄｏｍｅｄｉｃａ）又はＡｍｉｃｕｓ（Ｂａｘｔｅｒ）の機械で少なくとも２回の別の機会（好ましくは、動員後の４、５又は６日目、１日目は動員を誘導した最初の日である）に実施するが、他の例では、末梢血ＣＤ３４＋数が５細胞／ｍｍ3、好ましくは１０細胞／ｍｍ3、最も好ましくは２０細胞／ｍｍ3を上回る日を測定することによって、血漿交換はその前後の日に実施することができる。好ましい実施態様では、この血漿交換によって通過血流の約５リットル（Ｌ）から、好ましくは５〜１０Ｌ、より好ましくは１０〜２０Ｌ、さらに好ましくは２０Ｌ以上から細胞生成物が得られる。血漿交換それぞれから得られた生成物は、別々に処理するか、又は好ましい実施態様では、２回目の血漿交換の後で収集する。全細胞数及びＣＤ３４＋細胞絶対数を記録する。工程１＆２の使用によって、５ｘ１０6ＨＰ細胞／ｋｇを上回るまで、好ましくは２ｘ１０7ＨＰ細胞／ｋｇを上回るまで、より好ましくは４ｘ１０7ＨＰ細胞／ｋｇを上回るまでが生じる。
工程３−洗浄工程１（好ましくは血漿交換当日）
収集した細胞を洗浄する。細胞を遠心することによって、より好ましくは自動細胞洗浄機を使用して実施し、１例ではこの細胞洗浄はＮｅｘｅｌｌ ＣｙｔｏＭａｔｅ洗浄機を使用して実施する。
工程４−減量工程（好ましくは血漿交換当日）
ある実施態様では、血漿交換操作によって得られた細胞をＣｈａｒｔｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ ＤＡＣＳ−ＳＣTMシステムなどのシステムを使用して「減量（ｄｅｂｕｌｋ）」する。２日目の生成物と収集するために１日目から一晩生成物を保存するこの実施態様では、２つの血漿交換生成物を収集日に減量して、第２の生成物を減量するまで第１の生成物を保存した。
工程５−洗浄工程２（好ましくは６日目）
細胞を採集し、（２種類の生成物がある実施態様では）収集して、遠心することによって、又はＮｅｘｅｌｌ ＣｙｔｏＭａｔｅ装置又は同等装置を使用することによって洗浄する（２種類以上の生成物がある場合は、最終時点で収集する）。
工程６−ＣＤ３４ ＋ 細胞選択（好ましくは６日目）
ＣＤ３４＋細胞は、Ｉｓｏｌｅｘ ３００ｉ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ又は細胞発現マーカーの系列除去方法（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ糖タンパク質Ａ、ＳｔｅｍＳｅｐ）を使用することによって洗浄後の生成物から選択した。ＣＤ３４＋又は系列除去細胞を濃縮した収集物には、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも８０％のこの種の細胞が含まれている。
工程７−洗浄工程３（好ましくは６日目）
細胞を遠心によって、又はＮｅｘｅｌｌ ＣｙｔｏＭａｔｅ又は同等の装置を使用することによって洗浄した。
工程８−細胞培養（好ましくは６〜９日目）
細胞を計数して、細胞培養フラスコ、細胞培養袋、又は好ましい実施態様では１０００ｍＬ（３９０ｃｍ2）Ｎｅｘｅｌｌ Ｌｉｆｅｃｅｌｌ Ｘ−Ｆｏｌｄ培養袋又はサイトカイン／成長因子を含むイスコフ改変ダルベッコ培地及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を入れた同等の袋に好ましくは１ｘ１０5から５ｘ１０6細胞／ｍＬで入れる。好ましい実施態様では、このサイトカイン／成長因子混合物は、幹細胞因子（５０ｎｇ／ｍＬ）及び巨核球成長及び分化因子（１００ｎｇ／ｍＬ）から構成される。工程３〜９によって、（ＣＤ３４陽性によって評価すると）１ｋｇ当たり１２ｘ１０7以上に達するＨＰ細胞が得られる。
工程９−形質導入方法（好ましくは８日目）
細胞は、最初のフラスコ、好ましい実施態様のＬｉｆｅｃｅｌｌ培養袋又は同等物を含めた組織培養袋から、Ｃｙｔｏｍａｔｅ装置又は同等物を使用して収集し、レトロウイルス上清に再懸濁して（この一例は一定量２００ｍＬである）、第２の組織培養容器に移す。そのうちの１種類はレトロウイルス形質導入促進剤を有するＬｉｆｅｃｅｌｌ Ｘ−ｆｏｌｄ培養袋である。この様な薬剤には、ポリブレン、硫酸プロタミン、カチオン性脂質が含まれ、又は好ましい実施態様では、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ １〜４ｍｃｇ／ｃｍ2で予めコーティングした組織培養容器に入れる。４〜１０時間後、又は２４時間までに、ＣｙｔｏＭａｔｅ又は同等物を使用して移す操作を繰り返し、この２回目の形質導入では、細胞は新しい組織培養容器（ポリブレン、硫酸プロタミン）に移すか、又は元の容器又は元の容器と類似のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコーティング容器に戻した。好ましい実施態様では、これは新鮮な一定量のレトロウイルス上清中で実施し、一晩培養する。その他の実施態様では、これは行わないか、又は同等の期間中に数回繰り返す。繁殖不能性試験のためにレトロウイルス培養上清の一定量を収集する。これによって（ＣＤ３４陽性によって評価すると）１ｋｇ当たり６ｘ１０7個以上の遺伝子含有ＨＰ細胞が得られる。この数は、定量アッセイによって測定される。形質導入効率は、少なくとも２０％、好ましくは３０〜５０％の範囲で、より好ましくは５０％を上回る。
工程１０−収集細胞生成物（好ましくは９日目）
９日目の朝に、標準的細胞遠心法又は細胞培養のＣｙｔｏｍａｔｅ試料などの自動システムを使用して細胞を収集洗浄する。これによって、（ＣＤ３４陽性によって評価すると）１ｋｇ当たり５．７ｘ１０7個以上の遺伝子含有ＨＰ細胞が得られる。
工程１１−注入生成物（好ましくは９日目）
細胞を担体として５％糸血清アルブミン又は類似物を含有する生理学的注入緩衝液に再懸濁する。一定量の試料の繁殖不能性試験（好気性菌、嫌気性菌、真菌、マイコプラズマ）用に取り出す。注入生成物は、内毒素（ＬＡＬ）及びグラム染色試験の結果が得られるまで放出しない。
工程１２−患者への注入（好ましくは９日目）
ＣＤ３４＋細胞調製物を適切ならば投薬前の患者に投与する。好ましい実施態様では、患者に体重１ｋｇ当たり形質導入ＣＤ３４＋細胞０．５〜６ｘ１０7個（細胞／ｋｇ）を、担体として５％ヒト血清アルブミン又は類似物を含有する生理学的注入緩衝液に溶かして１回注入する。患者当たりの形質導入ＣＤ３４＋細胞の用量は、動員、血漿交換、単離、培養及び形質導入方法の各工程の効率に左右される。（形質導入及び非形質導入）ＣＤ３４＋細胞の総数は、細胞計数及びフローサイトメトリによって測定する。導入した遺伝子含有ＨＰ細胞によって、骨髄において遺伝子含有ＨＰ細胞が割合を占めるキメラ造血系が生じる。好ましい実施態様、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ処理用の１つの実施態様では、遺伝子含有ＨＰ細胞の割合は少なくとも５％、好ましくは１０％を上回り、より好ましくは２０％を上回る。
実験例５

ＨＩＶ−１複製を阻害する複数標的能を備えたＲＮＡｉの使用
ＨＩＶ−１に対する複数標的能を備えたＲＮＡｉ構築物は以下の通りに設計する。図１４に見られるようにＨＩＶ−１に対してセンス方向（１Ａ、２Ａ、３Ａ）及びアンチセンス方向（１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ）に対応する１９〜２５個のヌクレオチド部分を、１Ｂ、２Ｂ及び３Ｂがそれぞれ１Ａ、２Ａ及び３Ａの配列に相補的になるようにそれぞれ有する３種類のＲＮＡｉ単位を含むカセットを作製する。配列１Ａ、２Ａ及び３Ａは、例えばＨＸＢ２株又はその他の株の対応する領域における配列位置５８３１〜５８４９（ａｔｇｇａｇｃｃａｇｔａｇａｔｃｃｔａ）、配列位置５８５２〜５８７０（ｃｔａｇａｇｃｃｃｔｇｇａａｇｃａｔｃ）、及び配列位置５９７１〜５９８９（ｔｇｇｃａｇｇａａｇａａｇｃｇｇａｇａ）のようにＨＩＶ−１株で高く保存されているので、選択する。この配列は、以下のウェブサイト、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｑｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｉｖ−ｄｂ／ＮＵＭ−ＨＸＢ２／ＨＸＢ２ Ｎｕｃ．ｈｔｍＬにあるサービスを使用して算出した。配列１Ａ、２Ａ及び３ＡはほとんどのＨＩＶ−１株の対応する配列と比較してヌクレオチドの相違が１個以下であることが好ましい。前記の１９個のヌクレオチド配列それぞれは、多くのＨＩＶサブタイプでｔａｔ遺伝子内に適当に保存されており、サブタイプＢでは非常に良く保存されている。これらの１９個のヌクレオチド配列それぞれでは、サブタイプＢ内のコンセンサス配列と異なる塩基対が１個以内である。最初の配列にはＲｚ２の標的が含まれる。配列末端に近い相違がより耐性があり得る。ＲＮＡｉ単位は、長さがヌクレオチド３〜７個のスペーサによって隔てられる。スペーサはさらに長くてもよく、例えば、ＲＮＡｉ単位の細胞質局在化を促進するイントロン配列を含む。このカセットは、複数のＲＮＡｉ分子を放出させるために自己切断リボゾーム配列に隣接する。例えば、触媒ドメインが米国特許第6127114号によって設計されたハンマーヘッドリボザイムによって５’末端を処理し、米国特許第5856188号によって設計された自己触媒性ヘアピンリボザイムによって３‘’末端は処理することが可能である。これらは容認され得るが、他のヌクレオチドなしに、ＲＮＡｉ分子を塩基対（平滑）末端にする。自動触媒切断は、矢印の位置（図１４）で起こり、３個のＲＮＡｉを含有する分子を放出する。スペーサ１／２及び２／３は、切断可能な配列、例えばＲＮＡｉ単位を分離できるようにハンマーヘッド又はヘパリンリボザイム又は他のリボザイム単位によって切断可能な配列を含むことが可能である。明らかに、単一のＲＮＡｉ単位は、６個から１０個までもの単位を使用するか、マルチマーであることが可能である。
カセットは、重複してアニーリングしたオリゴヌクレオチドのＤＮＡ分子として組み立てて、Ｔ７プロモータの制御下にあるプラスミドベクターに挿入する。当業界では周知の逆方向反復塩基配列を有するプラスミドの安定複製を可能にする組換不能Ｅ．ｃｏｌｉ株をクローニング宿主として使用する。より長いスペーサ（例えば、イントロン）も、この点に関して役に立つ。挿入ＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して、放射標識ＵＴＰの存在下でインビトロにおいてＤＮＡを転写し、リボザイム単位の自己切断能は転写産物をポリアクリルアミドゲル上で電気泳動してオートラジオグラフィすることによってアッセイする。自己切断は、３７℃で１時間転写している間に９０％以上の効率で生じる。リボザイムドメイン中のステム及びループの長さ及び／又は配列は、切断が所望するよりも少ないときに調節することができる。
このカセットは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモータの制御下にあるｐＬＮＬ６などのレトロウイルスのプラスミド形態に挿入する。あるいは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性ポリメラーゼを使用することが可能である。このカセットは、ベクター内の制限部位に適切な方向で挿入する。得られたプラスミドをＡＭ−１２株などのパッケージング細胞株に導入し、安定してトランスフェクトした細胞を使用してレトロウイルスベクターを生成する。ＣｅｍＴ４細胞株又はＰＢＬをこのレトロウイルスベクターで形質導入し、ＲＮＡｉ構築物の発現は、当業界で周知のようにＲＮＡ分解酵素防御アッセイによって測定する。形質導入された細胞の有意な防御は、いくつかのＨＩＶ−１株のいずれかで感染した後に認められる。対照（ＲＮＡｉカセットを含まないベクター）と比較して９０％を上回るｐ２４産生の減少が認められ、ＨＩＶ−１複製が減少したことが示唆される。
ＣＤ３４＋細胞を患者から得、この出願の始めの方で説明した方法によってＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎの存在下でレトロウイルスベクターで形質導入する。１．６３ｘ１０6個より多いこのようなＣＤ３４＋細胞の全細胞集団の中で（患者の体重）１ｋｇ当たり少なくとも０．５ｘ１０6個の形質導入ＣＤ３４＋細胞を注入によって患者に投与する。好ましくは、１ｋｇ当たり５ｘ１０６を上回る形質導入ＣＤ３４＋細胞を投与する。これらの細胞を患者の骨髄に移植すると、保護されたＴリンパ球及びマクロファージ／単球が注入後３年以上産生される。これらの細胞は、ＨＩＶ−１感染に対して比較的保護されており、免疫機能の改善に関与している。
最終的な考察
本明細書で説明した臨床試験では、抗ＨＩＶ剤を生体外でＣＤ３４＋細胞で発現させるための遺伝子を導入し、これらの細胞を同種患者に注入することは、技術的に実行可能で、安全であることが示された。末梢血リンパ球及び骨髄細胞でのリボザイム構築物の存在及び発現は、少なくとも３年間認められた。この研究で治療した１０人の患者では、細胞マーキングの程度が変化しており、これによって以下の考察が可能となった。細胞マーキングの程度に関する変数は、ＣＤ３４＋細胞形質導入の割合、注入した形質導入ＣＤ３４＋細胞の数、及び注入したＣＤ３４＋細胞の総数であることが見いだされた。形質導入細胞の実際の数が重要であることがわかった。非形質導入細胞は、骨髄区画へ戻るので、末梢血及び肝臓などの器官において形質導入細胞の生存を促進する役割を果し得る。形質導入ＣＤ３４＋造血細胞の移植を延長するためには、骨髄切除による予備調整を行わない状況で、少なくとも１．６３ｘ１０6細胞の総ＣＤ３４＋細胞集団中０．５２ｘ１０6個の形質導入細胞の用量が最小限必要である。選択の程度が比較的に低くても、対照リンパ球を上回ってリボザイム含有リンパ球が優先的に生存した。優先的に生存する程度は、ＣＤ３４＋細胞依存性で、すなわち、注入した形質導入細胞の数と正の相関があり、これは予想外であった。選択の程度をより高めてリボゾーム保護されたリンパ球がより優先的に生存することを期待すること、細胞用量をより高めて治療的利点をより期待することは合理的である。
ＡＩＤＳ／ＨＩＶ感染及びその他の疾患を治療するために、造血細胞の効果的な遺伝子治療の基礎を提供する。効果的な品質保証及び臨床設定における方法の評価についての重要な知見を提供する。
参考文献
Figure 2005528319
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典型的なレトロウイルスの複製サイクル。
（Ａ）ウイルスが、標的細胞上の細胞表面受容体に結合し、融合及びウイルスの脱殻に引き続き、ゲノムＲＮＡが標的細胞に進入する。
（Ｂ）逆転写が起こり、ウイルスＲＮＡがｃＤＮＡに転換される。
（Ｃ）ｃＤＮＡが核内に入り、環状型へと変換される。
（Ｄ）次いで、ｃＤＮＡが宿主細胞ゲノム中に取り込まれる。
（Ｅ）プロウイルスの転写によって、ウイルスＲＮＡとｍＲＮＡが産生される。
（Ｆ）翻訳によって、ウイルスタンパク質が産生される。
（Ｇ）ウイルスによってコードされるタンパク質とパッケージングされたウイルスＲＮＡから、ウイルスのコアが形成される。
（Ｈ）コアが膜を獲得し、出芽によって細胞膜を通じて細胞を離脱する。
想定される本発明の作用様式。
リボザイムは、ＨＩＶ−１ウイルスのライフサイクルにおける複数のあらゆる点に作用することができる。リボザイムは、脱殻後及び逆転写の前に、ゲノムＲＮＡを切断することができ、あるいは、核若しくは細胞質中のウイルス転写物を切断してウイルスタンパク質の翻訳を阻害することができ、あるいは、集合前又は集合中に、新しく形成されたゲノムＲＮＡを切断することができる。
ＨＩＶ／ＡＩＤＳを治療するためにリボザイム遺伝子の導入を使用することの科学的根拠。
Ａ．正常なＣＤ３４＋造血前駆細胞は、ＨＩＶ−１が感染し得るリンパ球及び単球／マクロファージを生じ、これらの感染細胞は、死滅する前に、ＨＩＶ−１粒子を生成する。
Ｂ．リボザイム遺伝子を形質導入されたＣＤ３４＋造血前駆細胞は、リボザイム遺伝子を発現するリンパ球及び単球／マクロファージを生じる。治療用リボザイムはＨＩＶ−１ ＲＮＡを切断し、これら２つの枢要な細胞種におけるＨＩＶ−１の複製を阻害する。
造血の模式図。
ＣＤ３４＋造血前駆細胞は、中間前駆細胞を経ながら成熟度を増していく細胞を生じる。ＨＩＶ／ＡＩＤＳ感染において中心となる細胞は、ＣＤ４＋Ｔ−リンパ球及び単球／マクロファージ（アスタリスクが付されている）である。模式的に示されている全ての細胞は、造血細胞である。
Ｒｚ２標的部位の位置。
Ａ：複製、制御、及びアクセサリー遺伝子の位置を示すＨＩＶ−１ゲノムの模式図。
Ｂ：相補的な標的及びｔａｔ遺伝子内でハイブリダイズしている配列とともに、リボザイム配列が示されている。トリプレットＧＵＡのすぐ３’で切断が起こる。
Ｃ：Ｔａｔ及びＶｐｒタンパク質をコードする遺伝子中でのＧＵＡ標的配列の位置。
ＣＤ３４＋の第Ｉ相臨床試験の模式図。
ＨＩＶ−１に感染している１０人の患者が参加した。自家ＣＤ３４＋造血細胞中に、ＬＮＬ６とＲＲｚ２ベクターを別個に導入した。骨髄切除処理を行わずに、両細胞集団を患者に注入した。
形質導入に対するレトロネクチンの影響。
本図は、ＣＤ３４＋細胞をレトロウイルスベクターに接近させることにより、レトロネクチンが、どのようにレトロウイルスの形質導入を促進するかを模式的に示している。
長期のベクターの存在と発現。
ＲＲｚ２ベクター中のＲｚ２配列と重複するｎｅｏＲ遺伝子に対するプライマーを用いて、白血球サブセット中で、半定量的ＰＣＲ分析を行った。ＬＮＬ６とＲＲｚ２に対するＰＣＲ産物は、それぞれ、１７４及び２１６塩基対であり、一続きのｎｅｏＲ遺伝子の未翻訳末端を含んでいる。グラフＡは、形質導入を行ったＣＤ３４＋細胞の注入から２年後の患者５における、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、骨髄単核球（ＢＭＭＣ）、Ｔリンパ球、及び単球中のＬＮＬ６とＲＲｚ２ベクター配列を示している。グラフＢは、ＲＴ−ＰＣＲで測定を行った、３人の代表的な患者における、ＰＢＭＣ中におけるＬＮＬ６及びＲＲｚ２の両者の短期及び長期的発現を示している。発現は、放射性標識プライマーを用いた逆転写酵素（ＲＴ＋）ネステッドＰＣＲ中で評価した。各サンプルには、逆転写酵素を含有しない反応物（ＲＴ−）を含めた。グラフＣ．ナイーブＴ−リンパ球中でのベクター配列の検出。ゲルは、形質導入されたＣＤ３４＋細胞の注入から２年後の患者７における、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球中並びに末梢血から選択したナイーブＴリンパ球サブセット中のＬＮＬ及びＲＲｚ２ベクター配列に対するＰＣＲ分析を示している。Ｄ、Ｅ、及びＦは、ナイーブＴリンパ球中でのベクター配列の検出を示している。ゲルは、３人の患者における、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球中並びに末梢血から選択したナイーブＴリンパ球サブセット中のＬＮＬ６及びＲＲｚ２ベクター配列に関するＰＣＲの結果を示している。ベクター配列は、早くも注入後４週に、ナイーブＴ細胞サブセット中に検出された（パネルＦ）。パネルＥとＤには、それぞれ、形質導入を行ったＣＤ３４＋細胞の注入から２．５年及び２年後の時点での長期の検出が示されている。
図７−１に同じ。 図７−１に同じ。 １０人の患者中でのＰＣＲによるベクター検出の一覧。
ＰＣＲにより、ＬＮＬ６又はＲＲｚ２ベクター検出について、注入後最長３６ヶ月まで細胞を調べた。表記のように、細胞の種類は、骨髄単核球、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、顆粒球、Ｔリンパ球、及び単球である。Ｙ軸に記入されているように、各患者についてのデータが示されている。フィブロネクチン断片（ＣＨ−２９６）の使用後には、さらに長期の遺伝子のマーキングが観察され、形質導入効率の増加をもたらした（表１参照）。ベクター検出の有無は、ベクターコピー数とは無関係に丸で示してある。黒丸、両ベクターが検出された。白丸、いずれのベクターも検出されなかった。縦線入りの丸、リボザイムベクターのみ検出された。横線入りの丸、ＬＮＬ６対照ベクターのみ検出された。
Ｔリンパ球及び骨髄単核球中でのベクター減少の速度論の比較。
Ｔリンパ球及び骨髄単核球（ＢＭＭＣ）にわたるベクターコピーの減少速度の比較は、ＬＮＬ６に比べて、Ｔリンパ球中でＲＲｚ２マーキングの持続が増大することを示している（Ａ）。ＬＮＬ６マーキングは、（Ｂ）に示されている。プロットは、ベースラインのパーセントとして表されたベクターマーキングのレベルを示しており、ベースラインは、４週及び１２週の時点での、各細胞種のベクターコピー数の平均として定義される（赤い菱形と線：Ｔリンパ球、白い四角と黒線：ＢＭＭＣ）。（Ｃ）と（Ｄ）は、ＲＲｚ２を形質導入したＣＤ３４＋細胞の用量と、Ｔリンパ球（Ｃ）及びＰＢＭＣ（Ｄ）中のＬＮＬ６とＲＲｚ２コピー数間の差（保護指数）の線形的関係を表すプロットを示している。
Ｔリンパ球及び骨髄単核球中でのベクター減少の速度論の比較。（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、及び（Ｈ）は、Ｔリンパ球と骨髄単核球中でのベクター減少の速度論の比較、及び注入した被形質導入ＣＤ３４＋細胞用量との相関を示している。ＨＩＶ関連細胞の減少に対してリボゾームが誘導した保護は、ＨＩＶに感染しやすい細胞と感染しにくい細胞中でのＲＲｚ２及びＬＮＬ６ベクターＤＮＡの減少を比較することによって評価した。パネルＥは、表記の時点で、ＰＣＲにより、患者７でＣＤ４＋Ｔリンパ球中にＲＲｚとＬＮＬ６ベクターが検出されたことを示している。各バンドの放射能量は、同じＰＣＲ反応を実行した既知の標準に対して標準化されており（図示せず）、ＬＮＬ６に対するＲＲｚ２の比率（各ゲルの下に示した値）を時間に対してプロットした（パネルＦ）。ＰＲｚ２の保護に対する陰性対照として、ＢＭＭＣ（ＨＩＶに感染しにくい細胞を多く含有する）のプロットがパネルＦに示されている（ＰＣＲゲルは示さず）。ＬＮＬ６マーキングに対するＲＲｚ２マーキングの比率の経時的な傾向は、変化速度０からの差を反映するＰ値を用いた線形回帰によって概算した（ＲＲｚ２とＬＮＬ６マーキングは、等しい速度で減少すると予想した）。この患者では、ＢＭＭＣ中でのＬＮＬ６マーキングに対するＲＲｚ２マーキングの比は、長期にわたって、概ね一定を保った（勾配＝−０．０００５、０からの差、Ｐ＝．２８１）。これに対して、ＲＲｚ２マーキングは、ＨＩＶに感染しやすいＴリンパ球の中で、長期にわたり、ＬＮＬ６マーキングに比較して増加した（勾配＝０．００３６、０からの差、Ｐ＝．００８）。傾向線間の差は、統計的に有意であった（Ｐ＜０．００６）。ある患者について、ＬＮＬ６遺伝子マーキングとＲＲｚ２遺伝子マーキングの減少差の規模が注入されたＲＲｚ２被形質導入細胞の数と関連しているかどうかを調べるために、各ベクターの減少勾配間の差と、再導入されたＲＲｚ２被形質導入ＣＤ３４＋細胞の数との相関を調べた（スピアマンの順位）。線形回帰によって、ＬＮＬ６とＲＲｚ２マーキングに対する患者特異的な減少勾配を算出し、これらの勾配間の差（ＲＲｚ２−ＬＮＬ６）を、ＲＲｚ２によって媒介される保護の指標として採用した。パネルＧとパネルＨは、ＲＲｚ２被形質導入ＣＤ３４＋細胞用量間のこのような線形関係と信頼区間を表すプロット（点線）、及びＴリンパ球（プロットＨ）とＰＢＭＣ（プロットＧ）では、ＬＮＬ６とＲＲｚ２コピー数（保護指数）に差があることを示している。 被験患者中のＣＤ４＋細胞の絶対数（Ａ）とウイルス量（Ｂ）。
１ｍｍ３当りのＣＤ４＋細胞の絶対数（Ａ）と、血液１ｍＬ当りのＨＩＶ ＲＮＡコピーで表したウイルス量（Ｂ）とが、実験を通じて、患者１−１０について示されている。何人かの患者では、注入から１日後に、ウイルス量が当初増加するのが観察され、これらの患者は、動員期の間に、抗レトロウイルス治療を中止した。形質導入の間に、ＭＭＬＶ逆転写酵素の阻害が起こるかもしれないので、これを防ぐために、プロトコールには、薬剤を中止すること、又はヌクレオシド逆転写酵素阻害剤を非ヌクレオシド逆転写酵素若しくはプロテアーゼ阻害剤に置き換えることを含めた。抗レトロウイルス療法の変更後に、ウイルス血症が時折上昇するのを是正した。
第Ｉ相自家ＣＤ３４＋研究から得られた、患者＃００５中に存在する造血細胞集団の長期マーキング。
ゲル中に示されているのは、注入から２年後の骨髄及び末梢血集団中のＬＮＬ６及びＲＲｚ２でマークされた細胞から得られたＰＣＲ増幅されたバンドである。
第Ｉ相自家ＣＤ３４＋細胞研究から得られた、４人の患者中の末梢血単核球における遺伝子発現。
ＬＮＬ６とＲＲｚ２の両者の発現が、注入から２年の時点で、２人の患者について示されている。発現は、放射標識されたプライマーを用いる逆転写酵素ネステッドＰＣＲ反応で評価した。各試料に、ＲＴを含有しない反応物（ＲＴ−）を含めた。ＲＴの有無が記されている。
患者＃００７中に存在するＴリンパ球（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）部分集団の長期マーキング。
結果は、自家ＬＮＬ６又はＲＲｚ２を形質導入したＣＤ３４＋細胞を注入してから１年後のナイーブ及び記憶ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球中でのマーキングを示している。
ＲＮＡ転写物は、それぞれ、スペーサ（ＳＰ）によって隔てられたセンス（１Ａ、２Ａ、３Ａ）及びアンチセンス（１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ）セグメントを含有する３つのＲＮＡｉユニットを含有している。ＲＮＡｉユニットには、自己切断されるハンマーヘッドリボザイムとヘアピンリボザイム（矢印で示されている位置で切断される）が隣接している。

Claims (42)

  1. 薬学的に許容される担体と、組成物を投与すべきヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも１．６３×１０６のＣＤ３４＋造血細胞とを備え、少なくとも０．５２×１０６のかかるＣＤ３４＋造血細胞に抗ＨＩＶ因子を発現するウイルス構築物が形質導入されている組成物。
  2. ヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも９．３７×１０６のＣＤ３４＋造血細胞を備え、少なくとも５×１０６のかかるＣＤ３４＋造血細胞が形質導入されている、請求項１の組成物。
  3. 前記抗ＨＩＶ因子がＲＮＡである、請求項１の組成物。
  4. 前記抗ＨＩＶ因子がＲＮＡｉ分子である、請求項１の組成物。
  5. 前記抗ＨＩＶ因子がアンチセンス分子である、請求項１の組成物。
  6. 前記抗ＨＩＶ因子がリボザイムである、請求項１の組成物。
  7. 前記抗ＨＩＶ因子が、配列５’ＵＵＡ ＧＧＡ ＵＣＣ ＵＧＡ ＵＧＡ ＧＵＣ ＣＧＵ ＧＡＧ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＵ ＧＧＣ ＵＣＣ−３’を有するヌクレオチドを備えるリボザイムである、請求項１の組成物。
  8. 前記ウイルス構築物がレトロウイルス構築物である、請求項１の組成物。
  9. 前記組成物にサイトカインが実質的に存在しない、請求項１の組成物。
  10. 前記組成物にウイルスが実質的に存在しない、請求項１の組成物。
  11. 前記患者中で前記形質導入されたＣＤ３４＋細胞が生着することができ、且つ子孫細胞を少なくとも１２ヶ月間生み出すことができる、請求項１の組成物。
  12. 薬学的に許容される担体と、組成物を投与すべき患者のｋｇ体重当り少なくとも１．６３×１０６のＣＤ３４＋造血細胞とを備え、少なくとも０．５２×１０６のかかるＣＤ３４＋造血細胞に抗ＨＩＶ因子を発現するウイルス構築物が形質導入されている組成物であって、
    （ａ）前記患者からＣＤ３４＋造血細胞を単離する工程と、
    （ｂ）少なくとも１つのサイトカインとともに前記ＣＤ３４＋造血細胞を培養する工程と、
    （ｃ）前記細胞と前記ウイルス構築物の同所局在を増大させる因子の存在下で、前記ＣＤ３４＋造血細胞に前記抗ＨＩＶ因子を発現するウイルス構築物を形質導入する工程と、
    （ｄ）前記ＣＤ３４＋造血細胞を洗浄する工程と、
    （ｅ）前記ＣＤ３４＋造血細胞を薬学的に許容される担体と混合することによって、前記組成物を取得する工程と、を備えた方法によって製造される組成物。
  13. 工程（ｂ）の培養が少なくとも２つのサイトカインの存在下で行われる、請求項１２の組成物。
  14. 工程（ｂ）の培養が２つのサイトカインの存在下で行われる、請求項１２の組成物。
  15. 工程（ｃ）における前記細胞の形質導入が組換えフィブロネクチン断片の存在下で行われる、請求項１２の組成物。
  16. 薬学的に許容される担体と、組成物を投与すべきヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも１．６３×１０６のＣＤ３４＋造血細胞とを備え、少なくとも０．５２×１０６のかかるＣＤ３４＋造血細胞が形質転換前にＣＤ３４＋細胞中に存在しない目的の遺伝子で形質転換されている組成物。
  17. ヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも９×１０６のＣＤ３４＋造血細胞を備え、少なくとも５×１０６のＣＤ３４＋造血細胞が形質導入されている、請求項１６の組成物。
  18. 前記目的の遺伝子がＲＮＡ因子を発現する、請求項１６の組成物。
  19. 前記患者が成人である、請求項１６の組成物。
  20. 薬学的に許容される担体と、組成物を投与すべきヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも１．６３×１０６のＣＤ３４＋造血細胞とを備え、少なくとも０．５２×１０６のかかるＣＤ３４＋造血細胞が形質転換前にＣＤ３４＋細胞中に存在しない目的の遺伝子で形質転換されている組成物であって、
    （ａ）前記患者からＣＤ３４＋造血細胞を単離する工程と、
    （ｂ）少なくとも１つのサイトカインとともに前記ＣＤ３４＋造血細胞を培養する工程と、
    （ｃ）前記細胞とベクターの同所局在を増大させる因子の存在下で、目的の遺伝子をコードするベクターによって前記ＣＤ３４＋造血細胞を形質転換する工程と、
    （ｄ）前記ＣＤ３４＋造血細胞を洗浄する工程と、
    （ｅ）前記ＣＤ３４＋造血細胞を薬学的に許容される担体と混合することによって、前記組成物を取得する工程と、を備えた方法によって製造される組成物。
  21. ヒト患者の造血細胞中に目的の遺伝子を挿入する方法であって、
    ａ）前記ヒト患者の血液中にＣＤ３４＋造血前駆細胞を動員することと、
    ｂ）血漿交換によって前記患者の血液から白血球を単離することと、
    ｃ）免疫選択的な方法によって前記単離された白血球からＣＤ３４＋造血細胞を単離することと、
    ｄ）前記細胞を形質導入ベクターと同所局在させる因子の存在下で、工程ｃ）の前記ＣＤ３４＋造血細胞を目的の遺伝子による形質転換工程に供することと、
    ｅ）工程ｄ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数を測定することと、総数がヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも１．６３×１０６細胞であれば、次いで、工程ｆ）に進み、工程ｄ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数がヒト患者のｋｇ体重当り１．６３×１０６細胞未満であれば、少なくとも工程ｂ）−ｄ）を実施し、ＣＤ３４＋造血細胞を合流させることと、
    ｆ）前記ＣＤ３４＋造血細胞を前記患者に送達することによって、前記ヒト患者の前記造血細胞中に目的の遺伝子を挿入することと、
    を備えた方法。
  22. 前記細胞を形質転換ベクターと同所存在させる前記因子がフィブロネクチンの断片である、請求項２１の方法。
  23. 骨髄切除せずに工程ｆ）を行う、請求項２１の方法。
  24. 前記患者中に造血前駆細胞を動員する工程が、前記造血前駆細胞を動員するのに十分な量のサイトカインを前記患者に投与することによって行われる、請求項２１の方法。
  25. 前記患者の血液から白血球を単離する工程で、血漿交換が少なくとも２回行われる、請求項２１の方法。
  26. 目的の遺伝子による形質導入工程に前記ＣＤ３４＋造血細胞を供する工程が、組換えフィブロネクチン断片の存在下で行われる、請求項２１の方法。
  27. 少なくとも２つのサイトカインの存在下で、工程ｃ）の単離されたＣＤ３４＋造血細胞を培養する工程をさらに備える、請求項２１の方法。
  28. 前記ヒト患者が成人のヒト患者である、請求項２１の方法。
  29. 前記目的の遺伝子が抗ＨＩＶ因子をコードする、請求項２１の方法。
  30. 前記抗ＨＩＶ因子がＲＮＡである、請求項２９の方法。
  31. 前記抗ＨＩＶ因子がアンチセンス分子である、請求項２９の方法。
  32. 前記抗ＨＩＶ因子がリボザイムである、請求項２９の方法。
  33. 前記抗ＨＩＶ因子が、配列５’−ＵＵＡ ＧＧＡ ＵＣＣ ＵＧＡ ＵＧＡ ＧＵＣ ＣＧＵ ＧＡＧ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＵ ＧＧＣ ＵＣＣ−３’を有するヌクレオチドを備えるリボザイムである、請求項３２の方法。
  34. 工程ｅ）において、工程ｄ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数がヒト患者のｋｇ体重当り１．６３×１０６細胞未満であれば、工程ｄ）で得たＣＤ３４＋造血細胞を低温で保存し、工程ａ）−ｄ）を繰り返し、低温で保存した任意の細胞と工程ｄ）で得た前記細胞とを合流させる工程をさらに包含する、請求項２１の方法。
  35. ヒト患者の造血細胞中に目的の遺伝子を挿入する方法であって、
    ａ）前記患者の血液中にＣＤ３４＋造血前駆細胞を動員することと、
    ｂ）血漿交換によって前記患者の血液から白血球を単離することと、
    ｃ）免疫選択的な方法によって前記単離された白血球からＣＤ３４＋造血細胞を単離することと、
    ｄ）工程ｃ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数を測定することと、総数がヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも１．６３×１０６細胞であれば、次いで、工程ｅ）に進み、工程ｃ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数がヒト患者のｋｇ体重当り１．６３×１０６細胞未満であれば、工程ｂ）−ｃ）を実施して、前記ＣＤ３４＋造血細胞と合流させることと、
    ｅ）前記細胞を形質導入ベクターと同所に局在させる因子の存在下で、工程ｃ）の前記ＣＤ３４＋造血細胞を目的の遺伝子による形質転換工程に供することと、
    ｆ）前記ＣＤ３４＋造血細胞を前記患者に送達することによって、前記ヒト患者の造血細胞中に目的の遺伝子を挿入することと、
    を備えた方法。
  36. 前記細胞を形質転換ベクターと同所に局在させる前記因子がフィブロネクチンの断片である、請求項３５の方法。
  37. 配列５’−ＵＵＡ ＧＧＡ ＵＣＣ ＵＧＡ ＵＧＡ ＧＵＣ ＣＧＵ ＧＡＧ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＵ ＧＧＣ ＵＣＣ−３’を有するヌクレオチドを備えたリボザイムを発現する遺伝子をヒト患者の造血細胞中に挿入する方法であって、
    ａ）前記造血前駆細胞を動員するのに十分な量のサイトカインを前記患者に投与することによって、前記患者の血液中にＣＤ３４＋造血前駆細胞を動員することと、
    ｂ）血漿交換を少なくとも２回行うことによって前記患者の血液から白血球を単離することと、
    ｃ）免疫選択的な方法によって前記単離された白血球からＣＤ３４＋造血細胞を単離することと、
    ｄ）サイトカインの存在下において、培地中で、工程ｃ）の単離されたＣＤ３４＋造血細胞を約１日間培養することと、
    ｅ）組換えフィブロネクチン断片の存在下で、前記細胞中に配列５’−ＵＵＡ ＧＧＡ ＵＣＣ ＵＧＡ ＵＧＡ ＧＵＣ ＣＧＵ ＧＡＧ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＵ ＧＧＣ ＵＣＣ−３’を有するヌクレオチドを備えるリボザイムを生じさせるベクターを備えたレトロウイルスによる形質導入工程に、工程ｄ）のＣＤ３４＋造血前駆細胞を供することと、
    ｆ）工程ｅ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数を測定することと、総数がヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも１．６３×１０６細胞であれば、次いで、工程ｇ）に進み、工程ｅ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数がヒト患者のｋｇ体重当り１．６３×１０６細胞未満であれば、工程ｂ）−ｅ）を実施して、ＣＤ３４＋造血細胞を合流させることと、
    ｇ）骨髄切除せずに、前記ＣＤ３４＋造血細胞を前記患者に送達することにより、前記リボザイムを発現する遺伝子を前記ヒト患者の造血細胞中に挿入することと、
    を備えた方法。
  38. 請求項１の組成物を調製する方法であって、
    ａ）前記患者の血液中にＣＤ３４＋造血前駆細胞を動員することと、
    ｂ）血漿交換によって前記患者の血液から白血球を単離することと、
    ｃ）免疫選択的な方法によって前記単離された白血球からＣＤ３４＋造血細胞を単離することと、
    ｄ）前記細胞を形質導入ベクターと同所に局在させる因子の存在下で、工程ｃ）の前記ＣＤ３４＋造血細胞を目的の遺伝子による形質転換工程に供することと、
    ｅ）工程ｄ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数を測定することと、工程ｄ）後のＣＤ３４＋造血細胞の総数がヒト患者のｋｇ体重当り１．６３×１０６細胞未満であれば、工程ｂ）−ｄ）を再度実施して、ＣＤ３４＋造血細胞を合流させることと、
    を備えた方法。
  39. 薬学的に許容される担体と、組成物を投与すべきヒト患者のｋｇ体重当り少なくとも１．６３×１０６のＣＤ３４＋造血細胞とを備え、ｋｇ当り少なくとも０．５２×１０６のかかるＣＤ３４＋細胞に抗ＨＩＶ因子を発現するウイルス構築物が形質導入されている組成物の使用であって、ＨＩＶに感染したヒト患者を治療するための医薬を製造するための使用。
  40. 請求項３５の方法を実施する際に使用するための要素を備えたキット。
  41. ａ）ヒト患者中に造血前駆細胞を動員することができる量の因子と、
    ｂ）ＣＤ３４＋造血細胞を培養するのに適合した少なくとも１つのサイトカインを含む培地と、
    ｃ）細胞中に配列５’−ＵＵＡ ＧＧＡ ＵＣＣ ＵＧＡ ＵＧＡ ＧＵＣ ＣＧＵ ＧＡＧ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＵ ＧＧＣ ＵＣＣ−３’を有するリボザイムを生じさせる配列を有するヌクレオチドを備えたレトロウイルスベクターと、
    ｄ）内部が組換えフィブロネクチン断片で被覆された組織培養容器と、
    を備えたキット。
  42. 請求項４１のキットと該キットを使用するための使用書とを備えたパッケージ。
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