WO2009148057A1

WO2009148057A1 - 血球細胞の初期化法

Info

Publication number: WO2009148057A1
Application number: PCT/JP2009/060079
Authority: WO
Inventors: 研二長尾; 篤志國里; 功石田
Original assignee: 協和発酵キリン株式会社
Priority date: 2008-06-02
Filing date: 2009-06-02
Publication date: 2009-12-10
Also published as: JP2011160661A

Abstract

　体細胞から多能性幹細胞を製造する方法であって、（ａ）体細胞を、(i)ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子もしくはこれと同等の活性を示す物質、(ii)ＳＣＦもしくはこれと同等の活性を示す物質、(iii)ＴＰＯもしくはこれと同等の活性を示す物質、(iv)ＩＬ－３もしくはこれと同等の活性を示す物質、および(v)Ｆｌｔ－３リガンドもしくはこれと同等の活性を示す物質から選択される少なくとも２種のサイトカイン類を含む細胞培養培地中で培養する工程、ならびに（ｂ）体細胞を脱分化させる工程を含んでなり、工程（ａ）の後に工程（ｂ）が行われるか、または工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に行われるか、または工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に行われた後に工程（ａ）が行われる方法が開示される。この方法によれば、体細胞から効率的に多能性幹細胞を製造することが可能となる。

Description

血球細胞の初期化法

関連出願の参照

　本特許出願は、先に出願された日本国における特許出願である特願２００８－１４５０２２号（出願日：２００８年６月２日）に基づく優先権の主張を伴うものである。この先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。

発明の背景

　発明の分野
　本発明は、分化した体細胞、特に血球系細胞を初期化または脱分化することにより多能性幹細胞を製造するための方法およびキットに関する。

　背景技術
　胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、生体中の組織・臓器を構成するほぼ全ての種類の細胞に分化できる多能性を有したまま、長期間にわたる細胞増殖を無制限に維持できる細胞株である。この性質により、ＥＳ細胞は、パーキンソン病、Ｉ型糖尿病、脊髄損傷、心不全など、多くの疾患に対する移植療法のための細胞資源として、組織工学による人工組織・臓器作製のための多種類細胞材料の供給源として、さらには、基礎研究や創薬研究に用いられるヒト細胞の供給源としての利用が期待されている。しかしながら、ＥＳ細胞はヒトやマウスの初期胚を破壊して樹立された細胞株であることから、倫理的見地よりＥＳ細胞の利用に対する反対意見も多い。また、細胞移植療法については、他人の細胞を移植することになることから、臓器移植と同様に拒絶反応を惹起する危険性を伴っている。これらの問題を回避する方法として、患者自身の分化体細胞を初期化した、ＥＳ細胞に近い多能性と増殖能を有した誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の利用が期待されている。

　分化体細胞の初期化法として、例えば、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）にレトロウィルスベクターでＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－ｍｙｃの４遺伝子を同時感染させることによりｉＰＳ細胞を誘導する技術が報告されている（K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 126, pp.663-676, 2006；K. Okita, T. Ichisaka, S. Yamanaka, Nature, 448, pp. 313-317, 2007；M. Wernig et al., Nature, 448, pp.318-324, 2007）。マウス肝細胞および胃上皮細胞から同様の方法でｉＰＳ細胞を誘導する技術も報告されている（T. Aoi et al., Science Express on 14 Feb. 2008）。これらの報告における初期化因子のスクリーニング方法については国際公開第２００５／０８０５９８号パンフレットに提案されており、また、当該初期化因子については、他のＥＳ細胞特異的遺伝子（初期化因子の候補遺伝子）と共に国際公開第２００７／０６９６６６号パンフレットに提案されている。これらの報告および提案においては、ヒト細胞について一部記載があるものの、この段階ではヒトＥＳ細胞と同等の性質を持ったヒトｉＰＳ細胞としての樹立は不完全なものである。また、肝細胞や胃上皮細胞からの誘導はヒトに適用する場合には侵襲性が多く、採取する患者の負担が大きくなることが予想される。

　ヒトｉＰＳ細胞を樹立する方法としては、成人皮膚由来線維芽細胞 (ＨＤＦ細胞)にレトロウィルスを用いてＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－ｍｙｃの４因子を導入する方法が報告されている（K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 131, pp.861-872, 2007）。この方法においては、レトロウィルスを高効率に感染させるために、マウスエコトロピックウィルス受容体であるｓｏｌｕｔｅｃａｒｒｉｅｒｆａｍｉｌｙ７(Ｓｌｃ７ａ１) をレンチウィルスにより発現させた細胞を用いている。その結果、レトロウィルスの感染後２５日目頃よりヒトＥＳ細胞様のコロニーを認め、３０日目以降にコロニーのピックアップを実施している。この方法では、新たにマウスエコトロピックウィルス受容体をレンチウィルスにより導入しているため、異種動物由来の遺伝子の発現および染色体へのＤＮＡ断片挿入機会の増加による、宿主細胞の癌化リスクの増大といった課題を抱えている。さらに、誘導日数が１ヶ月におよぶため、培養コストについても課題を抱えている。また、この報告では、ｉＰＳ細胞の誘導に新生児包皮由来線維芽細胞（ＢＪ１細胞）も用いられており、その場合のヒトＥＳ細胞様コロニーの出現頻度はＨＤＦを用いた場合よりも高いが、誘導日数については短縮されていない。

　他のグループでは、アデノウィルスによりマウスエコトロピックウィルス受容体であるｍＣＡＴ１遺伝子を発現させたヒト新生児包皮由来線維芽細胞を用いて、同様の４因子をレトロウィルスにより導入し、ｉＰＳ細胞を誘導した報告もある（H.Masaki et al., Stem Cell Research, 1, pp.105-115, 2007）。この報告では、レトロウィルスの感染後１７日目にｉＰＳ様のコロニーの出現が認められている。この方法では、アデノウィルスでウィルス受容体を発現させていることにより、染色体ＤＮＡへの異種遺伝子の挿入リスクは低減されているが、異種遺伝子が細胞内に導入されることに伴うリスクは以前として残る。同様の４因子をレトロウィルスによりヒト胎児肺線維芽細胞 (ＭＲＣ５細胞)へ導入してｉＰＳ細胞を誘導した報告もある（I. H. Park et al., Nature, 451, pp.141-146, 2008）。しかしながら、この報告では、ＢＪ１細胞、成体間葉系幹細胞（ＭＳＣ細胞）、およびＨＤＦ細胞からの４因子によるｉＰＳ細胞誘導は成功していない。また、初期化因子としてＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬｉｎ２８の４因子を用いて、レンチウィルスで細胞に発現させることにより、ｆｅｔａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｓ(ＩＭＲ９０ｃｅｌｌｓ)やｎｅｗｂｏｒｎｆｏｒｅｓｋｉｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔからＥＳ細胞様コロニーを取得している報告もある（J. Yu et al., Science, 318, pp.1917-1920, 2007）。胎児や新生児の細胞を用いた場合、成人の表皮線維芽細胞を用いた場合に比べて、より短期間でｉＰＳ細胞が誘導できているが、治療や研究に用いる細胞源としては倫理的な課題が残る。この報告ではさらに、ヒトＥＳ細胞から分化誘導した血球細胞等を用いてｉＰＳ細胞が誘導可能であることが報告されている。しかし、ＥＳ細胞から分化誘導した細胞は正常な分化過程を経ておらず、成体由来の血球細胞と同一の細胞とはいえない。今のところ、成体から採取した血球細胞からのｉＰＳ細胞の誘導についての報告はない。

　Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－ｍｙｃの４因子に加え、Ｎａｎｏｇを共発現させることによりｉＰＳ細胞の誘導を効率化した報告もある(W. E. Lowry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, pp.2883-2888, 2008) 。Ｎａｎｏｇの存在下でリプログラミング（初期化）効率が上がることは従来から報告されている(J. Silva et al., Nature, 441, pp.997-1001, 2006) 。レトロウィルスを用いてＨＤＦ細胞に遺伝子導入を行い、ウィルス感染終了後２１日目でＥＳ細胞様コロニーが出現する。Ｎａｎｏｇを用いることによりｉＰＳ細胞の誘導効率が上がっているが、因子の種類を増やすことは、染色体に挿入される遺伝子の種類も増やすこととなり、初期化因子の種類を増やさない方法での効率改善が望まれる。

　また、マウスにおいては終末分化した成熟Ｂ細胞からｉＰＳ細胞を誘導した報告もある（J. Hanna et al., Cell, 133, pp.250-264, 2008）。この報告においては、ドキシサイクリン依存的に４つの核初期化因子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－ｍｙｃを発現するユニットをレンチウィルスベクターにより導入することによって、まずｉＰＳ細胞を誘導している。さらに、誘導されたｉＰＳ細胞を用いてトランスジェニックマウスを作製している。成熟Ｂ細胞からのｉＰＳ細胞誘導には、こうして得られたトランスジェニックマウスより調製したＢ細胞を用いており、同様の方法をヒトに適用することは不可能である。ヒトの終末分化した血液細胞からｉＰＳ細胞を誘導するためには本法を適用することはできず、ヒト初代細胞に適用できる初期化方法が望まれる。

　一方で、ＥＳ細胞のような多能性幹細胞の利用により治療効果が期待される医療領域では、ＥＳ細胞から分化誘導した細胞による治療法の検討と並行して、生体内に存在する体性幹細胞の利用が検討されてきた。そのような取組みの中、細胞移植療法への利用を目的として生体外で体性幹細胞を増幅する技術の報告がある。中でも造血幹細胞については、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔリガンド（ＦＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）と可溶化型ＩＬ－６受容体のα鎖（ＩＬ－６Ｒ）との融合タンパク質などのサイトカインを用いて、臍帯血由来の造血幹細胞や骨髄由来の造血幹細胞を増幅した報告がある（T. Ueda et al., J. of Clinical Investigation, 105, pp-1013-1021, 2000；L. Gammaitoni et al., Experimental Hematology, 31, pp. 261-270, 2003）。さらに、ストローマ細胞を用いて増幅率を向上させる技術もある（国際公開第２００３／０１４３３６号パンフレット）。いずれも血球系の幹細胞または前駆細胞を増幅する技術であり、増幅の際に他の細胞系譜への分化能を付与することはできず、体細胞の初期化作用や脱分化作用はない。また、造血幹細胞の増幅には限界があり、ＥＳ細胞のように多能性を維持したまま無制限に増殖させることはできない。

　本発明者らは、ＩＬ－６シグナル伝達因子（ＩＬ６ＳＴ）刺激因子とサイトカインカクテルとの存在下での培養と、細胞の脱分化とを組み合わせることにより、体細胞から多能性幹細胞を効率的に樹立できることを見出した。さらに、本発明者らは、前記培養において、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３およびＦｌｔ－３リガンドから選択される少なくとも２種のサイトカイン類を含む細胞培養培地を用いても同様の結果となることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。

　従って、本発明の目的は、体細胞から効率的に多能性幹細胞を製造する方法を提供することにある。

　そして、本発明による多能性幹細胞の製造法は、体細胞から多能性幹細胞を製造する方法であって、（ａ）体細胞を、(i)ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子もしくはこれと同等の活性を示す物質、(ii)ＳＣＦもしくはこれと同等の活性を示す物質、(iii)ＴＰＯもしくはこれと同等の活性を示す物質、(iv)ＩＬ－３もしくはこれと同等の活性を示す物質、および(v)Ｆｌｔ－３リガンドもしくはこれと同等の活性を示す物質から選択される少なくとも２種のサイトカイン類を含む細胞培養培地中で培養する工程、ならびに（ｂ）体細胞を脱分化させる工程を含んでなり、工程（ａ）の後に工程（ｂ）が行われるか、または工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に行われるか、または工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に行われた後に工程（ａ）が行われる方法である。工程（ａ）において用いられる細胞培養培地は、好ましくは上記の(i)～(v)から選択される少なくとも３種のサイトカイン類を含むものとされる。

　さらに、本発明の第二の態様によれば、体細胞から多能性幹細胞を製造する方法であって、（ａ）体細胞を、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子および少なくとも１種のサイトカインを含む細胞培養培地中で培養する工程、および（ｂ）体細胞を脱分化させる工程を含んでなり、工程（ａ）の後に工程（ｂ）が行われるか、または工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に行われる方法が提供される。

　本発明によれば、人体より軽微な負担で採取できる体細胞、例えば末梢血液細胞などから、従来法よりも短期間で高効率に多能性幹細胞を樹立することができる。多能性幹細胞の樹立に要する期間は、例えば、従来法の約１／２にまで短縮することが可能である。よって、製造された多能性幹細胞を、脊髄損傷などの緊急性の高い疾患の治療に利用することができ、また、多能性幹細胞の製造にかかる費用も低減することが可能となる。

ヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）から誘導された多能性幹細胞の未分化マーカーの発現量を評価したＦＡＣＳ解析の結果、誘導された多能性幹細胞が形成するコロニーの形態および誘導された多能性幹細胞のアルカリフォスファターゼの活性染色の結果を示した。[Ａ]はｈＢＭＭＮＣｓに対して核初期化因子を発現するレトロウィルスを感染させた後２０日目の未分化細胞マーカーＳＳＥＡ－４の発現を示した。図の水平軸がＳＳＥＡ－４の発現量を示し、垂直軸が示すＰＩの染色強度が低いものが生細胞を示した。図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。「ＳＴ３ＦＰ６」はレトロウィルス感染前２日間および核初期化プロセスにおいて、サイトカインカクテルとしてＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３、ＦＰ６をｈＢＭＭＮＣｓと共存させていることを示し、「ＳＴ３」はレトロウィルス感染前２日間および核初期化プロセスにおいて、サイトカインカクテルとしてＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３をｈＢＭＭＮＣｓと共存させていることを示した。[Ｂ]は核初期化プロセスにおいて形成された細胞コロニーの形態を示した。「Ｄａｙ１０」、「Ｄａｙ２０」はレトロウィルス感染開始からの日数を示した。[Ｃ]はｈＢＭＭＮＣｓから誘導された多能性幹細胞のレトロウィルス感染開始から２７日目のアルカリフォスファターゼ染色を示した。ヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）から誘導された多能性幹細胞の未分化マーカーの発現量を評価したＦＡＣＳ解析の結果および誘導された多能性幹細胞が形成するコロニーの形態を示した。レトロウィルス感染前２日間および核初期化プロセスにおいて、サイトカインカクテルとしてＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３、ＦＰ６、ＦｌｔリガンドをｈＢＭＭＮＣｓと共存させた場合を示した。[Ａ]はｈＢＭＭＮＣｓに対して核初期化因子を発現するレトロウィルスを感染させた後２２日目の未分化細胞マーカーＳＳＥＡ－４の発現を示した。図の水平軸がＳＳＥＡ－４の発現量を示し、垂直軸が細胞数を示した。 [Ｂ]は核初期化プロセスにおいて形成された細胞コロニーの形態を示した。ｐＭＸｓＩＧベクターを用いて調製されたレトロウィルスのヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）に対する感染効率を評価するためのＦＡＣＳ解析結果を示した。「ＰＩ」はヨウ化プロピジウムによる染色強度を示し、図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。各図の水平軸は感染したレトロウィルスゲノムから発現する緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの発現強度を示した。「サイトカイン培養なし」はレトロウィルス感染前後でサイトカイン類を共存させない場合を示した。「ＳＴ３添加培養」はレトロウィルス感染２日前より、ＦＡＣＳ解析を行ったレトロウィルス感染２日後までの間、ｈＢＭＭＮＣｓとＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３のサイトカインを共存させた場合を示した。「ＳＴ３ＦＰ６添加培養」はレトロウィルス感染２日前より、ＦＡＣＳ解析を行ったレトロウィルス感染２日後までの間、ｈＢＭＭＮＣｓとＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３、ＦＰ６のサイトカインを共存させた場合を示した。ｐＭＸｓＩＧベクターを用いて調製されたレトロウィルスが感染したヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）の細胞系譜を同定評価するためのＦＡＣＳ解析結果を示した。レトロウィルス感染２日前よりＦＡＣＳ解析を行ったレトロウィルス感染２日後までの間、ｈＢＭＭＮＣｓを、ＳＣＦ、ＴＰＯ、およびＩＬ－３サイトカインと共存させた場合をＳＴ３として示し、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３、およびＦＰ６サイトカインと共存させた場合をＳＴ３ＦＰ６として示し、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３、ＦＰ６、およびＦｌｔ３リガンドと共存させた場合をＳＴ３ＦＬＦＰ６として示した。各図の水平軸は感染したレトロウィルスゲノムから発現する緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの発現強度を示し、図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。「ＣＤ４５ＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ４５抗体による染色強度を示した。「ＣＤ３４ＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ３４抗体による染色強度を示した。「ＣＤ３８ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３８抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１１７ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１１７抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１１ｂＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体による染色強度を示した。「ＣＤ３ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１９ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１９抗体による染色強度を示した。ｐＭＸｓＩＧベクターを用いて調製されたレトロウィルスが感染したヒト末梢血由来単核球細胞（ｈＰＢＭＮＣｓ）の細胞系譜を同定評価するためのＦＡＣＳ解析結果を示した。レトロウィルス感染２日前よりＦＡＣＳ解析を行ったレトロウィルス感染２日後までの間、ｈＰＢＭＮＣｓをヒトＳＣＦ、ヒトＴＰＯ、ヒトＩＬ－３、ＦＰ６、Ｆｌｔ３リガンド、ヒトＧＭ－ＣＳＦ、ヒトＭ－ＣＳＦと共存させた場合をＧＭ培養として示し、ヒトＳＣＦ、ヒトＴＰＯ、ヒトＩＬ－３、ＦＰ６、ＬＰＳ、抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体の因子と共存させた場合をＴＢ培養として示した。各図の水平軸は感染したレトロウィルスゲノムから発現する緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの発現強度を示し、図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。「ＣＤ４５ＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ４５抗体による染色強度を示した。「ＣＤ３４ＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ３４抗体による染色強度を示した。「ＣＤ３８ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３８抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１１７ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１１７抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１１ｂＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体による染色強度を示した。「ＣＤ３ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１９ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１９抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１３ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１３抗体による染色強度を示した。クローニングしたヒト誘導多能性細胞株について、コロニー形態およびＦＡＣＳによるヒトＥＳ細胞マーカーＳＳＥＡ－４の発現解析結果を示した。図の水平軸がＳＳＥＡ－４の発現量を示し、垂直軸が細胞数を示した。クローニングしたヒト誘導多能性細胞株についてのＲＴ－ＰＣＲ解析結果を示した。図の水平方向に各細胞株を配置し、ＳＴ３、ＳＴ３ＦＰ６、ＳＴ３ＦＬＦＰ６は各細胞の誘導条件を示し、その下の数字が各クローン番号を示した。図の垂直方向には多能性幹細胞マーカーとして知られる遺伝子を配置し、コントロール遺伝子としてハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの結果を示した。図の黒色のバンドが各遺伝子についての発現を示している。Ｏｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）あるいはＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来の胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）から誘導された多能性幹細胞が形成するコロニーの形態および未分化性のマーカーであるＯｃｔ４－ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。[Ａ]はＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓに対して核初期化因子を発現するレトロウィルスを感染させた後５日目の細胞の形態および未分化性マーカーＯｃｔ４－ＥＧＦＰの発現を示した。「４遺伝子サンプル」はレトロウィルスを調製する際に、４つの核初期化遺伝子を同時にパッケージング細胞へ導入してレトロウィルスを作製した場合を示した。「４ウィルスサンプル」はレトロウィルスを調製する際に、４つの核初期化遺伝子をそれぞれ個別にパッケージング細胞へ導入してレトロウィルスを作製した後に、レトロウィルスを混合し細胞に感染させた場合を示した。[Ｂ]はＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓにレトロウィルスを感染させる際に、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３のサイトカインを共存させた場合の、レトロウィルス感染後５日目の細胞の形態および未分化性マーカーＯｃｔ４－ＥＧＦＰの発現を示した。 [Ｃ]はＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のＭＥＦに対して核初期化因子を発現するレトロウィルスを感染させた後５日目の細胞の形態および未分化性マーカーＯｃｔ４－ＥＧＦＰの発現を示した。Ｏｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウスの骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）から誘導された多能性幹細胞について、未分化性のマーカーであるＯｃｔ４－ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現と血球細胞のマーカーであるＣＤ４５抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果を示した。Ｏｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓに対して核初期化因子を発現するレトロウィルスを感染させた後７日目の解析を示した。「４遺伝子」はレトロウィルスを調製する際に、４つの核初期化遺伝子を同時にパッケージング細胞へ導入してレトロウィルスを作製した場合を示した。「４ウィルス」はレトロウィルスを調製する際に、４つの核初期化遺伝子をそれぞれ個別にパッケージング細胞へ導入してレトロウィルスを作製した後に、レトロウィルスを混合し細胞に感染させた場合を示した。「濃縮ウィルス」は「４ウィルス」と同様に調製したレトロウィルスを濃縮して感染に用いた場合を示した。各図の水平軸は感染したレトロウィルスゲノムから発現する緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの発現強度を示した。「ＣＤ４５ＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ４５抗体による染色強度を示し、図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。Ｏｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）あるいはＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来の胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）から誘導された多能性幹細胞が形成するコロニーの形態および未分化性のマーカーであるＯｃｔ４－ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。Ｏｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓあるいはＭＥＦに対して核初期化因子を発現するレトロウィルスを感染させた後７日目の様子を示した。「ｍＢＭＭＮＣｓ」はＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓから誘導された細胞を示した。「ＭＥＦ」はＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のＭＥＦから誘導された細胞を示した。Ｏｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウスの骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）から誘導された多能性幹細胞クローンについて、未分化性のマーカーであるＯｃｔ４－ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現とマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ－１抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果および多能性幹細胞クローンが形成するコロニーの形態とコロニーにおける未分化性のマーカーであるＯｃｔ４－ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。[Ａ]はＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭｉＰＳ細胞クローン＃７およびクローン＃１３について未分化性マーカーＯｃｔ４－ＥＧＦＰの発現およびマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ－１抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果を示した。「ＩｇＧＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合コントロールＩｇＧによる染色強度を示した。「ＳＳＥＡ－１　Ａｌｅｘａ６４７」はＡｌｅｘａ６４７結合抗マウスＳＳＥＡ－１抗体による染色強度を示した。各図の水平軸は未分化性マーカーＯｃｔ４－ＥＧＦＰの発現強度を示し、図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。[Ｂ]はＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭｉＰＳ細胞クローン＃７およびクローン＃１３についてマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ－１抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果を示した。水平軸はマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ－１抗原の発現強度を示し、垂直軸は細胞数を示した。図の実線がＡｌｅｘａ６４７結合抗マウスＳＳＥＡ－１抗体で染色した場合をしめし、破線はアロフィコシアニン結合コントロールＩｇＧで染色した場合を示した。[Ｃ]はＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭｉＰＳ細胞クローン＃７およびクローン＃１３が形成するコロニーの形態および未分化性のマーカーであるＯｃｔ４－ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。ｐＭＹｓＩＧベクターを用いて調製されたレトロウィルスのＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）あるいはＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来の胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）に対する感染効率を評価するためのＦＡＣＳ解析結果を示した。図の水平軸は感染したレトロウィルスゲノムから発現する緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの発現強度を示し、垂直軸は細胞数を示した。レトロウィルス感染後２日目の解析結果を示した。「ＢＭＭＮＣｓ」はＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来ｍＢＭＭＮＣｓを用いた場合を示し、「ゼラチン上に予め培養ＭＥＦ」はウィルス感染前日からゼラチンコートプレート上で培養していたＯｃｔ４－ＥＧＦＰマウスＭＥＦを用いた場合を示し、「レトロネクチン上ＭＥＦ」はＢＭＭＮＣｓと同様にレトロネクチンコートプレートで感染させたＭＥＦを用いた場合を示した。Ｏｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウスの骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）あるいはＭＥＦからｐＭＹｓ核初期化遺伝子ベクターを用いて調製されたレトロウィルスを用いて誘導された多能性幹細胞について、未分化性のマーカーであるＯｃｔ４－ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現とマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ－１抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果および多能性幹細胞クローンが形成するコロニーの形態とコロニーにおける未分化性のマーカーであるＯｃｔ４－ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。[Ａ]はレトロウィルス感染７日後のＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来ｍＢＭＭＮＣｓおよびＭＥＦの未分化性マーカーＯｃｔ４－ＥＧＦＰの発現およびマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ－１抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果を示した。「ＳＳＥＡ－１　Ａｌｅｘａ６４７」はＡｌｅｘａ６４７結合抗マウスＳＳＥＡ－１抗体による染色強度を示した。各図の水平軸は未分化性マーカーＯｃｔ４－ＥＧＦＰの発現強度を示し、図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。[Ｂ]はレトロウィルス感染７日後にＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓおよびＭＥＦが形成するコロニーの形態および未分化性のマーカーであるＯｃｔ４－ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。[Ｃ]はレトロウィルス感染１２日後にＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓおよびＭＥＦが形成するコロニーの形態および未分化性のマーカーであるＯｃｔ４－ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。「ＢＭＭＮＣｓ」はＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来ｍＢＭＭＮＣｓを用いた場合を示し、「ゼラチン上に予め培養ＭＥＦ」はウィルス感染前日からゼラチンコートプレート上で培養していたＯｃｔ４－ＥＧＦＰマウスＭＥＦを用いた場合を示し、「レトロネクチン上ＭＥＦ」はＢＭＭＮＣｓと同様にレトロネクチンコートプレートで感染させたＭＥＦを用いた場合を示した。ヌードマウスの皮下に移植されたマウス骨髄由来ｉＰＳ＃７細胞より形成された奇形腫を示す。[Ａ]は皮下に移植されたマウス骨髄由来ｉＰＳ＃７細胞あるいはＥＳ細胞より奇形腫が形成されたヌードマウスを示す。[Ｂ]は形成された奇形腫より作製した病理標本を示し、標本中には、未分化神経組織、中枢神経、大脳皮質様組織、毛根組織、筋組織、軟骨組織、白色脂肪組織、気管粘液上皮細胞及び繊毛を有する気管上皮細胞、食道粘膜様組織、膵臓腺房細胞、唾液腺の漿液細胞および粘液細胞などが観察される。マウス骨髄由来ｉＰＳ＃７細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの受精卵から作製した胚盤胞に注入後、偽妊娠マウスに移植することにより作出されたキメラ個体を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスは本来白色の毛色を示し、骨髄由来ｉＰＳ細胞は黒色の毛色を有するＣ５７ＢＬ／６マウスに由来している。黒色の毛色を有する細胞は骨髄由来ｉＰＳ細胞由来の細胞であることを示している。マウス骨髄由来のｉＰＳ細胞クローンとマウスＥＳ細胞およびマウス骨髄由来単核球細胞について、各細胞で発現している遺伝子の発現強度の比較を示した図である。「ｉＰＳ＃７」はマウスｉＰＳ細胞クローンを示し、「ＢＭＭＮＣ」はマウス骨髄由来単核球細胞を示す。各図の水平軸、垂直軸は各細胞で発現する遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの量を示し、図中の各点は一種類の遺伝子に対応している。比較する細胞間で発現する遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの量が同一である場合には、図中の各点は図の対角線上に位置することになる。クローニングしたヒト末梢血由来誘導多能性細胞クローンについてのＲＴ－ＰＣＲ解析結果を示した。図の水平方向に各クローンを配置し、１^st、２^nd、３^rd、４^thは表５に記載の実験、１回目、２回目、３回目、４回目に対応し、ＳＴ３、ＳＴ３ＦＰ、Ｎｏｎｅは各細胞の誘導条件を示し、その下の数字が各クローン番号を表した。コントロール細胞として、ＧＭ培養系サイトカイン処理を行ったあるいは、無処理の末梢血由来単核球細胞およびＭＥＦを用いた。図の垂直方向には多能性幹細胞マーカーとして知られる遺伝子を配置し、コントロール遺伝子としてハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの結果を示した。図の黒色のバンドが各遺伝子についての発現を示している。ヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）から誘導された多能性幹細胞株ＢＭｉＰＳ＃１７およびヒト末梢血由来単核球細胞（ｈＰＢＭＮＣｓ）から誘導された多能性幹細胞株ＰＢｉＰＳ＃１について、未分化マーカーの発現量を評価したＦＡＣＳ解析の結果を示した。図は未分化細胞マーカーＳＳＥＡ－４およびＴｒａ１-６０の発現を示した。図の水平軸がＳＳＥＡ－４の発現量を示し、垂直軸がＴｒａ１-６０を示した。図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。ヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）から誘導された多能性幹細胞株ＢＭｉＰＳ＃１７およびヒト末梢血由来単核球細胞（ｈＰＢＭＮＣｓ）から誘導された多能性幹細胞株ＰＢｉＰＳ＃１について、未分化マーカーの発現を評価した免疫染色の結果を示した。蛍光標識したヒト多能性幹細胞マーカーＯｃｔ３／４およびＮａｎｏｇに対する抗体を用いて細胞を染色し、蛍光顕微鏡によりシグナルを検出した結果を示した。ヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）から誘導された多能性幹細胞株ＢＭｉＰＳ＃１７およびヒト末梢血由来単核球細胞（ｈＰＢＭＮＣｓ）から誘導された多能性幹細胞株ＰＢｉＰＳ＃１、＃８についてのＲＴ－ＰＣＲ解析結果を示した。コントロール細胞として、サイトカイン無処理のｈＢＭＭＮＣｓ、ｈＰＢＭＮＣｓおよびＭＥＦを用いた。図の垂直方向には多能性幹細胞マーカーとして知られる遺伝子を配置し、コントロール遺伝子としてハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの結果を示した。図の黒色のバンドが各遺伝子についての発現を示している。Ｓｃｉｄマウスの精巣内に移植されたヒト多能性幹細胞株ＢＭｉＰＳ＃１７およびＰＢｉＰＳ＃１より形成された奇形腫を示す。[Ａ]はヒト多能性幹細胞株ＢＭｉＰＳ＃１７より形成された奇形腫の病理標本を示す。[Ｂ]はヒト多能性幹細胞株ＰＢｉＰＳ＃１より形成された奇形腫の病理標本を示す。いずれの標本中にも、未分化神経組織、筋組織、軟骨組織、消化管上皮細胞、唾液腺様の細胞などが観察された。Ｓｃｉｄマウスの精巣内に移植されたヒト多能性幹細胞株ＢＭｉＰＳ＃１７およびＰＢｉＰＳ＃１より形成された奇形腫を示す。各奇形腫の病理標本に対して、平滑筋細胞マーカーであるＳＭＡに対する抗体、肝細胞マーカーであるＡＦＰに対する抗体およびグリア細胞マーカーであるＧＦＡＰに対する抗体を用いて免疫染色を行った結果を示す。[Ａ]はヒト多能性幹細胞株ＢＭｉＰＳ＃１７より形成された奇形腫病理標本に対する免疫染色の結果を示す。[Ｂ]はヒト多能性幹細胞株ＰＢｉＰＳ＃１より形成された奇形腫病理標本に対する免疫染色の結果を示す。ヒト多能性幹細胞株ＰＢｉＰＳ＃１を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ分化誘導の結果および蛍光免疫染色の結果を示す。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ分化誘導後の細胞の様子および該細胞を蛍光標識された平滑筋細胞マーカーであるＳＭＡに対する抗体および肝細胞マーカーであるＡＦＰに対する抗体を用いて免疫染色を行い、蛍光顕微鏡で各抗体が反応した細胞を検出した結果を示す。Ｏｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）あるいはＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来の胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）とマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣｓ）とを融合することにより誘導されたハイブリッド型多能性幹細胞における未分化性のマーカーであるＯｃｔ４－ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現および形成するコロニーの形態を示した。[Ａ]はＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来の未分化性マーカーＯｃｔ４－ＥＧＦＰの発現およびマウス血球系分化細胞のマーカーであるＣＤ４５抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果を示した。各図の水平軸は未分化性マーカーＯｃｔ４－ＥＧＦＰの発現強度を示し、垂直軸はＣＤ４５の発現強度を示した。図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。[Ｂ]はＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓとｍＥＳＣｓとの融合によるハイブリッド型多能性幹細胞が形成するコロニーの形態および未分化性のマーカーであるＯｃｔ４－ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。マウス骨髄由来ｉＰＳ＃７細胞および＃１３細胞についてのＲＴ－ＰＣＲ解析結果を示した。コントロール細胞として、ｍＥＳＣｓ、ｍＢＭＭＮＣｓおよびＭＥＦを用いた。図の垂直方向には多能性幹細胞マーカーとして知られる遺伝子を配置し、コントロール遺伝子としてハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの結果を示した。図の白抜きのバンドが各遺伝子についての発現を示している。Ｔｇと表記された遺伝子はレトロウイルスに由来する核初期化遺伝子の発現を示している。ＲＶは核初期化遺伝子を組込んだベクターをコントロールとして用いた。マウス骨髄由来ｉＰＳ＃７細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの受精卵から作製した胚盤胞に注入後、偽妊娠マウスに移植することにより作出されたキメラ個体およびキメラ個体よりｉＰＳ細胞に由来する細胞が子孫伝達した結果の産仔を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスは本来白色の毛色を示し、骨髄由来ｉＰＳ細胞は黒色の毛色を有するＣ５７ＢＬ／６マウスに由来している。黒色の毛色を有する細胞は骨髄由来ｉＰＳ細胞由来の細胞であることを示している。キメラ個体はＣ５７ＢＬ／６マウスと交配し、両親が共に黒色の毛色を有することに起因する黒色の毛色を有する産仔が得られたことを示した。マウス骨髄由来ｉＰＳ＃７細胞および＃１３細胞についてのサザンブロット解析結果を示した。コントロール細胞としてＭＥＦを用いた。図の下段に示した核初期化遺伝子をプローブとしてハイブリダイゼーションを行った結果を示す。図の黒色のバンドが各遺伝子についての染色体遺伝子中に存在する内在遺伝子およびレトロウイルスにより組み込まれた遺伝子を示している。Ｏｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）あるいはＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来の胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）から誘導された多能性幹細胞について、クローニングのために１細胞ソーティングを行った際の未分化性のマーカーであるＯｃｔ４－ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現、血球細胞のマーカーであるＣＤ４５抗原の発現およびマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ－１抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果を示した［Ａ］。［Ｂ］１細胞ソーティングの結果増殖してきた多能性幹細胞について、サザンブロット解析を行った結果を示した。マウスＳｏｘ２遺伝子をプローブとしてハイブリダイゼーションを行い、コントロール細胞としてＭＥＦを用いた。図の黒色のバンドが染色体遺伝子中に存在するＳｏｘ２遺伝子およびレトロウイルスにより組み込まれたＳｏｘ２遺伝子を示している。マウス骨髄からの多能性細胞の誘導について、その由来細胞を同定するために宿主とする細胞の分画を行った結果を示した。［Ａ］ＡｕｔｏＭＡＣＳ装置および抗ＣＤ４５抗体を用いてＣＤ４５陽性細胞を分画した後に、ＦＡＣＳによりＣＤ４５陽性細胞を解析した結果を示す。図の水平軸はＣＤ４５抗原の発現強度を示し、垂直軸は細胞数を示す。［Ｂ］ＣＤ４５抗体により分画したそれぞれの細胞から多能性細胞誘導を実施し、１細胞ソーティングによりクローン分析を実施した結果を示す。１細胞ソーティングの結果増殖してきた多能性幹細胞について、サザンブロット解析を行った結果を示した。マウスＳｏｘ２遺伝子をプローブとしてハイブリダイゼーションを行い、コントロール細胞としてＭＥＦおよびｍＥＳＣｓを用いた。図の黒色のバンドが染色体遺伝子中に存在するＳｏｘ２遺伝子およびレトロウイルスにより組み込まれたＳｏｘ２遺伝子を示している。［Ｃ］ＣＤ４５陽性細胞画分から多能性幹細胞を誘導し、１細胞ソーティングによりクローニングした細胞について、未分化性のマーカーであるＯｃｔ４－ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現およびマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ－１抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果を示した。図の水平軸は未分化性マーカーＯｃｔ４－ＥＧＦＰの発現強度を示し、垂直軸は未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ－１抗原の発現強度を示した。図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。

発明の具体的説明

　本発明において製造される「多能性幹細胞」とは、種々の分化系譜に分化可能な細胞を意味し、必ずしもＥＳ細胞と同等のすべての細胞系譜に分化可能な細胞に限られるものではなく、例えば、内胚葉系幹細胞、中胚葉系幹細胞、または外胚葉系幹細胞としてもよい。例えば、心不全の治療に使用する多能性幹細胞を製造するためには、心筋細胞に分化可能な細胞を製造できればよい。あるいは、Ｉ型糖尿病の治療に使用する多能性幹細胞を製造するためには、β細胞に分化可能な細胞を製造できればよい。使用目的に応じたレポーター遺伝子や特異的表面抗原に対する抗体を用いることで、目的の細胞を効率よく分離することが可能である。

　本発明の好ましい実施態様によれば、「多能性幹細胞」は、ＥＳ細胞と同等のすべての細胞系譜に分化可能な細胞とされる。このような細胞は、ヒトにおいては、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ１－８１などのマーカー分子を発現する細胞である。マウスにおいては、ＳＳＥＡ－１などのマーカー分子を発現する細胞である。ヒトおよびマウスのそれらの細胞は、ＳＣＩＤマウスやヌードマウスなどの免疫不全マウスの皮下に移植することにより、奇形腫を形成することが知られている。多能性幹細胞から形成された奇形腫には、内胚葉系、中胚葉系、外胚葉系、それぞれの系譜の分化細胞が含まれる。よって、ＥＳ細胞と同等のすべての細胞系譜に分化可能な多能性幹細胞は、このような奇形腫の形成により特徴づけられる。

　本発明による多能性幹細胞の製造法は、所定のサイトカイン類を含む細胞培養培地中で培養する工程（以下「工程（ａ）」という）を含んでなる。

　本発明において「ＩＬ６シグナル伝達因子（ＩＬ６ＳＴ）」とは、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　６　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒを意味し、ｇｐ１３０とも呼ばれている。ＩＬ６ＳＴはシグナル領域、細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内領域から構成される全長９１８アミノ酸残基のタンパク質を意味する。ＩＬ６ＳＴについては、シグナルペプチドであるＮ末端から２２番目のグリシン残基までが欠失してもＩＬ６ＳＴを介したシグナル伝達は維持されることが知られている。ＩＬ－６と結合したＩＬ－６Ｒは２分子のＩＬ６ＳＴと結合し、ＩＬ６ＳＴはホモ二量体を形成する。ホモ二量体を形成したＩＬ６ＳＴは、細胞内領域のチロシン残基がリン酸化され、シグナル伝達が活性化されることが知られている。ＩＬ６ＳＴは、ＩＬ－１１Ｒとも結合し、シグナルを伝達することが知られている。また、ＩＬ６ＳＴは白血球遊走阻止因子レセプター（ＬＩＦＲ）、オンコスタチンＭレセプター（ＯＳＭＲ）、毛様体神経栄養因子レセプター（ＣＮＴＦＲ）、カルジオトロピンレセプター（ＣＴ－１Ｒ）などとも結合し、ヘテロ二量体を形成することにより活性化されることが知られている。

　本発明において「ＩＬ６ＳＴ刺激因子」とは、ヒトＩＬ６ＳＴを介してシグナルを伝達する分子を意味し、より具体的には、ＩＬ６ＳＴと会合することによりＩＬ６ＳＴの活性化を引き起こす分子をいう。ＩＬ６ＳＴ刺激因子としては、ＩＬ－６またはその変異体とＩＬ－６受容体（以下「ＩＬ－６Ｒ」という）またはその変異体との融合タンパク質、ＩＬ－６Ｒ（好ましくは、可溶性ＩＬ－６Ｒ（ｓＩＬ－６Ｒ））またはその変異体とＩＬ－６またはその変異体との組み合わせ（特表平１０－５０９０４０号）、ＩＬ－６とＩＬ－６受容体のα鎖との複合体、ＩＬ６ＳＴに対してアゴニストとして作用するＩＬ６ＳＴに対する抗体（Z. J. Gu et al., Leukemia, 14, pp.188-197, 2000）、インターロイキン－１１（ＩＬ－１１）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ、およびカルジオトロピンが挙げられる。

　本発明において「ＩＬ－６」とは、ＩＬ－６として一般的に知られる、４つのへリックスから構成される全長２１２アミノ酸残基のタンパク質を意味する。ＩＬ－６と同等の活性を示す物質としては、ＩＬ－６の変異体または誘導体が挙げられる。本発明において「ＩＬ－６の変異体」とは、置換、欠失、挿入、および付加から選択される１以上の改変を有し、かつＩＬ６ＳＴ刺激活性を有するＩＬ－６の変異体を意味する。ＩＬ－６については、シグナルペプチドであるＮ末端から２８番目のアラニン残基までが欠失してもＩＬ６ＳＴ刺激活性を維持することが知られている（ＷＯ００/０１７３１）。また、ＩＬ－６の３７番目のリジン残基のＣ末端側がプロテアーゼの消化作用を受けること、および２８番目のアラニン残基から３７番目のリジン残基までの１０アミノ酸残基が欠失してもＩＬ－６活性に支障がないことが知られている（ＷＯ００／０１７３１）。従って、本発明においては、Ｎ末端が欠失し、かつＩＬ６ＳＴ刺激活性を有する改変ＩＬ－６をＩＬ－６変異体として用いてもよい。このようなＩＬ－６変異体としては、２８番目までのＮ末端配列が欠失したＩＬ－６、３７番目までのＮ末端配列が欠失したＩＬ－６が挙げられる。

　本発明において、「ＩＬ－６Ｒ」とは、ＩＬ－６受容体として一般的に知られる、シグナル領域、細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内領域から構成される全長４６８アミノ酸残基のタンパク質を意味する。また、本発明において「ＩＬ－６Ｒの変異体」とは、置換、欠失、挿入、および付加から選択される１以上の改変を有し、かつＩＬ６ＳＴ刺激活性を有するＩＬ－６Ｒの変異体を意味する。ＩＬ－６Ｒについては、細胞外領域中に存在するサイトカインレセプター領域（１１２番目のバリン残基付近から３２３番目のアラニン残基付近までの領域）がＩＬ－６との結合に必要十分であることが知られている。従って、本発明においては、ＩＬ－６Ｒの１１２番目のバリン残基付近から３３３番目のアラニン残基付近までの領域を含んでなる改変ＩＬ－６ＲをＩＬ－６Ｒ変異体として用いてもよい。

　本発明の好ましい実施態様によれば、ＩＬ６ＳＴ刺激因子は、ＩＬ－６またはその変異体とＩＬ－６Ｒまたはその変異体とが直接またはリンカーを介して連結された融合タンパク質とされる。このような融合タンパク質は、当技術分野において公知の方法、例えば、ＷＯ００／０１７３１、ＷＯ９９／０２５５２、特表２０００－５０６０１４号、またはFischer et al., Nature Biotech., 15, pp.142-145, 1997に記載の方法に従って製造することができる。

　本発明の特に好ましい実施態様によれば、前記融合タンパク質は、ＩＬ－６Ｒの１１２番目のバリン残基から３３３番目のアラニン残基までの断片のＣ末端と、ＩＬ－６の３８番目のアスパラギン酸残基から２１２番目のメチオニン残基までの断片のＮ末端とが直接連結されたタンパク質（以下「ＦＰ６」という）とされる。この場合、この融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を宿主において発現可能なように連結したベクターを適当な宿主に導入し、形質転換された宿主を培養し、培養物からＦＰ６を採取することにより融合タンパク質ＦＰ６を製造することができる（ＷＯ００／０１７３１参照）。

　ＩＬ６ＳＴ刺激因子の細胞培養培地への添加量は特に制限されないが、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌとされる。

　本発明の特定の態様による多能性幹細胞の製造法において、ＩＬ－６ＳＴ刺激因子の使用は一つの主要な特徴である。特定の理論に拘束されるわけではないが、ＩＬ６ＳＴの活性化は、例えば、ＪＡＫキナーゼの活性化、ＳＴＡＴ３のリン酸化、リン酸化によりホモ二量体を形成したＳＴＡＴ３によるＪｕｎＢ、ＪＡＢなどの遺伝子の転写促進を順次引き起こし、結果として細胞増殖、細胞分化調節等を生じることが考えられる。よって、本発明においては、ＩＬ６ＳＴ刺激因子に替えて、活性化型ＪＡＫキナーゼ、リン酸化型ＳＴＡＴ３、ホモ二量体を形成させる変異を導入したＳＴＡＴ３Ｃ（J.F.Bromberg et. al., Cell, 98, pp-295-303, 1999）、エストロゲン類縁体により誘導性にホモ二量体を形成させるＳＴＡＴ３ＥＲ（T.Matsuda et al., EMBO Journal, 18, pp-4261-4269, 1999）、ＪＡＫキナーゼの阻害因子であるＳＯＣＳ分子の阻害剤などを、遺伝子またはタンパク質の形で細胞内に導入することも考えられる。

　工程（ａ）において使用される「サイトカイン類」としては、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびその変異体ならびにそれらの誘導体、ｃ－ｍｐｌリガンド（ＴＰＯを除く）およびその誘導体、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ－３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）のような増殖因子；抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体のような増殖刺激活性を有する抗体；リポ多糖（ＬＰＳ）のような増殖刺激因子；およびこれらの組み合わせが挙げられる。

　また、工程（ａ）においては、上記のサイトカイン類の代わりに、上記サイトカインと同等の活性を示す物質を用いてもよい。例えば、ＩＬ－６ＳＴ刺激因子の代わりに、ＩＬ６ＳＴやインターロイキン－６レセプターα（ＩＬ－６Ｒα）に対するアゴニストを用いることができる。同様に、幹細胞因子（ＳＣＦ）の代わりに、ＳＣＦのレセプターであるｃ－ｋｉｔ分子に対するアゴニストを用いることができる。また、ＴＰＯの代わりに、ＴＰＯのレセプターであるｍｐｌレセプターに対するアゴニスト、あるいはｃ－ｍｐｌリガンドを用いることができる。他に、Ｆｌｔ－３分子、インターロイキン－３レセプターα（ＩＬ－３Ｒα）、顆粒球コロニー刺激因子レセプター（Ｇ－ＣＳＦＲ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子レセプター（ＧＭ－ＣＳＦＲ）、マクロファージ・コロニー刺激因子レセプター（Ｍ－ＣＳＦＲ）、インターロイキン－７レセプター（ＩＬ－７Ｒ）などに対するアゴニストを、それぞれのサイトカイン類の代わりに用いることができる。これらのアゴニストとしては、それぞれの受容体に対する活性化抗体、非ペプチド性低分子リガンド等が挙げられる。

　本発明において「トロンボポエチン」（ＴＰＯ）とは、全長３３２アミノ酸残基のアミノ酸配列からなる、血小板産生を特異的に刺激または増大させる活性を有するタンパク質をいう（ＷＯ９５／２１９１９）。また、本発明において「ＴＰＯの変異体」とは、置換、欠失、挿入、および付加から選択される１以上の改変を有し、かつ血小板産生を特異的に刺激または増大させるＴＰＯの変異体を意味する。ＴＰＯの変異体としては、例えば、ＷＯ９５／１８８５８、特開平８－２７７２９６号公報、特開平８－２２８７８１号公報、およびＷＯ９５／２１９１９等に記載されているものが挙げられ、好ましくは、アミノ酸残基１番目から１６３番目までのアミノ酸配列からなるＴＰＯの変異体（断片）が挙げられる。

　本発明において「ＴＰＯおよびその変異体の誘導体」とは、水溶性ポリマーを連結してなるＴＰＯおよびその変異体を意味する。水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、好ましくは平均分子量が約５ｋＤａ～約５０ｋＤａであるポリエチレングリコールが挙げられる。ＴＰＯおよびその変異体のポリエチレングリコール化（ＰＥＧ化）は周知の方法に従って実施することができる（例えば、Focus on Growth Factors, 3, pp. 4-10, 1992参照）。水溶性ポリマー対「ＴＰＯおよびその変異体」タンパク質のモル比は１：１～１００：１とすることができ、ポリＰＥＧ化の場合には１：１～２０：１、モノＰＥＧ化の場合には１：１～５：１とすることができる。

　本発明において「ｃ－ｍｐｌリガンド」とは、ｍｐｌレセプターに結合可能なペプチド性リガンド、タンパク質性リガンド、および非ペプチド性リガンドを意味する。タンパク質性ｃ－ｍｐｌリガンド（ＴＰＯを除く）としては、巨核球の刺激剤としてのアゴニスト抗体（ＷＯ９９／０３４９５およびＷＯ９９／１０４９４）や造血レセプターアゴニストなどの他のタンパク質（ＷＯ９６／２３８８８、ＷＯ９７／１２９７８、ＷＯ９７／１２９８５、ＷＯ９８／１７８１０、ＷＯ９６／３４０１６およびＷＯ００／２４７７０）が挙げられる。ペプチド性ｃ－ｍｐｌリガンドとしては、ＷＯ９６／４０１８９、ＷＯ９６／４０７５０、ＷＯ９８／２５９６５、特開平１０－７２４９２号、ＷＯ９９／４２１２７、およびＷＯ００／２４７７０に記載されているものが挙げられる。非ペプチド性ｃ－ｍｐｌリガンドとしては、ベンゾジアゼピン誘導体（特開平１１－１４７７号および特開平１１－１５２２７６号）や他の低分子リガンド（ＷＯ９９／１１２６２、ＷＯ９９／２２７３３、ＷＯ９９／２２７３４、ＷＯ００／３５４４６およびＷＯ００／２８９８７）が挙げられる。

　本発明において「ｃ－ｍｐｌリガンドの誘導体」とは、水溶性ポリマーを連結してなるｃ－ｍｐｌリガンドおよびその変異体を意味する。水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、好ましくは平均分子量が約５ｋＤａ～約５０ｋＤａであるポリエチレングリコールが挙げられる。ｃ－ｍｐｌリガンドのポリエチレングリコール化（ＰＥＧ化）は周知の方法に従って実施することができる（例えば、Focus on Growth Factors, 3, pp. 4-10, 1992参照）。水溶性ポリマー対ｃ－ｍｐｌリガンドタンパク質のモル比は１：１～１００：１とすることができ、ポリＰＥＧ化の場合には１：１～２０：１、モノＰＥＧ化の場合には１：１～５：１とすることができる。

　本発明において「幹細胞因子」（ＳＣＦ：stem cell factorまたはsteel factor）とは、造血および生殖発生に重要な機能を果たす、全長２７３アミノ酸残基のアミノ酸配列からなるタンパク質をいう。また、本発明において「ＳＣＦの変異体」とは、置換、欠失、挿入および付加から選択される１以上の改変を有し、かつＳＣＦのレセプターであるｃ－ｋｉｔ分子を特異的に刺激して活性化させるＳＣＦの変異体を意味する。ＳＣＦについては、シグナルペプチドであるＮ末端から２５番目のスレオニン残基までが欠失しても活性を保持していることが知られている。ＳＣＦは、Ｎ末端から１８９番目のアラニン残基と１９０番目のアラニン残基との間で、あるいは１９０番目のアラニン残基と１９１番目のセリン残基との間でタンパク質分解酵素により消化されることにより可溶化型ＳＣＦとして存在することが知られている。また、複数のオルタナティブフォームが存在することが知られており、Ｎ末端から１７５番目のセリン残基から２０２番目のイソロイシン残基までを欠失した膜結合型のＳＣＦが存在することが知られている。本発明においては、これらの変異体のいずれもが「ＳＣＦの変異体」として使用可能である。

　本発明において「ＩＬ－３」は、造血幹・前駆細胞に作用し、コロニー形成を支持する活性を持つタンパク質である。また、ＩＬ－３は、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、単球などの分化した細胞の増殖因子として重要な機能を有する。ＩＬ－３は、全長１５２アミノ酸残基のアミノ酸配列からなる。また、本発明において「ＩＬ－３の変異体」とは、置換、欠失、挿入および付加から選択される１以上の改変を有し、かつＩＬ－３受容体を特異的に刺激して活性化させるＩＬ－３の変異体を意味する。ＩＬ－３については、シグナルペプチドであるＮ末端から１９番目のグルタミン残基までが欠失しても活性を保持していることが知られている。本発明においては、このような変異体を「ＩＬ－３の変異体」として使用することができる。

　本発明において「Ｆｌｔ－３リガンド」（ＦＬ）は、造血幹・前駆細胞の増殖因子として重要な機能を持つタンパク質である。ＦＬは全長２３５アミノ酸残基のアミノ酸配列からなる膜結合蛋白質である。また、本発明において「ＦＬの変異体」とは、置換、欠失、挿入および付加から選択される１以上の改変を有し、かつＦｌｔ－３チロシンキナーゼ受容体を特異的に刺激して活性化させるＦＬの変異体を意味し、好ましくはアミノ酸残基１番目から１８５番目のプロリン残基までのアミノ酸配列からなるＦＬの変異体（断片）が挙げられる。ＦＬについては、シグナルペプチドであるＮ末端から２６番目のグリシン残基までが欠失しても活性を保持していることが知られている。本発明においては、これらの変異体のいずれもが「ＦＬの変異体」として使用可能である。

　本発明では、「サイトカイン類」に代えて、各サイトカイン類の誘導体を用いることができる。サイトカイン類の「誘導体」とは、水溶性ポリマーを連結してなるサイトカイン類およびその変異体を意味する。水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、好ましくは平均分子量が約５ｋＤａ～約５０ｋＤａであるポリエチレングリコール、が挙げられる。サイトカイン類およびその変異体のポリエチレングリコール化（ＰＥＧ化）は周知の方法に従って実施できる（例えば、Focus on Growth Factors, 3, pp. 4-10, 1992）。水溶性ポリマー対「サイトカイン類」タンパク質のモル比は１：１～１００：１であることができ、ポリＰＥＧ化の場合には１：１～２０：１、モノＰＥＧ化の場合には１：１～５：１であることができる。

　以下に、本発明の好ましい実施態様について記載するが、各実施態様においても、上述したように、「サイトカイン類」に代えて、各サイトカイン類の変異体または誘導体を用いてもよい。

　本発明の好ましい実施態様によれば、工程（ａ）において用いられる細胞培養培地は、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３およびＦｌｔ－３リガンドから選択される少なくとも２種、より好ましくは少なくとも３種のサイトカイン類を含むものとされる。

　本発明の他の好ましい実施態様によれば、工程（ａ）において用いられる細胞培養培地は、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子と、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３およびＦｌｔ－３リガンドから選択される少なくとも１種のサイトカインとを含むものとされる。

　本発明のさらに好ましい実施態様によれば、工程（ａ）において用いられる細胞培養培地は、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＩＬ－３を含むものとされる。

　本発明の第二の態様による方法では、工程（ａ）に用いられる細胞培養培地は、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子および少なくとも１種のサイトカインを含むものとされる。本発明の好ましい実施態様によれば、このサイトカインは、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびその変異体ならびにそれらの誘導体、Ｆｌｔ－３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）およびその変異体、ならびにこれらの２以上の組合わせから選択され、より好ましくは、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３およびＦｌｔ－３リガンド、ならびにこれらの２以上の組合せから選択される。本発明の特に好ましい実施態様によれば、サイトカインは、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＩＬ－３の組合せ、またはＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３およびＦｌｔ－３リガンドの組合せとされる。

　工程（ａ）において用いられる細胞培養培地は、例えば、下記の群：顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）のような増殖因子；抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体のような増殖刺激活性を有する抗体；リポ多糖（ＬＰＳ）のような増殖刺激因子からなる群から選ばれる１種以上の増殖刺激因子をさらに含むものとしてもよい。これらの因子によるＩＬ６ＳＴの発現亢進により、多能性幹細胞の誘導がより効率化する場合もある。

　本発明の好ましい実施態様によれば、工程（ａ）において用いられる細胞培養培地は、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３、Ｆｌｔ－３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦを含むものとされる。

　これらサイトカインの細胞培養培地への添加量は特に制限されないが、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌとされる。

　培養に用いる基礎培地としては、血球細胞などの体細胞および多能性細胞の増殖および生存が害されない限り特に制限されないが、例えば、Ｄ－ＭＥＭ培地、Ｄ－ＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＭＥＭ－α培地、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＳｔｅｍＰｒｏ培地（以上、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｍＴｅＳＲ 1培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＨＥＳｃＧＲＯ培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、Ｎ２Ｂ２７培地、が好適に用いられる。培養温度は、通常２５～３９℃、好ましくは３３～３９℃である。また、培地に添加する物質としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ノックアウト血清リプレースメント（ＫｎｏｃｋＯｕｔＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２－メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸が挙げられる。ＣＯ_２は、通常４～１５％であり、５～１０％が好ましい。Ｏ_２は通常５～２５％である。また、培養にはトロンボポエチン（ＴＰＯ）およびその変異体およびそれらの誘導体、ｃ－ｍｐｌリガンド（ＴＰＯを除く）およびその誘導体、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ－３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）のような増殖因子；抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体のような増殖刺激活性を有する抗体；リポ多糖（ＬＰＳ）のような増殖刺激因子などのサイトカイン類の他に、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）、骨形成因子（ＢＭＰ）ファミリー、ヘッジホッグ因子（Ｈｈ）ファミリー、ｂＦＧＦなどに代表される増殖因子、ＭＩＰ－１α、ＳＤＦ－１などのＣＣケモカインあるいはＣＸＣケモカイン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）のような造血ホルモン、Ｗｎｔファミリー遺伝子産物、Ｎｏｔｃｈリガンドファミリー遺伝子産物、あるいはこれらの変異体もしくは誘導体、塩化リチウム、ピペコリン酸、γ―アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）などの化合物を、１０ｎｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの範囲で添加することもできる。

　本発明における培養では、培養用のシャーレ、フラスコ、培養バックを用いた培養が可能であるが、培地組成、ｐＨなどを機械的に制御し、高密度で培養が可能なバイオリアクターによって、その培養を改善することもできる。

　培養に用いるフィーダー細胞としては、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、ＳＮＬ細胞（A.P.McMahon and A.Bradley, Cell, 62, pp-1073-1085, 1990）、ＳＴＯ細胞などを用いることができる。フィーダー細胞の増殖を抑える方法としては、マイトマイシンＣ処理や放射線照射などの方法を用いることができる。また、フィーダー細胞に替えて、ＢＤマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）などのマトリゲル、あるいはコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックス蛋白質、あるいはゼラチンなどにより培養基材をコーティングする方法を用いることもできる。

　本発明による多能性幹細胞の製造法は、体細胞を脱分化させる工程（以下「工程（ｂ）」という）をさらに含んでなる。この工程（ｂ）は、工程（ａ）の後に行ってもよいし、または工程（ａ）と同時に行ってもよい。

　工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に行われる実施態様では、工程（ａ）に用いられる上記細胞培養培地中で体細胞の脱分化が行われる。すなわち、工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に開始される。この実施態様では、脱分化の過程で培地を他の培地、例えばＥＳ細胞培養用の培地に変更することもできる。すなわち、この実施態様では、工程（ａ）のみを先に終了させ、工程（ｂ）のみを継続してもよい。

　工程（ａ）の後に工程（ｂ）が行われる実施態様では、工程（ａ）に用いられる上記細胞培養培地中での体細胞の培養が行われ、その後、体細胞の脱分化が行われる。ここで、体細胞の脱分化は工程（ａ）で用いられる培地と同じ培地を用いて行うことができる。すなわち、この実施態様では、工程（ａ）は工程（ｂ）よりも先に開始されるが、工程（ｂ）を開始するときに、工程（ａ）は必ずしも終了していなくてもよい。さらに、この実施態様では、脱分化の過程で培地を他の培地、例えばＥＳ細胞培養用の培地に変更することもできる。すなわち、この実施態様では、工程（ａ）のみを先に終了させ、工程（ｂ）のみを継続してもよい。

　本発明による方法では、工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に行われた後に工程（ａ）が行われてもよい。この場合の好ましい実施態様によれば、工程（ｂ）と同時に行われる工程（ａ）において用いられる細胞培養培地は、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３、Ｆｌｔ－３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦを含むものとされ、工程（ｂ）の後に行われる工程（ａ）において用いられる細胞培養培地は、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＩＬ－３を含み、かつ、Ｆｌｔ－３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦを含まないものとされる。例えば、工程（ｂ）における脱分化開始の２日前から２日後において、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３、Ｆｌｔ－３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦを含む細胞培養培地で体細胞を培養し、脱分化開始の２日後から６日後にかけて、前記細胞培養培地からＦｌｔ－３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦを除去した培地（すなわち、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＩＬ－３を含み、かつ、Ｆｌｔ－３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦを含まない細胞培養培地）で体細胞を培養することができる。

　本発明において「脱分化」とは、分化した組織や器官の細胞が、より未分化性の高い状態に戻ることを意味し、言い換えれば、分化とは逆のプロセスをいう。工程（ｂ）における体細胞の脱分化は、当技術分野において公知の方法により行うことができる。

　本発明の好ましい実施態様によれば、工程（ｂ）における体細胞の脱分化は、該体細胞の核初期化処理によって行われる。ここで、「核初期化」とは、体細胞の核が受精卵の状態に戻ることをいう。このような核初期化処理は、当技術分野において公知の方法、例えば、ＷＯ２００７／０６９６６６に記載の方法に従って行うことができる。

　核初期化処理に用いられる核初期化因子としては、Ｏｃｔファミリー遺伝子（例えばＯｃｔ３／４遺伝子）、Ｋｌｆファミリー遺伝子（例えばＫｌｆ４遺伝子）、Ｓｏｘファミリー遺伝子（例えばＳｏｘ２遺伝子）およびＭｙｃファミリー遺伝子（例えばｃ－Ｍｙｃ遺伝子）の各遺伝子産物が挙げられる（ＷＯ２００７／０６９６６６）。従って、本発明における核初期化処理は、体細胞をこれらの遺伝子産物に接触させることによって行うことができる。あるいは、核初期化処理は、体細胞において、これらの遺伝子を活性化または発現させることによって行うこともできる。本発明の好ましい実施態様によれば、体細胞の核初期化処理は、Ｏｃｔファミリー遺伝子（例えばＯｃｔ３／４遺伝子）、Ｋｌｆファミリー遺伝子（例えばＫｌｆ４遺伝子）、Ｓｏｘファミリー遺伝子（例えばＳｏｘ２遺伝子）およびＭｙｃファミリー遺伝子（例えばｃ－Ｍｙｃ遺伝子）からなる群から選択される少なくとも１種、より好ましくは少なくとも２種、さらに好ましくは少なくとも３種の遺伝子を、発現可能な形で体細胞に導入することを含む。本発明の特に好ましい実施態様によれば、体細胞の核初期化処理は、Ｏｃｔファミリー遺伝子（例えばＯｃｔ３／４遺伝子）、Ｋｌｆファミリー遺伝子（例えばＫｌｆ４遺伝子）、Ｓｏｘファミリー遺伝子（例えばＳｏｘ２遺伝子）およびＭｙｃファミリー遺伝子（例えばｃ－Ｍｙｃ遺伝子）を、発現可能な形で体細胞に導入することを含む。

　さらに、核初期化因子としては、Ｌｉｎ２８遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、ＵＴＦ１遺伝子、Ｅｓｒｒ遺伝子ファミリーを使用することもできる。また、核初期化因子と共にＣ／ＥＢＰα遺伝子を導入することでリンパ球系の体細胞から多能性幹細胞を誘導できる場合がある。あるいは、Ｐａｘ５遺伝子の発現を抑制するような低分子化合物、ｓｉＲＮＡ分子等を用いることにより、リンパ球系の体細胞から多能性幹細胞を誘導できる場合がある。従って、核初期化処理は、体細胞をこれらの遺伝子産物に接触させる工程を含んでもよい。あるいは、核初期化処理は、体細胞において、これらの遺伝子を活性化または発現させる工程を含んでもよい。

　核初期化処理に用いられる培地は、例えば、下記の群：顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）のような増殖因子；抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体のような増殖刺激活性を有する抗体；リポ多糖（ＬＰＳ）のような増殖刺激因子からなる群から選ばれる１種以上の増殖刺激因子を含むものとしてもよい。これらの因子による核初期化遺伝子ファミリーの発現亢進により、多能性幹細胞の誘導がより効率化する場合もある。

　核初期化処理に用いられる核初期化因子としては、上記の遺伝子に替えて、サイトカイン類、ケモカイン類、増殖因子類、低分子化合物、マイクロＲＮＡなどのリボ核酸等を用いてもよい。このような核初期化因子としては、例えば、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）、骨形成因子（ＢＭＰ）ファミリー、ヘッジホッグ因子（Ｈｈ）ファミリー、ｂＦＧＦなどに代表される増殖因子、ＭＩＰ－１α、ＳＤＦ－１などのＣＣケモカインあるいはＣＸＣケモカイン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）のような造血ホルモン、Ｗｎｔファミリー遺伝子産物、Ｎｏｔｃｈリガンドファミリー遺伝子産物、塩化リチウム、ピペコリン酸、γ―アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）などの化合物、核初期化因子の発現を亢進させる低分子化合物、核初期化因子の転写調節に関わる因子のｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ分子などが挙げられる。核初期化因子の発現を亢進させる低分子化合物としては、ＢＩＸ‐０１２９４（Y. Shi et al., Cell Stem Cell, 2, pp.525-528, 2008）、ＢａｙＫ８６４４（Y. Shi et al., Cell Stem Cell, 3, pp.568-574, 2008）、ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（C. A. Lyssiotis et al., E-publication, 2009）、ＤＮＡメチル化阻害剤である５－Ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ、ならびにヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ　Ａ（ＴＳＡ）、ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅｈｙｄｒｏｘａｍｉｃａｃｉｄ（ＳＡＨＡ）、およびＶａｌｐｒｏｉｃａｃｉｄ（ＶＰＡ）（D. Huangfu et al., Nature Biotechnology, 26, pp.795-797, 2008；D. Huangfu et al., Nature Biotechnology, 26, pp.1269-1275, 2008）等が挙げられる。核初期化因子の転写調節に関わる因子のマイクロＲＮＡ分子としては、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ）－１４５、ｍｉＲ－２９１－３ｐ、ｍｉＲ－２９４、ｍｉＲ－２９５等が挙げられる（R. L. Ludson et al., Nature Biotechnology, 27, pp.459-461, 2009）。

　本発明の一つの実施態様によれば、体細胞の核初期化処理は、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、およびＭｙｃファミリー遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種（好ましくは少なくとも２種、より好ましくは少なくとも３種）の遺伝子、またはこれら４種の遺伝子を発現可能な形で体細胞に導入した場合と同等の活性を示す物質、例えば上述のようなサイトカイン類、ケモカイン類、増殖因子類、低分子化合物、マイクロＲＮＡなどのリボ核酸等で、体細胞を処理することを含む。

　核初期化処理に用いられる核初期化因子の細胞導入法は特に制限されるものではなく、例えば、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、アデノウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、ネコ内在ウィルスベクター、センダイウィルスベクター、動物細胞用ベクター等を用いる方法が挙げられ、好ましくはレトロウィルスベクターまたはレンチウィルスベクターを用いる方法、より好ましくはレトロウィルスベクターを用いる方法が挙げられる。また、核初期化因子を細胞に注入する方法を用いてもよく、あるいは膜透過性の修飾を施すことにより各因子を細胞に添加する方法を用いてもよい。

　核初期化処理に用いられる遺伝子の細胞導入法は特に制限されるものではなく、動物細胞への遺伝子導入に用いられる一般的な方法、例えば、モロニーマウス白血病ウィルス等のレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、レンチウィルスベクター、センダイウィルスベクター等のウィルス由来の動物細胞用ベクターを用いる方法、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＨＶＪリポソーム法等を用いることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、核初期化処理に用いられる遺伝子の細胞導入法は、ウィルス由来の動物細胞用ベクター、より好ましくはレトロウィルスベクターを用いる方法とされる。

　本発明による多能性幹細胞の製造法において、出発材料として用いられる体細胞は特に制限されるものではなく、いかなる体細胞であってもよい。また、体細胞としては、採取された後に一旦凍結保存された細胞を用いてもよい。

　本発明の好ましい実施態様によれば、前記体細胞は血球細胞とされる。本発明において「血球細胞」とは、生体内の血流中に存在しうる血液細胞と同等の細胞群を意味し、必ずしも末梢血液細胞に限られるものではなく、例えば骨髄中や臍帯血中に存在するものであってもよい。より具体的には、「血球細胞」とは、ＣＤ４５、ＣＤ１１aなどの血液細胞のマーカー分子を発現する細胞をいう。また、本明細書において、骨髄中に存在することが確認されている血球細胞を用いることにより、他の組織細胞からよりも効率的に多能性幹細胞を樹立できることが見出されている。よって、本発明の好ましい実施態様によれば、前記血球細胞は骨髄由来単核球細胞とされる。さらに、本明細書において、血液（特に末梢血）由来の単核球細胞を用いることにより、同様に多能性幹細胞を樹立できることが見出されている。よって、本発明の好ましい実施態様によれば、前記血球細胞は血液（特に末梢血）由来単核球細胞とされる。さらに、本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記血球細胞は分化血液細胞とされる。このような血球細胞は、採取された後に一旦凍結保存された細胞であってもよい。

　本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記体細胞（特に血球細胞）は、ＩＬ６ＳＴ刺激因子と上記サイトカインとの存在下での培養により、水疱性口内炎ウィルスのＧタンパク質を被覆タンパク質として持つレトロウィルスにより容易に感染する細胞とされる。
このような細胞は、レトロウィルスベクターによって遺伝子を導入する上で有利である。

　本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記体細胞（特に血球細胞）は、ＩＬ６ＳＴを発現する細胞とされる。具体的には、ＩＬ６ＳＴはいずれの血球細胞においても発現しているが、中でも発現の高いＴ細胞、単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、ＤＣ細胞、ＣＤ３４陽性細胞などを用いることが考えられる。また、血球細胞以外でもＩＬ６ＳＴを高発現する体細胞を用いることで、効率よく多能性幹細胞を製造することができる。具体的には、肝臓、腎臓、骨格筋、肺、すい臓、心臓、小腸、脊髄、唾液腺などの細胞も利用することが可能である。さらに具体的には、骨芽細胞などの骨形成細胞、アストロサイト細胞などの神経細胞、肝実質細胞などの肝細胞、血管内皮細胞などの内皮細胞、腸管上皮、神経上皮などの上皮細胞、皮膚などの線維芽細胞も利用することが可能である。

　本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記体細胞（特に血球細胞）は、工程（ａ）または（ｂ）で用いられるサイトカインに対するレセプターを発現する細胞とされる。具体的には、ｃ－ｋｉｔ（ＳＣＦレセプター）、ｃ－ｍｐｌ（ＴＰＯレセプター）、およびＦｌｔ３を発現する細胞として、ＣＤ３４陽性細胞などを用いることが考えられる。また、ＩＬ－３Ｒα（ＩＬ－３レセプター）などを発現する細胞として、単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）などを用いることが考えられる。血球細胞以外でも、ｃ－ｋｉｔを発現する細胞などが挙げられる。

　本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記体細胞（特に血球細胞）は、核初期化因子の少なくとも１種を発現する細胞とされる。例えば、核初期化因子の１つであるＫｌｆ４を発現する細胞としては、血球細胞の中では、単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、ＤＣ細胞、ＣＤ３４陽性細胞などが挙げられ、その他の組織では、肺、骨格筋、小腸などが挙げられる。Ｋｌｆ４以外についても、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｏｃｔ３／４ファミリー遺伝子、Ｍｙｃファミリー遺伝子、またはＳｏｘファミリー遺伝子を発現する体細胞を用いることができる。また、Ｏｃｔ３／４ファミリー遺伝子やＮａｎｏｇ遺伝子などの初期化遺伝子については、それらの偽遺伝子を発現する細胞を体細胞として利用することもできる。

　本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記体細胞（特に血球細胞）は、ＩＬ６ＳＴ刺激因子と上記のサイトカインとの存在下において核初期化因子の発現が上昇する細胞とされる。例えば、各サイトカインのレセプターであるｃ－ｋｉｔ（ＳＣＦレセプター）、ｃ－ｍｐｌ（ＴＰＯレセプター）、Ｆｌｔ３、ＩＬ－３Ｒα（ＩＬ－３レセプター）などを発現する細胞を用いることが考えられる。血球細胞の中では、ＣＤ３４陽性細胞、ＤＣ細胞などが挙げられる。また、上記サイトカインによるこれらのレセプターへの刺激により、核初期化因子であるＯｃｔ３／４ファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｍｙｃファミリー遺伝子、および／またはＳｏｘファミリー遺伝子の発現が上昇する細胞を用いることにより、これらすべての初期化因子を用いずとも、多能性幹細胞の製造が可能となる。

　本発明の好ましい実施態様によれば、前記体細胞（特に血球細胞）はヒト細胞とされる。この実施態様では、本発明に用いられるＩＬ６ＳＴ刺激因子、サイトカイン、核初期化因子またはその遺伝子は、全てヒト由来のものとすることが好ましい。これにより、ヒトの多能性幹細胞を効率よく製造することが可能となる。

　本発明に従って製造された細胞における脱分化または初期化の確認は、当技術分野において公知の方法によって行うことができる。このような方法としては、例えば、細胞表面に発現した未分化マーカーに対する抗体を用いて、蛍光励起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）を利用して解析する方法が挙げられる。具体的には、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ１－８１などの未分化マーカーに対する抗体を利用することができる。
また、ＮａｎｏｇやＯｃｔ３／４遺伝子といった未分化マーカーのレポーター遺伝子を細胞に導入して利用することもできる。

　本発明の工程（ａ）において用いられる細胞培養培地、特に、ＩＬ６ＳＴ刺激因子および少なくとも１種のサイトカインを含む細胞培養培地は、製造された多能性幹細胞の性質を維持するために利用することもできる。すなわち、工程（ａ）に用いられる細胞培養培地に含まれるサイトカイン類、特にＩＬ６ＳＴ刺激因子と上記のサイトカイン類は、核初期化プロセスの促進のみならず、核初期化後の初期化状態の維持に利用することもできる。

　本発明による多能性幹細胞の製造法に用いられる試薬類をまとめて、キットとすることもできる。従って、本発明によれば、体細胞から多能性幹細胞を製造するためのキットが提供され、該キットは、（ａ）以下のサイトカイン類：(i)ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子もしくはこれと同等の活性を示す物質、(ii)ＳＣＦもしくはこれと同等の活性を示す物質、(iii)ＴＰＯもしくはこれと同等の活性を示す物質、(iv)ＩＬ－３もしくはこれと同等の活性を示す物質、および(v)Ｆｌｔ－３リガンドもしくはこれと同等の活性を示す物質から選択される少なくとも２種のサイトカイン類を含む、体細胞を培養するための細胞培養培地、および（ｂ）体細胞を脱分化させるための試薬を含んでなる。ここで、前記（ａ）において用いられる細胞培養培地は、好ましくは上記の(i)～(v)から選択される少なくとも３種のサイトカイン類を含むものとされる。さらに、本発明の第二の態様によれば、体細胞から多能性幹細胞を製造するためのキットであって、（ａ）ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子および少なくとも１種のサイトカインを含む、体細胞を培養するための細胞培養培地、および（ｂ）体細胞を脱分化させるための試薬を含んでなるキットが提供される。

　好適なＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子および好適なサイトカインについては上述したとおりである。本発明の一つの実施態様によれば、前記（ａ）の細胞培養培地は、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３およびＦｌｔ－３リガンドから選択される少なくとも２種のサイトカイン類を含み、さらにＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦを含むものとされる。また、体細胞を脱分化させるための試薬についても上述したとおりであるが、好ましくは、Ｏｃｔファミリー遺伝子、ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、およびＭｙｃファミリー遺伝子を、発現可能な形で体細胞に導入するためのベクターを含む。本発明によるキットはさらに、多能性幹細胞の製造法に用いられる具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。

　本発明に従って製造された多能性幹細胞は、各種分化細胞に誘導することが可能であるため、細胞再生医療に利用することができる。すなわち、この多能性幹細胞は、患者本人の体細胞を用いた自家の細胞移植および細胞バンク等より入手した細胞を利用する同種の細胞移植の両者の移植系への利用が可能である。既に存在する血球細胞の大型細胞バンクからも多能性幹細胞の細胞バンクを構築することができる。

　また、本発明によれば、各種疾病の患者からの血球細胞検体より、疾病情報に対応した多能性幹細胞バンクを構築することが可能である。さらに、健常人由来の血球細胞を初期化した多能性幹細胞を用いて各種分化細胞を誘導することにより、あるいは難治性疾患の患者より入手した血球細胞を用いて疾患のターゲット細胞を誘導することにより、創薬スクリーニングのツールとしての各種ヒトモデル細胞系の構築も可能である。

　以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

例１：ヒト骨髄由来単核球細胞からの多能性細胞の誘導（１）
Ａ．ヒト骨髄由来単核球細胞の培養
　凍結保存されたヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）２．５×１０^６細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ社）を１００ｍｍペトリディッシュ２枚に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養を開始した。一方のディッシュには、ヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびヒトＩＬ－３（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、他方のディッシュにはＳＣＦ、ＴＰＯおよびＩＬ－３に加えてＦＰ６（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。ここで、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＩＬ－３からなるサイトカインカクテルを「ＳＴ３」と呼び、ＳＴ３にＦＰ６を加えたカクテルを「ＳＴ３ＦＰ６」と呼ぶ（以下同様）。培養開始２４時間後に、それぞれのディッシュにそれぞれのサイトカインカクテルを同濃度で再び添加した。培養開始４８時間後にそれぞれの細胞を回収し、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地５００μｌで懸濁した。ＳＴ３存在下で培養した細胞懸濁液にはＳＴ３を各３００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、ＳＴ３ＦＰ６存在下で培養した細胞懸濁液には、ＳＴ３（各３００ｎｇ／ｍｌ）に加えてＦＰ６を６０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。調製したｈＢＭＭＮＣｓを次のウィルス感染実験に用いた。

Ｂ．核初期化遺伝子を含む組換えレトロウィルスベクターの作製
　コラーゲンタイプＩコート１００ｍｍディッシュ１２枚に、それぞれ４×１０^６個のＧ３Ｔ－ｈｉ細胞（タカラバイオ社）を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養した。培養２４時間後に、核初期化遺伝子１種類についてディッシュ３枚を用いてウィルスベクターの遺伝子導入を行った。各ディッシュにつき、ｐＧＰｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社）６μｇ、ｐＶＳＶ－Ｇｖｅｃｔｏｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）６μｇ、およびレトロウィルスベクターｐＭＸｓ（T. Kitamura et al., Experimental Hematology, 31, pp.1007-1014, 2003；東京大学北村俊雄教授より供与）に核初期化遺伝子を挿入したプラスミド１２μｇを、遺伝子導入試薬ＦｕＧｅｎｅ６（ロシュダイグノスティック社）を用いて共導入した。用いた核初期化遺伝子は、ヒトＯｃｔ３／４、ヒトＳｏｘ２、ヒトＫｌｆ４、およびヒトｃ－ｍｙｃの４種類であった。核初期化遺伝子発現レトロウィルスベクター：ｐＭＸｓｈＯｃｔ３／４、ｐＭＸｓｈＳｏｘ２、ｐＭＸｓｈＫｌｆ４、およびｐＭＸｓｈｃ－ｍｙｃの構築は、山中らの方法に従って行った（K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 131, pp.861-872, 2007）。遺伝子導入の約４８時間後に、核初期化遺伝子の種類ごとに培養液を回収し、培養液を０．４５μｍフィルターでろ過後、５８００×ｇ、４℃で４時間遠心し、培養上清を捨てることでウィルス沈殿を取得した。ウィルス沈殿は全て１つにまとめ、２ｍｌの１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で懸濁した。最終的に液量は２．４ｍｌほどになった。

Ｃ．ヒト骨髄由来単核球細胞のウィルス感染処理
　予め５０μｇ／ｍｌのレトロネクチン（タカラバイオ社）でコートされた１２ウェルプレートへ、懸濁したウィルス沈殿を１ウェルにつき１．２ｍｌずつ添加し、１０８０×ｇ、２０℃で２時間遠心した。遠心後のプレートに前記のｈＢＭＭＮＣｓの細胞懸濁液５００μｌを各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ_２にて培養を開始した。培養開始約２４時間後に、それぞれにサイトカインを再び添加した。

　ウィルス感染開始から約４８時間後にトリプシンＥＤＴＡ液（ＧＩＢＣＯ社）で各ウェルの細胞を回収し、予め５×１０^５個／ディッシュのマウス胚性線維芽細胞をフィーダー細胞としたゼラチンコート１００ｍｍディッシュに１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地を用いて細胞を播き直した。それぞれのディッシュにはサイトカインを再び添加した。さらに、約２４時間後および約７２時間後に、サイトカイン入りの１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培地交換を実施した。その後、ウィルス感染開始から６日後からは、ＳＴ３またはＳＴ３ＦＰ６を含まないヒトＥＳ細胞培養用の培地に交換した。用いた培地の組成は、ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地（ＳＩＧＭＡ社）５００ｍｌ、非必須アミノ酸液（ＳＩＧＭＡ社）５ｍｌ、２００ｍＭＬ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社）６．２５ｍｌ、ＫＮＯＣＫＯＵＴ^TM ＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ(ＫＳＲ)（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社）１２５ｍｌ、２－メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ社）５μｌ、５ＮＮａＯＨ６３８μｌ、ＨｕｍａｎｂＦＧＦ（ＵＢＩ社）終濃度５ｎｇ／ｍｌであった。

　その後、毎日培地交換を実施した。ウィルス感染開始から１０日後には、両方のディッシュでいくつかのコロニーを確認した（図１Ｂ）。この時点でＳＴ３ＦＰ６存在下で培養したｈＢＭＭＮＣｓの場合、比較的大きな扁平コロニーを含んでいたのに対し、ＳＴ３存在下で培養したｈＢＭＭＮＣｓの場合は出現したコロニーはまだ小さく、マウスＥＳ細胞に似た形態のコロニーであった。１５日後には各２４個のコロニーをピックアップし、残りの細胞を予めフィーダー細胞を播いたゼラチンコート１００ｍｍディッシュに再播種した。２０日後に再びコロニーをピックアップし、残りの細胞の半分を播種し、さらに残りの半分の細胞について、ＦＡＣＳによりヒトＥＳ細胞マーカーＳＳＥＡ－４の発現確認を行った（図１Ａ）。ＦＡＣＳによる解析では、回収した細胞をｓｔａｉｎｉｎｇｍｅｄｉｕｍ（ＳＭ）（５％ＦＢＳ、０．０５％ＮａＮ_３、および０．５ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳ）３～５ｍｌで洗浄後、フィコエリスリン結合抗ＳＳＥＡ４抗体（ＢＤバイオサイエンス社）５μｌを添加し、氷中で１５分静置した。ＳＭ６ｍｌで洗浄後、死細胞を検出するための試薬ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）１μｇ／ｍｌを含むＳＭ液１ｍｌで再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）またはＦＡＣＳＡｒｉａＳＯＲＰ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて測定を行った。その結果、ＳＴ３ＦＰ６存在下で培養したｈＢＭＭＮＣｓを用いた場合、レトロウィルス感染２０日後の時点で、幹細胞マーカーであるＳＳＥＡ－４を発現する細胞が約４０％に達し、ＦＰ６を添加しなかった場合の約１５％に比して２．５倍以上に達していることが示された。また、ヒトＥＳ細胞においてはアルカリフォスファターゼが発現していることが知られている。そこで、２７日後の時点で、常法に従ってアルカリフォスファターゼ活性染色を行った（図１Ｃ）。
その結果、この時点でのコロニーのほとんどがアルカリフォスファターゼ陽性であることを確認した。以上より、ＳＴ３ＦＰ６存在下で培養したｈＢＭＭＮＣｓを用いた場合、多能性幹細胞の出現時期、細胞数において、ＳＴ３存在下で培養したｈＢＭＭＮＣｓを用いた場合を顕著に上回っていることが明らかとなった。

例２：ヒト骨髄由来単核球細胞からの多能性細胞の誘導（２）
Ａ．ヒト骨髄由来単核球細胞の培養
　凍結保存されたヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）２．５×１０⁶細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ社）を１００ｍｍペトリディッシュ１枚に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養を開始した。培地には、ヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＩＬ－３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＦｌｔ３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＰ６（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。
ここで、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＦＰ６からなるサイトカインカクテルを「ＳＴ３ＦＬＦＰ６」と呼ぶ（以下同様）。培養開始２４時間後に、ＳＴ３ＦＬＦＰ６を同濃度で再び添加した。培養開始４８時間後に細胞を回収し、総細胞数５×１０^５個の細胞を１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地５００μｌで懸濁した。細胞懸濁液には、ＳＴ３ＦＬ（各３００ｎｇ／ｍｌ）に加え、ＦＰ６を６０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。調製したｈＢＭＭＮＣｓを次のウィルス感染実験に用いた。

Ｂ．核初期化遺伝子を含む組換えレトロウィルスベクターの作製
　コラーゲンタイプＩコート１００ｍｍディッシュ１６枚に、それぞれ２．５×１０^６個のＧ３Ｔ－ｈｉ細胞（タカラバイオ社）を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養した。培養２４時間後に、核初期化遺伝子１種類についてディッシュ４枚を用いてウィルスベクターの遺伝子導入を行った。各ディッシュにつき、ｐＧＰｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社）６μｇ、ｐＶＳＶ－Ｇｖｅｃｔｏｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）６μｇ、およびレトロウィルスベクターｐＭＸｓに核初期化遺伝子を挿入したプラスミド１２μｇを、遺伝子導入試薬ＦｕＧｅｎｅ６（ロシュダイグノスティック社）を用いて共導入した。用いた核初期化遺伝子は、ヒトＯｃｔ３／４、ヒトＳｏｘ２、ヒトＫｌｆ４、ヒトｃ－ｍｙｃの４種類であった。遺伝子導入の約４８時間後に、核初期化遺伝子の種類ごとに培養液を回収し、培養液を０．７５μｍフィルターでろ過後、５０００×ｇ、４℃で４時間遠心し、培養上清を捨てることでウィルス沈殿を取得した。ウィルス沈殿は全て１つにまとめ、５００μｌの１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地を加えて再懸濁したところ、最終的に液量は１ｍｌほどになった。

Ｃ．ヒト骨髄由来単核球細胞のウィルス感染処理
　予め５０μｇ／ｍｌのレトロネクチン（タカラバイオ社）でコートされた１２ウェルプレート中の１つのウェルに、懸濁したウィルス沈殿を添加し、１０８０×ｇ、２０℃で２時間遠心した。遠心後のプレートに前記のｈＢＭＭＮＣｓの細胞懸濁液５００μｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ_２にて培養を開始した。培養開始約２４時間後に、ＳＴ３ＦＬＦＰ６入りの培地で培地交換を実施した。

　ウィルス感染開始から約４８時間後にトリプシンＥＤＴＡ液（ＧＩＢＣＯ社）で細胞を回収し、予め５×１０^５個／ディッシュのマウス胚性線維芽細胞をフィーダー細胞としたゼラチンコート１００ｍｍディッシュに、１０％ＦＢＳおよびＳＴ３ＦＬＦＰ６を補充したＤＭＥＭ培地を用いて細胞を播き直した。さらに、約４８時間後に１０％ＦＢＳおよびＳＴ３ＦＬＦＰ６を補充したＤＭＥＭ培地で培地交換を実施した。その後、ウィルス感染開始から６日後からは、ＳＴ３ＦＬＦＰ６を含まないヒトＥＳ細胞培養用の培地（例１Ｃに記載）に交換した。

　その後、毎日培地交換を実施した。ウィルス感染開始から１１日後には、両方のディッシュでいくつかのコロニーを確認した。１８日後には各２４個のコロニーをピックアップし、残りの細胞を予めフィーダー細胞を播いたゼラチンコート１００ｍｍディッシュに再播種した。２２日後の細胞を回収し、例１の方法に倣い、ＦＡＣＳによりヒトＥＳ細胞マーカーであるＳＳＥＡ－４の発現を解析した。その結果を図２に示す。

例３：レトロウィルス感染性ヒト骨髄由来単核球細胞の解析
Ａ．ヒト骨髄由来単核球細胞のレトロウィルス感染性の分析
　凍結保存されたｈＢＭＭＮＣｓ（Ａｌｌｃｅｌｌｓ社）を用いて、レトロウィルスの感染効率についての検討を行った。例１の方法に倣い、核初期化因子発現ｐＭＸｓベクターの代わりに、緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現するｐＭＸｓＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ（ｐＭＸｓＩＧ）ベクター（T. Kitamura et al., Experimental Hematology, 31, pp.1007-1014, 2003；東京大学北村俊雄教授より供与）を用いて実施した。

　ｈＢＭＭＮＣｓの培養条件は以下の３種類で実施した：(i)サイトカインを添加せずに、解凍後の細胞を用いてレトロウィルス感染を行った；(ii)例１と同様に、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地にヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびヒトＩＬ－３（１００ｎｇ／ｍｌ）を加えて（ＳＴ３）、前培養およびレトロウィルス感染を実施した；(iii)例１と同様に、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地にヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＩＬ－３（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＰ６（２０ｎｇ／ｍｌ）を加えて（ＳＴ３ＦＰ６）、前培養およびレトロウィルス感染を実施した。

　レトロウィルスの調製および感染方法は例１と同様に実施した。感染２日後に細胞を回収し、細胞をＳＭ液で洗浄後、ＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を含むＳＭ液１ｍｌで再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いてＦＡＣＳ解析を行った（図３）。その結果、サイトカインを添加した培養を行わない(i)の場合、レトロウィルスに感染する細胞は全く検出できなかったのに対して、ＳＴ３を添加（(ii)）することにより、生細胞中約４％の細胞がレトロウィルスに感染するようになり、さらにＦＰ６を加えてＳＴ３ＦＰ６を添加（(iii)）することにより、レトロウィルスに感染する細胞は約８％に増加した。一方で、本例にて使用したレトロウィルスをコントロール細胞のＮＩＨ３Ｔ３細胞に感染させたところ、９９％の効率で感染が可能であったことから、レトロウィルスそのものの感染能力は十分であった。

Ｂ．感染細胞の表面抗原マーカーの分析
　次に、例１および例２と同様にＳＴ３、ＳＴ３ＦＰ６またはＳＴ３ＦＬＦＰ６存在下で培養したｈＢＭＭＮＣｓに対して、ｐＭＸｓＩＧベクターより作製したレトロウィルスを感染させた場合の、ＥＧＦＰ陽性の感染細胞について、各種表面抗原マーカーに対する抗体を用いて免疫染色を行い、ＦＡＣＳを用いて解析を行った。

　回収した細胞をＳＭ液３～５ｍｌで洗浄後、各種抗体５μｌを添加し、氷中で１５分静置した。ＳＭ６ｍｌで洗浄後、ＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を含むＳＭ液１ｍｌで再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）にて測定を行った。用いた抗体は、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ４５抗体、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ３４抗体、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３８抗体、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体（以上、ＢＤバイオサイエンス社）、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３抗体、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１１７抗体、およびフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１９抗体（以上、ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社）であった。ＣＤ４５抗原は、すべてのヒト白血球、すなわちリンパ球、好酸球、単球、好塩基球、および好中球の表面に発現する。ＣＤ３４抗原は、最も未分化な造血幹細胞と造血前駆細胞に発現する。ＣＤ３８抗原は活性化したＴおよびＢリンパ球、ＮＫ細胞、単球、形質細胞および胸腺髄質細胞に発現する。ＣＤ１１ｂ抗原は、骨髄単球系細胞にみられ、ＮＫ細胞、顆粒球、単球／マクロファージに強く発現する。ＣＤ３抗原は、成熟Ｔ細胞および胸腺細胞に発現する。ＣＤ１１７抗原はごく少数の正常骨髄細胞にしか発現していないが、肥満細胞にも発現する。ＣＤ１９抗原は初期Ｂ細胞を含むすべての正常Ｂ細胞に発現するが、形質細胞に成熟すると消失する。

　解析の結果、レトロウィルス感染細胞のほぼ全てにおいて白血球のマーカーであるＣＤ４５は陽性であり、ＳＴ３ではほぼすべてがＣＤ３４陽性細胞であり、ＳＴ３ＦＰ６またはＳＴ３ＦＬＦＰ６では約６０％がＣＤ３４陽性細胞であった。一方で、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３、ＣＤ１９といったマーカーはいずれも陰性であった（図４）。

例４：レトロウィルス感染性ヒト末梢血由来単核球細胞の解析
　凍結保存されたヒト末梢血由来単核球細胞（ｈＰＢＭＮＣｓ）（Ａｌｌｃｅｌｌｓ社）に対して、例３と同様にｐＭＸｓＩＧベクターを用いてレトロウィルスの感染実験を行った。サイトカインカクテルを用いてｈＰＢＭＮＣｓを培養した場合の感染効率とＥＧＦＰ陽性の感染細胞について、各種表面抗原マーカーに対する抗体を用いて免疫染色を行い、ＦＡＣＳを用いて感染細胞の同定を行った。

　ｈＰＢＭＮＣｓの培養には、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地にヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＩＬ－３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＰ６（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＧＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加して培養したＧＭ培養系と、ヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＩＬ－３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＰ６（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）、抗ヒトＣＤ４０抗体＃３４１（キリンファーマ社）（１００ｎｇ／ｍｌ）、抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ３　ヤンセンファーマ）（１μｇ／ｍｌ）、抗ヒトＣＤ２８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（１μｇ／ｍｌ）を添加して前培養したＴＢ培養系の２通りの培養系を用いて、レトロウィルス感染を実施した。レトロウィルスの調製および感染方法は例１と同様に実施した。感染２日後に細胞を回収し、回収した細胞をＳＭ液３～５ｍｌで洗浄後、各種抗体５μｌを添加し、氷中で１５分静置した。ＳＭ６ｍｌで洗浄後、ＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を含むＳＭ液１ｍｌで再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）にて測定を行った。

　用いた抗体は、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ４５抗体、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ３４抗体、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３８抗体、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１３抗体（以上、ＢＤバイオサイエンス社）、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３抗体、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１１７抗体、およびフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１９抗体（以上、ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社）であった。ＣＤ１３抗原は、正常末梢血の好中球、好酸球、好塩基球および単球など、ほとんどの骨髄系細胞に発現する。

　解析の結果、レトロウィルス感染細胞のほぼ全てにおいて白血球のマーカーであるＣＤ４５は陽性であり、ＧＭ培養系では骨髄細胞を用いた場合と同様に、約半数がＣＤ３４陽性であった。ＴＢ培養系においてはＴ細胞のマーカーであるＣＤ３抗原陽性であった（図５）。本系を用いることにより、末梢血中に存在するＴ細胞などから多能性細胞を誘導できる可能性が考えられる。

例５：ヒト誘導多能性細胞クローンの表面抗原解析
　例１および例２の結果クローニングした細胞株について、コロニー形態の観察およびＦＡＣＳによりヒトＥＳ細胞マーカーＳＳＥＡ－４の発現確認を行った。ＦＡＣＳ解析の方法は例１と同様に行った。

　ＳＴ３の培養条件を用いて取得したクローン＃１６および＃３０、ＳＴ３ＦＰの培養条件を用いて取得したクローン＃２２および＃３３、ＳＴ３ＦＬＦＰの培養条件を用いて取得したクローン＃１および＃４について解析した結果を図６に示す。いずれのクローンも幹細胞マーカーであるＳＳＥＡ－４を有意に発現していることを確認した。

例６：ヒト誘導多能性細胞クローンのＲＴ－ＰＣＲ解析
　例５で解析したクローンを含め、例１および例２の結果取得した多能性幹細胞クローンについて、幹細胞特異的遺伝子のｍＲＮＡの発現をＲＴ－ＰＣＲ法を用いて解析した。

　各クローン細胞をマウス胚性線維芽細胞のフィーダー細胞上に播種し、ヒトＥＳ細胞用培地にて培養した細胞よりＲＮＡを回収した。用いた培地の組成は、ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地（ＳＩＧＭＡ社）５００ｍｌ、非必須アミノ酸液（ＳＩＧＭＡ社）５ｍｌ、２００ｍＭＬ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社）６．２５ｍｌ、ＫＮＯＣＫＯＵＴTM ＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ(ＫＳＲ)（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社）１２５ｍｌ、２－メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ社）５μｌ、５ＮＮａＯＨ６３８μｌ、ＨｕｍａｎｂＦＧＦ（ＵＢＩ社）終濃度５ｎｇ／ｍｌであった。回収した細胞はＰＢＳ緩衝液で洗浄後、細胞沈殿を液体窒素中にて凍結した。コントロール細胞として、凍結融解後のＢＭＭＮＣｓをフィーダー細胞上で数時間培養した細胞およびフィーダー細胞（ＭＥＦ細胞）を用意した。凍結後の細胞サンプルより、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、添付プロトコルに従って全ＲＮＡを調製した。調製したＲＮＡを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により添付のプロトコルに従ってｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＬＡ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用いて、９６℃－２０秒、５５℃－３０秒、および７２℃－３０秒からなる工程を１サイクルとして３５サイクルのＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応に用いたプライマーは山中らと同様のものを用いており（K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 131, pp.861-872, 2007）、各プライマーの塩基配列を表１に示す。各ＰＣＲ反応は各遺伝子についてフォワード（Ｆｗ）プライマーとリバース（Ｒｖ）プライマーとの組合せを用いて実施した。ＲＴ反応およびＰＣＲ反応のコントロールとして、ハウスキーピング遺伝子であるｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－3－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を用いた。ＰＣＲ反応物をエチジウムブロマイド入りのアガロースゲルにて電気泳動し、ＵＶトランスイルミネーターにより観察した結果を図７に示す。解析の結果、いずれのクローンも幹細胞マーカー遺伝子を発現していることを確認した。

例７：マウス骨髄由来単核球細胞からの多能性細胞の誘導（１）
Ａ．マウス骨髄由来単核球細胞の取得
　未分化な多能性幹細胞において緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現することが知られているＯｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス（１０～２０週齢）（K. Ohbo et al., Dev. Biol., 258,　pp.209-225, 2003; 横浜市立大学大保和之准教授より供与）の大腿骨内の骨髄を採取し、ＰＢＳに懸濁した。定法に従い（高津聖志、免疫研究の基礎技術、羊土社1995）、骨髄から比重遠心法により単核球細胞画分を濃縮し、これをマウス骨髄単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）として用いた。

Ｂ．核初期化遺伝子を含む組換えレトロウィルスベクターの作製
　コラーゲンタイプＩコート６０ｍｍディッシュ１０枚にそれぞれ１×１０^６個、および６ウェルプレートの各ウェルに１×１０^５個のレトロウィルス用のパッケージング用細胞：ＰＬＡＴ－Ｅ細胞（S.Morita et al., Gene Therapy, 7, pp.1063-1066, 2000；東京大学北村俊雄教授より供与）を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養した。培養２４時間後に、マウス核初期化遺伝子１種類について６０ｍｍディッシュ２枚を用いてウィルスベクターの遺伝子導入を行った。各ディッシュにつき、レトロウィルスベクターｐＭＸｓに核初期化遺伝子を挿入したプラスミド３μｇを遺伝子導入試薬ＦｕＧｅｎｅ６（ロシュダイグノスティック社）を用いて導入した。用いた核初期化遺伝子は、マウスＯｃｔ３／４、マウスＳｏｘ２、マウスＫｌｆ４、およびマウスｃ－ｍｙｃの４種類であった。核初期化遺伝子発現レトロウィルスベクター、ｐＭＸｓｍＯｃｔ３／４、ｐＭＸｓｍＳｏｘ２、ｐＭＸｓｍＫｌｆ４、およびｐＭＸｓｍｃ－ｍｙｃの構築は、山中らの方法に従って行った（K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 126, pp.663-676, 2006）。その他に、６０ｍｍディッシュ１枚と６ウェルプレートの３ウェル分において、上記４種類の遺伝子各３μｇのＤＮＡを併せて導入した。また、コントロールとして緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現するｐＭＸｓＩＧベクター３μｇを６０ｍｍディッシュ１枚に導入した。遺伝子導入の約４８時間後に、各核初期化遺伝子について６０ｍｍディッシュ１枚ずつを集めて０．２２μｍフィルターでろ過後、５８００×ｇ、４℃で４時間遠心し、培養上清を捨てた後に３ｍｌのマウスＥＳ細胞用培地で再懸濁した濃縮ウィルスサンプル(i)を取得した。マウスＥＳ細胞用培地としては、２０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地に１／１００容の２-メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ社）、１／１０００容のＥＳＧＲＯ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）を添加したものを用いた。また、各核初期化遺伝子について６０ｍｍディッシュ１枚ずつを集めて０．２２μｍフィルターでろ過しただけのものを４ウィルスサンプル(ii)とした。４種類の遺伝子を同時に導入した６０ｍｍディッシュ１枚と６ウェルプレートの３ウェル分の培養上清に
ついては、０．２２μｍフィルターでろ過し、４遺伝子サンプル(iii)とした。コントロールのｐＭＸｓＩＧベクターを導入した培養上清については、０．２２μｍフィルターでろ過したものをコントロールサンプル(iv)とした。

Ｃ．マウス骨髄由来単核球細胞のウィルス感染処理
　予め３３μｇ／ｍｌのレトロネクチン（タカラバイオ社）でコートされた１２ウェルプレートの２ウェルずつに上記(i)～(iv)のサンプルを添加し、１０８０×ｇ、２５℃で２時間遠心した。遠心後のプレートからウィルスサンプルを除去し、新たなマウスＥＳ細胞用培地を１ｍｌずつ添加した。さらに、(i)～(iv)の各サンプルの一方のウェルには、マウスＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびマウスＩＬ－３（１００ｎｇ／ｍｌ）（ＳＴ３）を添加した。その後、各ウェルに前記のＯｃｔ４－ＥＧＦＰマウスより調製したｍＢＭＭＮＣｓを１×１０^５個／ウェルになるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ_２にて培養を開始した。

　また、ウィルス感染前日に、Ｏｃｔ４ＥＧＦＰマウス由来胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を１２ウェルプレートに２×１０^４個／ウェルで播種して培養していた各ウェルについても、上記(i)～(iv)のサンプルを１ウェルずつに添加し、１０８０×ｇ、３２℃で４０分間遠心した後、３７℃、５％ＣＯ_２にて培養を開始した。

　ウィルス感染２日後のコントロールサンプルにおけるＥＧＦＰ発現細胞の割合は、ＭＥＦ細胞では３４％、サイトカインなしのｍＢＭＭＮＣｓでは５５％、ＳＴ３存在下のｍＢＭＭＮＣｓでは６０％であった。

　４ウィルスサンプル（(ii)）を感染させたｍＢＭＭＮＣｓについては、サイトカインの添加、非添加に関わらず、ウィルス感染開始から５日後にはＯｃｔ４－ＥＧＦＰレポーター遺伝子によるＥＧＦＰ遺伝子の発現が認められた（図８Ａ・Ｂ）。一方で、ＭＥＦについてはこの時点ではＥＧＦＰ遺伝子発現細胞の存在は認められなかった（図８Ｃ）。ウィルス感染７日後に、ｍＢＭＭＮＣｓ由来各サンプルについて、Ｏｃｔ４－ＥＧＦＰレポーター遺伝子の発現と血球細胞マーカーであるＣＤ４５抗原の発現のＦＡＣＳ解析を実施した。この解析のために、回収した細胞をＳＭ液３～５ｍｌで洗浄後、アロフィコシアニン結合抗マウスＣＤ４５抗体（ＢＤバイオサイエンス社）５μｌを添加し、氷中で１５分静置した。ＳＭ６ｍｌで洗浄後、ＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を含むＳＭ液１ｍｌで再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）にて測定を行った。その結果を図９および表２に示す。ＦＡＣＳ解析前の細胞の様子を図１０に示す。感染前のｍＢＭＭＮＣｓはそのほぼ全てがＣＤ４５抗原陽性であるのに対し、この時点でのＯｃｔ４－ＥＧＦＰ陽性細胞の多くは既にＣＤ４５抗原陰性であった。また同時に、ＦＡＣＳｓｏｒｔｉｎｇによりＥＧＦＰ陽性細胞の分取を行い、それらの細胞からクローニングを実施し、マウス骨髄由来誘導多能性幹細胞（ｍＢＭｉＰＳ）クローン＃７および＃１３を取得した。
取得した各クローンについてもＦＡＣＳ解析を実施した（図１１）。

　ＦＡＣＳによる解析では、回収した細胞をＳＭ液３～５ｍｌで洗浄後、各種抗体５μｌを添加し、氷中で１５分静置した。ＳＭ６ｍｌで洗浄後、ＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を含むＳＭ液１ｍｌで再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）またはＦＡＣＳ　Ａｒｉａ　ＳＯＲＰ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて測定を行った。抗体としては、アロフィコシアニン結合抗マウスＣＤ４５抗体（ＢＤバイオサイエンス社）、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７結合抗マウスＳＳＥＡ－１抗体を用いた。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７結合抗マウスＳＳＥＡ－１抗体は、抗マウスＳＳＥＡ－１抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）１００μｇをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ＰｒｏｔｅｉｎＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて標識することにより調製した。

例８：マウス骨髄由来単核球細胞からの多能性細胞の誘導（２）
Ａ．核初期化遺伝子を含む組換えレトロウィルスベクターの作製
　コラーゲンタイプＩコート６０ｍｍディッシュ１２枚にそれぞれ７×１０^５個のＰＬＡＴ－Ｅ細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養した。培養２４時間後に、各種遺伝子導入を行った。１２枚のうち４枚については、マウス核初期化遺伝子１種類について６０ｍｍディッシュ１枚を用いてウィルスベクターの遺伝子導入を行った。各ディッシュにつき、レトロウィルスベクターｐＭＹｓ（T. Kitamura et al., Experimental Hematology, 31, pp.1007-1014, 2003；東京大学北村俊雄教授より供与）に核初期化遺伝子を挿入したプラスミド４μｇを遺伝子導入試薬ＦｕＧｅｎｅ６（ロシュダイグノスティック社）を用いて導入した。用いた核初期化遺伝子は、ヒトＯｃｔ３／４、ヒトＳｏｘ２、ヒトＫｌｆ４、およびヒトｃ－ｍｙｃの４種類であった。６０ｍｍディッシュ４枚について、上記４種類の遺伝子各４μｇのＤＮＡを併せて導入した。
また、コントロールとして緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現するｐＭＹｓＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ（ｐＭＹｓＩＧ）ベクター１６μｇを６０ｍｍディッシュ４枚に導入した。

　遺伝子導入の約４８時間後に、各核初期化遺伝子を個別に導入した６０ｍｍディッシュ計４枚を集めて４ウィルスサンプルとし、４種同時に導入した計４枚を集めて４遺伝子サンプルとし、ｐＭＹｓＩＧベクターを導入した計４枚を集めてコントロールサンプルとした。いずれのサンプルについても、０．２２μｍフィルターでろ過後、５８００×ｇ、４℃で４時間遠心し、培養上清を捨てた後に２．５ｍｌのマウスＥＳ細胞用培地で再懸濁し、再び０．２２μｍフィルターでろ過を行った。

Ｂ．細胞のウィルス感染処理
　レトロネクチン（タカラバイオ社）でコートされた１２ウェルプレートの２ウェルずつに４ウィルスサンプル、４遺伝子サンプル、およびコントロールサンプルをそれぞれ添加し、１０８０×ｇ、２５℃で２時間遠心した。遠心後のプレートからウィルスサンプルを除去し、各サンプルのウェルに対して、マウスＥＳ細胞用培地で懸濁したＯｃｔ４－ＥＧＦＰマウスＢＭＭＮＣｓまたはＯｃｔ４－ＥＧＦＰマウスＭＥＦ細胞を１×１０^５個／ウェルになるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ_２にて培養を開始した。

　また、ウィルス感染前日に、Ｏｃｔ４－ＥＧＦＰマウスＭＥＦ細胞をゼラチンコート１２ウェルプレートに２×１０^４個／ウェルで播種して培養していた各ウェルについても、上記３種のサンプルを１ウェルずつに添加し、１０８０×ｇ、２５℃で４０分間遠心した後、３７℃、５％ＣＯ_２にて培養を開始した。

　ウィルス感染開始２日後のコントロールサンプルにおけるＥＧＦＰ発現細胞の割合は、レトロネクチンコートプレートで感染させたＭＥＦ細胞では９５％、ゼラチンコートプレートで予め培養していたＭＥＦ細胞では６５％、レトロネクチンコートプレートで感染させたｍＢＭＭＮＣｓでは２６％であった（図１２）。その後、ウィルス感染開始から７日目にＦＡＣＳｓｏｒｔｉｎｇを行い（図１３）、１２日目に出現コロニー数を計測した。その結果を表３にまとめた。

例９：マウス骨髄由来多能性細胞の多分化能解析
　ｍＢＭｉＰＳクローン＃７および＃１３について分化多能性を評価するため、ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃＡＪｃｌ－ｎｕ）の皮下への移植を行った。未分化ＥＳ細胞は生体内に移植されると奇形腫を形成することが知られている。コントロール細胞としてマウスＥＳ細胞Ｅ１４株を使用した。ヌードマウス１匹あたり各細胞１×１０^６個を１００μｌ血清非含有ＤＭＥＭ培地で懸濁して皮下投与した。その結果、マウスＥＳ細胞を移植した場合と同様の大きさの奇形腫瘍がｍＢＭｉＰＳ細胞を移植した全例でも形成された。移植後２週間後および４週間後の腫瘍を摘出し、ホルマリン固定により組織標本を作製した。組織学的な解析の結果、いずれのクローン由来の奇形腫においても、神経組織、軟骨組織、筋組織、脂肪組織、食道粘膜様組織、気管上皮などが認められたことから、ｍＢＭＭＮＣｓより誘導された各クローンが多能性を有することが証明された（図１４）。

　さらにｍＢＭｉＰＳクローン＃７細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの受精卵から作製した胚盤胞に注入後、偽妊娠マウスに移植することによりキメラ個体を作出することを試みた。その結果、Ｂａｌｂ／ｃマウスの産仔は白色の毛色を示すはずのところ、ｍＢＭｉＰＳ細胞に由来する黒色の毛色を有するキメラマウスが誕生した（図１５および表４）。毛色は全身の細胞の一部を反映するものであり、他の組織・臓器においてもｍＢＭｉＰＳ細胞に由来する細胞が個体を構成しているものと考えられた。

例１０：マウス骨髄由来多能性細胞の発現プロファイル解析
　ｍＢＭｉＰＳクローン＃７および＃１３について、各５×１０^５個の細胞からＲＮＡｅａｓｙｍｉｎｉｐｌｕｓｋｉｔ (ＱＩＡＧＥＮ社)を用いてＲＮＡを調製し、ＡｇｉｌｅｎｔＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｒｒａｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて発現プロファイル解析を実施した。コントロールとしてマウスＥＳ細胞Ｅ１４株およびマウスＢＭＭＮＣ細胞を使用した。その結果、図１６に示すような各遺伝子の発現パターンを示し、ｍＢＭｉＰＳクローン＃７および＃１３がＥＳ細胞と酷似した細胞であることが明らかとなった。

例１１：ヒト末梢血由来単核球細胞からの多能性細胞の誘導
　凍結保存されたヒト末梢血由来単核球細胞（ｈＰＢＭＮＣｓ）（Ａｌｌｃｅｌｌｓ社）に対して、例１および例２と同様にウイルス感染前の前培養を実施した。その際添加したサイトカインは表５に記載し、サイトカインの組合せおよび各濃度は例１のＳＴ３、ＳＴ３ＦＰ、例４のＧＭ培養系、ＴＢ培養系あるいはＧＭ培養系からＦＰ６を除いたＧＭ－ＦＰ培養系を用いた。ＤＮＡメチル化阻害剤である５－Ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ　５００ｎＭ（５ＡｚａＣ）を添加した場合も表５に記載した。核初期化遺伝子発現レトロウイルスの調製および感染方法は例１、例２と同様に実施した。但し、感染前培養時のｈＰＢＭＮＣｓの細胞数および感染時の細胞数については表５に記載の通りとした。ウイルス感染後の培養は、例１、例２と同様に実施し、いずれの誘導もウイルス感染開始６日後からはいずれのサイトカインも含まないヒトＥＳ細胞培養用の培地に交換し、以後毎日培地交換を実施した。ウイルス感染開始から２０日後頃までに出現、ピックアップしたES細胞様コロニー数を表５に示す。ウイルス感染効率は例３と同様に評価し、感染２日後のウイルス感染細胞の割合を表５に示した。解析の結果、ＳＴ３ＦＰ存在下での培養を組み合わせることで、高い頻度かつ短期間に多能性幹細胞が誘導できることが明らかとなった。ただし、ＳＴ３ＦＰを含む場合でもＴＢ培養系のような組合せでは逆に多能性幹細胞が誘導されにくくなることも判明した。

　本実験の結果取得した多能性幹細胞クローンあるいはサブクローンについて、幹細胞特異的遺伝子のｍＲＮＡの発現を例６と同様にＲＴ－ＰＣＲ法を用いて解析した（図１７）。但し、例６と異なるＰＣＲ用プライマーは桜田らの報告(H. Masaki et al., Stem Cell Res., 1, pp.105-115, 2008）を参照し、各プライマーの塩基配列を表６に示す。各ＰＣＲ反応は各遺伝子についてフォワード（Ｆｗ）プライマーとリバース（Ｒｖ）プライマーとの組合せを用いて実施した。また、アニーリング温度については、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴについては６５℃、ＴＤＧＦ、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＣＹＰ２６Ａ１については６０℃でＰＣＲ反応を実施した。解析の結果、多くのクローン、サブクローンで幹細胞マーカー遺伝子が発現していることを確認した。

例１２：ヒト骨髄由来誘導多能性細胞株の表面抗原解析（２）
　例１の結果クローニングした細胞株ＢＭｉＰＳ　ＳＴ３ＦＰ＃１７（ＢＭ　ｉＰＳ＃１７）および例１１の結果クローニングした細胞株ＰＢｉＰＳ　ＳＴ３ＦＰ＃１（ＰＢ　ｉＰＳ＃１）について、ＦＡＣＳによりヒトＥＳ細胞マーカーＳＳＥＡ－４およびＴＲＡ１－６０の発現確認を行った。ＢＭ　ｉＰＳ＃１７およびＰＢ　ｉＰＳ＃１はＭａｔｒｉｇｅｌｈＥＳＣ-ｑｕａｌｉｆｉｅｄＭａｔｒｉｘ（ＢＤバイオサイエンス社）でコートしたプレートを用いて、ｍＴｅＳＲ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて培養を行った。ＦＡＣＳ解析は例１、例７の方法に従い、抗体はフィコエリスリン結合抗ＳＳＥＡ４抗体（ＢＤバイオサイエンス）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７結合抗ＴＲＡ１－５０抗体を用いて実施した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７結合抗ＴＲＡ１－６０抗体は抗ＴＲＡ１－６０抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）１００μｇをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて標識することにより調製した。解析した結果を図１８に示す。解析の結果、幹細胞マーカーであるＳＳＥＡ－４およびＴＲＡ１－６０をヒトＥＳ細胞と同等レベルに高発現していることを確認した。

例１３：ヒト誘導多能性細胞株の免疫染色
　例１の結果クローニングした細胞株ＢＭ　ｉＰＳ＃１７および例１１の結果クローニングした細胞株ＰＢ　ｉＰＳ＃１について、免疫染色によるヒトＥＳ細胞マーカーＯｃｔ３／４およびＮａｎｏｇの発現確認を行った。細胞をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄後、４％パラフォルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液で室温１５分間処理し、細胞の固定を行った。固定後ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ溶液で室温５分間処理し、再びＰＢＳ緩衝液で３回洗浄を行った。１％ＢＳＡ溶液で室温３０分間ブロッキングを行った後、１％ＢＳＡ溶液で希釈した一次抗体液を室温１時間あるいは４℃で１晩反応させた。ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄を行い、１％ＢＳＡ溶液で希釈した二次抗体液を室温３０分間反応させた。反応液にＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を添加し、室温で５分間処理後、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、蛍光顕微鏡にて観察を実施した。用いた一次抗体は、抗Ｏｃｔ４抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）および抗Ｎａｎｏｇ抗体（リプロセル社）であり、二次抗体はＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＡｌｅｘａ５４６標識抗ラビットＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）であった。解析の結果、いずれの細胞も幹細胞マーカーであるＯｃｔ３／４およびＮａｎｏｇを有意に発現していることを確認した（図１９）。

例１４：ヒト誘導多能性細胞株のＲＴ－ＰＣＲ解析
　例１の結果クローニングした細胞株ＢＭ　ｉＰＳ＃１７および例１１の結果クローニングした細胞株ＰＢ　ｉＰＳ＃１、＃８について、例６、例１１と同様にＲＴ－ＰＣＲ解析を実施した（図２０）。解析の結果、いずれの細胞株も幹細胞マーカー遺伝子の発現を維持していることを確認した。

例１５：ヒト誘導多能性幹細胞株を用いたテラトーマ形成
　例１の結果クローニングした細胞株ＢＭ　ｉＰＳ＃１７および例１１の結果クローニングした細胞株ＰＢ　ｉＰＳ＃１を用いて、テラトーマ形成能を検討した。方法は、Ｂｅｌｍｏｎｔｅらや桜田らの方法に従い（T. Aasen et al., Nature Biotech., 26, pp.1276-1284, 2008、H. Masaki et al., Stem Cell Res., 1, pp.105-115, 2008）ＦＯＸＣＨＡＳＥＤＳＣＩＤＢａｌｂの１０から１４週齢の精巣へ移植を行った。１匹あたり２×１０^６個程度の細胞をｍＴｅＳＲ培地あるいはマトリゲル溶液に懸濁し、２７Ｇの注射針にて移植した。移植後８～１０週までに形成された腫瘍を摘出し、例９と同様にホルマリン固定により組織標本を作製した。ヘマトキシリン・エオジン染色による組織学的な解析の結果、いずれの細胞株由来の奇形腫においても神経組織、骨組織、軟骨組織、筋組織、消化管上皮様組織、腺様組織などが認められたことから、ｈＢＭＭＮＣｓあるいはｈＰＢＭＮＣｓより誘導された各細胞株が多能性を有することが証明された（図２１）。

　さらに抗ヒト抗体を用いて、ＥＮＶＩＳＩＯＮキットＨＲＰ（ＤＡＫＯ社）により免疫染色を行った。方法はキット添付のプロトコルに従い、抗原賦活化はＤＡＫＯ社製抗原賦活化液を１０倍希釈して使用し、ＤＡＫＯ社製内因性パーオキシダーゼブロッキング試薬を用いて内因性パーオキシダーゼの活性を阻害した。一次抗体は抗ヒトＳＭＡ抗体(ＤＡＫＯ)、抗ヒトＧＦＡＰ抗体（ＤＡＫＯ）、抗ヒトAFP抗体（DAKO）を用い、プロトコルに従い免疫複合体を形成させた後、室温にて３０～６０分反応させた。Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ緩衝液にて洗浄後、ＤＡＢ発色を行い、再度洗浄後ヘマトキシリン染色を行った。解析の結果、各抗体による特異的なシグナルを検出し、三胚葉系への分化を確認した（図２２）。

例１６：ヒト誘導多能性幹細胞株を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ分化誘導
　例１１の結果クローニングした細胞株ＰＢ　ｉＰＳ＃１を用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ分化誘導を実施した。分化誘導方法はＭｕｒｒｙら、あるいは山中らの方法に従った（M. A Laflamme et al., Nature Biotech., 25, pp.1015-1024, 2007、K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 131, pp.861-872, 2007）。ＰＢ　ｉＰＳ＃１をＭａｔｒｉｇｅｌｈＥＳＣ-ｑｕａｌｉｆｉｅｄＭａｔｒｉｘ（ＢＤバイオサイエンス社）でコートしたプレートを用いて、ｍＴｅＳＲ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で６日間培養を行った。細胞がコンフルエントになった状態で、培地をＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＡｃｔｉｖｉｎＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した無血清ＤＭＥＭ‐Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ社）に交換し２４時間培養した。さらに、培地をＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した無血清ＤＭＥＭ‐Ｆ１２培地に交換し４日間培養した後、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加した無血清ＤＭＥＭ‐Ｆ１２培地で１０日間培養したところで細胞を固定した。固定した細胞を用いて例１３同様に免疫染色を実施した。用いた抗体は、Ｃｙ３標識抗ＳＭＡ抗体（Ｓｉｇｍａ社）あるいは抗ヒトＡＦＰ抗体（ＤＡＫＯ社）およびＡｌｅｘａ５４６標識抗ラビットＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）であった。解析の結果、心血管細胞マーカーであるＳＭＡ陽性細胞および内胚葉系細胞マーカーであるＡＦＰ陽性細胞への分化を確認した（図２３）。

例１７：細胞融合によるマウス骨髄由来単核球細胞からの多能性細胞の誘導
　Ｏｃｔ４－ＥＧＦＰトランスジェニックマウス（１２～２４週齢）を用いて、細胞融合により体細胞初期化の効率を検討した。１３．５日胚より調製した胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）と比重遠心法により濃縮した骨髄単核球細胞画分（ｍＢＭＭＮＣｓ）を用いて比較を行った。それぞれ２×１０^６個の細胞と５×１０^５個のマウスＥＳ細胞（ＫＨ２細胞株；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｊａｅｎｉｓｃｈ教授より供与）とをＨＶＪ－Ｅ（石原産業）を用いて、添付プロトコルに従って細胞融合した。その結果、融合２日後にはＯｃｔ４－ＥＧＦＰレポーター遺伝子によるＥＧＦＰ遺伝子の発現が認められ、ＦＡＣＳｓｏｒｔｉｎｇによりＥＧＦＰ陽性細胞の分取を行った（図２４）。この時点ではＭＥＦ由来細胞の方がＥＧＦＰ発現細胞の割合が高かったが、分取後の細胞からはｍＢＭＭＮＣｓ由来細胞の方がより多くのＥＳ細胞様コロニーが出現することを確認した（図２４）。

例１８：マウス骨髄由来多能性細胞の発現プロファイル解析（２）
　ｍＢＭｉＰＳクローン＃７および＃１３について、各５×１０^５個の細胞からＲＮＡｅａｓｙｍｉｎｉｐｌｕｓｋｉｔ (ＱＩＡＧＥＮ社)を用いてＲＮＡを調製し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により添付のプロトコルに従ってｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＬＡ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を用いて、９６℃、２０秒、５５℃、３０秒、７２℃、３０秒からなる工程を１サイクルとして３５サイクルのＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応に用いたプライマーは山中らと同様のものを用いており（K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 126, pp.663-676, 2006）、各プライマーの塩基配列を表７に示す。各ＰＣＲ反応は各遺伝子についてフォワード（Ｆｗ）プライマーとリバース（Ｒｖ）プライマーとの組合せを用いて実施した。ＲＴ反応およびＰＣＲ反応のコントロールとして、ハウスキーピング遺伝子であるｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－3－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を用いた。ＰＣＲ反応物をエチジウムブロマイド入りのアガロースゲルにて電気泳動し、ＵＶトランスイルミネーターにより観察した結果を図２５に示す。解析の結果、いずれのクローンも幹細胞マーカー遺伝子を発現し、レトロウイルス由来遺伝子の発現が抑制されていることを確認した。

例１９：マウス骨髄由来多能性細胞の多分化能解析（２）
　例９と同様にｍＢＭｉＰＳクローン＃７および＃１３についてさらにキメラマウスを作製し、誕生したキメラマウス数を表８に示す。さらに誕生したキメラマウスのオスをＣ５７ＢＬ／６マウスのメスと交配させたところ、ｍＢＭｉＰＳクローン＃７細胞に由来するキメラマウス１個体について、産仔の全てが黒色の毛色を呈することを確認した（図２６）。以上より、ｍＢＭｉＰＳクローン＃７細胞が生殖系列の細胞に分化可能であり、骨髄細胞由来の多能性幹細胞が子孫伝達可能であることが確認された。

例２０：マウス骨髄由来多能性細胞のレトロウイルス遺伝子挿入数の解析
　ｍＢＭｉＰＳクローン＃７および＃１３について、マウスＯｃｔ３／４、マウスＳｏｘ２、マウスＫｌｆ４、マウスｃ－ｍｙｃのｃＤＮＡをプローブとしてサザンブロット解析を実施した。各細胞からＰｕｒｅｇｅｎｅ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔａ社）を用いてゲノムＤＮＡを調製し、１サンプル当り１０μｇのＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩあるいはＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ社）を用いて消化した。消化したＤＮＡを０．７％アガロースゲルを用いて電気泳動し、ナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ－Ｎ＋へ添付プロトコルに従いアルカリトランスファーを実施した。マウスＯｃｔ３／４、マウスＳｏｘ２、マウスＫｌｆ４、マウスｃ－ｍｙｃの各ｃＤＮＡはＭｅｇａｐｒｉｍｅ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて^３２Ｐ標識し、ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて添付プロトコルに従い、ハイブリダイゼーションを行った。Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、については、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで消化したＤＮＡに対してハイブリダイゼーションを行い、Ｋｌｆ４、ｃ－ｍｙｃについては、ＢａｍＨＩ消化したＤＮＡに対してハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイズしたプローブをＴｙｐｈｏｏｎ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて検出した。その結果、ｍＢＭｉＰＳクローン＃７および＃１３では、山中らが樹立したｉＰＳ細胞株に関する報告（K. Okita, T. Ichisaka, S. Yamanaka, Nature, 448, pp. 313-317, 2007）に比してレトロウイルス由来核初期化遺伝子のゲノムＤＮＡへの挿入コピー数が少ないことが確認された（図２７）。

例２１：マウス骨髄由来単核球細胞からの多能性細胞の誘導（３）
　マウス骨髄由来単核球細胞からの多能性細胞誘導について、クローン多様性を確認するためにＦＡＣＳを用いた１細胞ソーティングによりクローン分析を行った。例７のサイトカインなしの条件と同様に、１×１０^５個のＯｃｔ４－ＥＧＦＰマウス由来ＢＭＭＮＣsあるいはＭＥＦにレトロウイルスベクターｐＭＸｓを用いてマウス核初期化遺伝子を導入した。ＢＭＭＮＣｓについては遺伝子導入８日後に約９％の細胞がＥＧＦＰ陽性となり、ＭＥＦは１５日後に約０．００９％の細胞がＥＧＦＰ陽性となった（図２８）。ＢＭＭＮＣｓについては８日後に、ＭＥＦについては１５日後に、予めＭＥＦを播種した９６穴プレート５～６枚分に、ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いてＥＧＦＰ陽性細胞を１細胞／１ｗｅｌｌソーティングした。その結果、ＭＥＦからは増殖する細胞が得られなかったのに対し、ＢＭＭＮＣｓからは計１９個のｗｅｌｌで細胞が増殖し、そのうち１７個のｗｅｌｌでＥＳ細胞様のコロニー形成が認められた（表９）。増殖したＥＳ細胞様コロニーについて、例２０同様にゲノムＤＮＡを調製し、ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで消化した後に、Ｓｏｘ２ｃＤＮＡをプローブとしてサザンブロット解析を実施した。その結果、増殖したｗｅｌｌ間でクローンの重複があるものの、計５個の独立クローンが含まれることが明らかとなり、一度の遺伝子導入で複数の多能性細胞クローンが得られることが明らかとなった（図２８）。

例２２：マウス骨髄由来単核球細胞からの多能性細胞の誘導（４）
　マウス骨髄からの多能性細胞の誘導について、その由来細胞を同定するために宿主とする細胞の分画を行った。Ｏｃｔ４－ＥＧＦＰマウス由来ＢＭＭＮＣsをＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体（BDバイオサイエンス社）で染色し、ＦＩＴＣビーズおよびAｕｔｏＭＡＣＳ装置（ミルテニーバイオテク社）を用いて、ポジティブセレクション液(i)とネガティブセレクション液(ii)に分け、更にAｕｔｏＭＡＣＳを用いて(ii)をネガティブ選択(iii)した。ＣＤ４５抗原は、全ての白血球、すなわちリンパ球、単球、好酸球、好塩基球、好中球表面に発現する。(i)に含まれる細胞をＦＡＣＳで解析すると９９．９％がＣＤ４５陽性細胞であり（図２９）、(i)をＣＤ４５+画分とした。同様に(iii)に含まれる細胞を解析すると、８８．８％がＣＤ４５陽性細胞であり、(iii)をＣＤ４５±画分とした。ＣＤ４５+画分およびＣＤ４５±画分を用いて、例２１と同様にそれぞれから多能性細胞誘導を実施し、１細胞ソーティングによりクローン分析を実施した。遺伝子導入８日後に、予めＭＥＦを播種した９６穴プレート５～６枚分に、ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いてＥＧＦＰ陽性細胞を１細胞／１ｗｅｌｌソーティングしたところ、ＣＤ４５+画分からは４８０ｗｅｌｌ中３ｗｅｌｌ、ＣＤ４５±画分からは４８０ｗｅｌｌ中１８ｗｅｌｌでＥＳ細胞様の細胞増殖が確認された（表１０）。これらについて例２１と同様にサザンブロット解析によりクローン分析を行った。その結果、ＣＤ４５+画分からは１クローン、ＣＤ４５±画分からは複数クローンの多能性細胞が得られた。また、ＣＤ４５陽性の血球細胞から多能性細胞が得られることが明らかとなった（図２９）。

Claims

　体細胞から多能性幹細胞を製造する方法であって、
（ａ）体細胞を、
(i)ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子もしくはこれと同等の活性を示す物質、
(ii)ＳＣＦもしくはこれと同等の活性を示す物質、
(iii)ＴＰＯもしくはこれと同等の活性を示す物質、
(iv)ＩＬ－３もしくはこれと同等の活性を示す物質、および
(v)Ｆｌｔ－３リガンドもしくはこれと同等の活性を示す物質
から選択される少なくとも２種のサイトカイン類を含む細胞培養培地中で培養する工程、ならびに
（ｂ）体細胞を脱分化させる工程
を含んでなり、工程（ａ）の後に工程（ｂ）が行われるか、または工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に行われるか、または工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に行われた後に工程（ａ）が行われる、方法。
　工程（ａ）において用いられる細胞培養培地が、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３およびＦｌｔ－３リガンドから選択される少なくとも２種のサイトカイン類を含むものである、請求項１に記載の方法。
　工程（ａ）において用いられる細胞培養培地が、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子と、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３およびＦｌｔ－３リガンドから選択される少なくとも１種のサイトカインとを含むものである、請求項１に記載の方法。
　前記ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子が、ＩＬ－６もしくはその変異体とＩＬ－６受容体もしくはその変異体とが連結された融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
　工程（ａ）において用いられる細胞培養培地が、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＩＬ－３を含むものである、請求項１に記載の方法。
　工程（ａ）において用いられる細胞培養培地が、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３、Ｆｌｔ－３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦを含むものである、請求項１に記載の方法。
　工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に行われた後に工程（ａ）が行われ、工程（ｂ）と同時に行われる工程（ａ）において用いられる細胞培養培地が、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３、Ｆｌｔ－３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦを含むものであり、工程（ｂ）の後に行われる工程（ａ）において用いられる細胞培養培地が、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＩＬ－３を含み、かつ、Ｆｌｔ－３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦを含まないものである、請求項１に記載の方法。
　工程（ｂ）における体細胞の脱分化が、該体細胞の核初期化処理によって行われる、請求項１に記載の方法。
　体細胞の核初期化処理が、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、およびＭｙｃファミリー遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子を、発現可能な形で体細胞に導入することを含む、請求項８に記載の方法。
　体細胞の核初期化処理が、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、およびＭｙｃファミリー遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子を発現可能な形で体細胞に導入した場合と同等の活性を示す物質で、体細胞を処理することを含む、請求項８に記載の方法。
　体細胞の核初期化処理が、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、およびＭｙｃファミリー遺伝子を、発現可能な形で体細胞に導入することを含む、請求項８に記載の方法。
　体細胞が骨髄由来単核球細胞である、請求項１に記載の方法。
　体細胞が血液由来単核球細胞である、請求項１に記載の方法。
　体細胞が分化血液細胞である、請求項１に記載の方法。
　体細胞が、ＩＬ－６シグナル伝達因子を発現している細胞である、請求項１に記載の方法。
　体細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
　体細胞から多能性幹細胞を製造するためのキットであって、
（ａ）以下のサイトカイン類：
(i)ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子もしくはこれと同等の活性を示す物質、
(ii)ＳＣＦもしくはこれと同等の活性を示す物質、
(iii)ＴＰＯもしくはこれと同等の活性を示す物質、
(iv)ＩＬ－３もしくはこれと同等の活性を示す物質、および
(v)Ｆｌｔ－３リガンドもしくはこれと同等の活性を示す物質
から選択される少なくとも２種のサイトカイン類を含む、体細胞を培養するための細胞培養培地、および
（ｂ）体細胞を脱分化させるための試薬
を含んでなる、キット。
　前記（ａ）の細胞培養培地が、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３およびＦｌｔ－３リガンドから選択される少なくとも２種のサイトカイン類を含むものである、請求項１７に記載のキット。
　前記（ａ）の細胞培養培地が、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３およびＦｌｔ－３リガンドから選択される少なくとも２種のサイトカイン類を含み、さらにＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦを含むものである、請求項１７に記載のキット。
　前記（ａ）の細胞培養培地が、ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子と、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３およびＦｌｔ－３リガンドから選択される少なくとも１種のサイトカインとを含むものである、請求項１７に記載のキット。
　前記ＩＬ－６シグナル伝達因子刺激因子が、ＩＬ－６もしくはその変異体とＩＬ－６受容体もしくはその変異体とが融合された融合タンパク質である、請求項１７に記載のキット。
　体細胞を脱分化させるための試薬が、Ｏｃｔファミリー遺伝子、ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、およびＭｙｃファミリー遺伝子を、発現可能な形で体細胞に導入するためのベクターを含むものである、請求項１７に記載のキット。
　体細胞が骨髄由来単核球細胞である、請求項１７に記載のキット。
　体細胞が血液由来単核球細胞である、請求項１７に記載のキット。
　体細胞が分化血液細胞である、請求項１７に記載のキット。
　体細胞が、ＩＬ－６シグナル伝達因子を発現している細胞である、請求項１７に記載のキット。
　体細胞がヒト細胞である、請求項１７に記載のキット。