JP2024005979A - 肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための組成物および対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法およびキット - Google Patents

肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための組成物および対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法およびキット Download PDF

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【課題】本開示の目的の１つは、肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための組成物を提供することである。本開示の目的の１つは、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法またはキットを提供することである。【解決手段】肉芽腫を処置および／または予防するための、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む組成物が提供される。肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む組成物が提供される。また、対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルに基づいて、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法またはキットが提供される。【選択図】図１８

Description

本開示は、肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための組成物、および、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法およびキットに関する。
肉芽腫は、病原性微生物や不溶性異物に対する生体防御反応として生じる慢性炎症の一つであり、マクロファージ系の細胞を中心に様々な炎症細胞が集積して形成される。肉芽腫を伴う疾患として、サルコイドーシス、結核およびハンセン病などの抗酸菌感染症、環状肉芽腫、クローン病などが知られている。
サルコイドーシスは、皮膚、肺、眼、心臓などに肉芽腫をきたす疾患であり、肺線維症や不整脈を引き起こした場合は致死的である。現状では原因不明であり根治療法といえるものはない。ＪＡＫ阻害剤はサルコイドーシスの新たな治療薬の可能性があり現在治験が行われている（非特許文献１）。しかしながら、ＪＡＫ阻害剤には発がん性、免疫抑制といった全身性の副作用があり、長期の服用に適していない。
肉芽腫は病理組織学的に診断され、皮膚の肉芽腫は比較的診断しやすいが、肺、眼、心臓、肝臓、腎臓、リンパ節、神経、筋などの肉芽腫の診断は困難である。サルコイドーシスの血液検査には、マーカーとしてアンギオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）が使用されている。
William Damsky, Durga Thakral, Nkiruka Emeagwali, Anjela Galan, Brett King, Tofacitinib Treatment and Molecular Analysis of Cutaneous Sarcoidosis, N Engl J Med. 2018 Dec 27;379(26):2540-2546
本開示の目的の１つは、肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための組成物を提供することである。本開示の目的の１つは、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法またはキットを提供することである。
本発明者らは、肉芽腫に含まれるマクロファージおよびサルコイドーシス患者の血中ではペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルが高いことを見出し、さらに、ペントースリン酸経路に関連する酵素を阻害することにより、肉芽腫の形成が抑制されることを見出した。
従って、ある態様では、肉芽腫を処置および／または予防するための、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む組成物が提供される。
ある態様では、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む、肉芽腫を伴う疾患の処置および／または予防用の組成物が提供される。
ある態様では、対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルに基づいて、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法が提供される。
ある態様では、ペントースリン酸経路に関連する酵素に特異的に結合する試薬またはペントースリン酸経路に関連する酵素の遺伝子発現を測定するための試薬を含む、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するためのキットが提供される。
本開示は、肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するために、または、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するために有用である。
正常皮膚およびサルコイドーシス皮膚の抗原提示細胞の遺伝子発現によるクラスタリングを示す。 正常皮膚およびサルコイドーシス皮膚の抗原提示細胞の分画別割合を示す。 サルコイドーシス皮膚の抗原提示細胞の分画別遺伝子発現を示す。 正常皮膚およびサルコイドーシス皮膚病変における、ＣＤ６８、ＦＢＰ１およびＣＤ１６３の免疫染色像を示す。 正常皮膚、アトピー性皮膚炎、乾癬、環状肉芽腫、ハンセン病およびサルコイドーシスの皮膚病変における、ＡＣＥ、ＦＢＰ１およびＳＴＡＴ１の発現を示す。 正常皮膚、アトピー性皮膚炎、乾癬、サルコイドーシスおよび環状肉芽腫の皮膚病変における、ＣＤ１６３およびＦＢＰ１の免疫染色像を示す。 肺、心臓およびリンパ節のサルコイドーシス病変における、ＣＤ１６３、ＦＢＰ１およびＣＤ６８の免疫染色像を示す。 グルコース代謝経路の模式図である。 サルコイドーシス皮膚の抗原提示細胞の分画別遺伝子発現（ペントースリン酸回路に関係した遺伝子）を示す。 皮膚、肺、心臓およびリンパ節のサルコイドーシス病変における、ＣＤ１６３、ＦＢＰ１およびＧ６ＰＤの免疫染色像を示す。 サルコイドーシス患者と健常人の血清ＦＢＰ１濃度を示す。 ヒト単球をサイトカインの存在下で３日間培養した後のギムザ染色像を示す。 ヒト単球をサイトカインの存在下で３日間培養した後のＦＢＰ１とＧ６ＰＤ遺伝子発現を示す。 ヒト単球をサイトカインおよびＦＢＰ阻害剤、６ＡＮまたはトファチニブの存在下で３日間培養した後のギムザ染色像と巨細胞数を示す。 ヒト単球をサイトカインの存在下で３日間培養し、ＦＢＰ阻害剤、６ＡＮまたはトファチニブの存在下でさらに３日間培養した後のギムザ染色像と巨細胞数を示す。 ヒト単球をサイトカインおよびＦＢＰ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの存在下で３日間培養した後のギムザ染色像、ＦＢＰ１遺伝子発現および融合率を示す。 ６ＡＮ投与群と非投与群の炎症誘導マウスの代表的な皮膚組織像を示す。 ６ＡＮ投与群と非投与群の炎症誘導マウスの耳介厚を示す。 炎症誘導マウスの耳介に浸潤しているＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージおよび単球の数を、６ＡＮ投与群と非投与群で比較した結果を示す。
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間のすべての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。
本開示において、対象はいかなる種であってもよく、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）、好ましくはヒトである。
肉芽腫は、単球およびマクロファージ系の単核食細胞が結節状に浸潤した状態であり、感染性のものと非感染性のものがある。肉芽腫は、病理組織学的に、異物型、化膿型、サルコイド型、類結核型、柵状、間質型に分類される。本開示において、肉芽腫はいかなる分類のものであってもよく、例えば、サルコイド型、類結核型または柵状肉芽腫である。肉芽腫は様々な疾患において生じ、例えば、サルコイドーシス、環状肉芽腫、抗酸菌感染症（結核、ハンセン病、非結核性抗酸菌症など）およびクローン病において生じ得る。ある実施態様では、肉芽腫は環状肉芽腫、抗酸菌感染症またはクローン病における肉芽腫である。肉芽腫が形成される部位は限定されず、例えば、皮膚、肺、眼、心臓、肝臓、腎臓、リンパ節、神経、筋が挙げられる。ある実施態様では、肉芽腫は、皮膚、肺、心臓またはリンパ節、特に皮膚で形成される肉芽腫である。
ペントースリン酸経路は、グルコース代謝経路において、グルコース６－リン酸をリボース５－リン酸またはキシルロース－５－リン酸に代謝する経路である。その前段階で、フルクトース１，６－ビスリン酸がグルコース６－リン酸に変換される。これらの反応を含むグルコース代謝経路の一部を図８に示す。本開示において、「ペントースリン酸経路に関連する酵素」は、グルコース代謝経路においてフルクトース１，６－ビスリン酸がリボース５－リン酸またはキシルロース－５－リン酸に代謝される過程で作用する酵素を意味し、フルクトース－１，６－ビスホスファターゼ１（ＦＢＰ－１）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ（ＧＰＩ）、グルコース－６－リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤ）、６－ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬＳ）、６－ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤ）、リブロースホスフェート３－エピメラーゼ（ＲＰＥ）およびリボースホスフェートイソメラーゼ（ＲＰＩ）を含む。好ましくは、酵素は、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤまたは６ＰＧＤであり、より好ましくはＦＢＰ－１またはＧ６ＰＤである。
フルクトース－１，６－ビスホスファターゼ１（ＦＢＰ－１）は、フルクトース－１，６－ビスリン酸をフルクトース－６－リン酸に変換する酵素である。ＦＢＰ－１の代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１２１１００．１（ヒト、配列番号１）およびＮＰ＿０６２２６８．１（マウス、配列番号２）として登録されている。本開示において、ＦＢＰ－１は、すべての対立遺伝子の産物を含む。
グルコースフォスフェートイソメラーゼ（ＧＰＩ）は、フルクトース－６－リン酸をグルコース－６－リン酸に変換する酵素である。ＧＰＩの代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１７１６５１．１（ヒト、配列番号３）およびＮＰ＿０３２１８１．２（マウス、配列番号４）として登録されている。本開示において、ＧＰＩは、すべての対立遺伝子の産物を含む。
グルコース－６－リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤ）は、グルコース－６－リン酸をグルコノ－１，５－ラクトン－６－リン酸に変換する酵素である。Ｇ６ＰＤの代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００３９３．４（ヒト、配列番号５）、ＮＰ＿０３２０８８．１（マウス、配列番号６）およびＮＰ＿０６２３４１．２（マウス、配列番号７）として登録されている。本開示において、Ｇ６ＰＤは、すべての対立遺伝子の産物を含む。
６－ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬＳ）は、グルコノ－１，５－ラクトン－６－リン酸を６－ホスホグルコン酸に変換する酵素である。ＰＧＬＳの代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３６２２０．１（ヒト、配列番号８）およびＮＰ＿０７９６７２．１（マウス、配列番号９）として登録されている。本開示において、ＰＧＬＳは、すべての対立遺伝子の産物を含む。
６－ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤ）は、６－ホスホグルコン酸をリブロース－５－リン酸に変換する酵素である。６ＰＧＤの代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２６２２．２（ヒト、配列番号１０）およびＮＰ＿００１０７４７４３．１（マウス、配列番号１１）として登録されている。本開示において、６ＰＧＤは、すべての対立遺伝子の産物を含む。
リブロースホスフェート３－エピメラーゼ（ＲＰＥ）は、リブロース－５－リン酸をキシルロース－５－リン酸に変換する酵素である。ＲＰＥの代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２６５２１１．１（ヒト、配列番号１２）およびＮＰ＿００１２９７５７１．１（マウス、配列番号１３）として登録されている。本開示において、ＲＰＥは、すべての対立遺伝子の産物を含む。
リボースホスフェートイソメラーゼ（ＲＰＩ）は、リブロース－５－リン酸をリボース－５－リン酸に変換する酵素である。ＲＰＩの代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６５３１６４．２（ヒト、配列番号１４）およびＮＰ＿０３３１０１．２（マウス、配列番号１５）として登録されている。本開示において、ＲＰＩは、すべての対立遺伝子の産物を含む。
本開示に関して、ペントースリン酸経路に関連する酵素は、その機能が維持されている限り、本来のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加した配列を含んでいてもよい。「数個」とは、好ましくは２～７個、より好ましくは２～５個、最も好ましくは２～３個のアミノ酸を意味する。アミノ酸置換は、類似するアミノ酸残基間の保存的置換が好ましい。
また、ペントースリン酸経路に関連する酵素は、その機能が維持されている限り、本来のアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ等を用いて計算したときに（例えば、ＢＬＡＳＴのデフォルト、即ち初期条件のパラメーターを用いた場合に）、少なくとも約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９７％、約９８％もしくは約９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
後述する実施例により立証される通り、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を対象に投与することにより、肉芽腫を処置および／または予防し得る。本開示において、「肉芽腫を処置する」または「肉芽腫の処置」は、肉芽腫を有する対象において、肉芽腫の進行を遅延または停止させること、および／または、肉芽腫を軽減、緩和、改善または除去することを意味する。
本開示において、「肉芽腫を予防する」または「肉芽腫の予防」は、対象において、特に、肉芽腫を形成するリスクがある対象において、肉芽腫形成を防止すること、または、肉芽腫を形成する可能性を低減することを意味する。肉芽腫を形成するリスクがある対象には、例えば、サルコイドーシス、抗酸菌感染症およびクローン病などの肉芽腫を伴う疾患の患者が含まれる。
また、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を対象に投与することにより、肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防し得る。本開示において、「疾患を処置する」または「疾患の処置」は、疾患を有する対象において、疾患の進行を遅延または停止させること、および／または、疾患を軽減、緩和、改善または除去することを意味する。
本開示において、「疾患を予防する」または「疾患の予防」は、対象において、特に、疾患を発症する可能性が高いが、未だ発症していない対象において、疾患の発症を防止すること、または、疾患を発症する可能性を低減することを意味し、ここで、疾患の発症には再発が含まれる。
本開示において、「ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤」は、ペントースリン酸経路に関連する酵素の活性または発現を阻害する物質を意味する。当該阻害剤は、例えば、ペントースリン酸経路に関連する酵素の活性または発現を阻害する化合物、ペプチド、抗体または核酸であり得る。ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤として知られている物質、例えば、阻害剤として販売されている物質を使用することができる。インビトロまたはインビボの実験系でペントースリン酸経路に関連する酵素の活性または発現を阻害する物質を同定し、使用してもよい。
ＦＢＰ－１阻害剤として、例えば、２，５－ジクロロ－Ｎ－（５－クロロ－２－ベンゾキサゾリル）－ベンゼンスルホンアミド、ＭＢ０５０３２、ＭＢ０６３２２を使用し得る。Ｇ６ＰＤおよび６ＰＧＤの阻害剤として、例えば、６－アミノニコチンアミドを使用し得る。ＧＰＩの阻害剤として、例えば、２－デオキシ－Ｄ－グルコースを使用し得る。
ペントースリン酸経路に関連する酵素の活性または発現を阻害する核酸は、これらの酵素の遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾等のいかなる段階を阻害するものであってもよく、酵素活性を阻害するものであってもよい。このような核酸として、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、核酸アプタマー、デコイ核酸等が挙げられる。ペントースリン酸経路に関連する酵素の発現を阻害する核酸は、例えば、ｓｉＲＮＡである。
ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを特異的に破壊する二本鎖ＲＮＡを意味する。ループ領域を介してかかる二本鎖を連結させた一本鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も、ｓｉＲＮＡに含まれる。当業者は、標的ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に基づいて適当なｓｉＲＮＡを設計できる。各種のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡが販売されており、適当なｓｉＲＮＡを用いてもよい。
ペントースリン酸経路に関連する酵素の活性または発現を阻害する核酸を含むベクターを使用することもできる。ベクターの例として、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルスベクター等のウイルスベクターが挙げられる。
ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤の投与方法は特に限定されず、経口投与、非経口投与、注射、輸液等の一般的な投与経路を経ることができる。非経口投与は、全身投与であっても局所投与であってもよい。例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮内投与、皮下投与、経皮投与、筋肉内投与、腹腔内投与または鼻腔内投与が挙げられる。肉芽腫が皮膚にある場合、好ましくは局所投与であり、より具体的には、肉芽腫のある部位への塗布、噴霧または注入が挙げられる。
ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤は、組成物に含めて投与し得る。組成物は、固体、液体またはその間の任意の形態（例えば半固体）であり得、肉芽腫の部位、投与方法および投与量に応じて、公知の各種製剤形態を採り得る。例えば、錠剤、粉剤、粒剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、坐剤、用時溶解する固形の注射剤、液状の注射剤、注入剤、点滴用剤などの剤形が挙げられる。また、組成物は、スプレー剤、ローション剤、クリーム剤、貼付剤、軟膏、液剤、乳剤または懸濁剤などの外用剤であり得る。
これらの剤形は、常法により製剤化することによって製造される。さらに製剤上の必要に応じて、医薬品への使用が認められ得る各種の製剤用物質を配合することができる。製剤用物質は製剤の剤形により適宜選択することができるが、例えば、緩衝化剤、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤、色素、染料、香料等が挙げられる。
ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤の投与量および投与回数は、有効量の当該阻害剤が対象に投与されるように、投与対象の動物種、健康状態、年齢、体重、投与経路、投与形態等に応じて当業者が適宜設定できる。ある状況での有効量は、日常的な実験によって容易に決定することができる。
ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤は単回投与してもよく、複数回投与してもよく、持続投与してもよい。複数回投与する場合、例えば、１日１回～数回、例えば、１日１回、２回または３回の投与頻度で、連日または数日おきに、例えば、１日、２日、３日または７日おきに、投与し得る。投与期間は制限されず、例えば、肉芽腫が軽減されるまで投与を継続し得る。休薬期間を設けてもよい。
ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤は、単独で、または、１種またはそれ以上のさらなる有効成分、特に、肉芽腫を処置または予防する有効成分と併用できる。成分を「併用する」ことは、全成分を含有する投与剤形の使用および各成分を別個に含有する投与剤形の組合せの使用のみならず、それらが肉芽腫の処置または予防のために使用される限り、各成分を同時に、または、いずれかの成分を遅延して投与することも意味する。２種またはそれ以上のさらなる有効成分を併用することも可能である。例えば、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤に加えて、１種またはそれ以上のさらなる有効成分を含む組成物を使用し得る。
併用に適する有効成分には、例えば、ＪＡＫ阻害剤、非ステロイド消炎鎮痛薬、ステロイド、抗ヒスタミン薬、抗アレルギー薬、免疫抑制剤、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤などが含まれる。肉芽腫を伴う疾患の治療剤を併用することもできる。
ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤の投与に加えて、薬物療法以外の医療行為、例えば、外科的切除などを実施することもできる。
ある態様では、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む肉芽腫の処置および／または予防用の組成物が提供される。
ある態様では、肉芽腫の処置および／または予防を必要としている対象に有効量のペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を投与することを含む、肉芽腫の処置および／または予防方法が提供される。
ある態様では、肉芽腫の処置および／または予防用のペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が提供される。
ある態様では、肉芽腫を処置および／または予防するためのペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤の使用が提供される。
ある態様では、肉芽腫の処置および／または予防用の組成物の製造における、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤の使用が提供される。
ある態様では、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む、肉芽腫を伴う疾患の処置および／または予防用の組成物が提供される。
ある態様では、肉芽腫の処置および／または予防を必要としている対象に有効量のペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を投与することを含む、肉芽腫を伴う疾患の処置および／または予防方法が提供される。
ある態様では、肉芽腫を伴う疾患の処置および／または予防用のペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が提供される。
ある態様では、肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するためのペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤の使用が提供される。
ある態様では、肉芽腫を伴う疾患の処置および／または予防用の組成物の製造における、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤の使用が提供される。
また、後述する実施例により立証される通り、肉芽腫に含まれるマクロファージおよびサルコイドーシス患者の血中ではペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルが高い。従って、対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルに基づいて、対象が肉芽腫を有するか否かを判定することができる。当該酵素のレベルは、試料中の酵素の量または濃度であってもよく、酵素の発現レベルであってもよい。
試料は、対象から採取された血液、血漿または血清であり得る。血液試料は、通常の方法で、例えば静脈または動脈から、採取され得る。血漿試料または血清試料は、当業者に周知の方法により血液を適宜処理することにより調製し得る。この処理は、特に限定されず、臨床学的に許容されるいかなる処理でもあってもよい。例えば、抗凝固剤の添加、遠心分離などが行われる。試料は、対象から採取された他の体液、例えば、脳脊髄液、唾液、鼻汁、痰、胸水または腹水であってもよい。採取された試料を、必要に応じて適宜濃縮または希釈して使用し得る。試料は、使用に先立ち、その調製中または調製後に低温下で保存してもよく、例えば、冷凍保存し得る。
試料中のペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルは、ペントースリン酸経路に関連する酵素に特異的に結合する試薬を用いて測定することができる。ペントースリン酸経路に関連する酵素に特異的に結合する試薬は、例えば、化合物、ペプチド、抗体またはアプタマーであり得る。これらの試薬は、ペントースリン酸経路に関連する酵素と特異的に結合できるものであれば、断片、誘導体または類似体であってもよい。
例えば、試料中のペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルは、それに結合する抗体を用いる免疫学的手法により測定できる。免疫学的手法としては、酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ法、例えば、直接法、間接法、サンドイッチ法または競合法）、イムノクロマト法、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）などを例示でき、好ましくはＥＬＩＳＡ法である。
本開示に関して、抗体は、免疫グロブリン骨格をベースとする親和性リガンドを意味し、任意の起源のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含み、ネズミ、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒトおよび他の抗体、並びに複数の種に由来する配列を含むキメラ抗体、例えば、部分的にヒト化された抗体、例えば、部分的にヒト化されたマウス抗体を含む。抗体は、ペントースリン酸経路に関連する酵素と特異的に結合できるものであれば、その断片または誘導体であってもよい。
抗体は、ペントースリン酸経路に関連する酵素またはその抗原性を有する部分ペプチドを免疫原として用い、既存の一般的な製造方法によって製造し得る。例えば、ポリクローナル抗体は、動物を抗原で免疫化することにより産生し得、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して産生し得る。あるいは、市販の抗体を使用してもよい。
試薬は、検出可能な物質で標識することができる。検出可能な物質の例としては、放射性同位元素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、酵素標識およびビオチンが挙げられる。試薬に特異的に結合し、標識を有する物質、例えば二次抗体を使用してもよい。
試薬は、適切な支持体に結合されていてもよい。支持体は、試薬を固定できるものであれば特に限定されず、どのような形状や材質であっても良い。例えば、ナイロン膜などのメンブレン、ビーズ、ガラス、プラスチックおよび金属などの支持体が挙げられる。
あるいは、試料は、対象から採取された肉芽腫が疑われる組織であり得る。試料をペントースリン酸経路に関連する酵素に結合する試薬と接触させ、結合した試薬の量を画像上で測定することにより、ペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルを測定することができる。例えば、組織を切片にして観察してもよく、組織をスライドガラス等の基板に固定して観察してもよい。試料の固定、透過処理等の、試料中の物質の検出のための一般的な技術は、当分野で周知である。ペントースリン酸経路に関連する酵素に結合する試薬は上記の通りであり、画像処理により検出可能な標識を用いる。
正立顕微鏡、蛍光顕微鏡などの顕微鏡下で標識を可視化し、ＣＣＤカメラなどにより撮影し、標識のシグナル強度を測定する。シグナル強度の測定には、画像処理用のソフトウェア、例えば、ImageJ ソフトウェア（NIH, Bethesda, MD, USA）などを使用できる。
ペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルの測定には、自動イメージングおよび画像解析技術、例えばハイコンテント分析（ＨＣＡ）技術を利用してもよい。ＨＣＡ技術は当分野で知られており、多数の細胞の自動イメージングと、これに続く定量的画像解析を含む。ＨＣＡの同義語には、ハイコンテンツイメージングおよびハイコンテンツスクリーニングが含まれる。測定のスピードを速めるために、ロボットもしくは自動装置またはマイクロ流体デバイスを用いてもよい。
あるいは、対象から採取された肉芽腫が疑われる組織を溶解し、上記の免疫学的手法により試料中のペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルを測定してもよい。酵素の遺伝子発現レベルを、定量ＰＣＲ、マイクロアレイ分析、ＲＮＡシーケンシング、ノーザンブロッティング、ＳＡＧＥ法などの公知の手法により測定してもよい。
本方法では、対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルがカットオフ値と比較して高い場合に、対象が肉芽腫を有すると判定され、レベルがカットオフ値と比較して低い場合に対象が肉芽腫を有さないと判定される。
ペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルがカットオフ値と同等である場合、対象が肉芽腫を有すると判定するか、有さないと判定するか、判定の目的などに応じて任意に設定できる。従って、ある実施態様では、ペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルがカットオフ値以上である場合に対象が肉芽腫を有すると判定し、ペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルがカットオフ値未満である場合に対象が肉芽腫を有さないと判定する。別の実施態様では、ペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルがカットオフ値より高い場合に対象が肉芽腫を有すると判定し、ペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルがカットオフ値以下である場合に対象が肉芽腫を有さないと判定する。
カットオフ値は、肉芽腫を有する対象群と有さない対象群を、統計的に有意差をもって分けることができる値である。カットオフ値の設定は、種々の統計解析手法を用いて、公知の方法により実施できる。例えば、肉芽腫を有する対象群から取得された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルと、肉芽腫を有さない対象群から取得された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルを統計解析的に処理することにより、カットオフ値を設定できる。統計的有意差は、カイ二乗検定、一般化Wilcoxon検定、Wilcoxonの符号順位検定、Mann-Whitney検定、ログランク検定、Cox比例ハザードなどの公知の検定方法により解析され得る。カットオフ値の設定には、例えば、Prism等の統計解析用ソフトウェアを使用し得る。
カットオフ値は、感度および／または特異度に基づいて設定し得る。好ましくは、カットオフ値は、高い感度および高い特異度の両方を示す。ここで、感度とは、真の陽性率を意味する。また、特異度とは真の陰性率を意味する。例えば、肉芽腫を有する対象群で高い陽性率を示し、かつ、肉芽腫を有さない対象群で高い陰性率を示すペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルを、カットオフ値として設定し得る。
例えば、診断検査の有用性を検討する手法として一般的に用いられているＲＯＣ解析（receiver operating characteristic analysis）により、カットオフ値を設定することができる。ＲＯＣ解析では、各カットオフ値における感度を縦軸に、偽陽性率（１－特異度）を横軸にプロットしたＲＯＣ曲線が作成される。ＲＯＣ曲線は、診断能のない検査では対角線上の直線となるが、診断能が向上するほど、左上方に弧を描く曲線となる。左上隅との距離が最小となるＲＯＣ曲線上の点を与えるカットオフ値は、感度と特異度に優れると言える。また、ヨーデン指標（Youden index）に基づいてカットオフ値を設定することもできる。具体的には、肉芽腫を有する対象群および罹患していない対象群のペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルから感度および特異度を求め、これらの値に基づき、市販の解析ソフトを使用してＲＯＣ曲線を作成する。そして、感度と特異度が可能な限り１００％に近いときの値を求めて、その値をカットオフ値とし得る。
また、例えば、診断効率（即ち、肉芽腫を有する対象を「肉芽腫を有する」と正しく診断した症例と、肉芽腫を有さない対象を「肉芽腫を有さない」と正しく診断した症例との合計数の全症例数に対する割合）を求め、最も高い診断効率が算出されるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルをカットオフ値とし得る。
特徴に応じてサブグループ化された患者群についてカットオフ値を設定することもできる。例えば、性別、年齢層または人種に応じてそれぞれカットオフ値が設定されてよい。
ある実施態様では、本方法による判定結果を、診断のための情報として提供することができる。
ある実施態様では、本方法は、対象から試料を採取することを含む。
ある実施態様では、本方法は、対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルを測定することを含む。
ある実施態様では、本方法は、肉芽腫を有すると判定された対象において、肉芽腫を処置することを含む。例えば、本開示に従って、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を投与する。
別の態様では、ペントースリン酸経路に関連する酵素に特異的に結合する試薬またはペントースリン酸経路に関連する酵素の遺伝子発現を測定するための試薬を含む、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するためのキットが提供される。試薬は、水または適当な緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解されるか、または凍結乾燥された状態で、適切な容器中に収容されて提供され得る。好適な容器には、ボトル、バイアル、シリンジ、試験管、プレート、メンブレン等が含まれる。容器は、ガラス、プラスチックなどの多様な材料から形成されていてよい。キットは、ペントースリン酸経路に関連する酵素の検出に必要な他の成分や試薬をさらに含んでもよい。例えば、キットは、標識二次抗体、発色基質、ブロッキング液、洗浄緩衝液などをさらに含み得る。キットは、さらに、使用のための説明を含む添付文書等の、商業的見地および使用者の見地から望ましいその他の材料をさらに含み得る。
ある態様では、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための、ペントースリン酸経路に関連する酵素に特異的に結合する試薬またはペントースリン酸経路に関連する酵素の遺伝子発現を測定するための試薬が提供される。
ある態様では、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するためのキットを製造するための、ペントースリン酸経路に関連する酵素に特異的に結合する試薬またはペントースリン酸経路に関連する酵素の遺伝子発現を測定するための試薬の使用が提供される。
例えば、下記の実施態様が提供される。
［１］肉芽腫を予防および／または処置するための、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む組成物。
［２］肉芽腫が、サルコイドーシス、環状肉芽腫、抗酸菌感染症またはクローン病における肉芽腫である、第１項に記載の組成物。
［３］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む、肉芽腫を伴う疾患の処置および／または予防用の組成物。
［４］肉芽腫を伴う疾患がサルコイドーシス、環状肉芽腫、抗酸菌感染症またはクローン病である、第３項に記載の組成物。
［５］肉芽腫が、サルコイド型、類結核型または柵状肉芽腫である、第１項～第４項のいずれかに記載の組成物。
［６］肉芽腫が、皮膚、肺、眼、心臓、肝臓、腎臓、リンパ節、神経、筋で形成される肉芽腫である、第１項～第５項のいずれかに記載の組成物。
［７］肉芽腫が、皮膚、肺、心臓またはリンパ節で形成される肉芽腫である、第１項～第６項のいずれかに記載の組成物。
［８］肉芽腫が皮膚で形成される肉芽腫である、第１項～第７項のいずれかに記載の組成物。
［９］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤ、ＰＧＬＳ、６ＰＧＤ、ＲＰＥまたはＲＰＩである、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［１０］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤまたは６ＰＧＤである、第１項～第９項のいずれかに記載の組成物。
［１１］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１またはＧ６ＰＤである、第１項～第１０項のいずれかに記載の組成物。
［１２］ペントースリン酸経路に関連する酵素がＦＢＰ－１である、第１項～第１１項のいずれかに記載の組成物。
［１３］ペントースリン酸経路に関連する酵素がＧ６ＰＤである、第１項～第１１項のいずれかに記載の組成物。
［１４］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、２，５－ジクロロ－Ｎ－（５－クロロ－２－ベンゾキサゾリル）－ベンゼンスルホンアミド、ＭＢ０５０３２、ＭＢ０６３２２、２－デオキシ－Ｄ－グルコースまたは６－アミノニコチンアミドである、第１項～第１３項のいずれかに記載の組成物。
［１５］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、２，５－ジクロロ－Ｎ－（５－クロロ－２－ベンゾキサゾリル）－ベンゼンスルホンアミドまたは６－アミノニコチンアミドである、第１項～第１４項のいずれかに記載の組成物。
［１６］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤまたは６ＰＧＤに対するｓｉＲＮＡである、第１項～第１３項のいずれかに記載の組成物。
［１７］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤がＦＢＰ－１に対するｓｉＲＮＡである、第１項～第１３項のいずれかに記載の組成物。
［１８］対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルをカットオフ値と比較することを含む、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法。
［１９］対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルを測定することを含む、第１８項に記載の方法。
［２０］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤ、ＰＧＬＳ、６ＰＧＤ、ＲＰＥまたはＲＰＩである、第１８項または第１９項に記載の方法。
［２１］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤまたは６ＰＧＤである、第１８項～第２０項のいずれかに記載の方法。
［２２］対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルがカットオフ値と比較して高い場合に、対象が肉芽腫を有すると判定される、第１８項～第２１項のいずれかに記載の方法。
［２３］対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルがカットオフ値と比較して低い場合に、対象が肉芽腫を有さないと判定される、第１８項～第２２項のいずれかに記載の方法。
［２４］対象から採取された試料が、血液、血漿、血清または肉芽腫が疑われる組織である、第１８項～第２３項のいずれかに記載の方法。
［２５］対象から採取された試料が、血液、血漿または血清である、第１８項～第２４項のいずれかに記載の方法。
［２６］対象から採取された試料が、肉芽腫が疑われる組織である、第１８項～第２４項のいずれかに記載の方法。
［２７］ペントースリン酸経路に関連する酵素に特異的に結合する試薬またはペントースリン酸経路に関連する酵素の遺伝子発現を測定するための試薬を含む、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するためのキット。
［２８］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤ、ＰＧＬＳ、６ＰＧＤ、ＲＰＥまたはＲＰＩである、第２７項に記載のキット。
［２９］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤまたは６ＰＧＤである、第２７項または第２８項に記載のキット。
［３０］ペントースリン酸経路に関連する酵素に特異的に結合する試薬を含む、第２７項～第２９項のいずれかに記載のキット。
［３１］試薬が抗体である、第２７項～第３０項のいずれかに記載のキット。
本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、本発明は添付の特許請求の範囲において定義され、その技術的思想を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。以下、実施例にて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
［材料と方法］
患者検体の収集
ヒト試料は、京都大学大学院医学研究科の倫理委員会により承認されたプロトコルに基づき入手した（Ｒ０７４３）。サルコイドーシス患者は過去２週間に外用ステロイド／免疫調節剤を使用しておらず、過去４週間に全身性免疫抑制剤治療を受けていなかった。皮膚は生検後にバンバンカー（日本ジェネティクス）溶液に入れたあと－８０℃で凍結保存した。組織染色に用いたアトピー性皮膚炎、乾癬、環状肉芽腫症、皮膚サルコイドーシス、肺サルコイドーシス組織は、生検、手術後１０％中性緩衝ホルマリン液に２４時間浸した後、パラフィン包埋した。血清は血清分離剤入りスピッツを用いて採血し、遠心後に血清を回収した。
１細胞ＲＮＡシークエンスのライブラリ作成
凍結保存された生検検体は解凍したのち、Ｗｈｏｌｅ Ｓｋｉｎ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ， ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて２時間処理し細胞懸濁液を作成した。細胞懸濁液はＣｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ シングルセル ３' キット ｖ３．１（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いてライブラリを作成した。ライブラリＤＮＢＳＥＱ－Ｇ４００（ＭＧＩ Ｔｅｃｈ）はプラットフォームで配列決定し、約１億５千万から２億リードを得た。シークエンスデータは、ＣｅｌｌＲｅｎｇｅｒ ３．１．０（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いて解析した。
Ｓｅｕｒａｔを用いたクラスタリング解析
Ｓｅｕｒａｔパッケージ（バージョン４．０．６）を用いたクラスタリング解析は、全細胞を対象とした第１レベルの解析と、細胞種内の第２レベルの高解像度解析の両方で実施された。シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを単一のＳｅｕｒａｔオブジェクトに結合し、バッチ効果を除去するためにＳＣＴｒａｎｓｆｏｒｍ機能を用いて標準化した。１００遺伝子未満、５０００遺伝子以上、または２０％以上のミトコンドリア含有量を持つ細胞は除外した。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して、各クラスターで差次的に発現した遺伝子（ＤＥＧ）を同定し、広い細胞型を定義し、さらに亜集団を特徴付けるために、結果として得られた各細胞型について繰り返した。
サルコイドーシススコアの作成
サルコイドーシスのバルクＲＮＡシークエンスデータ（ＧＳＥ３２８８７）より非病変部と比べて病変部で上昇している上位１００個の遺伝子を抽出した。それらの遺伝子の平均発現をサルコイドーシススコアとした。
公共データベースを用いたｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑデータの解析
アトピー性皮膚炎、尋常性乾癬（ＨＵＭＡＮ ＣＥＬＬ ＡＴＬＡＳ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＡＬ）、環状肉芽腫（ＧＳＥ１５８９２４）、ハンセン病（ＧＳＥ１５１５２８）のデータベースからＳｅｕｒａｔのｓｕｂｓｅｔ機能を用いてＨＬＡ－ＤＲＡ陽性の抗原提示細胞を抽出し、その中のＦＢＰ－１、ＡＣＥ、ＳＴＡＴ１陽性細胞の割合をＤｏｔｐｌｏｔ機能を用いて調べた。
免疫染色
免疫染色は、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に対して行われた。ＢＯＮＤ ＲＸ自動免疫染色機（Ｌｅｉｃａ）を用いて染色した。抗原賦活化はＥＲ ｓｏｌｕｔｉｏｎ２で４０分行った。切片を、ＣＤ１６３（クローン１０Ｄ６、１：２００；Ｌｅｉｃａ）、ＦＢＰ－１（クローンＥＰＲ４６１９、１：１００；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ＣＤ６８（クローンＰＧ－Ｍ１、１：２００；Ｄａｋｏ）、Ｇ６ＰＤ（１：２０００；Ａｂｃａｍ）で染色した。二次抗体は、Ｏｐａｌ ｔｙｒａｍｉｄｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｋｏｙａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用した。蛍光顕微鏡ＢＺ９０００（キーエンス）を用いて画像を撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて解析した。
血清ＦＢＰ１の測定
Ｈｕｍａｎ ＦＢＰ１ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＬＳＢｉｏ）を用いて血清のＦＢＰ１濃度を測定した。
インビトロサルコイドーシスモデル
健常人の末梢血よりリンパ節分離溶液（ナカライ）を用いて末梢血単核球を分離した。ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて末梢血単核球よりＣＤ１４陽性単球を分離した。単球を１０％ウシ胎児血清入りＲＰＭＩにコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ、５μＭ）、ＣＤ４０Ｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮγ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１０ｎｇ／ｍｌ）を加えたものに入れ、０．５ｘ１０５／ウェルで９６ウェル平底プレートに播種した。阻害剤の実験では、フルクトース－１，６－ビスホスファターゼ－１阻害剤（ＦＢＰ－１阻害剤、２，５－ジクロロ－Ｎ－（５－クロロ－２－ベンゾキサゾリル）－ベンゼンスルホンアミド）（Ｃａｙｍａｎ、１００または５００μＭ）、トファシチニブ（Ｓｉｇｍａ、１μＭ）、６－アミノニコチンアミド（６ＡＮ）（Ｓｉｇｍａ、１００μＭ）を加えた。あるいは、ｈｏｒｉｚｏｎ社製のＦＢＰ－１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（製品番号Ｅ－００８７２５－００－００１０）および対照ｓｉＲＮＡを使用した（１μＭ）。メタノールで固定後、ギムザ染色液にて染色し、顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＣＫＫ５３）を用いて撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて解析した。
遺伝子発現の解析
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ は ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離した。ｃＤＮＡは、Ｐｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、トータルＲＮＡ試料から逆転写した。定量的ＲＴ－ＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）とＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲ装置（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。プライマーはすべてグライナー・ジャパンから入手した。プライマー配列は以下の通りである。
Figure 2024005979000002

ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間の初期酵素活性化、９５℃で１０秒、６０℃で２０秒のサイクルを４５回行った。遺伝子特異的な蛍光は６０℃で測定した。各サンプルについて、二重の試験反応を用いて遺伝子発現を解析し、結果はハウスキーピングであるＡＣＴＢ遺伝子の発現量に対して正規化した。
マウスの飼育
すべてのマウスは、京都大学大学院医学研究科実験動物研究施設において、特定の病原体を含まない条件下で維持されていた。すべての実験には７－１０週齢の雌マウスを使用した。すべての実験手順は、京都大学動物実験委員会により承認された。
マウス皮膚サルコイドーシスモデル
７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（チャールズリバー）に６ＡＮ（２０ｍｇ／ｋｇ）もしくはＰＢＳ（ナカライテスク）を腹腔内投与した。７時間後に麻酔下で２０００個のビーズ（Ｂｉｏ－Ｇｅｌ Ｐ１０００、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と２５μｇのコンカナバリンＡを耳介に皮内注射した。毎日、定圧厚さ測定器（テクロック）により耳介厚を測定した。実験４日目にマウスを安楽死させ解析した。
マウス皮膚組織の染色方法
耳介皮膚を１０％中性緩衝ホルマリン液に２４時間浸した後にパラフィン包埋を行った。５μｍの厚さで切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン染色（Ｓｉｇｍａ）を行った。
マウス皮膚浸潤細胞の解析
マウス耳介は背側と腹側のシートに分け、１０％子牛胎児血清、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．２５ｍｇ／ｍｌ Ｌｉｂｅｒａｓｅ ＴＬ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、０．３ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）含むＲＰＭＩ １６４０中、３７℃で６０分静置した。消化した皮膚シートを４０μｍセルストレーナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてろ過し、単細胞懸濁液とした。
皮膚から得た単細胞懸濁液を、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色し、死細胞を除外した。次に、抗ＣＤ１６／３２ Ａｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で非特異的Ａｂ結合をブロックし、細胞を表面抗原で染色した。下記に記した抗体で表面染色後、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で細胞を固定した。サンプルはＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａセルアナライザー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で評価し、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。
抗体一覧
Figure 2024005979000003
［結果］
サルコイドーシス病変におけるペントースリン酸経路の活性化
サルコイドーシスの皮膚病変の１細胞ＲＮＡシークエンスを行うことにより、サルコイドーシスにおいて増加しているマクロファージ（ＴＲＥＭ２マクロファージ）を見出した（図１、２）。サルコイドーシス特異的マクロファージは、アンギオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）、リゾチーム（ＬＹＺ）、ＳＴＡＴ１といったサルコイドーシス特異的遺伝子を発現していた（図３）。サルコイドーシス特異的マクロファージでは、フルクトース－１，６－ビスホスファターゼ１（ＦＢＰ－１）といった今までに報告されていない分子の発現が上昇していた（図３）。
サルコイドーシスの皮膚病変をＦＢＰ－１で免疫染色すると、サルコイドーシスの肉芽腫に一致して染色されたが、正常皮膚では全く染色されなかった（図４）。過去に報告された１細胞ＲＮＡシークエンスのデータを解析したところ、環状肉芽腫（ＧＡ）およびハンセン病の皮膚マクロファージにおいてＦＢＰ－１の発現が見られたが、健常皮膚、アトピー性皮膚炎、乾癬の皮膚では発現していなかった（図５）。次にタンパク発現においても、ＦＢＰ－１の発現は環状肉芽腫および肺・心臓・リンパ節サルコイドーシスの肉芽腫でも確認されたが、アトピー性皮膚炎および乾癬の病変では確認されなかった（図６～７）。
ＦＢＰ－１はグルコース代謝経路のうち、ペントースリン酸回路に作用するので（図８）、ペントースリン酸回路に関連する酵素の発現についてクラスタリング解析を行った。その結果、サルコイドーシス特異的マクロファージでは、グルコースフォスフェートイソメラーゼ（ＧＰＩ）、グルコース－６－リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤ）および６－ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤ）の発現も上昇していることが確認された（図９）。これらは、ペントースリン酸経路においてＦＢＰ－１の下流で作用する酵素である。また、免疫染色においてもＦＢＰ－１陽性細胞に一致してＧ６ＰＤ陽性細胞が見られた（図１０）。また、サルコイドーシス患者では血清のＦＢＰ１濃度が高いことが確認できた（図１１）。これらの結果は、肉芽腫のマクロファージではペントースリン酸経路が活性化しており、新たな診断マーカーとして使用できる可能性を示唆した。
サルコイドーシスモデルにおけるペントースリン酸経路の阻害
インビトロのサルコイドーシスモデルとして、ヒト末梢血単球をコンカナバリンＡとＩＦＮγ、ＣＤ４０Ｌと培養し巨細胞形成を誘導するものが従来から知られている（図１２）。このモデルにおいてもＦＢＰ－１やＧ６ＰＤといったペントースリン酸回路に関連する遺伝子が上昇していた（図１３）。そのため、ＦＢＰ－１阻害剤、Ｇ６ＰＤおよび６ＰＧＤ阻害剤（６ＡＮ）またはトファシチニブ（ＪＡＫ阻害剤）の存在下で巨細胞形成を誘導したところ、巨細胞形成は抑制された（図１４）。また、ＦＢＰ１阻害剤であるＭＢ０５０３２またはＧＰＩ阻害剤である２－デオキシ－Ｄ－グルコースを使用しても、同様に巨細胞形成は抑制された。さらに、巨細胞形成後にＦＢＰ－１阻害剤、６ＡＮまたはトファシチニブを投与したところ、巨細胞は減少した（図１５）。また、ＦＢＰ－１遺伝子に対するｓｉＲＮＡの存在下で巨細胞形成を誘導したところ、ＦＢＰ－１遺伝子の発現および巨細胞形成は抑制された（図１６）。ただし、低濃度のＦＢＰ－１阻害剤（１００μＭ）では、対照との差異は見られなかった。これらの結果は、サルコイドーシスの治療効果が示唆されているＪＡＫ阻害剤と同様に、ペントースリン酸経路の阻害剤をサルコイドーシスなどの肉芽腫形成疾患の予防および治療に用いられることを示唆する。
皮膚炎症誘導マウスにおけるペントースリン酸経路の阻害
マウスにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に懸濁した６ＡＮ（２０ｍｇ／Ｋｇ）を腹腔内投与し、その後にコンカナバリンＡとビーズを皮内注射し、皮膚の炎症およびマクロファージの集積を調べた。ＤＭＳＯ（溶媒）投与群と６ＡＮ投与群では皮下に肉芽腫の形成を認めた。しかしながら、６ＡＮ群では肉芽腫の大きさがＤＭＳＯ群より優位に減少した（図１７）。６ＡＮ投与群では、非投与群と比較して耳介膨張（図１８）が抑制された。また、耳介に浸潤している細胞を比較したところ、６ＡＮ投与群でマクロファージの集積が減弱していた（図１９）。これらの結果は、ペントースリン酸経路の阻害により皮膚における炎症、肉芽腫形成が抑制されることを示唆し、ペントースリン酸経路の阻害剤をサルコイドーシスなどの肉芽腫形成疾患の予防および治療に用いられることを示唆する。
本開示に従って、肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防すること、および、対象が肉芽腫を有するか否かを判定することができ、医療分野で有用である。

Claims (14)

  1. 肉芽腫を予防および／または処置するための、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む組成物。
  2. ペントースリン酸経路に関連する酵素が、フルクトース－１，６－ビスホスファターゼ－１（ＦＢＰ－１）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ（ＧＰＩ）、グルコース－６－リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤ）または６－ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤ）である、請求項１に記載の組成物。
  3. ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、Ｇ６ＰＤまたは６ＰＧＤである、請求項１に記載の組成物。
  4. ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、２，５－ジクロロ－Ｎ－（５－クロロ－２－ベンゾキサゾリル）－ベンゼンスルホンアミド、ＭＢ０５０３２、ＭＢ０６３２２、２－デオキシ－Ｄ－グルコースまたは６－アミノニコチンアミドである、請求項１に記載の組成物。
  5. ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、２，５－ジクロロ－Ｎ－（５－クロロ－２－ベンゾキサゾリル）－ベンゼンスルホンアミドまたは６－アミノニコチンアミドである、請求項１に記載の組成物。
  6. ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤまたは６ＰＧＤに対するｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。
  7. 肉芽腫が、サルコイドーシス、環状肉芽腫、抗酸菌感染症またはクローン病における肉芽腫である、請求項１～６のいずれかに記載の組成物。
  8. ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む、肉芽腫を伴う疾患の処置および／または予防用の組成物。
  9. 対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルをカットオフ値と比較することを含む、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法。
  10. 対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルを測定することを含む、請求項９に記載の方法。
  11. ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤまたは６ＰＧＤである、請求項９に記載の方法。
  12. 対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルがカットオフ値と比較して高い場合に、対象が肉芽腫を有すると判定される、請求項９に記載の方法。
  13. 対象から採取された試料が、血液、血漿、血清または肉芽腫が疑われる組織である、請求項９に記載の方法。
  14. ペントースリン酸経路に関連する酵素に特異的に結合する試薬またはペントースリン酸経路に関連する酵素の遺伝子発現を測定するための試薬を含む、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するためのキット。
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