WO2017142014A1 - 炎症性疾患を対象とした医薬 - Google Patents

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inflammatory
immune
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immune cells
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重則 後藤
木村　佳司
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医療法人社団 滉志会
株式会社メディネット
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Definitions

  • the present invention relates to a medicine for inflammatory diseases.
  • cancer immune cell therapy includes 1) dendritic cell vaccine therapy, 2) NK cell therapy, 3) ⁇ T cell therapy, 4) ⁇ T cell therapy, 5) cytotoxic T cell (CTL) therapy, etc.
  • CTL cytotoxic T cell
  • Dendritic cell vaccine therapy means that dendritic cells differentiated from monocytes in peripheral blood (Dendritic Cells: DC) phagocytose their target cancer cells and return them to the body, damaging the cancer cells
  • DC peripheral blood
  • APC antigen presenting cell
  • NK (Natural Killer) cell therapy is a method that activates and proliferates cells with high ability to damage abnormal cells such as NK cells in peripheral blood using multiple stimulating substances such as IL-2. How to get back and treat cancer.
  • NK cells are one of the lymphocytes responsible for the innate immune system, and have a strong cytotoxicity, and in particular, have a mechanism for recognizing and killing cells in which the expression or loss of MHC class I molecules has been reduced, and Since it functions as a main effector cell in antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), it is an important cell for rejection of tumor cells and virus-infected cells.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • ⁇ T cells are central cells responsible for a host defense reaction called lymphocyte stress-surveillance, and ⁇ T cell therapy is slightly present in the treetop blood collected from patients. (1-5%) This is a treatment method that selectively proliferates ⁇ T cells having ⁇ type T cell receptors (V ⁇ 9V ⁇ 2 receptors) and returns them to the body. ⁇ T cells do not depend on “antigens” recognized by ⁇ T cells, but “antigen-nonspecific” anti-tumors that kill cancer by recognizing molecules that are relatively commonly expressed on the surface of cancer cells An effect is obtained.
  • ⁇ T cell therapy is a method in which lymphocytes in peripheral blood are cultured for about 2 weeks using interleukin-2 (IL-2) and anti-CD3 antibody. This is a reversing treatment. Most of the T lymphocytes in peripheral blood are ⁇ T cells having an ⁇ type T cell receptor (TCR Cell Receptor: TCR), and many of the proliferated cells are also ⁇ T cells.
  • TCR Cell Receptor TCR Cell Receptor
  • the ⁇ T cell is presented with an antigen from the dendritic cell or the like, and attacks the cell having the antigen.
  • Cytotoxic T cell (CTL) therapy is a treatment in which cytotoxic T cells (CTL) are induced and returned to the body by stimulating T cells in peripheral blood mononuclear cells using cancer cells outside the body. Is the law. Cancer cells themselves serve as antigen-presenting cells (APCs), and it is possible to efficiently increase cytotoxic T cells (CTLs) that have the ability to attack their own cancers.
  • APCs antigen-presenting cells
  • Immune cell therapy has the advantage that it has few side effects compared with the three major therapies of surgical treatment, radiotherapy, and chemotherapy, and is the fourth cancer treatment method that is advanced for actual lung cancer patients. It is given as medical treatment.
  • the doctors who are the inventors of the present application are clinical doctors who are actually applying the above-mentioned cancer immune cell therapy to patients.
  • the inventors of the present application discovered that the symptoms of patients with ulcerative colitis were alleviated and reduced while observing the symptoms of patients who had undergone cancer immunotherapy over time. That is, the present invention is aimed at another application of immune cell therapy, an expanded application to inflammatory diseases, particularly ulcerative colitis.
  • Inflammatory diseases refer to diseases that involve excessive production of inflammatory cytokines.
  • Inflammatory cytokines include IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, tumor necrosis factor (TNF ⁇ / ⁇ ) and the like. Therefore, inflammatory diseases include, but are not limited to, Crohn's disease, rheumatoid arthritis, psoriasis (including psoriasis vulgaris, arthritic psoriasis, pustular psoriasis, psoriatic erythroderma), ankylosing spondylitis, ulcerative colon This includes intractable retinal uveitis due to inflammation and Behcet's disease.
  • IBD Inflammatory bowel disease
  • Crohn's disease and ulcerative colitis chronic inflammation of various parts of the gastrointestinal tract, including Crohn's disease and ulcerative colitis, which causes diarrhea and abdominal pain.
  • Inflammation is caused by a cellular immune response in the gastrointestinal mucosa.
  • the immune response involves the release of inflammatory mediators such as cytokines, interleukins, tumor necrosis factor (TNF), and lipid mediators.
  • Ulcerative colitis is an inflammatory disease of the large intestine that causes erosions and ulcers on the mucosa of the large intestine. Characteristic symptoms include diarrhea and abdominal pain with or without melena. The lesion has the property of spreading continuously and ascending from the rectum, and extends up to the entire colon from the rectum. Ulcerative colitis is classified as follows according to the spread and course of the lesion.
  • Classification by lesion spread Total colitis, left-sided colitis, proctitis 2) Stage classification: Active period, remission stage 3) Classification by severity: Mild, moderate, severe, severe 4) Clinical course Classification by: relapse remission type, chronic persistent type, acute fulminant type, first seizure type
  • ulcerative colitis The number of patients with ulcerative colitis in Japan is about 160,000, which develops from young to elderly, and there is no difference by gender. The cause of ulcerative colitis is thought to be due to abnormal autoimmune reaction, diet, etc., but it is still unknown at present.
  • ulcerative colitis develops, diarrhea and bloody stool are observed, which may be accompanied by convulsive or persistent abdominal pain.
  • severe, systemic symptoms such as fever, weight loss, and anemia occur.
  • Skin complications, joint and eye symptoms may appear as complications other than intestinal tract.
  • 5-aminosalicylic acid for example, 5-aminosalicylic acid (5-ASA) pharmaceutical oral or rectal administration, corticosteroid, blood cell component removal therapy, immunomodulator / suppressor, anti-TNF ⁇ receptor Symptoms can be improved by suppressing inflammation of the intestines by internal therapy such as body antagonists and anti-TNF ⁇ antibodies, but there is no method that leads to complete cure. If medical treatment does not improve symptoms, surgical treatment such as total colectomy may be performed.
  • CAP therapy blood cell component removal therapy
  • GCAP therapy that removes granulocytes and monocytes
  • leukocyte (granulocytes, monocytes and lymphocytes) removal therapy Although LCAP therapy has been applied and certain results have been achieved, a universally effective treatment method has not yet been established and has been designated as a specific medical disease by the Ministry of Health, Labor and Welfare.
  • Inventors of the present application verified biochemical parameters in addition to the time-lapse observation of patients who have undergone the above-mentioned immune cell therapy, and in contrast to the above-mentioned blood cell component removal therapy, immunity that returns immune cells grown outside the body to the patient It was confirmed that the symptom of inflammatory bowel disease was certainly alleviated by cell therapy, and the present invention was completed.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing inflammatory diseases comprising immune cells; [2] The pharmaceutical composition of [1], wherein the immune cell is a lymphocyte; [3] The pharmaceutical composition according to [1], wherein the immune cells are cultured lymphocytes; [4] The pharmaceutical composition according to [3], wherein the lymphocyte is mainly composed of any one of ⁇ T cells, ⁇ T cells, NK cells, and CD16 + and / or CD56 + cells; [5] The pharmaceutical composition of [1], wherein the immune cells are derived from peripheral blood mononuclear cells; [6] The pharmaceutical composition according to any one of [1] to [5], wherein the inflammatory disease is inflammatory bowel disease; [7] The pharmaceutical composition according to [6], wherein the inflammatory bowel disease is ulcerative colitis; [8] The pharmaceutical composition according to any one of [1] to [7], which is administered together with or subsequent to administration of a TNF ⁇ inhibitor. [9] The pharmaceutical composition according to any one of [1] to [7], which is administered together with or
  • [10] Use of isolated immune cells for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of inflammatory diseases; [11] Use of [10], wherein the immune cell is an isolated lymphocyte; [12] Use of [11], which is a lymphocyte cultured after immune cells have been isolated; [13] Use of [12], wherein the lymphocyte is mainly composed of either ⁇ T cell, ⁇ T cell, NK cell or CD16 + and / or CD56 + cell; [14] Use of [10], wherein the immune cells are derived from peripheral blood mononuclear cells; [15] The use according to any one of [10] to [14], wherein the inflammatory disease is inflammatory bowel disease; [16] Use of [15], wherein the inflammatory bowel disease is ulcerative colitis.
  • [17] A method for treating or preventing an inflammatory disease, comprising administering isolated immune cells to a patient; [18] The method of [17], wherein the immune cell is a lymphocyte; [19] The method of [17], wherein the immune cells are cultured lymphocytes; [20] The method of [19], wherein the lymphocyte is mainly composed of any one of ⁇ T cell, ⁇ T cell, NK cell, and CD16 + and / or CD56 + cell; [21] The method of [17], wherein the immune cells are derived from peripheral blood mononuclear cells; [22] The method according to any of [17] to [21], wherein the inflammatory disease is an inflammatory bowel disease; [23] The method of [22], wherein the inflammatory bowel disease is ulcerative colitis.
  • a method of treating or preventing inflammatory diseases [25] The method of [24], wherein the immune cell is a lymphocyte; [26] The method of [25], wherein the lymphocyte is mainly composed of either ⁇ T cell, ⁇ T cell, NK cell, or CD16 + and / or CD56 + cell; [27] The method according to any of [24] to [26], wherein the inflammatory disease is an inflammatory bowel disease; [28] The method of [27], wherein the inflammatory bowel disease is ulcerative colitis.
  • a method for producing a therapeutic or preventive agent for inflammatory bowel disease comprising the composition as an active ingredient, comprising culturing the collected peripheral blood mononuclear cells to obtain the composition.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells serving as a cell source of immune cells.
  • PBMCs means a cell population containing lymphocytes (NK cells, NKT cells, ⁇ T cells, ⁇ T cells, etc.), monocytes and the like isolated from peripheral blood.
  • the method for preparing PBMCs is not particularly limited.
  • peripheral blood obtained by blood collection can be separated by density gradient centrifugation to obtain PBMCs.
  • the amount of blood collected at one time may be appropriately set according to the type of immune cell therapy and the patient to be treated, and is, for example, about 20 to 75 mL.
  • the collected PBMCs are suspended in a culture medium (medium) and cultured with cytokines or the like depending on the type of immune cells to be proliferated or activated.
  • the culture includes a step performed for the purpose of proliferation, activation or processing of cells such as lymphocytes.
  • the type of the culture solution in which PBMCs are suspended is not particularly limited as long as immune cells can be grown.
  • Examples of such a culture solution include AIM-V medium, RPMI-1640 medium, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), Iskov medium, and the like.
  • Serum may be added to these culture solutions as necessary.
  • An example of serum added is autologous plasma.
  • the culture conditions for PBMCs are not particularly limited as long as immune cells can be proliferated and activated.
  • the culture may be performed for about 7 to 20 days under conditions of 34 to 38 ° C. (preferably 37 ° C.) and 2 to 10% (preferably 5%) CO 2 .
  • a culture solution is appropriately added according to the number of cells to be cultured.
  • IL-2 or the like is added as appropriate according to the increase in the amount of the culture solution.
  • NK cells When producing NK cells, a method of adding an agonist of molecules specifically expressed in NK cells, such as anti-CD16 antibody, IL-2, etc. to the medium and culturing them (eg, Patent 4275680) . Any method may be used as the NK cell used in the medicament of the present invention. Further, CD16 + and / or CD56 + cells prepared by the method described in Patent Document WO2009 / 151183 and the like may be used as NK cells.
  • ⁇ Method for producing ⁇ T cells Next, a method for producing ⁇ T cells will be exemplified.
  • the collected PBMCs are seeded in a culture solution to which bisphosphonate and IL-2 are added, and ⁇ T cells are cultured.
  • ⁇ T cells By culturing PBMCs in the presence of bisphosphonate and IL-2, ⁇ T cells can be selectively proliferated and activated to prepare a cell population containing activated ⁇ T cells with high purity (Patent Document 1). reference).
  • the bisphosphonate is not particularly limited and refers to a compound having a P—C—P skeleton.
  • Examples of the bisphosphonate used in the present invention include compounds represented by the following general formula [Chemical Formula 1], salts thereof, and hydrates thereof.
  • R is a hydrogen atom or a lower alkyl group
  • R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, a thiol group, or a substituted group.
  • Selected from the group consisting of an aryl group which may be substituted, an alkyl group which may be substituted, a lower alkylamino group, an aralkyl group, a cycloalkyl group and a heterocyclic group, and R 1 and R 2 are ones of the same cyclic structure. A part may be formed.
  • Examples of the substituent in R 1 and R 2 include a halogen atom, a lower alkyl group, a hydroxyl group, a thiol group, an amino group, an alkoxy group, an aryl group, an arylthio group, an aryloxy group, an alkylthio group, a cycloalkyl group, Selected from the group consisting of heterocyclic groups and the like.
  • examples of the halogen atom include a fluoro atom, a chloro atom, and a bromine atom; Chain or branched C 1 -C 30 alkyl group and the like; as the lower alkyl group, for example, linear or branched C 1 -C 10 alkyl group and the like; as the aryl group, for example, phenyl, naphthyl group and the like; Examples of the aralkyl group include an aryl-lower alkyl group and the like; Examples of the cycloalkyl group include a C 1 -C 10 cycloalkyl group such as cyclooctyl and adamantyl; and examples of the heterocyclic group include pyridyl, furyl, Pyrrolidinyl, imidazolyl, quinolyl, isoquinolyl group and the like are shown respectively.
  • the bisphosphonate is preferably pharmaceutically acceptable, and has a bone resorption inhibitory action and is generally used as a therapeutic agent for osteoporosis.
  • examples include pamidronic acid, alendronic acid, zoledronic acid, risedronic acid, ibandronic acid, incadronic acid and their salts, and hydrates thereof. These are aminobisphosphonates having a nitrogen atom, and pamidronic acid, alendronic acid, zoledronic acid and their salts, and their hydrates are particularly preferred.
  • bisphosphonate bone metabolism-improving drugs include, for example, disodium pamidronate pentahydrate (AREDIA (registered trademark); Novartis Pharma Co., Ltd.), zoledronic acid hydrate (ZOMETA (registered trademark); Novartis Pharma) Etc.).
  • AREDIA registered trademark
  • ZOMETA registered trademark
  • Novartis Pharma Novartis Pharma
  • the concentration of bisphosphonate added during the cultivation of PBMCs is preferably in the range of 0.05 to 100 ⁇ M, and more preferably in the range of 0.1 to 30 ⁇ M. More specifically, when pamidronic acid or a salt thereof or a hydrate thereof, alendronic acid or a salt thereof or a hydrate thereof is added as a bisphosphonate, the concentration of bisphosphonate is within a range of 1 to 30 ⁇ M. preferable. When zoledronic acid or a salt thereof or a hydrate thereof is added as the bisphosphonate, the concentration of bisphosphonate is preferably within the range of 0.1 to 10 ⁇ M.
  • the concentration of IL-2 added during cultivation of PBMCs is preferably in the range of 50 to 2000 U / mL, and more preferably in the range of 400 to 1000 U / mL.
  • the culture conditions for PBMCs are not particularly limited as long as ⁇ T cells can be grown and activated. Usually, it may be cultured for about 7 to 14 days in the presence of 34 to 38 ° C. (preferably 37 ° C.) and 2 to 10% (preferably 5%) CO 2. At this time, a culture solution is appropriately added according to the number of cells to be cultured. Furthermore, IL-2 is appropriately added so as to be 50 to 2000 U / mL, more preferably 400 to 1000 U / mL, in accordance with the increase of the culture medium amount.
  • a cell population containing a large amount of ⁇ T cells can be obtained.
  • the obtained cell population can be used as cells to be administered to a patient in ⁇ T cell therapy as described later.
  • Culturing is carried out at 34 to 38 ° C., preferably 37 ° C. under 2 to 10%, preferably 5% CO 2 conditions, and the culturing period is preferably 1 to 20 days, especially about 1 to 2 weeks.
  • the medium to be used is not particularly limited, but AIM-V medium (Invitrogen), RPMI-1640 medium (Invitrogen), Dulbecco's modified Eagle medium (Invitrogen), Iskov medium (Invitrogen), KBM medium (Kojin Bio), AlyS medium (cells)
  • a commercially available medium used for cell culture such as Scientific Research Laboratories can be used. Further, 5 to 20% of bovine serum, fetal bovine serum, human serum, human plasma and the like can be added as necessary.
  • ⁇ Method for producing ⁇ T cell> As a method for culturing ⁇ T cells, a method using an anti-CD3 antibody and IL-2 is preferable.
  • the anti-CD3 antibody may be added to the medium or immobilized on the culture vessel, but it can be cultured more favorably by seeding lymphocytes in a culture vessel such as a flask on which the anti-CD3 antibody is immobilized. Is known (for example, Japanese Patent No. 3056230).
  • the concentration of IL-2 is preferably added to the medium so as to be a concentration of 100 to 2000 IU / mL.
  • Culturing is carried out at 34 to 38 ° C., preferably 37 ° C. under 2 to 10%, preferably 5% CO 2 conditions, and the culturing period is preferably 1 to 20 days, especially about 1 to 2 weeks.
  • the medium to be used is not particularly limited, but AIM-V medium (Invitrogen), RPMI-1640 medium (Invitrogen), Dulbecco's modified Eagle medium (Invitrogen), Iskov medium (Invitrogen), KBM medium (Kojin Bio), AlyS medium (cells)
  • a commercially available medium used for cell culture such as Scientific Research Laboratories can be used. Further, 5 to 20% of bovine serum, fetal bovine serum, human serum, human plasma and the like can be added as necessary.
  • the medicament of the present invention is a medicament for treating / preventing inflammatory diseases, comprising immune cells produced by the production method of the present invention described above.
  • the medicament of the present invention is, for example, an injection (cell suspension) in which immune cells produced by the production method of the present invention are suspended in a liquid (eg, physiological saline) that can be used as a pharmaceutical product.
  • a liquid eg, physiological saline
  • This injection may be injected intravenously, intradermally, subcutaneously, etc., may be directly injected into a lesion, or may be administered systemically as an infusion.
  • the medicament of the present invention contains immune cells as essential components, but may contain other components as optional components.
  • the number of immune cells contained in the medicament of the present invention can be appropriately set according to the administration method and the type of disease. Usually, it may be set to be 10 8 to 10 12 / person (preferably 10 9 / person).
  • the method for producing the medicament of the present invention is not particularly limited.
  • the medicament of the present invention can be obtained by 1) collecting cultured immune cells by centrifugation or the like; 2) washing the collected immune cells with a washing solution (for example, physiological saline or PBS); The cells are collected by centrifugation or the like; 4) The collected immune cells are suspended in a liquid (eg, physiological saline) that can be used as a pharmaceutical product, and can be produced as an infusion that can be administered intravenously.
  • a liquid eg, physiological saline
  • the immunotherapy according to the present invention can be used as a substitute for or in combination with a medicine such as mesalazine or infliximab that inhibits the production of inflammatory cytokines and thereby alleviates the symptoms.
  • Treatment targets include not only ulcerative colitis, but also diseases associated with inflammatory cytokines, particularly TNF ⁇ , such as Crohn's disease, rheumatoid arthritis, psoriasis (usual psoriasis, arthritic psoriasis, pustular psoriasis, psoriatic) (Including erythroderma), ankylosing spondylitis, and refractory retinal uveitis due to Behcet's disease.
  • the therapeutic agent of the present invention can treat inflammatory diseases, especially ulcerative colitis, and reduce the symptoms of ulcerative colitis by a medical method that could not be completely cured.

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Abstract

本発明の課題は、炎症性疾患の治療、とりわけ潰瘍性大腸炎の症状軽減方法、及びそのための医薬を提供することにある。　免疫細胞療法を炎症性疾患の患者にも適用する。

Description

炎症性疾患を対象とした医薬
　本発明は、炎症性疾患を対象とした医薬に関するものである。
　現在、がん免疫細胞治療として、１）樹状細胞ワクチン療法、２）ＮＫ細胞療法、３）γδＴ細胞療法、４）αβＴ細胞療法、５）細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）療法などが盛んに行われている（特許文献１及び非特許文献１）。
　樹状細胞ワクチン療法とは、末梢血液中の単球から分化させた樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ: ＤＣ）に、その標的となるがん細胞を貪食させて体内に戻し、がん細胞を傷害する能力のある細胞（主にＴ細胞）や抗体産生機能をもつＢ細胞にがんや病原体の目印（抗原）を伝える役割を担う「抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ: ＡＰＣ）」として機能させることにより、がんを治療する方法である。
　ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ）細胞療法とは、末梢血中に含まれるＮＫ細胞などの異常細胞を傷害する能力の高い細胞を、ＩＬ－２など複数の刺激物質を用いて活性化、増殖させて体内に戻し、がんを治療する方法である。ＮＫ細胞は、自然免疫系を担うリンパ球の１種で、強い細胞傷害能を有しており、特に、ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　Ｉ分子が発現低下または消失した細胞を認識し殺傷する機構を有すること、および、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における主たるエフェクター細胞として機能することなどから、腫瘍細胞やウイルス感染細胞の拒絶に重要な細胞である。
　γδＴ細胞は、リンパ球ストレス（細胞傷害）監視機構（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｓｔｒｅｓｓ-ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）と呼ばれる生体防御反応を担う中心的な細胞であり、γδＴ細胞療法とは、患者から採血した梢血中にわずかに存在する（１～５％）γδ型Ｔ細胞受容体（Ｖγ９Ｖδ２受容体）をもつγδＴ細胞を選択的に増殖させ、体内に戻す治療法である。γδＴ細胞はαβＴ細胞が認識する「抗原」に依存することなく、がん細胞表面に比較的共通して発現する分子などを認識することでがんを殺傷する「抗原非特異的」な抗腫瘍効果が得られる。
　αβＴ細胞療法とは、末梢血液中に含まれるリンパ球を約２週間、インターロイキン－２（ＩＬ－２）と抗ＣＤ３抗体を用いて培養し、その全体を活性化・増殖させたのち体内に戻す治療法である。末梢血のＴリンパ球の大半がαβ型のＴ細胞受容体（Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ:　ＴＣＲ）を持つαβＴ細胞であり、増殖した細胞の多くもαβＴ細胞ということになる。αβＴ細胞は、上記樹状細胞などから、抗原を提示され、その抗原をもつ細胞に攻撃を加える。
　細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）療法は、体外でがん細胞を用いて末梢血単核球中のＴ細胞を刺激することにより、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導し、体内に戻す治療法である。がん細胞自体が抗原提示細胞（ＡＰＣ）としての役割を果たし、自身のがんに対する攻撃能力を持った細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を効率的に増やすことが可能になる。
　免疫細胞治療は、従来の外科治療、放射線治療、化学治療の三大療法に比べて副作用がほとんどないという利点を有しており、第４のがん治療法として実際の肺がん患者に対して先進医療として施されている。
国際公開第２００６／００６７２０号パンフレット
メディネットホームページｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｍｅｄｉｎｅｔ-ｉｎｃ.ｃｏ.ｊｐ/ｅｎｇｌｉｓｈ/ｓｅｒｖｉｃｅ/ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ.ｈｔｍｌ
　本願発明者である医師らは、上記がん免疫細胞療法を実際に患者に施している臨床医師らである。本願発明者らは、がん免疫療法を行った患者の症状の経時観察を行ううちに、潰瘍性大腸炎を発症している患者の症状が緩和軽減されていることを発見した。
　すなわち本願発明は、免疫細胞治療の別用途、炎症性疾患、特に潰瘍性大腸炎への適応拡大を目的とするものである。
　炎症性疾患とは、炎症性サイトカインの過剰な生成を伴う疾患を指す。炎症性サイトカインとしては、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα／β）などがある。
　従って炎症性疾患とはこれに限定されないが、クローン病、関節リウマチ、乾癬（尋常性乾癬、関節症性乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症を含む）、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、ベーチェット病による難治性網膜ぶどう膜炎などがこれにあたる。
　炎症性腸疾患（ＩＢＤ：ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）とは、クローン病および潰瘍性大腸炎を含み、下痢および腹痛をもたらす消化管各部の慢性炎症を特徴とする，再発と寛解を繰り返す病態である。
　炎症は、消化管粘膜における細胞性免疫反応により生じる。病因については不明であるが、免疫反応には、サイトカイン、インターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、及び脂質メディエーターなどの炎症メディエーターの放出が関与している。
＜潰瘍性大腸炎＞
　潰瘍性大腸炎（ＵＣ：Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）とは、大腸の粘膜にびらんや潰瘍ができる大腸の炎症性疾患である。特徴的な症状としては、下血を伴うまたは伴わない下痢と腹痛が起こる。病変は、直腸から連続的に、そして上行性に広がる性質があり、最大で直腸から結腸全体に広がる。潰瘍性大腸炎は、病変の広がりや経過により下記のように分類される。
１）病変の拡がりによる分類：全大腸炎、左側大腸炎、直腸炎
２）病期の分類：活動期、寛解期
３）重症度による分類：軽症、中等症、重症、激症
４）臨床経過による分類：再燃寛解型、慢性持続型、急性激症型、初回発作型
　わが国の潰瘍性大腸炎の患者数は約１６万人で、若年者から高齢者まで発症し、性別による差は認められない。潰瘍性大腸炎の原因は、自己免疫反応の異常や食生活等が原因と考えられているが、現在も不明である。
　潰瘍性大腸炎を発症すると、下痢や血便が認められ、痙攣性または持続的な腹痛を伴うことがある。重症になると、発熱、体重減少、貧血などの全身症状がおこる。また、腸管以外の合併症として皮膚の症状、関節や目の症状が出現することもある。
　潰瘍性大腸炎に対しては、例えば、５－アミノサリチル酸薬（５－ＡＳＡ）製薬の経口・直腸からの投与、副腎皮質ステロイド薬、血球成分除去療法、免疫調節薬・抑制薬、抗ＴＮＦα受容体拮抗薬、抗ＴＮＦα抗体などの内的治療法により腸の炎症を抑えることで症状を改善することができるが、完治に導く方法は存在しない。内科的治療で、症状が改善しない場合には、大腸全摘術等の外科的治療が行われることもある。
　細胞性免疫反応に起因すると考えられているため、上記薬物療法・外科療法以外に、非薬物療法の治療法として、血球成分除去療法（ＣＡＰ療法）なども用いられている。たとえば、重症激症患者及び難治性患者に対しては、顆粒球、単球を除去するＧＣＡＰ療法、ステロイド治療抵抗性の患者に対しては白血球（顆粒球、単球及びリンパ球）除去療法（ＬＣＡＰ療法）なども適用され、一定の成果が上げられているものの、普遍的に有効な治療法はいまだが確立されておらず、厚生労働省の特定医療疾患に指定されている。
　本願発明者らは、上記免疫細胞療法を行った患者の経時観察以外に生化学的パラメータの検証を行い、上記血球成分除去療法とは逆に、体外で増殖させた免疫細胞を患者に戻す免疫細胞療法により、炎症性腸疾患の症状の軽減緩和が確かになされていることを確認し、本願発明を完成させた。
　従って、本発明は本発明の構成は以下の［１］から［２９］の通りである。
［１］免疫細胞を含む、炎症性疾患治療用又は予防用医薬組成物；
［２］免疫細胞が、リンパ球である、［１］の医薬組成物；
［３］免疫細胞が、培養されたリンパ球である、［１］に記載の医薬組成物；
［４］リンパ球が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞又はＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋細胞のいずれかを主成分とする、［３］に記載の医薬組成物；
［５］免疫細胞が末梢血単核球由来である、［１］の医薬組成物；
［６］炎症性疾患が炎症性腸疾患である、［１］～［５］のいずれかの医薬組成物；
［７］炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、［６］の医薬組成物；
［８］ＴＮＦα阻害剤の投与と共にあるいは続いて投与される、［１］～［７］のいずれかの医薬組成物。
［９］ＴＮＦα阻害剤が抗ＴＮＦα抗体である、［８］の医薬組成物。
［１０］炎症性疾患治療用又は予防用医薬の製造のための、単離された免疫細胞の使用；
［１１］免疫細胞が単離されたリンパ球である、［１０］の使用；
［１２］免疫細胞が単離された後、培養されたリンパ球である、［１１］の使用；
［１３］リンパ球が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞又はＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋細胞のいずれかを主成分とする、［１２］の使用；
［１４］免疫細胞が末梢血単核球由来である、［１０］の使用；
［１５］炎症性疾患が炎症性腸疾患である、［１０］～［１４］のいずれかの使用；
［１６］炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、［１５］の使用。
［１７］単離された免疫細胞を患者に投与することを含む、炎症性疾患の治療又は予防方法；
［１８］免疫細胞がリンパ球である、［１７］の方法；
［１９］免疫細胞が、培養されたリンパ球である、［１７］の方法；
［２０］リンパ球が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞又はＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋細胞のいずれかを主成分とする、［１９］の方法；
［２１］免疫細胞が末梢血単核球由来である、［１７］の方法；
［２２］炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、［１７］～［２１］のいずれかの方法；
［２３］炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎である、［２２］の方法。
［２４］１）患者から末梢血単核球を単離するステップ、
　　　　２）末梢血単核球を培養して免疫細胞を得るステップ、及び
　　　　３）得られた免疫細胞を患者に投与するステップを含む、
炎症性疾患の治療又は予防方法；
［２５］免疫細胞がリンパ球である、［２４］の方法；
［２６］リンパ球が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞又はＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋細胞のいずれかを主成分とする、［２５］の方法；
［２７］炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、［２４］～［２６］のいずれかの方法；
［２８］炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、［２７］の方法。
［２９］採取した末梢血単核球を培養して組成物を取得することからなる、該組成物を有効成分とする炎症性腸疾患治療剤又は予防剤の製造方法。
　本願発明を用いることにより、患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ）の高い炎症性疾患の治療、炎症の軽減緩和を行うことが可能になる。
　以下、本発明を実施するための形態について説明する。
＜免疫細胞調製の準備＞
　まず、免疫細胞の細胞源となる末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を準備する。ここでＰＢＭＣｓとは、末梢血から分離された、リンパ球（ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞など）、単球などを含む細胞集団を意味する。ＰＢＭＣｓを準備する方法は、特に限定されない。例えば、採血により得られた末梢血を密度勾配遠心法により分離し、ＰＢＭＣｓを得ることができる。一回の採血量は、免疫細胞療法の種類と治療を行う患者に応じて適宜設定すればよいが、例えば２０～７５ｍＬ程度である。
　また、多量の細胞を確保する必要がある場合には、成分採血装置を用いて単核球成分を採取することにより、直接ＰＢＭＣｓを取得することが可能である。
　採取したＰＢＭＣｓは培養液（培地）に懸濁し、増殖又は活性化させたい免疫細胞の種類に応じて、サイトカイン等を添加して培養を行う。培養とは、リンパ球等の細胞の増殖、活性化又は加工を目的として実施する工程を含む。
　ＰＢＭＣｓを懸濁させる培養液の種類は、免疫細胞を増殖させることができれば特に限定されない。そのような培養液の例には、ＡＩＭ－Ｖ培地、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ培地等が挙げられる。これらの培養液には必要に応じて血清を添加してもよい。添加される血清の例としては、自己血漿が挙げられる。
　ＰＢＭＣｓの培養条件は、免疫細胞を増殖及び活性化させることができれば特に限定されない。通常は、３４～３８℃（好ましくは３７℃）かつ２～１０％（好ましくは５％）ＣＯ２条件下で、７～２０日程度培養すればよい。この際、培養する細胞数に応じて、培養液を適宜追加する。さらに、培養液量の増加に合わせて、ＩＬ－２等を適宜追加する。
＜ＮＫ細胞の製造方法＞
　ＮＫ細胞の製造する場合、抗ＣＤ１６抗体等、ＮＫ細胞に特異的に発現する分子のアゴニストや、ＩＬ－２等を培地に添加して培養する方法が一般的である（例えば、特許４２７５６８０等）。本発明の医薬に用いるＮＫ細胞としては、そのいずれの方法を用いても構わない。また、特許文献ＷＯ２００９／１５１１８３等に記載された方法により調製されたＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋細胞をＮＫ細胞として用いても構わない。
＜γδＴ細胞の製造方法＞
　次に、γδＴ細胞の製造方法について例示する。
　採取したＰＢＭＣｓをビスホスホネートおよびＩＬ－２を添加した培養液に播種し、γδＴ細胞を培養する。ＰＢＭＣｓをビスホスホネートおよびＩＬ－２の存在下で培養することにより、γδＴ細胞を選択的に増殖および活性化させて、活性化γδＴ細胞を高純度に含む細胞集団を調製することができる（特許文献１参照）。
　本発明において、ビスホスホネートとは、特に制限されず、Ｐ－Ｃ－Ｐの骨格を有する化合物をいう。本発明に用いるビスホスホネートは、例えば、下記一般式［化１］で表わされる化合物、その塩、及びそれらの水和物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　上記［化１］中、Ｒは、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択され、またＲ１とＲ２は同じ環状構造の一部を形成してもよい。
　上記Ｒ１とＲ２における置換基としては、例えば、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基等からなる群から選択される。
　本明細書において、ハロゲン原子としては、例えば、フルオロ原子、クロロ原子、臭素原子等；アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘプチル、オクチル、ペンタデカニル基等の直鎖又は分枝鎖Ｃ１－Ｃ３０アルキル基等；低級アルキル基としては、例えば、直鎖又は分枝鎖Ｃ１－Ｃ１０アルキル基等；アリール基としては、例えば、フェニル、ナフチル基等；アルアルキル基としては、例えば、アリール－低級アルキル基等；シクロアルキル基としては、例えば、シクロオクチル、アダマンチル等のＣ１－Ｃ１０シクロアルキル基等；複素環式基としては、ピリジル、フリル、ピロリジニル、イミダゾリル、キノリル、イソキノリル基等をそれぞれ示す。
　また、本発明において、ビスホスホネートは、薬学的に許容されるものが好ましく、骨吸収抑制作用を有し、一般的に骨粗鬆症治療薬として使用されているものがあげられる。その例として、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸およびこれらの塩、ならびにこれらの水和物が含まれる。これらは、窒素原子を有するアミノビスホスホネートであり、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸およびこれらの塩、ならびにこれらの水和物が特に好ましい。市販されているビスホスホネート系骨代謝改善薬としては、例えば、パミドロン酸二ナトリウム五水和物（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）；ノバルティスファーマ株式会社）、ゾレドロン酸水和物（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）；ノバルティスファーマ株式会社）などが挙げられる。
　ＰＢＭＣｓの培養時に添加するビスホスホネートの濃度は、０．０５～１００μＭの範囲内が好ましく、０．１～３０μＭの範囲内がより好ましい。より具体的には、ビスホスホネートとしてパミドロン酸もしくはその塩またはこれらの水和物、アレンドロン酸もしくはその塩またはこれらの水和物を添加する場合は、ビスホスホネートの濃度は、１～３０μＭの範囲内が好ましい。また、ビスホスホネートとしてゾレドロン酸もしくはその塩またはこれらの水和物を添加する場合は、ビスホスホネートの濃度は、０．１～１０μＭの範囲内が好ましい。
　ＰＢＭＣｓの培養時に添加するＩＬ－２の濃度は、５０～２０００Ｕ／ｍＬの範囲内が好ましく、４００～１０００Ｕ／ｍＬの範囲内がより好ましい。
　ＰＢＭＣｓの培養条件は、γδＴ細胞を増殖および活性化させることができれば特に限定されない。通常は、３４～３８℃（好ましくは３７℃）かつ２～１０％（好ましくは５％）ＣＯ２存在下で、７～１４日程度培養すればよい。この際、培養する細胞数に応じて、培養液を適宜追加する。更に、培養液量の増加に合わせて、ＩＬ－２を５０～２０００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは４００～１０００Ｕ／ｍＬとなるように適宜追加する。
　以上の手順により、γδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる。得られた細胞集団は、後述するようにγδＴ細胞療法において患者に投与する細胞として利用することができる。
　培養は、３４～３８℃、好ましくは３７℃で、２～１０％、好ましくは５％のＣＯ２条件下で行い、培養期間は１日～２０日、特に１～２週間程度が好ましい。
　使用する培地は特に限定されないが、ＡＩＭ－Ｖ培地（インビトロジェン）、ＲＰＭＩ－１６４０培地（インビトロジェン）、ダルベッコ改変イーグル培地（インビトロジェン）、イスコフ培地（インビトロジェン）、ＫＢＭ培地（コージンバイオ）、ＡＬｙＳ培地（細胞科学研究所）等細胞培養に使用されている市販の培地を使用することができる。また、必要に応じて５～２０％の牛血清、牛胎児血清、ヒト血清、ヒト血漿等を添加することができる。
　＜αβＴ細胞の製造方法＞
　次に、αβＴ細胞の製造方法について例示する。
　αβＴ細胞を培養する方法としては、抗ＣＤ３抗体及びＩＬ－２を用いた方法が好ましい。
　抗ＣＤ３抗体は培地中に添加しても、培養容器に固相化してもよいが、抗ＣＤ３抗体を固相化したフラスコ等の培養容器にリンパ球を播種することで、より好適に培養できることが知られている（例えば、特許３０５６２３０）。ＩＬ－２の濃度は培地中に１００～２０００ＩＵ／ｍＬの濃度となるように添加することが好ましい。
　培養は、３４～３８℃、好ましくは３７℃で、２～１０％、好ましくは５％のＣＯ２条件下で行い、培養期間は１日～２０日、特に１～２週間程度が好ましい。
　使用する培地は特に限定されないが、ＡＩＭ－Ｖ培地（インビトロジェン）、ＲＰＭＩ－１６４０培地（インビトロジェン）、ダルベッコ改変イーグル培地（インビトロジェン）、イスコフ培地（インビトロジェン）、ＫＢＭ培地（コージンバイオ）、ＡＬｙＳ培地（細胞科学研究所）等細胞培養に使用されている市販の培地を使用することができる。また、必要に応じて５～２０％の牛血清、牛胎児血清、ヒト血清、ヒト血漿等を添加することができる。
　＜免疫細胞を含む医薬＞
　本発明の医薬は、上述の本発明の製造方法により製造された免疫細胞を含む、炎症性疾患を治療・予防するための医薬である。
　本発明の医薬は、例えば、本発明の製造方法により製造された免疫細胞を医薬品として利用可能な液体（例えば、生理食塩水）に懸濁させた注射剤（細胞懸濁液）である。この注射剤は、静脈内や皮内、皮下などに注射されてもよいし、病変部に直接注入されてもよいし、点滴として全身投与されてもよい。
　本発明の医薬は、必須成分として免疫細胞を含むが、任意成分としてその他の成分を含んでいてもよい。
　本発明の医薬に含まれる免疫細胞の数は、投与方法や疾患の種類に応じて適宜設定されうる。通常は、１０８～１０１２個／人（好ましくは１０９個／人）となるように設定すればよい。
　本発明の医薬の製造方法は、特に限定されない。例えば、本発明の医薬は、１）培養した免疫細胞を遠心分離法などにより回収し；２）回収した免疫細胞を洗浄液（例えば、生理食塩水やＰＢＳなど）で洗浄し；３）洗浄した免疫細胞を遠心分離法などにより回収し；４）回収した免疫細胞を医薬品として利用可能な液体（例えば、生理食塩水）に懸濁させることにより、経静脈投与が可能な点滴剤として製造されうる。
　以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
＜１．免疫細胞の培養及び投与＞
　同意をいただいた患者から、末梢血を６７．５ｍＬ採取し、遠心分離法により末梢血単核球の培養を行った。瀬田クリニック新横浜ＣＰＣ（細胞加工施設）にて、およそ１４日間の培養を行い、活性化自己ＮＫ細胞を調製した。品質検査後、得られた活性化自己ＮＫ細胞を点滴剤として調製し、患者に経静脈投与を行った。
＜２．結果＞
　当該患者は、数年前から潰瘍性大腸炎により血便、頻便の症状があらわれており、メサラジン（５－アミノサリチル酸：５－ＡＳＡ）を服用しても改善が認められなかった。そこで、インフリキシマブの投与が２年前から開始され、一般的な用法・用量に従い２週間間隔の投与から４週間間隔に延長され、来院時も６～８週間間隔で投与されていた。インフリキシマブ（抗ヒトＴＮＦαモノクローナル抗体）の投与により、症状の緩和は認められたが、血便の症状は続いていた。
　２０１５年３月にＮＫ細胞１回目投与後、翌日より血便が軽減し、まもなく血便が消失した。そのため、潰瘍性大腸炎の主治医と相談し、インフリキシマブの投与を中止し、経過観察を行うこととなった。これまでに計５回の投与を実施し、患者は血便やその他の潰瘍性大腸炎の自覚症状はなく、軽快状態を継続している（２０１７年１月末現在）。また、３回目投与後に実施した内視鏡検査の結果でも炎症状態の明らかな改善が確認された。
　まとめ
　潰瘍性大腸炎の治療薬を長期にわたり投与しても改善しなかった症状が、免疫細胞の投与することで治療薬の投与なく軽快状態が続いていることから、免疫細胞治療は、炎症性疾患、とりわけ潰瘍性大腸炎の症状の治癒緩和に有効であることが、臨床医の総合的な診断の下、確認された。
　従って本願発明に係る免疫療法は、メサラジンやインフリキシマブなどのような、炎症性サイトカインの生成作用を阻害することにより症状の治癒緩和を生じる医薬の代用としてあるいは併用で用いることができる。
　治療疾患対象としては、潰瘍性大腸炎だけでなく、炎症性サイトカイン、とりわけＴＮＦαと関連する疾患、たとえば、クローン病、関節リウマチ、乾癬（尋常性乾癬、関節症性乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症を含む）、強直性脊椎炎、ベーチェット病による難治性網膜ぶどう膜炎などにも適用できる。
　本発明の治療薬は、従来、完治することができなかった内科的な手法により、炎症性疾患の治療、とりわけ潰瘍性大腸炎の症状軽減緩和を行うことが可能である。
 
 

Claims (29)

  1. 　免疫細胞を含む、炎症性疾患治療用又は予防用医薬組成物。
  2. 　前記免疫細胞が、リンパ球である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　前記免疫細胞が、培養したリンパ球である、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 　前記リンパ球が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞又はＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋細胞のいずれかを主成分とする、請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 　前記免疫細胞が末梢血単核球由来である、請求項１に記載の医薬組成物。
  6. 　前記炎症性疾患が炎症性腸疾患である、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 　前記炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、請求項６の医薬組成物。
  8. 　ＴＮＦα阻害剤の投与と共にあるいは続いて投与される、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  9. 　前記ＴＮＦα阻害剤が抗ＴＮＦα抗体である、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 　炎症性疾患治療用又は予防用医薬の製造のための、単離された免疫細胞の使用。
  11. 　前記免疫細胞が単離されたリンパ球である、請求項１０に記載の使用。
  12. 　前記リンパ球が単離された後、培養されたリンパ球である、請求項１１に記載の使用。
  13. 　前記リンパ球が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞又はＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋細胞のいずれかを主成分とする、請求項１２に記載の使用。
  14. 　前記免疫細胞が末梢血単核球由来である、請求項１０に記載の使用。
  15. 　前記炎症性疾患が炎症性腸疾患である、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の使用。
  16. 　前記炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、請求項１５に記載の使用。
  17. 　単離された免疫細胞を患者に投与することを含む、炎症性疾患の治療又は予防方法。
  18. 　前記免疫細胞がリンパ球である、請求項１７に記載の方法。
  19. 　前記リンパ球が、培養されたリンパ球である、請求項１８に記載の方法。
  20. 　前記リンパ球が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞又はＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋細胞のいずれかを主成分とする、請求項１９に記載の方法。
  21. 　前記免疫細胞が末梢血単核球由来である、請求項１７に記載の方法。
  22. 　前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 　前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎である、請求項２２に記載の方法。
  24. 　１）患者から末梢血単核球を単離するステップ、
    　２）末梢血単核球を培養して免疫細胞を得るステップ、及び
    　３）得られた免疫細胞を患者に投与するステップを含む、
    炎症性疾患の治療又は予防方法。
  25. 　前記免疫細胞がリンパ球である、請求項２４に記載の方法。
  26. 　前記リンパ球が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞又はＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋細胞のいずれかを主成分とする、請求項２５に記載の方法。
  27. 　前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 　前記炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、請求項２７に記載の方法。
  29. 　採取した末梢血単核球を培養して組成物を取得することからなる、該組成物を有効成分とする炎症性腸疾患治療剤又は予防剤の製造方法。
     
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