JP2013507974A - 線維芽細胞からの誘導多能性幹細胞および前駆細胞の作製法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2009年10月29日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第61/256,170号の優先権の恩典を主張し、その内容は参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
本開示は線維芽細胞の再プログラミングに関する。特に本開示は、線維芽細胞に由来する前駆細胞および誘導多能性幹細胞を作製する方法、およびその方法によって作出された細胞に関する。
いくつかのグループが、Oct-4を他の因子と共に形質導入した後に、ヒト線維芽細胞を誘導多能性幹細胞(iPSC)に再プログラミングすることができることを実証している(Takahashi et al.,2007;Takahashi and Yamanaka,2006;Yu et al.,2007)。例えば皮膚線維芽細胞は、Oct-4(POU5F1)、Sox-2、Klf-4、c-Myc、Nanog、およびLin28を含む多能性因子のカクテルの異所性発現によって、多能性状態に再プログラミングすることができる(Takahashi et al.,2007;Yu et al.,2007)。さらなる研究により、Oct4を別にすれば、これらの因子の大部分は、ユニークな幹/前駆細胞の使用によって(Heng et al.;Aasen et al.2008;Eminli et al.2008;Eminli et al.2009;Kim et al.2009)、あるいは皮膚線維芽細胞源のエピゲノムを標的とする化学薬品の添加によって(Shi et al.2008;Lyssiotis et al.2009)、排除できることが示された。これらの研究は、iPSCを作製するためのアプローチおよび方法がいくつかあることを実証しているが、多能性状態への再プログラミングの基礎をなす細胞機序および分子機序は、まだ大部分が不明なままである(Jaenisch and Young,2008)。iPSCは血液細胞運命へと分化することができるが、その結果生じる造血細胞は、胚性プログラムを利用する原始血液細胞を優先的に生成する。その上、これらの方法は今なお非効率的であり、そのことが、移植または血液病のモデル化を意図することを困難にしている(Lengerke and Daley, 2010)。これらのプロセスの特徴づけは、おそらくは完全な多能性誘導にとって理想的な再プログラミング因子の正しい組合せ、化学量論、または発現レベルを達成できないせいで安定な多能性状態を樹立することができない細胞中間体により、さらに複雑になる(Chan et al.,2009;Kanawaty and Henderson,2009;Lin et al.,2009;Mikkelsen et al.,2008)。この考えと合致して、線維芽細胞に由来する中間体細胞は、いくつかの分化した系譜(ニューロン、表皮、および中胚葉)に関連する遺伝子を共発現することが示されているが(Kanawaty and Henderson,2009;Mikkelsen et al.,2008)、それでもなお、これらの細胞の正確な実体と分化能は不明なままである。このことから、線維芽細胞をニューロン、心筋細胞、およびマクロファージ様細胞などの特殊な細胞タイプへと転換することによって最近実証されたように(Feng et al.,2008;Ieda et al.,2010;Vierbuchen et al.,2010)、転写因子の小さなサブセットを発現する線維芽細胞は、ユニークな条件下で、多能性を獲得することなく、指定された系譜に分化するように誘導されうるという可能性が生まれる。これらの研究はマウスモデルにおいて線維芽細胞転換を調べたものであるが、この概念をヒトに応用するために外挿することは、まだなされていない。
本発明者らはヒト皮膚線維芽細胞を使って、線維芽細胞の造血細胞(CD45+細胞)への直接転換を研究すると共に、線維芽細胞の誘導多能性幹細胞への再プログラミングを研究した。
a)POUドメイン含有遺伝子またはタンパク質を発現するか、POUドメイン含有遺伝子またはタンパク質で処理された線維芽細胞を提供する工程;および
b)多能性状態を経ることなく前駆細胞の作出を可能にする条件下で、工程(a)の細胞を培養する工程
を含む、線維芽細胞から前駆細胞を作製する方法を提供する。
a)本明細書に記載する方法によって前駆細胞またはそれに由来する細胞の培養物を調製する工程;
b)a)の細胞を試験剤で処理する工程;および
c)処理された前駆細胞またはそれに由来する細胞を分析に供する工程
を含むスクリーニングアッセイが、さらに提供される。
a)Oct-4レポーターを過剰発現する線維芽細胞を提供する工程;および
b)前記レポーターに関して陽性である細胞を単離する工程
を含む、増加した再プログラミング能を有する線維芽細胞の亜集団を単離する方法が提供される。
a)(i)Oct-4の発現が増加している線維芽細胞の集団および(ii)線維芽細胞の混合集団またはOct-4陰性線維芽細胞の集団を提供する工程;
b)a)の細胞をOct-4、Nanog、Sox2およびLin28で処理する工程;および
c)b)の処理細胞を、iPS細胞の作出を可能にする条件下で培養する工程
を含む、再プログラミングされた線維芽細胞由来の誘導多能性幹(iPS)細胞を、より高い効率で作製する方法を提供する。
a)本明細書に記載する方法によって誘導多能性幹細胞の培養物またはそこから分化した細胞を調製する工程;
b)前記細胞を試験剤で処理する工程;および
c)処理細胞を分析に供する工程
を含む、スクリーニングアッセイが提供される。
A.前駆細胞および分化細胞への線維芽細胞の直接転換
本発明者らは、Oct-4形質導入皮膚線維芽細胞が、造血前駆細胞および神経前駆細胞を生じさせることを示した。本発明者らはさらに、造血前駆細胞が骨髄系譜を完全に再構成する能力を有することを示した。
a)POUドメイン含有遺伝子またはタンパク質を発現するか、POUドメイン含有遺伝子またはタンパク質で処理された線維芽細胞を提供する工程;および
b)多能性状態を経ることなく前駆細胞の作出を可能にする条件下で、工程(a)の細胞を培養する工程
を含む、線維芽細胞から前駆細胞を作製する方法を提供する。
a)本明細書に記載する方法によって前駆細胞または分化細胞の培養物を調製する工程;
b)前記前駆細胞または分化細胞を試験剤で処理する工程;および
c)処理された前駆細胞または分化細胞を分析に供する工程
を含む、前駆細胞または分化細胞をスクリーニングする方法を提供する。
ヒトiPSCへの細胞再プログラミングの基礎をなすヒト線維芽細胞の起源がわかっていないことを考え、本発明者らは、細胞再プログラミングプロセスとの関連で成体皮膚線維芽細胞を特徴づけようと試みた。本発明者らは、再プログラミングされた細胞の作製を担う成体ヒト皮膚線維芽細胞の亜集団を同定し、特徴づけた。
a)Oct-4レポーターを発現する線維芽細胞を提供する工程;および
b)前記レポーターに関して陽性である細胞を単離する工程
を含む、増加した再プログラミング能を有する線維芽細胞の亜集団を単離する方法を提供する。
a)(i)Oct-4の発現が増加している線維芽細胞の集団および(ii)線維芽細胞の混合集団またはOct-4陰性線維芽細胞の集団を提供する工程;
b)a)の線維芽細胞をOct-4、Sox-2、NanogおよびLin-28で処理する工程;および
c)(b)の細胞を、iPS細胞の作出を可能にする条件下で培養する工程
を含む、再プログラミングされた線維芽細胞由来の誘導多能性幹(iPS)細胞を作製する方法も提供する。
a)本明細書に記載する方法によるiPS細胞またはそこから分化した細胞の培養物を調製する工程;
b)前記細胞を試験剤で処理する工程;および
c)処理された細胞を分析に供する工程
を含む、iPS細胞またはそこから分化した細胞をスクリーニングする方法を提供する。
結果
Oct-4を形質導入したhFibsからのCD45 +ve 集団の出現
多能性に向かう再プログラミングには、奇形腫形成能を有する安定な誘導多能性幹細胞(iPSC)の希少なサブセット中にさまざまな中間体細胞の生成を包含する事象のカスケードが必要である(Takahashi et al.,2007;Takahashi and Yamanaka,2006)(図8a〜c)。これらの中間体の一部は、造血細胞に似た丸い細胞形態を有するコロニーを形成し(図9a)、ヒト汎造血マーカーCD45を発現するが(CD45+ve)、iPSCを示す多能性マーカーTra-1-60(Chan et al.,2009)の共発現を欠く(図9b〜c)。これらのヒト線維芽細胞(hFib)由来CD45+ve細胞はFACSによって単離することができ、異所性Oct-4を優先的に発現する一方、低レベルのSox-2およびNanogを示すことがわかった(図9d〜e)。これらの知見は、完全に再プログラミングされたiPSCとは異なり、hFib由来中間体が、ヒト造血マーカーCD45の獲得によって例証されるように、独特な系譜特異的表現型を獲得できたことを示している。
Oct-4のみの異所性発現が、Sox-2を内在的に発現する神経前駆細胞の多能性再プログラミングをもたらすことが示されている(Kim et al.,2009)。そこで、CD45+ve hFibsのOct-4誘導出現中に、多能性の誘導および維持に不可欠であることが知られている一群の遺伝子(Takahashi and Yamanaka,2006)の発現を調べた。Oct-4(POU5F1)のアップレギュレーション(図12a)を除けば、Oct-4形質導入はhFibsの多能性遺伝子発現プロファイルを変化させなかった(図2d)。さらに、関連POUファミリーメンバーOct-2(POU2F2)およびOct-1(POU2F1)も、影響を受けていなかった(図12b)。また、完全に再プログラミングされたiPSCの確立されたマーカー、例えばSSEA3およびTra-1-60レベルも、Oct-4誘導CD45+veコロニー出現中に、再プログラミング因子の完全なセット(Oct-4、Sox-2、Nanog、およびLin-28)を形質導入したhFibsからのiPSC派生(Yu et al.,2007)と比較して調べた。Oct-4のみを異所性発現させた場合、hFibsOct-4では、0日目から31日目までの間、SSEA3もTra-1-60も検出できなかったのに対し、多能性iPSCの樹立中はSSEA3およびTra-1-60レベルが徐々に増加した(図3a〜b、図12c〜e)。内胚葉、中胚葉、および外胚葉を生じさせることができる完全に再プログラミングされたiPSCとは異なり、同じ数のOct-4形質導入hFibsを免疫不全マウスに注入しても、奇形腫を生じさせることはできなかった(図2cおよび表1)。iPSCとは異なり、hFibsもCD45+vehFibsOct-4も不死化されなかったが、およそ7継代にわたって維持することができ(図13a)、腫瘍形成性トランスフォーミング因子c-Myc(Lebofsky and Walter,2007)の上昇を伴わなかった(図13b)。したがって、これらの結果は、hFibOct-4細胞が、検出可能な形質転換細胞または多能性細胞の表現型または機能的性質を伴うことなく、造血細胞運命選択に資する細胞運命決定を明示することを示している。
網羅的遺伝子発現解析は、CD45+vehFibsOct-4が、動員末梢血(M-PB)由来および臍帯血(UCB)由来の造血前駆細胞(CD34+ve細胞)に由来する単核球(MNC)とクラスター化することを示した(図14a〜b)。これは、CD45+vehFibsOct-4が、複数の血液細胞タイプの機能的造血能を有しうることを示唆している。機能的ヒト造血能力を明確にするために、成体および胎児CD45+vehFibsOct-4の両方を物理的に単離した後、ヒト成体造血前駆細胞発生を支持することが知られているサイトカインカクテル(Wang et al.,2005)と共に培養し(図4a)、続いてCD45+vehFibsOct-4を増大させた(図14c〜d)。その結果生じた子孫はCD45発現を保ち、骨髄特異的マーカーCD33およびCD13を獲得した(図4bおよび図15)。CD45+vehFibsOct-4子孫のサブフラクションは、CD14を発現する単球を含み(図4c〜dおよび図16a)、これは、M-CSFおよびIL-4に対する応答性により、食作用能を有するマクロファージへと機能的に成熟するように、さらに刺激することができる(Silverstein et al.,1977)。CD45+vehFibsOct-4由来単球は、FACS(図4e)および免疫蛍光分析(図4fおよび図16b)によって示されるとおり、FITC標識ラテックスビーズを貪食することができたが、非形質導入サイトカイン処理hFibsはこのユニークな性質を欠いていた(図4e)。複数のhFibs供給源(成体および胎児)に由来する造血サイトカイン処理CD45+vehFibsOct-4は、顆粒球マーカーCD15の発現(図4gおよび図17b)ならびに好中球、好酸球、および好塩基球を含む顆粒球サブタイプに関連する特徴的な細胞形態および多核形態(図4hおよび図17c)によって示されるように、単球細胞とは異なる顆粒球細胞も生じさせることができた(図17a)。サイトカインがない場合、CD45+vehFibsOct-4細胞はCD45発現を保ったが、骨髄特異的マーカーは有意に減少し、単球系譜および顆粒球系譜は存在しなかった(図18a〜b)。これらの結果は、CD45+vehFibsOct-4からの造血性増大と成熟にはサイトカイン刺激が必要であることを示している。
CD45+vehFibsOct-4から全ての骨髄系譜を導出することができるにもかかわらず、赤血球系細胞は検出されなかった。エリスロポエチン(EPO)は初期赤血球分化を誘導することが示されているので(Fried,2009)、CD45+vehFibsOct-4からの赤血球系細胞派生を誘導するためにこれを選択した。Oct-4を形質導入すると、hFibsは、赤芽球マーカーCD71を40%近い頻度で発現し(図6a)、EPO誘導後は、それが2倍増加した。また、EPOで処理すると、グリコホリンA(赤血球機能に必要な決定的膜タンパク質)の発現(図6b)およびヒト成体β-グロビンタンパク質(赤血球による酸素輸送にユニークに必要)の発現(図6c)も誘導された。非形質導入hFibs(図6c)およびhPSCに由来する造血細胞(図6c挿入図)はβ-グロビンタンパク質レベルを欠いていた。EPOの非存在下では、CD45+vehFibsOct-4においてβ-グロビン転写産物だけが発現され(図5d)、β-グロビンタンパク質は検出できなかった(図6c)。対照的に、そしてまた、hPSCに由来する造血細胞とは異なり(Cerdan et al.,2004;Perlingeiro et al.,2001)、CD45+vehFibsOct-4に由来する造血細胞は、胚型(ゼータ)グロビン発現を欠き、あまり高レベルでない胎児型(イプシロン)グロビンを発現するにすぎなかった(図6d)。EPO処理CD45+vehFibsOct-4は、原始赤血球と成熟赤血球(脱核)の形態をどちらも呈し(図6e)、単球または顆粒球前駆細胞能力の低下を伴わずに、UCBで観察されるものに似たコロニー形成(BFU-E)およびCFU-混合コロニー(CFU-Mix;二重骨髄および赤血球能力)によって検出される赤血球前駆細胞出現を可能にした(図6f〜g、図22a〜b)。BFU-E能および成体型β-グロビンタンパク質と脱核赤血球の両方の存在とに基づけば、EPO処理CD45+vehFibsOct-4は、造血細胞運命へのhFibsの転換中に、二次的(成体型)であって一次的(胚性)でない造血プログラムを利用するのだろう(Orkin and Zon,2002)。
hFibsの造血転換中のPOUドメイン含有タンパク質Oct-4の役割をより広く理解するために、遺伝子発現プロファイルならびに造血因子、非造血因子および多能性因子のOct-4プロモーター占有を、CD45+ve細胞の出現および成熟の時間経過に沿って調べた(図7a)。網羅的遺伝子発現解析は、転写活性化および転写抑制の両方にいくつかの変化を示した。Oct-4形質導入後4日目には早くも、代謝プロセスおよび発生プロセスを含む数多くの分子パスウェイに有意な変化が起こる(図23a)。さらにまた、CD45+ve細胞出現の経過に沿った3つの時点(hFibs(0日目)、CD45+vehFibsOct-4(4日目)およびCD45+vehFibsOct-4(21日目))で調べたhFibsの網羅的遺伝子発現は、線維芽細胞特異的遺伝子発現(Yu et al.,2007)の減少を示したが(図7b)、予想できるOct-4の増加(POU5F1特異的プローブセット)を除けば、多能性遺伝子の誘導は起こらなかった(図7c)。Oct-4形質導入hFibsは、直ちに、サイトカインに対する応答性に必要ないくつかの造血サイトカイン受容体(それぞれFLT3LおよびSCFのFlt3受容体およびc-kit受容体を含む)のアップレギュレーションを示した(図7d)。また、初期ヒト造血発生に関連する転写因子もアップレギュレートされた(図7eおよび図23b〜c)。これらのデータは、Oct-4が、hFibsにおいて、造血細胞運命転換を編成する分子変換のカスケードを誘導することを示している。
本実施例は、ヒト成体皮膚および胎児包皮線維芽細胞が、Oct-4依存的細胞プログラミングにより、多能性状態を経ることなくまたは中胚葉経路の活性化を伴うことなく(Tsai et al.,1994;Vijayaragavan et al.,2009)、骨髄、赤血球および巨核球血液細胞運命の多能性造血細胞に直接転換されうることを実証している。さらにまた、一次造血から二次造血への遷移が、胚型ヘモグロビン発現から成体型ヘモグロビン発現へのシフトによって叙述されることを考えると(Orkin and Zon,2002)、CD45+ve線維芽細胞は、hPSC由来の造血細胞とは異なり(Chang et al.,2006)、もっぱら成体型のグロビンタンパク質および造血遺伝子プロファイルを獲得することが実証され、それは、この転換プロセス中に、二次造血プログラムが動員されていることを示している。
細胞培養-
初代ヒト皮膚成体線維芽細胞は胸部皮膚組織に由来し、胎児線維芽細胞は包皮組織に由来し、まず、Oct-4レンチウイルスベクターによる形質導入前は、線維芽細胞培地(10% v/v FBS(ウシ胎児血清、HyClone)、1mM L-グルタミン(Gibco)、1% v/v 非必須アミノ酸(NEAA;Gibco)が補われたDMEM(Gibco))中で維持した。Oct-4を形質導入したヒト皮膚線維芽細胞は、16ng/ml bFGF(BD Biosciences)および30ng/ml IGFII(Millipore)を含有する10%ノックアウト(knockout)血清代替物(Gibco)、1%非必須アミノ酸(Gibco)、1mM L-グルタミン(Gibco)、および0.1mMβ-メルカプトエタノールが補われた完全F12培地(F12 DMEM;Gibco)中、または16ng/ml bFGFおよび30ng/ml IGFIIを含有し、300ng/ml Flt-3(R&D Systems)および300ng/ml幹細胞因子(SCF;R&D Systems)が補われた完全F12培地中、マトリゲル・コート・ディッシュ上で、21日間、維持した。生成するCD45+ve Oct形質導入細胞を、低接着24ウェルプレート上に移し、80%ノックアウトDMEM(KO-DMEM)(Gibco)、20% v/v非熱不活化ウシ胎児血清(FCS)(HyClone)、1% v/v非必須アミノ酸、1mM L-グルタミン、および0.1mMβ-メルカプトエタノール(Sigma)からなる造血培地中で、16日間培養した。培養物を、サイトカイン(SCF、G-CSF、Flt3、IL-3、IL-6およびBMP-4;R&D Systems)を含む造血分化培地で置き換えるか、赤血球/巨核球分化の場合は、培地に造血サイトカイン+3U/ml EPOを補い、4日ごとに交換した後、分子分析および機能分析のために収集した。
Oct-4、Nanog、Sox-2およびLin-28のcDNAを含有するレンチウイルスベクター(pSIN)をAddgeneから入手した。これらのベクターを293-FTパッケージ細胞株にビラパワー(virapower)と共にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後にウイルス上清を収集し、超遠心分離してウイルスを濃縮した。線維芽細胞形質導入には8μg/mlポリブレンの存在下で等量の各ウイルスを使った。
単一の転写因子を含有する細胞を作製するために、ヒト成体皮膚線維芽細胞(Fibs)(胸部皮膚に由来するもの;年齢30〜40歳)または胎児包皮Fibsを、10,000細胞/ウェルの密度で、マトリゲルコート12ウェルプレートに播種した。播種の24時間後に、Fibsを、Oct-4またはNanogまたはSox-2を発現するレンチウイルスに感染させた(NanogおよびSox-2形質導入は成体皮膚Fibsについてのみ行った)。次に、形質導入された線維芽細胞を、300ng/ml Flt-3および300ng/ml SCFが補われた16ng/ml bFGFおよび30ng/ml IGFIIを含有する完全F12培地中、または16ng/ml bFGFおよび30ng/ml IGFIIのみを含有する完全F12培地中で、最長21日まで成長させた。出現するCD45+veコロニーを感染の14〜21日後に計数した。コロニーを手作業で拾い、マトリゲル・コート・ウェル上で維持した。分子分析を、精製非形質導入Fibs(D0)、4日目(D4)のOct-4形質導入Fibs、21日目(D21)のCD45+ve Fibs、および37日目(D37)の造血サイトカイン処理したまたは無処理のCD45+ve Fibsについて行った。Oct-4形質導入後4日目は、次に挙げるいくつかの基準に基づき、初期事象時点として選択した:a,形質導入後の回復のための最適な時間;b,培養内での目に見える形態変化;およびc,正常な細胞周期動態の再開。4日目のOct-4形質導入Fibs(D4)を、終夜のピューロマイシン選択によって単離し(Oct-4ベクターはピューロマイシン耐性カセットを含有する)、試料の純度をOct-4に関する染色と、それに続くフローサイトメトリーを使ったOct-4発現解析によって検証したところ、分子分析に使用した試料は99%のOct-4レベルを呈した。21日目(D21)および37日目(D37)のCD45+veFibsOct-4は、それらのCD45発現に基づいて単離した。D21およびD37細胞をCD45-APC抗体(BD Biosciences)で染色し、FACSAria II(Becton-Dickinson)を使ってソートしたところ、分子分析に使用した試料は99%のCD45レベルを呈した。
線維芽細胞から再プログラミングされた細胞を作製するために、細胞を、10,000細胞/ウェルの密度で、マトリゲルコート12ウェルプレート上に播種した。播種の24時間後に、線維芽細胞に、Oct-4/Nanog/Sox-2/Lin-28を発現するレンチウイルス(Yu et al.2007)を形質導入した。次に、形質導入された線維芽細胞を、30ng/ml IGFIIおよび16ng/ml bFGFが補われたF12培地で成長させた。再プログラミングされたiPSCコロニーを、感染の4週間後に計数した。コロニーを手作業で拾い、マトリゲル・コート・ウェル上で維持した。
生細胞染色のために、滅菌Tra-1-60抗体(Millipore)を滅菌Alexa Fluor-647と室温でプレコンジュゲートした。再プログラミングされたコロニーをF12培地で1回洗浄し、Tra-1-60-Alexa 647抗体と共に、室温で30分間インキュベートした。次に培養物を2回洗浄して未結合の抗体を除去した。細胞をオリンパスIX81蛍光顕微鏡で可視化した。
多能性マーカー発現については、細胞をコラゲナーゼIVで処理してから、細胞解離バッファー中に37℃で10分間入れた(Gibco)。その細胞懸濁液を、SSEA3抗体(1:100)(Developmental Studies Hybridoma Bank、mABクローンMC-631、University of Iowa、アイオワ州アイオワシティ)またはTra-1-60-PE(1:100)抗体(BD Biosciences)で染色した。SSEA3染色にはAlexa Fluor-647ヤギ抗ラットIgM(1:1000)(Molecular Probes、Invitrogen)を二次抗体として使用した。生細胞を7-アミノアクチノマイシン(7AAD)排除によって同定してから、FACSCalibur(Becton-Dickinson)を使って細胞表面マーカーについて分析した。収集した事象をFlowJo 8.8.6ソフトウェア(Tree Star Inc.)を使って分析した。
Norgen RNA単離キットを使って全RNAを単離した。次に、RNAを、スーパースクリプト(superscript)III(Invitrogen)を用いるcDNA合成に供した。定量PCR(qPCR)は、Platinum SYBR Green-UDPミックス(Invitrogen)を使って行った。試料を分析するために、閾値をGus-B(ベータ-グルクロニダーゼ)(Oschima et al.1987)の検出に設定し、次に内部対照GAPDHに対して規格化した。この実験のベースラインは、線維芽細胞において観察される遺伝子発現レベルに設定した。この線維芽細胞の出発集団内での遺伝子の一部の発現を考慮して、これらの細胞の遺伝子発現パターンを含めた。したがってデータは、デルタサイクル閾値(ΔC(t))対デルタΔC(t)(ΔΔC(t))として表す。(qPCRプライマー配列は表5に記載する)。
ヒト皮膚線維芽細胞(2レプリケート)、ピューロマイシン選択4日目Oct-4形質導入線維芽細胞(2レプリケート)およびソートしたCD45+ve細胞(2レプリケート)から、全RNA精製キット(Norgen)を使って全RNAを抽出した。Bioanalyzer(Agilent Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ)を使ってRNAの完全性を評価した。試料の標識とHuman Gene 1.0STアレイ(Affymetrix)へのハイブリダイゼーションは、Ottawa Health Research Institute Microarray Core Facilit(OHRI;カナダ・オタワ州)によって行われた。Affymetrixデータは、Affymetrix Expression Consoleに実装されているロバスト・マルチ-アベレージ(robust multi-average:RMA)法で抽出し、規格化し、要約した。データの規格化、シグナル強度の抽出およびプローブレベル解析のために、CELファイルをdChIPソフトウェア(Li and Wong 2001)にインポートした。
ChIPは先に記述されているように行った(Rampalli et al.2007)。簡単に述べると、ヒト多能性細胞(H9およびiPSC1.2)、ヒト皮膚線維芽細胞、ピューロマイシン選択4日目Oct-4形質導入細胞、ソートした21日目CD45+ve細胞を、1%ホルムアルデヒドを使って架橋した。0.1%SDSを含有するバッファー中でクロマチンを消化して、およそ1000bp長のフラグメントを得た。超音波処理したDNAを、抗Oct4(ChIP用抗体;Cell Signaling Technology)および抗ウサギIgG抗体(Santacruz Biotechnology)を用いる免疫沈降に供した。免疫沈降したDNAをさらに脱架橋(reverse cross-link)し、精製し、UDG-Platinium Syber Greenミックス(Invitrogen)を用いるqPCR解析に供した。プロモーター特異的ChIPプライマーを表6に列挙する。相対的濃縮度を計算するために、対照抗体に観察されるシグナルを、特異的抗体から検出されるシグナルから差し引き、得られた差を、50分の1のChIP投入材料から観察されたシグナルで割った。
ヒト巨核球を検出するために、MegaCult(商標)-C Complete Kit with Cytokines(Stem Cell Technologies)を使用した。巨核球の派生は、キットに同梱されている説明書に従って行った。キットには、巨核球CFUの最適な成長のために前もって選択されたトロンボポエチン(TPO)、インターロイキン3(IL-3)、IL-6、IL-11およびSCFなどの構成要素、成長用のチャンバースライド、およびその後の免疫細胞化学染色のための抗体が含まれている。手短に言えば、10,000個のCD45+ve EPO処理細胞を、上述した成長因子のカクテルを含有するMegaCult培地にプレーティングした。ヒトCFU-Mkは10〜15日目までに検出可能になり、続いてそれらをプロトコールに従って固定し、染色した。二次ビオチン化抗体に連結されたMk特異的抗原GPIIb/IIIa(CD41)-アルカリ・ホスファターゼ・アビジン・コンジュゲート検出系を使用した。この場合、Mk-CFUは赤/ピンク色であった。
1000個のCD45+ve Oct-4形質導入細胞を冷2%FBS/PBSで2回洗浄し、500μlの冷1%FBS/PBSに希釈した。試料をCytospinの適当なウェルにローディングした。試料を500rpmで5分間遠心して、スライドに付着させた。スライドをメタノールで1分間固定し、30分間乾燥させた。次に、スライドをGiemsa-Wright染色液で3分間染色した後、PBS中に10分間置き、蒸留水中で手早く洗浄した。スライドを終夜乾燥させ、封入材(Dako)で封入した。スライドをオリンパスIX81顕微鏡で見た。
フルオレセイン(FITC)コンジュゲート・ラテックス・ビーズ(Sigma)を、IL-4およびM-CSFで処理したCD45+FibsOct-4細胞に由来する単球による食作用を分析するための粒子トレーサーとして使用した。食作用を測定するために、3%FBS/PBSに懸濁した10μlのパックトビーズ(packed beads)を、テフロンチューブ中の106個の細胞に加えた。37℃で90分間のインキュベーション後に、遊離のビーズを除去するために、3%FBSおよび0.1%EDTAを含有する冷PBSで、細胞を3回洗浄した。次に、FITCビーズの取り込みを伴うCD45の発現を検出するために細胞を標識し(APCコンジュゲートCD45 mAb)、FACSCalibur(BD)を用いるフローサイトメトリーで分析するか、組織培養用スライド(VWR)上に1000個の細胞をサイトスピンすることによって視覚化し、オリンパスIX81蛍光顕微鏡で見た。
細胞を、FACSAria IIでソートした(Becton-Dickinson)CD45+CD34+細胞1,000個または全細胞(EPO処理)5000個の密度で、1mlのMethocult GF H4434(Stem Cell Technologies、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー)にプレーティングした。14日間の培養後に、標準的形態基準を使ってコロニーをスコア化し、FACSCalibur(Becton-Dickinson)を使って造血表面マーカーについて分析した。収集した事象はFlowJo 8.8.6ソフトウェア(Tree Star Inc.)を使って分析した。異種移植由来生着細胞からのコロニー派生については、細胞を、まず最初にHLA-A/B/C(BD Biosciences)に基づいてソートし、次に、ヒト特異的抗CD45(BD Biosciences)を使って、CD45発現についてソートした。次に、HLA-A/B/CおよびCD45二重陽性細胞を、Methocult GF H4434に、1000細胞/mlの密度でプレーティングした。さらに、生着細胞に由来するコロニーを、FACSAria II(Becton-Dickinson)を使って、造血表面マーカーについて分析した。収集した事象は、FlowJo 8.8.6ソフトウェア(Tree Star Inc.)を使って分析した。
移植の24時間前に、NOD/SCID IL2Rγcヌル成体マウス(NSG)に、325ラドを亜致死的に照射した。5.0×105個のCD45+ve Oct形質導入(D37)またはヒト皮膚線維芽細胞またはヒト動員末梢血またはヒト臍帯血系譜枯渇(lineage depleted)細胞を大腿骨内注入によって移植した。10週間後に、動物を選別し、注入を受けた大腿骨、対側骨および脾臓からの骨髄(BM)を、フローサイトメトリー(FACSCalibur、Becton-Dickinson)と、それに続くFlowJo 8.8.6ソフトウェア(Tree Star Inc.)を使ったデータ解析により、ヒト細胞の存在について分析した。HLA-A/B/CおよびCD45について陽性な細胞を、CD14などの造血系譜特異的マーカーの発現について分析した。二次移植については、全生着骨髄細胞を、一次移植について説明した成体照射NSGマウスに、静脈内移植(IV注入)した。次に、生着細胞からのゲノムDNAを、次に挙げるヒト17番染色体のα-サテライトに特異的なプライマー:
により、従来のPCRを使って分析した。
全ての手法とプロトコールはMcMaster University Animal Care Councilによって承認された。成体皮膚線維芽細胞、胎児皮膚(包皮)線維芽細胞、CD45+ve Oct-4形質導入成体皮膚線維芽細胞、CD45+ve Oct-4形質導入胎児線維芽細胞およびiPSC1.1〜1.4を、コラゲナーゼIVで5〜10分間処理した後、収集し、食塩水で2回洗浄し、食塩水に再懸濁した。1試料あたり500,000個の細胞を、雄NOD-SCIDマウスに精巣内注入した。最初の注入の10〜12週間後にマウスを屠殺した。奇形腫を摘出し、パラフィンに包埋し、5μm間隔で薄切した後、キシレン中で脱パラフィン化し、段階的な一連のアルコール濃度で処理した。試料を、ヘマトキシリンおよびエオシンまたはOct4で染色してから、脱水およびキシレン処理を行った。Permountを使ってスライドを封入し、Aperio Scan Scopeを使ってスライドをスキャンすることによって撮像し、Image Scope v9.0.19.1516.ソフトウェアを使って、画像をキャプチャした。転移細胞の存在を調べるために、肺、脾臓、肝臓、脳および腎臓を含むさまざまな臓器からも組織を集めた。各胚葉サブタイプに特異的な、厳格な組織学的および形態学的基準に基づいて、組織タイピングを行った。骨などの中胚葉系譜は、骨細胞および骨片(bone spicule)の存在を使って同定し;軟骨は軟骨細胞の存在および細胞外マトリックスの特異的染色によって同定した。腸管腔などの内胚葉系譜は、管腔上皮における杯細胞の存在によって同定した。皮膚などの外胚葉系譜は、特色のある細胞層形態(すなわち層状)に基づいて同定し;脳または神経管は、特異的な組織学的基準に基づいて同定した。胚葉の存在および組織タイピングはMcMaster Pathologyによって確認された。
全ての検定はInStat Version 3.0a統計ソフトウェア(GraphPad Software)を使って行った。平均およびs.e.mを含む記述統計を、一元配置ANOVA、独立サンプル両側t検定と共に使用して、有意差を決定した。p<0.01を有意と見なした。
結果
ヒト皮膚線維芽細胞は希少な亜集団を含有する
転写因子Oct4およびSox2は共通するDNA結合モチーフを持っており、多能性ネットワークに関連付けられる遺伝子のエンハンサーおよびプロモーター領域を調節する(Loh et al.2006;Kim et al.2008)。ヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト線維芽細胞(hFibs)に、三量体化(C3+)Oct4エンハンサーエレメントを含有する最近報告されたEOSレンチウイルスベクター(図25a)を形質導入した(Hotta et al.2009)。GFP発現がpGKプロモーターによって制御される陽性対照ベクターを使うと、GFP発現(GFP+ve)細胞は顕微鏡で容易に検出することができ(図25b)、フローサイトメトリーで定量されるhFibsまたはhESCへの総レンチウイルス形質導入効率は50〜60%だった(図25cおよび図32a)。プロモーターエレメントを欠く陰性対照ベクターを使用した場合、hFibsでも、hESCでも、顕微鏡(図25b)またはフローサイトメトリー分析(図25c)を使ってGFP発現を検出することはできなかった。予想どおり、C3+EOSベクターが形質導入されたGFP+ve hESCは高頻度に観察された(図25b、cおよび図32b)。しかし、成体胸部由来hFibsへのC3+EOS形質導入は、GFPを発現する皮膚線維外細胞の希少な集団を明らかにした(図25b、c)。希少なGFP+ve hFibsを示すC3+EOSを形質導入したhFib培養物の共焦点Zスタックイメージングは、培養物中に存在する他のhFibsとは形態的にも空間的にも異なっている(図32c)。hFibsのこの亜集団の検出は、個々の細胞における高コピー数組込みによるものではなかった。というのも、異なる濃度のEOSレンチウイルスを使ってhFibsの形質導入を行ってもGFP+ve hFibsの頻度は変化せず、一方、個々のGFP+ve hFibsは、細胞単位では、ウイルス濃度とは無関係に、識別することが不可能なGFPレベルを発現したからである(図32d〜f)。インビトロ培養線維芽細胞の組成はそれが由来する組織に依存して変動することを考え、ヒト新生児包皮由来および成体肺由来の線維芽細胞というユニークな供給源(どちらも組織特異的な皮膚幹細胞集団を含有する毛包を欠くもの)を調べた(Terunuma et al.2008)。成体胸部由来皮膚hFibsと同様に、C3+EOSベクターを形質導入した包皮および肺線維芽細胞は、GFP+veサブセットを0.5〜4%の頻度で含有したことから、GFP+veサブセットの存在はヒト線維芽細胞供給源に依存しないことが示された(図25d、e)。
多能性幹細胞(PSC)の他に、Oct4発現は、真皮、多能性幹細胞、およびがん細胞を含む複数の体細胞組織でも報告されているが(Li et al.;Jiang et al.2002;Goolsby et al.2003;Dyce et al.2004;Johnson et al.2005;Moriscot et al.2005;Zhang et al.2005;D'lppolito et al.2006;Dyce et al.2006;Izadpanah et al.2006;Nayernia et al.2006;Ren et al.2006;Yu et al.2006;Izadpanah et al.2008)、非PSCにおけるOct4の代用性(surrogacy)および機能はまだ不明である(Lengner et al.2007;Lengner et al.2008)。C3+EOSベクターの活性化がOct4の存在に基づくことから、Oct4の発現を、全hFibsにおいて、また、GFP+ve hFibサブセットとGFP-ve hFibサブセットとを対比して、注意深く調べた。いくつかのOct4アイソフォームおよび偽遺伝子は配列類似性を有し(Atlasi et al.2008)、転写産物検出の解釈を複雑にし、潜在的に偽陽性をもたらす。そこで、1)Oct4;2)Oct4B1胚特異的Oct4アイソフォーム;および3)Oct4B細胞質変異体を正確に認識する最近特徴づけられた(Atlasi et al.2008)複数のプライマーセットを使って、hFibs中のOct4転写産物を同定した(図26a)。GFP+ve hFibsでは、hESC対照と同様に、Oct4およびそのアイソフォームB1の発現が濃縮されたが、細胞質アイソフォームOct4Bの発現はなかったのに対し(図26b、c)、全hFibsおよびGFP-ve hFibsは、どの形態のOct転写産物も発現しなかった(図26b、c)。系譜特異的遺伝子発現の対照として使用した中胚葉遺伝子ブラキュリは差次的に発現しなかった(図26c)。次に、GFP+ve hFibsが、Oct4および多能性に関連する他の遺伝子を発現する可能性を調べた。定量的遺伝子発現解析により、hESCと比較すると低レベルではあるものの(図25e)、Oct4(図26b、c)に加えて、GFP+ve hFibsにおけるNanogおよびSox2の発現も示された(図26d)。全hFibsとGFP+veおよびGFP-ve hFibsからの全ゲノム発現プロファイルをhESC、iPSC株と、3'オリゴヌクレオチドアレイを使って比較し、ヒトおよびマウスESCに特異的な遺伝子の発現と、不均質な線維芽細胞培養物に関連する遺伝子の発現とを対比して評価した(Takahashi et al.2007;Yu et al.2007)。GFP-ve hFibsが不均質なヒト皮膚線維芽細胞の複数の供給源と強くクラスター化したのに対し、GFP+ve hFibsは、それらが由来する全hFibsとクラスター化せず、その代わりに多能性hESCおよびiPSC株とクラスター化した(図26f)。
NOS+exp hFibsは、遺伝子発現の際立った特徴を、完全に再プログラミングされたiPSCと共有しているので、それらの機能的再プログラミング能力を、全hFibsと比較して調べた。iPSC株の大半は不均質なhFibsを使って導出され、iPSC作製を支持するためにマウス胚性線維芽細胞(MEF)を使用する(Park et al.2008)。しかし、iPSCの臨床的応用には、ゼノフリー(xeno-free)条件と、MEFなどの支持細胞からのヒトiPSCの迅速かつ簡便な単離および分離を可能にする方法とが必要になるであろう。この用途に基づく制限に具体的に対処するために、図27aに模式的に図解するように、フィーダーフリー条件を使ってマトリゲル上でヒトiPSCを導出した。全hFibsおよびNOS+exp hFibsに、先に規定された再プログラミング因子(Hotta et al.2009)を形質導入し、培養物を位相差顕微鏡と生細胞蛍光顕微鏡の両方で調べることにより、形態変化を特徴づけ、コロニー形成を同定し、Tra1-60を発現するコロニーのサブフラクションを同定した。ヒトiPSC作製に関して以前に報告された頻度と合致して(Utikal et al.2009;Aasen et al.2008;Meissner et al.2007)、全hFibsが(投入細胞10,000個につき)約0.9%のコロニー形成効率を呈したのに対し、同じ数の高度に精製されたNOS+exp hFibs単離物は、コロニーを形成することができなかった(図27b)。この結果は、6つの独立した実験レプリケートにおいて一貫して観察されたことから、分析した60,000個(10,000個×6)を越えるNOS+exp hFibsからは、iPSC生成に向かう増殖性コロニーの形成を、この精製サブセットを使って導き出すことはできなかったことが示された。
精製NOS+exp hFibsは、不均質な全hFibsの培養物から単離すると、再プログラミングされたコロニーを生成することができなかった(図27b)。ニッチが幹細胞の性質の調節に及ぼす十分に確立された効果を考慮して(Bendall et al.2007)、NOS+exp亜集団の再プログラミング能は、高度に精製されたNOS+exp hFibsからのiPSC出現を妨げる複雑な微小環境キューに依存するのかもしれないという仮説を立てた。NOS+exp hFibsにはEOSベクターが形質導入されているので、GFPおよびプロウイルス組込みが、NOS+exp細胞の蛍光マーカーおよび分子マーカーとなり、それらを使って、不均質な線維芽細胞と共に共培養した時のNOS+exp hFibsの寄与を識別することができる。確立された基準(図27b〜g)を使って再プログラミング能およびiPSC生成への寄与を測定するために、競合アッセイにおいて、NOS+exp hFibsを、全hFibsと1:9の比で混合した。
10%のNOS+exp hFibsと90%の全hFibsとを含有する共培養物において、精製NOS+exp hFibsは、不均質な全hFibsが提供する微小環境の存在下で、iPSCコロニーを生成した(図28)。そこで、微小環境組成が、NOS+exp hFibの相対的細胞密度の産物として、有素因集団の再プログラミング頻度に影響を及ぼしうるかどうかを探究した。全hFibsに対するNOS+exp hFibsの相対的濃縮密度をある範囲にわたって使用し、再プログラミング能力をコロニー形成によって調べ、NOS+exp hFibの寄与をGFP発現によって識別した。50%に向かうNOS+exp hFibsの密度の増加は、再プログラミング効率に関して、プラトーを示した(図29a)。このプラトーを越えると、NOS+exp hFibs再プログラミング能力は、支持性全hFibの比率が低下するにつれて低下し、最終的には、支持性全hFibsがなくなるとコロニー形成が完全になくなった(図29a)。混合物中のNOS+exp hFibsの密度を<2.5%まで低下させると、全hFibsに由来する低頻度のiPSC生成(図27a〜g)を思わせるコロニー生成の減少が起こった(図30a)。これらの結果から、NOS+exp hFibsの再プログラミング能力は、微小環境または支持性ニッチ細胞に対する相対的な比密度に依存することが示唆された。
以前の研究により、毛包のバルジ領域(バルジ幹細胞)、毛包間表皮(IFE幹細胞)、真皮乳頭(SKP)を含む皮膚のさまざまな領域からの多能性幹細胞の単離が実証されている(Manabu Ohyama 2006;Biernaskie et al.2009;Jensen et al.2009)。NOS+exp hFibsと、皮膚から単離された、以前に記載された多能性幹/前駆細胞との、潜在的類似性を評価するために、hFibsのこのユニークな集団を、網羅的ゲノム発現プロファイルに基づいて、さらに調べた。線維芽細胞遺伝子シグネチャーおよび個々の皮膚幹/前駆細胞に特異的な分子マーカーを使って、バルジ幹細胞、ケラチノサイト、およびSKP(Toma et al.2005;Manabu Ohyama 2006;Jensen et al.2009)と比較した全hFibs、NOS+exp hFibs、およびNOS-exp hFibsの階層的クラスタリング(図30a)により、NOS+exp hFibsは既存の皮膚幹/前駆細胞とは異なること、そして、Nanog、Oct4、およびSox2を含む多能性転写ネットワークをそれらが発現する点で、さらに識別されることが明らかになった(図30a)。皮膚由来の幹/前駆細胞に加えて、神経、造血、およびケラチノサイト前駆細胞も、増進した再プログラミング能を有することが示されている(Aasen et al.2008;Eminli et al.2009)。そこで、NOS+exp hFibsの網羅的分子表現型を、これらの系譜特異的成体幹細胞と比較したところ、NOS+exp hFibsはこれらの幹細胞タイプとクラスター化しないことが示された(図29b)。総合すると、これらの分析は、NOS+exp hFibsが、増進した再プログラミングを起こすとされている真皮派生物または組織特異的前駆細胞と以前に関連付けられた幹/前駆細胞とは、異なることを示している(図29b)。
多能性再プログラミングを理解し増進するための臨床的に妥当なモデル系として、ヒト皮膚線維芽細胞を使用することにより、多能性細胞との分子的類似性と多能性再プログラミングの助けになる固有の細胞周期状態とを有する有素因細胞集団の存在に関する証拠が得られ、理論に束縛されることは望まないが、再プログラミングプロセスにおけるこれらの細胞の役割に関するモデルが提唱される(図31)。これらの有素因ヒト皮膚線維芽細胞は、細胞周期活性化因子(例えばCCNB1/2、PCNA、MCM2-7、およびANAPC1)の増進した発現を含むユニークな細胞周期特性を有し、Nanog、Oct4、およびSox2の発現によって同定され、識別されるので、NOS+exp hFibsと呼ばれる(図31)。NOS+exp hFibsのユニークな分子的およびエピジェネティック的基底状態は、線維芽細胞の不均質な培養物または増進した再プログラミング能力を有する以前報告された幹/前駆細胞集団とは異なり、ヒトiPSCおよびESCに似ている。残りのhFibs(NOS-exp)は、支持性ニッチとの共培養または長期にわたる培養期間にも関わらず、iPSCへの再プログラミングには参加しない(図31)。それでもなお、例えばがん遺伝子の導入または細胞周期調節因子の撹乱など何らかのユニークな条件によって多能性が誘導されうる可能性は排除されない(図31)。幹/前駆細胞および増進した増殖状態はどちらもiPSC生成に正の影響を与えるので、固有の細胞周期特性を持つここで同定されたNOS+exp hFibsに似た細胞タイプは、効率の良い増進された再プログラミングを受けやすい。この考えと合致して、Smithらが公表した最近の研究(Smith et al.2010)は、MEFの急速に分裂する小サブフラクションがiPSCコロニー形成に寄与することの証拠を提出しているが、それ以上の特徴づけは行われていない。それはおそらく、MEF中のそれらユニークな細胞タイプを特定し単離することが現時点ではできないからであろう。再プログラミングは、新しい多能性状態を樹立するために必要な、ターゲット細胞の既存のエピジェネティック状態または細胞「記憶」の除去であると考えられるので、hPSCと類似するNOS+exp hFibsの分子表現型およびエピジェネティック状態を考慮すると、再プログラミングが最終分化した線維芽細胞を転換する程度と、多能性の達成に不可欠な限定的拘束ステップの克服との対比については、さらなる概念的および実験的検討が必要である。これらの結果は、多能性状態を樹立するのに必要な誘導性の分子変化に応答する能力を有素因細胞のエリートサブセットがユニークに有するという、細胞レベルでの再プログラミング誘導を説明するためのエリート・ストカスティック・モデル(elite stochastic model)を支持している。
細胞培養-
成体ヒト皮膚線維芽細胞は胸部皮膚に由来し(第1継代で入手;推奨増大量-細胞集団倍加数15)、新生児皮膚線維芽細胞は包皮に由来し(第1継代で入手;推奨増大量-細胞集団倍加数15)、肺線維芽細胞は肺組織に由来し(第10継代で入手;推奨増大量-細胞集団倍加数24)[Sciencell]、線維芽細胞培地(10%FBS(HyClone)、L-グルタミン(Gibco)、非必須アミノ酸(NEAA;Gibco)が補われたDMEM(Gibco))中で維持した。実験は全て、別段の言及がない限り、胸部由来皮膚線維芽細胞を使って行った。ヒトiPS細胞は、16ng/ml bFGF(BD Biosciences)が補われたiPS培地(20%ノックアウト血清代替物(Gibco)、L-グルタミン(Gibco)、NEAA、ベータ-メルカプトエタノールが補われたF12 DMEM(Gibco))中、マトリゲル・コート・ディッシュ上で維持した。hESCは、8ng/ml bFGFが補われたMEF条件培地中、マトリゲル・コート・ディッシュ上で維持した。多能性細胞に、さまざまな濃度のEOS C3+レンチウイルスを、継代後2日目に形質導入した。293細胞は、10%ウシ胎児血清、必須アミノ酸およびL-グルタミンを含有するDMEM中で培養した。トランスフェクションに先だって、293細胞をチャンバースライドに播種した。1μgのpSIN-Oct4ベクターをリポフェクトアミン2000試薬(Invitrogen)を使ってトランスフェクトした。実験はトランスフェクションの36時間後に行った。培養NOS+exp hFibsを作製するために、成体皮膚線維芽細胞にEOS C3+Oct4レンチウイルスベクターを形質導入し、NOS+exp細胞をソートし、線維芽細胞培地中で少なくとも5継代は培養した。
レンチウイルスpSIN-EGFP、pSIN-PGK-EGFPおよびpSIN-C3+EOSベクターは、Hottaら2008によって合成され、記述された。Oct4、Nanog、Sox2、およびLin28のcDNAを含有するレンチウイルスベクター(pSIN)はAddgeneから入手した。これらのベクターを、293-FTパッケージ細胞株にビラパワーと共にコトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後にウイルス上清を収集し、超遠心分離してウイルスを濃縮した。陽性対照の形質導入効率を確認するために、pGK EGFPレンチウイルスを、表示の希釈度で線維芽細胞に形質導入した。線維芽細胞形質導入には8ng/mlポリブレンの存在下で等量の各ウイルスを使った。
線維芽細胞に、第3継代において、C3+EOSベクターを形質導入し、3継代にわたって維持した。細胞をトリプシン処理し、7AAD排除を使って生細胞を同定した。線維芽細胞を、GFP発現に基づいて、FACS Ariall(BD)でソートした。qRT-PCRアッセイおよびクロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイのために、PBS中の0.5%FBS(v/v)が入っているチューブに、50,000個のGFP+ve(NOS+exp)細胞とGFP-ve(NOS-exp)細胞をソートした。細胞を、RNA抽出用に遠心分離によって集めるか、ChIP研究用に1%ホルムアルデヒドを使って架橋した。
マトリゲル上で:全hFibs、GFP+ve細胞(10,000個のNOS+exp細胞という)および10,000個のGFP-ve細胞(10,000個のNOS-exp細胞という)から再プログラミングされた細胞を作製するために、細胞を、10,000細胞/ウェルの密度で、マトリゲルコート12ウェルプレート上に播種した。混合物実験の場合は、NOS+exp培養細胞を、1:9の比(1000個の培養NOS+exp+9000個の全hFibs)または1:1の比(5000個の培養NOS+exp+5000個の全hFibs)で混合した。素因の証明に関する実験の場合は、1000個のNOS+exp細胞を全hFib培養物からソートし、マトリゲル・コート・ディッシュ上で9000個の全hFibsと混合した。播種の24時間後に、線維芽細胞に、Oct4、Nanog、Sox2、およびLin28を発現するレンチウイルスを形質導入した。次に、形質導入された線維芽細胞をiPSC培地中で成長させた。再プログラミングされたコロニーを感染の3〜6週間後に計数した。コロニーを手作業で拾い、マトリゲル・コート・ウェル上で維持した。MEF上で:10,000個のNOS+expまたはNOS-exp細胞を三つ組にして12ウェルディッシュに播種した。播種の24時間後に、hFibsに、Oct4、Nanog、Sox2、およびLin28を発現するレンチウイルスを形質導入した。形質導入の36時間後に、トリプシン処理によってhFibsを集め、照射MEFが入っているプレート上に移した。再プログラミングされたコロニーを感染の3〜6週間後に計数した。コロニーを手作業で拾い、MEF上で維持した。
マトリゲル上で派生したヒトES細胞またはiPSC細胞を80%コンフルエントまで成長させ、以前に記述されているように(Chadwick et al.2003)、EBを形成させた。細胞を、80%ノックアウトDMEM(KO-DMEM)(Gibco)、20%非熱不活化ウシ胎児血清(FBS)(HyClone)、1%非必須アミノ酸、1mML-グルタミン、および0.1mMベータ-メルカプトエタノールからなる分化培地中、低接着6ウェルプレートに移した。培養物を、新鮮な分化培地、または50ng/ml BMP-4(R&D Systems)、300ng/ml幹細胞因子(SCF)(Amgen)、および300ng/ml Flt-3リガンド(R&D Systems)が補われた培地で置き換えた。EBを15日間維持し、培地を4日ごとに交換した。神経プレカーサー分化のために、EBをEB培地のみの中で4日間培養した。最初の4日間の後、ポリ-L-リジン/フィブロネクチンでコートした12ウェルプレートにEBを移し、B27およびN2サプリメント(Gibco)、10ng/ml bFGF、10ng/mlヒト上皮成長因子(hEGF)、1ng/mlヒト血小板由来成長因子AA(PDGF-AA)(R&D Systems)、および1ng/mlヒトインスリン様成長因子1(hIGF-1)(R&D Systems)を含むDMEM/F12からなる神経増殖培地中で維持した。培養物をプレートに付着させ、単層として4日間増大させた。
Norgen全RNA単離キットを使って全RNAを単離した。次に、RNAを、スーパースクリプトIII(Invitrogen)を用いるcDNA合成に供した。定量PCRは、Platinium SYBR Green-UDPミックス(Invitrogen)を使って行った。ゲノムDNAは、ALL IN ONE単離キット(Norgen)を使って単離した。EOSプロウイルス組込み研究には、150ngのゲノムDNAをPCR反応におけるGFPの増幅に使用した。PCR反応は、2×PCRマスターミックス(Fermentas)を使って行った。生成物を1.2%アガロースゲルで分割した。プライマー配列を表7に記載する。
hESC、全線維芽細胞、293、Oct4を過剰発現する293、GFP+ve(NOS+exp)および全hFibsから、溶解バッファー[50mMトリス(pH8.0)、150mM NaCl、1%(v/v)Nonidet P-40、0.1%(w/v)SDS、0.5%(v/v)デオキシコール酸ナトリウムおよびコンプリート(Complete)プロテアーゼ・インヒビター(GE Healthcare)]中に、細胞抽出物を調製した。表示した抗体によるウェスタンブロッティングのために、約60μgのタンパク質をローディングした。
クロマチンIPは先に記述されているように行った(Rampalli et al.2007)。簡単に述べると、1%ホルムアルデヒドを使って細胞を架橋し、0.1%SDSを含有するバッファー中でクロマチンを消化して、約400bp長のフラグメントを得た。超音波処理したDNAを、ChIP用の抗体(抗トリメチルH3K4(Abcam)、抗トリメチルH3K27(Abcam)、抗Oct4(Cell Signaling)、抗Nanog(Cell Signaling)、抗Sox2(Cell Signaling)、抗ブラキュリT(Abcam)、抗ウサギIgGおよび抗マウスIgG抗体)を用いる免疫沈降に供した。免疫沈降したDNAをさらに脱架橋し、精製し、Platinium Syber Green-UDPミックスを用いるqPCR解析に供した。相対的濃縮度を計算するために、対照IPシグナルを、特異的なシグナルから差し引き、得られた差を、50分の1の投入材料から観察されたシグナルで割った。
生細胞染色のために、滅菌Tra-1-60抗体(Millipore)を滅菌Alexa Fluor 647ヤギ抗マウスIgM(Molecular Probes、Invitrogen)と、室温でプレコンジュゲートした。再プログラミングされたコロニーをiPSC培地で1回洗浄し、Tra-1-60-Alexa 647抗体と共に、室温で30分間インキュベートした。次に培養物を2回洗浄して未結合の抗体を除去した。細胞をオリンパス蛍光顕微鏡を使って可視化した。
誘導多能性細胞をコラゲナーゼIV(Gibco)で処理してから、細胞解離バッファー(Gibco)中に37℃で10分間入れた。細胞懸濁液をSSEA-3(Developmental Studies Hybridoma Bank、mABクローンMC-631、University of Iowa、アイオワ州アイオワシティ)で染色した。細胞をAlexa Fluor 647ヤギ抗ラットIgM(Molecular Probes、Invitrogen)で可視化した。適当な陰性対照を利用した。生細胞を7-アミノアクチノマイシン(7AAD)排除によって同定してから、FACS Calibur(BDIS)を使って、細胞表面マーカー発現について分析した。収集した事象をFlowJo 6.4.1ソフトウェア(Tree Star Inc.)を使って分析した。iPSC細胞から生成したEBを、15日目に、0.4U/mlコラゲナーゼB(Roche Diagnostics、カナダ・ケベック州ラバル)で解離し、血液細胞生成マーカーおよび造血マーカーの発現について分析した。造血細胞(CD45+)は、単一細胞(2〜5×105細胞/ml)を蛍光色素コンジュゲートモノクローナル抗体(mAb)汎白血球マーカーCD45-APC(Milteny Biotech、ドイツ)で染色することによって同定した。mAbおよびそれらの対応するアイソタイプを1〜2mg/mlで使用した。造血表現型を有する細胞の頻度を、7AAD(Immunotech)排除による生細胞で、FACS Caliburを使って決定し、FlowJoソフトウェア(Tree Star)を使って解析を行った。神経増殖培地中のEBは、4日間の培養後にトリプシン処理し、細胞表面マーカーA2B5(R&D Systems)で染色した。細胞をAlexa Fluor 647ヤギ抗マウスIgM(Molecular Probes、Invitrogen)で可視化した。A2B5を発現する細胞の頻度を、7AAD(Immunotech)排除による生細胞で、FACS Caliburを使って決定し、FlowJoソフトウェア(Tree Star)を使って解析を行った。
全線維芽細胞、293、pSIN-Oct4ベクターをトランスフェクトした293、およびソートしたNOS+exp細胞をチャンバースライドに播種した。EOS C3+を形質導入したhESCを、マトリゲルコート12ウェルディッシュで成長させた。細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、Triton X-100中で透過処理してから、ヒトOct4について染色した(ラット抗ヒトOct3/4モノクローナル抗体クローン240408)(R&D Systems)。次に細胞を二次抗体Alexa Fluor 647抗ラットIgG(Molecular Probes)で染色した。DAPIを含有するVectashield封入剤(Vector Labs)でチャンバースライドを封入し、対比染色した。HMMR染色のために、成体皮膚線維芽細胞にEOS C3+レンチウイルスを形質導入し、CD168(HMMR)(ab67003)染色を上述のように行った。オリンパスIX81蛍光顕微鏡を使って細胞を可視化した。
全ての手法とプロトコールはMcMaster University Animal Care Councilによって承認された。誘導多能性幹細胞培養物をコラゲナーゼIVで5〜10分間処理した後、収集し、食塩水で2回洗浄し、食塩水に再懸濁した。1試料あたり500,000個の細胞を、雄NOD-SCIDマウスに精巣内注入した。最初の注入の10〜12週間後にマウスを屠殺した。奇形腫を摘出し、パラフィンに包埋し、5μm間隔で薄切した後、キシレン中で脱パラフィン化し、段階的な一連のアルコール濃度で処理した。試料を、ヘマトキシリンおよびエオシンまたはOct4で染色してから、脱水およびキシレン処理を行った。Permountを使ってスライドを封入し、Aperio Scan Scopeを使ってスライドをスキャンすることによって撮像し、Image Scope v9.0.19.1516.ソフトウェアを使って、画像をキャプチャした。各胚葉サブタイプに特異的な、厳格な組織学的および形態学的基準に基づいて、組織タイピングを行った。骨などの中胚葉系譜は、骨細胞および骨片の存在を使って同定し;軟骨は軟骨細胞の存在および細胞外マトリックスの特異的染色によって同定した。腸管腔などの内胚葉系譜は、管腔上皮における杯細胞の存在によって同定した。皮膚などの外胚葉系譜は、特色のある細胞層形態(すなわち層状)に基づいて同定し;脳または神経管は、特異的な組織学的基準に基づいて同定した。胚葉の存在および組織タイピングはMcMaster Pathologyによって確認された。
EOSベクターを形質導入した成体皮膚線維芽細胞をチャンバースライドに播種した。細胞をPBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒド/PBSで10分間固定した後、Triton X-100中で透過処理した。DAPIを含むVECTASHIELD HardSet封入剤(Vector Labs)を使って、スライドを封入し、対比染色した。オリンパスIX81蛍光顕微鏡を使って細胞を可視化し、Photometrix Cool Snap HQ2カメラで、In Vivoバージョン3.1.2(Photometrix)ソフトウェアを使って、z-スタック(1視野あたり30切片)をキャプチャした。ImageJソフトウェアを使ってZ-切片/像スタックを擬似カラー化し、3Dマッピングした。
全RNA精製キット(Norgen)を製造者の説明書に従って使用することで、成体皮膚線維芽細胞(全)、NOS+exp(GFP+ve)、NOS-exp(GFP-ve)細胞、iPS NOS+veおよびhESCから、全RNAを単離した。RNA増幅、GeneChip 3'オリゴヌクレオチド・マイクロアレイ・ハイブリダイゼーションおよび処理は、Ottawa Health Research Institute(オンタリオ州オタワ)のOGICにより、製造者のプロトコール(Affymetrix)に従って行われた。各試料について、200ngの一本鎖DNAを標識し、Affymetrix HG-U133 Plus 2.0チップにハイブリダイズさせた。発現シグナルはAffymetrix GeneChipスキャナーでスキャンし、データ抽出はAffymetrix AGCCソフトウェアを使って行った。データの規格化と解析は、Dchipソフトウェア(Li and Wong 2001 PNAS)を使って行った。ピアソン相関係数を使った階層的クラスタリングを規格化したデータに対して行った。差次的にアップレギュレートされる遺伝子をD-ChIPを使って分析した。遺伝子オントロジー(GO)分析はFATIGO(http://babelomics.bioinfo.cipf.es)を使って行った。
結果と考察
ヒト皮膚線維芽細胞からのニューロン転換を促進するために、Oct-4(POU5F1)を神経サイトカイン(bFGF、EGF)と共に使用した。Vierbuchenとその共同研究者ら(Vierbuchen et al.,2010)は、単一のニューロン細胞タイプ、すなわちニューロンへのマウス線維芽細胞の転換を示しているが、本実施例では、多能性状態を迂回しつつ、オリゴデンドロサイト、アストロサイトおよびニューロンへのヒト線維芽細胞の転換を実証する(図38)。POUドメイン結合タンパク質Oct-4を形質導入したヒト皮膚線維芽細胞を、当分野において使用されている標準的な神経、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイト分化アッセイのために、ヒト・ラミニン・コート・ディッシュを使ってプレーティングし、bFGF、EGFおよびBMP-4が補われた神経/オリゴデンドロサイトまたはアストロサイト分化培地中で培養した(図38a)。非形質導入/対照線維芽細胞とは異なり、Oct-4を形質導入したヒト皮膚線維芽細胞は、神経系譜特異的な形態の獲得(図38b)によって実証されるとおり、3つ全ての神経系譜(ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト)を生じさせた。Oct-4形質導入線維芽細胞を、神経系譜特異的マーカー発現、例えばアストロサイト特異的マーカーGFAP(グリア線維性酸性タンパク質)、オリゴデンドロサイト特異的マーカーOlig-4(リゴデンドログリア細胞転写因子4)およびニューロン特異的マーカー(TUBB3)ベータ-チューブリンIIIなどの発現について、さらに分析した。Oct-4を形質導入したヒト皮膚線維芽細胞は、アストロサイト、ニューロンおよびオリゴデンドロサイト出現を示す免疫蛍光イメージング(図38c、e、g)およびFACS分析(図38d、f、h、i)によって実証されるとおり、GFAP、TUBB3およびOlig-4を発現した。
神経プレカーサー分化-
(Pollard et al.,2009;Reubinoff et al.,2001;Roy et al.,2006)を応用。成体皮膚線維芽細胞および胎児皮膚線維芽細胞を、20%FBS、IGFIIおよびbFGFが補われたF12-DMEM培地中で培養した。線維芽細胞にOct-4レンチウイルスを形質導入し、上述の培地で培養した。さらなるニューロン分化は、B27およびN2サプリメント(Gibco)、20ng/ml bFGFおよび20ng/mlヒト上皮成長因子(hEGF)(R&D Systems)を含むDMEM/F12からなる神経プレカーサー培地で行った(Carpenter et al.,2001)。細胞をプレートに付着させ、単層として14日間増大させた。培地を3日ごとに置き換え、細胞を7日目に、Accutase(Sigma)を5分間使って単一細胞懸濁液に解離することによって継代した。
ドーパミン作動性前駆細胞分化培養物は、先に記述されたように調製した(Roy et al.,2006)。簡単に述べると、神経プレカーサー培養物をAccutaseで5分間解離した後、N2(Gibco)、bFGF(10ng/ml)、ヒトSHHのN末端活性フラグメント(200ng/ml)、およびFGF8(100ng/ml;R&D)が補われたDMEM/F12からなる中脳ニューロン培地中、新しいラミニン・コート・プレート(BD Biosciences)に移した。培地を3日ごとに置き換えた。7日後に、SHHおよびFGFを取り除き、N2、GDNF(20ng/ml)、BDNF(20ng/ml)および0.5%FBSが補われたDMEM/F12培地で置き換えることにより、ドーパミン作動性ニューロン分化を誘導した。培養物をこれらの条件下で14日間維持した後、染色(すなわち、ドーパミン作動性ニューロンの場合は、チロシンヒドロキシラーゼ、βIIIチューブリン)のために固定した。
*値の計算:(総細胞数×CD45+細胞の頻度)
**値の計算:(総細胞数×CD34+CD45+細胞の頻度)
完全な造血再構築を達成するのに必要な皮膚パッチサイズの計算:
-60kgの個体は1.5×108個のCD34+ve細胞を必要とするであろう。
-直径6mmの皮膚穿刺物は1.0×107個の細胞を含む。
-最初にプレーティングした10,000個の線維芽細胞につき、CD34+CD45+細胞は約21,000個になる。
-したがって、1.5×108個のCD34+ve細胞を得るのに必要なFibsの数
=(10,000×1.5×108)/(21,000)
=7.14×107個の線維芽細胞。
-したがって、直径42.83mm(7.14×6mm)の皮膚パッチに相当する7.1個の皮膚穿刺物が必要である。
Claims (43)
- a)POUドメイン含有遺伝子またはタンパク質を発現するか、またはPOUドメイン含有遺伝子またはタンパク質で処理された線維芽細胞を提供する工程;および
b)多能性状態を経ることなく前駆細胞の作出を可能にする条件下で、工程(a)の細胞を培養する工程
を含む、線維芽細胞から前駆細胞を作製する方法。 - 工程(a)におけるPOUドメイン含有遺伝子またはタンパク質を発現する線維芽細胞が、レンチウイルス形質導入によって作出される、請求項1記載の方法。
- POUドメイン含有遺伝子またはタンパク質で処理された線維芽細胞が、外因性POUドメイン含有遺伝子またはタンパク質を提供することを含む、請求項1記載の方法。
- POUドメイン含有遺伝子またはタンパク質がOct遺伝子またはタンパク質である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- Oct遺伝子またはタンパク質がOct-1、Oct-2、Oct-4またはOct-11である、請求項4記載の方法。
- Oct遺伝子またはタンパク質がOct-4である、請求項5記載の方法。
- 前駆細胞の作出を可能にする条件が、培養期間が25日までのコロニー形成アッセイを含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 工程(b)で作出された細胞を分化細胞の作出を可能にする条件下で分化培地において培養する工程をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- 分化培地が、少なくとも一つの造血サイトカインを含む造血培地を含む、請求項8記載の方法。
- 少なくとも一つの造血サイトカインがFlt3リガンドおよび/またはSCFである、請求項9記載の方法。
- 分化造血細胞が骨髄芽球系譜の細胞である、請求項10記載の方法。
- 骨髄芽球系譜細胞が単球または顆粒球である、請求項11記載の方法。
- 少なくとも一つの造血サイトカインがEPOである、請求項10または11記載の方法。
- 分化造血細胞が赤血球系譜または巨核球系譜の細胞である、請求項13記載の方法。
- 分化培地が、線維芽細胞成長因子、上皮成長因子、インスリン成長因子II、骨形成因子4、bFGF、ヒトSHHのN末端活性フラグメント、FGF8、GDNF、BDNFおよび/または胎児ウシ血清を含む神経培地を含む、請求項8記載の方法。
- 分化神経細胞がニューロンまたはグリア細胞である、請求項15記載の方法。
- ニューロンがドーパミン作動性ニューロンである、請求項16記載の方法。
- グリア細胞がアストロサイトまたはオリゴデンドロサイトである、請求項16記載の方法。
- 線維芽細胞が皮膚線維芽細胞である、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
- 請求項1〜19のいずれか一項記載の方法によって作製された、単離された前駆細胞または分化細胞。
- 生着または細胞置換を必要とする対象における生着または細胞置換のための、請求項20記載の細胞の使用。
- 自家移植または非自家移植を必要とする対象における自家移植または非自家移植のための、請求項21記載の使用。
- 対象がヒトである、請求項21または22記載の使用。
- 血液、細胞性および非細胞性の血液構成要素、血液製剤または造血幹細胞の供給源としての、請求項20記載の造血細胞の使用。
- a)請求項1〜19のいずれか一項記載の方法によって前駆細胞または分化細胞の培養物を調製する工程;
b)前記細胞を試験剤で処理する工程;および
c)前記細胞を分析に供する工程
を含む、前駆細胞またはそれに由来する細胞をスクリーニングする方法。 - a)Oct-4レポーターを発現する線維芽細胞を提供する工程;および
b)前記レポーターに関して陽性である細胞を単離する工程
を含む、増加した再プログラミング能を有する線維芽細胞の亜集団を単離する方法。 - Oct-4レポーターを発現する線維芽細胞がレンチウイルス形質導入によって作出される、請求項26記載の方法。
- レポーター遺伝子が蛍光タンパク質を含み、かつ工程(b)では、蛍光にもとづく該タンパク質の検出によって細胞が単離される、請求項26または27記載の方法。
- レポーター遺伝子が抗生物質耐性を付与する遺伝子をコードし、かつ細胞は抗生物質の存在下における生残によって単離される、請求項26または27記載の方法。
- 線維芽細胞が皮膚線維芽細胞である、請求項26〜29のいずれか一項記載の方法。
- a)(i)Oct-4の発現が増加している線維芽細胞の集団および(ii)線維芽細胞の混合集団またはOct-4陰性集団を提供する工程;
b)a)の線維芽細胞をOct-4、Sox-2、NanogおよびLin-28で処理する工程;
c)b)の線維芽細胞を、iPS細胞の作出を可能にする条件下で培養する工程
を含む、再プログラミングされた線維芽細胞由来の誘導多能性幹細胞を作製する方法。 - b)の線維芽細胞が、レンチウイルス形質導入でOct-4、Sox-2、NanogおよびLin-28遺伝子を導入することによって処理される、請求項31記載の方法。
- TRA-1-60および/またはSSEA-3および/または他の任意の多能性マーカーを発現する細胞を分析および選択する工程をさらに含む、請求項31または32記載の方法。
- a)i)のOct-4の発現が増加している線維芽細胞の集団が、請求項26〜30のいずれか一項記載の方法によって作出される、請求項31〜33のいずれか一項記載の方法。
- a)i)とa)ii)の細胞の比が50:50である、請求項31〜34のいずれか一項記載の方法。
- a)i)とa)ii)の細胞の比が10:90である、請求項31〜34のいずれか一項記載の方法。
- 線維芽細胞が皮膚線維芽細胞である、請求項31〜36のいずれか一項記載の方法。
- 請求項31〜37のいずれか一項記載の方法によって作製された、単離された誘導多能性幹細胞またはそれから分化した細胞。
- 生着を必要とする対象における生着のための、請求項38記載の細胞の使用。
- 自家移植または非自家移植を必要とする対象における自家移植または非自家移植のための、請求項39記載の使用。
- 対象がヒトである、請求項39または40記載の使用。
- 誘導多能性幹細胞またはそれから分化した細胞の供給源としての、請求項38記載の細胞の使用。
- a)請求項31〜37のいずれか一項記載の方法によって誘導多能性幹細胞またはそれから分化した細胞の培養物を調製する工程;
b)前記細胞を試験剤で処理する工程;および
c)処理された細胞を分析に供する工程
を含む、誘導多能性幹細胞またはそれから分化した細胞をスクリーニングする方法。
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Muggeo | A STEP-BY-STEP PROCESS TO GENERATE FUNCTIONAL OSTEOCLASTS FROM SITE SPECIFIC GENE-CORRECTED INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS: AN AUTOLOGOUS CELL THERAPY APPROACH TO TREAT AUTOSOMAL RECESSIVE OSTEOPETROSIS. |
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