JP2016501526A - 治療用アポトーシス細胞調製物、その製造方法及びその使用 - Google Patents

治療用アポトーシス細胞調製物、その製造方法及びその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】【解決手段】本発明は、初期アポトーシス状態の単核豊富細胞の集団を含む医薬組成物、前記組成物の製造方法、及び病的免疫応答によって特徴付けられる疾患の治療におけるその使用を提供する。医薬組成物は、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、及び炎症性腸疾患、痛風及び関節炎を含むがこれらに限定されない自己免疫疾患、を含むがこれらに限定されない症状の治療に使用され得る。【選択図】なし

Description

本発明は、アポトーシス細胞を含む治療用細胞集団、特に、初期アポトーシス状態の単核細胞豊富細胞を含む組成物、当該組成物の製造方法、及び病的免疫応答によって特徴付けられる疾患の治療における当該組成物の使用に関する。
病的免疫応答によって特徴付けられる疾患は、著しい死亡率及び罹患率に関連する多くの疾患、特に全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等の自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等の移植関連疾患を含む。自己免疫疾患は通常、２つの一般的な種類、すなわち、全身性自己免疫疾患（例えば、ＳＬＥ及び強皮症）及び臓器特異的自己免疫疾患（例えば多発性硬化症及び糖尿病）に分類され得る。
免疫抑制薬は、移植された臓器及び組織（例えば、骨髄、心臓、腎臓、肝臓）の拒絶の治療又は予防のためや、自己免疫疾患又はおそらく自己免疫起源である疾患（例えば、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、クーロン病、ベーチェット病、天疱瘡、ぶどう膜炎、及び潰瘍性大腸炎）の治療のためや、他の非自己免疫炎症性疾患の一部（例えば、長期アレルギー性喘息コントロール）並びに移植関連疾患（例えば、ＧＶＨＤ）の治療のために使用されてきた。しかしながら、免疫抑制薬治療は、多く合併症をもたらすことがあり、病的免疫反応を扱う改善された方法が求められている。
米国及びヨーロッパでは毎年約３０，０００人の患者が同種骨髄移植（ＢＭＴ）を経験している。同種骨髄移植（ａｌｌｏ−ＢＭＴ）では、患者へのドナー骨髄の注入は、２つの免疫系からの細胞の相互作用を伴う。同種移植を受ける患者の調整レジメンは、免疫系を抑制することによってドナー幹細胞を患者に移植することができる。一旦ドナー免疫細胞が患者の体に樹立されると、該細胞は、任意の残留癌細胞を含む患者自身の組織及び細胞を、異なった又は外来であると認識し得る。次いで、免疫系は、肝臓、胃腸管又は皮膚等のある臓器に損傷を起こし得る。この効果は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）として知られている。
今日現在、ＧＶＨＤ予防は、カルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）、シクロスポリン又はタクロリムスを含む免疫抑制薬と、メトトレキサート、マイコフェノレートモフェチル（ＭＭＦ）又はシロリムスのいずれかとの組合せを含む。しかしながら、急性ＧＶＨＤは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）一致の同胞由来の移植を受けるＢＭＴ患者の３５％〜７０％で依然として起こり、非関連ドナー移植レシピエントではもっと頻繁に起こる。
カルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）は、急性ＧＶＨＤを部分的に阻害するが、それらは、Ｔ細胞発達を阻害し、疾患再発のリスクを増加させることによって免疫再構成を修復し得る。従って、同種ＢＭＴを経験している血液系腫瘍を有する患者は、ＣＮＩの使用を最小限にし、ＧＶＨＤを予防し、有利な移植片対腫瘍効果を含む機能性免疫系を維持する、ＧＶＨＤ予防を必要とする。
米国特許第６，５２４，８６５号明細書（特許文献１）、米国特許第６，６０７，７２２号明細書（特許文献２）及び米国特許第７，１０９，０３１号明細書（特許文献３）、並びに米国特許出願公開第２０１０／０２６７１３７号（特許文献４）、米国特許出願公開第２０１０／０１８３７３６５号（特許文献５）は、免疫抑制レシピエント樹状細胞の産生に関し、移植又はインプラントに対する免疫応答を減少させることを意図した、樹状細胞を壊死又はアポトーシスドナー白血球と接触させることに関する。
本発明の発明者の１人に関する国際公開ＷＯ２００２／０６０３７６号（特許文献６）は、対象における全身性自己免疫疾患の治療方法であって、該対象から得られたアポトーシス及び／又は壊死細胞の投与による方法を開示する。
本発明の発明者の１人に関する国際公開ＷＯ２００６／１１７７８６号（特許文献７）は、病的免疫応答によって特徴付けられる疾患の治療のための瀕死白血球又は死白血球を含む細胞調製物の使用を更に開示する。瀕死白血球又は死白血球は、表面に接着させるために生きた白血球を誘導することによって得られ、該対象において病的免疫応答を抑制することができる。
本願の優先日後に公表されたメヴォラッチ（Mevorach）等による研究では、関連したドナーからのＨＬＡ一致骨髄破壊的同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後の、急性移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の予防法としての、ドナー単核初期アポトーシス細胞の注入について考察されている（Mevorach et al., ePub October, 2013, Biol Blood Marrow Transplant（非特許文献１））。
血液細胞収集中に抗凝固剤を使用することは日常的である。細胞保存において、抗凝固剤の使用は細胞収率を改善すると報告されてきた。マツモト（Matsumoto）等は、ウイスコンシン大学（ＵＷ）液中での保存を含む様々な条件下で末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）の保存と、自家血清及び抗凝固剤溶液酸クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）溶液Ａ中での低体温保存とを比較した。顆粒球マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）の生存は、４℃での自家血清及びＡＣＤ−Ａ中での液低体温保存、又は８０℃での低温保存で達成された生存よりも、ＵＷ液で有意に見出された（Matsumoto et al., 2002, Bone Marrow Transplantation, 30(11): 777-784（非特許文献２））。バーガー（Burger）等は、細胞の低温保存又はＡＣＤ−Ａ添加のために回収された血漿へのヘパリンの添加は、凍結溶液のゼラチン化を抑制した（Burger, S.R. et al., 1996, Transfusion, 36: 798-801（非特許文献３））。国際公開ＷＯ２００３／００６６９１号（特許文献８）には、ヘパリン含有ＣＤ３４＋細胞用の細胞低温保存培地が開示されている。カオ（Kao）等の文献には、ＡＣＤ−Ａ及び／又はヘパリン含有培地中で、４℃又は２０℃での、骨髄細胞、末梢血幹細胞又は末梢血単核細胞生成物の保存が開示されている（Kao et al., 2011, Transfusion, 51: 137-147（非特許文献４））。米国特許第６，４８９，３１１号明細書（特許文献９）には、細胞アポトーシスを抑制するための抗凝固剤の使用が開示されている。
自己免疫疾患及び炎症性疾患及び移植関連疾患を含む免疫疾患を治療又は予防するための組成物及び方法の要求は、依然として満たされていない。例えば、ＧＶＨＤは、３０％〜７０％の推定発生率を有し、成功的な同種血液又は骨髄移植にとって主な障害となっており、ＧＶＨＤ予防のための最適な方法は未だ確率されていない。特に、安全に、信頼性があり、再現可能でかつ効果的な方法でＧＶＨＤを予防又は緩和する組成物及び方法を得ることが必須である。
米国特許第６，５２４，８６５号明細書 米国特許第６，６０７，７２２号明細書 米国特許第７，１０９，０３１号明細書 米国特許出願公開第２０１０／０２６７１３７号 米国特許出願公開第２０１０／０１８３７３６５号 国際公開ＷＯ２００２／０６０３７６号 国際公開ＷＯ２００６／１１７７８６号 国際公開ＷＯ２００３／００６６９１号 米国特許第６，４８９，３１１号明細書
Mevorach et al., ePub October, 2013, Biol Blood Marrow Transplant Matsumoto et al., 2002, Bone Marrow Transplantation, 30(11): 777-784 Burger, S.R. et al., 1996, Transfusion, 36: 798-801 Kao et al., 2011, Transfusion, 51: 137-147
本発明は、治療用の初期アポトーシス細胞集団に関する。特に、本発明は、初期アポトーシス細胞の単核豊富細胞（mononuclear-enriched cell）の明瞭な調製物、その改善された製造方法、及び病的免疫応答によって特徴付けられた疾患の治療における臨床現場でのその使用に関する。かかる疾患の例は、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、クーロン病、潰瘍性大腸炎を含むが、これらに限定されない。加えて、本発明は、初期アポトーシス状態の単核豊富細胞を含む治療用組成物を取得するための方法、安定かつ再現可能な細胞収率、及びその使用を提供する。
本発明は、一部では、骨髄細胞の移植に加えて、別個の注入で投与された単核豊富な初期状態アポトーシス細胞が、ＧＶＨＤに対して緩和的又は予防的効果を有するとの発見に基づく。特に、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受ける造血器腫瘍に罹患した対象への本発明のアポトーシス細胞調製物の注入は、急性高グレードＧＶＨＤ（例えば、グレードＩＩ〜ＩＶ）の発生を誘発する点で効果的であった。加えて、アポトーシス細胞集団は、前記対象における肝毒性の発生を顕著に減少させ、場合によってはＨＳＣＴの生着までの期間を減少させることが分かった。
本発明はまた、一部では、本発明のアポトーシス細胞組成物の１回注入が、ＩＢＤの異なった種類の動物モデルでの臨床スコア及び組織学的損傷の両方を有意に緩和したとの発見に基づく。
臨床現場における本発明の実施化中に、本発明の発明者らは、特定のドナーの血液から本発明の細胞調製物を製造すると、異なる調製物間で低い及び／又は不安的な細胞収率をもたらすという問題に遭遇した。場合によっては、細胞収率は、得られた組成物中の細胞凝集物の形成によって悪影響を受けた。この問題は、高レベルの血液トリグリセリドを有するドナー由来の細胞を用いて製造された組成物において特に高頻度に見られた。低細胞収率及び／又は凝集体の形成のこれらの問題を解決するために、（細胞回収中にきまって使用された抗凝固剤に加えて）アポトーシスの誘導の１又はそれ以上のステージ中の抗凝固剤の使用が、組成物中に高くかつ安定な細胞収量をもたらすことが見出された。更に、細胞回収に使用されたプロトコルにかかわらず、アポトーシスの誘導の１又はそれ以上のステージ中の抗凝固剤の添加が、本発明の組成物の異なった調製物中の高くかつ安定な細胞収量の維持を可能にした。いくつかの実施形態によれば、以下に例示されるように、アポトーシスの誘導の１又はそれ以上のステージ中の抗凝固剤の添加は、高くかつ安定な細胞収率（アポトーシスが誘導された初期細胞のうち、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、典型的には少なくとも５０％の細胞）を有する組成物の製造を可能にする。各可能性は本発明の別の実施形態を表す。
以下に例示されるように、高いトリグリセリドレベル又は通常のトリグリセリドレベルの存在下で細胞組成物を製造する際に、かかる高くかつ安定な細胞収率はともに観察される。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞組成物の１又はそれ以上の生存段階中の抗凝固剤の使用は、該組成物中の生細胞の高くかつ安定な細胞収率、及び／又は該組成物中の初期アポトーシスステージの細胞の高くかつ安定な細胞収率をもたらす。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。従って、本発明は、初期アポトーシスの、安定でかつ高生存単核細胞豊富細胞組成物、前記細胞組成物の改善された製造方法、及び自己免疫疾患及び炎症性疾患を治療又は緩和する点でのその使用を提供する。
一態様によれば、本発明は、単核豊富細胞を含む細胞調製物であって、少なくとも８５％の単核細胞を含み、該調製物中の細胞の少なくとも４０％が初期アポトーシス状態にあり、該調製物中の細胞の少なくとも８５％が生細胞であり、該調製物が１５％以下のＣＤ１５ｈｉｇｈ発現細胞（CD15high expressing cell）を含むことを特徴とする調製物を提供する。
別の態様によれば、本発明は、本発明の細胞調製物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、前記調製物を含む組成物は抗凝固剤を更に含む。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、ヘパリン、ＡＣＤフォーミュラ（formula）Ａ又はそれらの組合せから選択される。各々の可能性は、本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、患者への前記細胞調製物の投与に用いられる最終懸濁媒体を含む該組成物中のヘパリンは、０．００５〜２．５Ｕ／ｍｌの濃度で存在する。別の実施形態によれば、患者への前記細胞調製物の投与に用いられる最終懸濁媒体を含む該組成物中のヘパリンは、０．０１〜１Ｕ／ｍｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態によれば、患者への前記細胞調製物の投与に用いられる最終懸濁媒体を含む該組成物中のＡＣＤフォーミュラＡは、０．０１〜１０％ｖ／ｖの濃度で存在する。他の実施形態によれば、患者への前記細胞調製物の投与に用いられる最終懸濁媒体を含む該組成物中のＡＣＤフォーミュラＡは、０．０５〜５％ｖ／ｖの濃度で存在する。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、３０μｇ／ｍｌを超えない濃度で残りのメチルプレドニゾロンを更に含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、１０％以下のＣＤ１５ｈｉｇｈ発現細胞を更に含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物中の細胞は、異質遺伝子型ドナーから回収される。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物中の細胞は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）方法で使用される造血幹細胞（ＨＳＣ）のドナーと同一のドナーから回収される。非限定的な例によれば、ドナーからの細胞の回収は、白血球除去法によって影響を受ける。ある実施形態によれば、単核豊富細胞調製物は自家細胞を含むことになる。
当分野で知られているように、抗凝固剤は通常、細胞回収手順（白血球除去法を含むがこれに限定されない）中に使用されることに留意されたい。本発明のいくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、本発明の組成物の調製中に使用される少なくとも１つの媒体に更に添加される。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物の調製中に使用される少なくとも１つの媒体は、凍結媒体、洗浄媒体、アポトーシス誘導インキュベーション媒体及びそれらの組合せからなる群より選択される。各々の可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、ヘパリン、ＡＣＤフォーミュラＡ及びこれらの組合せからなる群より選択される。各々の可能性は本発明の別の実施形態を示す。当分野で知られている他の抗凝固剤（例えばフォンダパリヌクス、ビバリルジン及びアルガトロバンを含むがこれらに限定されない）もまた本発明に従って使用し得ることに留意されたい。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物の調製で使用される少なくとも１つの媒体は、１０Ｕ／ｍｌのへパリンを含む５％のＡＣＤフォーミュラＡ液を含む。典型的な実施形態によれば、抗凝固剤は、本発明の細胞組成物の最終懸濁媒体に添加されない。本明細書で使用される用語「最終懸濁媒体」及び「投与媒体」は同じ意味で使用される。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物の調製で使用される少なくとも１つの媒体は、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌの濃度のヘパリンを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物の調製で使用される少なくとも１つの媒体は、１〜１５％ｖ／ｖの濃度でＡＣＤフォーミュラＡを含む。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体は抗凝固剤を含む。他の実施形態によれば、インキュベーション媒体は抗凝固剤を含む。好ましい実施形態によれば、凍結媒体及びインキュベーション媒体のいずれも凝固剤を含む。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、ヘパリン、ＡＣＤフォーミュラＡ及びこれらの組合せからなる群より選択される。各々の可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、凍結媒体中のへパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌの濃度にある。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体中のＡＣＤフォーミュラＡは、１％〜１５％ｖ／ｖの濃度にある。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中のへパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌの濃度にある。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中のＡＣＤフォーミュラＡは、１〜１５％ｖ／ｖの濃度にある。特定の実施形態によれば、抗凝固剤は、クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）フォーミュラＡの溶液である。更なる実施形態では、以下に例示するように、本発明の組成物の調製中に使用される少なくとも１つの媒体に添加される抗凝固剤は、１０Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含むＡＣＤフォーミュラＡである。
いくつかの実施形態によれば、本発明の単核豊富細胞調製物は、少なくとも８５％の単核細胞、好ましくは少なくとも９０％の単核細胞を含む。各可能性は本発明の別個の実施形態である。いくつかの実施形態によれば、細胞調製物は、少なくとも９０％の単核細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、細胞調製物は、少なくとも９５％の単核細胞を含む。
更なるいくつかの実施形態によれば、本発明の単核豊富細胞調製物は、リンパ球、単核細胞及びナチュラルキラー細胞からなる群より選択される細胞種を含む。更なる実施形態では、単核豊富細胞調製物は、１５％以下、又は１０％以下、典型的には５％以下の、顆粒白血球．（すなわち、好中球、好塩基球、及び好酸球）としても知られている、多形核白血球を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。更に別の実施形態によれば、単核豊富細胞調製物は、１５％以下、又は１０％以下、典型的には５％以下の、ＣＤ１５ｈｉｇｈ発現細胞を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
別の態様によれば、本発明は、本発明の組成物の製造方法であって、ドナーの末梢血から、少なくとも６５％の単核細胞を含む単核豊富細胞調製物を取得するステップと、単核豊富細胞調製物を凍結媒体中で凍結するステップと、単核豊富細胞調製物を解凍するステップと、約１０〜１００μｇ／ｍＬの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含むアポトーシス誘導インキュベーション媒体中で単核豊富細胞調製物をインキュベートするステップと、細胞調製物を投与媒体中に懸濁し、それによって本発明の組成物を提供するステップとを含み、凍結媒体及びアポトーシス誘導インキュベーション媒体の少なくとも１つが抗凝固剤を含むことを特徴とする製造方法を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法で使用されるアポトーシス誘導インキュベーション媒体は、抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法で使用される凍結媒体及びアポトーシス誘導インキュベーション媒体のいずれも、抗凝固剤を含む。任意の理論又はメカニズムに拘束されるものではないが、異なる細胞組成物において高くかつ安定的な細胞収率を維持するためには、細胞回収プロトコルにかかわらず、本発明の組成物の製造中に、凍結媒体及びアポトーシス誘導インキュベーション媒体の両方に抗凝固剤を添加することが好ましい。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞組成物中の高くかつ安定的な細胞収率は、アポトーシス誘導のために使用される初期細胞集団の細胞の、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、典型的には少なくとも５０％の細胞収率である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。本明細書で使用される用語「インキュベーション媒体」及び「アポトーシスインキュベーション媒体」は同じ意味で使用される。
いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は少なくとも約６時間冷凍される。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は少なくとも約１２時間冷凍される。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は約１２時間冷凍される。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、少なくとも８、１０、１２、１８、２４時間冷凍される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法に従う解凍された細胞をインキュベートするステップは、約２〜１２時間、場合により４〜８時間、典型的には約６時間に及ぶ。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法に従う解凍された細胞をインキュベートするステップは、約６時間に及ぶ。いくつかの実施形態によれば、インキュベートするステップは少なくとも６時間に及ぶ。
いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞調製物を取得するステップは、白血球除去法によって達成される。あるいくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従う単核豊富細胞調製物の取得は、回収時に少なくとも６５％、場合により少なくとも７０％、典型的には少なくとも８０％の単核細胞を含む調製物の取得を意味する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従う凍結ステップは、本発明の細胞調製物中の単核細胞の初期アポトーシス状態を誘導する点で最初のステップである。本明細書で使用される用語「凍結」及び「低温保存」は同じ意味で使用される。
いくつかの実施形態によれば、アポトーシス誘導インキュベーション媒体は、アポトーシス誘導剤を含み、かかる媒体中でのインキュベーションは、本発明の細胞調製物中の単核細胞の初期アポトーシス状態を誘導する第２のステップとなる。いくつかの実施形態によれば、アポトーシス誘導剤はメチルプレドニゾロンである。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体は、約５〜１００μｇ／ｍＬ、場合により約４０〜６０μｇ／ｍＬの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体は、約５０μｇ／ｍＬの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含む。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーション中の細胞濃度は約０．５×１０６〜１０×１０６の範囲である。ある実施形態によれば、インキュベーション中の細胞濃度は約５×１０６細胞／ｍｌである。
別の態様によれば、本発明は、免疫疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は緩和を必要とする対象において、これらの疾患を予防又は緩和する方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、免疫疾患は移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）である。いくつかの実施形態によれば、免疫疾患は高グレードのＧＶＨＤである。いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＧＶＨＤの予防又は緩和を必要とする対象においてＧＶＨＤを予防又は緩和する方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。
いくつかの実施形態によれば、ＧＶＨＤは、高グレードのＧＶＨＤの発生を予防するために緩和される。特定の実施形態では、高グレードのＧＶＨＤはグレードＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤである。別の特定の実施形態では、高グレードのＧＶＨＤはグレードＩＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤである。特定の実施形態によれば、医薬組成物は、高グレードのＧＶＨＤからグレードＩのＧＶＨＤへのシフトを誘導する。別の特定の実施形態によれば、ＧＶＨＤは急性ＧＶＨＤである。更に別の実施形態では、ＧＶＨＤは慢性ＧＶＨＤである。別の特定のいくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞調製物を含む医薬組成物を対象に投与する方法は、高グレードのＧＶＨＤを予防し、同時に、対象は移植片対腫瘍効果又は移植片対白血病効果（ＧＶＬ効果）を維持する。いくつかの実施形態によれば、本発明の治療方法の後、対象は移植片対白血病効果（ＧＶＬ効果）を維持している。
別の実施形態によれば、本医薬組成物は、ＧＶＨＤに関連した肝毒性を減少させる。いくつかの実施形態によれば、前記ＧＶＨＤは肝臓ＧＶＨＤである。
別の実施形態によれば、対象は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受けている。いくつかの実施形態によれば、ＨＳＣＴは、同種異系ＨＳＣＴである。いくつかの実施形態によれば、ＨＳＣＴは同種異系のＨＳＣＴであり、本発明の医薬組成物は造血幹細胞の同一ドナーから得られた細胞を含む。特定のいくつかの実施形態によれば、前記対象は造血器腫瘍に罹患している。いくつかの実施形態によれば、前記造血器腫瘍は、白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、及び多発性骨髄腫（すなわち、形質細胞障害）からなる群より選択される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。例示的な態様によっては、前記造血器腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、及び慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）からなる群より選択される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
他のいくつかの実施形態によれば、対象は固形臓器移植を受けている。固形臓器移植は、肺、心臓、腎臓、膵臓、肝臓及び小腸から選択される臓器を含むが、これらに限定されない。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、移植された臓器と同一又は異なったドナーから得られる細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、本発明のアポトーシス細胞は自家細胞である。
別の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、移植レシピエントに投与された調整処置後に投与される。別の実施形態によれば、医薬組成物は、移植の１日前から移植の１５日後までに間に投与される。別の実施形態によれば、医薬組成物の投与は、移植の最大３０時間前までに行われる。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物の投与は、移植の最大２４時間前までに行われる。特定のいくつかの実施形態によれば、医薬組成物の投与は、移植の約２４〜３０時間前までに行われる。更に別の実施形態によれば、医薬組成物の投与は、移植と同時に行われる。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は静脈内に投与される。別の実施形態によれば、医薬組成物は単回投与される。別の実施形態によれば、医薬組成物は複数回投与される。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は静脈内投与用に製剤化される。
更なる実施形態によれば、炎症性疾患は関節炎であり、リウマチ様関節炎を含むがこれに限定されない。いくつかの実施形態によれば、本発明は、関節炎の予防又は緩和を必要としている対象において関節炎を予防又は緩和する方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与するステップを含む方法を提供する。別の実施形態によれば、炎症性疾患は痛風である。いくつかの実施形態によれば、本発明は、痛風の予防又は緩和を必要としている対象において痛風を予防又は緩和する方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与するステップを含む方法を提供する。
更なる実施形態によれば、炎症性疾患は炎症性腸疾患である。いくつかの実施形態によれば、炎症性腸疾患は、クーロン病、潰瘍性大腸炎及びそれらの組合せから選択される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明は、クーロン病、潰瘍性大腸炎及びそれらの組合せから選択される炎症性疾患の予防又は緩和を必要とする対象において炎症性疾患の予防又は緩和方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、対象における免疫疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は緩和における使用のための本発明の医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、対象におけるＧＶＨＤの予防又は緩和における使用のための本発明の医薬組成物を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明は、対象におけるクーロン病及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択される炎症性腸疾患の予防又は緩和における使用のための本発明の医薬組成物を提供する。可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、免疫疾患又は自己免疫疾患又は炎症性疾患を予防又は緩和するための医薬の製造のための本発明の医薬組成物を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の説明及び図面から明らかになるであろう。
ＡｐｏＣｅｌｌ細胞調製物との接触後に未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）の成熟阻害を示すインビトロ効能アッセイを示す。ＬＰＳ処置ｉＤＣとの相互作用、及びＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ８６発現レベルの検出後に、アポトーシス細胞調製物の寛容原性効果を試験した。結果は１患者の代表である。 アポトーシス細胞の単回投与を受ける患者において全生存の増加割合を示すヒストグラムである。本明細書に開示された方法に従って調製された３５〜２１０×１０６アポトーシス細胞を受ける、コホートＩ〜ＩＶ（ｎ＝１３）の４つ全てにおける移植患者の生存率（パーセント）を、試験の４５日、１００日及び１８０日で表示する。 アポトーシス細胞の単回投与を受ける患者において非再発生存の増加割合を示すヒストグラムである。本明細書に開示された方法に従って調製された３５〜２１０×１０６アポトーシス細胞を受ける、コホートＩ〜ＩＶ（ｎ＝１３）の４つ全てにおける移植患者の生存率（パーセント）を、試験の４５日、１００日及び１８０日で表示する。 院内記録からの整合対照群の生存率（ｎ＝２５；既存対照）と比べた、ＡｐｏＣｅｌｌ組成物の単回注入を受けた骨髄移植患者の移植関連死亡率（ｎ＝１３；ＡｐｏＣｅｌｌ）を示すヒストグラムである。 各コホートにおける処置患者のための最初の退院までの期間を示すヒストグラムである。 単回の高用量のアポトーシス細胞を投与される移植患者におけるグレードＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤの減少した発生を示すヒストグラムである。アポトーシス細胞集団を投与される４つのコホートＩ（３５×１０６アポトーシス細胞）、ＩＩ（７０×１０６アポトーシス細胞）、ＩＩＩ（１４０×１０６アポトーシス細胞）及びＩＶ（２１０×１０６アポトーシス細胞）の各々における、急性グレードＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤを発症している移植患者の数（パーセント）。明らかに、より高用量処置群（コホートＩＩＩ及びＩＶ）の患者は急性グレードＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤを発症しなかった。 アポトーシス細胞調製物（３５〜２１０×１０６アポトーシス細胞；ＡｐｏＣｅｌｌ）の単回投与を受ける１３人の移植レシピエントにおけるグレードＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤの減少した発生を、院内記録からの２５の一致した既存対照（既存対照）と比較して示すヒストグラムである。 アポトーシス細胞の単回投与を受ける移植患者の肝毒性の減少した発生を説明するヒストグラムである。３５〜２１０×１０６のアポトーシス細胞調製物から受ける、４つのコホートＩ−ＩＶ（ｎ＝１３；カラム２）の全てにおいて肝毒性を発症する移植患者の割を、病因記録由来の整合対照群ｎ＝１８；カラム１）及び長期間記録された移植患者（ｎ＝１１４８；カラム３）のそれと比較した（グーリーらの文献、同前論文）。 アポトーシス細胞の単回投与を受ける移植患者の肝毒性の減少した発生を説明するヒストグラムである。アポトーシス細胞を受ける、４つのコホートＩ（３５×１０６アポトーシス細胞）（カラム１）、ＩＩ（７０×１０６アポトーシス細胞）（カラム２）、ＩＩＩ（１４０×１０６アポトーシス細胞）（カラム３）及びＩＶ（２１０×１０６アポトーシス細胞）（カラム４）の各々の移植患者の肝毒性の発生。 アポトーシス細胞の単回投与を受ける移植後患者における血漿バイオマーカー（ＴＮＦＲ１）の動態を示す。 アポトーシス細胞の単回投与を受ける移植後患者における血漿バイオマーカー（ＩＬ−２Ｒａ）の動態を示す。 アポトーシス細胞の単回投与を受ける移植後患者における血漿バイオマーカー（ＩＬ−１５）の動態を示す。 アポトーシス細胞の単回投与を受ける移植後患者における血漿バイオマーカー（ＩＬ−１β）の動態を示す。 アポトーシス細胞の単回投与を受ける移植後患者における血漿バイオマーカー（ＨＧＦ）の動態を示す。 アポトーシス細胞の単回投与を受ける移植後患者における血漿バイオマーカー（ＩＬ−８）の動態を示す。 アポトーシス細胞の単回投与を受ける移植後患者における血漿バイオマーカー（ＩＬ−７）の動態を示す。 アポトーシス細胞の単回投与を受ける移植後患者における血漿バイオマーカー（ＩＬ−６）の動態を示す。 Ｔ細胞転移誘導大腸炎由来のアポトーシス細胞調製物の保護効果を説明するグラフである。Ｒａｇ１−／−マウスは、ＷＴ ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ（●）、又はＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴ細胞のみ（■）、又はアポトーシス細胞との組合せ（▲）を受けた。表示した動物数の平均体重／群（＊ｐ＜０．０５，ｔ−検定）。 Ｔ細胞転移誘導大腸炎由来のアポトーシス細胞調製物の保護効果を説明するグラフである。ＩＢＤ臨床スコア。ボックス内の数値は、エラーバー付き各パラメータの平均スコアを示す（＊ｐ＜０．０２，ｔ−検定）。３つの独立実験の平均±ＳＥＭとしてデータを示す。体重変化及び便の硬さを毎日監視した。注目すべきは、いずれのマウス群でも血便は検出されなかった。 Ｔ細胞転移誘導大腸炎由来のアポトーシス細胞調製物の保護効果を説明するグラフである。非処置動物及びコントロールリンパ節（膝窩）と比べたＡｐｏＣｅｌｌ後の腸間膜リンパ節中の制御したＴ制御細胞を示す。 マウスのマクロファージ由来のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導カスパーゼ−１媒介ＩＬ−１β放出を示す棒グラフである。マウスの一次常在型腹腔マクロファージ（ｐＭΦ）は、リポ多糖（ＬＰＳ）、非処理（左側）、又は３％のＤＳＳ及びｚ−ＹＶＡＤ−ｆｍｋ（１０μＭ）の表示した組み合わせで処理された。ＩＬ−１β放出は、ＥＬＩＳＡによって上清中で決定した。代表的なデータを、３点での３つの独立実験の平均±ＳＥＭとして示す（＊ｐ＜０．０２、ｔ検定）。 ３％のＤＳＳ及び／又はＬＰＳで処置したマウスの一次常在型腹腔マクロファージ（ｐＭΦ）によるＩＬ−１β放出を比較する棒グラフである。ＩＬ−１β放出に対する効果は、細胞外Ｋ＋（１３０ｍＭ）での処理後のＥＬＩＳＡによって、上清で決定された。 ３％のＤＳＳ及び／又はＬＰＳで処置したマウスの一次常在型腹腔マクロファージ（ｐＭΦ）によるＩＬ−１β放出を比較する棒グラフである。ＩＬ−１β放出に対する効果は、バフィロマイシンＡ１（１０ｎＭ）での処理後のＥＬＩＳＡによって、上清で決定された。 ３％のＤＳＳ及び／又はＬＰＳで処置したマウスの一次常在型腹腔マクロファージ（ｐＭΦ）によるＩＬ−１β放出を比較する棒グラフである。ＩＬ−１β放出に対する効果は、ＲＯＳ阻害剤Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）（２０ｍＭ）での処理後のＥＬＩＳＡによって、上清で決定された。 ３％のＤＳＳ及び／又はＬＰＳで処置したマウスの一次常在型腹腔マクロファージ（ｐＭΦ）によるＩＬ−１β放出を比較する棒グラフである。３％のＤＳＳ及び／又はＬＰＳによる処理後のＩＬ−１β放出は、野生型（ＷＴ）又はＮＬＲＰ３−欠損マウス（Ｎｌｒｐ３−／−）から抽出されたｐＭΦで更に決定された。３点での３〜５の独立実験の平均±ＳＥＭとして代表的なデータを示す（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，ｔ−検定）。 デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導腸炎からのアポトーシス細胞調製物の保護効果を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、蒸留水（●）、又は経口的に任意にＰＢＳ処理による３％のＤＳＳを含む蒸留水（■）、又はアポトーシス細胞（▲）を与えられた。表示した動物数／群の平均体重。 デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導腸炎からのアポトーシス細胞調製物の保護効果を示す。ＩＢＤ臨床スコア。ボックス内の数値はエラーバーを有する各パラメータの平均スコアを示す（＊ｐ＜０．００１，ｔ−検定）。３つの独立実験の平均±ＳＥＭとしてデータを示す。体重変化、血便及び便の硬度を毎日監視した。 デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導腸炎からのアポトーシス細胞調製物の保護効果を示す。ＤＳＳ−処置マウスでの結腸及び脾臓での顕微鏡変化。アポトーシス細胞処理なし（ＤＳＳ＋ＰＢＳ）又はアポトーシス細胞処理あり（ＤＳＳ＋ＡｐｏＣｅｌｌ）の３％のＤＳＳで処置した、４匹のマウスの解剖した大腸及び脾臓の写真を示す。 デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導腸炎からのアポトーシス細胞調製物の保護効果を示す。ＤＳＳ−処置マウスからの結腸ホモジネートのＩＬ−１βサイトカインレベル。ＩＬ−１βレベルをＥＬＩＳＡで分析した。平均±ＳＥＭ、３匹マウス／群でデータを示す（＊ｐ＜０．０１，＊＊ｐ＜０．００１，一元配置分散分析法）。 遠位結腸断片の組織学的外観及び組織学的腸炎重症度スコアを示す。遠位結腸断片のＨ＆Ｅ外観（１１Ａ−Ｉ及び１１Ａ−ＩＩ）及び組織学的スコア（１１Ａ−ＩＩＩ）は、ＤＳＳ−処置Ｂａｌｂ／ｃマウス（１１Ａ−Ｉ，３％のＤＳＳ＋ＰＢＳ）及びＤＳＳ−及びＡｐｏＣｅｌｌ−処置マウス（１１Ａ−ＩＩ，３％のＤＳＳ＋ＡｐｏＣｅｌｌ）を示す。３つの独立実験の結果（＊ｐ＜０．０５，独立ｔ検定）。 アポトーシス細胞調製物によって処置された腫れ上がった結腸での好中球集積阻害を示す。マウス結腸組織断片は、マウスミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）に対するウサギモノクローナル抗体を用いる免疫組織化学アッセイによって染色した。免疫染色後、スライドをヘマトキシリンで対比染色した。画像は、ＨＲＰ−抗ウサギ二次抗体によって追跡されたＭＰＯ染色を示す。全ての画像はｘ２００である。（１１Ｂ−Ｉ）染色コントロール。ＨＲＰ−抗ウサギ二次抗体のみ、抗ＭＰＯなしで染色した非処置結腸。（１１Ｂ−ＩＩ）正常結腸コントロール。非処置結腸でのＭＰＯ−染色好中球（０％のＤＳＳ＋ＰＢＳ）。（１１Ｂ−ＩＩＩ）ＤＳＳ処置。３％のＤＳＳ処置結腸でのＭＰＯ−染色好中球（３％のＤＳＳ＋ＰＢＳ）。（１１Ｂ−ＩＶ）アポトーシス細胞及びＤＳＳ処置。アポトーシス細胞注入した３％のＤＳＳ処置結腸でのＭＰＯ−染色好中球（３％のＤＳＳ＋ＡｐｏＣｅｌｌ）。 ポトーシス細胞調製物によって処置されたＤＳＳ−誘導腸炎のシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害を示す。マウスＣＯＸ−２に対する抗体を用いる免疫組織化学的アッセイによって、マウス結腸組織断片を染色した。免疫染色後に、スライドはヘマトキシリンによって対比染色した。全ての画像は×２００である。（Ｉ）染色コントロール。抗ＣＯＸ−２なしのＨＲＰ−抗うさぎ二次抗体で染色した非処理結腸。（ＩＩ）非処理結腸でのＣＯＸ−２発現（０％のＤＳＳ＋ＰＢＳ）。（ＩＩＩ）３％のＤＳＳ処置結腸でのＣＯＸ−２発現（３％のＤＳＳ＋ＰＢＳ）。（ＩＶ）アポトーシス細胞注入した３％のＤＳＳ処置結腸でのＣＯＸ−２発現（３％のＤＳＳ＋ＡｐｏＣｅｌｌ）。 アポトーシス細胞調製物にいって処置されたＤＳＳ−誘導腸炎でのＩκ−Ｂα阻害を示す。マウスのホスホＩκ−Ｂα（ｐＩκ−Ｂα）に対する抗体を用いて、免疫組織化学アッセイによってマウス結腸組織断片を染色した。免疫染色後に、スライドをヘマトキシリンで対比染色した。画像はｐＩκ−Ｂαを示す。全ての画像はｘ２００。（Ｉ）ＨＲＰ−抗ウサギ二次抗体のみ、抗ｐＩκ−Ｂαなしで染色した非処置結腸。（ＩＩ）非処置結腸でのｐＩκ−Ｂα染色（０％のＤＳＳ＋ＰＢＳ）。（ＩＩＩ）３％のＤＳＳ処置結腸でのｐＩκ−Ｂα発現（３％のＤＳＳ＋ＰＢＳ）。（ＩＶ）アポトーシス細胞注入した３％のＤＳＳ処置結腸でのｐＩκ−Ｂα発現（３％のＤＳＳ＋ＡｐｏＣｅｌｌ）。 アポトーシス細胞集団によって処置されたＤＳＳ誘導腸炎のＮＦ−κＢ阻害を示す。マウス結腸組織断片は、マウスのホスホ−ＮＦ−κＢ（ｐＮＦ−κＢ）ｐ６５に対する抗体を用いる免疫組織化学的アッセイによって染色した。免疫染色後、スライドをヘマトキシリンで対比染色した。画像は、ｐＮＦ−κＢ ｐ６５染色を示す。全ての画像はｘ２００である。（Ｉ）ＨＲＰ−抗ウサギ二次抗体のみ、抗ＮＦ−κＢなしで染色した非処置結腸。（ＩＩ）非処置結腸でのｐＮＦ−κＢ ｐ６５染色（０％のＤＳＳ＋ＰＢＳ）。（ＩＩＩ）３％のＤＳＳ処置結腸中のｐＮＦ−κＢ ｐ６５発現（３％のＤＳＳ＋ＰＢＳ）。（ＩＶ）アポトーシス細胞注入した３％のＤＳＳ処置結腸でのｐＮＦ−κＢ ｐ６５発現（３％のＤＳＳ＋ＡｐｏＣｅｌｌ）。 マウスのｐＭΦマクロファージからのＩＬ−１β放出に対するアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）の効果を比較する棒グラフである。マクロファージはＬＰＳ及び／若しくは３％のＤＳＳで処理され、又はＬＰＳ及び／若しくは３％のＤＳＳ処理前にアポトーシス細胞（１：８）で処理される。３点での３つの独立した実験の平均±ＳＥＭとして代表的なデータを示す（＊ｐ＜０．０１，ｔ−検定）。 マウスのｐＭΦマクロファージからのＩＬ−１β放出に対するアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）の効果を比較する棒グラフである。ＬＰＳ及び／若しくは３％のＤＳＳで処理されるか、又はＬＰＳ及び／若しくは３％のＤＳＳ処理前にアポトーシス細胞（１：８）で処理される。いくつかの実施形態によれば、細胞は、アポトーシス細胞の添加及びＤＳＳ感作前に４５分間、２μＭサイトカラシンＤでインキュベートした。３点での２つの独立した実験の平均±ＳＥＭとして代表的なデータを示す（＊ｐ＜０．０１，一元配置分散分析法）。 マウスのｐＭΦマクロファージからのＩＬ−１β放出に対するアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）の効果を比較する棒グラフである。ｐＭΦ細胞は、２時間サポトーシス細胞の存在下でインキュベートし次いで１時間のＬＰＳ処理（黒い棒グラフ）、又は最初に１時間のＬＰＳ処理、次いで２時間アポトーシス細胞でインキュベートした（白い棒グラフ）。処理によっては、次いで、ｐＭΦ細胞は、インフラマソーム誘導物質：ニゲリシン２．５μＭでインキュベートした。ＥＬＩＳＡによって上清中でＩＬ−１βを決定した。３点での３つの独立実験の平均±ＳＥＭとして代表的なデータを示す（＊ｐ＜０．００１，一元配置分散分析法）。 マウスのｐＭΦマクロファージからのＩＬ−１β放出に対するアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）の効果を比較する棒グラフである。ｐＭΦ細胞は、２時間サポトーシス細胞の存在下でインキュベートし次いで１時間のＬＰＳ処理（黒い棒グラフ）、又は最初に１時間のＬＰＳ処理、次いで２時間アポトーシス細胞でインキュベートした（白い棒グラフ）。処理によっては、次いで、ｐＭΦ細胞は、インフラマソーム誘導物質：尿酸一ナトリウム（ＭＳＵ）２００μｇ／ｍｌでインキュベートした。ＥＬＩＳＡによって上清中でＩＬ−１βを決定した。３点での３つの独立実験の平均±ＳＥＭとして代表的なデータを示す（＊ｐ＜０．００１，一元配置分散分析法）。 マウスのｐＭΦマクロファージからのＩＬ−１β放出に対するアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）の効果を比較する棒グラフである。ｐＭΦ細胞は、２時間サポトーシス細胞の存在下でインキュベートし次いで１時間のＬＰＳ処理（黒い棒グラフ）、又は最初に１時間のＬＰＳ処理、次いで２時間アポトーシス細胞でインキュベートした（白い棒グラフ）。処理によっては、次いで、ｐＭΦ細胞は、インフラマソーム誘導物質：ピロリン酸カルシウム二水和物（ＣＰＰＤ）２００μｇ／ｍｌでインキュベートした。ＥＬＩＳＡによって上清中でＩＬ−１βを決定した。３点での３つの独立実験の平均±ＳＥＭとして代表的なデータを示す（＊ｐ＜０．００１，一元配置分散分析法）。 ｐＭΦ細胞の上清及び細胞溶解物から抽出されたタンパク質についてウェスタンブロット分析を行った。細胞の一部をインキュベートした。２時間アポトーシス細胞存在下でインキュベートとした後１時間ＬＰＳ処理する（左から６番目のレーン）、又は１時間（ＮＦ−κＢシグナル伝達を促進するために）ＬＰＳで最初に処理し、次いで２時間アポトーシス細胞でインキュベートして（左から７番目のレーン）。ＬＰＳ及び／又はアポトーシス細胞でのインキュベーション後、ｐＭΦの一部は、ニゲリシン２．５μＭでインキュベートした。自己マウスアクチンは、ローディングコントロールとして働いた。２つの実験の代表的データを示す。 ｐＭΦ細胞の上清及び細胞溶解物から抽出されたタンパク質についてウェスタンブロット分析を行った。細胞の一部をインキュベートした。２時間アポトーシス細胞存在下でインキュベートとした後１時間ＬＰＳ処理する（左から６番目のレーン）、又は１時間（ＮＦ−κＢシグナル伝達を促進するために）ＬＰＳで最初に処理し、次いで２時間アポトーシス細胞でインキュベートして（左から７番目のレーン）。ＬＰＳ及び／又はアポトーシス細胞でのインキュベーション後、ｐＭΦの一部は、ピロリン酸カルシウム二水和物２００μｇ／ｍＬ（ＣＰＰＤ）でインキュベートした。自己マウスアクチンは、ローディングコントロールとして働いた。２つの実験の代表的データを示す。 ｐＭΦ細胞の上清及び細胞溶解物から抽出されたタンパク質で行ったウェスタンブロット分析を示す。ｐＭΦ細胞は、ＬＰＳ、アポトーシス細胞又はアポトーシス細胞で処理され、又はＬＰＳ前にサポトーシス細胞で処理され（ＮＦ−κＢシグナル伝達前、左から４番目のレーン）、又は（ＮＦ−κＢシグナル伝達を促進するために）アポトーシス細胞処理前にＬＰＳで処理された（左から５番目のレーン）。抗マウスアクチンはローディングコントロールとして働いた。２つ実験の代表的データを示す。 ｐＭΦ細胞の上清及び細胞溶解物から抽出されたタンパク質で行ったウェスタンブロット分析を示す。ｐＭΦ細胞は、ＬＰＳ、アポトーシス細胞又はアポトーシス細胞で処理され、又はＬＰＳ前にサポトーシス細胞で処理され（ＮＦ−κＢシグナル伝達前、左から４番目のレーン）、又は（ＮＦ−κＢシグナル伝達を促進するために）アポトーシス細胞処理前にＬＰＳで処理された（左から５番目のレーン）。抗マウスアクチンはローディングコントロールとして働いた。２つ実験の代表的データを示す。 Ａ〜Ｆからなり、（１８Ａ）明視野顕微鏡で、又は（１８Ｂ−Ｆ）１μＭの活性酸素種（ＲＯＳ）感受性色素で染色した蛍光顕微鏡下で、使用して見られるｐＭΦ細胞を示す顕微鏡写真である。（１８Ｂ−Ｆ）ＲＯＳ感受性色素での染色前に、ｐＭΦ細胞をＲＯＳ阻害剤（Ｎ−アセチル−システイン，７．５ｍＭ）でインキュベートし、（１８Ｄ）ピオシアニンで処理し（０．５ｍＭ）、（１８Ｅ）３％のＤＳＳで処理し、又は（１８Ｆ）アポトーシス細胞で２時間処理し、次いで３％のＤＳＳで３０分間インキュベーションした。全てのパネルでの拡大はＸ１００である。実験は３回繰り返した；１つの代表的実験を示す。 アポトーシス細胞で前処理されたＤＳＳ−処理マクロファージ中活性酸素種（ＲＯＳ）発生での減少を示すグラフである。ＲＯＳ感受性色素で染色したｐＭΦのフローサイトメトリー分析。ｐＭΦはアポトーシス細胞で２時間処理され、ＬＰＳで処理され、その後３％のＤＳＳで３０分間インキュベーションした。陰性対照試料は、媒体のみで処理された。ＲＯＳ生成は、ＦＳＣ／ＳＳＣパラメータに基づいて死細胞を除いて、蛍光プローブを用いてフローサイトメトリーによって決定された。３点での３つの実験の平均±ＳＥＭを示す（＊ｐ＜０．０５，独立ｔ検定）。 腹腔マクロファージ（ｐＭΦ）でリソソーム損傷及びＫ＋流出に対するアポトーシス細胞の効果を示す棒グラフである。アポトーシス細胞で２時間及び／又はＤＳＳで２４時間処理したＢ６ ｐＭΦのフローサイトメトリー分析は、フルオロクロムアクリジンオレンジ（ＡＯ）で染色した。リソソームの減少数と相関する蛍光の消失は、ＦＳＣ／ＳＳＣパラメータに基づく死細胞を除いて、フローサイトメトリーで分析した。４つの独立実験の平均±ＳＥＭを示す（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０３，一元配置分散分析法）。 腹腔マクロファージ（ｐＭΦ）でリソソーム損傷及びＫ＋流出に対するアポトーシス細胞の効果を示す棒グラフである。アポトーシス細胞処理はニゲリシン誘導ＩＬ−１β分泌を阻害する。Ｂ６ ｐＭΦ細胞は、ＬＰＳ処理の存在下で所定の濃度のニゲリシンでアポトーシス細胞処理あり又はなしで処理した（＊ｐ＜０．０１，独立ｔ検定）。
本発明は、いくつかの実施形態によれば、アポトーシス細胞集団に関し、より詳細には、初期アポトーシス単核豊富細胞集団に関する。本発明は更に、そのような細胞集団の製造方法、及び病的免疫応答によって特徴付けられる疾患の治療における臨床現場でのその使用に関する。
移植関連疾患
ドナー細胞におけるアポトーシスのエクスビボ誘導によって産生された初期アポトーシスの単核豊富細胞の単回注入の臨床試験結果は、移植関連疾患、例えば骨髄移植患者における移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の抑制、予防及び／又は緩和のためのこれらのアポトーシス細胞集団の安全性及び有効性を示す。以下に詳述するように、本発明の方法に従う豊富単核細胞中の初期アポトーシス誘導は、アポトーシス同種異系ドナー細胞の臨床グレード集団であって、同一のドナーからの骨髄由来細胞で注入した時に、移植に関連した重要因子に影響を与え、造血器腫瘍を有する対象におけるＧＶＨＤの発生を効果的に減少させた集団を提供した。
特に、移植１００日後には、グレードＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤの発生は、調製されたアポトーシスドナー細胞で処置されたＨＳＣ移植レシピエントにおいて減少し、非再発生存率は有意に増加した。本明細書で実証されるように、急性のグレードＩＩ〜ＩＶ及びグレードＩＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤの発生は、対照群（７１％のグレードＩＩ〜ＩＶ）に比べて非常に低かった（各々、２３％及び１５％）。顕著なことに、アポトーシス細胞集団のより高い用量（１４０×１０６及び２１０×１０６アポトーシス細胞）での処置は、（一致既存対照の５０％と比べて）０％の急性ＧＶＨＤグレードＩＩ〜ＩＶを示した。
本発明の方法に従って調製されたアポトーシスドナー細胞の注入は、ＨＳＣの生着までの期間を減少させ、ＨＳＣ移植レシピエントにおける肝毒性の発生を減少させる点で有効であった。
ＧＶＨＤによって誘導されるプロ炎症性サイトカインの誘導の予防は、臨床適用のための難題であったが、本明細書に示されている結果は、本発明のアポトーシス細胞組成物を受けたＨＳＣ移植レシピエントにおけるＧＶＨＤ関連因子の血清レベルの減少を示す（図６）。特に、６個の異なるバイオマーカーＴＮＦＲＩ、ＩＬ−２Ｒａ、ＨＧＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−１５及びＩＬ−７の血漿レベルは、高グレードから低グレードのＧＶＨＤか非ＧＶＨＤかを識別した。追加の２つのコントロールサイトカイン（ＩＬ−１ｂ及びＩＬ−６）は、発見の特異性を更に強調した。更に、インビトロ効能アッセイは、本発明のアポトーシス細胞調製物との相互作用後のＤＣ成熟化の阻害を明確に示した（図１）。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受けている対象においてＧＶＨＤを予防又は緩和する方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＨＳＣＴを受けている対象においてＧＶＨＤを予防又は緩和する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＨＳＣＴを受けている対象においてＧＶＨＤを予防又は緩和する方法であって、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含む本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、調製物が少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の該細胞の少なくとも４０％が初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも８５％が生細胞であり、調製物が１５％以下の多形核白血球を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＨＳＣＴを受けている対象においてＧＶＨＤを予防又は緩和する方法であって、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含む本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、調製物が少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の該細胞の少なくとも４０％が初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも８５％が生細胞である方法を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＨＳＣＴを受けている対象においてＧＶＨＤを予防又は緩和する方法であって、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含む本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、該調製物が少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも４０％が初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも８５％が生細胞であり、調製物が１５％以下の多形核白血球を含み、医薬組成物がヘパリン、ＡＣＤフォーミュラＡ及びそれらの組合せからなる群より選択される抗凝固剤を含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＨＳＣＴを受けている対象においてＧＶＨＤを予防又は緩和する方法であって、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含む本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、調製物が少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の該細胞の少なくとも４０％が初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも８５％が生細胞であり、医薬組成物がヘパリン、ＡＣＤフォーミュラＡ及びそれらの組合せからなる群より選択される抗凝固剤を含む方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物中のヘパリンは、０．００１〜３Ｕ／ｍｌ、典型的には０．００１〜２．５Ｕ／ｍｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物中のヘパリンは、０．００５〜２．５Ｕ／ｍｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物中のヘパリンは、０．０１〜１Ｕ／ｍｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物中のＡＣＤフォーミュラＡは、０．０１〜６％ｖ／ｖの濃度で存在する。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物中のＡＣＤフォーミュラＡは、０．０５〜５％ｖ／ｖの濃度で存在する。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物中のＡＣＤフォーミュラＡは、０．０１〜１０％ｖ／ｖの濃度で存在する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＨＳＣＴを受ける対象においてＧＶＨＤを予防又は緩和する方法であって、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含む本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、調製物が少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも４０％が初期アポトーシス状態にあり、製物中の細胞の少なくとも８５％が生細胞であり、調製物が１５％以下の多形核白血球を含み、調製物が３０μｇ／ｍｌを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを含むことを特徴とする方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＨＳＣＴを受ける対象においてＧＶＨＤを予防又は緩和する方法であって、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含む本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、調製物が少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の該細胞の少なくとも４０％が初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも８５％が生細胞であり、調製物が３０μｇ／ｍｌを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを含むことを特徴とする方法を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＨＳＣＴを受ける対象においてＧＶＨＤを予防又は緩和する方法であって、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含む本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、調製物が少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の該細胞の少なくとも４０％が初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも８５％が生細胞であり、調製物が１５％以下の多形核白血球を含み、組成物がヘパリン、ＡＣＤフォーミュラＡ及びその組合せからなる群より選択される抗凝固剤を含み、調製物が３０μｇ／ｍｌを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＨＳＣＴを受ける対象においてＧＶＨＤを予防又は緩和する方法であって、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含む本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、該調製物が少なくとも８５％の単核細胞を含み、該調製物中の該細胞の少なくとも４０％が初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも８５％が生細胞であり、組成物がヘパリン、ＡＣＤフォーミュラＡ及びその組合せからなる群より選択される抗凝固剤を含み、調組成物が３０μｇ／ｍｌを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＨＳＣＴを受ける対象においてＧＶＨＤを予防又は緩和する方法であって、本発明の細胞調製物を含む医薬組成物を該対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＨＳＣＴを受ける対象においてＧＶＨＤを予防又は緩和する方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＨＳＣＴを受ける対象においてＧＶＨＤの予防又は緩和において使用するための本発明の医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、残留メチルプレドニゾロンを更に含む。いくつかの実施形態によれば、３０μｇ／ｍｌを超えない濃度でメチルプレドニゾロンをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、抗凝固剤を更に含む。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、ヘパリン、ＡＣＤフォーミュラＡ及びその組合せからなる群より選択される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、ＧＶＨＤは高グレードのＧＶＨＤである。特定のいくつかの実施形態によれば、高グレードのＧＶＨＤは、グレードＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤである。特定のいくつかの実施形態によれば、高グレードのＧＶＨＤは、グレードＩＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤである。特定のいくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、高グレードのＧＶＨＤからグレードＩのＧＶＨＤへのシフトを誘導する。
別の実施形態によれば、ＧＶＨＤは急性ＧＶＨＤである。更に別の実施形態によれば、ＧＶＨＤは慢性ＧＶＨＤである。別の特定のいくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物が投与された対象は、移植片対腫瘍効果（ＧＶＴ効果）、又は移植片対白血病効果（ＧＶＬ効果）を維持する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、ＧＶＨＤは対象の肝臓におけるＧＶＨＤである。同種異系ＨＳＣＴレシピエントにおける肝機能不全は、代表的なレジメン及び他の薬物療法からの毒性、感染症、肝中心静脈閉塞症（ＶＯＤ）、及び肝臓の急性及び慢性移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を含む、様々な因子に起因することがある。
別の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、ＧＶＨＤに関連した肝毒性を減少させる。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物は、ＧＶＨＤに関連した肝毒性を減少させる。肝毒性の共通の症状及び合併症は、リンパ節炎、発熱、赤血球沈降速度増加高ビリルビンレベル、及び発熱性好中球減少症を含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、免疫疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は緩和の必要性のある対象において該疾患を予防又は治療する方法であって、本発明の細胞調製物を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明は、免疫疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は緩和の必要性のある対象において該疾患を予防又は治療する方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、免疫疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は緩和を必要とする対象における該疾患の予防又は緩和における使用のための本発明の細胞調製物を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明は、免疫疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は緩和を必要とする対象における該疾患の予防又は緩和における使用のための本発明の医薬組成物を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、免疫疾患はＧＶＨＤである。いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＧＶＨＤの予防又は緩和を必要とする対象におけるＧＶＨＤの予防又は緩和における使用のための本発明の医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、造血器腫瘍の予防又は治療を必要とする対象において該疾患を予防又は緩和するための方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。特定のいくつかの実施形態によれば、該対象は造血器腫瘍に罹患している。
本明細書で使用される用語「造血器腫瘍」は、血液細胞の制御できない異常な増殖によって特徴付けられる任意の血液細胞癌を言う。用語「造血器腫瘍」は、白血病、骨髄異形成症候群、リンパ腫、及び多発性骨髄腫（プラズマ細胞増殖症）を含むがこれらに限定されない。用語「白血病」は、循環する血液中の白血球の対応する増加を伴う又は伴わない、体組織中の白血球数の異常な増加によって特徴付けられる血液形成臓器疾患（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）等）を言う。用語「骨髄異形成症候群」は、骨髄が前白血病プロセスを示唆する定量的かつ定性的変化を示すが、急性白血病として必ずしも終了しない慢性経過を有する症状を意味する。用語「リンパ腫」は、Ｂ又はＴリンパ球から得られたリンパ芽球の悪性腫瘍（例えば、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）等）を意味する。用語「プラズマ細胞増殖症」は、プラズマ細胞増殖に起因する形質細胞増加（例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）、プラズマ細胞白血病（ＰＣＬ）等）を意味する。
例示的ないくつかの実施形態によれば、前記造血器腫瘍は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群より選択される。
Ｔ−リンパ球等のある種のドナー血液細胞の注入は、移植片対白血病効果を刺激することもできる。この効果は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を有する患者で最も良く観察されている。ＣＭＬでは、移植再寛解（transplant re-enter remission）後に患者の７５パーセントが再発する。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）等の他の疾患については、効果があまりはっきりしない；ＡＭＬ及びＭＤＳでは患者の約２０パーセントが寛解に入る。急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する患者については、少数の患者が移植片対白血病効果（ＧＶＬ効果）から少なくとも一時的に利益を得ているとされているが、ＧＶＬ効果の存在は不明である。
他の方法では、ドナー免疫細胞は、残留の白血病、リンパ腫又は癌細胞を異なったもとして認識し、それらを破壊することがある。遡及的試験は、急性又は慢性ＧＶＨＤを発症する患者が、ＧＶＨＤを発症していない患者よりも低い疾患再発率を有することを証明している。この発見は移植片対腫瘍効果の直接的な指標である。
用語「移植前処置」とは、移植前の、放射線、免疫血清、化学療法及び／又は免疫抑制剤を含む様々な処置レジメンでの移植レシピエントの予備的処置を意味する。移植前処置は骨髄移植前には非常に一般的である。
本明細書で使用される用語「対象」、「患者」及び「それを必要としている対象」は、同じ意味で使用され、本発明の医薬組成物の投与を必要としている対象を意味する。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、ＨＳＣＴを受けている又は受けることになる対象に投与される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、それを必要としている対象は、ＨＳＣＴを受ける対象である。いくつかの実施形態によれば、本発明の、それを必要としている対象に移植された造血幹細胞（ＨＳＣ）及び医薬組成物の細胞は、同一のドナーから得られる。
別の実施形態によれば、本発明の医薬組成物の投与は、ＨＳＣＴの最大２４時間前までに行われる。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物の投与は、ＨＳＣＴの約２４〜３０時間前までに行われる。更に別の実施形態によれば、本発明の医薬組成物の投与は、ＨＳＣＴと同時に行われる。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物の投与は、ＨＳＣＴ後の最大１５日までに行われる。追加のいくつかの実施形態によれば、ＨＳＣＴで使用されたＨＳＣは同種異系のＨＳＣである。非限定的な例によれば、ＨＳＣＴで使用されたＨＳＣは、骨髄、末梢血、又は臍帯血から得られる。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。別の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は単回投与される。
炎症性腸疾患
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、クーロン病及び潰瘍性大腸炎として発症される、胃腸管の粘膜免疫系の異常調節を有する慢性腸炎症によって特徴付けられる。本明細書で使用される用語ＩＢＤは、クーロン病、潰瘍性大腸炎又はそれらの組合せを意味する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。腸微小植物及び危険シグナル（例えばデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）など）の両方を含む遺伝子因子及び環境因子は、全て腸炎症を誘発することが明らかにされた。ＴＮＦα及びＩＦＮγ遮断、及び抗−ＩＬ−１βストラテジー、並びに抗生物質治療は、大腸炎誘発を緩和でき、このことは、核内因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）、及び基底膜中のマクロファージ及び樹状細胞のインフラマソームの阻害に役割を果たすことを示唆している。
本明細書に開示された本発明の細胞調製物及び医薬組成物の治療的効果は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）において更に証明された。本明細書で以下に例証するように、本発明の医薬組成物の単回注入は、ＩＢＤの２つの異なったモデル、すなわちナイーブＣＤ４細胞の養子Ｔ細胞伝達（ＴＣＴ）及びデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性大腸炎の、臨床的スコア及び組織学所見の両方を有意に緩和した。
デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）モデルは、通常、損傷治癒プロセス及び本質的免疫応答を研究するために適した上皮細胞損傷モデルとして解される。基底膜マクロファージによるＤＳＳ取り込みは、炎症プロセスを開始する。ＬＰＳで処理され、次いでＤＳＳに曝露されたマクロファージは、ＮＬＲＰ３依存的、ＡＳＣ依存的、及びカスパーゼ−１依存的に高レベルのＩＬ−１β及びＩＬ−１８を分泌する。この効果は、ＤＳＳの細胞内取込み作用が実験的に遮断された時に完全になくなった。
カスパーゼは、プログラムされた細胞死の誘導及び実行に関連し、後にはプロアポトーシス又はプロ炎症性として分類される炎症に関連することが初めに明らかにされたシステインプロテアーゼである。カスパーゼ−１は、よく研究され特徴付けられた３つのプロ炎症性カスパーゼの１つである。その触媒活性は、サイトカイン、最も顕著にはＩＬ−１βのカスパーゼ−１依存的プロセシングを介在する「インフラマソーム」と呼ばれる多タンパク質複合体内の自己活性化によって制御される。プロ炎症性刺激は、ＩＬ−１βプリホームの発現を誘導するが、サイトカイン成熟及び放出は、インフラマソームによってコントロールされる。
多数のＮＯＤＥ様受容体（ＮＬＲ）ファミリーメンバーが報告されているが、インビボでのその生理的機能は数ケースについてのみ解明されてきた。ＮＬＲＰ１、ＮＬＲＰ３及びＩＰＡＦは、カスパーゼ−１自己活性化を誘導する高分子量複合体を形成するためのホモタイプＮＡＣＨＴドメイン相互作用を介して自己多量化する危険前哨（danger sentinel）である。ＮＬＲＰ３インフラマソームは、ＮＬＲＰ３足場、ＡＳＣ（ＰＹＣＡＲＤ）アダプター、及びカスパーゼ１−からなる。免疫防御の一部として、ＮＬＲＰ３は、真菌カンジダ・アルビカンス及びサッカロマイセス・セレビシエ、孔形成毒素及びウイルス、並びに様々な微生物成分等の病原全体への曝露の際に活性化される。興味深いことに、ＮＬＲＰ３はまた、炎症性疾患及びおそらく自己免疫疾患をもたらす宿主由来分子によって活性化される。損傷細胞、尿酸ナトリウム一水和物結晶及びアミロイド原線維−βペプチドによって放出される細胞外ＡＴＰ及びヒアロローナンは、一例である。
本発明は、最初に、本発明のアポトーシス細胞組成物が、インビトロ及びインビボの両方で、ＮＬＲＰ３インフラマソームを負に制御し、造血細胞中でＮＬＲＰ３インフラマソームを介して誘導されたプロ炎症性応答を下方調節することができることを示す。
インフラマソームトリガーは、トール受容体（ＴＬＲ）及びインフラマソームトリガーの両方を必要とするツーヒットモデルである。実際に、本発明野アポトーシス細胞は、ＴＬＲ及びＮＦ−κＢ経路を阻害することが明らかとなって。ＴＬＲトリガーは、プロＩＬ−１β及びプロＩＬ−１８の亢進された転写に重要であり、ＤＳＳ効果に実際に必要とされる。本明細書では、本発明のアポトーシス細胞が転写前及び転写後の両レベルで活性化ＩＬ−１βの分泌を阻害し、ＮＦ−κＢ及びＮＬＲＰ３に対して異なった阻害効果を有したことが示されている。
本明細書では以下に、本発明のアポトーシス細胞組成物がインフラマソーム活性化の制御に記載されている３つのメカニズム全てを行うことを更に示す。本発明の組成物中に含まれるアポトーシス細胞は、化学阻害剤ＮＡＣについて示されたと類似の割回で、ＲＯＳ形成を減少及び阻害することができることが示された。マクロファージが本質的な免疫応答の一部として微生物病因をコントロールために毒性ＲＯＳを利用し、ＲＯＳがＩＢＤの発症に役割を果たすと考えられる炎症性シグナルの主なメディエイターとして同定されたことは、良く知られている。更に、ＲＯＳの発生は、ＥＲＫリン酸化を介してＩＬ−１βを誘導することが分かった。一方、ＩＬ−１βシグナルは、ＲＯＳ発生を誘導することがある。ＤＳＳがＲＯＳ形成を誘導することが示されているが、マクロファージが本発明の調製物に含まれるアポトーシス細胞で予備処理される時には、ＲＯＳ発生の顕著な減少、結果的に少ないＩＬ−１β分泌が観察された。
第２のメカニズムは、リソソームを含む。リソソーム損傷又は漏出は、内因性危険シグナルとして働きことができ、ＮＬＲＰ３インフラマソームによって感知されることが明らかとなった。アポトーシス細胞排除はファゴリソソーム経路によって媒介されるので、リソソーム液胞の関連が分析された。本明細書で例証されるように、アポトーシス細胞を定着した腹腔マクロファージからのリソソームは、ＤＳＳ感作により安定であり、影響を受けることなく又は損傷されなかった。このことは、定着されたアポトーシス細胞は、アポトーシス摂取後の少なくとも２４時間にリソソームを感知しなくなるとの注意を指摘し得る。総合すると、これらの結果は、インフラマソーム阻害及びアポトーシス細胞排除に因る炎症消散のメカニズムを示す。
インフラマソームはまた、カリウムイオノフォアニゲリシン等の細胞内カリウムを枯渇するシグナル伝達経路に応答して活性化されることを示唆した。マクロファージがアポトーシス細胞で前処理されると、ニゲリシン誘導ＩＬ−１β分泌は有意に阻害された。アポトーシス細胞がニゲリシン誘導ＩＬ−１β分泌を阻害する手段は明確でないが、支持する証拠は、おそらくＮＦ−κＢシグナル伝達によって最もよく媒介される直接的インフラマソーム上流阻害メカニズムを証明し得る。この注目は、感染性及び非感染性炎症性症状の両方を生じ得た炎症制御メカニズムを例証する。アポトーシス細胞を明確にできないことは、おそらく細胞内オルガネラ明確化の失敗で理解されるので、持続性のインフラマソーム依存的炎症を引き起こすことになる。
纏めると、本発明の細胞調製物の注入は、ＩＢＤのマウスモデルでは有利であり、３つのメカニズムを介してインフラマソーム及びＮＦ−κＢ依存的炎症の両方を阻害する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＩＢＤの予防又は緩和を必要としている対象において該疾患を予防又は緩和する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＩＢＤの予防又は緩和を必要としている対象における該疾患の予防又は緩和における使用のための本発明の医薬組成物を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＩＢＤの予防又は緩和を必要としている対象において該疾患を予防又は緩和する方法であって、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含む医薬組成物を該対象に投与するステップを含み、調製物は少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも４０％は初期アポトーシス状態にあり、調製物中の細胞の少なくとも８５％は生細胞であり、調製物は１５％以下の多核白血球を含み、医薬組成物は、ヘパリン、ＡＣＤフォーミュラＡ及びそれらの組合せからなる群より選択される抗凝固剤を含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＩＢＤの予防又は緩和を必要としている対象において該疾患を予防又は緩和する方法であって、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含む医薬組成物を該対象に投与するステップを含み、調製物は少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも４０％は初期アポトーシス状態にあり、調製物中の細胞の少なくとも８５％は生細胞であり、調製物は１５％以下の多核白血球を含み、医薬組成物は、ヘパリン、ＡＣＤフォーミュラＡ及びそれらの組合せからなる群より選択される抗凝固剤を含み、調製物は３０μｇ／ｍｌを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
アポトーシス細胞調製物
いくつかの実施形態によれば、本発明の調製物は、単核豊富細胞を含む細胞調製物であって、該調製物は少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも４０％は初期アポトーシス状態にあり、調製物中の細胞の少なくとも８５％は生細胞であり、調製物が１５％以下の多核白血球を含むような細胞調製物を意味する。いくつかの実施形態によれば、本発明の調製物は、単核豊富細胞を含む細胞調製物であって、調製物は少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも４０％は初期アポトーシス状態にあり、調製物中の細胞の少なくとも８５％は生細胞であり、調製物は１５％以下のＣＤ１５ｈｉｇｈ発現細胞を含むような細胞調製物を意味する。本明細書で用いる用語「調製物」、「本発明の調製物」、「本発明のアポトーシス細胞調製物」、「本発明の細胞調製物」、「細胞調製物」及び「単核豊富調製物」は同じ意味で使用される。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、単核豊富細胞を含む細胞調製物であって、該調製物は少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも４０％は初期アポトーシス状態にあり、調製物中の細胞の少なくとも８５％は生細胞であり、調製物が１５％以下の多核白血球を含むことを特徴とする細胞調製物を提供する。
本明細書で用いる用語「本発明の組成物」、「本発明の医薬組成物」、「医薬組成物」、「組成物」、「アポトーシス細胞組成物」及び「本発明の細胞調製物を含む組成物」は同じ意味で使用され、本発明の細胞調製物を含む組成物を意味する。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、本発明の細胞調製物を含み、抗凝固剤を更に含む組成物を意味する。いくつかの実施形態によれば、用語「本発明の組成物」は、本発明の細胞調製物、及び患者への該細胞調製物の投与のために使用される最終懸濁媒体を含む組成物を意味する。いくつかの実施形態によれば、本明細書で使用される用語「最終懸濁媒体」及び「投与媒体」は同じ意味で使用され、本発明の細胞調製物の投与のために使用される媒体を意味する。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物を含む医薬組成物は、本明細書では「ＡｐｏＣｅｌｌ」を意味する。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、本明細書では「ＡｐｏＣｅｌｌ」を意味する。
いくつかの実施形態によれば、本発明の単核豊富細胞調製物は、少なくとも８５％の単核細胞、少なくとも８５％の単核細胞、少なくとも９０％の単核細胞又は少なくとも９５％の単核細胞を含み、各可能性は本発明の別の実施形態である。いくつかの実施形態によれば、本発明の単核豊富細胞調製物は、少なくとも８０％の単核細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の単核豊富細胞調製物は、少なくとも９０％の単核細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の単核豊富細胞調製物は、少なくとも９５％の単核細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物は、リンパ球、単核細胞及びナチュラルキラー細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞種を含む。いくつかの実施形態によれば、単核細胞はリンパ球及び単核細胞を含む。本明細書及び特許請求の範囲で使用される単核細胞は、１つの分葉核（lobed nucleus）を有する白血球である。
いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物の少なくとも４０％が初期アポトーシス状態にある。他の実施形態によれば、本発明の細胞調製物の少なくとも４０％、好ましくは約５０％が初期アポトーシス状態にある。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物の４０〜６５％、好ましくは５５〜６０％が初期アポトーシス状態にある。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
当然のことながら、いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示された細胞調製物中の高パーセンテージの単核細胞は、白血球除去法、低温保存を用いる初期アポトーシス誘導、及びメチルプレドニゾロンによるインキュベーション、及び様々な洗浄ステップを含む）本明細書に以下に記載される、複数ステップの製造プロトコルに従って達成される。
いくつかの実施形態によれば、本発明の単核豊富細胞調製物は、多核白血球及び好中球を含むがこれらに限定されない非単核白血球の低濃度を含む。単核豊富細胞調製物は、顆粒球を含まないことが好ましい。
いくつかの実施形態によれば、顆粒球は、本発明の製造方法の様々なステップ中に崩壊する。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、顆粒球の１５％以下、又は１０％以下、典型的には５％以下を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、顆粒球は、本発明の製造方法の凍結及び解凍ステップ後に顕著な程度に崩壊する。いくつかの実施形態によれば、顆粒球は、本発明の製造方法の凍結及び解凍ステップ後に顕著な程度に崩壊し、凍結及び／又は解凍ステップ後の洗浄ステップ中に本発明の調製物から洗浄される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、顆粒球は崩壊し、本発明の製造方法の様々な洗浄ステップ中に本発明の細胞調製物から洗浄される。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、１５％以下、場合により１０％以下、典型的には５％以下の多核白血球を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は５％以下の多核白血球を含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、１５％以下、又は１０％以下、典型的には５％以下のＣＤ１５ｈｉｇｈ発現細胞を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は５％以下のＣＤ１５ｈｉｇｈ発現細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、明細書の以下で例証されるように、本発明の組成物は、１％以下のＣＤ１５ｈｉｇｈ発現細胞を含む。本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、ＣＤ１５ｈｉｇｈ発現細胞は顆粒球である。
アポトーシスの初期の特徴は、血漿膜の形態的な変化である。この変化は、細胞膜の内層から外層までのリン脂質ホスファチジルセリン（ＰＳ）膜の転位を含む。カルシウムイオンの存在下で、アネキシンＶはＰＳに対して高い特異性及び親和性を有する。従って、曝露されたＰＳを有する細胞へのアネキシンＶの結合は、初期細胞性アポトーシスを検出する非常に感受性の高い方法を提供する。従って、本明細書で使用される、細胞の「初期アポトーシス状態」又は「初期アポトーシス細胞」は、無傷の細胞膜を依然と有する細胞集団を意味するが、該細胞集団は、ＤＮＡ開裂を受け、ホスファチジルセリンの転位を受けたばかりである。本明細書で使用される初期アポトーシス細胞、又は初期アポトーシス状態にある細胞は、アネキシンＶを用いて陽性に染色され、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で陰性に染色される細胞である。初期アポトーシスの検出方法は、当分野で知られており、例えば、フローサイトメトリーによる、アネキシンＶ陽性及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性の初期アポトーシス細胞検出である。いくつかの実施形態によれば、後期アポトーシス状態にある細胞は、フローサイトメトリーを用いて実証され得るように、アネキシンＶを用いる陽性染色及びＰＩを用いる陽性染色によって検出され得る。ＰＩは、膜不透過性であり、従って細胞膜の完全性が危険に曝されている細胞、例えば後期アポトーシス又は壊死細胞に入ることができるにすぎないことに留意されたい。いくつかの実施形態によれば、フローサイトメトリーを用いて実証され得るように、壊死細胞はPIに強い染色を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞集団中の細胞の少なくとも４０％は、初期アポトーシス状態である。他のいくつかの実施形態によれば、本発明の細胞集団中の細胞の少なくとも５０％又は少なくとも６０％は、初期アポトーシス状態である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞集団は懸濁中の細胞を含む。別の実施形態によれば、本発明の細胞集団は、表面に接着するように細胞を誘導することによって調製されない。
本明細書で使用される細胞の「生存性」は、壊死又は後期アポトーシスを経ない細胞を意味する。従って、本明細書で使用される用語「生細胞」は、壊死を経ない細胞又は後期アポトーシス状態にない細胞を意味する。いくつかの実施形態によれば、用語「生細胞」は、無傷のプラズマ膜を有する細胞を意味する。細胞生存率を決定するアッセイ、例えばフローサイトメトリーを用いて検出され得るヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色は、当分野で知られている。従って、いくつかの実施形態によれば、生細胞はヨウ化プロピジウム取り込みを示さない細胞である。壊死は、光、蛍光又は電子顕微鏡技術によって、又は色素トリパンブルーの取り込みを介して更に同定され得る。
壊死とは異なった細胞死プロセスであるアポトーシスは、例えば正常細胞及び組織発達中に起こる、プログラム化されかつ秩序的な生理的な細胞の排除、病原感染細胞のＴ−リンパ球殺傷、及び変異的に損傷された細胞の自己排除である。アポトーシス細胞は、細胞質及び核での異なった形態的変化、規則的に間隔を置いた部位でのクロマチン開裂、及びヌクレオソーム間の部位でのゲノムＤＮＡのヌクレオチド鎖切断によって特徴付けられる。例えばアネキシンＶを用いる細胞アポトーシスを決定するためのアッセイは当分野で知られている。一方、壊死は、生じた細胞死の本質的に病原性の及びプロ炎症性のプロセスであるが、典型的には、致命的な細胞損傷後に酵素の制御不能でかつ進行性の分解作用によるものに限らない。壊死細胞は、典型的には、ミトコンドリア膨張、核凝集、細胞溶解、膜統合性の欠如、及び究極的な細胞死によって特徴付けられる。
いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物は、少なくとも８５％、９０％、９５％の生細胞、又は少なくとも９７％の生細胞を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。別の実施形態では、本発明の細胞調製物は、最大１５％、１０％、５％の壊死細胞又は後期アポトーシス状態の細胞、又は最大の３％の壊死細胞又は後期アポトーシス状態の細胞を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。更なる実施形態では、本発明の細胞調製物中の生細胞の高パーセンテージは、調製後少なくとも２４時間維持する。いくつかの実施形態によれば、壊死細胞及び／又は後期アポトーシス状態の細胞は崩壊し、よって、本発明の製造方法の洗浄ステップ中に本発明の最終細胞調製物から実質的に除去される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
本発明のいくつかの実施形態によれば、自己免疫疾患（例えばＧＶＨＤ）において治療免疫寛容を誘導するために、本発明の細胞調製物中の治療的単核豊富細胞は、同種異型個体から得られることが好ましい。同種異型の単核豊富細胞は、好ましくは、前記細胞を投与された対象とハプロタイプが一致する。ヒト対象のハプロタイプ一致は、治療的移植の点で、当分野できまって実施され、通常、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲアレルの一致を含む。いくつかの実施形態によれば、単核細胞豊富細胞集団の起源は、ＨＬＡのＡ座、Ｂ座、Ｃ座及びＤＲ座で少なくとも７／８でＨＬＡ一致の同種異型ドナーから得られる。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞調製物の起源は自家である。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は本発明の細胞調製物を含み、抗凝固剤を更に含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、本発明の細胞調製物を含み、残留メチルプレドニゾロンを更に含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、本発明の細胞調製物を含み、抗凝固剤及び残留メチルプレドニゾロンを更に含む。いくつかの実施形態によれば、残留メチルプレドニゾロンは、本発明の製造方法の使用後に本発明の医薬組成物中に残るメチルプレドニゾロンを意味する。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は抗凝固剤を含む。当業者に公知のように、本明細書で使用される抗凝固剤は、血液凝固を抑制し又は減少させる物質を意味する。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤はヘパリンである。他のいくつかの実施形態によれば、クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）フォーミュラＡである。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、ＡＣＤフォーミュラＡ及びヘパリンを含む組成物である。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、約１０Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含むＡＣＤフォーミュラＡである。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、ヘパリン、ＡＣＤフォーミュラＡ及びそれら組合せからなる群より選択される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物中の抗凝固剤の存在は、本組成物の製造方法の凍結及び／又はインキュベーション及び／又は洗浄段階中の抗凝固剤の添加に因る。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物の製造中の抗凝固剤の存在は、本明細書に記載のアポトーシス誘導に逆には影響しない。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物はヘパリンを含む。いくつかの実施形態によれば、ヘパリンは、硫酸化ヘテロ多糖ヘパリン、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）及びそれらの組合せからなる群より選択される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、ヘパリンは合成ヘパリンであり、例えばフォンダパリヌクスなどであるが、これに限定されない。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、０．００１〜３Ｕ／ｍｌ、又は０．００５〜２．５Ｕ／ｍｌ、典型的に０．０１〜１Ｕ／ｍｌの濃度のヘパリンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、０．００１〜２．５Ｕ／ｍｌ、又は０．００１〜１Ｕ／ｍｌ、典型的に０．００１〜０．５Ｕ／ｍｌの濃度のヘパリンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、０．００５〜１Ｕ／ｍｌ、又は０．００５〜０．６Ｕ／ｍｌ、場合により０．００５〜０．５Ｕ／ｍｌの濃度のヘパリンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。他のいくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、０．０１〜３Ｕ／ｍｌ、又は０．０１〜２Ｕ／ｍｌ、又は０．０１〜０．６Ｕ／ｍｌの濃度のヘパリンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、０．０１〜０．５Ｕ／ｍｌの濃度のヘパリンを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、０．０５〜０．２５Ｕ／ｍｌの濃度のヘパリンを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、０．０１〜０．６Ｕ／ｍｌの濃度のヘパリンを含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、最大３Ｕ／ｍｌのヘパリン、典型的には最大２．５Ｕ／ｍｌのへパリン、場合により最大１Ｕ／ｍｌのへパリン、又は最大０．５Ｕ／ｍｌのへパリンを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、少なくとも０．００１Ｕ／ｍｌのへパリン、又は少なくとも０．００５Ｕ／ｍｌのへパリン、場合により少なくとも０．０１ヘパリンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、最大３００Ｕ、又は最大１５０Ｕ、場合により最大７５Ｕのヘパリンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、最大１８０Ｕのヘパリンを含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物中に含まれるヘパリンは、本発明の細胞調製物及び患者への細胞調製物の投与に使用される最終懸濁媒体を含む組成物中のヘパリンを意味する。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物中に含まれるＡＣＤフォーミュラＡは、本発明の細胞調製物及び患者への細胞調製物の投与に使用される最終懸濁媒体を含む組成物中のヘパリンを意味する。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、０．５〜５００Ｕのヘパリン、場合により０．５〜５００Ｕのヘパリン、又は７〜１８０Ｕのヘパリンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物はＡＣＤフォーミュラＡを含む。いくつかの実施形態によれば、ＡＣＤフォーミュラＡは、クエン酸、デキストロース及びクエン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態によれば、ＡＣＤフォーミュラＡは、クエン酸を０．７３ｇ／１００ｍｌの濃度で、デキストロース一水和物を２．４５ｇ／１００ｍｌの濃度で、及びクエン酸ナトリウム脱水物を２．２０ｇ／１００ｍｌの濃度で含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、ＡＣＤフォーミュラＡを０．０１〜１０％ｖ／ｖ、又は０．０５〜６％ｖ／ｖ、場合により０．１〜５％ｖ／ｖの濃度で含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、ＡＣＤフォーミュラＡを０．０５〜１０％ｖ／ｖ、場合により０．０５〜６％ｖ／ｖ、又は０．０５〜５％ｖ／ｖの濃度で含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
別の実施形態によれば、本発明の組成物は、ＡＣＤフォーミュラＡを０．１〜１０％ｖ／ｖ、又は０．１〜６％ｖ／ｖ、場合により０．１〜５％ｖ／ｖの濃度で含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、ＡＣＤフォーミュラＡを０．５〜２．５％ｖ／ｖの濃度で含む。ある実施形態では、本発明の組成物は、ＡＣＤフォーミュラＡを０．０５〜６％ｖ／ｖ、典型的には０．１〜６％ｖ／ｖの濃度で含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、最大１５ｍｌ、又は最大９ｍｌ、場合により最大７．５ｍｌのＡＣＤフォーミュラＡを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。あるいくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、最大１８ｍｌのＡＣＤフォーミュラＡを含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、０．０５〜４０ｍｌのＡＣＤフォーミュラＡ、場合により０．１〜２５ｍｌのＡＣＤフォーミュラＡ、又は０．７〜１８ｍｌのＡＣＤフォーミュラＡを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、メチルプレドニゾロンを更に含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物中の残留メチルプレドニゾロンの存在は、細胞調製物の製造方法のインキュベーション段階におけるメチルプレドニゾロンの使用に起因する。いくつかの実施形態によれば、メチルプレドニゾロンは、本発明の細胞調製物の製造中に本発明で、該細胞が初期アポトーシス状態に入るように誘導される手法の一部として使用される。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、０．５〜３０μｇ／ｍｌ、場合により１〜２５μｇ／ｍｌ、典型的には３〜２２μｇ／ｍｌの濃度でメチルプレドニゾロンを更に含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、３．７〜２１．９μｇ／ｍｌの濃度でメチルプレドニゾロンを更に含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、３０μｇ／ｍｌを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを更に含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、３０μｇ／ｍｌ、場合により２５μｇ／ｍを超えない、典型的には２１．９μｇ／ｍｌを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを更に含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、０．５〜６０μｇ／ｍｌ、場合により１．１２〜６０μｇ／ｍｌの濃度でメチルプレドニゾロンを更に含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、６０μｇ／ｍｌを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを更に含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、場合により少なくとも１μｇ／ｍｌ、又は少なくとも３μｇ／ｍｌのメチルプレドニゾロンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、少なくとも３．５μｇ／ｍｌのメチルプレドニゾロンを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、少なくとも３．７μｇ／ｍｌのメチルプレドニゾロンを含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、０．１〜２５ｍｇのメチルプレドニゾロン、場合により０．４〜２０ｍｇのメチルプレドニゾロン、又は０．６７〜１８ｍｇのメチルプレドニゾロンを更に含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。本発明の組成物は、２５ｍｇ、典型的には２０ｍｇ、又は１８ｍｇを超えない量でメチルプレドニゾロンを更に含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、１５ｍｇを超えない量でメチルプレドニゾロンを更に含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含み、該調製物が少なくとも８５％の単核細胞を含み、該調製物中の細胞の少なくとも４０％が初期状態にあり、該調製物中の細胞の少なくとも８５％が生細胞であり、該調製物が１５％以下の多核白血球を含む。あるいくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含み、該調製物が少なくとも８５％の単核細胞を含み、該調製物中の細胞の少なくとも４０％が初期状態にあり、該調製物中の細胞の少なくとも８５％が生細胞である。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含み、該調製物が少なくとも８５％の単核細胞を含み、該調製物中の細胞の少なくとも４０％が初期状態にあり、該調製物中の細胞の少なくとも８５％が生細胞であり、該医薬組成物が抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、ヘパリン、ＡＣＤフォーミュラＡ及びそれらの組合せからなる群より選択される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含み、該調製物が少なくとも８５％の単核細胞を含み、該調製物中の細胞の少なくとも４０％が初期状態にあり、該調製物中の細胞の少なくとも８５％が生細胞であり、該調製物が１５％以下の多核白血球を含み、該医薬組成物が抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、ヘパリン、ＡＣＤフォーミュラＡ及びそれらの組合せからなる群より選択される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物中のヘパリンは、０．００５〜２．５Ｕ／ｍｌの濃度で存在する。他のいくつかの実施形態によれば、本発明の組成物中のＡＣＤフォーミュラＡは、０．０１〜１０％ｖ／ｖ、又は０．０５〜５％ｖ／ｖの濃度で存在する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含み、該調製物が少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも４０％が初期状態にあり、調製物中の細胞の少なくとも８５％が生細胞であり、調製物が１５％以下の多核白血球を含み、組成物が３０μｇ／ｍｌを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含み、該調製物が少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも４０％が初期状態にあり、調製物中の細胞の少なくとも８５％が生細胞であり、組成物が３０μｇ／ｍｌを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含み、該調製物が少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも４０％が初期状態にあり、調製物中の細胞の少なくとも８５％が生細胞であり、調製物が１５％以下の多核白血球を含み、組成物が抗凝固剤及びメチルプレドニゾロンを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物中のメチルプレドニゾロンの濃度は３０μｇ／ｍｌを超えない。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含み、該調製物が少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも４０％が初期状態にあり、調製物中の細胞の少なくとも８５％が生細胞であり、調製物が抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物中のメチルプレドニゾロンの濃度は３０μｇ／ｍｌを超えない。
特定のいくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、約３０×１０６〜３００×１０６細胞／ｋｇ体重、約１００×１０６〜３００×１０６細胞／ｋｇ体重、又は約１２０×１０６〜２５０×１０６細胞／ｋｇ体重の用量で投与される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。特定のいくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、約３５×１０６細胞／ｋｇ体重の用量で投与される。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、約１４０×１０６〜２１０×１０６細胞／ｋｇ体重の用量で投与される。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、約１４０×１０６細胞／ｋｇ体重の用量で投与される。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、約２１０×１０６細胞／ｋｇ体重の用量で投与される。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、約３５×１０６〜２１０×１０６細胞／ｋｇ体重の用量で投与される。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、約２５０×１０６細胞／ｋｇ体重の用量で投与される。他のいくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、約５×１０６細胞／ｋｇ体重の用量で投与される。当然のことながら、前記低用量は本明細書に開示された組成物の局所注射、例えば関節炎の治療のための関節への局所注射に好適である。
いくつかの実施形態によれば、本発明の治療的単核豊富細胞は、全身的に、好ましくは静脈内経路によって対象に投与される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。あるいは、該治療的単核豊富細胞は、非経口、腹腔内、関節内、筋肉内及び皮下経路を含む様々な他の経路に従って対象に投与され得る。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。好ましくは、該治療的単核豊富細胞は、生理食塩水、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等を含むがこれらに限定されない好適な生理的緩衝液に懸濁されて対象に投与される。更に、懸濁媒体は細胞の生存性の維持に役立つ補助剤を更に含んでよい。
アポトーシス細胞調製物の製造方法
別の態様によっては、本発明の医薬組成物の製造方法（本明細書では「本発明の製造方法」と称する）であって、ドナーの末梢血から、少なくとも６５％の単核細胞を含む単核豊富細胞調製物を取得するステップと、単核豊富細胞調製物を凍結媒体中で凍結するステップと、単核豊富細胞調製物を解凍するステップと、約１０〜１００μｇ／ｍＬの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含むインキュベーション媒体中で、該単核豊富細胞調製物をインキュベートするステップと、前記細胞調製物を投与媒体中に懸濁し、それによって本発明の医薬組成物を提供するステップとを含み、前記凍結媒体及び前記インキュベーション媒体の少なくとも１つは抗凝固剤を含むことを特徴とする製造方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従って得られた医薬組成物は、少なくとも８５％の単核細胞を含む。更なる実施形態では、本医薬組成物は、少なくとも８５％の単核細胞、９０％の単核細胞又は９０％超の単核細胞を含む。各可能性は本発明の別の実施形態である。いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、少なくとも９０％の単核細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、少なくとも９５％の単核細胞を含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従う単核豊富細胞組成物を得ることは、白血球除去法によって行われる。本明細書で使用される用語「白血球除去法」は、白血球がドナー血液から分離されるアフェレーシス手段を意味する。いくつかの実施形態によれば、ドナー血液は白血球除去法を受け、よって、単核豊富細胞組成物は本発明の製造方法に従って得られる。当分野で知られているように、回収された細胞の凝集を防ぐためには、白血球除去法中の少なくとも１つの抗凝固剤の使用が必要とされることに留意されたい。
いくつかの実施形態によれば、白血球除去法手法は、本発明の製造方法に従う単核豊富細胞組成物の回収を可能にするように構成される。いくつかの実施形態によれば、白血球除去法によって得られた細胞回収は、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％の単核細胞を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、細胞ドナー由来の血漿は、本発明の製造方法に従う単核豊富細胞組成物の取得に並行して回収される。いくつかの実施形態によれば、細胞ドナー由来の約３００〜６００ｍｌの血漿は、本発明の製造方法に従う単核豊富細胞組成物の取得に並行して回収される。いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従う単核豊富細胞組成物の取得に並行して回収される血漿は、凍結及び／又はインキュベーション媒体の一部として使用される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞集団は、細胞回収時に、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％の単核細胞を含むが、本発明の方法に従う本発明の最終医薬組成物は、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の単核細胞を含むことに留意されたい。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
特定の実施形態によれば、本発明の製造方法に使用される単核豊富細胞集団は、細胞回収時に少なくとも５０％の単核細胞を含む。あるいくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、本発明の製造方法であって、該方法がドナーの末梢血から単核豊富細胞集団を得るステップを含み、該単核豊富細胞集団は少なくとも５０％の単核細胞を含むことを特徴とする製造方法を提供する。あるいくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、本発明の製造方法であって、少なくとも５０％の単核細胞を含む単核豊富細胞集団を凍結するステップを含むことを特徴とする製造方法を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従って得られた単核法豊富細胞調製物は、凍結媒体中での凍結を受ける。いくつかの実施形態によれば、凍結は徐々に進行する。いくつかの実施形態によれば、回収後に細胞は、凍結されるまで室温で維持される。いくつかの実施形態によれば、細胞調製物は細胞回収後であって凍結前に洗浄媒体中での少なくとも１つの洗浄ステップを経る。本明細書で使用される用語「細胞を取得する（得る）」及び「細胞回収」は同じ意味で使用される。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物の細胞は、回収の３〜６時間以内に凍結される。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物は、細胞の回収の６時間以内に凍結される。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物は、細胞の回収の１、２、３、４、５、６、７、８時間以内に凍結される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。他のいくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物は、細胞の回収の最大８、１２、２４、４８、７２時間以内に凍結される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。他のいくつかの実施形態によれば、回収後、細胞は凍結されるまで２〜８℃で維持される。
いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従って凍結させるステップは、細胞調製物を約−１８〜−２５℃で凍結させ、その後、細胞調製物を約−８０℃で凍結させ、最後に、解凍するまで液体窒素中で細胞調製物を凍結させるステップを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従って凍結させるステップは、細胞調製物を約−１８〜−２５℃で少なくとも２時間凍結させ、細胞調製物を約−８０℃で少なくとも２時間凍結させ、最後に、解凍するまで液体窒素中で細胞調製物を凍結させるステップを含む。いくつかの実施形態によれば、細胞は、解凍前に少なくとも８、１０又は１２時間、液体窒素中で維持される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、細胞調製物中の細胞は、解凍、及びアポトーシス誘導インキュベーション媒体でインキュベートされるまで液体窒素中で維持される。いくつかの実施形態によれば、細胞調製物中の細胞は、造血幹細胞移植の日まで液体窒素中で維持される。非限定的な例によれば、細胞回収及び凍結から本発明の最終組成物の調製までの期間は１〜５０日、又は６〜３０日でよい。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。別の実施形態によれば、細胞調整物は、長期間、例えば少なくとも数ヶ月間、液体窒素中で維持され得る。
いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従って凍結させるステップは、細胞調製物を約−１８〜−２５℃で少なくとも０．５、１、２、４時間凍結させるステップを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従って凍結させるステップは、細胞調製物を約−１８〜−２５℃で約２時間凍結させるステップを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従って凍結させるステップは、細胞調製物を約−１８℃で少なくとも０．５、１、２、４、１２時間凍結させるステップを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２０ヶ月間凍結し続けることができる。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、少なくとも０．５、１、２、３、４、５年間凍結し続けることもできる。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、少なくとも２０ヶ月間凍結し続けることができる。
いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、少なくとも８、１０、１２、１８、２４時間凍結される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、少なくとも８時間凍結される。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、少なくとも約１０時間凍結される。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、少なくとも約１２時間凍結される。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、約１２時間凍結される。いくつかの実施形態によれば、（約−１８〜−２５℃で、約−８０℃で、及び液体窒素中での）単核豊富細胞組成物の総凍結時間は、少なくとも８、１０、１２、１８、２４時間である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、凍結は少なくとも一部では、単核豊富細胞組成物の細胞において初期アポトーシス状態を誘導する。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体は、Ｌ−グルタミン、Ｈｅｐｅｓ、Ｈｅｓ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び血漿を含むＲＰＭＩ １６４０培地を含む。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体中の血漿は、本発明の組成物の単核豊富細胞を提供したドナーの自家血漿である。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５％のＨｅｓ、１０％のジメチルスルホキシド及び２０％ｖ／ｖの血漿を含むＲＰＭＩ １６４０培地を含む。
いくつかの実施形態によれば、凍結媒体は抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体、インキュベーション媒体及び洗浄媒体を含む、本発明の製造方法中で使用された媒体の少なくとも一部は、抗凝固剤を含む。あるいくつかの実施形態によれば、抗凝固剤を含む本発明の製造方法中で使用された全ての媒体は、抗凝固剤と同一の濃度を含む。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、本発明の細胞調製物の最終懸濁媒体に添加されない。
いくつかの実施形態によれば、凍結媒体への少なくとも抗凝固剤の添加は、本発明の細胞調製物の収率を改善する。他のいくつかの実施形態によれば、凍結媒体への抗凝固剤の添加は、高トリグリセリドレベルの存在下で、本発明の細胞調製物の収率を改善する。本明細書において、本発明の細胞調製物の収率を改善は、凍結された細胞のうちの生細胞の割合（パーセンテージ）、生細胞のうちの初期状態アポトーシス細胞の割合、及びそれらの組合せのうち、少なくとも１つの改善に関する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物における細胞収率は、本発明に従うアポトーシス誘導に供された最初の細胞数の内の、組成物中の細胞数を意味する。本明細書で使用される用語「初期アポトーシス状態の誘導」及び「アポトーシスの誘導」は同じ意味で使用される。
いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞集団の収率の改善は、調製物が製造された凍結細胞数の内、調製物の初期アポトーシス生細胞数の改善を意味する。
いくつかの実施形態によれば、凍結媒体への抗凝固剤の添加は、本発明の医薬組成物の異なった調製物間の高くかつ安定した収率に寄与する。好ましい実施形態によれば、凍結媒体及びインキュベーション媒体への抗凝固剤の添加は、使用した細胞回収プロトコルにかかわらず、医薬組成物の異なった調製物間の高くかつ安定した収率をもたらす。
いくつかの実施形態によれば、凍結媒体は、ヘパリン、ＡＣＤフォーミュラＡ及びそれらの組合せからなる群より選択される抗凝固剤を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体中で使用される抗凝固剤は、１０Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含むＡＣＤフォーミュラＡである。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体は、１０Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含む５％ｖ／ｖのＡＣＤフォーミュラＡ溶液を含む。
いくつかの実施形態によれば、凍結媒体はヘパリンを含む。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体中のヘパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌの濃度である。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体中のヘパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌ、場合により０．３〜０．７Ｕ／ｍｌ、典型的には約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体中のヘパリンは、約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。
いくつかの実施形態によれば、凍結媒体はＡＣＤフォーミュラＡを含む。いくつかの実施形態によれば、凍結培媒体中のＡＣＤフォーミュラＡは１〜１５％ｖ／ｖの濃度である。いくつかの実施形態によれば、凍結培媒体中のＡＣＤフォーミュラＡは、１〜１５％ｖ／ｖ、場合により４〜７％ｖ／ｖ、典型的には約５％ｖ／ｖの濃度である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、凍結培媒体中のＡＣＤフォーミュラＡは、約５％ｖ／ｖの濃度である。
いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、細胞回収後でかつ凍結媒体中に再懸濁されて凍結される前に、少なくとも洗浄ステップを経る。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、凍結及び解凍後に少なくとも１つの洗浄ステップを経る。いくつかの実施形態によれば、洗浄ステップは、単核豊富細胞組成物の遠心、その後の上清抽出及び洗浄媒体中での再懸濁を含む。
いくつかの実施形態によれば、細胞回収は、単核豊富細胞組成物を得ることを意味する。いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法中に行われる洗浄ステップは、洗浄媒体中で行われる。あるいくつかの実施形態によれば、洗浄ステップは、本発明の製造方法のインキュベーションステップの洗浄媒体中で行われるまで行われる。いくつかの実施形態によれば、洗浄培体は、Ｌ−グルタミン及びＨｅｐｅｓで補完されたＲＰＭＩ １６４０培地を含む。いくつかの実施形態によれば、洗浄培体は、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓで補完されたＲＰＭＩ １６４０培地を含む。
いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体は抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体は、ヘパリン、ＡＣＤフォーミュラＡ及びそれらの組合せからなる群より選択される抗凝固剤を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体中の抗凝固剤の濃度は、凍結媒体中のそれと同一の濃度である。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体中の抗凝固剤の濃度は、インキュベーション媒体中のそれと同一の濃度である。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体で使用される抗凝固剤は、１０Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含むＡＣＤフォーミュラＡである。
いくつかの実施形態によれば、洗浄培体はヘパリンを含む。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体中のヘパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌの濃度である。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体中のヘパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌ、場合により０．３〜０．７Ｕ／ｍｌ、典型的には約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。あるいくつかの実施形態によれば、洗浄媒体中のヘパリンは約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。
いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体はＡＣＤフォーミュラＡを含む。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体中のＡＣＤフォーミュラＡは、１〜１５％ｖ／ｖの濃度である。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体中のＡＣＤフォーミュラＡは、１〜１５％ｖ／ｖ、場合により４〜７％ｖ／ｖ、典型的には約５％ｖ／ｖの濃度である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体中のＡＣＤフォーミュラＡは約５％ｖ／ｖの濃度である。
いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、本発明の組成物の対象への意図した投与の数時間前に解凍される。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、約３３℃〜３９℃で解凍される。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、約３０〜２４０秒、好ましくは４０〜１８０秒、最も好ましくは５０〜１２０秒間解凍される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、本発明の組成物の意図した投与の少なくとも１０時間前、又は本発明の組成物の意図した投与の少なくとも２０、３０、４０又は５０時間前に解凍される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、本発明の組成物の意図した投与の少なくとも１５〜２４時間前に解凍される。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、本発明の組成物の意図した投与の少なくとも２４時間前に解凍される。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、本発明の組成物の意図した投与の少なくとも２０時間前に解凍される。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、本発明の組成物の意図した投与の少なくとも３０時間前に解凍される。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、本発明の組成物の意図した投与の少なくとも２４時間前に解凍される。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、解凍前及び／又は後に洗浄媒体中での少なくとも１つの洗浄ステップを経る。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、凍結及び解凍後にインキュベーション媒体中でインキュベートされる。いくつかの実施形態によれば、解凍とインキュベーションとの間に少なくとも１つの洗浄ステップがある。本明細書で用いる用語「インキュベーション媒体」及び「アポトーシス誘導インキュベーション媒体」は同じ意味で使用される。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体は、Ｌ−グルタミンで補完したＲＰＭＩ １６４０培地、Ｈｅｐｅｓメチルプレドニゾロン及び血漿を含む。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ及び１０％ｖ／ｖの血漿を含む。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中の血漿は、本発明の細胞調製物の細胞が得られた同一ドナーから得られる。いくつかの実施形態によれば、血漿はインキュベーションの日にインキュベーション媒体に添加される。いくつかの実施形態によれば、インキュベーションは３７℃で、５％ＣＯ２で行われる。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体は、メチルプレドニゾロンを含む。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中のメチルプレドニゾロンは、単核豊富細胞組成物中の細胞を更に誘導して、初期アポトーシス状態にさせる。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物中の細胞は、メチルプレドニゾロンの存在下に凍結及びインキュベートすることによって初期アポトーシス状態に入るように誘導される。いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法は、有利には、壊死の誘導なしに実質的に初期アポトーシス状態の誘導を可能にし、細胞は、調製後約２４時間、前記初期アポトーシス状態で安定である。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体は、約１０〜１００μｇ／ｍｌの濃度でメチルプレドニゾロンを含む。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体は、約４０〜６０μｇ／ｍｌ、又は約４５〜５５μｇ／ｍｌの濃度でメチルプレドニゾロンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体は、５０μｇ／ｍｌの濃度でメチルプレドニゾロンを含む。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーションは、約２〜１２時間、場合により４〜８時間、典型的には約５〜７時間である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、インキュベーションは約６時間である。いくつかの実施形態によれば、インキュベーションは少なくとも約６時間である。好ましい実施形態では、インキュベーションは６時間である。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体は抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤のインキュベーション媒体への添加は、本発明の細胞集団の収率を改善する。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中の抗凝固剤は、凍結媒体中と同一濃度である。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体は、ヘパリン、ＡＣＤフォーミュラＡ及びそれらの組合せからなる群より選択される抗凝固剤を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中で使用される抗凝固剤は、１０Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含むＡＣＤフォーミュラＡである。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体はヘパリンを含む。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中のヘパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌの濃度である。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中のヘパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌ、場合により０．３〜０．７Ｕ／ｍｌ、典型的には約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。あるいくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中のヘパリンは約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体はＡＣＤフォーミュラＡを含む。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中のＡＣＤフォーミュラＡは、１〜１５％ｖ／ｖの濃度である。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中のＡＣＤフォーミュラＡは、１〜１５％ｖ／ｖ、場合により４〜７％ｖ／ｖ、典型的には約５％ｖ／ｖの濃度である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中のＡＣＤフォーミュラＡは、約５％ｖ／ｖの濃度である。
いくつかの実施形態によれば、凍結媒体及びインキュベーション媒体の両方は抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体及びインキュベーション媒体の両方への抗凝固剤の添加は、例えば細胞回収中に添加された抗凝固剤の添加時期及び種類に限定されない細胞回収条件にかかわらず、本発明の組成物の異なった調製物間で高くかつ安定した細胞収率をもたらす。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体及びインキュベーション媒体の両方への抗凝固剤の添加は、白血球除去法中の抗凝固剤の添加時期及び／又は種類にかかわらず、本発明の細胞調製物の高くかつ安定した細胞収率をもたらす。いくつかの実施形態によれば、高トリグリセリドレベルの存在下での本発明の細胞調製物の製造は、異なった調製物間で低く及び／又は不安定な細胞収率をもたらす。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、高トリグリセリドレベルを有するドナーの血液から細胞調製物を製造することは、低く及び／又は不安定な細胞収率をもたらす。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、用語「高トリグリセリドレベル」は、同一の性別及び年齢の健常対象の正常レベルを超えるトリグリセリドレベルを意味ずる。いくつかの実施形態によれば、用語「高トリグリセリドレベル」は、約１．７ミリモル／リットルを超えるトリグリセリドレベルを意味ずる。本明細書で使用される高くかつ安定な収率は、対象に投与する時に治療的効果を示す用量の調製を可能にする十分に高い、本発明の組成物の細胞収率を意味する。いくつかの実施形態によれば、治療的効果は、対象における免疫疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患を治療、予防又は緩和する能力を意味する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、高くかつ安定な細胞収率は、最初に凍結された細胞のうちの、本発明の組成物中の細胞の少なくとも３０％、場合により少なくとも４０％、典型的には少なくとも５０％の細胞収率である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物が高トリグリセリドレベルを有するドナーから得られる場合には、該ドナーは、供与前にトリグリセリド低下媒体（例えばスタチン及び／又はベザフィブラートであるが、これらに限定されない）を投与される、供与前に少なくとも８、１０、１２時間絶食する、供与の少なくとも２４、４８、７２時間前に血中トリグリセリドレベルを減少させるために適切な食事をとる、及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１つの手段をとることになる。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体及び／又は凍結媒体への抗凝固剤の添加は、ドナーの血中のトリグリセリドレベルにかかわらず、本発明の組成物に高くかつ安定した細胞収率をもたらす。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体及び／又は凍結媒体への抗凝固剤の添加は、正常又は高トリグリセリドレベルを有するドナーの血液から得られる場合に、本発明の組成物に高くかつ安定した細胞収率をもたらす。いくつかの実施形態によれば、少なくともインキュベーション媒体への抗凝固剤の添加は、ドナーの血中のトリグリセリドレベルにかかわらず、本発明の組成物に高くかつ安定した細胞収率をもたらす。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体及びインキュベーション媒体への抗凝固剤の添加は、ドナーの血中のトリグリセリドレベルにかかわらず、本発明の組成物に高くかつ安定した細胞収率をもたらす。
いくつかの実施形態によれば、凍結媒体及び／又はインキュベーション媒体及び／又は洗浄媒体は、少なくとも０．１Ｕ／ｍｌ、場合により少なくとも０．３Ｕ／ｍｌ、典型的に少なくとも０．５Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体及び／又はインキュベーション媒体及び／又は洗浄媒体は、少なくとも１％ｖ／ｖ、場合により少なくとも３％ｖ／ｖ、典型的に少なくとも５％ｖ／ｖの濃度でＡＣＤフォーミュラＡを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、本発明の製造方法の各段階間で少なくとも１つの洗浄ステップを経る。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、本発明の製造方法に渡って洗浄ステップ中に洗浄媒体に添加される。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、インキュベーション後に少なくとも１つの洗浄ステップを経る。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、ＰＢＳを用いるインキュベーション後に少なくとも１つの洗浄ステップを経る。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、投与媒体での細胞調製物の再懸濁前に最終の洗浄ステップに添加されない。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、投与媒体での細胞調製物の再懸濁前に最終の洗浄ステップで使用されるＰＢＳに添加されない。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は投与媒体に添加されない。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーション中の細胞濃度は、約５×１０６細胞／ｍｌである。
いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、凍結、解凍及びインキュベーション後に投与媒体に懸濁され、それによって本発明の医薬組成物を与える。いくつかの実施形態によれば、投与媒体は好適な生理的緩衝液を含む。好適な生理的緩衝液の非限定例は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）等である。いくつかの実施形態によれば、投与媒体はＰＢＳを含む。いくつかの実施形態によれば、投与媒体は、細胞の生存性の維持を助ける補助剤を含む。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、投与前に濾過される。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、少なくとも２００μｍのフィルターを用いて投与前に濾過される。
いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、得られる細胞調製物の最終体積が１００〜１０００ｍｌ、場合により２００〜８００ｍｌ、典型的には３００〜６００ｍｌとなるように投与媒体に再懸濁される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、本発明の医薬組成物の製造方法であって、少なくとも６５％の単核細胞を含む単核豊富細胞調製物を凍結媒体中で凍結するステップと、単核豊富細胞調製物を解凍するステップと、約１０〜１００μｇ／ｍＬの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含むインキュベーション媒体中で、単核豊富細胞調製物をインキュベートするステップと、前記細胞調製物を投与媒体中で再構築し、それによって本発明の医薬組成物を提供するステップとを含み、前記凍結媒体及び前記インキュベーション媒体の少なくとも１つは抗凝固剤を含むことを特徴とする製造方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物の製造方法は、単核豊富細胞組成物を取得するステップを更に含む。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、ドナーの末梢血から得られる。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、移植のために使用される同一のドナーの末梢血から得られる。いくつかの実施形態によれば、単核豊富細胞組成物は、ＨＳＣＴについては同一のドナー提供細胞の末梢血から得られる。いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法のための単核豊富細胞組成物は、取得時に造血幹細胞動員を経ないドナーから得られる。いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法のための単核豊富細胞組成物は、取得時に顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）での処理を受けないドナーから得られる。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、本発明の医薬組成物の製造方法であって、ドナーの末梢血から少なくとも６５％の単核細胞を含む単核豊富細胞調製物を取得するステップと、単核豊富細胞調製物を、抗凝固剤を含む凍結媒体中で凍結するステップと、単核豊富細胞調製物を解凍するステップと、単核豊富細胞調製物をインキュベートするステップと、前記細胞調製物を投与媒体中に懸濁し、それによって、本発明の医薬組成物を提供するステップとを含み、インキュベーション媒体は、抗凝固剤及び約５０μｇ／ｍＬの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含むことを特徴とする製造方法を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、本発明の細胞調製物であって、本発明の製造方法によって製造される細胞調製物を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含む医薬組成物であって、該調製物は少なくとも８５％の単核細胞を含み、該調製物中の該細胞の少なくとも４０％は初期アポトーシス状態にあり、該調製物中の該細胞の少なくとも８５％は生細胞であり、当該医薬組成物が、ドナーの末梢血から、少なくとも６５％の単核細胞を含む単核豊富細胞調製物を取得するステップと、単核豊富細胞調製物を凍結媒体中で凍結するステップと、単核豊富細胞調製物を解凍するステップと、単核豊富細胞調製物を、約１０〜１００μｇ／ｍＬの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含むインキュベーション媒体中でインキュベートするステップと、細胞調製物を投与媒体中に懸濁し、それによって、本発明の医薬組成物を提供するステップとを含み、凍結媒体及びインキュベーション媒体の少なくとも１つは抗凝固剤を含む製造方法によって製造される、医薬組成物を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含む医薬組成物であって、調製物は少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の該細胞の少なくとも４０％は初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも８５％は生細胞であり、当該医薬組成物が、ドナーの末梢血から、少なくとも６５％の単核細胞を含む単核豊富細胞調製物を取得するステップと、単核豊富細胞調製物を、抗凝固剤を含む凍結媒体中で凍結するステップと、単核豊富細胞調製物を解凍するステップと、単核豊富細胞調製物を、抗凝固剤及び約５０μｇ／ｍＬの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含むインキュベーション媒体中でインキュベートするステップと、細胞調製物を投与媒体中に懸濁し、それによって、本発明の医薬組成物を提供するステップとを含む製造方法によって製造されることを特徴とする医薬組成物を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含む医薬組成物であって、調製物は少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の該細胞の少なくとも４０％は初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも８５％は生細胞であり、調製物は１５％以下の多核白血球を含み、当該医薬組成物が、ドナーの末梢血から、少なくとも６５％の単核細胞を含む単核豊富細胞調製物を取得するステップと、単核豊富細胞調製物を凍結媒体中で凍結するステップと、単核豊富細胞調製物を解凍するステップと、単核豊富細胞調製物を、約１０〜１００μｇ／ｍＬの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含むインキュベーション媒体中でインキュベートするステップと、細胞調製物を投与媒体中に懸濁し、それによって、本発明の医薬組成物を提供するステップとを含み、凍結媒体及びインキュベーション媒体の少なくとも１つは抗凝固剤を含む製造方法によって製造される、医薬組成物を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、単核豊富細胞を含む細胞調製物を含む医薬組成物であって、調製物は少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の該細胞の少なくとも４０％は初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも８５％は生細胞であり、調製物は１５％以下の多核白血球を含み、当該医薬組成物が、ドナーの末梢血から、少なくとも６５％の単核細胞を含む単核豊富細胞調製物を取得するステップと、単核豊富細胞調製物を、抗凝固剤を含む凍結媒体中で凍結するステップと、単核豊富細胞調製物を解凍するステップと、単核豊富細胞調製物を、抗凝固剤及び約５０μｇ／ｍＬの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含むインキュベーション媒体中でインキュベートするステップと、細胞調製物を投与媒体中に懸濁し、それによって、本発明の医薬組成物を提供するステップとを含む製造方法によって製造されることを特徴とする医薬組成物を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
定義
用語「〜を含む」、「〜を有する」及びそれらの変化形は、「〜を含むが、それに限定されない」ことを意味する。
用語「〜から成る」は、「〜を含み、かつ限定されない」ことを意味する。
用語「本質的になる」は、組成物、方法又は構造が追加の成分、ステップ及び／又は部分を含み得るが、該追加の成分、ステップ及び／又は部分がクレームされた組成物、方法又は構造の基本的及び新規な特徴を物質的に変更しない場合に限る。
本明細書で使用される用語「ｖ／ｖ」及び「ｖｏｌ／ｖｏｌ」は同じ意味で使用され、体積／体積濃度を意味する。
本明細書においては、単数形で記述されている場合であっても、他に明確に定義しない限り、複数の形態を含む。例えば、用語「化合物」又は「少なくとも１つの化合物」は、複数の化合物（それらの混合物を含む）を含む。
本明細書を通して、本発明の様々な実施形態は範囲形式で示される。範囲形式での記載は簡便及び簡潔さのためのみであり、本発明の範囲に対する確固たる限定と解されるべきではないことを理解されたい。従って、範囲の記載は、可能な下位範囲の全て及び該範囲内の個々の数値を具体的に開示していると解釈されたい。例えば、１〜６のような範囲の記載は、下位範囲、例えば１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等、及び該範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５及び６を具体的に開示していると解釈されたい。このことは、範囲の広さに依らない。
本明細書に数値範囲が示されている時は常に、指摘された範囲内の任意の記載された数値（少数・分数、又は整数）を含むことを意味する。１番目に示した数「〜」２番目に示した数「の範囲」、及び１番目に示した数「から」２番目に示した数「までの範囲」という用語は、本明細書で同じ意味で使用され、１番目に示した数、２番目に示した数、及び両者間の全ての少数・分数及び整数を含むことを意味する。
本明細書で使用される用語「約」は、記述値±１０％を意味する。
本明細書で使用される用語「方法」は、所定の業務を遂行するための方法、手段、技術及び手法を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学及び医薬分野の実務者に公知であるか、又は彼らによって公知の方法、手段、技術及び手法から容易に開発されたかのいずれかの、方法、手段、技術及び手法を含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される用語「治療すること」は、症状の進行を解消し、実質的に阻害し、遅らせ、又は逆転させ、症状の臨床的又は美容的な症候を実質的に緩和し、又は症状の臨床的若しくは美容的な症候の出現を実質的に抑制することを含む。
好ましくは、本発明の方法は、ヒト対象等の哺乳動物対象において疾患を治療するために使用される。該方法が、本明細書に記載のような成功的な臨床試験相１／２ａの点から、ヒト対象を治療するために使用され得ることは容易に理解できよう。
明確化のために、別の実施形態の文脈に記載される本発明のある特徴は、１つの実施形態では、組み合わせて提供されてもよい。反対に、簡略化のために、１つの実施形態の文脈に記載される本発明の様々な特徴は、別個に、又は任意の好適なサブコンビネーションで、又は好適には本発明の任意の他の記載の実施形態で、提供されてもよい。様々な実施形態の文脈に記載のある特徴は、該実施形態がこれらの要素なしには実施不可でなければ、これらの実施形態の必須の特徴とは見なされない。
上に記載された及び以下の請求項でクレームされた本発明の様々な実施形態及び局面は、以下の実施例に実験的支持がある。
実施例
本明細書に開示する実施例１〜４において以下の方法を用いた。
ＡｐｏＣｅｌｌの分析方法及び規格
幾つかの製造段階中にＡｐｏＣｅｌｌを試験した。アポトーシス誘導に先立ち採取した濃縮単核球及び最終ＡｐｏＣｅｌｌ調製品に関連する品質管理試験、試験方法、試験施設、及び規格を下表３に記載する。
Figure 2016501526
臨床投与へ向けての出荷に先立ちＡｐｏＣｅｌｌをさらに試験した。製品出荷へ向けての品質管理試験、試験方法、試験施設、及び規格を下表４に示す。無菌性及び力価試験は製品出荷後に実施した。
Figure 2016501526
細胞数
細胞数は白血球（ＷＢＣ）数から得られる。
細胞生存率
細胞生存率をヨウ化プロピジウム染色によりフローサイトメトリーで測定した。
同一性／純度
シスメックス（SYSMEX）血球分析装置の百分率数から、採取した濃縮単核球の同一性及び純度を決定した。同一性／純度を白血球数のリンパ球と単球のパーセンテージの和により算出した。血球分析装置により単核球パーセンテージが３０％未満であった場合は、別の評価方法を使用することができる。すなわち、特異的認識抗体を用いたフローサイトメトリーでは、ＣＤ１５及びＣＤ１４用の二重染色が実施され、顆粒球のパーセンテージがＣＤ１５ｈｉｇｈＣＤ１４ｌｏｗ−ｎｅｇ細胞のパーセンテージとして測定されることになる。ＣＤ１５ｈｉｇｈＣＤ１４ｌｏｗ−ｎｅｇ細胞部分が７０％未満であった場合、その採取分は以降のプロセスで使用可能ということになる。もし７０％を超えた場合は、当該採取分は廃棄される。代替として、顆粒球パーセンテージを測定する同等試験を用いることができる。
ＡｐｏＣｅｌｌ製品出荷前の同一性／純度をフローサイトメトリー分析により決定し、顆粒球の割合を評価した。ＣＤ１５及びＣＤ１４の二重染色を実施し、顆粒球のパーセンテージをＣＤ１５ｈｉｇｈＣＤ１４ｌｏｗ−ｎｅｇ細胞のパーセンテージとして測定した。
同一性：アポトーシス表現型
アポトーシスは、２色フローサイトメーターによるアッセイでアネキシン及びヨウ化プロピジウムの染色（Ａｎ＋ＰＩ−）を評価して測定した。
無菌性
ドナー細胞の各ロットは、連邦規則集（ＦＤＡ）の２１ＣＦＲ６１０．１２に則った「直接無菌性試験法」を使用して無菌性について試験する。試料を毎日モニタリングし、測定値を接種後１４日目に記録する。
エンドトキシン（ＬＡＬ）
Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳは、ＦＤＡの認可を受けたエンドトキシン検出システムであり、携帯型分光光度計とともにＬＡＬ試験カートリッジを使用し、測定したその場で結果が得られる。ＰＴＳにより、定量的なＬＡＬ試験結果が約１５分で得られる。
力価
未熟ＤＣ（ｉＤＣ）をＡｐｏＣｅｌｌ調製６日前にヴェルボヴェツキ（Verbovetski）らの文献（JEM 2002）の記載にあるように調製した。簡単に言うと、細胞調製物のドナー又はレシピエント以外の対象に由来する未熟単球由来樹状細胞を血液バフィーコートのＣＤ１４＋選択分画から作製した。ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社（GE Healthcare Life Sciences）製、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて単離し、ＰＢＭＣから単球を単離するために抗ＣＤ１４磁気のビーズを製造者の指示（ＢＤバイオサイエンス社（BD Biosciences）製、米国カリフォルニア州サンノゼ）に従って使用した。単球を、１％自己由来血漿、ＧＭＣＳＦ（０．１μｇ／ｍｌ）、及びＩＬ−４（０．１μｇ／ｍｌ）（ペプロテック社（PeproTech）製、米国ニュージャージー州ロッキー・ヒル）の存在下の培地のウェルに濃度１.２５×１０６／１.５ｍｌで置いた。２日おきに０.１５ｍｌを取り除き、血漿、ＩＬ−４（０．０５μｇ／ｍｌ）、及びＧＭＣＳＦ（０．１μｇ／ｍｌ）含有培地０．２５ｍｌを添加した。６日目までに、９０％を超える細胞がＣＤ１４−で、ＤＲ、ＣＤ−８３、及びＣＤ−８６を低発現していた。ｉＤＣに対してＡｐｏＣｅｌｌをＤＣ：ＡｐｏＣｅｌｌ比１：２、１：４、及び１：８で一晩（１６〜２４時間）導入した。処理によっては、抗炎症作用を評価するために、相互作用から２時間後に１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを添加した。相互作用後、細胞を回収し、ＤＣｓｉｇｎ（ｉＤＣの同一性確認用）及びＨＬＡ−ＤＲ又はＣＤ８６（炎症誘発性免疫反応の評価用）の双方で染色した。対照としてアイソタイプ・コントロールを使用した。樹状細胞上のＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ８６の発現（ＤＣｓｉｇｎ陽性細胞）をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳキャリバー、ベクトン・ディッキンソン社（Becton Dickenson）製、米国カリフォルニア州サンノゼ）を用いて評価した。ＦＣＳ ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを用いてＤＣｓｉｎｇ陽性細胞（１００００イベント）の分析を実施した。
少なくとも１比の少なくとも１マーカーにおける有意な（コルゴモロフ・スミルノフ分析）ダウンレギュレーションを、ＡｐｏＣｅｌｌと相互作用させた後にＤＣの寛容化表現型用マーカーとして使用した。
試験デザイン及び患者
ＡｐｏＣｅｌｌの第１／２ａ相多施設共同臨床試験（clinicaltrials.gov登録番号：ＮＣＴ００５２４７８４）をＨＬＡ一致同胞の同種骨髄移植を受ける被検者に実施した。ＡｐｏＣｅｌｌ投与の安全性忍容性及び予備的有効性を評価するため試験を実施した。
試験の主要評価項目は、ＨＬＡ一致同胞の同種骨髄移植を受ける被検者に移植後１８０日以内にＡｐｏＣｅｌｌを用量漸増投与した場合の安全性プロファイル及び忍容性（用量制限毒性（ＤＬＴ））を検討することとした。
副次的評価項目は、同種骨髄移植（ａｌｌｏＢＭＴ）生着成功率及び生着成功までの期間を測定し、ＡｐｏＣｅｌｌ注入後の急性ＧＶＨＤの発生率とグレードを記載し、ＡｐｏＣｅｌｌ注入及びａｌｌｏＢＭＴ後のレシピエントの免疫機能を検討することとした。転帰評価のため、以下のパラメータを用いた：好中球及び血小板回復までの期間、好中球の完全ドナー型キメラ状態までの期間、生着不全、再発又は悪性化した被検者の割合、感染症の発生率（細菌性、ウイルス性、真菌性）、４５日目（ＡｐｏＣｅｌｌ注入の４６日後）、１００日目及び１８０日目の被検者の全生存率、１８０日目の急性ＧｖＨＤ未発症の被検者の生存割合、ＡｐｏＣｅｌｌ注入後の急性ＧｖＨＤの発症率とグレード、グレードＩＩＩ〜ＩＶの急性ＧｖＨＤを発症した被検者の割合、急性ＧｖＨＤ発症までの期間。追加の副次的評価項目として生着までの期間及び退院までの期間を含めた。
初期ＡｐｏＣｅｌｌ用量（コホート１）は３５×１０６アポトーシス細胞／ｋｇとし、移植前日（−１日目）にＡｐｏＣｅｌｌの予備的安全性プロファイルを評価するため、まず患者１人の採用で開始し、その後引き続き、さらに２人の被検者を第１のコホートに採用した。１人目の患者のＡｐｏＣｅｌｌ注入は、４５日目の試験の実施計画書で規定された安全性基準を満たしており、続いて２人目の患者に同一用量で試験したところ、やはり試験の実施計画書で規定された安全性基準を満たしていた。その後、試験は次の相へ移り、データ及び安全性モニタリング委員会（ＤＳＭＢ）により、各コホート１〜３の３１日目の試験終了後、及びコホート４の４５日目の試験終了後に安全性データの中間解析が実施された。いずれのコホートもＤＳＭＢ基準を満たし、試験の終了が許可された。
初期計画は、各コホートにつき３人の患者を採用することであった。しかし、７人目の患者は１４０×１０６細胞／ｋｇではなくわずか９０×１０６細胞／ｋｇしか投与を受けなかったため、ただちに第２コホート（７０×１０６細胞／ｋｇ）に追加例として含めた。１、３及び４コホートが各３人、コホート２が４人で、計１３人の患者が治療を受けた。
適格基準には以下を含めた：成人男性又は女性被検者であること、年齢が１８〜６０歳であること、スクリーニング受診時の体重が少なくとも４０ｋｇであること、及びベースライン受診時の余命が少なくとも６ヶ月であること。被検者は、移植が適切とされるいかなる疾患のＨＬＡ一致同胞の同種骨髄移植（ａｌｌｏＢＭＴ）にも適格とされたが、進行性又はコントロール不良の悪性腫瘍は除外された。遺伝子型がＨＬＡ一致の同胞、表現型がＨＬＡ一致の一等親から移植できること、ＨＬＡのＡ座、Ｂ座、Ｃ座及びＤＲ座で少なくとも７／８のＨＬＡ一致であること、及び臨床医の骨髄破壊的レジメンの判断が要件とされた。
除外基準は、妊娠、血清学的陽性ＨＩＶ、活動性の重篤な感染症、Ｔ細胞を除去した同種移植片；カルノフスキーのパフォーマンスステータス（Karnofsky performance status：ＫＰＳ）が８０％未満、又は重篤な臓器機能不全（例えば、予測値に対する左室駆出率＜４０％、努力肺活量＜６０％、肝臓トランスアミナーゼ＞２．５×正常値上限、又は血清ビリルビン＞３ｍｇ／ｄＬ又はクレアチニン＞２２１μｍｏｌ／Ｌ（２．５ｍｇ／ｄＬ）であった。
前処置レジメン及び対症療法
患者の前処置レジメンは、ブスルファンベース又は全身照射（ＴＢＩ）ベースのいずれかとした。ブスルファンの場合は、経口ブスルファン１６ｍｇ／ｋｇ×４日とサイトキサン１２０ｍｇ／ｋｇ、又はＦｌｕ−Ｂｕ２−ＴＴ２の場合は、フルダラビン３０ｍｇ／ｋｇ／日を５又は６日、ブスルファンＩ．Ｖ３．２ｍｇ／ｋｇ／日を２日又は４日、チオテパＩ．Ｖ．５ｍｇ／ｋｇ／日を２日（レジメン名：ＦＢＴ）とした。ＴＢＩベースのレジメンでは、シクロホスファミドＩ．Ｖ．６０ｍｇ／ｋｇを２日又はエトポシド（ＶＰ−１６）６０ｍｇ／ｋｇを、少なくとも１２００ｃＧｙの分割ＴＢＩ用量の全身照射とともに投与した。シクロホスファミドとＴＢＩの投与順序は各施設の移植センターの判断によるが、全患者ともシクロホスファミドとＴＢＩを同じ順序で投与を受けることとした。シクロホスファミド又はＶＰ１６（エトポシド）の投与が最後になった場合、末梢血幹細胞注入まで少なくとも１日の休薬期間を置かなければならないとした。分割ＴＢＩを施設のプロトコルに従い投与した。メスナは可能ではあるが、必須ではない。しかし、各参加施設はその施設のガイドラインに従った前処置レジメンを用いることができたが、骨髄破壊的で、かつそのセンターの試験対象患者全員に対して使用することが条件とされた。抗胸腺細胞（ＡＴＧ）による前処置レジメンは禁止した（除外基準）。
投与はすべて理想体重をもとに決定され、ＡｐｏＣｅｌｌは移植前日（Ｄａｙ−１）に静脈内に投与した。
ＧＶＨＤ予防
本試験の被検者は、通常の標準治療に従って処方されたＧＶＨＤ予防レジメンを受け、ＩＶシクロスポリン用量３ｍｇ／ｋｇを処置前（Ｄａｙ−１）（用量は血漿中濃度に応じて調整）に開始し、ＩＶメソトレキセートをＤａｙ＋１、＋３及び＋６にそれぞれ用量１５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２で投与した（各投与後１８時間からフォリン酸を３回投与）。
シクロスポリンは、患者が嚥下可能な場合は経口投与し、Ｄａｙ＋９０まで継続した（疾患ステータスとキメラ状態に従う）。
男性／女性のドナー−レシピエントの組合せにおいて標準的な細胞遺伝学的分析によりキメラ状態を評価した。女性キメラ中の残留男性細胞をアメロゲニン遺伝子方法により検出した。性別が一致したドナー−レシピエントの組合せでは、ＶＮＴＲ（縦列反復配列多型）ＰＣＲアッセイ及びその後のＳＴＲ（縦列型反復配列）ＰＣＲアッセイを５％検出感度で使用し、残留する宿主又はドナー細胞の有無について評価した。過去１０年のさらなる既存対照をグーリーらの文献（Gooley TA, NEJM 2010）から抜粋した。
感染イベントをすべて記録し、米国国立癌研究所（ＮＣＩ）の有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）（第３版）に従いグレード付けをした。感染までの期間を１８０日目まで評価した。ＣＭＶをスクリーニング時、試験の３日目、１０日目、１７日目、３１日目、４５日目、６６日目、１００日目及び１８０日目の受診時に試験した。
急性ＧＶＨＤのための集中的な経過観察期間（−１〜３日目）、短期経過観察期間（１０日目、１７日目、３１日目及び４５日目に受診）及び長期経過観察期間（６６日目、１００日目及び１８０日目に受診）を設けた。経過観察期間中、受診機会は、毎週受診では±２日、隔週又はそれ以上の間隔の受診では±５日であった。
治療関連毒性
有害事象（ＡＥ）を報告しかつＣＴＣＡＥ（第３版）に従いグレード付けをした。ＨＳＣＴとＧＶＨＤに一般に関連するＡＥに対する、ＡＥとＡｐｏＣｅｌｌとの関係を臨床プロトコルガイダンスに従い慎重に割り付けた。ＧＶＨＤ重症度を臨床的に判定したが、罹患臓器の生検を可能な限り実施することが強く推奨された。
また、全コホートにおいて、ＡｐｏＣｅｌｌ製品をａｌｌｏＢＭＴの２４〜３０時間前に注入するというタイミングにより、幹細胞注入前のこの２４〜３０時間の期間にさらに安全性評価を行うことができた。
レジメン関連ではない毒性及び無再発の死亡率（ＮＲＭ）
移植に関連した罹患率及び死亡率には、重篤なＡＥ（ＳＡＥ）報告並びに生着不全、静脈閉塞疾患（ＶＯＤ）、敗血症又は細菌感染症、非感染性肺炎、出血、難治性ＧＶＨＤ、及び多臓器不全の記録を含めた。非致死的な毒性には、グレードＩＶのＡＬＴ、ＡＳＴ、又はビリルビン高値、グレードＩＩＩの血清クレアチニン、可逆性ＶＯＤ、出血性膀胱炎、心膜液貯留、又は硬膜下血腫のあらゆるＳＡＥ又は記録が含まれる。
ＧＶＨＤの診断及び治療
トーマスＥＤ（Thomas ED）らの文献（Thomas ED et al. NEJM 1979）の１００日試験に従い、急性ＧＶＨＤのグレード付けをした。１００日〜１８０日の慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＨＶＤ）のグレード付けをフィリポビッチＡＨ（Filipovich AH）らの文献（Biol Blood Marrow Transplant 2005）の記載に従い行った。慢性ＧＶＨＤは大きく分けて、（１）急性ＧＶＨＤの特徴を有していない古典的慢性ＧＶＨＤ、及び（２）慢性及び急性ＧＶＨＤ双方の特徴が混在する重複症候群が含まれる。慢性ＧＶＨＤの組織学的又は臨床徴候又は症状が見られない場合、移植後の経過期間を問わず、皮膚、消化管、又は肝臓の特徴的な異常が持続性、再発、又は新規発症であれば急性ＧＶＨＤとして分類しなければならない。
生着及びドナーキメラ状態
好中球生着は、異なる測定日の絶対好中球数が３回連続して（ＡＮＣ）＞０．５×１０９／Ｌと定義した。第１回目の測定日を好中球生着日とした。血小板生着は、血小板数が、血小板輸血をせずに３日以上に渡る測定で３回連続して＞２０×１０９／Ｌと定義した。第１回目の測定日を血小板生着日とした。被検者は、生着日の３日前から、又は生着日後の７日間は血小板輸血を受けてはならないこととした。血小板数が１００×１０９／Ｌを超えるまでの期間も計測した。１０日目、３１日目、４５日目、６６日目、１００日目及び１８０日目にキメラ状態を評価した。一次的生着不全は、骨髄を侵す進行性悪性疾患不在下で好中球回復が見られない場合と定義した。二次的生着不全は、骨髄を侵す進行性悪性疾患の不在下でドナー生着が見られない（ドナーキメラ状態＜５％）場合と定義した。
最初の退院までの期間
最初の退院までの期間は、ＨＳＣＴ当日（０日目）から最初の退院の日までの期間とし、初期入院期間を記録した。
ＡｐｏＣｅｌｌ調製
ＡｐｏＣｅｌｌ製品には、ＨＬＡ一致の同胞ドナーからの濃縮単核球分画で作製したアポトーシス細胞が含有されている。ドナーの適格基準には以下が含まれる：成人の男性又は女性ドナーであること、１８〜６５歳であること；ＨＬＡのＡ座、Ｂ座、Ｃ座及びＤＲ座で少なくとも７／８のＨＬＡ一致のドナー及びレシピエントであること；４０ｋｇ以上あること；ＨＳＣＴへの献血に加え、ＡｐｏＣｅｌｌ作製のために造血性血液単核球を提供する意志のあること。適格となったドナーはおよそ１９日目に診療施設に再来院し、白血球除去法（コーブスペクトラ（Cobe Spectra）（登録商標）、ガンブロＢＣＴ社（Gambro BCT）製、アメリカ合衆国コロラド州レイクウッド）を用いて現地のＳＯＰに従い末梢血単核球採取を受けた。白血球除去の約２．５時間の間、血液７Ｌの処理を行い、細胞を室温にて輸送パックに採取した。ドナーからの濃縮単核球分画の推定収量は推定容量１００〜１４０ｍｌ中１．０×１０１０細胞であった。白血球除去で得られた採取細胞中の単核球分画平均パーセンテージは８８±８％（６５〜９６％の範囲）であった。細胞収量はドナーの変動性に応じ異なった。ＨＬＡ一致ドナーから採取した濃縮単核球分画は、細胞の凍結と融解、及びそれに続くメチルプレドニゾロンとのインキュベーションを含む複数工程による早期アポトーシス誘導のため、順次各工程に供された。ＡｐｏＣｅｌｌ最終懸濁液は、早期アポトーシス細胞を少なくとも４０％含有していた。注入用細胞懸濁液を現行の医薬品等の製造品質管理基準（サイクリックＧＭＰ）のもと調製した。注入は、ＨＳＣＴの２４〜３０時間前及び調製完了から８時間以内に実施した。細胞は、投与時まで２〜８℃にて保存した。
血漿バイオマーカー
スクリーニング時及び試験のための受診日の−１日目（ＡｐｏＣｅｌｌ注入前日）、０日目（ＨＳＣＴ前日）及び３日目、１０日目、１７日目、３１日目、４５日目、６６日目及び１００日目に血漿及び血清試料を採取した。最適な回復を保証するため、血漿及び血清試料を採取後２〜４時間以内に分取し、サイトカイン濃度測定時まで−８０℃で保存した。サイトカインは、ＴＮＦＲ１、ＩＬ−２Ｒａ、ＨＧＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−６及びＩＬ−１βを測定し（ＩＬ−７の測定には高感度キットを使用）、いずれもＲ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）（アメリカ合衆国ミネソタ州）より入手した。ＩＬ−７及びＩＬ−１５をスクリーニング時から試験３１目の受診時まで試験し、それ以外のサイトカインは、特に明記しない限り、試験のための１００日目受診時まで試験した。ＥＬＩＳＡを２連で実施した。プレートをインフィニットＦ５０吸光プレートリーダー（テカン社（Techan）製、オーストリア）を用いマゼラン（Magellan）ソフトウェアにより分析した。結果は濃度レベル中央値として表している。
統計的分析
記述統計を使用し、転帰測定値及びベースライン特性についてまとめた。本分析では、利用可能な全データは、欠損データに外挿せずに示した。被検者は、中止又は試験完了又は死亡までの利用可能なデータで寄与した。平均値、中央値、標準偏差（ＳＤ）、最小値及び最高値を含む記述統計を使用し連続変数を要約した。二値変数は計数及びパーセンテージとして表した。スチューデントｔ検定を使用し、死亡率とＧＶＨＤ発生率を既存対照及びこれまでの報告と比較した。ＡｐｏＣｅｌｌ注入を受けた全被検者を安全性分析に含めた。力価評価解析にはスチューデントｔ検定（両側検定タイプ１）を使用した。
既存対照
既存対照患者を、ハダサー大学病院（Hadassah University Hospital）の骨髄移植・がん免疫療法センター（Bone Marrow Transplantation & Cancer Immunotherapy Center）のコンピュータに登録されている患者から選択し、その際、一致する同胞ドナーからの同種幹細胞移植を受けていること、及び年齢、性別、疾患、疾患ステータス及び前処置レジメンが現在の試験対象患者と同様であること、という規則に従った。分析前に患者の電子ファイルのデータを確認した。対照群は、２５人（男性１８人、女性７人）の患者からなり、年齢の中央値は２６歳（９〜６３歳の範囲）であった。患者は全員、１９８２年から２００９年までに、ＢＭＴのためにハダサー病院に紹介されていた。患者選択の際の前提条件であったように、本試験では、すべての患者が完全に一致するＨＬＡクラスＩ及びＩＩの家族からの移植を受けた（同胞２４人、父親１人）。
患者２１人の生着データがわかった。１人の患者（５％）に晩期拒絶反応が発生した。好中球生着は、全ての患者（２１人中の２１人）において、中央値１４日（９〜２２日の範囲）で達成された。血小板生着は、評価可能な患者１８人中の１６人において、中央値１２．５日（９〜３２日）で達成された。
対照患者２５人中の１８人（７２％）は、初期移植入院を終え退院した。入院期間中央値は、４０．５日であった（２７〜７９日の範囲）。
ＧＶＨＤ：対照患者２５人中の１５人（６０％）は、時間中央値２６日で急性のＧＶＨＤのグレードＩ〜ＩＶを発症した。グレードＩＩ〜ＩＶの急性ＧＶＨＤの発生率は５０％（患者２４人中の１２人）、ＩＩＩ〜ＩＶの急性ＧＶＨＤの発生率は２０％（２５人中の５人）であった。
移植関連死亡率（ＴＲＭ）：最初の１００日間に患者２５人中の７人（２８％）が移植関連合併症のため死亡した。１００〜２００日目の期間の生存患者に移植合併症による死亡例はなかったため、ＴＲＭは２００日目で２８％を維持した。死亡原因は、患者３人が感染、１人がＧＶＨＤ、１人がＧＩ出血、１人が拒絶反応、１人が心拍停止であった。
移植関連毒性（ＴＲＴ）：クレアチニン−利用可能な腎機能データのある１８人中の４人の患者（２２％）は２００日目までのクレアチニン＞１．５×正常値上限と定義される腎不全であった。そのうち２人の腎不全は重度であり介入を必要とした。ビリルビン−利用可能なビリルビン値データのある患者１８人中の７人（３９％）が２００日目までのビリルビン＞２×正常値上限と定義される有意な肝毒性を示していた。
本明細書に開示する実施例５〜１０では以下の方法を用いた。
細胞培養及び試薬
細胞を、高グルコース添加（インビトロジェンギブコ（Invitrogen-Gibco）、カリフォルニア州カールスバッド）Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に、１％Ｌ−グルタミン（バイオロジカルインダストリーズ社（Biological Industries）製、イスラエル）、１０％ウシ胎児血清（バイオロジカルインダストリーズ社製）、及び１０μｇ／ｍｌシプロフロキサシン（シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich）製、イスラエル）を添加して培養した。カスパーゼ１阻害薬ｚ−ＹＶＡＤ−ｆｍｋ、ニゲリシン、及びバフィロマイシンＡ１をカルビオケム社（Calbiochem）（ドイツ、ダルムシュタット）から購入した。Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）及びリポ多糖（ＬＰＳ）は、シグマアルドリッチ社製であった。ＤＳＳ試薬は、ＭＰバイオメディカルズ社（MP Biomedicals）製（フランス、イルキルシュ）であった。免疫染色には、以下の抗体を用いた：抗ＣＯＸ２（ケイマンケミカルズ社（Cayman Chemicals）製、アメリカ合衆国ミシガン州アナーバー）、抗ミエロペルオキシダーゼ（サーモサイエンティフィック社（Thermo Scientific）製、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ウォルサム）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩκＢα及び抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＦ−κＢ ｐ６５（セルシグナリングス社（Cell Signaling）製、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ダンバース）。
アポトーシス細胞の作製
ヒトアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）含有組成物を健常なボランティアドナーの濃縮単核球分画から白血球除去法で作製した。白血球除去中、およそ３００ｍｌの自己由来血漿をドナーから採取し、その後、アポトーシス細胞の調製に使用した。血漿を輸送パックに採取し、分取して−８０℃で２時間凍結した後、−１８〜（−）２５℃で製造時まで保存した。採取した細胞は上表３にある回収細胞用の全規格を満たしていた。百分率数をＳＹＳＭＥＸ血球分析装置で実施した。細胞生存率をヨウ化プロピジウム染色によるフローサイトメトリーで測定した。採取後、細胞を２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ及び１０Ｕ／ｍｌのヘパリン含有５％ＡＣＤ−Ａ液を添加したＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄し、５〜６．５×１０７細胞／ｍｌで凍結バッグに凍結した。凍結培地の最終配合物は２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５％のＨｅｓ、並びに２０％の自己由来血漿及び１０Ｕ／ｍｌのヘパリン含有５％ＡＣＤ−Ａ液含有１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地であった。次いで、細胞を融解し、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ及び１０Ｕ／ｍｌのヘパリン含有５％ＡＣＤ−Ａ液を添加したＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄した。その後、細胞を１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ｍＭのＬ−グルタミンに加え、１０％の自己由来血漿、１０Ｕ／ｍｌのヘパリン含有５％ＡＣＤ−Ａ液及び５０μｇ／ｍｌのメチルプレドニゾロンを添加したＲＰＭＩ １６４０培地に最終濃度５×１０６／ｍｌで再懸濁し、ライフセル社（LifeCell）製フラスコ内で３７℃で６時間、５％ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄した後、所望の濃度でＰＢＳに再懸濁した。
アポトーシス細胞測定
アポトーシスをアネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）アポトーシス検出キット（ＭＢＬインターナショナル社（MBL International）製、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ウーバン）を用いて評価した。細胞をＦＡＣＳキャリバーフローサイトメーターで取得し、ＦＣＳエクスプレス（FCS Express）ソフトウェア（デノボ社（De Novo）製、アメリカ合衆国カリフォルニア州ロサンゼルス）を用いて分析した。アポトーシス細胞は一定して少なくとも４０％アネキシンＶを含有し、＜５％ＰＩ陽性細胞をすべての実験で用いた。
腹腔内マクロファージの単離
ＷＴ又はＮｌｒｐ３−／−マウスの常駐する腹腔内マクロファージ（ｐＭΦ）をほかの記載にある通り（Bauer et al.2010）作製した。簡単に言うと,マウスをイソフルラン麻酔下で頚椎脱臼に供した。次いで、壁側腹膜を暴露させ腹腔内に１０ｍｌのトランスピペット２％ＦＢＳ入ＰＢＳで腹腔洗浄を行った。腹腔洗浄液を遠心分離し所望濃度で再懸濁した。接着したｐＭΦ（Ｆ４／８０陽性細胞）サブセットはフローサイトメーター分析で観察したところ約２０％の腹腔洗浄からなっていた。細胞をその後培養皿にとり一晩置いた。細胞を洗浄し、接着細胞をサイトカインアッセイに使用した。指示がある場合は、細菌叢作用を中和するため、ＷＴとＮＬＲＰ３欠損マウスの共飼育から４週間後に実験を実施した。
ＩＬ−１βＥＬＩＳＡ
ｐＭΦを９６ウェルプレートに密度２×１０５細胞／ウェルで播種した。１時間のＬＰＳプライミングの後、細胞を異なるアクチベーターで２４時間刺激した。細胞培養上清をＥＬＩＳＡ（バイオレジェンド社（Biolegend）製、アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ）に使用した。その際、製造者のプロトコルに従い実施した。
ウェスタンブロット法
処理したＩＬ−１βｐ１７サブユニット及び活性化カスパーゼ１ｐ１０サブユニット及びそれらの培養上清への放出をウェスタンブロット法で測定した。すなわち、指定アクチベーター添加から１２時間後、その上清を採取しＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液に懸濁し、８５℃まで１０分加熱した。マクロファージを溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００及びプロテアーゼ阻害薬カクテル（Roche））に溶解し−８０℃で分析時まで保存した。１×１０６マクロファージのタンパク質をウェルあたり１５％アクリルアミドゲルで負荷し、電気ブロッティングでＰＶＤＦ（ポリ（フッ化ビニリデン））膜へ移した。ウェスタンブロット法を希釈倍率１：５００の抗マウスＩＬ−１β抗体（クローンＢ１２２；バイオレジェンド社製）及び希釈倍率１：１０００の抗マウスカスパーゼ１ｐ１０抗体（サンタ・クルーズ社（Santa Cruz）製）で実施した。適切なＨＲＰ標識二次抗体（ジャクソンイムノリサーチ社（Jackson ImmunoResearch Laboratories）製、アメリカ合衆国ペンシルベニア州ウェストグローブ）を使用し、タンパク質をＥＣＬ試薬（バイオロジカルインダストリーズ社製）で検出した。抗マウスアクチンは負荷対照とした。
大腸炎の誘導
大腸炎を３％（ｗ／ｖ）ＤＳＳ溶液（ｍ．ｗ．３６，０００〜５０，０００；ＭＰバイオメディカルズ社製）の経口投与により誘導し、屠殺まで７〜９日間水を自由に摂取させた。対照群には同期間、蒸留水（０％のＤＳＳ）を与えた。アポトーシス細胞処置をした場合、マウスの尾に２５〜３０×１０６細胞／１５０μｌＰＢＳを単回注入した。対照マウスには、１５０μｌのＰＢＳを与えた。
養子Ｔ細胞導入による大腸炎の誘導
ナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴ細胞を、既述（Izcue, 2008）のように、ＦＡＣＳ分取でＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓から単離した。すなわち、ＣＤ４＋リンパ球の陰性濃縮後、単一細胞懸濁液をＡＰＣ標識抗ＣＤ４及びＦＩＴＣ−抗ＣＤ４５ＲＢで染色した（いずれもバイオレジェンド社より入手）。ナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴ細胞をＦＡＣＳ Ａｒｉａセルソーター（ＢＤバイオサイエンス社製、カリフォルニア州サンノゼ）で精製した（＞９９％）。ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ母集団も分取し、陰性対照とした。性別が一致するＲａｇ１−／−レシピエントマウスに、５×１０５ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ又はＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗＴ細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．）注入で与え、腸の炎症の発生について以下に記載のとおり監視した。アポトーシス細胞処置を受けた群に、各マウスの尾に３０×１０６ＡｐｏＣｅｌｌ／１５０μｌＰＢＳを指定日に注入した。対照群には１５０μｌのＰＢＳのみを注入した。
大腸炎の全体的評価
対照群において臨床疾患症状が明らかになった時点でマウスを調べた。通常、ＤＳＳモデルで７〜９日前後、ＴＣＴモデルで８週間である。他の文献（Hartmann, 2000）に記載されている通りに（但し変更を加えて）、体重変化、便の硬さ、及び血便を連日測定して標準的なＩＢＤ臨床スコアを用いてＩＢＤを評価した。体重減少がない場合を０、体重減少１〜５％を１、５〜１０％を２、１０〜２０％を３、及び２０％を超える場合を４ポイントとした。便の硬さについては、形の良いペレット状有形便には０ポイント、ペースト状の半有形便で肛門に付着しない場合は２ポイント、及び肛門に付着しない液体様便には４ポイントを付した。出血スコアは、便潜血が見られない場合は０ポイント、便潜血反応が陽性の場合は２ポイント、及び肉眼的出血が認められる場合は４ポイントとした。これらのスコアを加えて、０（健常）から１２（大腸炎の活動性が最大）の総臨床スコアを形成した。動物を屠殺した後、結腸を摘出して４％ホルムアルデヒド内に固定し、パラフィンに包埋してからヘマトキシリン・エオジンで染色した。標本の遠位の結腸部分で、粘膜の損傷、炎症の存在と程度、陰窩の損傷、及び体積比百分率を０から４の範囲で組織学的に定量した。標本及び治療群は、組織学的定量の前に無作為化した。
活性酸素種（ＲＯＳ）の測定
インフラマソームを誘発する薬剤ＤＳＳによるＲＯＳの産生をＲＯＳ検出キット（アメリカ合衆国ニューヨーク州ファーミングデールのエンゾライフサイエンス社（Enzo Life Sciences）製）で測定した。雌のＢ６マウスからｐＭΦを８穴チャンバースライドに密度０．１×１０６細胞／チャンバーで播種し、３７℃で一晩培養した。その後、ｐＭΦをＰＢＳで２回洗浄し、アポトーシス細胞とともに１：８の比で２時間処理した後、洗浄してＬＰＳでプライミングし、３％のＤＳＳでさらに３０分処理した。陰性対照細胞は培地のみで処理した。洗浄後、細胞を２００μｌのＤＭＥＭに懸濁し、ＲＯＳ検出試薬（１μＭ）で３０分染色した。ＤＳＳで誘導した細胞内ＲＯＳを、５２５ｎｍ蛍光フィルターに励起波長４８８ｎｍを用い蛍光顕微鏡検査で検出した（初期倍率×１００）。フローサイトメーターによる検出を使用する場合、処理後ＭΦをトリプシン−ＥＤＴＡを用いて剥離、洗浄し、ＬＳＲＩＩ分析装置（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて分析した。
リソソームの安定性評価
ＤＳＳで誘導したことによるリソソームの損傷を、他の文献（Bauer et al. 2010）に記載されているようなアクリジンオレンジ染色により評価した。簡単に言うと、腹腔マクロファージを２４ウェル培養皿に採取して一晩置き、その後、非接着細胞をＰＢＳで洗浄した。残存する接着マクロファージ細胞をアポトーシス細胞（１：８）に２時間導入した。次いで、マクロファージを洗浄し、ＬＰＳで１時間プライミング後、ＤＳＳで２４時間刺激した。続いて、細胞を洗浄し、０.２５μｇ／ｍｌアクリジンオレンジで１５分インキュベートしてリソソーム染色を行った。リソソームの損傷は、ＬＳＲＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社製）により蛍光６００〜６５０ｎｍで蛍光強度の欠損部分として測定した。
免疫組織化学
Ｂａｌｂ／ｃマウスから得たパラフィンで包埋したスライドを脱パラフィンし、３％Ｈ２Ｏ２でインキュベートした。抗原の脱マスキングは、１ｍＭのＥＤＴＡ含有１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液内でマイクロ波加熱（２０分）により実施した。スライドを、ＣＡＳ−ＢＬＯＣＫ（インビトロジェン社製）で希釈した抗ＣＯＸ２、抗ＭＰＯ、抗ｐＮＦ−κＢ、及び抗ｐＩκＢα一次抗体と共に、または対照としてＣＡＳ−ＢＬＯＣＫのみでインキュベートした。その後、適切な二次抗体（ニチレイ社製）を添加し、スライドを室温にて３０分インキュベートした。ＤＡＢ基質キット（サーモサイエンティフィック社製）を使用して呈色させ、次いで、マイヤーヘマトキシリン液（シグマアルドリッチ社製）で対比染色をした。一次抗体未添加の対照では全例において背景染色は低いか、又はまったく見られなかった。
動物及び共飼育
ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６マウスをハーラン社（Harlan Inc.）（イスラエル国エルサレム）から入手した。マウスはいずれも雌で、到着時８〜１０週齢であった。指示がある場合は、細菌叢作用を中和するため、ＷＴマウスとＮＬＲＰ３欠損マウスの共飼育が４週間経過してから実験を実施した。
統計的分析
すべてのデータは平均±標準誤差（ＳＥＭ）で表される。差異の統計的有意性は、不対ｔ検定（別段の指示がない限り、両側検定）または一元配置分散分析法及びテューキーの多重比較検定により評価した。０．０５以下のＰ値を統計的に有意であると考えた。
結果
実施例１
骨髄破壊的同種骨髄移植におけるＧＶＨＤ予防としての同種アポトーシス細胞の注入は安全である
患者、ドナー及び移植片の特徴
レシピエントに移植した総細胞数及びレシピエントに注入した総ＣＤ３４＋細胞数それぞれの中央値は１３．６×１０８／ｋｇ（範囲：９．３〜２９．５×１０８／ｋｇ）及び７．２×１０６／ｋｇ（範囲：３．７〜２２．４×１０６／ｋｇ）であった（表１）。患者、疾患、及び移植の特徴を表１にまとめている。最も診断頻度の高かったのは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ；ｎ＝７、５４％）であり、次いで急性骨髄性白血病（ＡＭＬ；ｎ＝５、３８％）高く、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ；ｎ＝１、７．７％）が１例であった。ＡＭＬ患者では、新規疾患を呈した患者が１例、及び先行する骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）からＡＭＬを発症した患者が４例であった。計５例のＡＬＬ患者が第１完全寛解（ＣＲ１）し、１例が第２完全寛解（ＣＲ２）、また１例は第２部分寛解（ＰＲ２）であった。計５例のＡＭＬ患者はＣＲ１であった。ＣＭＬ患者１名は慢性期にあり、移植前のチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）３剤に対し不応答であった。患者はすべて関連ドナー移植片を受けた。患者の年齢の中央値は３７歳であった（範囲、２０〜５９歳）。ＨＬＡ Ａ、Ｂ、Ｃ（患者１３人中の８人で評価した）及びＤＲ遺伝子座でのＨＬＡ一致に加え、ＤＱについても患者１３人中の１２人で評価した。ＨＬＡ一致データを表１に示す。
Figure 2016501526
力価アッセイ
寛容原性ＤＣは、アポトーシス細胞（Verbovetski I J Exp Med 2002）またはアポトーシス細胞製品（Krispin A Blood 2006）との相互作用で作製することができる。各ＡｐｏＣｅｌｌ調製物に対し、調製したＡｐｏＣｅｌｌの寛容原性作用を未熟樹状細胞（ｉＤＣ）とのインビトロ内相互作用を用いて個別に調べた。ｉＤＣはＨＬＡ−ＤＲ及び共刺激分子を低レベルで発現する。ＬＰＳのような成熟化刺激に暴露後、ｉＤＣは成熟しＨＬＡ−ＤＲ及び共刺激分子ＣＤ８６の発現レベルを上方制御する。
ＡｐｏＣｅｌｌ製剤１３剤の対象患者への注入で得られた力価アッセイの結果を表２にまとめている。結果は、ＡｐｏＣｅｌｌと相互作用させた後の、ＬＰＳ処理したＤＣの成熟阻害（ＤＲ及びＣＤ８６の発現阻害）の平均パーセンテージを表している。表２に示すように、有意かつ用量依存的なダウンレギュレーションが認められた。１人の患者の力価アッセイから得た代表的な結果を図１に示す。
Figure 2016501526
生着
レシピエントの好中球回復までの期間の中央値は１３日（範囲、１１〜１９）、また血小板回復までの期間の中央値は１５日（範囲、１１〜５９）であった。好中球及び血小板生着までの期間の中央値は、第１コホートでそれぞれ１３日（１３〜１４日の範囲）及び１７日（範囲１１〜５９）；第２コホートでそれぞれ１４日（範囲１１〜１７）及び１４日（範囲１１〜１８）；第３コホートでそれぞれ１４日（範囲１２〜１９）及び１５日（範囲１３〜５４）；並びに第４コホートでそれぞれ１２日（範囲１１〜１３）及び１５日（範囲１３〜１７）であった。
試験３１日目にキメラ状態について利用可能なデータのある患者１２人中の１０人（８３％）がドナー型であった。追加の患者１人は検査技術不良により３１日目のデータがなかったが、後日の受診（４５日）でドナー型であることが分かった。６６日目までに患者１００％がドナー型に変換された。一次生着不全は発生しなかった。３１日目に混合キメラ状態の患者がいなかったのは、疾患の早期再発であったことがわかった。
有害事象
ＳＡＥが１０例報告され、ＡｐｏＣｅｌｌ注入と無関連であるのが７例、ほとんど関係ないのが３例であった。記録されたＳＡＥは、敗血症性ショック２例、再発２例、出血性膀胱炎１例、アデノウイルス感染症による胃腸炎１例、嘔吐１例、及び発熱３例であった。何百ものＡＥのうち、ＡｐｏＣｅｌｌ注入関連の可能性があると報告されたのはわずか３例のみで（いずれもＡｐｏＣｅｌｌ関連が確実または可能性があると定義されたＡＥではない）；注入当日（ｄａｙ−１）の低血圧１例、注入当日（第１日）の咽喉灼熱感１例、及び試験１３１日目の再発１例であった。
再発
移植後１００日目及び１８０日目の累積再発率はそれぞれ７．７％（ｎ＝１）及び３１％（ｎ＝４）であった。再発した患者４人中の３人（７５％）はＡＬＬであった。いずれの患者もシクロスポリンを投与されていた。
生存率
４５、１００及び１８０日目の全生存率はそれぞれ１００％、９２．３％及び８４．６％であった（図２Ａ）。再発に関連しない生存率は４５日目で１００％、１００日目及び１８０日目で９２．３％であった（図２Ｂ）。移植関連死亡率（ＴＲＭ）は４５日目で０％、１００日目で７７．％及び１８０日目で７７．％であった。治療群中で死亡した患者は１人（７．７％）のみであり（図２Ｃのカラム１）、これに対し、院内記録にある対応する既存対照では７人（２８％）（図２Ｃのカラム２）、後ろ向き調査（データ図示せず）では１６％であった。
最初の退院までの期間
全１３人の患者の最初の退院までの平均時間は、３４．２日（１５〜１０３日の範囲）であった。第１コホート用量（３５×１０６／ｋｇ）で治療を受けた３人の患者の最初の退院までの平均時間は４６．３日（１５〜１０３日の範囲）であり、第２コホート用量（７０×１０６／ｋｇ）で治療を受けた４人の患者の最初の退院までの平均時間は３３．５日（２０〜８７日の範囲）であり、第３コホート用量（１４０×１０６／ｋｇ）で治療を受けた３人の患者の最初の退院までの平均時間は２４．３日（２２〜２８日の範囲）であり、最終コホート用量（２１０×１０６／ｋｇ）で治療を受けた３人の患者の最初の退院までの平均時間は１８．３日（１７〜２１日の範囲）であった（図３）。
ここに示した結果は、骨髄破壊的同種骨髄移植における移植片対宿主病の予防としてドナーの早期アポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）を単回注入することが安全であることを示唆している。ＡｐｏＣｅｌｌはＢＭＴの２４時間前に投与され、ＡｐｏＣｅｌｌ注入に特異的に関連する又は関連の可能性があるＳＡＥは報告されなかった。計１０例のＳＡＥが報告され、ＡｐｏＣｅｌｌ注入との関連性不明（７例）または関連性はほとんどない（３例）ものであった。何百ものＡＥのうち、ＡｐｏＣｅｌｌ注入関連の可能性があると報告されたのはわずか３例のみで、注入当日の低血圧、やはり注入当日の咽喉灼熱感、及び試験１３１日目の再発であった。いずれもＡｐｏＣｅｌｌ関連が確実または可能性があると定義されたＡＥの報告はなかった。さらに、既存対照及び文献（グーリーらの文献、同前論文）に記載の同様の患者と比較した場合、調査した全用量において生着までの期間の延長、入院期間、キメラ状態遅延、死亡率上昇、ＣＭＶなどの重篤な感染症、及び再発は観察されなかった。
実施例２
同種アポトーシス細胞の注入は、骨髄破壊的同種骨髄移植を受ける患者における高グレードのＧＶＨＤを低減する
急性ＧＶＨＤを、１３例中の１２例の患者に１００日間、また第２治療群の患者１例に８７日間の試験を通して評価した。全例を第１００日目の累積発生率に含めた。全患者における、グレードＩＩ〜ＩＶ及びＩＩＩ〜ＩＶの急性ＧＶＨＤ（ａＧＶＨＤ）の第１００日累積発生率は、それぞれ２３．１％及び１５．４％であった（図４）。１１人中の１０人の患者において１８０日間試験の急性ＧＶＨＤを評価した。グレードＩＩ〜ＩＶ及びＩＩＩ〜ＩＶの急性ＧＶＨＤ発症までの期間の中央値はそれぞれ３１日（範囲、３１〜４４日）及び４７日（範囲、３１〜６２日）であった。移植後１００日目以降に急性ＧＶＨＤを発症した患者はいなかった。１１人中の１０人の患者を第１８０日のａＧＶＨＤについて評価した。１０人中の１人の患者（１０％）はグレードＩの持続型ａＧＶＨＤの皮膚を呈しており、試験１８０日目の全体的重症度はグレードＩであった。注目されるのは、ＡｐｏＣｅｌｌの最高用量で治療を受けた２コホートにおいて高グレードのＧＶＨＤ（グレードＩＩ〜ＩＶ）が記録されなかったことである（図４Ａ）。アポトーシス細胞調製剤の単回注入を投与された移植患者のグレードＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤの発生率は、院内記録の既存対照（被検者２５人のうちの５０％、図４Ｂのカラム２）及び文献報告（７１％、データ図示せず；グーリーらの文献、同前論文）の場合と比較して有意に低かった（被検者１３人中の７．７％、図４Ｂのカラム１）。
高グレードのａＧＶＨＤを回避し成功の可能性が高い治療の場合、ＧＶＨＤの重症度と相関することが見出されている（Horowitz MM Blood 1990）、移植片対白血病（ＧＶＬ）作用が失われる可能性があるという問題が浮上する。本試験では、再発率は１００日目で７．７％、及び１８０日目で３０．８％であった。１００日目の再発率は、ａｌｌｏＢＭＴを受けた同様の患者で報告されている再発率と異なるものではない。１８０日目までの再発率３０％は、境界線として高いと考えられるかもしれないが、再発の７５％はＡＬＬ患者であった（同様の年齢群で４人中の３人が７０％という高い率で再発する傾向がある）。さらに、２つの高用量においてグレードＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤは０まで低減したが、同じコホート内でグレードＩのａＧＶＨＤは５０％まで上昇し、このことは、生理学的方法としてＡｐｏＣｅｌｌ治療は高グレードのＧＶＨＤを消失させるというよりはむしろ低減することを示している。
慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）を試験の１００日目から１８０日目まで評価した。患者１１人中の１０人を１８０日目のｃＧＶＨＤについて評価した。患者１０人中の５人（５０％）は皮膚（４人の患者）及び結膜（１人の患者）に異常のある軽度のｃＧＶＨＤであった。
過去１０年間の既存対照及び文献報告（グーリーらの文献、同前論文）にあるグレードＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤの発生率が７１％、グレードＩＩＩ〜ＩＶが１４％と比較すると、実施例２は、急性のグレードＩＩ〜ＩＶ及びグレードＩＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤの発生率が非常に低い（それぞれ２３％及び１５％）ことを示す。注目すべきは、２つの高用量群において、グレードＩＩ〜ＩＶのａＧＶＨＤは０％であり、このことは、非常に有効な予防的治療であることを示唆している。
実施例３
アポトーシス細胞の単回投与を受けた移植患者における肝毒性発生率の低減
アポトーシス細胞３５〜２１０×１０６の投与を受けた、全４コホートＩ〜ＩＶ（ｎ＝１３；カラム２）における肝毒性を発症した移植患者数を、院内記録（ｎ＝１８）の整合対照群、及び長期記録された移植患者（ｎ＝１１４８；グーリーらの文献、同前論文）双方と比較した。
治療群では肝毒性のあった患者は１例のみであったのに対し（７.７％；図５Ａのカラム２）、対応する既存対照では３９％（図５Ａのカラム１）及び長期記録された移植患者では２０％（図５Ａのカラム３）であった。注目されるのは、ＧＶＨＤの肝毒性が、対応する既存対照で観察された３９％と比較すると、発明のアポトーシス細胞調製物で治療を受けた高用量治療３群（コホートＩＩ〜ＩＶ）ではまったく認められなかったことである（図５Ｂ）。
実施例４
急性ＧＶＨＤ（ａＧＶＨＤ）血漿バイオマーカーを用いた臨床試験バリデーション
臨床結果のさらなるバリデーションを行うために、ａＧＶＨＤ識別因子またはａＧＶＨＤ予測因子として報告されている血漿バイオマーカーを調べた。ＩＬ−２Ｒａ、ＴＮＦＲ１、ＩＬ−８及びＨＧＦの４種の血漿バイオマーカーのパネルを、ａＧＶＨＤ患者とそうでない患者を最適に識別する一助となり得、またＧＶＨＤの臨床症状を発症している患者でＧＶＨＤ診断を確定でき、さらにはＧＶＨＤの重症度に関係なく生存率についての予後情報を提供できるマーカーとして提案した。
第一に、ＴＮＦＲ１、ＩＬ−２Ｒａ、ＩＬ−８の血漿中濃度及びＨＧＦの血清中濃度を評価した。図６Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦに示すように、ａＧＶＨＤグレード０〜Ｉ群と比較して、ａＧＶＨＤグレードＩＩ〜ＩＶ群において明らかに高濃度が認められた。ａＧＶＨＤグレード０〜Ｉ群におけるＤａｙ＋１０、＋１７、及び＋３１のＴＮＦＲＩ濃度の中央値は、それぞれ２１７２ｐｇ／ｍｌ、２５３０ｐｇ／ｍｌ、及び２６９８ｐｇ／ｍｌであった。しかしながら、ａＧＶＨＤグレードＩＩ〜ＩＶ群では、ＴＮＦＲＩ濃度の中央値はそれぞれ３１７１ｐｇ／ｍｌ、３３０１ｐｇ／ｍｌ及び４３４２ｐｇ／ｍｌであった。同様に、ａＧＶＨＤグレード０〜Ｉ群におけるＩＬ−２Ｒａ濃度の中央値はそれぞれ３６５０ｐｇ／ｍｌ、２９１６ｐｇ／ｍｌ、及び２４５５ｐｇ／ｍｌであり、対するａＧＶＨＤグレードＩＩ〜ＩＶ群ではそれぞれ４６０１ｐｇ／ｍｌ、８１０２ｐｇ／ｍｌ及び３６２４ｐｇ／ｍｌであった。ここでも、ａＧＶＨＤ０〜Ｉ群におけるＤａｙ＋１７、＋３１、及び＋４５のＨＧＦ濃度の中央値はそれぞれ１５１７ｐｇ／ｍｌ、１４６４ｐｇ／ｍｌ、及び１８７３ｐｇ／ｍｌであり、これに対しａＧＶＨＤグレードＩＩ〜ＩＶ群ではそれぞれ２４１８ｐｇ／ｍｌ、３２６４ｐｇ／ｍｌ及び２３２６ｐｇ／ｍｌであった。最後に、ａＧＶＨＤグレード０〜Ｉ群におけるＤａｙ＋１０、１７及び＋３１のＩＬ−８の濃度の中央値はそれぞれ４８．３ｐｇ／ｍｌ、２２．３ｐｇ／ｍｌ及び３７．１ｐｇ／ｍｌであり、これに対するａＧＶＨＤグレードＩＩ〜ＩＶ群ではそれぞれ９０．８ｐｇ／ｍｌ、４１．９ｐｇ／ｍｌ及び６１．８ｐｇ／ｍｌであった（図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｅ及び図６Ｆ）。
いくつかの刊行物では、特にＴＮＦＲＩ濃度に関して、サイトカイン濃度よりも濃度比中央値の使用が好まれている（Ferrara JL Best practice & research clinical haematology 2007, Choi SW et al Transplantation 2012）。しかし、本発明の発明者らがＴＮＦＲＩ比またはほかのサイトカイン比を使用したときでも結果に変わりはなかった（データ図示せず）。
さらに２つのサイトカインＩＬ−１５及びＩＬ−７をａＧＶＨＤとの相関関係のために報告した。図６Ｃに示すように、本試験でのａＧＶＨＤグレードＩＩ〜ＩＶ群におけるＤａｙ０、＋３、＋１０、＋１７それぞれのＩＬ−１５の血漿中濃度の中央値は３３.５ｐｇ／ｍｌ、３０ｐｇ／ｍｌ、ａ４２ｐｇ／ｍｌ及び１２ｐｇ／ｍｌであり、ａＧＶＨＤグレード０〜Ｉ群におけるそれぞれの値１８.６ｐｇ／ｍｌ、１５.７ｐｇ／ｍｌ、１５.５ｐｇ／ｍｌ及び７.０ｐｇ／ｍｌに比して有意に高かった。
ＩＬ−７も高グレードのＧＶＨＤにおいて高かったが（図６Ｇ）、主な上昇が認められたのはグレードＩＩＩ〜ＩＶにおけるＤａｙ＋１０、＋１７及び＋３１で、それぞれ８．９ｐｇ／ｍｌ、３２．６ｐｇ／ｍｌ及び２３．０ｐｇ／ｍｌであり、対するａＧＶＨＤ０〜Ｉ群ではそれぞれ４．５／ｍｌ、１０．５ｐｇ／ｍｌ及び９．０ｐｇ／ｍｌであった。
サイトカインの対照として、ＩＬ−６及びＩＬ−１ｂを測定した。期待されたとおり、ほかのサイトカインはＧＶＨＤのグレード間の区別なく上昇を示した。
実施例４は、本明細書に提示の臨床データを支持する血漿バイオマーカーを示す。公表されているデータには何が最良のバイオマーカーであるかは記載されていないが、異なる６種のバイオマーカーであるＴＮＦＲＩ、ＩＬ−２Ｒａ、ＨＧＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−１５及びＩＬ−７の血漿中濃度は、高〜低グレードかＧＶＨＤなしかで明確に識別された。さらなる２つの対照サイトカイン（ＩＬ−１ｂ及びＩＬ−６）により知見の特異度がいっそう強調された。
実施例５
炎症性大腸炎でのアポトーシス細胞組成物の改善効果
大腸炎寛解におけるアポトーシス細胞の単一注入の治療効果が、２つのＩＢＤモデル、すなわちナイーブＣＤ４細胞の養子Ｔ細胞移入（ＴＣＴ）及びデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）に誘導された大腸炎において試験された。
まず、ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈのナイーブＴ細胞が、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスから収集されかつ分類され、ＲＡＧ酵素を欠く免疫欠損マウスへと養子移入された。移入された細胞の対照として、非ナイーブ（ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ）Ｔ細胞が使用された。１５０μｌのＰＢＳ中に早期アポトーシス細胞を含む組成物がＴ細胞移入の日にマウスに投与され、対照として１５０μｌのＰＢＳが使用された。
４週間後、ＰＢＳ治療群のマウスは、ＩＢＤの臨床徴候、つまり、体重の減少及び粥状便排出を現し始めた。しかしながら、アポトーシス細胞組成物で治療された群は、臨床兆候がみられなかった。アポトーシス細胞治療群は体重が増加したのに対し、ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈマウス群がそれらの初期体重の１７％を失った（図７Ａ、ｐ＜０．０３）。同様に全体の臨床スコアは、非治療群と比較して、アポトーシス細胞により治療された群において有意に低減された（図７Ｂ、ｐ＜０．０２）。治療群における腸間膜Ｔ調節性細胞の上昇は、腸間膜リンパ節でも示された（図７Ｃ）。
実施例６
ＤＳＳは、ＮＬＲＰ３インフラマソームを介してカスパーゼ−１−依存性プロ−ＩＬ−１βプロセシングを誘導する
ＩＬ−１βの増強生産は、ＤＳＳに対するマウスのマクロファージの露出の際に検出されることがこれまで示されており、より最近では、ＮＬＲＰ３インフラマソーム依存性であることがインビトロ及びインビボで示された。
インフラマソームの負の調節におけるアポトーシス細胞の可能性のある役割を研究するために、マウスのマクロファージが生成され、ＤＳＳに対して露出された。これまでの観察との一致において、図８にみられ得るように、ＤＳＳは、マウスのマクロファージからＩＬ−１β放出を誘導することがみられた。ＬＰＳでトリガーするトール様レセプター（ＴＬＲ）とＤＳＳでトリガーするインフラマソームの組合せは、著しいＩＬ−１β分泌へと導いた。図８にみられるように、特異的インヒビターｚ−ＹＶＡＤ−ｆｍｋペプチドによるカスパーゼ−１の阻害は、ＩＬ−１β放出のほとんど完全な阻害を導き（ｐ＜０．０５、独立ｔ検定）、ＤＳＳ−媒介のＩＬ−１β放出におけるカスパーゼ−１の役割を示した。ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化は、Ｋ＋流出依存性、リソソーム依存性、及びＲＯＳ依存性である。実際に、高濃度のＫＣｌによるＫ＋流出のブロッキングは、ＤＳＳ媒介のＩＬ−１β放出を阻害した（図９Ａ、ｐ＜０．０５、独立ｔ検定）。同様に、バフィロマイシン、空胞のＨ＋ＡＴＰａｓｅのインヒビターによるリソソーム酸性化のブロッキングは、ＩＬ−１β分泌を阻害した（図９Ｂ、ｐ＝０．０５、独立ｔ検定）。最後に、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）によるＲＯＳ生成の阻害は、ＩＬ−１β分泌を有意に阻害した（図９Ｃ、ｐ＜０．０５、独立ｔ検定）。
ＤＳＳ媒介のＩＬ−１β分泌がカスパーゼ−１及びＮＬＲＰ３活性化依存性であることの発見をさらにサポートするために、野生型及びＮＬＲＰ３−欠損マウスがともに収容され、マクロファージがマウスから抽出され、ＤＳＳにさらされた。図９Ｄにみられ得るように、ＤＳＳ−誘導Ｌ−１β分泌は、ＮＬＲＰ３−欠損マウスから抽出されたマクロファージにおいて有意に低減された（ｐ＜０．０２、ｔ検定）。
実施例７
アポトーシス細胞組成物による治療は、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）モデルにおいて抗炎症効果を示す
Ｂａｌｂ／ｃマウスに３％のＤＳＳを飲料水に８〜９日間投与することにより、ＤＳＳ媒介腸炎症モデルにおいてインビボで、アポトーシス細胞組成物を用いる治療の効果がさらに試験された。体重、直腸あたりの潜伏性のまたは全体の血液の存在、糞便の一貫性を含む、炎症性大腸疾患（ＩＢＤ）スコアパラメータが毎日測定された。
ＤＳＳに加えてアポトーシス細胞で治療されたマウスは、ＤＳＳのみにより治療されたマウスと比較して、６日目から開始する体重減少が有意に少なくなることを示した（図１０Ａ、ｐ＜０．０５及び０．００１、ｔ検定）。臨床スコア分析は、評価された全てのパラメータにおいて、アポトーシス細胞により治療されたマウスにおいて重度の大腸炎が有意に少なくなることを明らかにした（図１０Ｂ、ｐ＜０．０１、ｔ検定）。マクロ的試験では、ＤＳＳで治療された結腸は、深刻に炎症性かつ充血性であり、大量の下痢による糞便の減少を含んだ。アポトーシス細胞により治療した場合には、結腸は、発症が低減され、ＤＳＳのみにより治療されたマウスの結腸よりもより長かった（９．４±０．１４ｃｍ対８．９±０．２、ｐ＜０．０５）（図１０Ｃ）。
次に、ＩＬ−１βレベルが、アポトーシス細胞組成物による治療を含みまたは含まずに、ＤＳＳにより治療されたマウスの結腸ホモジネートで測定された。ＤＳＳ摂取７日後に、ＩＬ−１βレベルが、アポトーシス細胞組成物により治療されないマウスの結腸で、有意に上昇した（図１０Ｄ、ｐ＜０．０２、ｔ検定）。しかしながら、ＤＳＳ摂取前に、単一のアポトーシス細胞注入により治療されたマウスにおいて、同様の上昇は観察されなかった。
示された観察をさらに確立するために、結腸組織の組織学的及び免疫組織化学的分析が、ＤＳＳ摂取後の９日目に得られた。バイオプシーは、アポトーシス細胞により治療されたマウスにおける、炎症性細胞によるより少ない重度の粘膜浸入及び低減された組織損傷を有意に示し、有意に改善された組織学的大腸炎の重症度のスコアへと変換した（図１１Ａ、Ｉ〜ＩＩＩ、ｐ＜０．０５、ｔ検定）。本分析は、異なる群に対して盲検の病理医により行われた。ＩＬ−１βは、炎症部位で好中球の蓄積を誘導することが知られているので、結腸炎症における好中球の範囲が評価された。好中球浸入は、アポトーシス細胞治療を受けなかったマウスの結腸組織においてより著しく高かった。アポトーシス細胞治療による好中球浸入における飛躍的な軽減をさらに示すために、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）染色が、ヘマトキシリン染色（図１１Ｂ）と組み合わされた。実際に、ＤＳＳ治療マウスは、結腸におけるＭＰＯ染色好中球の飛躍的な増加を示したが、アポトーシス細胞による単一の治療は、ＭＰＯ染色好中球蓄積を著しく低減した。
シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）は、炎症促進性プロスタグランジンの形成における重要なステップを触媒し、ＩＬ−１βにより誘導されることを示した。Ｃｏｘ２カスケードの主要な産物はＰＧＥ２であり、これは、急性の炎症正反応における重要な媒介物である。実際に、Ｃｏｘ２免疫染色は、非治療結腸と比較してＤＳＳ治療結腸における正細胞の数の劇的な上昇を示した（図１２）。アポトーシス細胞治療が適用された場合、著しい低減が観察された。
実施例８
ＤＳＳ誘導大腸炎におけるアポトーシス細胞によるインビボＮＦ−κＢ阻害
ＮＦ−κＢは、通常、抑制タンパク質であるＩκＢαとの会合により、細胞質に隔離される。ＮＦ−κＢの活性化は、ＩκＢαをリン酸化するＩＫＫ複合体の刺激を伴い、その分解及び活性化ＮＦ−κＢの核転送をトリガーする。ＮＦ−κＢシグナリングを試験するために、ＤＳＳ誘導大腸炎を有するマウス由来の結腸組織におけるＩκＢαのリン酸化が試験され、アポトーシス細胞による治療後のＤＳＳにさらされたマウスと比較された。かなり高い数のｐＩκＢα−正細胞が、アポトーシス細胞によっても治療された結腸と比較して、ＤＳＳのみにより治療された結腸において観察された（図１３）。ＮＦ−κＢシグナリングの阻害が、免疫染色により検出される核のリン酸−ｐ６５ＮＦ−κＢについて陽性であった細胞数の低減によりさらに確認された（図１４）。
実施例９
アポトーシス細胞は、マクロファージ由来のインフラマソーム誘導ＩＬ−１β放出を阻害する
ＴＬＲアゴニストにさらされたマクロファージによるＩＬ−１β放出の阻害が示されるが、ＮＬＲＰ３特異的活性化の際にそれらが分泌を阻害し得るかどうかは知られていない。インフラマソーム−誘導ＩＬ−１β放出の際のアポトーシス細胞組成物の影響を試験するために、単離されたマクロファージは、アポトーシス細胞とのより早期の相互作用の有無にかかわらず、リポ多糖（ＬＰＳ）及びＤＳＳに２時間さらされた。
マクロファージ及びアポトーシス細胞をインキュベートすることは、ＴＬＲ及びインフラマソームのトリガーの不存在下におけるＩＬ−１β分泌に影響を与えなかった。しかしながら、ＬＰＳ及びＤＳＳの存在下でのアポトーシス細胞治療前に、ｚ−ＹＶＡＤ、ＫＣｌ、バフィロマイシン及びＮＡＣと同様の阻害率で、マクロファージからのＩＬ−１β分泌を有意に阻害し、アポトーシス細胞がインフラマソーム経路を負にシグナルすることを示唆した（図１５Ａ、ｐ＜０．０１、独立ｔ検定）。アポトーシス細胞の負のシグナリングサイトカラシンＤのレベルをさらに示すために、アクチン重合を阻害する薬物が、貪食を防止して排除するために使用された。このアプローチを用いて、貪食のないマクロファージに対するアポトーシス細胞の結合は、ＩＬ−１β分泌の阻害のために完全に十分であることが示された（図１５Ｂ、＊ｐ＜０．０１、一元配置分散分析法）。
ＮＦ−κシグナリングによりトリガーするＴＬＲについての必要性と、アポトーシス細胞がＮＦ−κＢを阻害し、よって、インフラマソーム阻害の不存在下でＩＬ−１β分泌を阻害することができるという事実とを前提としてし、ＩＬ−１β分泌がアポトーシス細胞によりＮＦ−κＢ及びＮＬＲＰ３レベルの両方で阻害されるかどうかを解明するために一連の実験が開始された。レジデントな腹膜のマクロファージ（ｐＭΦ）が、アポトーシス細胞とともにインキュベートされ、洗浄され、及び種々のインフラマソーム誘導因子による刺激後に、ＬＰＳにより薬物刺激され、またはＬＰＳにより最初に薬物刺激され、新規のプロＩＬ−１β転写の蓄積を可能にし、その後、アポトーシス細胞及び誘導因子により処理された。
アポトーシス細胞治療の前に、転写前レベルで活性化されたＩＬ−１βの分泌が阻害されるが、それはＮＦ−κＢ経路の阻害に起因すると考えられる。しかし、より重要なことに、阻害効果、例えば、ＩＬ−１β分泌は、新規なＩＬ−１βの蓄積後、つまり、ＬＰＳプライミング後にも観察された。この阻害は、ナイジェリシン、ピロリン酸カルシウム（ＣＰＰＤ）、及び尿酸一ナトリウム（ＭＳＵ）を含む、ＮＬＲＰ３インフラマソームトリガーメカニズムの３つの異なる活性化物質を用いて得られ、ＮＬＲＰ３インフラマソームでのより強いインヒビターの影響を示唆した（図１５ＣからＥ、ｐ＜０．００１、一元配置分散分析法）。転写後レベルの分泌の阻害は、サイトカラシンＤを用いても取得され得、それは、貪食のないアポトーシス細胞の認識の際にインフラマソームの負のシグナリングをさらに支持する（データ図示せず）。
結果は、プロＩＬ−１β（ｐ３５）及び切断されて分泌されたＩＬ−１β（ｐ１７）に対するウェスタンブロット分析によりさらに検証された。マクロファージ（ｐＭΦ）は、１時間のＬＰＳプライミングへと続く２時間のアポトーシス細胞の存在下で（転写前に送達されたＡｐｏＣｅｌｌ）インキュベートされ、または１時間のＬＰＳ（ＮＦ−κＢシグナリングを促進するための）によりまずプライムされ、その後、２時間アポトーシス細胞によりインキュベートされた（転写後に送達されたＡｐｏＣｅｌｌ）。マクロファージは、その後、任意に、インフラマソーム誘導因子である、ナイジェリシン（２．５μＭ）または二水和ピロリン酸カルシウム２００μｇ／ｍＬ（ＣＰＰＤ）とともにインキュベートされた。
ＥＬＩＳＡ結果と同様に、アポトーシス細胞処理前のＬＰＳまたはＬＰＳ前のアポトーシス細胞により処理された上清のマクロファージにおける減少した切断ＩＬ−１βサブユニットが観察された（図１６Ａ〜図１６Ｂ、ＩＬ−１β、上側のパネル）。それ自身によりプライミングするＬＰＳは、上清にはないが、細胞溶解分画にみられ得るマクロファージにおける新規なプロＩＬ−１βの蓄積へと導くのは、注目すべきである（図１６ＡからＢにおける左側から３つ目のレーン、ＩＬ−１β、下側のパネル）。ＩＬ−１βレベルの減少は、ＬＰＳによりトリガーするＮＦ−κＢがアポトーシス細胞に対する露出前も可能である場合であってもみられた。比較可能な結果は、カスパーゼ−１のより少ない活性化が、異なる誘導物質の存在下で、アポトーシス細胞処理後の転写前及び転写後のレベルで測定された、カスパーゼ−１により示される。
ウェスタンブロット分析は、アポトーシス細胞及びＬＰＳがそれ自身により、インフラマソームトリガーの不存在下での成熟したＩＬ−１βの分泌またはカスパーゼ−１活性化に影響を及ぼさないことを確認するためにも使用された。実際に、成熟したＩＬ−１βの分泌またはカスパーゼ−１の活性化が、転写前及び転写後の両レベルで観察され、ＮＬＲＰ３−インフラマソームの関与を示した（図１７Ａ〜図１７Ｂ）。まとめると、アポトーシス細胞は、ＮＦ−κＢ及びＮＬＲＰ３に明確な阻害効果を有するようである。
実施例１０
アポトーシス細胞抗インフラマソーム効果は、ＲＯＳ、リソソーム安定化、及びＫ＋流出を介して媒介される
ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化は、ＲＯＳ−依存性であることが示唆され、実際に多くのＮＬＲＰ３刺激物質は、ＲＯＳ生成も誘導する。ＤＳＳは、ＩＬ−１βの蓄積及びＮＬＲＰ３活性化中にＲＯＳを生成することも発見された。
ＲＯＳ生成の際のアポトーシス細胞治療の効果は、蛍光顕微鏡検査法及びリアルタイムフローサイトメトリーの両方により試験された。これまでの観察による一致では、ＤＳＳとインキュベートされた腹膜マクロファージは、ＲＯＳの別の誘導因子、ピオシアニンと同様に、ＲＯＳを誘導することがみられた（図１８）。マクロファージがアポトーシス細胞とともに前処理された場合、その後ＤＳＳで処理され、著しく有意なＲＯＳ生成の低減がみられた（図１８及び図１９、ｐ＜０．０５、一元配置分散分析法）。低減は、ＲＯＳインヒビターであるＮ−アセチル−システイン（ＮＡＣ）により得られる効果と同様である。
ＮＬＲＰ３活性化における重要なメカニズムとして説明される第２のメカニズムは、次々にインフラマソームをトリガーするリソソーム内容物のサイトゾル放出を導く、リソソーム損傷である。また、ＤＳＳがリソソーム損傷によりインフラマソームをトリガーすることが示唆された。アポトーシス細胞がリソソーム損傷を防止するかどうかを試験するために、サイトゾル染色が、ＤＮＡ及びＲＮＡと単量体結合される場合には緑の蛍光を、酸性のコンパートメントで二量体化する場合には赤の蛍光を発光する染料、アクリジンオレンジにより行われた。赤の蛍光の程度は、細胞内酸性リソソームのレベルと関連する。
ＤＳＳ処理は、赤の蛍光強度の有意な減少をもたらし（図２０Ａ、ｐ＜０．０５、一元配置分散分析法）、リソソーム損傷を示し、ＤＳＳ及び結晶についてのこれまでの所見と一致する。マクロファージがＤＳＳ投与前にアポトーシス細胞で処理された場合、酸性のコンパートメントの数の有意な増加が検出され、リソソームコンパートメントの安定化を示唆した（図２０Ａ、ｐ＜０．０３、一元配置分散分析法）。この観察は、共焦点顕微鏡を用いて確認され、マクロファージがＤＳＳで処理された場合に、より拡散したサイトゾル染色パターンを示し、リソソームの破裂を示した（データ図示せず）。しかしながら、ＤＳＳ投与前にアポトーシス細胞により処理される場合には、リソソームは無傷なようであった。まとめると、このデータは、リソソームコンパートメント安定化は、アポトーシス細胞によるインフラマソーム調節を伴うことを示唆している。
第３のＮＬＲＰ３活性化メカニズムは、ＡＴＰ及びＰ２Ｘ７レセプターを介して、または孔形成トキシンによる細胞内イオン環境における変化を伴うことが示唆され、おそらく、パネキシン１をも伴う。Ｋ＋流出をブロッキングすることまたは高濃度のＫ＋を適用することは、ＤＳＳを含む、多くの試剤によりＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化を防止した。
アポトーシス細胞の存在下におけるＫ＋流出の役割を評価するために、ＬＰＳ及びナイジェリシン投与後に、ＩＬ−１β分泌を阻害する際に、アポトーシス細胞により前処理されたマクロファージの効果が試験された。図２０Ｂにみられるように、ＩＬ−１β分泌は、実際に、高濃度では適格性が少なくなるものの、アポトーシス細胞により用量依存的に最大７０％まで阻害された。
実施例１１
ＡｐｏＣｅｌｌ細胞調製物は、メチルプレドニゾロンを含む
ＡｐｏＣｅｌｌ最終産物のメチルプレドニゾロンの量を測定するために、細胞調製物が、本発明の産生方法にしたがって産生された。調製中に、細胞は、５０μｇ／ｍＬメチルプレドニゾロンを含むインキュベーション培地中で６時間インキュベートされた。アポトーシス誘導の最後に、細胞は洗浄され、ＰＢＳに再懸濁された。品質管理試料の収集後のＡｐｏＣｅｌｌ産物の最終的な量は、３００ｍｌであった。ＡｐｏＣｅｌｌ最終産物の上清におけるメチルプレドニゾロンの残留量は、３回の実行から調製される最終産物で測定された。メチルプレドニゾロンレベルが、逆相液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定された。分析は、イスラエル国レホヴォトのスペクトラボ分析研究所（Spectrolab Analytical Laboratory）により権限が与えられて、実行された。ＡｐｏＣｅｌｌ最終産物における残留メチルプレドニゾロンのレベルを下表３に示す。
最終産物における残留メチルプレドニゾロンの濃度の範囲は、ＡｐｏＣｅｌｌ産物の最も低い投与量では３．７ｍｇ／Ｌであり、最も高い投与量では２１．９ｍｇ／Ｌである。最終的な投与量における総メチルプレドニゾロンの範囲は、ＡｐｏＣｅｌｌ投与量に相関する１．１１〜６．５７ｍｇである。結果は、最も高いコホートを含む、ＡｐｏＣｅｌｌに存在するメチルプレドニゾロンの量が、骨髄移植中の一般的な治療プロトコルの一部として、患者が受けるメチルプレドニゾロンの投与量に対してわずかであることを示す。
Figure 2016501526
実施例１２
ＡｐｏＣｅｌｌ細胞調製物収量での高トリグリセリドレベルを含む血漿の影響
ＡｐｏＣｅｌｌ組成物の細胞収量での高レベルのトリグリセリド（ＴＧ）を含む血漿の影響を測定するために、細胞は、正常なトリグリセリドレベルを有する健常なドナーから収集され、抗凝固剤を含まない凍結培地で凍結された。解凍後に、細胞は４つの処理群に分けられた。
（１）正常なトリグリセリドレベルを有する、自己血漿を含むインキュベーション培地におけるインキュベーション。
（２）正常なトリグリセリドレベルを有する、異種性の血漿を含むインキュベーション培地におけるインキュベーション。
（３）２３．５ミリモル／リットルのＴＧレベルを有する、異種性の高脂血症の血漿を含むインキュベーション培地におけるインキュベーション。
（４）５．６ミリモル／リットルのＴＧレベルを有する、異種性の高脂血症の血漿を含むインキュベーション培地におけるインキュベーション。
表４で示す結果から分かるように、高トリグリセリドレベルを含む血漿の存在下でのインキュベーションは、より低いＡｐｏＣｅｌｌ収率をもたらした（Ａｎ＋＝アネキシンＶ染色についての陽性の細胞、ＰＩ−＝ヨウ化プロピジウム染色について陰性である細胞）。同様に、表５に示される結果にみられるように、本明細書で上記実施例１から４と同じ方法を用いて、高トリグリセリドレベルを有するドナーから、本発明の細胞調製物を調製することは、低いＡｐｏＣｅｌｌ収量をもたらした。
Figure 2016501526
Figure 2016501526
実施例１３
高トリグリセリドレベルを含む血漿の存在下でのＡｐｏＣｅｌｌ細胞調製物収量に対する抗凝固剤の影響
ＡｐｏＣｅｌｌの産生中の抗凝固剤の添加が、高くて安定した細胞収率をもたらすかどうかを測定するために、細胞は、白血球除去法を用いて健常なドナーから収集され、本明細書に記載されるＡｐｏＣｅｌｌ産物を産生するために使用された。産生中に、細胞は凍結培地で凍結され、ともにいずれかを含むインキュベーション培地でインキュベートされた。
１．正常なトリグリセリドレベルを有する自己血漿。凍結時またはインキュベーション培地に抗凝固薬をいれない。
２．正常なトリグリセリドレベルを有する健常なドナーからの異種性の血漿。凍結時またはインキュベーション培地に抗凝固薬をいれない。
３．高トリグリセリドレベルを有する異種性の高脂血症の血漿。凍結時またはインキュベーション培地に抗凝固薬をいれない。
４．高トリグリセリドレベルを有する異種性の高脂血症の血漿（３項と同じ）及び５％抗凝固剤溶液（ＡＣＤ処方Ａ＋１０Ｕ／ｍｌのへパリン）。
各処理群由来の細胞が、実験にわたって、それらが凍結されるのと同じ血漿にさらされた。
実施例１１に示される結果と一致して、表６の結果は、高血漿レベルのトリグリセリドは、処理３にみられるように（凍結細胞の１０．４％）、ＡｐｏＣｅｌｌ細胞調製物の低収量をもたらすことを示す。予想外に、調製プロセス中の抗凝固剤の添加は、防止効果を有し、よって、処理４にみられるように、標準的な細胞調製物の収量の達成を可能にする（凍結細胞の４２．６％）。
Figure 2016501526
実施例１４
ＡｐｏＣｅｌｌ細胞−調製物の収量は、調製プロセスの各ステージ中の抗凝固剤の添加に影響される
最終的な調製物の細胞収量への、ＡｐｏＣｅｌｌの産生の異なるステージ中の抗凝固剤添加の影響を試験するために、細胞が、２つの異なる医療センター（メディカルセンター１及び２と表示される）で、同じ３人の健常なドナー（００３６、００３７、及び００３８で表示される）から白血球除去法により収集された。さらに、メディカルセンター１で、細胞がさらに２人の健常なドナーから収集された（００３９−１及び００４０−１で表示される）。メディカルセンターでの細胞収集は、以下のように、細胞収集中の抗凝固剤添加のプロトコルが異なっていた。
１．センター１−５０００Ｕのヘパリン（ヘパリンナトリウム、フレゼニウス社（Fresenius）製）が酸性のクエン酸デキストロースフォーミュラＡ（ＡＣＤフォーミュラＡ）のバック内に注入され、小フラクションがドナーと収集バック（細胞及び血漿）に到達するように、ヘパリン及びＡＣＤフォーミュラＡが白血球除去装置で循環する。
２．センター２−５０００Ｕのヘパリン（ヘパリンナトリウム、フレゼニウス社製）が直接細胞収集バックに注入され、よってヘパリンは白血球除去装置内で循環せず、ドナーに到達せず、血漿収集バックに到達しない。ＡＣＤフォーミュラＡは、しかしながら、装置内を循環し、ドナーと収集バック（細胞及び血漿）に到達する。
よって、メディカルセンター１及び２の産生方法の主な相違点は、収集バック中のヘパリンの濃度である。メディカルセンター２での細胞収集バック中のヘパリンの濃度は、メディカルセンター１での細胞収集バック中のヘパリンの濃度と比較して高い。また、メディカルセンター２における血漿収集バックには、実質的にヘパリンが含まれていない。
２つの医療センターでの以下の細胞収集後に、４つの条件下で収集された細胞からＡｐｏＣｅｌｌ細胞調製物が産生された。
１．Ｆ−／Ｉｎｃ−＝凍結、インキュベーション、または洗浄ステップ中に抗凝固薬が添加されなかった。
２．Ｆ−／Ｉｎｃ＋＝凍結及び洗浄中に抗凝固薬が添加されなかったが、インキュベーション中には添加された。
３．Ｆ＋／Ｉｎｃ＋＝凍結中、凍結後の洗浄ステップ中、及びインキュベーション中に抗凝固薬が添加された。
４．Ｆ＋／Ｉｎｃ−＝凍結中及び凍結後の洗浄ステップ中に抗凝固薬が添加されたが、インキュベーション中には添加されなかった。
本実験中に抗凝固剤を含む各凍結用培地、インキュベーション用培地または洗浄用培地は、５％抗凝固薬を含んでいた。実験中に使用された抗凝固薬は、１０Ｕ／ｍｌのへパリンが添加されたＡＣＤフォーミュラＡであった。
表７に示されるように、凍結またはインキュベーション中の抗凝固薬の添加なしに産生されたＡｐｏＣｅｌｌ細胞調製物の平均収量は、メディカルセンター２のほうがメディカルセンター１よりも低かった（それぞれ、２５．２対５１．４％）。インキュベーション中またはインキュベーション及び凍結中の抗凝固薬の添加は、メディカルセンター１及び２の両方において、４０％以上の高く安定した細胞収量をもたらした。よって、インキュベーション中またはインキュベーション及び凍結中の抗凝固薬の添加は、細胞収集条件に関わらず、ＡｐｏＣｅｌｌ細胞調製物の高い収量をもたらす。表７中の収量の値は、組成物が由来する凍結収集細胞からのＡｐｏＣｅｌｌ組成物における細胞を指す。
Figure 2016501526
実施例１５
ＡｐｏＣｅｌｌ細胞調製物内の多形核の細胞の特徴づけ
ＡｐｏＣｅｌｌ細胞調製物内の顆粒球のパーセンテージを評価するために、多形核の細胞のパーセンテージが、白血球除去法により収集される細胞内、及び各収集物から産生されたＡｐｏＣｅｌｌ組成内で測定された（Ｃｏｌ−同じ患者由来の試験された細胞収集の数）。表８に示されるように、ＡｐｏＣｅｌｌ組成物内の顆粒球のパーセンテージは、白血球除去法で収集された単核に富む細胞分画内の多形核の細胞パーセンテージよりもかなり低い。
Figure 2016501526
本発明は、その具体的な実施形態に関連して記載したが、多くの代替形態、変更形態、変形形態が当業者に明白であることは明らかである。したがって、本発明の趣旨及び添付の特許請求の範囲に含まれる代替形態、変更形態、変形形態が全て包含されることが意図される。
本明細書で言及した全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的に及び個々に参照により本明細書に組み込まれることが示されるのと同じ程度に、明細書内に参照によりそれらの全体においてここに組み込まれる。また、本明細書におけるあらゆる参考文献の列挙及び確認は、そのような参考文献が、本発明の先行技術として利用可能であることを認めるとは解釈されるべきではない。見出しが使用されるという程度で、それらは必須の限定として解釈されるべきではない。

Claims (47)

  1. 単核豊富細胞を含む細胞調製物であって、
    当該調製物が、少なくとも８５％の単核細胞を含み、
    当該調製物中の前記細胞の少なくとも４０％が初期アポトーシス状態にあり、
    当該調製物中の前記細胞の少なくとも８５％が生細胞であり、
    当該調製物が、１５％以下のＣＤ１５ｈｉｇｈ発現細胞を含むことを特徴とする細胞調製物。
  2. 少なくとも９０％の単核細胞を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞調製物。
  3. 少なくとも９５％の単核細胞を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞調製物。
  4. リンパ球、単核細胞及びナチュラルキラー細胞からなる群より選択された少なくとも１つの細胞種を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞調製物。
  5. ５％以下の多形核白血球を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞調製物。
  6. 請求項１に記載の細胞調製物を含むことを特徴とする医薬組成物。
  7. 抗凝固剤を更に含むことを特徴とする請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 前記抗凝固剤が、ヘパリン、クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）フォーミュラＡ、及びそれらの組合せからなる群より選択されたものであることを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 前記ヘパリンが、０．００５〜２．５Ｕ／ｍｌの濃度で存在することを特徴とする請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 前記ＡＣＤフォーミュラＡが、０．０１〜１０％ｖ／ｖの濃度で存在することを特徴とする請求項８に記載の医薬組成物。
  11. 前記抗凝固剤が、１０Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含有するＡＣＤフォーミュラＡであることを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。
  12. ３０μｇ／ｍｌを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを更に含むことを特徴とする請求項６に記載の医薬組成物。
  13. １０％以下のＣＤ１５ｈｉｇｈ発現細胞を含むことを特徴とする請求項６に記載の医薬組成物。
  14. 請求項６に記載の医薬組成物の製造方法であって、
    ドナーの末梢血から、少なくとも６５％の単核細胞を含む単核豊富細胞調製物を取得するステップと、
    前記単核豊富細胞調製物を凍結媒体中で凍結するステップと、
    前記単核豊富細胞調製物を解凍するステップと、
    約１０〜１００μｇ／ｍＬの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含むアポトーシス誘導インキュベーション媒体中で、前記単核豊富細胞調製物をインキュベートするステップと、
    前記細胞調製物を投与媒体中に懸濁するステップとを含み、
    前記凍結媒体及び前記アポトーシス誘導インキュベーション媒体の少なくとも１つが、抗凝固剤を含むことを特徴とする製造方法。
  15. 前記取得ステップが、白血球除去法によって行われることを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
  16. 前記抗凝固剤が、ヘパリン、ＡＣＤフォーミュラＡ、及びそれらの組合せからなる群より選択されたものであることを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
  17. 前記ヘパリンが、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌの濃度で存在することを特徴とする請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ＡＣＤフォーミュラＡが１〜１５％ｖ／ｖの濃度で存在することを特徴とする請求項１６に記載の製造方法。
  19. 前記抗凝固剤が、１０Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含有するＡＣＤフォーミュラＡであることを特徴とする請求項１６に記載の製造方法。
  20. 前記アポトーシス誘導インキュベーション媒体が抗凝固剤を含むことを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
  21. 前記凍結媒体及び前記アポトーシス誘導インキュベーション媒体の両方が抗凝固剤を含むことを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
  22. 前記インキュベーションが、約２〜１２時間に及ぶことを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
  23. 前記インキュベーションが、約６時間に及ぶことを特徴とする請求項２２に記載の製造方法。
  24. 前記インキュベーション中の前記細胞濃度が、約０．５×１０６〜１０×１０６細胞／ｍｌであることを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
  25. 前記メチルプレドニゾロンが、約５０μｇ／ｍｌの最終濃度であることを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
  26. 免疫疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療、予防又は緩和を必要とする対象において、前記疾患を治療、予防又は緩和する方法であって、
    請求項６に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
  27. 前記免疫疾患が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ＧＶＨＤが、高グレードＧＶＨＤであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
  29. 前記医薬組成物が、高グレードＧＶＨＤからグレードＩのＧＶＨＤへのシフトを誘導することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
  30. 前記ＧＶＨＤが、急性ＧＶＨＤであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
  31. 前記医薬組成物が、ＧＶＨＤに関連した肝毒性を減少させることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
  32. 前記対象が、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受けていることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
  33. 前記ＨＳＣＴが同種異系のＨＳＣＴであり、前記医薬組成物が造血幹細胞の同一ドナーから得られた細胞を含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
  34. 前記対象が、造血器腫瘍に罹患していることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
  35. 前記造血器腫瘍が、白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、及び多発性骨髄腫からなる群より選択されたものであることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
  36. 前記造血器腫瘍が、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及び慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）からなる群より選択されたものであることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
  37. 前記対象において、移植片対腫瘍反応効果、又は移植片対白血病効果（ＧＶＬ効果）を維持させることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
  38. 前記対象が、固形臓器移植を受けていることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
  39. 前記臓器が、肺、心臓、腎臓、膵臓、肝臓及び小腸からなる群より選択されたものであることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
  40. 前記医薬組成物の投与が前記移植前２４時間までに行われることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
  41. 前記医薬組成物の投与が移植と同時に行われることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
  42. 前記医薬組成物が前記移植後１５日までに投与されることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
  43. 前記炎症性疾患が関節炎であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
  44. 前記炎症性疾患が痛風であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
  45. 前記炎症性疾患が炎症性腸疾患であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
  46. 前記炎症性腸疾患が、クーロン病、潰瘍性大腸炎、及びそれらの組合せからなる群より選択されたものであることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
  47. 前記医薬組成物が静脈内注射によって投与されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
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