JP2016501526A5 - - Google Patents
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Description
本発明は、アポトーシス細胞を含む治療用細胞集団、特に、初期アポトーシス状態の濃縮単核細胞含む組成物、当該組成物の製造方法、及び病的免疫応答によって特徴付けられる疾患の治療における当該組成物の使用に関する。
病的免疫応答によって特徴付けられる疾患は、著しい死亡率及び罹患率に関連する多くの疾患、特に全身性エリテマトーデス(SLE)等の自己免疫疾患、移植片対宿主病(GVHD)等の移植関連疾患を含む。自己免疫疾患は通常、2つの一般的な種類、すなわち、全身性自己免疫疾患(例えば、SLE及び強皮症)及び臓器特異的自己免疫疾患(例えば多発性硬化症及び糖尿病)に分類され得る。
免疫抑制薬は、移植された臓器及び組織(例えば、骨髄、心臓、腎臓、肝臓)の拒絶の治療又は予防のためや、自己免疫疾患又はおそらく自己免疫起源である疾患(例えば、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、クーロン病、ベーチェット病、天疱瘡、ぶどう膜炎、及び潰瘍性大腸炎)の治療のためや、他の非自己免疫炎症性疾患の一部(例えば、長期アレルギー性喘息コントロール)並びに移植関連疾患(例えば、GVHD)の治療のために使用されてきた。しかしながら、免疫抑制薬治療は、多く合併症をもたらすことがあり、病的免疫反応を扱う改善された方法が求められている。
米国及びヨーロッパでは毎年約30,000人の患者が同種骨髄移植(BMT)を経験している。同種骨髄移植(allo−BMT)では、患者へのドナー骨髄の注入は、2つの免疫系からの細胞の相互作用を伴う。同種移植を受ける患者の調整レジメンは、免疫系を抑制することによってドナー幹細胞を患者に移植することができる。一旦ドナー免疫細胞が患者の体に樹立されると、該細胞は、任意の残留癌細胞を含む患者自身の組織及び細胞を、異なった又は外来であると認識し得る。次いで、免疫系は、肝臓、胃腸管又は皮膚等のある臓器に損傷を起こし得る。この効果は、移植片対宿主病(GVHD)として知られている。
今日現在、GVHD予防は、カルシニューリン阻害剤(CNI)、シクロスポリン又はタクロリムスを含む免疫抑制薬と、メトトレキサート、マイコフェノレートモフェチル(MMF)又はシロリムスのいずれかとの組合せを含む。しかしながら、急性GVHDは、ヒト白血球抗原(HLA)一致の同胞由来の移植を受けるBMT患者の35%〜70%で依然として起こり、非関連ドナー移植レシピエントではもっと頻繁に起こる。
カルシニューリン阻害剤(CNI)は、急性GVHDを部分的に阻害するが、それらは、T細胞発達を阻害し、疾患再発のリスクを増加させることによって免疫再構成を修復し得る。従って、同種BMTを経験している血液系腫瘍を有する患者は、CNIの使用を最小限にし、GVHDを予防し、有利な移植片対腫瘍効果を含む機能性免疫系を維持する、GVHD予防を必要とする。
米国特許第6,524,865号明細書(特許文献1)、米国特許第6,607,722号明細書(特許文献2)及び米国特許第7,109,031号明細書(特許文献3)、並びに米国特許出願公開第2010/0267137号(特許文献4)、米国特許出願公開第2010/01837365号(特許文献5)は、免疫抑制レシピエント樹状細胞の産生に関し、移植又はインプラントに対する免疫応答を減少させることを意図した、樹状細胞を壊死又はアポトーシスドナー白血球と接触させることに関する。
本発明の発明者の1人に関する国際公開WO2002/060376号(特許文献6)は、対象における全身性自己免疫疾患の治療方法であって、該対象から得られたアポトーシス及び/又は壊死細胞の投与による方法を開示する。
本発明の発明者の1人に関する国際公開WO2006/117786号(特許文献7)は、病的免疫応答によって特徴付けられる疾患の治療のための瀕死白血球又は死白血球を含む細胞調製物の使用を更に開示する。瀕死白血球又は死白血球は、表面に接着させるために生きた白血球を誘導することによって得られ、該対象において病的免疫応答を抑制することができる。
本願の優先日後に公表されたメヴォラッチ(Mevorach)等による研究では、関連したドナーからのHLA一致骨髄破壊的同種造血幹細胞移植(HSCT)後の、急性移植片対宿主疾患(GVHD)の予防法としての、ドナー単核初期アポトーシス細胞の注入について考察されている(Mevorach et al., ePub October, 2013, Biol Blood Marrow Transplant(非特許文献1))。
血液細胞収集中に抗凝固剤を使用することは日常的である。細胞保存において、抗凝固剤の使用は細胞収率を改善すると報告されてきた。マツモト(Matsumoto)等は、ウイスコンシン大学(UW)液中での保存を含む様々な条件下で末梢血幹細胞(PBSC)の保存と、自家血清及び抗凝固剤溶液酸クエン酸デキストロース(ACD)溶液A中での低体温保存とを比較した。顆粒球マクロファージコロニー形成単位(CFU−GM)の生存は、4℃での自家血清及びACD−A中での液低体温保存、又は80℃での低温保存で達成された生存よりも、UW液で有意に見出された(Matsumoto et al., 2002, Bone Marrow Transplantation, 30(11): 777-784(非特許文献2))。バーガー(Burger)等は、細胞の低温保存又はACD−A添加のために回収された血漿へのヘパリンの添加は、凍結溶液のゼラチン化を抑制した(Burger, S.R. et al., 1996, Transfusion, 36: 798-801(非特許文献3))。国際公開WO2003/006691号(特許文献8)には、ヘパリン含有CD34+細胞用の細胞低温保存培地が開示されている。カオ(Kao)等の文献には、ACD−A及び/又はヘパリン含有培地中で、4℃又は20℃での、骨髄細胞、末梢血幹細胞又は末梢血単核細胞生成物の保存が開示されている(Kao et al., 2011, Transfusion, 51: 137-147(非特許文献4))。米国特許第6,489,311号明細書(特許文献9)には、細胞アポトーシスを抑制するための抗凝固剤の使用が開示されている。
自己免疫疾患及び炎症性疾患及び移植関連疾患を含む免疫疾患を治療又は予防するための組成物及び方法の要求は、依然として満たされていない。例えば、GVHDは、30%〜70%の推定発生率を有し、成功的な同種血液又は骨髄移植にとって主な障害となっており、GVHD予防のための最適な方法は未だ確率されていない。特に、安全に、信頼性があり、再現可能でかつ効果的な方法でGVHDを予防又は緩和する組成物及び方法を得ることが必須である。
Mevorach et al., ePub October, 2013, Biol Blood Marrow Transplant
Matsumoto et al., 2002, Bone Marrow Transplantation, 30(11): 777-784
Burger, S.R. et al., 1996, Transfusion, 36: 798-801
Kao et al., 2011, Transfusion, 51: 137-147
本発明は、治療用の初期アポトーシス細胞集団に関する。特に、本発明は、初期アポトーシス細胞の濃縮単核細胞(mononuclear-enriched cell、濃縮された単核細胞、豊富単核細胞)の明瞭な調製物、その改善された製造方法、及び病的免疫応答によって特徴付けられた疾患の治療における臨床現場でのその使用に関する。かかる疾患の例は、移植片対宿主疾患(GVHD)、クーロン病、潰瘍性大腸炎を含むが、これらに限定されない。加えて、本発明は、初期アポトーシス状態の濃縮単核細胞を含む治療用組成物を取得するための方法、安定かつ再現可能な細胞収率、及びその使用を提供する。
本発明は、一部では、骨髄細胞の移植に加えて、別個の注入で投与された濃縮された単核の初期状態アポトーシス細胞が、GVHDに対して緩和的又は予防的効果を有するとの発見に基づく。特に、造血幹細胞移植(HSCT)を受ける造血器腫瘍に罹患した対象への本発明のアポトーシス細胞調製物の注入は、急性高グレードGVHD(例えば、グレードII〜IV)の発生を誘発する点で効果的であった。加えて、アポトーシス細胞集団は、前記対象における肝毒性の発生を顕著に減少させ、場合によってはHSCTの生着までの期間を減少させることが分かった。
本発明はまた、一部では、本発明のアポトーシス細胞組成物の1回注入が、IBDの異なった種類の動物モデルでの臨床スコア及び組織学的損傷の両方を有意に緩和したとの発見に基づく。
臨床現場における本発明の実施化中に、本発明の発明者らは、特定のドナーの血液から本発明の細胞調製物を製造すると、異なる調製物間で低い及び/又は不安的な細胞収率をもたらすという問題に遭遇した。場合によっては、細胞収率は、得られた組成物中の細胞凝集物の形成によって悪影響を受けた。この問題は、高レベルの血液トリグリセリドを有するドナー由来の細胞を用いて製造された組成物において特に高頻度に見られた。低細胞収率及び/又は凝集体の形成のこれらの問題を解決するために、(細胞回収中にきまって使用された抗凝固剤に加えて)アポトーシスの誘導の1又はそれ以上のステージ中の抗凝固剤の使用が、組成物中に高くかつ安定な細胞収量をもたらすことが見出された。更に、細胞回収に使用されたプロトコルにかかわらず、アポトーシスの誘導の1又はそれ以上のステージ中の抗凝固剤の添加が、本発明の組成物の異なった調製物中の高くかつ安定な細胞収量の維持を可能にした。いくつかの実施形態によれば、以下に例示されるように、アポトーシスの誘導の1又はそれ以上のステージ中の抗凝固剤の添加は、高くかつ安定な細胞収率(アポトーシスが誘導された初期細胞のうち、少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、典型的には少なくとも50%の細胞)を有する組成物の製造を可能にする。各可能性は本発明の別の実施形態を表す。
以下に例示されるように、高いトリグリセリドレベル又は通常のトリグリセリドレベルの存在下で細胞組成物を製造する際に、かかる高くかつ安定な細胞収率はともに観察される。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞組成物の1又はそれ以上の生存段階中の抗凝固剤の使用は、該組成物中の生細胞の高くかつ安定な細胞収率、及び/又は該組成物中の初期アポトーシスステージの細胞の高くかつ安定な細胞収率をもたらす。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。従って、本発明は、初期アポトーシスの、安定でかつ高生存濃縮単核細胞組成物、前記細胞組成物の改善された製造方法、及び自己免疫疾患及び炎症性疾患を治療又は緩和する点でのその使用を提供する。
一態様によれば、本発明は、濃縮単核細胞を含む細胞調製物であって、少なくとも85%の単核細胞を含み、該調製物中の細胞の少なくとも40%が初期アポトーシス状態にあり、該調製物中の細胞の少なくとも85%が生細胞であり、該調製物が15%以下のCD15high発現細胞(CD15high expressing cell)を含むことを特徴とする調製物を提供する。
別の態様によれば、本発明は、本発明の細胞調製物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、前記調製物を含む組成物は抗凝固剤を更に含む。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、ヘパリン、ACDフォーミュラ(formula)A又はそれらの組合せから選択される。各々の可能性は、本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、患者への前記細胞調製物の投与に用いられる最終懸濁媒体を含む該組成物中のヘパリンは、0.005〜2.5U/mlの濃度で存在する。別の実施形態によれば、患者への前記細胞調製物の投与に用いられる最終懸濁媒体を含む該組成物中のヘパリンは、0.01〜1U/mlの濃度で存在する。いくつかの実施形態によれば、患者への前記細胞調製物の投与に用いられる最終懸濁媒体を含む該組成物中のACDフォーミュラAは、0.01〜10%v/vの濃度で存在する。他の実施形態によれば、患者への前記細胞調製物の投与に用いられる最終懸濁媒体を含む該組成物中のACDフォーミュラAは、0.05〜5%v/vの濃度で存在する。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、30μg/mlを超えない濃度で残りのメチルプレドニゾロンを更に含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、10%以下のCD15high発現細胞を更に含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物中の細胞は、異質遺伝子型ドナーから回収される。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物中の細胞は、造血幹細胞移植(HSCT)方法で使用される造血幹細胞(HSC)のドナーと同一のドナーから回収される。非限定的な例によれば、ドナーからの細胞の回収は、白血球除去法によって影響を受ける。ある実施形態によれば、濃縮単核細胞調製物は自家細胞を含むことになる。
当分野で知られているように、抗凝固剤は通常、細胞回収手順(白血球除去法を含むがこれに限定されない)中に使用されることに留意されたい。本発明のいくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、本発明の組成物の調製中に使用される少なくとも1つの媒体に更に添加される。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物の調製中に使用される少なくとも1つの媒体は、凍結媒体、洗浄媒体、アポトーシス誘導インキュベーション媒体及びそれらの組合せからなる群より選択される。各々の可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、ヘパリン、ACDフォーミュラA及びこれらの組合せからなる群より選択される。各々の可能性は本発明の別の実施形態を示す。当分野で知られている他の抗凝固剤(例えばフォンダパリヌクス、ビバリルジン及びアルガトロバンを含むがこれらに限定されない)もまた本発明に従って使用し得ることに留意されたい。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物の調製で使用される少なくとも1つの媒体は、10U/mlのへパリンを含む5%のACDフォーミュラA液を含む。典型的な実施形態によれば、抗凝固剤は、本発明の細胞組成物の最終懸濁媒体に添加されない。本明細書で使用される用語「最終懸濁媒体」及び「投与媒体」は同じ意味で使用される。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物の調製で使用される少なくとも1つの媒体は、0.1〜2.5U/mlの濃度のヘパリンを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物の調製で使用される少なくとも1つの媒体は、1〜15%v/vの濃度でACDフォーミュラAを含む。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体は抗凝固剤を含む。他の実施形態によれば、インキュベーション媒体は抗凝固剤を含む。好ましい実施形態によれば、凍結媒体及びインキュベーション媒体のいずれも凝固剤を含む。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、ヘパリン、ACDフォーミュラA及びこれらの組合せからなる群より選択される。各々の可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、凍結媒体中のへパリンは、0.1〜2.5U/mlの濃度にある。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体中のACDフォーミュラAは、1%〜15%v/vの濃度にある。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中のへパリンは、0.1〜2.5U/mlの濃度にある。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中のACDフォーミュラAは、1〜15%v/vの濃度にある。特定の実施形態によれば、抗凝固剤は、クエン酸デキストロース(ACD)フォーミュラAの溶液である。更なる実施形態では、以下に例示するように、本発明の組成物の調製中に使用される少なくとも1つの媒体に添加される抗凝固剤は、10U/mlの濃度でヘパリンを含むACDフォーミュラAである。
いくつかの実施形態によれば、本発明の濃縮単核細胞調製物は、少なくとも85%の単核細胞、好ましくは少なくとも90%の単核細胞を含む。各可能性は本発明の別個の実施形態である。いくつかの実施形態によれば、細胞調製物は、少なくとも90%の単核細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、細胞調製物は、少なくとも95%の単核細胞を含む。
更なるいくつかの実施形態によれば、本発明の濃縮単核細胞調製物は、リンパ球、単球及びナチュラルキラー細胞からなる群より選択される細胞種を含む。更なる実施形態では、濃縮単核細胞調製物は、15%以下、又は10%以下、典型的には5%以下の、顆粒白血球(すなわち、好中球、好塩基球、及び好酸球)としても知られている、多形核白血球を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。更に別の実施形態によれば、濃縮単核細胞調製物は、15%以下、又は10%以下、典型的には5%以下の、CD15high発現細胞を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
別の態様によれば、本発明は、本発明の組成物の製造方法であって、ドナーの末梢血から、少なくとも65%の単核細胞を含む濃縮単核細胞調製物を取得するステップと、濃縮単核細胞調製物を凍結媒体中で凍結するステップと、濃縮単核細胞調製物を解凍するステップと、約10〜100μg/mLの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含むアポトーシス誘導インキュベーション媒体中で濃縮単核細胞調製物をインキュベートするステップと、細胞調製物を投与媒体中に懸濁し、それによって本発明の組成物を提供するステップとを含み、凍結媒体及びアポトーシス誘導インキュベーション媒体の少なくとも1つが抗凝固剤を含むことを特徴とする製造方法を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法で使用されるアポトーシス誘導インキュベーション媒体は、抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法で使用される凍結媒体及びアポトーシス誘導インキュベーション媒体のいずれも、抗凝固剤を含む。任意の理論又はメカニズムに拘束されるものではないが、異なる細胞組成物において高くかつ安定的な細胞収率を維持するためには、細胞回収プロトコルにかかわらず、本発明の組成物の製造中に、凍結媒体及びアポトーシス誘導インキュベーション媒体の両方に抗凝固剤を添加することが好ましい。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞組成物中の高くかつ安定的な細胞収率は、アポトーシス誘導のために使用される初期細胞集団の細胞の、少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、典型的には少なくとも50%の細胞収率である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。本明細書で使用される用語「インキュベーション媒体」及び「アポトーシスインキュベーション媒体」は同じ意味で使用される。
いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は少なくとも約6時間冷凍される。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は少なくとも約12時間冷凍される。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は約12時間冷凍される。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、少なくとも8、10、12、18、24時間冷凍される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法に従う解凍された細胞をインキュベートするステップは、約2〜12時間、場合により4〜8時間、典型的には約6時間に及ぶ。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法に従う解凍された細胞をインキュベートするステップは、約6時間に及ぶ。いくつかの実施形態によれば、インキュベートするステップは少なくとも6時間に及ぶ。
いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞調製物を取得するステップは、白血球除去法によって達成される。あるいくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従う濃縮単核細胞調製物の取得は、回収時に少なくとも65%、場合により少なくとも70%、典型的には少なくとも80%の単核細胞を含む調製物の取得を意味する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従う凍結ステップは、本発明の細胞調製物中の単核細胞の初期アポトーシス状態を誘導する点で最初のステップである。本明細書で使用される用語「凍結」及び「低温保存」は同じ意味で使用される。
いくつかの実施形態によれば、アポトーシス誘導インキュベーション媒体は、アポトーシス誘導剤を含み、かかる媒体中でのインキュベーションは、本発明の細胞調製物中の単核細胞の初期アポトーシス状態を誘導する第2のステップとなる。いくつかの実施形態によれば、アポトーシス誘導剤はメチルプレドニゾロンである。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体は、約5〜100μg/mL、場合により約40〜60μg/mLの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体は、約50μg/mLの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含む。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーション中の細胞濃度は約0.5×106〜10×106の範囲である。ある実施形態によれば、インキュベーション中の細胞濃度は約5×106細胞/mlである。
別の態様によれば、本発明は、免疫疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は緩和を必要とする対象において、これらの疾患を予防又は緩和する方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、免疫疾患は移植片対宿主疾患(GVHD)である。いくつかの実施形態によれば、免疫疾患は高グレードのGVHDである。いくつかの実施形態によれば、本発明は、GVHDの予防又は緩和を必要とする対象においてGVHDを予防又は緩和する方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。
いくつかの実施形態によれば、GVHDは、高グレードのGVHDの発生を予防するために緩和される。特定の実施形態では、高グレードのGVHDはグレードII〜IVのGVHDである。別の特定の実施形態では、高グレードのGVHDはグレードIII〜IVのGVHDである。特定の実施形態によれば、医薬組成物は、高グレードのGVHDからグレードIのGVHDへのシフトを誘導する。別の特定の実施形態によれば、GVHDは急性GVHDである。更に別の実施形態では、GVHDは慢性GVHDである。別の特定のいくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞調製物を含む医薬組成物を対象に投与する方法は、高グレードのGVHDを予防し、同時に、対象は移植片対腫瘍効果又は移植片対白血病効果(GVL効果)を維持する。いくつかの実施形態によれば、本発明の治療方法の後、対象は移植片対白血病効果(GVL効果)を維持している。
別の実施形態によれば、本医薬組成物は、GVHDに関連した肝毒性を減少させる。いくつかの実施形態によれば、前記GVHDは肝臓GVHDである。
別の実施形態によれば、対象は、造血幹細胞移植(HSCT)を受けている。いくつかの実施形態によれば、HSCTは、同種異系HSCTである。いくつかの実施形態によれば、HSCTは同種異系のHSCTであり、本発明の医薬組成物は造血幹細胞の同一ドナーから得られた細胞を含む。特定のいくつかの実施形態によれば、前記対象は造血器腫瘍に罹患している。いくつかの実施形態によれば、前記造血器腫瘍は、白血病、骨髄異形成症候群(MDS)、リンパ腫、及び多発性骨髄腫(すなわち、形質細胞障害)からなる群より選択される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。例示的な態様によっては、前記造血器腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、骨髄異形成症候群(MDS)、及び慢性骨髄白血病(CML)からなる群より選択される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
他のいくつかの実施形態によれば、対象は固形臓器移植を受けている。固形臓器移植は、肺、心臓、腎臓、膵臓、肝臓及び小腸から選択される臓器を含むが、これらに限定されない。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、移植された臓器と同一又は異なったドナーから得られる細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、本発明のアポトーシス細胞は自家細胞である。
別の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、移植レシピエントに投与された調整処置後に投与される。別の実施形態によれば、医薬組成物は、移植の1日前から移植の15日後までに間に投与される。別の実施形態によれば、医薬組成物の投与は、移植の最大30時間前までに行われる。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物の投与は、移植の最大24時間前までに行われる。特定のいくつかの実施形態によれば、医薬組成物の投与は、移植の約24〜30時間前までに行われる。更に別の実施形態によれば、医薬組成物の投与は、移植と同時に行われる。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は静脈内に投与される。別の実施形態によれば、医薬組成物は単回投与される。別の実施形態によれば、医薬組成物は複数回投与される。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は静脈内投与用に製剤化される。
更なる実施形態によれば、炎症性疾患は関節炎であり、リウマチ様関節炎を含むがこれに限定されない。いくつかの実施形態によれば、本発明は、関節炎の予防又は緩和を必要としている対象において関節炎を予防又は緩和する方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与するステップを含む方法を提供する。別の実施形態によれば、炎症性疾患は痛風である。いくつかの実施形態によれば、本発明は、痛風の予防又は緩和を必要としている対象において痛風を予防又は緩和する方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与するステップを含む方法を提供する。
更なる実施形態によれば、炎症性疾患は炎症性腸疾患である。いくつかの実施形態によれば、炎症性腸疾患は、クーロン病、潰瘍性大腸炎及びそれらの組合せから選択される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明は、クーロン病、潰瘍性大腸炎及びそれらの組合せから選択される炎症性疾患の予防又は緩和を必要とする対象において炎症性疾患の予防又は緩和方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、対象における免疫疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は緩和における使用のための本発明の医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、対象におけるGVHDの予防又は緩和における使用のための本発明の医薬組成物を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明は、対象におけるクーロン病及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択される炎症性腸疾患の予防又は緩和における使用のための本発明の医薬組成物を提供する。可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、免疫疾患又は自己免疫疾患又は炎症性疾患を予防又は緩和するための医薬の製造のための本発明の医薬組成物を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の説明及び図面から明らかになるであろう。
本発明は、いくつかの実施形態によれば、アポトーシス細胞集団に関し、より詳細には、初期アポトーシス濃縮単核細胞集団に関する。本発明は更に、そのような細胞集団の製造方法、及び病的免疫応答によって特徴付けられる疾患の治療における臨床現場でのその使用に関する。
移植関連疾患
ドナー細胞におけるアポトーシスのエクスビボ誘導によって産生された初期アポトーシスの濃縮単核細胞の単回注入の臨床試験結果は、移植関連疾患、例えば骨髄移植患者における移植片対宿主疾患(GVHD)の抑制、予防及び/又は緩和のためのこれらのアポトーシス細胞集団の安全性及び有効性を示す。以下に詳述するように、本発明の方法に従う濃縮単核細胞中の初期アポトーシス誘導は、アポトーシス同種異系ドナー細胞の臨床グレード集団であって、同一のドナーからの骨髄由来細胞で注入した時に、移植に関連した重要因子に影響を与え、造血器腫瘍を有する対象におけるGVHDの発生を効果的に減少させた集団を提供した。
特に、移植100日後には、グレードII〜IVのGVHDの発生は、調製されたアポトーシスドナー細胞で処置されたHSC移植レシピエントにおいて減少し、非再発生存率は有意に増加した。本明細書で実証されるように、急性のグレードII〜IV及びグレードIII〜IVのGVHDの発生は、対照群(71%のグレードII〜IV)に比べて非常に低かった(各々、23%及び15%)。顕著なことに、アポトーシス細胞集団のより高い用量(140×106及び210×106アポトーシス細胞)での処置は、(一致既存対照の50%と比べて)0%の急性GVHDグレードII〜IVを示した。
本発明の方法に従って調製されたアポトーシスドナー細胞の注入は、HSCの生着までの期間を減少させ、HSC移植レシピエントにおける肝毒性の発生を減少させる点で有効であった。
GVHDによって誘導されるプロ炎症性サイトカインの誘導の予防は、臨床適用のための難題であったが、本明細書に示されている結果は、本発明のアポトーシス細胞組成物を受けたHSC移植レシピエントにおけるGVHD関連因子の血清レベルの減少を示す(図6)。特に、6個の異なるバイオマーカーTNFRI、IL−2Ra、HGF、IL−8、IL−15及びIL−7の血漿レベルは、高グレードから低グレードのGVHDか非GVHDかを識別した。追加の2つのコントロールサイトカイン(IL−1b及びIL−6)は、発見の特異性を更に強調した。更に、インビトロ効能アッセイは、本発明のアポトーシス細胞調製物との相互作用後のDC成熟化の阻害を明確に示した(図1)。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、造血幹細胞移植(HSCT)を受けている対象においてGVHDを予防又は緩和する方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、HSCTを受けている対象においてGVHDを予防又は緩和する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、HSCTを受けている対象においてGVHDを予防又は緩和する方法であって、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含む本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、調製物が少なくとも85%の単核細胞を含み、調製物中の該細胞の少なくとも40%が初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも85%が生細胞であり、調製物が15%以下の多形核白血球を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、HSCTを受けている対象においてGVHDを予防又は緩和する方法であって、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含む本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、調製物が少なくとも85%の単核細胞を含み、調製物中の該細胞の少なくとも40%が初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも85%が生細胞である方法を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、HSCTを受けている対象においてGVHDを予防又は緩和する方法であって、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含む本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、該調製物が少なくとも85%の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも40%が初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも85%が生細胞であり、調製物が15%以下の多形核白血球を含み、医薬組成物がヘパリン、ACDフォーミュラA及びそれらの組合せからなる群より選択される抗凝固剤を含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明は、HSCTを受けている対象においてGVHDを予防又は緩和する方法であって、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含む本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、調製物が少なくとも85%の単核細胞を含み、調製物中の該細胞の少なくとも40%が初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも85%が生細胞であり、医薬組成物がヘパリン、ACDフォーミュラA及びそれらの組合せからなる群より選択される抗凝固剤を含む方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物中のヘパリンは、0.001〜3U/ml、典型的には0.001〜2.5U/mlの濃度で存在する。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物中のヘパリンは、0.005〜2.5U/mlの濃度で存在する。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物中のヘパリンは、0.01〜1U/mlの濃度で存在する。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物中のACDフォーミュラAは、0.01〜6%v/vの濃度で存在する。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物中のACDフォーミュラAは、0.05〜5%v/vの濃度で存在する。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物中のACDフォーミュラAは、0.01〜10%v/vの濃度で存在する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、HSCTを受ける対象においてGVHDを予防又は緩和する方法であって、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含む本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、調製物が少なくとも85%の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも40%が初期アポトーシス状態にあり、製物中の細胞の少なくとも85%が生細胞であり、調製物が15%以下の多形核白血球を含み、調製物が30μg/mlを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを含むことを特徴とする方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、HSCTを受ける対象においてGVHDを予防又は緩和する方法であって、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含む本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、調製物が少なくとも85%の単核細胞を含み、調製物中の該細胞の少なくとも40%が初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも85%が生細胞であり、調製物が30μg/mlを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを含むことを特徴とする方法を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、HSCTを受ける対象においてGVHDを予防又は緩和する方法であって、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含む本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、調製物が少なくとも85%の単核細胞を含み、調製物中の該細胞の少なくとも40%が初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも85%が生細胞であり、調製物が15%以下の多形核白血球を含み、組成物がヘパリン、ACDフォーミュラA及びその組合せからなる群より選択される抗凝固剤を含み、調製物が30μg/mlを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明は、HSCTを受ける対象においてGVHDを予防又は緩和する方法であって、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含む本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含み、該調製物が少なくとも85%の単核細胞を含み、該調製物中の該細胞の少なくとも40%が初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも85%が生細胞であり、組成物がヘパリン、ACDフォーミュラA及びその組合せからなる群より選択される抗凝固剤を含み、調組成物が30μg/mlを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、HSCTを受ける対象においてGVHDを予防又は緩和する方法であって、本発明の細胞調製物を含む医薬組成物を該対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、HSCTを受ける対象においてGVHDを予防又は緩和する方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、HSCTを受ける対象においてGVHDの予防又は緩和において使用するための本発明の医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、残留メチルプレドニゾロンを更に含む。いくつかの実施形態によれば、30μg/mlを超えない濃度でメチルプレドニゾロンをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、抗凝固剤を更に含む。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、ヘパリン、ACDフォーミュラA及びその組合せからなる群より選択される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、GVHDは高グレードのGVHDである。特定のいくつかの実施形態によれば、高グレードのGVHDは、グレードII〜IVのGVHDである。特定のいくつかの実施形態によれば、高グレードのGVHDは、グレードIII〜IVのGVHDである。特定のいくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、高グレードのGVHDからグレードIのGVHDへのシフトを誘導する。
別の実施形態によれば、GVHDは急性GVHDである。更に別の実施形態によれば、GVHDは慢性GVHDである。別の特定のいくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物が投与された対象は、移植片対腫瘍効果(GVT効果)、又は移植片対白血病効果(GVL効果)を維持する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、GVHDは対象の肝臓におけるGVHDである。同種異系HSCTレシピエントにおける肝機能不全は、代表的なレジメン及び他の薬物療法からの毒性、感染症、肝中心静脈閉塞症(VOD)、及び肝臓の急性及び慢性移植片対宿主疾患(GVHD)を含む、様々な因子に起因することがある。
別の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、GVHDに関連した肝毒性を減少させる。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物は、GVHDに関連した肝毒性を減少させる。肝毒性の共通の症状及び合併症は、リンパ節炎、発熱、赤血球沈降速度増加高ビリルビンレベル、及び発熱性好中球減少症を含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、免疫疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は緩和の必要性のある対象において該疾患を予防又は治療する方法であって、本発明の細胞調製物を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明は、免疫疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は緩和の必要性のある対象において該疾患を予防又は治療する方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、免疫疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は緩和を必要とする対象における該疾患の予防又は緩和における使用のための本発明の細胞調製物を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明は、免疫疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は緩和を必要とする対象における該疾患の予防又は緩和における使用のための本発明の医薬組成物を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、免疫疾患はGVHDである。いくつかの実施形態によれば、本発明は、GVHDの予防又は緩和を必要とする対象におけるGVHDの予防又は緩和における使用のための本発明の医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、造血器腫瘍の予防又は治療を必要とする対象において該疾患を予防又は緩和するための方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。特定のいくつかの実施形態によれば、該対象は造血器腫瘍に罹患している。
本明細書で使用される用語「造血器腫瘍」は、血液細胞の制御できない異常な増殖によって特徴付けられる任意の血液細胞癌を言う。用語「造血器腫瘍」は、白血病、骨髄異形成症候群、リンパ腫、及び多発性骨髄腫(プラズマ細胞増殖症)を含むがこれらに限定されない。用語「白血病」は、循環する血液中の白血球の対応する増加を伴う又は伴わない、体組織中の白血球数の異常な増加によって特徴付けられる血液形成臓器疾患(例えば、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)等)を言う。用語「骨髄異形成症候群」は、骨髄が前白血病プロセスを示唆する定量的かつ定性的変化を示すが、急性白血病として必ずしも終了しない慢性経過を有する症状を意味する。用語「リンパ腫」は、B又はTリンパ球から得られたリンパ芽球の悪性腫瘍(例えば、ホジキンリンパ腫(HL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)等)を意味する。用語「プラズマ細胞増殖症」は、プラズマ細胞増殖に起因する形質細胞増加(例えば、多発性骨髄腫(MM)、プラズマ細胞白血病(PCL)等)を意味する。
例示的ないくつかの実施形態によれば、前記造血器腫瘍は、骨髄異形成症候群(MDS)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)及び慢性骨髄性白血病(CML)からなる群より選択される。
T−リンパ球等のある種のドナー血液細胞の注入は、移植片対白血病効果を刺激することもできる。この効果は、慢性骨髄性白血病(CML)を有する患者で最も良く観察されている。CMLでは、移植再寛解(transplant re-enter remission)後に患者の75パーセントが再発する。急性骨髄性白血病(AML)及び骨髄異形成症候群(MDS)等の他の疾患については、効果があまりはっきりしない;AML及びMDSでは患者の約20パーセントが寛解に入る。急性リンパ芽球性白血病(ALL)を有する患者については、少数の患者が移植片対白血病効果(GVL効果)から少なくとも一時的に利益を得ているとされているが、GVL効果の存在は不明である。
他の方法では、ドナー免疫細胞は、残留の白血病、リンパ腫又は癌細胞を異なったもとして認識し、それらを破壊することがある。遡及的試験は、急性又は慢性GVHDを発症する患者が、GVHDを発症していない患者よりも低い疾患再発率を有することを証明している。この発見は移植片対腫瘍効果の直接的な指標である。
用語「移植前処置」とは、移植前の、放射線、免疫血清、化学療法及び/又は免疫抑制剤を含む様々な処置レジメンでの移植レシピエントの予備的処置を意味する。移植前処置は骨髄移植前には非常に一般的である。
本明細書で使用される用語「対象」、「患者」及び「それを必要としている対象」は、同じ意味で使用され、本発明の医薬組成物の投与を必要としている対象を意味する。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、HSCTを受けている又は受けることになる対象に投与される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、それを必要としている対象は、HSCTを受ける対象である。いくつかの実施形態によれば、本発明の、それを必要としている対象に移植された造血幹細胞(HSC)及び医薬組成物の細胞は、同一のドナーから得られる。
別の実施形態によれば、本発明の医薬組成物の投与は、HSCTの最大24時間前までに行われる。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物の投与は、HSCTの約24〜30時間前までに行われる。更に別の実施形態によれば、本発明の医薬組成物の投与は、HSCTと同時に行われる。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物の投与は、HSCT後の最大15日までに行われる。追加のいくつかの実施形態によれば、HSCTで使用されたHSCは同種異系のHSCである。非限定的な例によれば、HSCTで使用されたHSCは、骨髄、末梢血、又は臍帯血から得られる。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。別の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は単回投与される。
炎症性腸疾患
炎症性腸疾患(IBD)は、クーロン病及び潰瘍性大腸炎として発症される、胃腸管の粘膜免疫系の異常調節を有する慢性腸炎症によって特徴付けられる。本明細書で使用される用語IBDは、クーロン病、潰瘍性大腸炎又はそれらの組合せを意味する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。腸微小植物及び危険シグナル(例えばデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)など)の両方を含む遺伝子因子及び環境因子は、全て腸炎症を誘発することが明らかにされた。TNFα及びIFNγ遮断、及び抗−IL−1βストラテジー、並びに抗生物質治療は、大腸炎誘発を緩和でき、このことは、核内因子カッパB(NF−κB)、及び基底膜中のマクロファージ及び樹状細胞のインフラマソームの阻害に役割を果たすことを示唆している。
本明細書に開示された本発明の細胞調製物及び医薬組成物の治療的効果は、炎症性腸疾患(IBD)において更に証明された。本明細書で以下に例証するように、本発明の医薬組成物の単回注入は、IBDの2つの異なったモデル、すなわちナイーブCD4細胞の養子T細胞伝達(TCT)及びデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性大腸炎の、臨床的スコア及び組織学所見の両方を有意に緩和した。
デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)モデルは、通常、損傷治癒プロセス及び本質的免疫応答を研究するために適した上皮細胞損傷モデルとして解される。基底膜マクロファージによるDSS取り込みは、炎症プロセスを開始する。LPSで処理され、次いでDSSに曝露されたマクロファージは、NLRP3依存的、ASC依存的、及びカスパーゼ−1依存的に高レベルのIL−1β及びIL−18を分泌する。この効果は、DSSの細胞内取込み作用が実験的に遮断された時に完全になくなった。
カスパーゼは、プログラムされた細胞死の誘導及び実行に関連し、後にはプロアポトーシス又はプロ炎症性として分類される炎症に関連することが初めに明らかにされたシステインプロテアーゼである。カスパーゼ−1は、よく研究され特徴付けられた3つのプロ炎症性カスパーゼの1つである。その触媒活性は、サイトカイン、最も顕著にはIL−1βのカスパーゼ−1依存的プロセシングを介在する「インフラマソーム」と呼ばれる多タンパク質複合体内の自己活性化によって制御される。プロ炎症性刺激は、IL−1βプリホームの発現を誘導するが、サイトカイン成熟及び放出は、インフラマソームによってコントロールされる。
多数のNODE様受容体(NLR)ファミリーメンバーが報告されているが、インビボでのその生理的機能は数ケースについてのみ解明されてきた。NLRP1、NLRP3及びIPAFは、カスパーゼ−1自己活性化を誘導する高分子量複合体を形成するためのホモタイプNACHTドメイン相互作用を介して自己多量化する危険前哨(danger sentinel)である。NLRP3インフラマソームは、NLRP3足場、ASC(PYCARD)アダプター、及びカスパーゼ1−からなる。免疫防御の一部として、NLRP3は、真菌カンジダ・アルビカンス及びサッカロマイセス・セレビシエ、孔形成毒素及びウイルス、並びに様々な微生物成分等の病原全体への曝露の際に活性化される。興味深いことに、NLRP3はまた、炎症性疾患及びおそらく自己免疫疾患をもたらす宿主由来分子によって活性化される。損傷細胞、尿酸ナトリウム一水和物結晶及びアミロイド原線維−βペプチドによって放出される細胞外ATP及びヒアロローナンは、一例である。
本発明は、最初に、本発明のアポトーシス細胞組成物が、インビトロ及びインビボの両方で、NLRP3インフラマソームを負に制御し、造血細胞中でNLRP3インフラマソームを介して誘導されたプロ炎症性応答を下方調節することができることを示す。
インフラマソームトリガーは、トール受容体(TLR)及びインフラマソームトリガーの両方を必要とするツーヒットモデルである。実際に、本発明野アポトーシス細胞は、TLR及びNF−κB経路を阻害することが明らかとなって。TLRトリガーは、プロIL−1β及びプロIL−18の亢進された転写に重要であり、DSS効果に実際に必要とされる。本明細書では、本発明のアポトーシス細胞が転写前及び転写後の両レベルで活性化IL−1βの分泌を阻害し、NF−κB及びNLRP3に対して異なった阻害効果を有したことが示されている。
本明細書では以下に、本発明のアポトーシス細胞組成物がインフラマソーム活性化の制御に記載されている3つのメカニズム全てを行うことを更に示す。本発明の組成物中に含まれるアポトーシス細胞は、化学阻害剤NACについて示されたと類似の割回で、ROS形成を減少及び阻害することができることが示された。マクロファージが本質的な免疫応答の一部として微生物病因をコントロールために毒性ROSを利用し、ROSがIBDの発症に役割を果たすと考えられる炎症性シグナルの主なメディエイターとして同定されたことは、良く知られている。更に、ROSの発生は、ERKリン酸化を介してIL−1βを誘導することが分かった。一方、IL−1βシグナルは、ROS発生を誘導することがある。DSSがROS形成を誘導することが示されているが、マクロファージが本発明の調製物に含まれるアポトーシス細胞で予備処理される時には、ROS発生の顕著な減少、結果的に少ないIL−1β分泌が観察された。
第2のメカニズムは、リソソームを含む。リソソーム損傷又は漏出は、内因性危険シグナルとして働きことができ、NLRP3インフラマソームによって感知されることが明らかとなった。アポトーシス細胞排除はファゴリソソーム経路によって媒介されるので、リソソーム液胞の関連が分析された。本明細書で例証されるように、アポトーシス細胞を定着した腹腔マクロファージからのリソソームは、DSS感作により安定であり、影響を受けることなく又は損傷されなかった。このことは、定着されたアポトーシス細胞は、アポトーシス摂取後の少なくとも24時間にリソソームを感知しなくなるとの注意を指摘し得る。総合すると、これらの結果は、インフラマソーム阻害及びアポトーシス細胞排除に因る炎症消散のメカニズムを示す。
インフラマソームはまた、カリウムイオノフォアニゲリシン等の細胞内カリウムを枯渇するシグナル伝達経路に応答して活性化されることを示唆した。マクロファージがアポトーシス細胞で前処理されると、ニゲリシン誘導IL−1β分泌は有意に阻害された。アポトーシス細胞がニゲリシン誘導IL−1β分泌を阻害する手段は明確でないが、支持する証拠は、おそらくNF−κBシグナル伝達によって最もよく媒介される直接的インフラマソーム上流阻害メカニズムを証明し得る。この注目は、感染性及び非感染性炎症性症状の両方を生じ得た炎症制御メカニズムを例証する。アポトーシス細胞を明確にできないことは、おそらく細胞内オルガネラ明確化の失敗で理解されるので、持続性のインフラマソーム依存的炎症を引き起こすことになる。
纏めると、本発明の細胞調製物の注入は、IBDのマウスモデルでは有利であり、3つのメカニズムを介してインフラマソーム及びNF−κB依存的炎症の両方を阻害する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、IBDの予防又は緩和を必要としている対象において該疾患を予防又は緩和する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、IBDの予防又は緩和を必要としている対象における該疾患の予防又は緩和における使用のための本発明の医薬組成物を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、IBDの予防又は緩和を必要としている対象において該疾患を予防又は緩和する方法であって、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含む医薬組成物を該対象に投与するステップを含み、調製物は少なくとも85%の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも40%は初期アポトーシス状態にあり、調製物中の細胞の少なくとも85%は生細胞であり、調製物は15%以下の多核白血球を含み、医薬組成物は、ヘパリン、ACDフォーミュラA及びそれらの組合せからなる群より選択される抗凝固剤を含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、IBDの予防又は緩和を必要としている対象において該疾患を予防又は緩和する方法であって、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含む医薬組成物を該対象に投与するステップを含み、調製物は少なくとも85%の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも40%は初期アポトーシス状態にあり、調製物中の細胞の少なくとも85%は生細胞であり、調製物は15%以下の多核白血球を含み、医薬組成物は、ヘパリン、ACDフォーミュラA及びそれらの組合せからなる群より選択される抗凝固剤を含み、調製物は30μg/mlを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを含むことを特徴とする方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
アポトーシス細胞調製物
いくつかの実施形態によれば、本発明の調製物は、濃縮単核細胞を含む細胞調製物であって、該調製物は少なくとも85%の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも40%は初期アポトーシス状態にあり、調製物中の細胞の少なくとも85%は生細胞であり、調製物が15%以下の多核白血球を含むような細胞調製物を意味する。いくつかの実施形態によれば、本発明の調製物は、濃縮単核細胞を含む細胞調製物であって、調製物は少なくとも85%の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも40%は初期アポトーシス状態にあり、調製物中の細胞の少なくとも85%は生細胞であり、調製物は15%以下のCD15high発現細胞を含むような細胞調製物を意味する。本明細書で用いる用語「調製物」、「本発明の調製物」、「本発明のアポトーシス細胞調製物」、「本発明の細胞調製物」、「細胞調製物」及び「濃縮単核調製物」は同じ意味で使用される。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、濃縮単核細胞を含む細胞調製物であって、該調製物は少なくとも85%の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも40%は初期アポトーシス状態にあり、調製物中の細胞の少なくとも85%は生細胞であり、調製物が15%以下の多核白血球を含むことを特徴とする細胞調製物を提供する。
本明細書で用いる用語「本発明の組成物」、「本発明の医薬組成物」、「医薬組成物」、「組成物」、「アポトーシス細胞組成物」及び「本発明の細胞調製物を含む組成物」は同じ意味で使用され、本発明の細胞調製物を含む組成物を意味する。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、本発明の細胞調製物を含み、抗凝固剤を更に含む組成物を意味する。いくつかの実施形態によれば、用語「本発明の組成物」は、本発明の細胞調製物、及び患者への該細胞調製物の投与のために使用される最終懸濁媒体を含む組成物を意味する。いくつかの実施形態によれば、本明細書で使用される用語「最終懸濁媒体」及び「投与媒体」は同じ意味で使用され、本発明の細胞調製物の投与のために使用される媒体を意味する。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物を含む医薬組成物は、本明細書では「ApoCell」を意味する。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、本明細書では「ApoCell」を意味する。
いくつかの実施形態によれば、本発明の濃縮単核細胞調製物は、少なくとも85%の単核細胞、少なくとも85%の単核細胞、少なくとも90%の単核細胞又は少なくとも95%の単核細胞を含み、各可能性は本発明の別の実施形態である。いくつかの実施形態によれば、本発明の濃縮単核細胞調製物は、少なくとも80%の単核細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の濃縮単核細胞調製物は、少なくとも90%の単核細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の濃縮単核細胞調製物は、少なくとも95%の単核細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物は、リンパ球、単球及びナチュラルキラー細胞からなる群より選択される少なくとも1つの細胞種を含む。いくつかの実施形態によれば、単核細胞はリンパ球及び単球を含む。本明細書及び特許請求の範囲で使用される単核細胞は、1つの分葉核(lobed nucleus)を有する白血球である。
いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物の少なくとも40%が初期アポトーシス状態にある。他の実施形態によれば、本発明の細胞調製物の少なくとも40%、好ましくは約50%が初期アポトーシス状態にある。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物の40〜65%、好ましくは55〜60%が初期アポトーシス状態にある。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
当然のことながら、いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示された細胞調製物中の高パーセンテージの単核細胞は、白血球除去法、低温保存を用いる初期アポトーシス誘導、及びメチルプレドニゾロンによるインキュベーション、及び様々な洗浄ステップを含む)本明細書に以下に記載される、複数ステップの製造プロトコルに従って達成される。
いくつかの実施形態によれば、本発明の濃縮単核細胞調製物は、多核白血球及び好中球を含むがこれらに限定されない非単核白血球の低濃度を含む。濃縮単核細胞調製物は、顆粒球を含まないことが好ましい。
いくつかの実施形態によれば、顆粒球は、本発明の製造方法の様々なステップ中に崩壊する。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、顆粒球の15%以下、又は10%以下、典型的には5%以下を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、顆粒球は、本発明の製造方法の凍結及び解凍ステップ後に顕著な程度に崩壊する。いくつかの実施形態によれば、顆粒球は、本発明の製造方法の凍結及び解凍ステップ後に顕著な程度に崩壊し、凍結及び/又は解凍ステップ後の洗浄ステップ中に本発明の調製物から洗浄される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、顆粒球は崩壊し、本発明の製造方法の様々な洗浄ステップ中に本発明の細胞調製物から洗浄される。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、15%以下、場合により10%以下、典型的には5%以下の多核白血球を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は5%以下の多核白血球を含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、15%以下、又は10%以下、典型的には5%以下のCD15high発現細胞を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は5%以下のCD15high発現細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、明細書の以下で例証されるように、本発明の組成物は、1%以下のCD15high発現細胞を含む。本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、CD15high発現細胞は顆粒球である。
アポトーシスの初期の特徴は、血漿膜の形態的な変化である。この変化は、細胞膜の内層から外層までのリン脂質ホスファチジルセリン(PS)膜の転位を含む。カルシウムイオンの存在下で、アネキシンVはPSに対して高い特異性及び親和性を有する。従って、曝露されたPSを有する細胞へのアネキシンVの結合は、初期細胞性アポトーシスを検出する非常に感受性の高い方法を提供する。従って、本明細書で使用される、細胞の「初期アポトーシス状態」又は「初期アポトーシス細胞」は、無傷の細胞膜を依然と有する細胞集団を意味するが、該細胞集団は、DNA開裂を受け、ホスファチジルセリンの転位を受けたばかりである。本明細書で使用される初期アポトーシス細胞、又は初期アポトーシス状態にある細胞は、アネキシンVを用いて陽性に染色され、ヨウ化プロピジウム(PI)で陰性に染色される細胞である。初期アポトーシスの検出方法は、当分野で知られており、例えば、フローサイトメトリーによる、アネキシンV陽性及びヨウ化プロピジウム(PI)陰性の初期アポトーシス細胞検出である。いくつかの実施形態によれば、後期アポトーシス状態にある細胞は、フローサイトメトリーを用いて実証され得るように、アネキシンVを用いる陽性染色及びPIを用いる陽性染色によって検出され得る。PIは、膜不透過性であり、従って細胞膜の完全性が危険に曝されている細胞、例えば後期アポトーシス又は壊死細胞に入ることができるにすぎないことに留意されたい。いくつかの実施形態によれば、フローサイトメトリーを用いて実証され得るように、壊死細胞はPIに強い染色を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞集団中の細胞の少なくとも40%は、初期アポトーシス状態である。他のいくつかの実施形態によれば、本発明の細胞集団中の細胞の少なくとも50%又は少なくとも60%は、初期アポトーシス状態である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞集団は懸濁中の細胞を含む。別の実施形態によれば、本発明の細胞集団は、表面に接着するように細胞を誘導することによって調製されない。
本明細書で使用される細胞の「生存性」は、壊死又は後期アポトーシスを経ない細胞を意味する。従って、本明細書で使用される用語「生細胞」は、壊死を経ない細胞又は後期アポトーシス状態にない細胞を意味する。いくつかの実施形態によれば、用語「生細胞」は、無傷のプラズマ膜を有する細胞を意味する。細胞生存率を決定するアッセイ、例えばフローサイトメトリーを用いて検出され得るヨウ化プロピジウム(PI)染色は、当分野で知られている。従って、いくつかの実施形態によれば、生細胞はヨウ化プロピジウム取り込みを示さない細胞である。壊死は、光、蛍光又は電子顕微鏡技術によって、又は色素トリパンブルーの取り込みを介して更に同定され得る。
壊死とは異なった細胞死プロセスであるアポトーシスは、例えば正常細胞及び組織発達中に起こる、プログラム化されかつ秩序的な生理的な細胞の排除、病原感染細胞のT−リンパ球殺傷、及び変異的に損傷された細胞の自己排除である。アポトーシス細胞は、細胞質及び核での異なった形態的変化、規則的に間隔を置いた部位でのクロマチン開裂、及びヌクレオソーム間の部位でのゲノムDNAのヌクレオチド鎖切断によって特徴付けられる。例えばアネキシンVを用いる細胞アポトーシスを決定するためのアッセイは当分野で知られている。一方、壊死は、生じた細胞死の本質的に病原性の及びプロ炎症性のプロセスであるが、典型的には、致命的な細胞損傷後に酵素の制御不能でかつ進行性の分解作用によるものに限らない。壊死細胞は、典型的には、ミトコンドリア膨張、核凝集、細胞溶解、膜統合性の欠如、及び究極的な細胞死によって特徴付けられる。
いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物は、少なくとも85%、90%、95%の生細胞、又は少なくとも97%の生細胞を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。別の実施形態では、本発明の細胞調製物は、最大15%、10%、5%の壊死細胞又は後期アポトーシス状態の細胞、又は最大の3%の壊死細胞又は後期アポトーシス状態の細胞を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。更なる実施形態では、本発明の細胞調製物中の生細胞の高パーセンテージは、調製後少なくとも24時間維持する。いくつかの実施形態によれば、壊死細胞及び/又は後期アポトーシス状態の細胞は崩壊し、よって、本発明の製造方法の洗浄ステップ中に本発明の最終細胞調製物から実質的に除去される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
本発明のいくつかの実施形態によれば、自己免疫疾患(例えばGVHD)において治療免疫寛容を誘導するために、本発明の細胞調製物中の治療的濃縮単核細胞は、同種異型個体から得られることが好ましい。同種異型の濃縮単核細胞は、好ましくは、前記細胞を投与された対象とハプロタイプが一致する。ヒト対象のハプロタイプ一致は、治療的移植の点で、当分野できまって実施され、通常、HLA−A、HLA−B及びHLA−DRアレルの一致を含む。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞集団の起源は、HLAのA座、B座、C座及びDR座で少なくとも7/8でHLA一致の同種異型ドナーから得られる。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞調製物の起源は自家である。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は本発明の細胞調製物を含み、抗凝固剤を更に含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、本発明の細胞調製物を含み、残留メチルプレドニゾロンを更に含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、本発明の細胞調製物を含み、抗凝固剤及び残留メチルプレドニゾロンを更に含む。いくつかの実施形態によれば、残留メチルプレドニゾロンは、本発明の製造方法の使用後に本発明の医薬組成物中に残るメチルプレドニゾロンを意味する。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は抗凝固剤を含む。当業者に公知のように、本明細書で使用される抗凝固剤は、血液凝固を抑制し又は減少させる物質を意味する。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤はヘパリンである。他のいくつかの実施形態によれば、クエン酸デキストロース(ACD)フォーミュラAである。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、ACDフォーミュラA及びヘパリンを含む組成物である。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、約10U/mlの濃度でヘパリンを含むACDフォーミュラAである。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、ヘパリン、ACDフォーミュラA及びそれら組合せからなる群より選択される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物中の抗凝固剤の存在は、本組成物の製造方法の凍結及び/又はインキュベーション及び/又は洗浄段階中の抗凝固剤の添加に因る。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物の製造中の抗凝固剤の存在は、本明細書に記載のアポトーシス誘導に逆には影響しない。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物はヘパリンを含む。いくつかの実施形態によれば、ヘパリンは、硫酸化ヘテロ多糖ヘパリン、未分画ヘパリン(UFH)、低分子量ヘパリン(LMWH)及びそれらの組合せからなる群より選択される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、ヘパリンは合成ヘパリンであり、例えばフォンダパリヌクスなどであるが、これに限定されない。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、0.001〜3U/ml、又は0.005〜2.5U/ml、典型的に0.01〜1U/mlの濃度のヘパリンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、0.001〜2.5U/ml、又は0.001〜1U/ml、典型的に0.001〜0.5U/mlの濃度のヘパリンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、0.005〜1U/ml、又は0.005〜0.6U/ml、場合により0.005〜0.5U/mlの濃度のヘパリンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。他のいくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、0.01〜3U/ml、又は0.01〜2U/ml、又は0.01〜0.6U/mlの濃度のヘパリンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、0.01〜0.5U/mlの濃度のヘパリンを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、0.05〜0.25U/mlの濃度のヘパリンを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、0.01〜0.6U/mlの濃度のヘパリンを含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、最大3U/mlのヘパリン、典型的には最大2.5U/mlのへパリン、場合により最大1U/mlのへパリン、又は最大0.5U/mlのへパリンを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、少なくとも0.001U/mlのへパリン、又は少なくとも0.005U/mlのへパリン、場合により少なくとも0.01ヘパリンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、最大300U、又は最大150U、場合により最大75Uのヘパリンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、最大180Uのヘパリンを含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物中に含まれるヘパリンは、本発明の細胞調製物及び患者への細胞調製物の投与に使用される最終懸濁媒体を含む組成物中のヘパリンを意味する。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物中に含まれるACDフォーミュラAは、本発明の細胞調製物及び患者への細胞調製物の投与に使用される最終懸濁媒体を含む組成物中のヘパリンを意味する。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、0.5〜500Uのヘパリン、場合により0.5〜500Uのヘパリン、又は7〜180Uのヘパリンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物はACDフォーミュラAを含む。いくつかの実施形態によれば、ACDフォーミュラAは、クエン酸、デキストロース及びクエン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態によれば、ACDフォーミュラAは、クエン酸を0.73g/100mlの濃度で、デキストロース一水和物を2.45g/100mlの濃度で、及びクエン酸ナトリウム脱水物を2.20g/100mlの濃度で含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、ACDフォーミュラAを0.01〜10%v/v、又は0.05〜6%v/v、場合により0.1〜5%v/vの濃度で含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、ACDフォーミュラAを0.05〜10%v/v、場合により0.05〜6%v/v、又は0.05〜5%v/vの濃度で含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
別の実施形態によれば、本発明の組成物は、ACDフォーミュラAを0.1〜10%v/v、又は0.1〜6%v/v、場合により0.1〜5%v/vの濃度で含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、ACDフォーミュラAを0.5〜2.5%v/vの濃度で含む。ある実施形態では、本発明の組成物は、ACDフォーミュラAを0.05〜6%v/v、典型的には0.1〜6%v/vの濃度で含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、最大15ml、又は最大9ml、場合により最大7.5mlのACDフォーミュラAを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。あるいくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、最大18mlのACDフォーミュラAを含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、0.05〜40mlのACDフォーミュラA、場合により0.1〜25mlのACDフォーミュラA、又は0.7〜18mlのACDフォーミュラAを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、メチルプレドニゾロンを更に含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物中の残留メチルプレドニゾロンの存在は、細胞調製物の製造方法のインキュベーション段階におけるメチルプレドニゾロンの使用に起因する。いくつかの実施形態によれば、メチルプレドニゾロンは、本発明の細胞調製物の製造中に本発明で、該細胞が初期アポトーシス状態に入るように誘導される手法の一部として使用される。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、0.5〜30μg/ml、場合により1〜25μg/ml、典型的には3〜22μg/mlの濃度でメチルプレドニゾロンを更に含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、3.7〜21.9μg/mlの濃度でメチルプレドニゾロンを更に含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、30μg/mlを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを更に含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、30μg/ml、場合により25μg/mを超えない、典型的には21.9μg/mlを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを更に含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、0.5〜60μg/ml、場合により1.12〜60μg/mlの濃度でメチルプレドニゾロンを更に含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、60μg/mlを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを更に含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、少なくとも0.5μg/ml、場合により少なくとも1μg/ml、又は少なくとも3μg/mlのメチルプレドニゾロンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、少なくとも3.5μg/mlのメチルプレドニゾロンを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、少なくとも3.7μg/mlのメチルプレドニゾロンを含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、0.1〜25mgのメチルプレドニゾロン、場合により0.4〜20mgのメチルプレドニゾロン、又は0.67〜18mgのメチルプレドニゾロンを更に含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。本発明の組成物は、25mg、典型的には20mg、又は18mgを超えない量でメチルプレドニゾロンを更に含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、15mgを超えない量でメチルプレドニゾロンを更に含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含み、該調製物が少なくとも85%の単核細胞を含み、該調製物中の細胞の少なくとも40%が初期状態にあり、該調製物中の細胞の少なくとも85%が生細胞であり、該調製物が15%以下の多核白血球を含む。あるいくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含み、該調製物が少なくとも85%の単核細胞を含み、該調製物中の細胞の少なくとも40%が初期状態にあり、該調製物中の細胞の少なくとも85%が生細胞である。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含み、該調製物が少なくとも85%の単核細胞を含み、該調製物中の細胞の少なくとも40%が初期状態にあり、該調製物中の細胞の少なくとも85%が生細胞であり、該医薬組成物が抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、ヘパリン、ACDフォーミュラA及びそれらの組合せからなる群より選択される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含み、該調製物が少なくとも85%の単核細胞を含み、該調製物中の細胞の少なくとも40%が初期状態にあり、該調製物中の細胞の少なくとも85%が生細胞であり、該調製物が15%以下の多核白血球を含み、該医薬組成物が抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、ヘパリン、ACDフォーミュラA及びそれらの組合せからなる群より選択される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物中のヘパリンは、0.005〜2.5U/mlの濃度で存在する。他のいくつかの実施形態によれば、本発明の組成物中のACDフォーミュラAは、0.01〜10%v/v、又は0.05〜5%v/vの濃度で存在する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含み、該調製物が少なくとも85%の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも40%が初期状態にあり、調製物中の細胞の少なくとも85%が生細胞であり、調製物が15%以下の多核白血球を含み、組成物が30μg/mlを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含み、該調製物が少なくとも85%の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも40%が初期状態にあり、調製物中の細胞の少なくとも85%が生細胞であり、組成物が30μg/mlを超えない濃度でメチルプレドニゾロンを含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含み、該調製物が少なくとも85%の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも40%が初期状態にあり、調製物中の細胞の少なくとも85%が生細胞であり、調製物が15%以下の多核白血球を含み、組成物が抗凝固剤及びメチルプレドニゾロンを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物中のメチルプレドニゾロンの濃度は30μg/mlを超えない。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含み、該調製物が少なくとも85%の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも40%が初期状態にあり、調製物中の細胞の少なくとも85%が生細胞であり、調製物が抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物中のメチルプレドニゾロンの濃度は30μg/mlを超えない。
特定のいくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、約30×106〜300×106細胞/kg体重、約100×106〜300×106細胞/kg体重、又は約120×106〜250×106細胞/kg体重の用量で投与される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。特定のいくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、約35×106細胞/kg体重の用量で投与される。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、約140×106〜210×106細胞/kg体重の用量で投与される。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、約140×106細胞/kg体重の用量で投与される。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、約210×106細胞/kg体重の用量で投与される。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、約35×106〜210×106細胞/kg体重の用量で投与される。いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、約250×106細胞/kg体重の用量で投与される。他のいくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、約5×106細胞/kg体重の用量で投与される。当然のことながら、前記低用量は本明細書に開示された組成物の局所注射、例えば関節炎の治療のための関節への局所注射に好適である。
いくつかの実施形態によれば、本発明の治療的濃縮単核細胞は、全身的に、好ましくは静脈内経路によって対象に投与される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。あるいは、該治療的濃縮単核細胞は、非経口、腹腔内、関節内、筋肉内及び皮下経路を含む様々な他の経路に従って対象に投与され得る。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。好ましくは、該治療的濃縮単核細胞は、生理食塩水、PBS、HBSS等を含むがこれらに限定されない好適な生理的緩衝液に懸濁されて対象に投与される。更に、懸濁媒体は細胞の生存性の維持に役立つ補助剤を更に含んでよい。
アポトーシス細胞調製物の製造方法
別の態様によっては、本発明の医薬組成物の製造方法(本明細書では「本発明の製造方法」と称する)であって、ドナーの末梢血から、少なくとも65%の単核細胞を含む濃縮単核細胞調製物を取得するステップと、濃縮単核細胞調製物を凍結媒体中で凍結するステップと、濃縮単核細胞調製物を解凍するステップと、約10〜100μg/mLの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含むインキュベーション媒体中で、該濃縮単核細胞調製物をインキュベートするステップと、前記細胞調製物を投与媒体中に懸濁し、それによって本発明の医薬組成物を提供するステップとを含み、前記凍結媒体及び前記インキュベーション媒体の少なくとも1つは抗凝固剤を含むことを特徴とする製造方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従って得られた医薬組成物は、少なくとも85%の単核細胞を含む。更なる実施形態では、本医薬組成物は、少なくとも85%の単核細胞、90%の単核細胞又は90%超の単核細胞を含む。各可能性は本発明の別の実施形態である。いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、少なくとも90%の単核細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、少なくとも95%の単核細胞を含む。
いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従う濃縮単核細胞組成物を得ることは、白血球除去法によって行われる。本明細書で使用される用語「白血球除去法」は、白血球がドナー血液から分離されるアフェレーシス手段を意味する。いくつかの実施形態によれば、ドナー血液は白血球除去法を受け、よって、濃縮単核細胞組成物は本発明の製造方法に従って得られる。当分野で知られているように、回収された細胞の凝集を防ぐためには、白血球除去法中の少なくとも1つの抗凝固剤の使用が必要とされることに留意されたい。
いくつかの実施形態によれば、白血球除去法手法は、本発明の製造方法に従う濃縮単核細胞組成物の回収を可能にするように構成される。いくつかの実施形態によれば、白血球除去法によって得られた細胞回収は、少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、最も好ましくは少なくとも80%の単核細胞を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、細胞ドナー由来の血漿は、本発明の製造方法に従う濃縮単核細胞組成物の取得に並行して回収される。いくつかの実施形態によれば、細胞ドナー由来の約300〜600mlの血漿は、本発明の製造方法に従う濃縮単核細胞組成物の取得に並行して回収される。いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従う濃縮単核細胞組成物の取得に並行して回収される血漿は、凍結及び/又はインキュベーション媒体の一部として使用される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞集団は、細胞回収時に、少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、最も好ましくは少なくとも80%の単核細胞を含むが、本発明の方法に従う本発明の最終医薬組成物は、少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の単核細胞を含むことに留意されたい。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
特定の実施形態によれば、本発明の製造方法に使用される濃縮単核細胞集団は、細胞回収時に少なくとも50%の単核細胞を含む。あるいくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、本発明の製造方法であって、該方法がドナーの末梢血から濃縮単核細胞集団を得るステップを含み、該濃縮単核細胞集団は少なくとも50%の単核細胞を含むことを特徴とする製造方法を提供する。あるいくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、本発明の製造方法であって、少なくとも50%の単核細胞を含む濃縮単核細胞集団を凍結するステップを含むことを特徴とする製造方法を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従って得られた濃縮単核細胞調製物は、凍結媒体中での凍結を受ける。いくつかの実施形態によれば、凍結は徐々に進行する。いくつかの実施形態によれば、回収後に細胞は、凍結されるまで室温で維持される。いくつかの実施形態によれば、細胞調製物は細胞回収後であって凍結前に洗浄媒体中での少なくとも1つの洗浄ステップを経る。本明細書で使用される用語「細胞を取得する(得る)」及び「細胞回収」は同じ意味で使用される。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物の細胞は、回収の3〜6時間以内に凍結される。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物は、細胞の回収の6時間以内に凍結される。いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物は、細胞の回収の1、2、3、4、5、6、7、8時間以内に凍結される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。他のいくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物は、細胞の回収の最大8、12、24、48、72時間以内に凍結される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。他のいくつかの実施形態によれば、回収後、細胞は凍結されるまで2〜8℃で維持される。
いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従って凍結させるステップは、細胞調製物を約−18〜−25℃で凍結させ、その後、細胞調製物を約−80℃で凍結させ、最後に、解凍するまで液体窒素中で細胞調製物を凍結させるステップを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従って凍結させるステップは、細胞調製物を約−18〜−25℃で少なくとも2時間凍結させ、細胞調製物を約−80℃で少なくとも2時間凍結させ、最後に、解凍するまで液体窒素中で細胞調製物を凍結させるステップを含む。いくつかの実施形態によれば、細胞は、解凍前に少なくとも8、10又は12時間、液体窒素中で維持される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、細胞調製物中の細胞は、解凍、及びアポトーシス誘導インキュベーション媒体でインキュベートされるまで液体窒素中で維持される。いくつかの実施形態によれば、細胞調製物中の細胞は、造血幹細胞移植の日まで液体窒素中で維持される。非限定的な例によれば、細胞回収及び凍結から本発明の最終組成物の調製までの期間は1〜50日、又は6〜30日でよい。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。別の実施形態によれば、細胞調整物は、長期間、例えば少なくとも数ヶ月間、液体窒素中で維持され得る。
いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従って凍結させるステップは、細胞調製物を約−18〜−25℃で少なくとも0.5、1、2、4時間凍結させるステップを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従って凍結させるステップは、細胞調製物を約−18〜−25℃で約2時間凍結させるステップを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法に従って凍結させるステップは、細胞調製物を約−18℃で少なくとも0.5、1、2、4、12時間凍結させるステップを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、20ヶ月間凍結し続けることができる。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、少なくとも0.5、1、2、3、4、5年間凍結し続けることもできる。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、少なくとも20ヶ月間凍結し続けることができる。
いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、少なくとも8、10、12、18、24時間凍結される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、少なくとも8時間凍結される。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、少なくとも約10時間凍結される。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、少なくとも約12時間凍結される。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、約12時間凍結される。いくつかの実施形態によれば、(約−18〜−25℃で、約−80℃で、及び液体窒素中での)濃縮単核細胞組成物の総凍結時間は、少なくとも8、10、12、18、24時間である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、凍結は少なくとも一部では、濃縮単核細胞組成物の細胞において初期アポトーシス状態を誘導する。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体は、L−グルタミン、Hepes、Hes、ジメチルスルホキシド(DMSO)及び血漿を含むRPMI 1640培地を含む。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体中の血漿は、本発明の組成物の濃縮単核細胞を提供したドナーの自家血漿である。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体は、2mMのL−グルタミン、10mMのHepes、5%のHes、10%のジメチルスルホキシド及び20%v/vの血漿を含むRPMI 1640培地を含む。
いくつかの実施形態によれば、凍結媒体は抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体、インキュベーション媒体及び洗浄媒体を含む、本発明の製造方法中で使用された媒体の少なくとも一部は、抗凝固剤を含む。あるいくつかの実施形態によれば、抗凝固剤を含む本発明の製造方法中で使用された全ての媒体は、抗凝固剤と同一の濃度を含む。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、本発明の細胞調製物の最終懸濁媒体に添加されない。
いくつかの実施形態によれば、凍結媒体への少なくとも抗凝固剤の添加は、本発明の細胞調製物の収率を改善する。他のいくつかの実施形態によれば、凍結媒体への抗凝固剤の添加は、高トリグリセリドレベルの存在下で、本発明の細胞調製物の収率を改善する。本明細書において、本発明の細胞調製物の収率を改善は、凍結された細胞のうちの生細胞の割合(パーセンテージ)、生細胞のうちの初期状態アポトーシス細胞の割合、及びそれらの組合せのうち、少なくとも1つの改善に関する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物における細胞収率は、本発明に従うアポトーシス誘導に供された最初の細胞数の内の、組成物中の細胞数を意味する。本明細書で使用される用語「初期アポトーシス状態の誘導」及び「アポトーシスの誘導」は同じ意味で使用される。
いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞集団の収率の改善は、調製物が製造された凍結細胞数の内、調製物の初期アポトーシス生細胞数の改善を意味する。
いくつかの実施形態によれば、凍結媒体への抗凝固剤の添加は、本発明の医薬組成物の異なった調製物間の高くかつ安定した収率に寄与する。好ましい実施形態によれば、凍結媒体及びインキュベーション媒体への抗凝固剤の添加は、使用した細胞回収プロトコルにかかわらず、医薬組成物の異なった調製物間の高くかつ安定した収率をもたらす。
いくつかの実施形態によれば、凍結媒体は、ヘパリン、ACDフォーミュラA及びそれらの組合せからなる群より選択される抗凝固剤を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体中で使用される抗凝固剤は、10U/mlの濃度でヘパリンを含むACDフォーミュラAである。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体は、10U/mlの濃度でヘパリンを含む5%v/vのACDフォーミュラA溶液を含む。
いくつかの実施形態によれば、凍結媒体はヘパリンを含む。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体中のヘパリンは、0.1〜2.5U/mlの濃度である。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体中のヘパリンは、0.1〜2.5U/ml、場合により0.3〜0.7U/ml、典型的には約0.5U/mlの濃度である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体中のヘパリンは、約0.5U/mlの濃度である。
いくつかの実施形態によれば、凍結媒体はACDフォーミュラAを含む。いくつかの実施形態によれば、凍結培媒体中のACDフォーミュラAは1〜15%v/vの濃度である。いくつかの実施形態によれば、凍結培媒体中のACDフォーミュラAは、1〜15%v/v、場合により4〜7%v/v、典型的には約5%v/vの濃度である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、凍結培媒体中のACDフォーミュラAは、約5%v/vの濃度である。
いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、細胞回収後でかつ凍結媒体中に再懸濁されて凍結される前に、少なくとも洗浄ステップを経る。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、凍結及び解凍後に少なくとも1つの洗浄ステップを経る。いくつかの実施形態によれば、洗浄ステップは、濃縮単核細胞組成物の遠心、その後の上清抽出及び洗浄媒体中での再懸濁を含む。
いくつかの実施形態によれば、細胞回収は、濃縮単核細胞組成物を得ることを意味する。いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法中に行われる洗浄ステップは、洗浄媒体中で行われる。あるいくつかの実施形態によれば、洗浄ステップは、本発明の製造方法のインキュベーションステップの洗浄媒体中で行われるまで行われる。いくつかの実施形態によれば、洗浄培体は、L−グルタミン及びHepesで補完されたRPMI 1640培地を含む。いくつかの実施形態によれば、洗浄培体は、2mMのL−グルタミン及び10mMのHepesで補完されたRPMI 1640培地を含む。
いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体は抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体は、ヘパリン、ACDフォーミュラA及びそれらの組合せからなる群より選択される抗凝固剤を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体中の抗凝固剤の濃度は、凍結媒体中のそれと同一の濃度である。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体中の抗凝固剤の濃度は、インキュベーション媒体中のそれと同一の濃度である。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体で使用される抗凝固剤は、10U/mlの濃度でヘパリンを含むACDフォーミュラAである。
いくつかの実施形態によれば、洗浄培体はヘパリンを含む。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体中のヘパリンは、0.1〜2.5U/mlの濃度である。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体中のヘパリンは、0.1〜2.5U/ml、場合により0.3〜0.7U/ml、典型的には約0.5U/mlの濃度である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。あるいくつかの実施形態によれば、洗浄媒体中のヘパリンは約0.5U/mlの濃度である。
いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体はACDフォーミュラAを含む。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体中のACDフォーミュラAは、1〜15%v/vの濃度である。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体中のACDフォーミュラAは、1〜15%v/v、場合により4〜7%v/v、典型的には約5%v/vの濃度である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体中のACDフォーミュラAは約5%v/vの濃度である。
いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、本発明の組成物の対象への意図した投与の数時間前に解凍される。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、約33℃〜39℃で解凍される。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、約30〜240秒、好ましくは40〜180秒、最も好ましくは50〜120秒間解凍される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、本発明の組成物の意図した投与の少なくとも10時間前、又は本発明の組成物の意図した投与の少なくとも20、30、40又は50時間前に解凍される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、本発明の組成物の意図した投与の少なくとも15〜24時間前に解凍される。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、本発明の組成物の意図した投与の少なくとも24時間前に解凍される。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、本発明の組成物の意図した投与の少なくとも20時間前に解凍される。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、本発明の組成物の意図した投与の少なくとも30時間前に解凍される。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、本発明の組成物の意図した投与の少なくとも24時間前に解凍される。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、解凍前及び/又は後に洗浄媒体中での少なくとも1つの洗浄ステップを経る。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、凍結及び解凍後にインキュベーション媒体中でインキュベートされる。いくつかの実施形態によれば、解凍とインキュベーションとの間に少なくとも1つの洗浄ステップがある。本明細書で用いる用語「インキュベーション媒体」及び「アポトーシス誘導インキュベーション媒体」は同じ意味で使用される。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体は、L−グルタミンで補完したRPMI 1640培地、Hepesメチルプレドニゾロン及び血漿を含む。いくつかの実施形態によれば、洗浄媒体は、2mMのL−グルタミン、10mMのHepes及び10%v/vの血漿を含む。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中の血漿は、本発明の細胞調製物の細胞が得られた同一ドナーから得られる。いくつかの実施形態によれば、血漿はインキュベーションの日にインキュベーション媒体に添加される。いくつかの実施形態によれば、インキュベーションは37℃で、5%CO2で行われる。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体は、メチルプレドニゾロンを含む。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中のメチルプレドニゾロンは、濃縮単核細胞組成物中の細胞を更に誘導して、初期アポトーシス状態にさせる。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物中の細胞は、メチルプレドニゾロンの存在下に凍結及びインキュベートすることによって初期アポトーシス状態に入るように誘導される。いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法は、有利には、壊死の誘導なしに実質的に初期アポトーシス状態の誘導を可能にし、細胞は、調製後約24時間、前記初期アポトーシス状態で安定である。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体は、約10〜100μg/mlの濃度でメチルプレドニゾロンを含む。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体は、約40〜60μg/ml、又は約45〜55μg/mlの濃度でメチルプレドニゾロンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体は、50μg/mlの濃度でメチルプレドニゾロンを含む。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーションは、約2〜12時間、場合により4〜8時間、典型的には約5〜7時間である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、インキュベーションは約6時間である。いくつかの実施形態によれば、インキュベーションは少なくとも約6時間である。好ましい実施形態では、インキュベーションは6時間である。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体は抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤のインキュベーション媒体への添加は、本発明の細胞集団の収率を改善する。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中の抗凝固剤は、凍結媒体中と同一濃度である。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体は、ヘパリン、ACDフォーミュラA及びそれらの組合せからなる群より選択される抗凝固剤を含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中で使用される抗凝固剤は、10U/mlの濃度でヘパリンを含むACDフォーミュラAである。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体はヘパリンを含む。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中のヘパリンは、0.1〜2.5U/mlの濃度である。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中のヘパリンは、0.1〜2.5U/ml、場合により0.3〜0.7U/ml、典型的には約0.5U/mlの濃度である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。あるいくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中のヘパリンは約0.5U/mlの濃度である。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体はACDフォーミュラAを含む。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中のACDフォーミュラAは、1〜15%v/vの濃度である。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中のACDフォーミュラAは、1〜15%v/v、場合により4〜7%v/v、典型的には約5%v/vの濃度である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体中のACDフォーミュラAは、約5%v/vの濃度である。
いくつかの実施形態によれば、凍結媒体及びインキュベーション媒体の両方は抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体及びインキュベーション媒体の両方への抗凝固剤の添加は、例えば細胞回収中に添加された抗凝固剤の添加時期及び種類に限定されない細胞回収条件にかかわらず、本発明の組成物の異なった調製物間で高くかつ安定した細胞収率をもたらす。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体及びインキュベーション媒体の両方への抗凝固剤の添加は、白血球除去法中の抗凝固剤の添加時期及び/又は種類にかかわらず、本発明の細胞調製物の高くかつ安定した細胞収率をもたらす。いくつかの実施形態によれば、高トリグリセリドレベルの存在下での本発明の細胞調製物の製造は、異なった調製物間で低く及び/又は不安定な細胞収率をもたらす。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、高トリグリセリドレベルを有するドナーの血液から細胞調製物を製造することは、低く及び/又は不安定な細胞収率をもたらす。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、用語「高トリグリセリドレベル」は、同一の性別及び年齢の健常対象の正常レベルを超えるトリグリセリドレベルを意味ずる。いくつかの実施形態によれば、用語「高トリグリセリドレベル」は、約1.7ミリモル/リットルを超えるトリグリセリドレベルを意味ずる。本明細書で使用される高くかつ安定な収率は、対象に投与する時に治療的効果を示す用量の調製を可能にする十分に高い、本発明の組成物の細胞収率を意味する。いくつかの実施形態によれば、治療的効果は、対象における免疫疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患を治療、予防又は緩和する能力を意味する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、高くかつ安定な細胞収率は、最初に凍結された細胞のうちの、本発明の組成物中の細胞の少なくとも30%、場合により少なくとも40%、典型的には少なくとも50%の細胞収率である。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞調製物が高トリグリセリドレベルを有するドナーから得られる場合には、該ドナーは、供与前にトリグリセリド低下媒体(例えばスタチン及び/又はベザフィブラートであるが、これらに限定されない)を投与される、供与前に少なくとも8、10、12時間絶食する、供与の少なくとも24、48、72時間前に血中トリグリセリドレベルを減少させるために適切な食事をとる、及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも1つの手段をとることになる。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体及び/又は凍結媒体への抗凝固剤の添加は、ドナーの血中のトリグリセリドレベルにかかわらず、本発明の組成物に高くかつ安定した細胞収率をもたらす。いくつかの実施形態によれば、インキュベーション媒体及び/又は凍結媒体への抗凝固剤の添加は、正常又は高トリグリセリドレベルを有するドナーの血液から得られる場合に、本発明の組成物に高くかつ安定した細胞収率をもたらす。いくつかの実施形態によれば、少なくともインキュベーション媒体への抗凝固剤の添加は、ドナーの血中のトリグリセリドレベルにかかわらず、本発明の組成物に高くかつ安定した細胞収率をもたらす。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体及びインキュベーション媒体への抗凝固剤の添加は、ドナーの血中のトリグリセリドレベルにかかわらず、本発明の組成物に高くかつ安定した細胞収率をもたらす。
いくつかの実施形態によれば、凍結媒体及び/又はインキュベーション媒体及び/又は洗浄媒体は、少なくとも0.1U/ml、場合により少なくとも0.3U/ml、典型的に少なくとも0.5U/mlの濃度でヘパリンを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態によれば、凍結媒体及び/又はインキュベーション媒体及び/又は洗浄媒体は、少なくとも1%v/v、場合により少なくとも3%v/v、典型的に少なくとも5%v/vの濃度でACDフォーミュラAを含む。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、本発明の製造方法の各段階間で少なくとも1つの洗浄ステップを経る。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、本発明の製造方法に渡って洗浄ステップ中に洗浄媒体に添加される。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、インキュベーション後に少なくとも1つの洗浄ステップを経る。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、PBSを用いるインキュベーション後に少なくとも1つの洗浄ステップを経る。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、投与媒体での細胞調製物の再懸濁前に最終の洗浄ステップに添加されない。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は、投与媒体での細胞調製物の再懸濁前に最終の洗浄ステップで使用されるPBSに添加されない。いくつかの実施形態によれば、抗凝固剤は投与媒体に添加されない。
いくつかの実施形態によれば、インキュベーション中の細胞濃度は、約5×106細胞/mlである。
いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、凍結、解凍及びインキュベーション後に投与媒体に懸濁され、それによって本発明の医薬組成物を与える。いくつかの実施形態によれば、投与媒体は好適な生理的緩衝液を含む。好適な生理的緩衝液の非限定例は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)等である。いくつかの実施形態によれば、投与媒体はPBSを含む。いくつかの実施形態によれば、投与媒体は、細胞の生存性の維持を助ける補助剤を含む。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、投与前に濾過される。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、少なくとも200μmのフィルターを用いて投与前に濾過される。
いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、得られる細胞調製物の最終体積が100〜1000ml、場合により200〜800ml、典型的には300〜600mlとなるように投与媒体に再懸濁される。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、本発明の医薬組成物の製造方法であって、少なくとも65%の単核細胞を含む濃縮単核細胞調製物を凍結媒体中で凍結するステップと、濃縮単核細胞調製物を解凍するステップと、約10〜100μg/mLの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含むインキュベーション媒体中で、濃縮単核細胞調製物をインキュベートするステップと、前記細胞調製物を投与媒体中で再構築し、それによって本発明の医薬組成物を提供するステップとを含み、前記凍結媒体及び前記インキュベーション媒体の少なくとも1つは抗凝固剤を含むことを特徴とする製造方法を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物の製造方法は、濃縮単核細胞組成物を取得するステップを更に含む。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、ドナーの末梢血から得られる。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、移植のために使用される同一のドナーの末梢血から得られる。いくつかの実施形態によれば、濃縮単核細胞組成物は、HSCTについては同一のドナー提供細胞の末梢血から得られる。いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法のための濃縮単核細胞組成物は、取得時に造血幹細胞動員を経ないドナーから得られる。いくつかの実施形態によれば、本発明の製造方法のための濃縮単核細胞組成物は、取得時に顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)での処理を受けないドナーから得られる。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、本発明の医薬組成物の製造方法であって、ドナーの末梢血から少なくとも65%の単核細胞を含む濃縮単核細胞調製物を取得するステップと、濃縮単核細胞調製物を、抗凝固剤を含む凍結媒体中で凍結するステップと、濃縮単核細胞調製物を解凍するステップと、濃縮単核細胞調製物をインキュベートするステップと、前記細胞調製物を投与媒体中に懸濁し、それによって、本発明の医薬組成物を提供するステップとを含み、インキュベーション媒体は、抗凝固剤及び約50μg/mLの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含むことを特徴とする製造方法を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、本発明の細胞調製物であって、本発明の製造方法によって製造される細胞調製物を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含む医薬組成物であって、該調製物は少なくとも85%の単核細胞を含み、該調製物中の該細胞の少なくとも40%は初期アポトーシス状態にあり、該調製物中の該細胞の少なくとも85%は生細胞であり、当該医薬組成物が、ドナーの末梢血から、少なくとも65%の単核細胞を含む濃縮単核細胞調製物を取得するステップと、濃縮単核細胞調製物を凍結媒体中で凍結するステップと、濃縮単核細胞調製物を解凍するステップと、濃縮単核細胞調製物を、約10〜100μg/mLの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含むインキュベーション媒体中でインキュベートするステップと、細胞調製物を投与媒体中に懸濁し、それによって、本発明の医薬組成物を提供するステップとを含み、凍結媒体及びインキュベーション媒体の少なくとも1つは抗凝固剤を含む製造方法によって製造される、医薬組成物を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含む医薬組成物であって、調製物は少なくとも85%の単核細胞を含み、調製物中の該細胞の少なくとも40%は初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも85%は生細胞であり、当該医薬組成物が、ドナーの末梢血から、少なくとも65%の単核細胞を含む濃縮単核細胞調製物を取得するステップと、濃縮単核細胞調製物を、抗凝固剤を含む凍結媒体中で凍結するステップと、濃縮単核細胞調製物を解凍するステップと、濃縮単核細胞調製物を、抗凝固剤及び約50μg/mLの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含むインキュベーション媒体中でインキュベートするステップと、細胞調製物を投与媒体中に懸濁し、それによって、本発明の医薬組成物を提供するステップとを含む製造方法によって製造されることを特徴とする医薬組成物を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含む医薬組成物であって、調製物は少なくとも85%の単核細胞を含み、調製物中の該細胞の少なくとも40%は初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも85%は生細胞であり、調製物は15%以下の多核白血球を含み、当該医薬組成物が、ドナーの末梢血から、少なくとも65%の単核細胞を含む濃縮単核細胞調製物を取得するステップと、濃縮単核細胞調製物を凍結媒体中で凍結するステップと、濃縮単核細胞調製物を解凍するステップと、濃縮単核細胞調製物を、約10〜100μg/mLの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含むインキュベーション媒体中でインキュベートするステップと、細胞調製物を投与媒体中に懸濁し、それによって、本発明の医薬組成物を提供するステップとを含み、凍結媒体及びインキュベーション媒体の少なくとも1つは抗凝固剤を含む製造方法によって製造される、医薬組成物を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、濃縮単核細胞を含む細胞調製物を含む医薬組成物であって、調製物は少なくとも85%の単核細胞を含み、調製物中の該細胞の少なくとも40%は初期アポトーシス状態にあり、調製物中の該細胞の少なくとも85%は生細胞であり、調製物は15%以下の多核白血球を含み、当該医薬組成物が、ドナーの末梢血から、少なくとも65%の単核細胞を含む濃縮単核細胞調製物を取得するステップと、濃縮単核細胞調製物を、抗凝固剤を含む凍結媒体中で凍結するステップと、濃縮単核細胞調製物を解凍するステップと、濃縮単核細胞調製物を、抗凝固剤及び約50μg/mLの最終濃度でメチルプレドニゾロンを含むインキュベーション媒体中でインキュベートするステップと、細胞調製物を投与媒体中に懸濁し、それによって、本発明の医薬組成物を提供するステップとを含む製造方法によって製造されることを特徴とする医薬組成物を提供する。各可能性は本発明の別の実施形態を示す。
定義
用語「〜を含む」、「〜を有する」及びそれらの変化形は、「〜を含むが、それに限定されない」ことを意味する。
用語「〜から成る」は、「〜を含み、かつ限定されない」ことを意味する。
用語「本質的になる」は、組成物、方法又は構造が追加の成分、ステップ及び/又は部分を含み得るが、該追加の成分、ステップ及び/又は部分がクレームされた組成物、方法又は構造の基本的及び新規な特徴を物質的に変更しない場合に限る。
本明細書で使用される用語「v/v」及び「vol/vol」は同じ意味で使用され、体積/体積濃度を意味する。
本明細書においては、単数形で記述されている場合であっても、他に明確に定義しない限り、複数の形態を含む。例えば、用語「化合物」又は「少なくとも1つの化合物」は、複数の化合物(それらの混合物を含む)を含む。
本明細書を通して、本発明の様々な実施形態は範囲形式で示される。範囲形式での記載は簡便及び簡潔さのためのみであり、本発明の範囲に対する確固たる限定と解されるべきではないことを理解されたい。従って、範囲の記載は、可能な下位範囲の全て及び該範囲内の個々の数値を具体的に開示していると解釈されたい。例えば、1〜6のような範囲の記載は、下位範囲、例えば1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6等、及び該範囲内の個々の数値、例えば1、2、3、4、5及び6を具体的に開示していると解釈されたい。このことは、範囲の広さに依らない。
本明細書に数値範囲が示されている時は常に、指摘された範囲内の任意の記載された数値(少数・分数、又は整数)を含むことを意味する。1番目に示した数「〜」2番目に示した数「の範囲」、及び1番目に示した数「から」2番目に示した数「までの範囲」という用語は、本明細書で同じ意味で使用され、1番目に示した数、2番目に示した数、及び両者間の全ての少数・分数及び整数を含むことを意味する。
本明細書で使用される用語「約」は、記述値±10%を意味する。
本明細書で使用される用語「方法」は、所定の業務を遂行するための方法、手段、技術及び手法を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学及び医薬分野の実務者に公知であるか、又は彼らによって公知の方法、手段、技術及び手法から容易に開発されたかのいずれかの、方法、手段、技術及び手法を含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される用語「治療すること」は、症状の進行を解消し、実質的に阻害し、遅らせ、又は逆転させ、症状の臨床的又は美容的な症候を実質的に緩和し、又は症状の臨床的若しくは美容的な症候の出現を実質的に抑制することを含む。
好ましくは、本発明の方法は、ヒト対象等の哺乳動物対象において疾患を治療するために使用される。該方法が、本明細書に記載のような成功的な臨床試験相1/2aの点から、ヒト対象を治療するために使用され得ることは容易に理解できよう。
明確化のために、別の実施形態の文脈に記載される本発明のある特徴は、1つの実施形態では、組み合わせて提供されてもよい。反対に、簡略化のために、1つの実施形態の文脈に記載される本発明の様々な特徴は、別個に、又は任意の好適なサブコンビネーションで、又は好適には本発明の任意の他の記載の実施形態で、提供されてもよい。様々な実施形態の文脈に記載のある特徴は、該実施形態がこれらの要素なしには実施不可でなければ、これらの実施形態の必須の特徴とは見なされない。
上に記載された及び以下の請求項でクレームされた本発明の様々な実施形態及び局面は、以下の実施例に実験的支持がある。
実施例
本明細書に開示する実施例1〜4において以下の方法を用いた。
ApoCellの分析方法及び規格
幾つかの製造段階中にApoCellを試験した。アポトーシス誘導に先立ち採取した濃縮単核球及び最終ApoCell調製品に関連する品質管理試験、試験方法、試験施設、及び規格を下表3に記載する。
幾つかの製造段階中にApoCellを試験した。アポトーシス誘導に先立ち採取した濃縮単核球及び最終ApoCell調製品に関連する品質管理試験、試験方法、試験施設、及び規格を下表3に記載する。
臨床投与へ向けての出荷に先立ちApoCellをさらに試験した。製品出荷へ向けての品質管理試験、試験方法、試験施設、及び規格を下表4に示す。無菌性及び力価試験は製品出荷後に実施した。
細胞数
細胞数は白血球(WBC)数から得られる。
細胞数は白血球(WBC)数から得られる。
細胞生存率
細胞生存率をヨウ化プロピジウム染色によりフローサイトメトリーで測定した。
細胞生存率をヨウ化プロピジウム染色によりフローサイトメトリーで測定した。
同一性/純度
シスメックス(SYSMEX)血球分析装置の百分率数から、採取した濃縮単核球の同一性及び純度を決定した。同一性/純度を白血球数のリンパ球と単球のパーセンテージの和により算出した。血球分析装置により単核球パーセンテージが30%未満であった場合は、別の評価方法を使用することができる。すなわち、特異的認識抗体を用いたフローサイトメトリーでは、CD15及びCD14用の二重染色が実施され、顆粒球のパーセンテージがCD15highCD14low−neg細胞のパーセンテージとして測定されることになる。CD15highCD14low−neg細胞部分が70%未満であった場合、その採取分は以降のプロセスで使用可能ということになる。もし70%を超えた場合は、当該採取分は廃棄される。代替として、顆粒球パーセンテージを測定する同等試験を用いることができる。
シスメックス(SYSMEX)血球分析装置の百分率数から、採取した濃縮単核球の同一性及び純度を決定した。同一性/純度を白血球数のリンパ球と単球のパーセンテージの和により算出した。血球分析装置により単核球パーセンテージが30%未満であった場合は、別の評価方法を使用することができる。すなわち、特異的認識抗体を用いたフローサイトメトリーでは、CD15及びCD14用の二重染色が実施され、顆粒球のパーセンテージがCD15highCD14low−neg細胞のパーセンテージとして測定されることになる。CD15highCD14low−neg細胞部分が70%未満であった場合、その採取分は以降のプロセスで使用可能ということになる。もし70%を超えた場合は、当該採取分は廃棄される。代替として、顆粒球パーセンテージを測定する同等試験を用いることができる。
ApoCell製品出荷前の同一性/純度をフローサイトメトリー分析により決定し、顆粒球の割合を評価した。CD15及びCD14の二重染色を実施し、顆粒球のパーセンテージをCD15highCD14low−neg細胞のパーセンテージとして測定した。
同一性:アポトーシス表現型
アポトーシスは、2色フローサイトメーターによるアッセイでアネキシン及びヨウ化プロピジウムの染色(An+PI−)を評価して測定した。
アポトーシスは、2色フローサイトメーターによるアッセイでアネキシン及びヨウ化プロピジウムの染色(An+PI−)を評価して測定した。
無菌性
ドナー細胞の各ロットは、連邦規則集(FDA)の21CFR610.12に則った「直接無菌性試験法」を使用して無菌性について試験する。試料を毎日モニタリングし、測定値を接種後14日目に記録する。
ドナー細胞の各ロットは、連邦規則集(FDA)の21CFR610.12に則った「直接無菌性試験法」を使用して無菌性について試験する。試料を毎日モニタリングし、測定値を接種後14日目に記録する。
エンドトキシン(LAL)
Endosafe−PTSは、FDAの認可を受けたエンドトキシン検出システムであり、携帯型分光光度計とともにLAL試験カートリッジを使用し、測定したその場で結果が得られる。PTSにより、定量的なLAL試験結果が約15分で得られる。
Endosafe−PTSは、FDAの認可を受けたエンドトキシン検出システムであり、携帯型分光光度計とともにLAL試験カートリッジを使用し、測定したその場で結果が得られる。PTSにより、定量的なLAL試験結果が約15分で得られる。
力価
未熟DC(iDC)をApoCell調製6日前にヴェルボヴェツキ(Verbovetski)らの文献(JEM 2002)の記載にあるように調製した。簡単に言うと、細胞調製物のドナー又はレシピエント以外の対象に由来する未熟単球由来樹状細胞を血液バフィーコートのCD14+選択分画から作製した。PBMCをFicoll(GEヘルスケアライフサイエンス社(GE Healthcare Life Sciences)製、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)を用いて単離し、PBMCから単球を単離するために抗CD14磁気のビーズを製造者の指示(BDバイオサイエンス社(BD Biosciences)製、米国カリフォルニア州サンノゼ)に従って使用した。単球を、1%自己由来血漿、GMCSF(0.1μg/ml)、及びIL−4(0.1μg/ml)(ペプロテック社(PeproTech)製、米国ニュージャージー州ロッキー・ヒル)の存在下の培地のウェルに濃度1.25×106/1.5mlで置いた。2日おきに0.15mlを取り除き、血漿、IL−4(0.05μg/ml)、及びGMCSF(0.1μg/ml)含有培地0.25mlを添加した。6日目までに、90%を超える細胞がCD14−で、DR、CD−83、及びCD−86を低発現していた。iDCに対してApoCellをDC:ApoCell比1:2、1:4、及び1:8で一晩(16〜24時間)導入した。処理によっては、抗炎症作用を評価するために、相互作用から2時間後に10ng/mlのLPSを添加した。相互作用後、細胞を回収し、DCsign(iDCの同一性確認用)及びHLA−DR又はCD86(炎症誘発性免疫反応の評価用)の双方で染色した。対照としてアイソタイプ・コントロールを使用した。樹状細胞上のHLA−DR及びCD86の発現(DCsign陽性細胞)をフローサイトメトリー(FACSキャリバー、ベクトン・ディッキンソン社(Becton Dickenson)製、米国カリフォルニア州サンノゼ)を用いて評価した。FCS expressソフトウェアを用いてDCsing陽性細胞(10000イベント)の分析を実施した。
未熟DC(iDC)をApoCell調製6日前にヴェルボヴェツキ(Verbovetski)らの文献(JEM 2002)の記載にあるように調製した。簡単に言うと、細胞調製物のドナー又はレシピエント以外の対象に由来する未熟単球由来樹状細胞を血液バフィーコートのCD14+選択分画から作製した。PBMCをFicoll(GEヘルスケアライフサイエンス社(GE Healthcare Life Sciences)製、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)を用いて単離し、PBMCから単球を単離するために抗CD14磁気のビーズを製造者の指示(BDバイオサイエンス社(BD Biosciences)製、米国カリフォルニア州サンノゼ)に従って使用した。単球を、1%自己由来血漿、GMCSF(0.1μg/ml)、及びIL−4(0.1μg/ml)(ペプロテック社(PeproTech)製、米国ニュージャージー州ロッキー・ヒル)の存在下の培地のウェルに濃度1.25×106/1.5mlで置いた。2日おきに0.15mlを取り除き、血漿、IL−4(0.05μg/ml)、及びGMCSF(0.1μg/ml)含有培地0.25mlを添加した。6日目までに、90%を超える細胞がCD14−で、DR、CD−83、及びCD−86を低発現していた。iDCに対してApoCellをDC:ApoCell比1:2、1:4、及び1:8で一晩(16〜24時間)導入した。処理によっては、抗炎症作用を評価するために、相互作用から2時間後に10ng/mlのLPSを添加した。相互作用後、細胞を回収し、DCsign(iDCの同一性確認用)及びHLA−DR又はCD86(炎症誘発性免疫反応の評価用)の双方で染色した。対照としてアイソタイプ・コントロールを使用した。樹状細胞上のHLA−DR及びCD86の発現(DCsign陽性細胞)をフローサイトメトリー(FACSキャリバー、ベクトン・ディッキンソン社(Becton Dickenson)製、米国カリフォルニア州サンノゼ)を用いて評価した。FCS expressソフトウェアを用いてDCsing陽性細胞(10000イベント)の分析を実施した。
少なくとも1比の少なくとも1マーカーにおける有意な(コルゴモロフ・スミルノフ分析)ダウンレギュレーションを、ApoCellと相互作用させた後にDCの寛容化表現型用マーカーとして使用した。
試験デザイン及び患者
ApoCellの第1/2a相多施設共同臨床試験(clinicaltrials.gov登録番号:NCT00524784)をHLA一致同胞の同種骨髄移植を受ける被検者に実施した。ApoCell投与の安全性忍容性及び予備的有効性を評価するため試験を実施した。
ApoCellの第1/2a相多施設共同臨床試験(clinicaltrials.gov登録番号:NCT00524784)をHLA一致同胞の同種骨髄移植を受ける被検者に実施した。ApoCell投与の安全性忍容性及び予備的有効性を評価するため試験を実施した。
試験の主要評価項目は、HLA一致同胞の同種骨髄移植を受ける被検者に移植後180日以内にApoCellを用量漸増投与した場合の安全性プロファイル及び忍容性(用量制限毒性(DLT))を検討することとした。
副次的評価項目は、同種骨髄移植(alloBMT)生着成功率及び生着成功までの期間を測定し、ApoCell注入後の急性GVHDの発生率とグレードを記載し、ApoCell注入及びalloBMT後のレシピエントの免疫機能を検討することとした。転帰評価のため、以下のパラメータを用いた:好中球及び血小板回復までの期間、好中球の完全ドナー型キメラ状態までの期間、生着不全、再発又は悪性化した被検者の割合、感染症の発生率(細菌性、ウイルス性、真菌性)、45日目(ApoCell注入の46日後)、100日目及び180日目の被検者の全生存率、180日目の急性GvHD未発症の被検者の生存割合、ApoCell注入後の急性GvHDの発症率とグレード、グレードIII〜IVの急性GvHDを発症した被検者の割合、急性GvHD発症までの期間。追加の副次的評価項目として生着までの期間及び退院までの期間を含めた。
初期ApoCell用量(コホート1)は35×106アポトーシス細胞/kgとし、移植前日(−1日目)にApoCellの予備的安全性プロファイルを評価するため、まず患者1人の採用で開始し、その後引き続き、さらに2人の被検者を第1のコホートに採用した。1人目の患者のApoCell注入は、45日目の試験の実施計画書で規定された安全性基準を満たしており、続いて2人目の患者に同一用量で試験したところ、やはり試験の実施計画書で規定された安全性基準を満たしていた。その後、試験は次の相へ移り、データ及び安全性モニタリング委員会(DSMB)により、各コホート1〜3の31日目の試験終了後、及びコホート4の45日目の試験終了後に安全性データの中間解析が実施された。いずれのコホートもDSMB基準を満たし、試験の終了が許可された。
初期計画は、各コホートにつき3人の患者を採用することであった。しかし、7人目の患者は140×106細胞/kgではなくわずか90×106細胞/kgしか投与を受けなかったため、ただちに第2コホート(70×106細胞/kg)に追加例として含めた。1、3及び4コホートが各3人、コホート2が4人で、計13人の患者が治療を受けた。
適格基準には以下を含めた:成人男性又は女性被検者であること、年齢が18〜60歳であること、スクリーニング受診時の体重が少なくとも40kgであること、及びベースライン受診時の余命が少なくとも6ヶ月であること。被検者は、移植が適切とされるいかなる疾患のHLA一致同胞の同種骨髄移植(alloBMT)にも適格とされたが、進行性又はコントロール不良の悪性腫瘍は除外された。遺伝子型がHLA一致の同胞、表現型がHLA一致の一等親から移植できること、HLAのA座、B座、C座及びDR座で少なくとも7/8のHLA一致であること、及び臨床医の骨髄破壊的レジメンの判断が要件とされた。
除外基準は、妊娠、血清学的陽性HIV、活動性の重篤な感染症、T細胞を除去した同種移植片;カルノフスキーのパフォーマンスステータス(Karnofsky performance status:KPS)が80%未満、又は重篤な臓器機能不全(例えば、予測値に対する左室駆出率<40%、努力肺活量<60%、肝臓トランスアミナーゼ>2.5×正常値上限、又は血清ビリルビン>3mg/dL又はクレアチニン>221μmol/L(2.5mg/dL)であった。
前処置レジメン及び対症療法
患者の前処置レジメンは、ブスルファンベース又は全身照射(TBI)ベースのいずれかとした。ブスルファンの場合は、経口ブスルファン16mg/kg×4日とサイトキサン120mg/kg、又はFlu−Bu2−TT2の場合は、フルダラビン30mg/kg/日を5又は6日、ブスルファンI.V3.2mg/kg/日を2日又は4日、チオテパI.V.5mg/kg/日を2日(レジメン名:FBT)とした。TBIベースのレジメンでは、シクロホスファミドI.V.60mg/kgを2日又はエトポシド(VP−16)60mg/kgを、少なくとも1200cGyの分割TBI用量の全身照射とともに投与した。シクロホスファミドとTBIの投与順序は各施設の移植センターの判断によるが、全患者ともシクロホスファミドとTBIを同じ順序で投与を受けることとした。シクロホスファミド又はVP16(エトポシド)の投与が最後になった場合、末梢血幹細胞注入まで少なくとも1日の休薬期間を置かなければならないとした。分割TBIを施設のプロトコルに従い投与した。メスナは可能ではあるが、必須ではない。しかし、各参加施設はその施設のガイドラインに従った前処置レジメンを用いることができたが、骨髄破壊的で、かつそのセンターの試験対象患者全員に対して使用することが条件とされた。抗胸腺細胞(ATG)による前処置レジメンは禁止した(除外基準)。
患者の前処置レジメンは、ブスルファンベース又は全身照射(TBI)ベースのいずれかとした。ブスルファンの場合は、経口ブスルファン16mg/kg×4日とサイトキサン120mg/kg、又はFlu−Bu2−TT2の場合は、フルダラビン30mg/kg/日を5又は6日、ブスルファンI.V3.2mg/kg/日を2日又は4日、チオテパI.V.5mg/kg/日を2日(レジメン名:FBT)とした。TBIベースのレジメンでは、シクロホスファミドI.V.60mg/kgを2日又はエトポシド(VP−16)60mg/kgを、少なくとも1200cGyの分割TBI用量の全身照射とともに投与した。シクロホスファミドとTBIの投与順序は各施設の移植センターの判断によるが、全患者ともシクロホスファミドとTBIを同じ順序で投与を受けることとした。シクロホスファミド又はVP16(エトポシド)の投与が最後になった場合、末梢血幹細胞注入まで少なくとも1日の休薬期間を置かなければならないとした。分割TBIを施設のプロトコルに従い投与した。メスナは可能ではあるが、必須ではない。しかし、各参加施設はその施設のガイドラインに従った前処置レジメンを用いることができたが、骨髄破壊的で、かつそのセンターの試験対象患者全員に対して使用することが条件とされた。抗胸腺細胞(ATG)による前処置レジメンは禁止した(除外基準)。
投与はすべて理想体重をもとに決定され、ApoCellは移植前日(Day−1)に静脈内に投与した。
GVHD予防
本試験の被検者は、通常の標準治療に従って処方されたGVHD予防レジメンを受け、IVシクロスポリン用量3mg/kgを処置前(Day−1)(用量は血漿中濃度に応じて調整)に開始し、IVメソトレキセートをDay+1、+3及び+6にそれぞれ用量15mg/m2、10mg/m2、10mg/m2で投与した(各投与後18時間からフォリン酸を3回投与)。
シクロスポリンは、患者が嚥下可能な場合は経口投与し、Day+90まで継続した(疾患ステータスとキメラ状態に従う)。
本試験の被検者は、通常の標準治療に従って処方されたGVHD予防レジメンを受け、IVシクロスポリン用量3mg/kgを処置前(Day−1)(用量は血漿中濃度に応じて調整)に開始し、IVメソトレキセートをDay+1、+3及び+6にそれぞれ用量15mg/m2、10mg/m2、10mg/m2で投与した(各投与後18時間からフォリン酸を3回投与)。
シクロスポリンは、患者が嚥下可能な場合は経口投与し、Day+90まで継続した(疾患ステータスとキメラ状態に従う)。
男性/女性のドナー−レシピエントの組合せにおいて標準的な細胞遺伝学的分析によりキメラ状態を評価した。女性キメラ中の残留男性細胞をアメロゲニン遺伝子方法により検出した。性別が一致したドナー−レシピエントの組合せでは、VNTR(縦列反復配列多型)PCRアッセイ及びその後のSTR(縦列型反復配列)PCRアッセイを5%検出感度で使用し、残留する宿主又はドナー細胞の有無について評価した。過去10年のさらなる既存対照をグーリーらの文献(Gooley TA, NEJM 2010)から抜粋した。
感染イベントをすべて記録し、米国国立癌研究所(NCI)の有害事象共通用語規準(CTCAE)(第3版)に従いグレード付けをした。感染までの期間を180日目まで評価した。CMVをスクリーニング時、試験の3日目、10日目、17日目、31日目、45日目、66日目、100日目及び180日目の受診時に試験した。
急性GVHDのための集中的な経過観察期間(−1〜3日目)、短期経過観察期間(10日目、17日目、31日目及び45日目に受診)及び長期経過観察期間(66日目、100日目及び180日目に受診)を設けた。経過観察期間中、受診機会は、毎週受診では±2日、隔週又はそれ以上の間隔の受診では±5日であった。
治療関連毒性
有害事象(AE)を報告しかつCTCAE(第3版)に従いグレード付けをした。HSCTとGVHDに一般に関連するAEに対する、AEとApoCellとの関係を臨床プロトコルガイダンスに従い慎重に割り付けた。GVHD重症度を臨床的に判定したが、罹患臓器の生検を可能な限り実施することが強く推奨された。
有害事象(AE)を報告しかつCTCAE(第3版)に従いグレード付けをした。HSCTとGVHDに一般に関連するAEに対する、AEとApoCellとの関係を臨床プロトコルガイダンスに従い慎重に割り付けた。GVHD重症度を臨床的に判定したが、罹患臓器の生検を可能な限り実施することが強く推奨された。
また、全コホートにおいて、ApoCell製品をalloBMTの24〜30時間前に注入するというタイミングにより、幹細胞注入前のこの24〜30時間の期間にさらに安全性評価を行うことができた。
レジメン関連ではない毒性及び無再発の死亡率(NRM)
移植に関連した罹患率及び死亡率には、重篤なAE(SAE)報告並びに生着不全、静脈閉塞疾患(VOD)、敗血症又は細菌感染症、非感染性肺炎、出血、難治性GVHD、及び多臓器不全の記録を含めた。非致死的な毒性には、グレードIVのALT、AST、又はビリルビン高値、グレードIIIの血清クレアチニン、可逆性VOD、出血性膀胱炎、心膜液貯留、又は硬膜下血腫のあらゆるSAE又は記録が含まれる。
移植に関連した罹患率及び死亡率には、重篤なAE(SAE)報告並びに生着不全、静脈閉塞疾患(VOD)、敗血症又は細菌感染症、非感染性肺炎、出血、難治性GVHD、及び多臓器不全の記録を含めた。非致死的な毒性には、グレードIVのALT、AST、又はビリルビン高値、グレードIIIの血清クレアチニン、可逆性VOD、出血性膀胱炎、心膜液貯留、又は硬膜下血腫のあらゆるSAE又は記録が含まれる。
GVHDの診断及び治療
トーマスED(Thomas ED)らの文献(Thomas ED et al. NEJM 1979)の100日試験に従い、急性GVHDのグレード付けをした。100日〜180日の慢性GVHD(cGHVD)のグレード付けをフィリポビッチAH(Filipovich AH)らの文献(Biol Blood Marrow Transplant 2005)の記載に従い行った。慢性GVHDは大きく分けて、(1)急性GVHDの特徴を有していない古典的慢性GVHD、及び(2)慢性及び急性GVHD双方の特徴が混在する重複症候群が含まれる。慢性GVHDの組織学的又は臨床徴候又は症状が見られない場合、移植後の経過期間を問わず、皮膚、消化管、又は肝臓の特徴的な異常が持続性、再発、又は新規発症であれば急性GVHDとして分類しなければならない。
トーマスED(Thomas ED)らの文献(Thomas ED et al. NEJM 1979)の100日試験に従い、急性GVHDのグレード付けをした。100日〜180日の慢性GVHD(cGHVD)のグレード付けをフィリポビッチAH(Filipovich AH)らの文献(Biol Blood Marrow Transplant 2005)の記載に従い行った。慢性GVHDは大きく分けて、(1)急性GVHDの特徴を有していない古典的慢性GVHD、及び(2)慢性及び急性GVHD双方の特徴が混在する重複症候群が含まれる。慢性GVHDの組織学的又は臨床徴候又は症状が見られない場合、移植後の経過期間を問わず、皮膚、消化管、又は肝臓の特徴的な異常が持続性、再発、又は新規発症であれば急性GVHDとして分類しなければならない。
生着及びドナーキメラ状態
好中球生着は、異なる測定日の絶対好中球数が3回連続して(ANC)>0.5×109/Lと定義した。第1回目の測定日を好中球生着日とした。血小板生着は、血小板数が、血小板輸血をせずに3日以上に渡る測定で3回連続して>20×109/Lと定義した。第1回目の測定日を血小板生着日とした。被検者は、生着日の3日前から、又は生着日後の7日間は血小板輸血を受けてはならないこととした。血小板数が100×109/Lを超えるまでの期間も計測した。10日目、31日目、45日目、66日目、100日目及び180日目にキメラ状態を評価した。一次的生着不全は、骨髄を侵す進行性悪性疾患不在下で好中球回復が見られない場合と定義した。二次的生着不全は、骨髄を侵す進行性悪性疾患の不在下でドナー生着が見られない(ドナーキメラ状態<5%)場合と定義した。
好中球生着は、異なる測定日の絶対好中球数が3回連続して(ANC)>0.5×109/Lと定義した。第1回目の測定日を好中球生着日とした。血小板生着は、血小板数が、血小板輸血をせずに3日以上に渡る測定で3回連続して>20×109/Lと定義した。第1回目の測定日を血小板生着日とした。被検者は、生着日の3日前から、又は生着日後の7日間は血小板輸血を受けてはならないこととした。血小板数が100×109/Lを超えるまでの期間も計測した。10日目、31日目、45日目、66日目、100日目及び180日目にキメラ状態を評価した。一次的生着不全は、骨髄を侵す進行性悪性疾患不在下で好中球回復が見られない場合と定義した。二次的生着不全は、骨髄を侵す進行性悪性疾患の不在下でドナー生着が見られない(ドナーキメラ状態<5%)場合と定義した。
最初の退院までの期間
最初の退院までの期間は、HSCT当日(0日目)から最初の退院の日までの期間とし、初期入院期間を記録した。
最初の退院までの期間は、HSCT当日(0日目)から最初の退院の日までの期間とし、初期入院期間を記録した。
ApoCell調製
ApoCell製品には、HLA一致の同胞ドナーからの濃縮単核球分画で作製したアポトーシス細胞が含有されている。ドナーの適格基準には以下が含まれる:成人の男性又は女性ドナーであること、18〜65歳であること;HLAのA座、B座、C座及びDR座で少なくとも7/8のHLA一致のドナー及びレシピエントであること;40kg以上あること;HSCTへの献血に加え、ApoCell作製のために造血性血液単核球を提供する意志のあること。適格となったドナーはおよそ19日目に診療施設に再来院し、白血球除去法(コーブスペクトラ(Cobe Spectra)(登録商標)、ガンブロBCT社(Gambro BCT)製、アメリカ合衆国コロラド州レイクウッド)を用いて現地のSOPに従い末梢血単核球採取を受けた。白血球除去の約2.5時間の間、血液7Lの処理を行い、細胞を室温にて輸送パックに採取した。ドナーからの濃縮単核球分画の推定収量は推定容量100〜140ml中1.0×1010細胞であった。白血球除去で得られた採取細胞中の単核球分画平均パーセンテージは88±8%(65〜96%の範囲)であった。細胞収量はドナーの変動性に応じ異なった。HLA一致ドナーから採取した濃縮単核球分画は、細胞の凍結と融解、及びそれに続くメチルプレドニゾロンとのインキュベーションを含む複数工程による早期アポトーシス誘導のため、順次各工程に供された。ApoCell最終懸濁液は、早期アポトーシス細胞を少なくとも40%含有していた。注入用細胞懸濁液を現行の医薬品等の製造品質管理基準(サイクリックGMP)のもと調製した。注入は、HSCTの24〜30時間前及び調製完了から8時間以内に実施した。細胞は、投与時まで2〜8℃にて保存した。
ApoCell製品には、HLA一致の同胞ドナーからの濃縮単核球分画で作製したアポトーシス細胞が含有されている。ドナーの適格基準には以下が含まれる:成人の男性又は女性ドナーであること、18〜65歳であること;HLAのA座、B座、C座及びDR座で少なくとも7/8のHLA一致のドナー及びレシピエントであること;40kg以上あること;HSCTへの献血に加え、ApoCell作製のために造血性血液単核球を提供する意志のあること。適格となったドナーはおよそ19日目に診療施設に再来院し、白血球除去法(コーブスペクトラ(Cobe Spectra)(登録商標)、ガンブロBCT社(Gambro BCT)製、アメリカ合衆国コロラド州レイクウッド)を用いて現地のSOPに従い末梢血単核球採取を受けた。白血球除去の約2.5時間の間、血液7Lの処理を行い、細胞を室温にて輸送パックに採取した。ドナーからの濃縮単核球分画の推定収量は推定容量100〜140ml中1.0×1010細胞であった。白血球除去で得られた採取細胞中の単核球分画平均パーセンテージは88±8%(65〜96%の範囲)であった。細胞収量はドナーの変動性に応じ異なった。HLA一致ドナーから採取した濃縮単核球分画は、細胞の凍結と融解、及びそれに続くメチルプレドニゾロンとのインキュベーションを含む複数工程による早期アポトーシス誘導のため、順次各工程に供された。ApoCell最終懸濁液は、早期アポトーシス細胞を少なくとも40%含有していた。注入用細胞懸濁液を現行の医薬品等の製造品質管理基準(サイクリックGMP)のもと調製した。注入は、HSCTの24〜30時間前及び調製完了から8時間以内に実施した。細胞は、投与時まで2〜8℃にて保存した。
血漿バイオマーカー
スクリーニング時及び試験のための受診日の−1日目(ApoCell注入前日)、0日目(HSCT前日)及び3日目、10日目、17日目、31日目、45日目、66日目及び100日目に血漿及び血清試料を採取した。最適な回復を保証するため、血漿及び血清試料を採取後2〜4時間以内に分取し、サイトカイン濃度測定時まで−80℃で保存した。サイトカインは、TNFR1、IL−2Ra、HGF、IL−8、IL−7、IL−15、IL−6及びIL−1βを測定し(IL−7の測定には高感度キットを使用)、いずれもR&Dシステムズ社(R&D systems)(アメリカ合衆国ミネソタ州)より入手した。IL−7及びIL−15をスクリーニング時から試験31目の受診時まで試験し、それ以外のサイトカインは、特に明記しない限り、試験のための100日目受診時まで試験した。ELISAを2連で実施した。プレートをインフィニットF50吸光プレートリーダー(テカン社(Techan)製、オーストリア)を用いマゼラン(Magellan)ソフトウェアにより分析した。結果は濃度レベル中央値として表している。
スクリーニング時及び試験のための受診日の−1日目(ApoCell注入前日)、0日目(HSCT前日)及び3日目、10日目、17日目、31日目、45日目、66日目及び100日目に血漿及び血清試料を採取した。最適な回復を保証するため、血漿及び血清試料を採取後2〜4時間以内に分取し、サイトカイン濃度測定時まで−80℃で保存した。サイトカインは、TNFR1、IL−2Ra、HGF、IL−8、IL−7、IL−15、IL−6及びIL−1βを測定し(IL−7の測定には高感度キットを使用)、いずれもR&Dシステムズ社(R&D systems)(アメリカ合衆国ミネソタ州)より入手した。IL−7及びIL−15をスクリーニング時から試験31目の受診時まで試験し、それ以外のサイトカインは、特に明記しない限り、試験のための100日目受診時まで試験した。ELISAを2連で実施した。プレートをインフィニットF50吸光プレートリーダー(テカン社(Techan)製、オーストリア)を用いマゼラン(Magellan)ソフトウェアにより分析した。結果は濃度レベル中央値として表している。
統計的分析
記述統計を使用し、転帰測定値及びベースライン特性についてまとめた。本分析では、利用可能な全データは、欠損データに外挿せずに示した。被検者は、中止又は試験完了又は死亡までの利用可能なデータで寄与した。平均値、中央値、標準偏差(SD)、最小値及び最高値を含む記述統計を使用し連続変数を要約した。二値変数は計数及びパーセンテージとして表した。スチューデントt検定を使用し、死亡率とGVHD発生率を既存対照及びこれまでの報告と比較した。ApoCell注入を受けた全被検者を安全性分析に含めた。力価評価解析にはスチューデントt検定(両側検定タイプ1)を使用した。
記述統計を使用し、転帰測定値及びベースライン特性についてまとめた。本分析では、利用可能な全データは、欠損データに外挿せずに示した。被検者は、中止又は試験完了又は死亡までの利用可能なデータで寄与した。平均値、中央値、標準偏差(SD)、最小値及び最高値を含む記述統計を使用し連続変数を要約した。二値変数は計数及びパーセンテージとして表した。スチューデントt検定を使用し、死亡率とGVHD発生率を既存対照及びこれまでの報告と比較した。ApoCell注入を受けた全被検者を安全性分析に含めた。力価評価解析にはスチューデントt検定(両側検定タイプ1)を使用した。
既存対照
既存対照患者を、ハダサー大学病院(Hadassah University Hospital)の骨髄移植・がん免疫療法センター(Bone Marrow Transplantation & Cancer Immunotherapy Center)のコンピュータに登録されている患者から選択し、その際、一致する同胞ドナーからの同種幹細胞移植を受けていること、及び年齢、性別、疾患、疾患ステータス及び前処置レジメンが現在の試験対象患者と同様であること、という規則に従った。分析前に患者の電子ファイルのデータを確認した。対照群は、25人(男性18人、女性7人)の患者からなり、年齢の中央値は26歳(9〜63歳の範囲)であった。患者は全員、1982年から2009年までに、BMTのためにハダサー病院に紹介されていた。患者選択の際の前提条件であったように、本試験では、すべての患者が完全に一致するHLAクラスI及びIIの家族からの移植を受けた(同胞24人、父親1人)。
既存対照患者を、ハダサー大学病院(Hadassah University Hospital)の骨髄移植・がん免疫療法センター(Bone Marrow Transplantation & Cancer Immunotherapy Center)のコンピュータに登録されている患者から選択し、その際、一致する同胞ドナーからの同種幹細胞移植を受けていること、及び年齢、性別、疾患、疾患ステータス及び前処置レジメンが現在の試験対象患者と同様であること、という規則に従った。分析前に患者の電子ファイルのデータを確認した。対照群は、25人(男性18人、女性7人)の患者からなり、年齢の中央値は26歳(9〜63歳の範囲)であった。患者は全員、1982年から2009年までに、BMTのためにハダサー病院に紹介されていた。患者選択の際の前提条件であったように、本試験では、すべての患者が完全に一致するHLAクラスI及びIIの家族からの移植を受けた(同胞24人、父親1人)。
患者21人の生着データがわかった。1人の患者(5%)に晩期拒絶反応が発生した。好中球生着は、全ての患者(21人中の21人)において、中央値14日(9〜22日の範囲)で達成された。血小板生着は、評価可能な患者18人中の16人において、中央値12.5日(9〜32日)で達成された。
対照患者25人中の18人(72%)は、初期移植入院を終え退院した。入院期間中央値は、40.5日であった(27〜79日の範囲)。
GVHD:対照患者25人中の15人(60%)は、時間中央値26日で急性のGVHDのグレードI〜IVを発症した。グレードII〜IVの急性GVHDの発生率は50%(患者24人中の12人)、III〜IVの急性GVHDの発生率は20%(25人中の5人)であった。
移植関連死亡率(TRM):最初の100日間に患者25人中の7人(28%)が移植関連合併症のため死亡した。100〜200日目の期間の生存患者に移植合併症による死亡例はなかったため、TRMは200日目で28%を維持した。死亡原因は、患者3人が感染、1人がGVHD、1人がGI出血、1人が拒絶反応、1人が心拍停止であった。
移植関連毒性(TRT):クレアチニン−利用可能な腎機能データのある18人中の4人の患者(22%)は200日目までのクレアチニン>1.5×正常値上限と定義される腎不全であった。そのうち2人の腎不全は重度であり介入を必要とした。ビリルビン−利用可能なビリルビン値データのある患者18人中の7人(39%)が200日目までのビリルビン>2×正常値上限と定義される有意な肝毒性を示していた。
本明細書に開示する実施例5〜10では以下の方法を用いた。
細胞培養及び試薬
細胞を、高グルコース添加(インビトロジェンギブコ(Invitrogen-Gibco)、カリフォルニア州カールスバッド)Dulbeccoの改変イーグル培地(DMEM)に、1%L−グルタミン(バイオロジカルインダストリーズ社(Biological Industries)製、イスラエル)、10%ウシ胎児血清(バイオロジカルインダストリーズ社製)、及び10μg/mlシプロフロキサシン(シグマアルドリッチ社(Sigma Aldrich)製、イスラエル)を添加して培養した。カスパーゼ1阻害薬z−YVAD−fmk、ニゲリシン、及びバフィロマイシンA1をカルビオケム社(Calbiochem)(ドイツ、ダルムシュタット)から購入した。N−アセチル−L−システイン(NAC)及びリポ多糖(LPS)は、シグマアルドリッチ社製であった。DSS試薬は、MPバイオメディカルズ社(MP Biomedicals)製(フランス、イルキルシュ)であった。免疫染色には、以下の抗体を用いた:抗COX2(ケイマンケミカルズ社(Cayman Chemicals)製、アメリカ合衆国ミシガン州アナーバー)、抗ミエロペルオキシダーゼ(サーモサイエンティフィック社(Thermo Scientific)製、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ウォルサム)、抗phospho−IκBα及び抗phospho−NF−κB p65(セルシグナリングス社(Cell Signaling)製、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ダンバース)。
細胞を、高グルコース添加(インビトロジェンギブコ(Invitrogen-Gibco)、カリフォルニア州カールスバッド)Dulbeccoの改変イーグル培地(DMEM)に、1%L−グルタミン(バイオロジカルインダストリーズ社(Biological Industries)製、イスラエル)、10%ウシ胎児血清(バイオロジカルインダストリーズ社製)、及び10μg/mlシプロフロキサシン(シグマアルドリッチ社(Sigma Aldrich)製、イスラエル)を添加して培養した。カスパーゼ1阻害薬z−YVAD−fmk、ニゲリシン、及びバフィロマイシンA1をカルビオケム社(Calbiochem)(ドイツ、ダルムシュタット)から購入した。N−アセチル−L−システイン(NAC)及びリポ多糖(LPS)は、シグマアルドリッチ社製であった。DSS試薬は、MPバイオメディカルズ社(MP Biomedicals)製(フランス、イルキルシュ)であった。免疫染色には、以下の抗体を用いた:抗COX2(ケイマンケミカルズ社(Cayman Chemicals)製、アメリカ合衆国ミシガン州アナーバー)、抗ミエロペルオキシダーゼ(サーモサイエンティフィック社(Thermo Scientific)製、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ウォルサム)、抗phospho−IκBα及び抗phospho−NF−κB p65(セルシグナリングス社(Cell Signaling)製、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ダンバース)。
アポトーシス細胞の作製
ヒトアポトーシス細胞(ApoCell)含有組成物を健常なボランティアドナーの濃縮単核球分画から白血球除去法で作製した。白血球除去中、およそ300mlの自己由来血漿をドナーから採取し、その後、アポトーシス細胞の調製に使用した。血漿を輸送パックに採取し、分取して−80℃で2時間凍結した後、−18〜(−)25℃で製造時まで保存した。採取した細胞は上表3にある回収細胞用の全規格を満たしていた。百分率数をSYSMEX血球分析装置で実施した。細胞生存率をヨウ化プロピジウム染色によるフローサイトメトリーで測定した。採取後、細胞を2mMのL−グルタミン、10mMのHepes及び10U/mlのヘパリン含有5%ACD−A液を添加したRPMI 1640培地で洗浄し、5〜6.5×107細胞/mlで凍結バッグに凍結した。凍結培地の最終配合物は2mMのL−グルタミン、10mMのHepes、5%のHes、並びに20%の自己由来血漿及び10U/mlのヘパリン含有5%ACD−A液含有10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を添加したRPMI 1640培地であった。次いで、細胞を融解し、2mMのL−グルタミン、10mMのHepes及び10U/mlのヘパリン含有5%ACD−A液を添加したRPMI 1640培地で洗浄した。その後、細胞を10mMのHepes、2mMのL−グルタミンに加え、10%の自己由来血漿、10U/mlのヘパリン含有5%ACD−A液及び50μg/mlのメチルプレドニゾロンを添加したRPMI 1640培地に最終濃度5×106/mlで再懸濁し、ライフセル社(LifeCell)製フラスコ内で37℃で6時間、5%CO2でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を回収し、PBSで洗浄した後、所望の濃度でPBSに再懸濁した。
ヒトアポトーシス細胞(ApoCell)含有組成物を健常なボランティアドナーの濃縮単核球分画から白血球除去法で作製した。白血球除去中、およそ300mlの自己由来血漿をドナーから採取し、その後、アポトーシス細胞の調製に使用した。血漿を輸送パックに採取し、分取して−80℃で2時間凍結した後、−18〜(−)25℃で製造時まで保存した。採取した細胞は上表3にある回収細胞用の全規格を満たしていた。百分率数をSYSMEX血球分析装置で実施した。細胞生存率をヨウ化プロピジウム染色によるフローサイトメトリーで測定した。採取後、細胞を2mMのL−グルタミン、10mMのHepes及び10U/mlのヘパリン含有5%ACD−A液を添加したRPMI 1640培地で洗浄し、5〜6.5×107細胞/mlで凍結バッグに凍結した。凍結培地の最終配合物は2mMのL−グルタミン、10mMのHepes、5%のHes、並びに20%の自己由来血漿及び10U/mlのヘパリン含有5%ACD−A液含有10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を添加したRPMI 1640培地であった。次いで、細胞を融解し、2mMのL−グルタミン、10mMのHepes及び10U/mlのヘパリン含有5%ACD−A液を添加したRPMI 1640培地で洗浄した。その後、細胞を10mMのHepes、2mMのL−グルタミンに加え、10%の自己由来血漿、10U/mlのヘパリン含有5%ACD−A液及び50μg/mlのメチルプレドニゾロンを添加したRPMI 1640培地に最終濃度5×106/mlで再懸濁し、ライフセル社(LifeCell)製フラスコ内で37℃で6時間、5%CO2でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を回収し、PBSで洗浄した後、所望の濃度でPBSに再懸濁した。
アポトーシス細胞測定
アポトーシスをアネキシンV及びヨウ化プロピジウム(PI)アポトーシス検出キット(MBLインターナショナル社(MBL International)製、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ウーバン)を用いて評価した。細胞をFACSキャリバーフローサイトメーターで取得し、FCSエクスプレス(FCS Express)ソフトウェア(デノボ社(De Novo)製、アメリカ合衆国カリフォルニア州ロサンゼルス)を用いて分析した。アポトーシス細胞は一定して少なくとも40%アネキシンVを含有し、<5%PI陽性細胞をすべての実験で用いた。
アポトーシスをアネキシンV及びヨウ化プロピジウム(PI)アポトーシス検出キット(MBLインターナショナル社(MBL International)製、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ウーバン)を用いて評価した。細胞をFACSキャリバーフローサイトメーターで取得し、FCSエクスプレス(FCS Express)ソフトウェア(デノボ社(De Novo)製、アメリカ合衆国カリフォルニア州ロサンゼルス)を用いて分析した。アポトーシス細胞は一定して少なくとも40%アネキシンVを含有し、<5%PI陽性細胞をすべての実験で用いた。
腹腔内マクロファージの単離
WT又はNlrp3−/−マウスの常駐する腹腔内マクロファージ(pMΦ)をほかの記載にある通り(Bauer et al.2010)作製した。簡単に言うと,マウスをイソフルラン麻酔下で頚椎脱臼に供した。次いで、壁側腹膜を暴露させ腹腔内に10mlのトランスピペット2%FBS入PBSで腹腔洗浄を行った。腹腔洗浄液を遠心分離し所望濃度で再懸濁した。接着したpMΦ(F4/80陽性細胞)サブセットはフローサイトメーター分析で観察したところ約20%の腹腔洗浄からなっていた。細胞をその後培養皿にとり一晩置いた。細胞を洗浄し、接着細胞をサイトカインアッセイに使用した。指示がある場合は、細菌叢作用を中和するため、WTとNLRP3欠損マウスの共飼育から4週間後に実験を実施した。
WT又はNlrp3−/−マウスの常駐する腹腔内マクロファージ(pMΦ)をほかの記載にある通り(Bauer et al.2010)作製した。簡単に言うと,マウスをイソフルラン麻酔下で頚椎脱臼に供した。次いで、壁側腹膜を暴露させ腹腔内に10mlのトランスピペット2%FBS入PBSで腹腔洗浄を行った。腹腔洗浄液を遠心分離し所望濃度で再懸濁した。接着したpMΦ(F4/80陽性細胞)サブセットはフローサイトメーター分析で観察したところ約20%の腹腔洗浄からなっていた。細胞をその後培養皿にとり一晩置いた。細胞を洗浄し、接着細胞をサイトカインアッセイに使用した。指示がある場合は、細菌叢作用を中和するため、WTとNLRP3欠損マウスの共飼育から4週間後に実験を実施した。
IL−1βELISA
pMΦを96ウェルプレートに密度2×105細胞/ウェルで播種した。1時間のLPSプライミングの後、細胞を異なるアクチベーターで24時間刺激した。細胞培養上清をELISA(バイオレジェンド社(Biolegend)製、アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ)に使用した。その際、製造者のプロトコルに従い実施した。
pMΦを96ウェルプレートに密度2×105細胞/ウェルで播種した。1時間のLPSプライミングの後、細胞を異なるアクチベーターで24時間刺激した。細胞培養上清をELISA(バイオレジェンド社(Biolegend)製、アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ)に使用した。その際、製造者のプロトコルに従い実施した。
ウェスタンブロット法
処理したIL−1βp17サブユニット及び活性化カスパーゼ1p10サブユニット及びそれらの培養上清への放出をウェスタンブロット法で測定した。すなわち、指定アクチベーター添加から12時間後、その上清を採取しSDS−PAGE試料緩衝液に懸濁し、85℃まで10分加熱した。マクロファージを溶解緩衝液(50mMのTris−HCl pH8.0、5mMのEDTA、150mMのNaCl、1%のTriton−X100及びプロテアーゼ阻害薬カクテル(Roche))に溶解し−80℃で分析時まで保存した。1×106マクロファージのタンパク質をウェルあたり15%アクリルアミドゲルで負荷し、電気ブロッティングでPVDF(ポリ(フッ化ビニリデン))膜へ移した。ウェスタンブロット法を希釈倍率1:500の抗マウスIL−1β抗体(クローンB122;バイオレジェンド社製)及び希釈倍率1:1000の抗マウスカスパーゼ1p10抗体(サンタ・クルーズ社(Santa Cruz)製)で実施した。適切なHRP標識二次抗体(ジャクソンイムノリサーチ社(Jackson ImmunoResearch Laboratories)製、アメリカ合衆国ペンシルベニア州ウェストグローブ)を使用し、タンパク質をECL試薬(バイオロジカルインダストリーズ社製)で検出した。抗マウスアクチンは負荷対照とした。
処理したIL−1βp17サブユニット及び活性化カスパーゼ1p10サブユニット及びそれらの培養上清への放出をウェスタンブロット法で測定した。すなわち、指定アクチベーター添加から12時間後、その上清を採取しSDS−PAGE試料緩衝液に懸濁し、85℃まで10分加熱した。マクロファージを溶解緩衝液(50mMのTris−HCl pH8.0、5mMのEDTA、150mMのNaCl、1%のTriton−X100及びプロテアーゼ阻害薬カクテル(Roche))に溶解し−80℃で分析時まで保存した。1×106マクロファージのタンパク質をウェルあたり15%アクリルアミドゲルで負荷し、電気ブロッティングでPVDF(ポリ(フッ化ビニリデン))膜へ移した。ウェスタンブロット法を希釈倍率1:500の抗マウスIL−1β抗体(クローンB122;バイオレジェンド社製)及び希釈倍率1:1000の抗マウスカスパーゼ1p10抗体(サンタ・クルーズ社(Santa Cruz)製)で実施した。適切なHRP標識二次抗体(ジャクソンイムノリサーチ社(Jackson ImmunoResearch Laboratories)製、アメリカ合衆国ペンシルベニア州ウェストグローブ)を使用し、タンパク質をECL試薬(バイオロジカルインダストリーズ社製)で検出した。抗マウスアクチンは負荷対照とした。
大腸炎の誘導
大腸炎を3%(w/v)DSS溶液(m.w.36,000〜50,000;MPバイオメディカルズ社製)の経口投与により誘導し、屠殺まで7〜9日間水を自由に摂取させた。対照群には同期間、蒸留水(0%のDSS)を与えた。アポトーシス細胞処置をした場合、マウスの尾に25〜30×106細胞/150μlPBSを単回注入した。対照マウスには、150μlのPBSを与えた。
大腸炎を3%(w/v)DSS溶液(m.w.36,000〜50,000;MPバイオメディカルズ社製)の経口投与により誘導し、屠殺まで7〜9日間水を自由に摂取させた。対照群には同期間、蒸留水(0%のDSS)を与えた。アポトーシス細胞処置をした場合、マウスの尾に25〜30×106細胞/150μlPBSを単回注入した。対照マウスには、150μlのPBSを与えた。
養子T細胞導入による大腸炎の誘導
ナイーブCD4+CD45RBhighT細胞を、既述(Izcue, 2008)のように、FACS分取でC57BL/6マウスの脾臓から単離した。すなわち、CD4+リンパ球の陰性濃縮後、単一細胞懸濁液をAPC標識抗CD4及びFITC−抗CD45RBで染色した(いずれもバイオレジェンド社より入手)。ナイーブCD4+CD45RBhighT細胞をFACS Ariaセルソーター(BDバイオサイエンス社製、カリフォルニア州サンノゼ)で精製した(>99%)。CD4+CD45RBlow母集団も分取し、陰性対照とした。性別が一致するRag1−/−レシピエントマウスに、5×105CD4+CD45RBhigh又はCD4+CD45RBlowT細胞を腹腔内(i.p.)注入で与え、腸の炎症の発生について以下に記載のとおり監視した。アポトーシス細胞処置を受けた群に、各マウスの尾に30×106ApoCell/150μlPBSを指定日に注入した。対照群には150μlのPBSのみを注入した。
ナイーブCD4+CD45RBhighT細胞を、既述(Izcue, 2008)のように、FACS分取でC57BL/6マウスの脾臓から単離した。すなわち、CD4+リンパ球の陰性濃縮後、単一細胞懸濁液をAPC標識抗CD4及びFITC−抗CD45RBで染色した(いずれもバイオレジェンド社より入手)。ナイーブCD4+CD45RBhighT細胞をFACS Ariaセルソーター(BDバイオサイエンス社製、カリフォルニア州サンノゼ)で精製した(>99%)。CD4+CD45RBlow母集団も分取し、陰性対照とした。性別が一致するRag1−/−レシピエントマウスに、5×105CD4+CD45RBhigh又はCD4+CD45RBlowT細胞を腹腔内(i.p.)注入で与え、腸の炎症の発生について以下に記載のとおり監視した。アポトーシス細胞処置を受けた群に、各マウスの尾に30×106ApoCell/150μlPBSを指定日に注入した。対照群には150μlのPBSのみを注入した。
大腸炎の全体的評価
対照群において臨床疾患症状が明らかになった時点でマウスを調べた。通常、DSSモデルで7〜9日前後、TCTモデルで8週間である。他の文献(Hartmann, 2000)に記載されている通りに(但し変更を加えて)、体重変化、便の硬さ、及び血便を連日測定して標準的なIBD臨床スコアを用いてIBDを評価した。体重減少がない場合を0、体重減少1〜5%を1、5〜10%を2、10〜20%を3、及び20%を超える場合を4ポイントとした。便の硬さについては、形の良いペレット状有形便には0ポイント、ペースト状の半有形便で肛門に付着しない場合は2ポイント、及び肛門に付着しない液体様便には4ポイントを付した。出血スコアは、便潜血が見られない場合は0ポイント、便潜血反応が陽性の場合は2ポイント、及び肉眼的出血が認められる場合は4ポイントとした。これらのスコアを加えて、0(健常)から12(大腸炎の活動性が最大)の総臨床スコアを形成した。動物を屠殺した後、結腸を摘出して4%ホルムアルデヒド内に固定し、パラフィンに包埋してからヘマトキシリン・エオジンで染色した。標本の遠位の結腸部分で、粘膜の損傷、炎症の存在と程度、陰窩の損傷、及び体積比百分率を0から4の範囲で組織学的に定量した。標本及び治療群は、組織学的定量の前に無作為化した。
対照群において臨床疾患症状が明らかになった時点でマウスを調べた。通常、DSSモデルで7〜9日前後、TCTモデルで8週間である。他の文献(Hartmann, 2000)に記載されている通りに(但し変更を加えて)、体重変化、便の硬さ、及び血便を連日測定して標準的なIBD臨床スコアを用いてIBDを評価した。体重減少がない場合を0、体重減少1〜5%を1、5〜10%を2、10〜20%を3、及び20%を超える場合を4ポイントとした。便の硬さについては、形の良いペレット状有形便には0ポイント、ペースト状の半有形便で肛門に付着しない場合は2ポイント、及び肛門に付着しない液体様便には4ポイントを付した。出血スコアは、便潜血が見られない場合は0ポイント、便潜血反応が陽性の場合は2ポイント、及び肉眼的出血が認められる場合は4ポイントとした。これらのスコアを加えて、0(健常)から12(大腸炎の活動性が最大)の総臨床スコアを形成した。動物を屠殺した後、結腸を摘出して4%ホルムアルデヒド内に固定し、パラフィンに包埋してからヘマトキシリン・エオジンで染色した。標本の遠位の結腸部分で、粘膜の損傷、炎症の存在と程度、陰窩の損傷、及び体積比百分率を0から4の範囲で組織学的に定量した。標本及び治療群は、組織学的定量の前に無作為化した。
活性酸素種(ROS)の測定
インフラマソームを誘発する薬剤DSSによるROSの産生をROS検出キット(アメリカ合衆国ニューヨーク州ファーミングデールのエンゾライフサイエンス社(Enzo Life Sciences)製)で測定した。雌のB6マウスからpMΦを8穴チャンバースライドに密度0.1×106細胞/チャンバーで播種し、37℃で一晩培養した。その後、pMΦをPBSで2回洗浄し、アポトーシス細胞とともに1:8の比で2時間処理した後、洗浄してLPSでプライミングし、3%のDSSでさらに30分処理した。陰性対照細胞は培地のみで処理した。洗浄後、細胞を200μlのDMEMに懸濁し、ROS検出試薬(1μM)で30分染色した。DSSで誘導した細胞内ROSを、525nm蛍光フィルターに励起波長488nmを用い蛍光顕微鏡検査で検出した(初期倍率×100)。フローサイトメーターによる検出を使用する場合、処理後MΦをトリプシン−EDTAを用いて剥離、洗浄し、LSRII分析装置(BDバイオサイエンス社製)を用いて分析した。
インフラマソームを誘発する薬剤DSSによるROSの産生をROS検出キット(アメリカ合衆国ニューヨーク州ファーミングデールのエンゾライフサイエンス社(Enzo Life Sciences)製)で測定した。雌のB6マウスからpMΦを8穴チャンバースライドに密度0.1×106細胞/チャンバーで播種し、37℃で一晩培養した。その後、pMΦをPBSで2回洗浄し、アポトーシス細胞とともに1:8の比で2時間処理した後、洗浄してLPSでプライミングし、3%のDSSでさらに30分処理した。陰性対照細胞は培地のみで処理した。洗浄後、細胞を200μlのDMEMに懸濁し、ROS検出試薬(1μM)で30分染色した。DSSで誘導した細胞内ROSを、525nm蛍光フィルターに励起波長488nmを用い蛍光顕微鏡検査で検出した(初期倍率×100)。フローサイトメーターによる検出を使用する場合、処理後MΦをトリプシン−EDTAを用いて剥離、洗浄し、LSRII分析装置(BDバイオサイエンス社製)を用いて分析した。
リソソームの安定性評価
DSSで誘導したことによるリソソームの損傷を、他の文献(Bauer et al. 2010)に記載されているようなアクリジンオレンジ染色により評価した。簡単に言うと、腹腔マクロファージを24ウェル培養皿に採取して一晩置き、その後、非接着細胞をPBSで洗浄した。残存する接着マクロファージ細胞をアポトーシス細胞(1:8)に2時間導入した。次いで、マクロファージを洗浄し、LPSで1時間プライミング後、DSSで24時間刺激した。続いて、細胞を洗浄し、0.25μg/mlアクリジンオレンジで15分インキュベートしてリソソーム染色を行った。リソソームの損傷は、LSRII(BDバイオサイエンス社製)により蛍光600〜650nmで蛍光強度の欠損部分として測定した。
DSSで誘導したことによるリソソームの損傷を、他の文献(Bauer et al. 2010)に記載されているようなアクリジンオレンジ染色により評価した。簡単に言うと、腹腔マクロファージを24ウェル培養皿に採取して一晩置き、その後、非接着細胞をPBSで洗浄した。残存する接着マクロファージ細胞をアポトーシス細胞(1:8)に2時間導入した。次いで、マクロファージを洗浄し、LPSで1時間プライミング後、DSSで24時間刺激した。続いて、細胞を洗浄し、0.25μg/mlアクリジンオレンジで15分インキュベートしてリソソーム染色を行った。リソソームの損傷は、LSRII(BDバイオサイエンス社製)により蛍光600〜650nmで蛍光強度の欠損部分として測定した。
免疫組織化学
Balb/cマウスから得たパラフィンで包埋したスライドを脱パラフィンし、3%H2O2でインキュベートした。抗原の脱マスキングは、1mMのEDTA含有10mMのTris緩衝液内でマイクロ波加熱(20分)により実施した。スライドを、CAS−BLOCK(インビトロジェン社製)で希釈した抗COX2、抗MPO、抗pNF−κB、及び抗pIκBα一次抗体と共に、または対照としてCAS−BLOCKのみでインキュベートした。その後、適切な二次抗体(ニチレイ社製)を添加し、スライドを室温にて30分インキュベートした。DAB基質キット(サーモサイエンティフィック社製)を使用して呈色させ、次いで、マイヤーヘマトキシリン液(シグマアルドリッチ社製)で対比染色をした。一次抗体未添加の対照では全例において背景染色は低いか、又はまったく見られなかった。
Balb/cマウスから得たパラフィンで包埋したスライドを脱パラフィンし、3%H2O2でインキュベートした。抗原の脱マスキングは、1mMのEDTA含有10mMのTris緩衝液内でマイクロ波加熱(20分)により実施した。スライドを、CAS−BLOCK(インビトロジェン社製)で希釈した抗COX2、抗MPO、抗pNF−κB、及び抗pIκBα一次抗体と共に、または対照としてCAS−BLOCKのみでインキュベートした。その後、適切な二次抗体(ニチレイ社製)を添加し、スライドを室温にて30分インキュベートした。DAB基質キット(サーモサイエンティフィック社製)を使用して呈色させ、次いで、マイヤーヘマトキシリン液(シグマアルドリッチ社製)で対比染色をした。一次抗体未添加の対照では全例において背景染色は低いか、又はまったく見られなかった。
動物及び共飼育
BALB/cまたはC57BL/6マウスをハーラン社(Harlan Inc.)(イスラエル国エルサレム)から入手した。マウスはいずれも雌で、到着時8〜10週齢であった。指示がある場合は、細菌叢作用を中和するため、WTマウスとNLRP3欠損マウスの共飼育が4週間経過してから実験を実施した。
BALB/cまたはC57BL/6マウスをハーラン社(Harlan Inc.)(イスラエル国エルサレム)から入手した。マウスはいずれも雌で、到着時8〜10週齢であった。指示がある場合は、細菌叢作用を中和するため、WTマウスとNLRP3欠損マウスの共飼育が4週間経過してから実験を実施した。
統計的分析
すべてのデータは平均±標準誤差(SEM)で表される。差異の統計的有意性は、不対t検定(別段の指示がない限り、両側検定)または一元配置分散分析法及びテューキーの多重比較検定により評価した。0.05以下のP値を統計的に有意であると考えた。
すべてのデータは平均±標準誤差(SEM)で表される。差異の統計的有意性は、不対t検定(別段の指示がない限り、両側検定)または一元配置分散分析法及びテューキーの多重比較検定により評価した。0.05以下のP値を統計的に有意であると考えた。
結果
実施例1
骨髄破壊的同種骨髄移植におけるGVHD予防としての同種アポトーシス細胞の注入は安全である
骨髄破壊的同種骨髄移植におけるGVHD予防としての同種アポトーシス細胞の注入は安全である
患者、ドナー及び移植片の特徴
レシピエントに移植した総細胞数及びレシピエントに注入した総CD34+細胞数それぞれの中央値は13.6×108/kg(範囲:9.3〜29.5×108/kg)及び7.2×106/kg(範囲:3.7〜22.4×106/kg)であった(表1)。患者、疾患、及び移植の特徴を表1にまとめている。最も診断頻度の高かったのは、急性リンパ芽球性白血病(ALL;n=7、54%)であり、次いで急性骨髄性白血病(AML;n=5、38%)高く、慢性骨髄性白血病(CML;n=1、7.7%)が1例であった。AML患者では、新規疾患を呈した患者が1例、及び先行する骨髄異形成症候群(MDS)からAMLを発症した患者が4例であった。計5例のALL患者が第1完全寛解(CR1)し、1例が第2完全寛解(CR2)、また1例は第2部分寛解(PR2)であった。計5例のAML患者はCR1であった。CML患者1名は慢性期にあり、移植前のチロシンキナーゼ阻害剤(TKI)3剤に対し不応答であった。患者はすべて関連ドナー移植片を受けた。患者の年齢の中央値は37歳であった(範囲、20〜59歳)。HLA A、B、C(患者13人中の8人で評価した)及びDR遺伝子座でのHLA一致に加え、DQについても患者13人中の12人で評価した。HLA一致データを表1に示す。
レシピエントに移植した総細胞数及びレシピエントに注入した総CD34+細胞数それぞれの中央値は13.6×108/kg(範囲:9.3〜29.5×108/kg)及び7.2×106/kg(範囲:3.7〜22.4×106/kg)であった(表1)。患者、疾患、及び移植の特徴を表1にまとめている。最も診断頻度の高かったのは、急性リンパ芽球性白血病(ALL;n=7、54%)であり、次いで急性骨髄性白血病(AML;n=5、38%)高く、慢性骨髄性白血病(CML;n=1、7.7%)が1例であった。AML患者では、新規疾患を呈した患者が1例、及び先行する骨髄異形成症候群(MDS)からAMLを発症した患者が4例であった。計5例のALL患者が第1完全寛解(CR1)し、1例が第2完全寛解(CR2)、また1例は第2部分寛解(PR2)であった。計5例のAML患者はCR1であった。CML患者1名は慢性期にあり、移植前のチロシンキナーゼ阻害剤(TKI)3剤に対し不応答であった。患者はすべて関連ドナー移植片を受けた。患者の年齢の中央値は37歳であった(範囲、20〜59歳)。HLA A、B、C(患者13人中の8人で評価した)及びDR遺伝子座でのHLA一致に加え、DQについても患者13人中の12人で評価した。HLA一致データを表1に示す。
力価アッセイ
寛容原性DCは、アポトーシス細胞(Verbovetski I J Exp Med 2002)またはアポトーシス細胞製品(Krispin A Blood 2006)との相互作用で作製することができる。各ApoCell調製物に対し、調製したApoCellの寛容原性作用を未熟樹状細胞(iDC)とのインビトロ内相互作用を用いて個別に調べた。iDCはHLA−DR及び共刺激分子を低レベルで発現する。LPSのような成熟化刺激に暴露後、iDCは成熟しHLA−DR及び共刺激分子CD86の発現レベルを上方制御する。
寛容原性DCは、アポトーシス細胞(Verbovetski I J Exp Med 2002)またはアポトーシス細胞製品(Krispin A Blood 2006)との相互作用で作製することができる。各ApoCell調製物に対し、調製したApoCellの寛容原性作用を未熟樹状細胞(iDC)とのインビトロ内相互作用を用いて個別に調べた。iDCはHLA−DR及び共刺激分子を低レベルで発現する。LPSのような成熟化刺激に暴露後、iDCは成熟しHLA−DR及び共刺激分子CD86の発現レベルを上方制御する。
ApoCell製剤13剤の対象患者への注入で得られた力価アッセイの結果を表2にまとめている。結果は、ApoCellと相互作用させた後の、LPS処理したDCの成熟阻害(DR及びCD86の発現阻害)の平均パーセンテージを表している。表2に示すように、有意かつ用量依存的なダウンレギュレーションが認められた。1人の患者の力価アッセイから得た代表的な結果を図1に示す。
生着
レシピエントの好中球回復までの期間の中央値は13日(範囲、11〜19)、また血小板回復までの期間の中央値は15日(範囲、11〜59)であった。好中球及び血小板生着までの期間の中央値は、第1コホートでそれぞれ13日(13〜14日の範囲)及び17日(範囲11〜59);第2コホートでそれぞれ14日(範囲11〜17)及び14日(範囲11〜18);第3コホートでそれぞれ14日(範囲12〜19)及び15日(範囲13〜54);並びに第4コホートでそれぞれ12日(範囲11〜13)及び15日(範囲13〜17)であった。
レシピエントの好中球回復までの期間の中央値は13日(範囲、11〜19)、また血小板回復までの期間の中央値は15日(範囲、11〜59)であった。好中球及び血小板生着までの期間の中央値は、第1コホートでそれぞれ13日(13〜14日の範囲)及び17日(範囲11〜59);第2コホートでそれぞれ14日(範囲11〜17)及び14日(範囲11〜18);第3コホートでそれぞれ14日(範囲12〜19)及び15日(範囲13〜54);並びに第4コホートでそれぞれ12日(範囲11〜13)及び15日(範囲13〜17)であった。
試験31日目にキメラ状態について利用可能なデータのある患者12人中の10人(83%)がドナー型であった。追加の患者1人は検査技術不良により31日目のデータがなかったが、後日の受診(45日)でドナー型であることが分かった。66日目までに患者100%がドナー型に変換された。一次生着不全は発生しなかった。31日目に混合キメラ状態の患者がいなかったのは、疾患の早期再発であったことがわかった。
有害事象
SAEが10例報告され、ApoCell注入と無関連であるのが7例、ほとんど関係ないのが3例であった。記録されたSAEは、敗血症性ショック2例、再発2例、出血性膀胱炎1例、アデノウイルス感染症による胃腸炎1例、嘔吐1例、及び発熱3例であった。何百ものAEのうち、ApoCell注入関連の可能性があると報告されたのはわずか3例のみで(いずれもApoCell関連が確実または可能性があると定義されたAEではない);注入当日(day−1)の低血圧1例、注入当日(第1日)の咽喉灼熱感1例、及び試験131日目の再発1例であった。
SAEが10例報告され、ApoCell注入と無関連であるのが7例、ほとんど関係ないのが3例であった。記録されたSAEは、敗血症性ショック2例、再発2例、出血性膀胱炎1例、アデノウイルス感染症による胃腸炎1例、嘔吐1例、及び発熱3例であった。何百ものAEのうち、ApoCell注入関連の可能性があると報告されたのはわずか3例のみで(いずれもApoCell関連が確実または可能性があると定義されたAEではない);注入当日(day−1)の低血圧1例、注入当日(第1日)の咽喉灼熱感1例、及び試験131日目の再発1例であった。
再発
移植後100日目及び180日目の累積再発率はそれぞれ7.7%(n=1)及び31%(n=4)であった。再発した患者4人中の3人(75%)はALLであった。いずれの患者もシクロスポリンを投与されていた。
移植後100日目及び180日目の累積再発率はそれぞれ7.7%(n=1)及び31%(n=4)であった。再発した患者4人中の3人(75%)はALLであった。いずれの患者もシクロスポリンを投与されていた。
生存率
45、100及び180日目の全生存率はそれぞれ100%、92.3%及び84.6%であった(図2A)。再発に関連しない生存率は45日目で100%、100日目及び180日目で92.3%であった(図2B)。移植関連死亡率(TRM)は45日目で0%、100日目で77.%及び180日目で77.%であった。治療群中で死亡した患者は1人(7.7%)のみであり(図2Cのカラム1)、これに対し、院内記録にある対応する既存対照では7人(28%)(図2Cのカラム2)、後ろ向き調査(データ図示せず)では16%であった。
45、100及び180日目の全生存率はそれぞれ100%、92.3%及び84.6%であった(図2A)。再発に関連しない生存率は45日目で100%、100日目及び180日目で92.3%であった(図2B)。移植関連死亡率(TRM)は45日目で0%、100日目で77.%及び180日目で77.%であった。治療群中で死亡した患者は1人(7.7%)のみであり(図2Cのカラム1)、これに対し、院内記録にある対応する既存対照では7人(28%)(図2Cのカラム2)、後ろ向き調査(データ図示せず)では16%であった。
最初の退院までの期間
全13人の患者の最初の退院までの平均時間は、34.2日(15〜103日の範囲)であった。第1コホート用量(35×106/kg)で治療を受けた3人の患者の最初の退院までの平均時間は46.3日(15〜103日の範囲)であり、第2コホート用量(70×106/kg)で治療を受けた4人の患者の最初の退院までの平均時間は33.5日(20〜87日の範囲)であり、第3コホート用量(140×106/kg)で治療を受けた3人の患者の最初の退院までの平均時間は24.3日(22〜28日の範囲)であり、最終コホート用量(210×106/kg)で治療を受けた3人の患者の最初の退院までの平均時間は18.3日(17〜21日の範囲)であった(図3)。
全13人の患者の最初の退院までの平均時間は、34.2日(15〜103日の範囲)であった。第1コホート用量(35×106/kg)で治療を受けた3人の患者の最初の退院までの平均時間は46.3日(15〜103日の範囲)であり、第2コホート用量(70×106/kg)で治療を受けた4人の患者の最初の退院までの平均時間は33.5日(20〜87日の範囲)であり、第3コホート用量(140×106/kg)で治療を受けた3人の患者の最初の退院までの平均時間は24.3日(22〜28日の範囲)であり、最終コホート用量(210×106/kg)で治療を受けた3人の患者の最初の退院までの平均時間は18.3日(17〜21日の範囲)であった(図3)。
ここに示した結果は、骨髄破壊的同種骨髄移植における移植片対宿主病の予防としてドナーの早期アポトーシス細胞(ApoCell)を単回注入することが安全であることを示唆している。ApoCellはBMTの24時間前に投与され、ApoCell注入に特異的に関連する又は関連の可能性があるSAEは報告されなかった。計10例のSAEが報告され、ApoCell注入との関連性不明(7例)または関連性はほとんどない(3例)ものであった。何百ものAEのうち、ApoCell注入関連の可能性があると報告されたのはわずか3例のみで、注入当日の低血圧、やはり注入当日の咽喉灼熱感、及び試験131日目の再発であった。いずれもApoCell関連が確実または可能性があると定義されたAEの報告はなかった。さらに、既存対照及び文献(グーリーらの文献、同前論文)に記載の同様の患者と比較した場合、調査した全用量において生着までの期間の延長、入院期間、キメラ状態遅延、死亡率上昇、CMVなどの重篤な感染症、及び再発は観察されなかった。
実施例2
同種アポトーシス細胞の注入は、骨髄破壊的同種骨髄移植を受ける患者における高グレードのGVHDを低減する
同種アポトーシス細胞の注入は、骨髄破壊的同種骨髄移植を受ける患者における高グレードのGVHDを低減する
急性GVHDを、13例中の12例の患者に100日間、また第2治療群の患者1例に87日間の試験を通して評価した。全例を第100日目の累積発生率に含めた。全患者における、グレードII〜IV及びIII〜IVの急性GVHD(aGVHD)の第100日累積発生率は、それぞれ23.1%及び15.4%であった(図4)。11人中の10人の患者において180日間試験の急性GVHDを評価した。グレードII〜IV及びIII〜IVの急性GVHD発症までの期間の中央値はそれぞれ31日(範囲、31〜44日)及び47日(範囲、31〜62日)であった。移植後100日目以降に急性GVHDを発症した患者はいなかった。11人中の10人の患者を第180日のaGVHDについて評価した。10人中の1人の患者(10%)はグレードIの持続型aGVHDの皮膚を呈しており、試験180日目の全体的重症度はグレードIであった。注目されるのは、ApoCellの最高用量で治療を受けた2コホートにおいて高グレードのGVHD(グレードII〜IV)が記録されなかったことである(図4A)。アポトーシス細胞調製剤の単回注入を投与された移植患者のグレードII〜IVのGVHDの発生率は、院内記録の既存対照(被検者25人のうちの50%、図4Bのカラム2)及び文献報告(71%、データ図示せず;グーリーらの文献、同前論文)の場合と比較して有意に低かった(被検者13人中の7.7%、図4Bのカラム1)。
高グレードのaGVHDを回避し成功の可能性が高い治療の場合、GVHDの重症度と相関することが見出されている(Horowitz MM Blood 1990)、移植片対白血病(GVL)作用が失われる可能性があるという問題が浮上する。本試験では、再発率は100日目で7.7%、及び180日目で30.8%であった。100日目の再発率は、alloBMTを受けた同様の患者で報告されている再発率と異なるものではない。180日目までの再発率30%は、境界線として高いと考えられるかもしれないが、再発の75%はALL患者であった(同様の年齢群で4人中の3人が70%という高い率で再発する傾向がある)。さらに、2つの高用量においてグレードII〜IVのGVHDは0まで低減したが、同じコホート内でグレードIのaGVHDは50%まで上昇し、このことは、生理学的方法としてApoCell治療は高グレードのGVHDを消失させるというよりはむしろ低減することを示している。
慢性GVHD(cGVHD)を試験の100日目から180日目まで評価した。患者11人中の10人を180日目のcGVHDについて評価した。患者10人中の5人(50%)は皮膚(4人の患者)及び結膜(1人の患者)に異常のある軽度のcGVHDであった。
過去10年間の既存対照及び文献報告(グーリーらの文献、同前論文)にあるグレードII〜IVのGVHDの発生率が71%、グレードIII〜IVが14%と比較すると、実施例2は、急性のグレードII〜IV及びグレードIII〜IVのGVHDの発生率が非常に低い(それぞれ23%及び15%)ことを示す。注目すべきは、2つの高用量群において、グレードII〜IVのaGVHDは0%であり、このことは、非常に有効な予防的治療であることを示唆している。
実施例3
アポトーシス細胞の単回投与を受けた移植患者における肝毒性発生率の低減
アポトーシス細胞の単回投与を受けた移植患者における肝毒性発生率の低減
アポトーシス細胞35〜210×106の投与を受けた、全4コホートI〜IV(n=13;カラム2)における肝毒性を発症した移植患者数を、院内記録(n=18)の整合対照群、及び長期記録された移植患者(n=1148;グーリーらの文献、同前論文)双方と比較した。
治療群では肝毒性のあった患者は1例のみであったのに対し(7.7%;図5Aのカラム2)、対応する既存対照では39%(図5Aのカラム1)及び長期記録された移植患者では20%(図5Aのカラム3)であった。注目されるのは、GVHDの肝毒性が、対応する既存対照で観察された39%と比較すると、発明のアポトーシス細胞調製物で治療を受けた高用量治療3群(コホートII〜IV)ではまったく認められなかったことである(図5B)。
実施例4
急性GVHD(aGVHD)血漿バイオマーカーを用いた臨床試験バリデーション
急性GVHD(aGVHD)血漿バイオマーカーを用いた臨床試験バリデーション
臨床結果のさらなるバリデーションを行うために、aGVHD識別因子またはaGVHD予測因子として報告されている血漿バイオマーカーを調べた。IL−2Ra、TNFR1、IL−8及びHGFの4種の血漿バイオマーカーのパネルを、aGVHD患者とそうでない患者を最適に識別する一助となり得、またGVHDの臨床症状を発症している患者でGVHD診断を確定でき、さらにはGVHDの重症度に関係なく生存率についての予後情報を提供できるマーカーとして提案した。
第一に、TNFR1、IL−2Ra、IL−8の血漿中濃度及びHGFの血清中濃度を評価した。図6A、B、E及びFに示すように、aGVHDグレード0〜I群と比較して、aGVHDグレードII〜IV群において明らかに高濃度が認められた。aGVHDグレード0〜I群におけるDay+10、+17、及び+31のTNFRI濃度の中央値は、それぞれ2172pg/ml、2530pg/ml、及び2698pg/mlであった。しかしながら、aGVHDグレードII〜IV群では、TNFRI濃度の中央値はそれぞれ3171pg/ml、3301pg/ml及び4342pg/mlであった。同様に、aGVHDグレード0〜I群におけるIL−2Ra濃度の中央値はそれぞれ3650pg/ml、2916pg/ml、及び2455pg/mlであり、対するaGVHDグレードII〜IV群ではそれぞれ4601pg/ml、8102pg/ml及び3624pg/mlであった。ここでも、aGVHD0〜I群におけるDay+17、+31、及び+45のHGF濃度の中央値はそれぞれ1517pg/ml、1464pg/ml、及び1873pg/mlであり、これに対しaGVHDグレードII〜IV群ではそれぞれ2418pg/ml、3264pg/ml及び2326pg/mlであった。最後に、aGVHDグレード0〜I群におけるDay+10、17及び+31のIL−8の濃度の中央値はそれぞれ48.3pg/ml、22.3pg/ml及び37.1pg/mlであり、これに対するaGVHDグレードII〜IV群ではそれぞれ90.8pg/ml、41.9pg/ml及び61.8pg/mlであった(図6A、図6B、図6E及び図6F)。
いくつかの刊行物では、特にTNFRI濃度に関して、サイトカイン濃度よりも濃度比中央値の使用が好まれている(Ferrara JL Best practice & research clinical haematology 2007, Choi SW et al Transplantation 2012)。しかし、本発明の発明者らがTNFRI比またはほかのサイトカイン比を使用したときでも結果に変わりはなかった(データ図示せず)。
さらに2つのサイトカインIL−15及びIL−7をaGVHDとの相関関係のために報告した。図6Cに示すように、本試験でのaGVHDグレードII〜IV群におけるDay0、+3、+10、+17それぞれのIL−15の血漿中濃度の中央値は33.5pg/ml、30pg/ml、a42pg/ml及び12pg/mlであり、aGVHDグレード0〜I群におけるそれぞれの値18.6pg/ml、15.7pg/ml、15.5pg/ml及び7.0pg/mlに比して有意に高かった。
IL−7も高グレードのGVHDにおいて高かったが(図6G)、主な上昇が認められたのはグレードIII〜IVにおけるDay+10、+17及び+31で、それぞれ8.9pg/ml、32.6pg/ml及び23.0pg/mlであり、対するaGVHD0〜I群ではそれぞれ4.5/ml、10.5pg/ml及び9.0pg/mlであった。
サイトカインの対照として、IL−6及びIL−1bを測定した。期待されたとおり、ほかのサイトカインはGVHDのグレード間の区別なく上昇を示した。
実施例4は、本明細書に提示の臨床データを支持する血漿バイオマーカーを示す。公表されているデータには何が最良のバイオマーカーであるかは記載されていないが、異なる6種のバイオマーカーであるTNFRI、IL−2Ra、HGF、IL−8、IL−15及びIL−7の血漿中濃度は、高〜低グレードかGVHDなしかで明確に識別された。さらなる2つの対照サイトカイン(IL−1b及びIL−6)により知見の特異度がいっそう強調された。
実施例5
炎症性大腸炎でのアポトーシス細胞組成物の改善効果
炎症性大腸炎でのアポトーシス細胞組成物の改善効果
大腸炎寛解におけるアポトーシス細胞の単一注入の治療効果が、2つのIBDモデル、すなわちナイーブCD4細胞の養子T細胞移入(TCT)及びデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)に誘導された大腸炎において試験された。
まず、CD45RBhighのナイーブT細胞が、WT C57BL/6マウスから収集されかつ分類され、RAG酵素を欠く免疫欠損マウスへと養子移入された。移入された細胞の対照として、非ナイーブ(CD45RBlow)T細胞が使用された。150μlのPBS中に早期アポトーシス細胞を含む組成物がT細胞移入の日にマウスに投与され、対照として150μlのPBSが使用された。
4週間後、PBS治療群のマウスは、IBDの臨床徴候、つまり、体重の減少及び粥状便排出を現し始めた。しかしながら、アポトーシス細胞組成物で治療された群は、臨床兆候がみられなかった。アポトーシス細胞治療群は体重が増加したのに対し、CD45RBhighマウス群がそれらの初期体重の17%を失った(図7A、p<0.03)。同様に全体の臨床スコアは、非治療群と比較して、アポトーシス細胞により治療された群において有意に低減された(図7B、p<0.02)。治療群における腸間膜T調節性細胞の上昇は、腸間膜リンパ節でも示された(図7C)。
実施例6
DSSは、NLRP3インフラマソームを介してカスパーゼ−1−依存性プロ−IL−1βプロセシングを誘導する
DSSは、NLRP3インフラマソームを介してカスパーゼ−1−依存性プロ−IL−1βプロセシングを誘導する
IL−1βの増強生産は、DSSに対するマウスのマクロファージの露出の際に検出されることがこれまで示されており、より最近では、NLRP3インフラマソーム依存性であることがインビトロ及びインビボで示された。
インフラマソームの負の調節におけるアポトーシス細胞の可能性のある役割を研究するために、マウスのマクロファージが生成され、DSSに対して露出された。これまでの観察との一致において、図8にみられ得るように、DSSは、マウスのマクロファージからIL−1β放出を誘導することがみられた。LPSでトリガーするトール様レセプター(TLR)とDSSでトリガーするインフラマソームの組合せは、著しいIL−1β分泌へと導いた。図8にみられるように、特異的インヒビターz−YVAD−fmkペプチドによるカスパーゼ−1の阻害は、IL−1β放出のほとんど完全な阻害を導き(p<0.05、独立t検定)、DSS−媒介のIL−1β放出におけるカスパーゼ−1の役割を示した。NLRP3インフラマソームの活性化は、K+流出依存性、リソソーム依存性、及びROS依存性である。実際に、高濃度のKClによるK+流出のブロッキングは、DSS媒介のIL−1β放出を阻害した(図9A、p<0.05、独立t検定)。同様に、バフィロマイシン、空胞のH+ATPaseのインヒビターによるリソソーム酸性化のブロッキングは、IL−1β分泌を阻害した(図9B、p=0.05、独立t検定)。最後に、N−アセチル−L−システイン(NAC)によるROS生成の阻害は、IL−1β分泌を有意に阻害した(図9C、p<0.05、独立t検定)。
DSS媒介のIL−1β分泌がカスパーゼ−1及びNLRP3活性化依存性であることの発見をさらにサポートするために、野生型及びNLRP3−欠損マウスがともに収容され、マクロファージがマウスから抽出され、DSSにさらされた。図9Dにみられ得るように、DSS−誘導L−1β分泌は、NLRP3−欠損マウスから抽出されたマクロファージにおいて有意に低減された(p<0.02、t検定)。
実施例7
アポトーシス細胞組成物による治療は、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)モデルにおいて抗炎症効果を示す
アポトーシス細胞組成物による治療は、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)モデルにおいて抗炎症効果を示す
Balb/cマウスに3%のDSSを飲料水に8〜9日間投与することにより、DSS媒介腸炎症モデルにおいてインビボで、アポトーシス細胞組成物を用いる治療の効果がさらに試験された。体重、直腸あたりの潜伏性のまたは全体の血液の存在、糞便の一貫性を含む、炎症性大腸疾患(IBD)スコアパラメータが毎日測定された。
DSSに加えてアポトーシス細胞で治療されたマウスは、DSSのみにより治療されたマウスと比較して、6日目から開始する体重減少が有意に少なくなることを示した(図10A、p<0.05及び0.001、t検定)。臨床スコア分析は、評価された全てのパラメータにおいて、アポトーシス細胞により治療されたマウスにおいて重度の大腸炎が有意に少なくなることを明らかにした(図10B、p<0.01、t検定)。マクロ的試験では、DSSで治療された結腸は、深刻に炎症性かつ充血性であり、大量の下痢による糞便の減少を含んだ。アポトーシス細胞により治療した場合には、結腸は、発症が低減され、DSSのみにより治療されたマウスの結腸よりもより長かった(9.4±0.14cm対8.9±0.2、p<0.05)(図10C)。
次に、IL−1βレベルが、アポトーシス細胞組成物による治療を含みまたは含まずに、DSSにより治療されたマウスの結腸ホモジネートで測定された。DSS摂取7日後に、IL−1βレベルが、アポトーシス細胞組成物により治療されないマウスの結腸で、有意に上昇した(図10D、p<0.02、t検定)。しかしながら、DSS摂取前に、単一のアポトーシス細胞注入により治療されたマウスにおいて、同様の上昇は観察されなかった。
示された観察をさらに確立するために、結腸組織の組織学的及び免疫組織化学的分析が、DSS摂取後の9日目に得られた。バイオプシーは、アポトーシス細胞により治療されたマウスにおける、炎症性細胞によるより少ない重度の粘膜浸入及び低減された組織損傷を有意に示し、有意に改善された組織学的大腸炎の重症度のスコアへと変換した(図11A、I〜III、p<0.05、t検定)。本分析は、異なる群に対して盲検の病理医により行われた。IL−1βは、炎症部位で好中球の蓄積を誘導することが知られているので、結腸炎症における好中球の範囲が評価された。好中球浸入は、アポトーシス細胞治療を受けなかったマウスの結腸組織においてより著しく高かった。アポトーシス細胞治療による好中球浸入における飛躍的な軽減をさらに示すために、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)染色が、ヘマトキシリン染色(図11B)と組み合わされた。実際に、DSS治療マウスは、結腸におけるMPO染色好中球の飛躍的な増加を示したが、アポトーシス細胞による単一の治療は、MPO染色好中球蓄積を著しく低減した。
シクロオキシゲナーゼ(COX)は、炎症促進性プロスタグランジンの形成における重要なステップを触媒し、IL−1βにより誘導されることを示した。Cox2カスケードの主要な産物はPGE2であり、これは、急性の炎症正反応における重要な媒介物である。実際に、Cox2免疫染色は、非治療結腸と比較してDSS治療結腸における正細胞の数の劇的な上昇を示した(図12)。アポトーシス細胞治療が適用された場合、著しい低減が観察された。
実施例8
DSS誘導大腸炎におけるアポトーシス細胞によるインビボNF−κB阻害
DSS誘導大腸炎におけるアポトーシス細胞によるインビボNF−κB阻害
NF−κBは、通常、抑制タンパク質であるIκBαとの会合により、細胞質に隔離される。NF−κBの活性化は、IκBαをリン酸化するIKK複合体の刺激を伴い、その分解及び活性化NF−κBの核転送をトリガーする。NF−κBシグナリングを試験するために、DSS誘導大腸炎を有するマウス由来の結腸組織におけるIκBαのリン酸化が試験され、アポトーシス細胞による治療後のDSSにさらされたマウスと比較された。かなり高い数のpIκBα−正細胞が、アポトーシス細胞によっても治療された結腸と比較して、DSSのみにより治療された結腸において観察された(図13)。NF−κBシグナリングの阻害が、免疫染色により検出される核のリン酸−p65NF−κBについて陽性であった細胞数の低減によりさらに確認された(図14)。
実施例9
アポトーシス細胞は、マクロファージ由来のインフラマソーム誘導IL−1β放出を阻害する
アポトーシス細胞は、マクロファージ由来のインフラマソーム誘導IL−1β放出を阻害する
TLRアゴニストにさらされたマクロファージによるIL−1β放出の阻害が示されるが、NLRP3特異的活性化の際にそれらが分泌を阻害し得るかどうかは知られていない。インフラマソーム−誘導IL−1β放出の際のアポトーシス細胞組成物の影響を試験するために、単離されたマクロファージは、アポトーシス細胞とのより早期の相互作用の有無にかかわらず、リポ多糖(LPS)及びDSSに2時間さらされた。
マクロファージ及びアポトーシス細胞をインキュベートすることは、TLR及びインフラマソームのトリガーの不存在下におけるIL−1β分泌に影響を与えなかった。しかしながら、LPS及びDSSの存在下でのアポトーシス細胞治療前に、z−YVAD、KCl、バフィロマイシン及びNACと同様の阻害率で、マクロファージからのIL−1β分泌を有意に阻害し、アポトーシス細胞がインフラマソーム経路を負にシグナルすることを示唆した(図15A、p<0.01、独立t検定)。アポトーシス細胞の負のシグナリングサイトカラシンDのレベルをさらに示すために、アクチン重合を阻害する薬物が、貪食を防止して排除するために使用された。このアプローチを用いて、貪食のないマクロファージに対するアポトーシス細胞の結合は、IL−1β分泌の阻害のために完全に十分であることが示された(図15B、*p<0.01、一元配置分散分析法)。
NF−κシグナリングによりトリガーするTLRについての必要性と、アポトーシス細胞がNF−κBを阻害し、よって、インフラマソーム阻害の不存在下でIL−1β分泌を阻害することができるという事実とを前提としてし、IL−1β分泌がアポトーシス細胞によりNF−κB及びNLRP3レベルの両方で阻害されるかどうかを解明するために一連の実験が開始された。レジデントな腹膜のマクロファージ(pMΦ)が、アポトーシス細胞とともにインキュベートされ、洗浄され、及び種々のインフラマソーム誘導因子による刺激後に、LPSにより薬物刺激され、またはLPSにより最初に薬物刺激され、新規のプロIL−1β転写の蓄積を可能にし、その後、アポトーシス細胞及び誘導因子により処理された。
アポトーシス細胞治療の前に、転写前レベルで活性化されたIL−1βの分泌が阻害されるが、それはNF−κB経路の阻害に起因すると考えられる。しかし、より重要なことに、阻害効果、例えば、IL−1β分泌は、新規なIL−1βの蓄積後、つまり、LPSプライミング後にも観察された。この阻害は、ナイジェリシン、ピロリン酸カルシウム(CPPD)、及び尿酸一ナトリウム(MSU)を含む、NLRP3インフラマソームトリガーメカニズムの3つの異なる活性化物質を用いて得られ、NLRP3インフラマソームでのより強いインヒビターの影響を示唆した(図15CからE、p<0.001、一元配置分散分析法)。転写後レベルの分泌の阻害は、サイトカラシンDを用いても取得され得、それは、貪食のないアポトーシス細胞の認識の際にインフラマソームの負のシグナリングをさらに支持する(データ図示せず)。
結果は、プロIL−1β(p35)及び切断されて分泌されたIL−1β(p17)に対するウェスタンブロット分析によりさらに検証された。マクロファージ(pMΦ)は、1時間のLPSプライミングへと続く2時間のアポトーシス細胞の存在下で(転写前に送達されたApoCell)インキュベートされ、または1時間のLPS(NF−κBシグナリングを促進するための)によりまずプライムされ、その後、2時間アポトーシス細胞によりインキュベートされた(転写後に送達されたApoCell)。マクロファージは、その後、任意に、インフラマソーム誘導因子である、ナイジェリシン(2.5μM)または二水和ピロリン酸カルシウム200μg/mL(CPPD)とともにインキュベートされた。
ELISA結果と同様に、アポトーシス細胞処理前のLPSまたはLPS前のアポトーシス細胞により処理された上清のマクロファージにおける減少した切断IL−1βサブユニットが観察された(図16A〜図16B、IL−1β、上側のパネル)。それ自身によりプライミングするLPSは、上清にはないが、細胞溶解分画にみられ得るマクロファージにおける新規なプロIL−1βの蓄積へと導くのは、注目すべきである(図16AからBにおける左側から3つ目のレーン、IL−1β、下側のパネル)。IL−1βレベルの減少は、LPSによりトリガーするNF−κBがアポトーシス細胞に対する露出前も可能である場合であってもみられた。比較可能な結果は、カスパーゼ−1のより少ない活性化が、異なる誘導物質の存在下で、アポトーシス細胞処理後の転写前及び転写後のレベルで測定された、カスパーゼ−1により示される。
ウェスタンブロット分析は、アポトーシス細胞及びLPSがそれ自身により、インフラマソームトリガーの不存在下での成熟したIL−1βの分泌またはカスパーゼ−1活性化に影響を及ぼさないことを確認するためにも使用された。実際に、成熟したIL−1βの分泌またはカスパーゼ−1の活性化が、転写前及び転写後の両レベルで観察され、NLRP3−インフラマソームの関与を示した(図17A〜図17B)。まとめると、アポトーシス細胞は、NF−κB及びNLRP3に明確な阻害効果を有するようである。
実施例10
アポトーシス細胞抗インフラマソーム効果は、ROS、リソソーム安定化、及びK+流出を介して媒介される
アポトーシス細胞抗インフラマソーム効果は、ROS、リソソーム安定化、及びK+流出を介して媒介される
NLRP3インフラマソームの活性化は、ROS−依存性であることが示唆され、実際に多くのNLRP3刺激物質は、ROS生成も誘導する。DSSは、IL−1βの蓄積及びNLRP3活性化中にROSを生成することも発見された。
ROS生成の際のアポトーシス細胞治療の効果は、蛍光顕微鏡検査法及びリアルタイムフローサイトメトリーの両方により試験された。これまでの観察による一致では、DSSとインキュベートされた腹膜マクロファージは、ROSの別の誘導因子、ピオシアニンと同様に、ROSを誘導することがみられた(図18)。マクロファージがアポトーシス細胞とともに前処理された場合、その後DSSで処理され、著しく有意なROS生成の低減がみられた(図18及び図19、p<0.05、一元配置分散分析法)。低減は、ROSインヒビターであるN−アセチル−システイン(NAC)により得られる効果と同様である。
NLRP3活性化における重要なメカニズムとして説明される第2のメカニズムは、次々にインフラマソームをトリガーするリソソーム内容物のサイトゾル放出を導く、リソソーム損傷である。また、DSSがリソソーム損傷によりインフラマソームをトリガーすることが示唆された。アポトーシス細胞がリソソーム損傷を防止するかどうかを試験するために、サイトゾル染色が、DNA及びRNAと単量体結合される場合には緑の蛍光を、酸性のコンパートメントで二量体化する場合には赤の蛍光を発光する染料、アクリジンオレンジにより行われた。赤の蛍光の程度は、細胞内酸性リソソームのレベルと関連する。
DSS処理は、赤の蛍光強度の有意な減少をもたらし(図20A、p<0.05、一元配置分散分析法)、リソソーム損傷を示し、DSS及び結晶についてのこれまでの所見と一致する。マクロファージがDSS投与前にアポトーシス細胞で処理された場合、酸性のコンパートメントの数の有意な増加が検出され、リソソームコンパートメントの安定化を示唆した(図20A、p<0.03、一元配置分散分析法)。この観察は、共焦点顕微鏡を用いて確認され、マクロファージがDSSで処理された場合に、より拡散したサイトゾル染色パターンを示し、リソソームの破裂を示した(データ図示せず)。しかしながら、DSS投与前にアポトーシス細胞により処理される場合には、リソソームは無傷なようであった。まとめると、このデータは、リソソームコンパートメント安定化は、アポトーシス細胞によるインフラマソーム調節を伴うことを示唆している。
第3のNLRP3活性化メカニズムは、ATP及びP2X7レセプターを介して、または孔形成トキシンによる細胞内イオン環境における変化を伴うことが示唆され、おそらく、パネキシン1をも伴う。K+流出をブロッキングすることまたは高濃度のK+を適用することは、DSSを含む、多くの試剤によりNLRP3インフラマソーム活性化を防止した。
アポトーシス細胞の存在下におけるK+流出の役割を評価するために、LPS及びナイジェリシン投与後に、IL−1β分泌を阻害する際に、アポトーシス細胞により前処理されたマクロファージの効果が試験された。図20Bにみられるように、IL−1β分泌は、実際に、高濃度では適格性が少なくなるものの、アポトーシス細胞により用量依存的に最大70%まで阻害された。
実施例11
ApoCell細胞調製物は、メチルプレドニゾロンを含む
ApoCell細胞調製物は、メチルプレドニゾロンを含む
ApoCell最終産物のメチルプレドニゾロンの量を測定するために、細胞調製物が、本発明の産生方法にしたがって産生された。調製中に、細胞は、50μg/mLメチルプレドニゾロンを含むインキュベーション培地中で6時間インキュベートされた。アポトーシス誘導の最後に、細胞は洗浄され、PBSに再懸濁された。品質管理試料の収集後のApoCell産物の最終的な量は、300mlであった。ApoCell最終産物の上清におけるメチルプレドニゾロンの残留量は、3回の実行から調製される最終産物で測定された。メチルプレドニゾロンレベルが、逆相液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて測定された。分析は、イスラエル国レホヴォトのスペクトラボ分析研究所(Spectrolab Analytical Laboratory)により権限が与えられて、実行された。ApoCell最終産物における残留メチルプレドニゾロンのレベルを下表3に示す。
最終産物における残留メチルプレドニゾロンの濃度の範囲は、ApoCell産物の最も低い投与量では3.7mg/Lであり、最も高い投与量では21.9mg/Lである。最終的な投与量における総メチルプレドニゾロンの範囲は、ApoCell投与量に相関する1.11〜6.57mgである。結果は、最も高いコホートを含む、ApoCellに存在するメチルプレドニゾロンの量が、骨髄移植中の一般的な治療プロトコルの一部として、患者が受けるメチルプレドニゾロンの投与量に対してわずかであることを示す。
実施例12
ApoCell細胞調製物収量での高トリグリセリドレベルを含む血漿の影響
ApoCell細胞調製物収量での高トリグリセリドレベルを含む血漿の影響
ApoCell組成物の細胞収量での高レベルのトリグリセリド(TG)を含む血漿の影響を測定するために、細胞は、正常なトリグリセリドレベルを有する健常なドナーから収集され、抗凝固剤を含まない凍結培地で凍結された。解凍後に、細胞は4つの処理群に分けられた。
(1)正常なトリグリセリドレベルを有する、自己血漿を含むインキュベーション培地におけるインキュベーション。
(2)正常なトリグリセリドレベルを有する、異種性の血漿を含むインキュベーション培地におけるインキュベーション。
(3)23.5ミリモル/リットルのTGレベルを有する、異種性の高脂血症の血漿を含むインキュベーション培地におけるインキュベーション。
(4)5.6ミリモル/リットルのTGレベルを有する、異種性の高脂血症の血漿を含むインキュベーション培地におけるインキュベーション。
(1)正常なトリグリセリドレベルを有する、自己血漿を含むインキュベーション培地におけるインキュベーション。
(2)正常なトリグリセリドレベルを有する、異種性の血漿を含むインキュベーション培地におけるインキュベーション。
(3)23.5ミリモル/リットルのTGレベルを有する、異種性の高脂血症の血漿を含むインキュベーション培地におけるインキュベーション。
(4)5.6ミリモル/リットルのTGレベルを有する、異種性の高脂血症の血漿を含むインキュベーション培地におけるインキュベーション。
表4で示す結果から分かるように、高トリグリセリドレベルを含む血漿の存在下でのインキュベーションは、より低いApoCell収率をもたらした(An+=アネキシンV染色についての陽性の細胞、PI−=ヨウ化プロピジウム染色について陰性である細胞)。同様に、表5に示される結果にみられるように、本明細書で上記実施例1から4と同じ方法を用いて、高トリグリセリドレベルを有するドナーから、本発明の細胞調製物を調製することは、低いApoCell収量をもたらした。
実施例13
高トリグリセリドレベルを含む血漿の存在下でのApoCell細胞調製物収量に対する抗凝固剤の影響
高トリグリセリドレベルを含む血漿の存在下でのApoCell細胞調製物収量に対する抗凝固剤の影響
ApoCellの産生中の抗凝固剤の添加が、高くて安定した細胞収率をもたらすかどうかを測定するために、細胞は、白血球除去法を用いて健常なドナーから収集され、本明細書に記載されるApoCell産物を産生するために使用された。産生中に、細胞は凍結培地で凍結され、ともにいずれかを含むインキュベーション培地でインキュベートされた。
1.正常なトリグリセリドレベルを有する自己血漿。凍結時またはインキュベーション培地に抗凝固薬をいれない。
2.正常なトリグリセリドレベルを有する健常なドナーからの異種性の血漿。凍結時またはインキュベーション培地に抗凝固薬をいれない。
3.高トリグリセリドレベルを有する異種性の高脂血症の血漿。凍結時またはインキュベーション培地に抗凝固薬をいれない。
4.高トリグリセリドレベルを有する異種性の高脂血症の血漿(3項と同じ)及び5%抗凝固剤溶液(ACD処方A+10U/mlのへパリン)。
1.正常なトリグリセリドレベルを有する自己血漿。凍結時またはインキュベーション培地に抗凝固薬をいれない。
2.正常なトリグリセリドレベルを有する健常なドナーからの異種性の血漿。凍結時またはインキュベーション培地に抗凝固薬をいれない。
3.高トリグリセリドレベルを有する異種性の高脂血症の血漿。凍結時またはインキュベーション培地に抗凝固薬をいれない。
4.高トリグリセリドレベルを有する異種性の高脂血症の血漿(3項と同じ)及び5%抗凝固剤溶液(ACD処方A+10U/mlのへパリン)。
各処理群由来の細胞が、実験にわたって、それらが凍結されるのと同じ血漿にさらされた。
実施例11に示される結果と一致して、表6の結果は、高血漿レベルのトリグリセリドは、処理3にみられるように(凍結細胞の10.4%)、ApoCell細胞調製物の低収量をもたらすことを示す。予想外に、調製プロセス中の抗凝固剤の添加は、防止効果を有し、よって、処理4にみられるように、標準的な細胞調製物の収量の達成を可能にする(凍結細胞の42.6%)。
実施例14
ApoCell細胞−調製物の収量は、調製プロセスの各ステージ中の抗凝固剤の添加に影響される
ApoCell細胞−調製物の収量は、調製プロセスの各ステージ中の抗凝固剤の添加に影響される
最終的な調製物の細胞収量への、ApoCellの産生の異なるステージ中の抗凝固剤添加の影響を試験するために、細胞が、2つの異なる医療センター(メディカルセンター1及び2と表示される)で、同じ3人の健常なドナー(0036、0037、及び0038で表示される)から白血球除去法により収集された。さらに、メディカルセンター1で、細胞がさらに2人の健常なドナーから収集された(0039−1及び0040−1で表示される)。メディカルセンターでの細胞収集は、以下のように、細胞収集中の抗凝固剤添加のプロトコルが異なっていた。
1.センター1−5000Uのヘパリン(ヘパリンナトリウム、フレゼニウス社(Fresenius)製)が酸性のクエン酸デキストロースフォーミュラA(ACDフォーミュラA)のバック内に注入され、小フラクションがドナーと収集バック(細胞及び血漿)に到達するように、ヘパリン及びACDフォーミュラAが白血球除去装置で循環する。
2.センター2−5000Uのヘパリン(ヘパリンナトリウム、フレゼニウス社製)が直接細胞収集バックに注入され、よってヘパリンは白血球除去装置内で循環せず、ドナーに到達せず、血漿収集バックに到達しない。ACDフォーミュラAは、しかしながら、装置内を循環し、ドナーと収集バック(細胞及び血漿)に到達する。
1.センター1−5000Uのヘパリン(ヘパリンナトリウム、フレゼニウス社(Fresenius)製)が酸性のクエン酸デキストロースフォーミュラA(ACDフォーミュラA)のバック内に注入され、小フラクションがドナーと収集バック(細胞及び血漿)に到達するように、ヘパリン及びACDフォーミュラAが白血球除去装置で循環する。
2.センター2−5000Uのヘパリン(ヘパリンナトリウム、フレゼニウス社製)が直接細胞収集バックに注入され、よってヘパリンは白血球除去装置内で循環せず、ドナーに到達せず、血漿収集バックに到達しない。ACDフォーミュラAは、しかしながら、装置内を循環し、ドナーと収集バック(細胞及び血漿)に到達する。
よって、メディカルセンター1及び2の産生方法の主な相違点は、収集バック中のヘパリンの濃度である。メディカルセンター2での細胞収集バック中のヘパリンの濃度は、メディカルセンター1での細胞収集バック中のヘパリンの濃度と比較して高い。また、メディカルセンター2における血漿収集バックには、実質的にヘパリンが含まれていない。
2つの医療センターでの以下の細胞収集後に、4つの条件下で収集された細胞からApoCell細胞調製物が産生された。
1.F−/Inc−=凍結、インキュベーション、または洗浄ステップ中に抗凝固薬が添加されなかった。
2.F−/Inc+=凍結及び洗浄中に抗凝固薬が添加されなかったが、インキュベーション中には添加された。
3.F+/Inc+=凍結中、凍結後の洗浄ステップ中、及びインキュベーション中に抗凝固薬が添加された。
4.F+/Inc−=凍結中及び凍結後の洗浄ステップ中に抗凝固薬が添加されたが、インキュベーション中には添加されなかった。
1.F−/Inc−=凍結、インキュベーション、または洗浄ステップ中に抗凝固薬が添加されなかった。
2.F−/Inc+=凍結及び洗浄中に抗凝固薬が添加されなかったが、インキュベーション中には添加された。
3.F+/Inc+=凍結中、凍結後の洗浄ステップ中、及びインキュベーション中に抗凝固薬が添加された。
4.F+/Inc−=凍結中及び凍結後の洗浄ステップ中に抗凝固薬が添加されたが、インキュベーション中には添加されなかった。
本実験中に抗凝固剤を含む各凍結用培地、インキュベーション用培地または洗浄用培地は、5%抗凝固薬を含んでいた。実験中に使用された抗凝固薬は、10U/mlのへパリンが添加されたACDフォーミュラAであった。
表7に示されるように、凍結またはインキュベーション中の抗凝固薬の添加なしに産生されたApoCell細胞調製物の平均収量は、メディカルセンター2のほうがメディカルセンター1よりも低かった(それぞれ、25.2対51.4%)。インキュベーション中またはインキュベーション及び凍結中の抗凝固薬の添加は、メディカルセンター1及び2の両方において、40%以上の高く安定した細胞収量をもたらした。よって、インキュベーション中またはインキュベーション及び凍結中の抗凝固薬の添加は、細胞収集条件に関わらず、ApoCell細胞調製物の高い収量をもたらす。表7中の収量の値は、組成物が由来する凍結収集細胞からのApoCell組成物における細胞を指す。
実施例15
ApoCell細胞調製物内の多形核の細胞の特徴づけ
ApoCell細胞調製物内の多形核の細胞の特徴づけ
ApoCell細胞調製物内の顆粒球のパーセンテージを評価するために、多形核の細胞のパーセンテージが、白血球除去法により収集される細胞内、及び各収集物から産生されたApoCell組成内で測定された(Col−同じ患者由来の試験された細胞収集の数)。表8に示されるように、ApoCell組成物内の顆粒球のパーセンテージは、白血球除去法で収集された単核に富む細胞分画内の多形核の細胞パーセンテージよりもかなり低い。
本発明は、その具体的な実施形態に関連して記載したが、多くの代替形態、変更形態、変形形態が当業者に明白であることは明らかである。したがって、本発明の趣旨及び添付の特許請求の範囲に含まれる代替形態、変更形態、変形形態が全て包含されることが意図される。
本明細書で言及した全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的に及び個々に参照により本明細書に組み込まれることが示されるのと同じ程度に、明細書内に参照によりそれらの全体においてここに組み込まれる。また、本明細書におけるあらゆる参考文献の列挙及び確認は、そのような参考文献が、本発明の先行技術として利用可能であることを認めるとは解釈されるべきではない。見出しが使用されるという程度で、それらは必須の限定として解釈されるべきではない。
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