IT202100009272A1 - Metodo di riprogrammazione cellulare migliorata - Google Patents
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Description
UN METODO MIGLIORATO DI RIPROGRAMMAZIONE CELLULARE
La presente invenzione riguarda un metodo migliorato di riprogrammazione delle cellule adulte umane in hiPSCs, il metodo comprendente l'integrazione del terreno di riprogrammazione o il terreno di riprogrammazione e il terreno di espansione con una o pi? molecole biologiche selezionate tra Fattore di Crescita degli Epatociti (HGF), Interleuchina 6 (IL6) insieme al recettore solubile Interleuchina 6 (sIL6R) e Neuregulina 1 (NRG1). Il metodo dell'invenzione aumenta drasticamente l'efficienza di riprogrammazione.
STATO DELL'ARTE
Le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) sono cellule staminali pluripotenti derivate da cellule adulte umane che sono molto promettenti soprattutto per lo studio in vitro dell'embriogenesi e per la derivazione di modelli in vitro di tessuti umani, e in generale come fonte di cellule umane specifiche del paziente di potenzialmente qualsiasi tessuto. Sono caratterizzate da impronte molecolari chiave ai livelli di rete genetica e vie di segnalazione. I geni NANOG, POU5F1 (codificante per la proteina OCT4) e SOX2 costituiscono la rete trascrizionale principale di pluripotenza essenziale che ad innesco supporta fattori di trascrizione secondari (ad esempio, i membri della famiglia MYC, ZFX) e stabilizza la pluripotenza. La pluripotenza nelle cellule somatiche ? normalmente ottenuta attraverso cambiamenti molecolari indotti dall'espressione forzata di quattro fattori di trascrizione: OCT4, SOX2, KLF4 e cMYC. Tuttavia, ci sono diverse pubblicazioni che hanno evidenziato una riduzione del numero di fattori o di altri set di fattori adatti alla riprogrammazione cellulare (vedi, a titolo d?esempio, i fattori di Thomson OCT4, SOX2, NANOG e LIN28 e altra letteratura scientifica e brevettuale). Nella fase iniziale della riprogrammazione, l'espressione esogena di questi fattori di trascrizione perturba la rete trascrizionale delle cellule somatiche. In risposta, le cellule integrano segnali intrinseci ed estrinseci per rimodellare la cromatina e raggiungere un nuovo stato epigenetico. Le ultime fasi di riprogrammazione, maturazione e stabilizzazione, portano all'espressione endogena del circuito centrale della pluripotenza, comprendente OCT4, SOX2 e NANOG, e l'attivazione di un programma trascrizionale che assomiglia molto a quello che governa la pluripotenza nelle cellule staminali embrionali.
Al fine di aumentare l'efficienza di riprogrammazione e migliorare la qualit? complessiva delle hiPSCs ottenute, sono state sviluppate diverse strategie di somministrazione dei fattori di trascrizione. Inoltre, ? stata raggiunta una migliore comprensione della riorganizzazione epigenetica e del ricablaggio della rete genetica della pluripotenza durante la riprogrammazione. Metodi particolarmente interessanti sono quelli che usano vettori non integranti per indurre in maniera esogena l'espressione dei fattori critici di trascrizione, come i vettori episomiali (Yu, J. et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science 324, 797?8012009) e mRNA modificati (mmRNA) (Warren, L. et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell 7, 618?630 (2010) and Yoshioka, N. et al. Efficient generation of human iPSCs by a synthetic selfreplicative RNA. Cell Stem Cell 13, 246?254 (2013)) che garantiscono l'ottenimento di hiPSCs senza transgeni.
D'altra parte, aiutati dalle tecnologie ad alta produttivit? disponibili, molteplici studi hanno esaminato le barriere epigenetiche e trascrizionali durante la riprogrammazione. Pochi lavori hanno riportato il ruolo delle vie di segnalazione in diverse fasi della riprogrammazione: ad esempio, l'attivazione della via TGF-? potrebbe essere un regolatore negativo durante l'acquisizione del fenotipo epiteliale, mentre ha un effetto positivo sulla riprogrammazione durante le primissime fasi e nelle fasi successive, quando agisce come promotore della pluripotenza.
Tuttavia, la riprogrammazione cellulare umana per indurre la pluripotenza ? ancora un processo inefficiente. Ad esempio, utilizzando mmRNA - la tecnologia pi? efficiente finora - la resa massima ? di ~ 3 colonie di hiPSCs per 100 cellule somatiche seminate (Schlaeger, T. M. et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat. Biotechnol.33, 58?632015).
Attualmente, la riprogrammazione viene eseguita nei laboratori all'interno di dispositivi standard per la coltura cellulare, come piastre Petri e piastre multi-pozzetto. In alternativa, la letteratura recente, tra cui WO2017/179021, riporta metodi migliori di riprogrammazione cellulare nei sistemi microfluidici.
Quando la riprogrammazione viene eseguita all'interno dei suddetti dispositivi standard per la coltura cellulare, il processo ?, anche nella migliore delle ipotesi, altamente inefficiente. Ad esempio, utilizzando mmRNA ? la tecnologia pi? efficiente finora ? la resa massima ? di ~ 3 colonie di hiPSCs per 100 cellule somatiche seminate (Schlaeger, T. M. et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat. Biotechnol.33, 58?632015).
Quindi, nei sistemi convenzionali non microfluidici, la riprogrammazione cellulare umana per indurre la pluripotenza ? ancora un processo inefficiente.
La scoperta di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSCs) ha enfatizzato la funzione dei fattori di trascrizione nel controllo dell'identit? cellulare, trascurando il ruolo dei segnali cellulari estrinseci. La riprogrammazione delle cellule somatiche in hiPSCs ? paradigmatica di un cambiamento dell'identit? cellulare guidata dal fattore di trascrizione in tre fasi distinte e ben definite: l?uscita delle cellule da uno stato somatico, la transizione attraverso uno stato trascrizionale ed epigenetico promiscuo dipendente da transgene, l?instaurazione infine di un'identit? pluripotente autorinnovante. Diversi studi hanno stabilito tratti distintivi e piani d?azione per la formazione delle hiPSCs e nuovi progressi tecnologici, come le analisi di singola cellula, hanno ulteriormente perfezionato la nostra comprensione del processo di riprogrammazione. Questi lavori hanno caratterizzato meglio ed in dettaglio le fasi iniziali e finali della riprogrammazione umana ma si sono collegati con gli stadi intermedi attraverso traiettorie ipotetiche e pi? incerte. Mentre c'? una raccolta di letteratura che descrive la traiettoria di riprogrammazione nel topo, le sottili dinamiche degli intermedi di riprogrammazione umana, che costituiscono il collo di bottiglia del processo, rimangono in gran parte inesplorate a causa della complessit? di riconoscere e selezionare fenotipi rari che si evolveranno in un destino di hiPSCs.
Si pensa che le singole cellule durante la riprogrammazione evolvano con una progressione regolare sotto una pressione selettiva che risulta in cloni "d'?lite" dominanti. ? stato recentemente suggerito che la riprogrammazione delle cellule murine pu? anche dipendere da dinamiche di popolazione attraverso meccanismi cellulari non autonomi in modo dipendente dal contesto, cio? mediata da fattori secreti dalle cellule. Coerentemente con questa ipotesi, ? stato recentemente riportato che l'efficienza della riprogrammazione delle cellule somatiche umane in hiPSCs pu? essere notevolmente migliorata in un ambiente confinato microfluidico, che migliora l'accumulo dei fattori secreti e sostiene l'acquisizione della pluripotenza umana sia primed che na?ve.
Tuttavia, non vi ? alcuna conoscenza o identificazione di quali molecole biologiche potrebbero essere coinvolte nel miglioramento dell'efficienza della riprogrammazione delle cellule somatiche umane in hiPSCs, nei sistemi convenzionali non microfluidici.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
Data la necessit? nell'arte, in particolare per motivi medici, di protocolli efficienti per la fornitura di hiPSCs (per esempio protocolli che hanno portato alla produzione di un gran numero di hiPSCs di buona qualit? a partire anche da piccole quantit? di cellule somatiche), gli autori della presente invenzione hanno fornito un protocollo migliorato di riprogrammazione dalle cellule somatiche umane alle hiPSCs in cui tale riprogrammazione viene effettuata in dispositivi di coltura cellulare convenzionali (cio? sistemi o dispositivi non microfluidici, come piastre di Petri, piastre multi-pozzetto, fiasche di coltura cellulare e simili).
Gli autori hanno constatato che i protocolli di riprogrammazione convenzionali sono notevolmente migliorati integrando il terreno di riprogrammazione o il terreno di riprogrammazione e il terreno di espansione con almeno uno dei seguenti:
fattore di crescita degli epatociti (HGF);
una combinazione di interleuchina 6 (IL6) e del recettore solubile dell'interleuchina 6 (sIL6R);
neuregulina 1 (NRG-1).
Gli autori hanno scoperto che tale integrazione migliora notevolmente il processo di riprogrammazione fornendo un aumento delle hiPSCs di 2-5 volte rispetto al numero di hiPSCs ottenute con lo stesso protocollo senza aggiunta di detto HGF e/o IL6 sIL6R e/o NRG-1.
Gli esperimenti riportati negli esempi che seguono e nella figura 1 dimostrano che l'integrazione del terreno di riprogrammazione e del terreno di espansione con l'HGF; o una combinazione di IL6 e sIL6R; o neuregulina 1 (NRG-1), migliora il processo di riprogrammazione fornendo un aumento delle hiPSCs di 2 volte rispetto al numero di hiPSCs ottenute con lo stesso protocollo senza detta aggiunta (vedi figura 1).
Inoltre, integrando il terreno di riprogrammazione con HGF e/o una combinazione di IL6 e sIL6R durante l?intera fase iniziale della riprogrammazione e integrando il terreno di riprogrammazione e il terreno di espansione con NRG-1 durante l?intera fase tardiva della riprogrammazione, migliora il processo fornendo un aumento delle hiPSCs di 3 volte rispetto al numero di hiPSCs ottenute con lo stesso protocollo senza detta aggiunta (vedi figura 2).
Alla fine, gli esempi seguenti e la figura 2 mostrano che l'integrazione con HGF, una combinazione di IL6 e sIL6R e con NRG-1 durante tutte le fasi di riprogrammazione precoce e tardiva migliora il processo di riprogrammazione fornendo un aumento delle hiPSCs di 5 volte rispetto al numero di hiPSCs ottenute con lo stesso protocollo senza detta aggiunta (vedi figura 2).
Oggetto dell'invenzione ?, quindi, un metodo di riprogrammazione delle cellule adulte somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hi-PSCs), comprendente l'integrazione del terreno di riprogrammazione o il terreno di riprogrammazione e il terreno di espansione con almeno uno dei seguenti:
fattore di crescita degli epatociti (HGF);
una combinazione di interleuchina 6 (IL6) e recettore solubile dell?interleuchina 6 (sIL6R);
neuregulina 1 (NRG-1).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE
Figura 1.
In basso, efficienza di riprogrammazione in piastre da 24 pozzetti standard con aggiunta di HGF, di IL6 e del recettore solubile dell?IL6 (sIL6R), o NRG1 al giorno 9 (n=14 per il controllo, n=19 per HGF, n=5 per IL6 sIL6R, n =16 per NRG1); ANOVA seguito dal test di confronti multipli di Tukey ? stato utilizzato per valutare le differenze tra le condizioni, **P < 0.01, ***P < 0.001. In alto, immagini di quantificazione rappresentative in piastre da 24 pozzetti standard valutate mediante immunocolorazione di NANOG e TRA-1-60.
Figura 2.
In basso, efficienza di riprogrammazione in piastre da 24 pozzetti standard con aggiunta temporalmente modulata di HGF, di IL6 e del recettore solubile dell?IL6 (sIL6R) e NRG-1 al giorno 9 (n=14 per il controllo, n=6 per HGF durante tutta la fase iniziale e NRG-1 durante tutta la fase tardiva, n=4 per HGF IL6 sIL6R durante tutta la fase iniziale e NRG-1 durante tutta la fase tardiva, n=4 per HGF IL6 e sIL6R NRG-1 per l'intero processo); ANOVA seguito dal test di confronti multipli di Tukey ? stato utilizzato per valutare le differenze tra le condizioni, **P < 0.01, ***P < 0.001. In alto, immagini di quantificazione rappresentative in piastre da 24 pozzetti standard valutate mediante immuno-colorazione di NANOG e TRA-1-60.
GLOSSARIO
Il termine "riprogrammazione" nella presente descrizione indica il processo utilizzato per de-differenziare le cellule adulte e differenziate in cellule che hanno un fenotipo immaturo e pluripotente, come le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC).
"hiPSC" sta per cellule staminali pluripotenti indotte umane, che sono un tipo di cellule staminali pluripotenti che possono essere generate direttamente da cellule adulte. I protocolli convenzionali di riprogrammazione cellulare umana dalle cellule somatiche alle cellule staminali pluripotenti indotte in dispositivi standard per la coltura cellulare, come piastre di Petri, piastre multi-pozzetto, fiasche di coltura e simili, prevedono circa 12-15 giorni di coltura.
La fase "iniziale" della riprogrammazione nella presente descrizione e nelle rivendicazioni ? una fase comunemente nota alla persona qualificata come la fase che termina con la comparsa dei gruppi di cellule epiteliali dopo i primi giorni di riprogrammazione. Si riferisce mediamente a un periodo di tempo a partire dal giorno 1 o dal giorno 2 dopo la semina delle cellule somatiche e di detto fino a terminare mediamente tra il giorno 3 e il giorno 6 di detta riprogrammazione. Nella presente descrizione e nelle rivendicazioni, in ogni caso la fase iniziale termina con la comparsa dei gruppi cellulari epiteliali, cio? l'ultimo giorno della fase iniziale ? il giorno prima della comparsa dei gruppi cellulari epiteliali.
La fase "tardiva" della riprogrammazione nella presente descrizione e nelle rivendicazioni ? una fase comunemente nota alla persona esperta del settore e si riferisce a un periodo di tempo che inizia in media dal giorno 6, o comunque dal giorno in cui sono visibili i gruppi cellulari epiteliali, e termina l'ultimo giorno di detta riprogrammazione.
Poich? l'inizio della fase tardiva coincide con la comparsa dei gruppi cellulari epiteliali, quindi, quando necessario, l'ultimo giorno della fase iniziale e il primo giorno della fase tardiva possono essere facilmente regolati in ogni esperimento dalla persona esperta del settore.
In altri termini la fase iniziale pu? essere definita come un periodo di tempo che parte dal giorno 1 o dal giorno 2 e termina il giorno prima della comparsa dei gruppi di cellule epiteliali, e la fase tardiva pu? essere definita come un periodo di tempo che inizia il giorno in cui compaiono i gruppi di cellule epiteliali e termina l'ultimo giorno di tale riprogrammazione.
Secondo la presente descrizione e rivendicazione, si pu? fare riferimento ai giorni del protocollo di riprogrammazione. ? chiaro che prima di iniziare un metodo/protocollo di riprogrammazione ? necessaria la semina delle cellule da riprogrammare. Nella presente specifica, il detto periodo di semina ? indicato come giorno 0. Il conteggio progressivo dei giorni nel protocollo di riprogrammazione, dal primo giorno in poi, inizia lo stesso giorno in cui le cellule somatiche sono esposte per la prima volta ai fattori di trascrizione (fattori di trascrizione).
Il terreno di riprogrammazione ? qualsiasi tipo di terreno a disposizione della persona esperta del settore adatto alle cellule sottoposte ad un protocollo di riprogrammazione. Il termine terreno di espansione ? inteso nella presente descrizione con il significato comunemente usato nell'arte e si riferisce al terreno per l'espansione delle cellule ripristinate na?ve pluripotenti indotte umane (hiPSC), questo terreno viene utilizzato dopo la comparsa dei gruppi di cellule epiteliali durante la riprogrammazione invece del terreno di riprogrammazione precedentemente utilizzato.
Il terreno di riprogrammazione ? qualsiasi tipo di terreno a disposizione della persona esperta del settore adatto alle cellule sottoposte a un protocollo di riprogrammazione.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
La presente invenzione fornisce un metodo migliorato di riprogrammazione delle cellule somatiche umane adulte in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hi-PSC), comprendente l'integrazione del terreno di riprogrammazione o il terreno di riprogrammazione e il terreno di espansione con almeno uno dei seguenti:
HGF;
una combinazione di IL6 e sIL6R;
NRG-1.
Come indicato in precedenza, il termine "riprogrammazione" indica il processo per dedifferenziare le cellule differenziate in cellule che siano immature e pluripotenti, note anche come cellule staminali pluripotenti indotte (iPSc).
Secondo l'invenzione, il metodo di riprogrammazione dell'invenzione pu? essere qualsiasi metodo di riprogrammazione convenzionale in cui le cellule somatiche adulte sono esposte a adeguati fattori di trascrizione di riprogrammazione nel terreno di riprogrammazione convenzionale per un numero adeguato di giorni; il metodo comprende ulteriormente l'integrazione del terreno di riprogrammazione o il terreno di riprogrammazione e il terreno di espansione con almeno uno dei seguenti:
HGF;
una combinazione di IL6 e sIL6R;
NRG-1.
I metodi di riprogrammazione noti adatti secondo l'invenzione includono il metodo divulgato da Takahashi K. e Yamanaka S. nel 2006 (Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors Cell 2006, 07:024), da Takahashi K. et al nel 2007 (Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors Cell 2007, 11: 19) o qualsiasi sua modifica.
Secondo l'invenzione, uno di questi metodi comprender? ulteriormente l?integrazione del terreno di riprogrammazione o il terreno di riprogrammazione e il terreno di espansione con almeno uno dei seguenti:
HGF;
una combinazione di IL6 e sIL6R;
NRG-1.
In generale, i metodi di riprogrammazione noti adatti sono metodi in cui le cellule somatiche adulte sono riprogrammate per essere "cellule staminali pluripotenti indotte (cellule iPS)", attraverso l?introduzione retro-virale o l?espressione transitoria di fattori di trascrizione adatti come Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc o Oct4, Sox2, Nanog, Lin-28 e, facoltativamente, altri fattori di trascrizione adatti noti.
Secondo l'invenzione, i fattori di trascrizione possono essere forniti alle cellule mediante espressione transitoria, ad esempio sottoponendo le cellule a riprogrammazione introducendo in tali cellule mRNA o mmRNA codificante tali fattori di trascrizione e/o inducendo nelle cellule l'espressione transitoria di tali fattori, con adeguati vettori inducibili.
Preferibilmente, la riprogrammazione viene effettuata mediante espressione transitoria dei fattori di trascrizione selezionati.
Secondo la presente invenzione, i fattori di trascrizione adatti sono almeno Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Secondo una forma di realizzazione preferita i fattori di trascrizione adatti sono Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog e Lin-28 (OSKMNL).
Secondo una forma di realizzazione dell'invenzione, il metodo di riprogrammazione pu? essere il seguente:
a. sostituzione del terreno di coltura delle cellule somatiche precedentemente seminate e coltivate per circa 16-24 ore con un adeguato terreno di riprogrammazione;
b. preparazione di una soluzione di trasfezione comprendente mRNA codificanti per i fattori di trascrizione per la riprogrammazione di Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc; preferibilmente comprendente gli mRNA dei fattori di trascrizione Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog e Lin-28 (OSKMNL);
c. aggiunta di detta soluzione di trasfezione a un nuovo lotto del detto terreno di riprogrammazione standard;
d. sostituzione del terreno utilizzato in a. con il terreno di riprogrammazione con detta soluzione di trasfezione preparata in c.;
e. Incubazione delle cellule durante la notte a 37?C;
f. sostituzione del terreno utilizzato in d. con un nuovo lotto di detto terreno di riprogrammazione adatto utilizzato in a.;
g. ripetizione dei passaggi da b. a f. per ogni primo giorno della fase tardiva, cio? fino al giorno 6 o comunque fino alla comparsa dei gruppi di cellule epiteliali;
h. sostituzione nel secondo giorno della fase tardiva (cio? al giorno 7 o al giorno successivo alla comparsa dei gruppi cellulari epiteliali) del terreno del passaggio f. del primo giorno della fase tardiva con detto terreno di riprogrammazione standard senza detti fattori di trascrizione e incubazione delle cellule durante la notte a 37?C;
i. sostituzione giornaliera dell'ultimo terreno utilizzato con un adeguato terreno di espansione hiPSC integrato opzionalmente con penicillina-streptomicina e incubazione delle cellule durante la notte a 37 ?C fino alla fine di detta riprogrammazione;
Il terreno di riprogrammazione, o il terreno di riprogrammazione e il terreno di espansione, sono ulteriormente integrati con almeno uno dei seguenti:
HGF;
una combinazione di IL6 e sIL6R;
NRG-1.
Di seguito ? riportata una descrizione dettagliata del protocollo di integrazione.
Secondo una forma di realizzazione preferita, al giorno 1, le cellule dovrebbero essere poste in terreno di riprogrammazione almeno 9 ore prima di iniziare la trasfezione e dovrebbero raggiungere ~ 50-60% di confluenza prima della prima trasfezione.
Secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione dell'invenzione, la semina cellulare al giorno 0, cio? prima di iniziare la riprogrammazione, deve essere effettuata ad una densit? di 40-80 cellule/mm<2 >preferibilmente, circa 60 cellule/mm<2>.
Tutte le cellule somatiche umane sono cellule adatte al metodo di riprogrammazione dell'invenzione. Secondo una forma di realizzazione preferita, dette cellule somatiche umane sono cellule della pelle o del sangue.
Secondo una forma di realizzazione preferita, dette cellule sono cellule adulte.
Per quanto riguarda la preparazione della soluzione di trasfezione, la persona esperta del settore capirebbe facilmente che dovrebbero essere utilizzati tubi e punte senza RNasi e che, data la facile degradazione dell'RNA, dovrebbe essere utilizzata un?aliquota di RNA appena scongelata ogni giorno.
I terreni adatti per la riprogrammazione cellulare possono essere qualsiasi terreno di riprogrammazione commerciale come il terreno di riprogrammazione Pluriton (ad es. Stemgent, Nordic Diagnostica AB), terreno di riprogrammazione Nutristem hPSC XF (Biological Industries) terreno di riprogrammazione ReproTeSR (STEMCELL Technologies), terreno di riprogrammazione TeSR-E7 (STEMCELL Technologies), terreno di riprogrammazione Essential 6 (Thermo Fisher Scientific), terreno di riprogrammazione Essential 8 (Thermo Fisher Scientific) e simili.
Dove necessario o consigliabile, l'integrazione di FGF2 pu? essere ad una concentrazione finale di 20 ng/ml.
Possono essere utilizzati anche antibiotici adatti come penicillina e/o streptomicina. Sono disponibili in commercio anche kit commerciali per la preparazione della soluzione di trasfezione e mRNA dei fattori di trascrizione adatti. Inoltre, le informazioni sui terreni, sulla soluzione di trasfezione e sugli mRNA adatti per i protocolli di riprogrammazione sono pubblicate su un gran numero di articoli scientifici e sono ora conoscenza comune per la persona esperta del settore.
Il metodo sopra descritto ? in media di 12 giorni e pu? essere diviso in una fase iniziale che ? mediamente dal giorno 1 o giorno 2 fino al giorno 5, e in fase tardiva, che ? mediamente dal giorno 6 al giorno 12. In ogni caso, l'inizio della fase tardiva coincide con la comparsa dei gruppi cellulari epiteliali quindi, quando necessario, l'ultimo giorno della fase iniziale e il primo giorno della fase tardiva possono essere facilmente regolati in ogni esperimento.
In ogni caso, il metodo dell'invenzione pu? comprendere qualsiasi protocollo comunemente utilizzato per riprogrammare le cellule somatiche umane in hiPSC noto nell'arte, al quale le fasi di supplemento del terreno di riprogrammazione con almeno uno dei seguenti:
fattore di crescita degli epatociti (HGF);
una combinazione di interleuchina 6 (IL6) e recettore solubile dell?interleuchina 6 (sIL6R);
neuregulina 1 (NRG-1);
vengono aggiunte.
Secondo la presente invenzione, HGF (fattore di crescita degli epatociti) ? preferibilmente HGF umano, ad esempio come identificato dall'identificatore UniProt P14210-1.
Preferibilmente per il metodo dell'invenzione viene utilizzato HGF umano ricombinante. Sia HGF umano che di topo sono disponibili in commercio (ad esempio Abcam, Gibco, MitenyiBiotec, Sinobiologic, Peprotech).
IL-6 ? una citochina pleiotropica ben nota nell'arte. Qualsiasi IL-6 pu? essere utilizzata, preferibilmente IL-6 ricombinante umana viene utilizzata per il metodo dell'invenzione. Varie IL-6 umane ricombinanti sono disponibili in commercio (ad esempio Peprotech, Abcam, Miltenyi Biotech, Gibco, Invivogen ecc.).
Il recettore IL-6 ha diverse isoforme, tra cui c'? la forma solubile del recettore IL-6 (sIL6R) che agisce come agonista dell'attivit? di IL-6.
Secondo la presente invenzione, il recettore dell?IL-6 ricombinante umano solubile ? preferito per il metodo dell'invenzione. sIL6R umano ? disponibile in commercio (ad esempio Peprotech, Abcam, MiltenyiBiotech,Gibco, Invivogen ecc.).
L'integrazione con la combinazione IL-6 e sIL6R secondo l?invenzione pu? essere effettuata integrando il terreno di riprogrammazione con aliquote separate di IL6 e sIL6R, o integrando il terreno di riprogrammazione con una miscela di IL6 e sIL6R. Neuregulina-1 (NRG-1) ? un membro della famiglia dei fattori di crescita della neuregulina. Secondo la presente invenzione pu? essere utilizzata qualsiasi NRG-1. In particolare, NRG-1 umana ricombinante ? preferita per il metodo dell'invenzione. NRG-1 umana ricombinante ? disponibile in commercio (ad esempio R&D, Abcam, Sinobiological).
Secondo l'invenzione, l'integrazione con almeno uno dei seguenti:
HGF;
una combinazione di IL6 e sIL6R;
NRG-1
pu? essere effettuata a partire dal giorno 1 o dal giorno 2 di detta riprogrammazione fino alla fine della riprogrammazione.
Quando l'integrazione viene effettuata a partire dal giorno 1 o dal giorno 2 di detta riprogrammazione fino alla fine della riprogrammazione, vengono integrati sia il terreno di riprogrammazione che il terreno di espansione. Secondo una forma di realizzazione questo pu? essere fatto con HGF, o con una combinazione di IL6 e sIL6R, o con NRG-1. Come mostrato nella figura 1, detta forma di realizzazione si traduce in un aumento di due volte delle hi-PSC ottenute.
Secondo un'ulteriore forma di realizzazione l'integrazione dal giorno 1 o dal giorno 2 di detta riprogrammazione fino alla fine della riprogrammazione pu? essere effettuata con HGF e una combinazione IL6 e sIL6R; con HGF e NRG-1 o con una combinazione IL6 e sIL6R e NRG-1.
Secondo una forma di realizzazione preferita l'integrazione dal giorno 1 o dal giorno 2 di detta riprogrammazione fino alla fine della riprogrammazione viene effettuata con HGF, una combinazione IL6 e sIL6R e NRG-1. Come mostrato nella figura 2, detta forma di realizzazione si traduce in un aumento di cinque volte delle hi-PSC ottenute. La nuova integrazione viene effettuata ogni volta che il terreno viene cambiato. Secondo un'ulteriore forma di realizzazione, l?integrazione pu? essere portata avanti fino all'ultimo giorno della fase iniziale della riprogrammazione. In altri termini, viene portata avanti fino alla comparsa dei gruppi di cellule epiteliali, che ? mediamente al giorno 6 della riprogrammazione. In altri termini, secondo questa forma di realizzazione l'integrazione pu? essere effettuata dal giorno 1 o 2 al giorno 5 della riprogrammazione. Secondo una forma di realizzazione detta integrazione dal giorno 1 o 2 fino all'ultimo giorno della fase iniziale della riprogrammazione pu? essere effettuata con HGF; e/o con una combinazione di IL6 e sIL6R.
Inoltre, quando l'integrazione viene effettuata dal giorno 1 o 2 fino all'ultimo giorno della fase iniziale della riprogrammazione, il metodo dell'invenzione pu? comprendere ulteriormente l'integrazione del terreno di riprogrammazione e del terreno di espansione con NRG-1 per l'intera fase tardiva di detta riprogrammazione (cio? dalla comparsa dei gruppi cellulari epiteliali, che ? mediamente al giorno 6, fino alla fine della riprogrammazione). In altri termini, secondo questa forma di realizzazione l'integrazione pu? essere effettuata dal giorno 6 alla fine della riprogrammazione.
Come mostrato nella figura 2, detta forma di realizzazione si traduce in un triplice aumento delle hi-PSC ottenute.
Secondo la forma di realizzazione dell'invenzione, il metodo di riprogrammazione pu? comprendere le seguenti fasi:
a. sostituzione del terreno di coltura delle cellule somatiche precedentemente seminate e coltivate per circa 16-24 ore con un adeguato terreno di riprogrammazione integrato con HGF, o con una combinazione IL6 e sIL6R, o con NRG-1;
b. preparazione di una soluzione di trasfezione comprendente mRNA codificanti per i fattori di trascrizione per la riprogrammazione Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc; comprendenti preferibilmente gli mRNA dei fattori di trascrizione Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog e Lin-28 (OSKMNL);
c. Aggiunta di detta soluzione di trasfezione ad un nuovo lotto di detto terreno di riprogrammazione standard integrato con HGF, o con una combinazione IL6 e sIL6R, o con NRG-1;
d. sostituzione del terreno utilizzato in a. con il terreno di riprogrammazione con detta soluzione di trasfezione preparata in c.;
e. Incubazione delle cellule durante la notte a 37?C;
f. sostituzione del terreno utilizzato in d. con un nuovo lotto di detto terreno di riprogrammazione adatto integrato con HGF, o con una combinazione di IL6 e sIL6R, o con NRG-1 utilizzato in a.;
g. ripetizione dei passaggi da b. a f. per ogni giorno il primo giorno della fase tardiva, cio? fino al giorno 6 o comunque alla comparsa dei gruppi cellulari epiteliali;
h. sostituzione al secondo giorno della fase tardiva (cio? al giorno 7 o al giorno successivo la comparsa dei gruppi cellulari epiteliali) del terreno del passaggio f. del primo giorno della fase tardiva con detto terreno di riprogrammazione standard senza trascrizione di detti fattori integrati con HGF, o con una combinazione di IL6 e sIL6R, o conNRG-1 e incubazione delle cellule durante la notte a 37 ?C;
i. sostituzione giornaliera dell'ultimo terreno utilizzato con un adeguato terreno di espansione hiPSC integrato con HGF, o con una combinazione di IL6 e sIL6R, o con NRG-1 integrato opzionalmente con penicillina-streptomicina e incubazione delle cellule durante la notte a 37?C fino alla fine della detta riprogrammazione;
Secondo un'altra forma di realizzazione ogni integrazione in a. c. f. h. e i. del metodo sopra descritto pu? essere effettuata con HGF e una combinazione di IL6 e sIL6R; o con HGF e NRG-1 o con una combinazione di IL6 e sIL6R e NRG-1.
Secondo una forma di realizzazione preferita ogni integrazione in a. c. f. h. e i. del metodo sopra descritto pu? essere effettuata con HGF; una combinazione di IL6 e sIL6R; e NRG-1.
Secondo un'altra forma di realizzazione, il metodo di riprogrammazione dell?invenzione pu? comprendere i seguenti passaggi:
a. sostituzione del terreno di coltura delle cellule somatiche precedentemente seminate e coltivate per circa 16-24 ore con un adeguato terreno di riprogrammazione integrato con HGF e/o con una combinazione di IL6 e sIL6R;
b. preparazione di una soluzione di trasfezione comprendente mRNA codificanti per i fattori di trascrizione per la riprogrammazione di Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc; comprendenti preferibilmente gli mRNA dei fattori di trascrizione Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc,Nanog e Lin-28 (OSKMNL);
c. aggiunta di detta soluzione di trasfezione ad un nuovo lotto di detto terreno standard di riprogrammazione integrato con HGF e/o con una combinazione di IL6 e sIL6R; d. sostituzione del terreno utilizzato in a. con il terreno di riprogrammazione con detta soluzione di trasfezione preparata in c.;
e. Incubazione delle cellule durante la notte a 37?C;
f. sostituzione del terreno utilizzato in d. con un nuovo lotto di detto terreno di riprogrammazione adatto utilizzato in a. integrato con HGF e/o con una combinazione di IL6 e sIL6R;
g. ripetizione dei passaggi da b. a f. per ogni giorno il primo giorno della fase iniziale, cio? fino al giorno 6 o comunque alla comparsa dei gruppi cellulari epiteliali, il terreno di riprogrammazione ? integrato con HGF e/o con una combinazione di IL6 e sIL6R fino al giorno 5 e con NRG-1dal giorno 6;
h. sostituzione al secondo giorno della fase tardiva (cio? il giorno 7 o il giorno successivo alla comparsa dei gruppi cellulari epiteliali) del terreno del passaggio f. del primo giorno della fase tardiva con detto terreno di riprogrammazione standard senza trascrizione di tali fattori integrati con NRG-1 e incubazione delle cellule durante la notte a 37 ?C;
i. sostituzione giornaliera dell'ultimo terreno utilizzato con un adeguato terreno di espansione hiPSC integrato con NRG-1 integrato opzionalmente con penicillinastreptomicina e incubazione delle cellule durante la notte a 37?C fino alla fine della detta riprogrammazione.
Secondo una qualsiasi forma di realizzazione dell'invenzione, quando il terreno ? integrato con HGF, la concentrazione finale di HGF ? da 80 a 120 ng/mL; preferibilmente, circa 100 ng/mL.
Secondo l'invenzione, quando il terreno ? integrato con la combinazione di IL6 e sIL6R, la concentrazione finale di IL6 pu? variare da 40 a 60 ng/mL e la concentrazione finale di sIL6R pu? variare da 8 a 12 ng/mL; preferibilmente, la concentrazione finale di IL6 pu? essere di circa 50 ng/mL e la concentrazione finale sIL6R pu? essere di circa 10 ng/mL.
Infine, laddove il detto terreno sia integrato con NRG-1, la concentrazione finale pu? essere da 80 a 120 ng/mL; preferibilmente circa 100 ng/mL.
Secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione sopra, il metodo pu? essere eseguito in condizioni di ipossia (5%O<2>).
? qui dichiarato che tutte le cellule somatiche adulte utilizzate negli esempi sono state ottenute con il consenso informato del donatore.
Esempi
Esempio 1.
Nella coltura convenzionale (cio? nelle piastre di Petri), un aumento significativo di circa 2 volte dell'efficienza di riprogrammazione, in termini di area relativa TRA-1-60<+>/NANOG<+>, ? stato osservato quando il terreno ? stato integrato durante tutta la riprogrammazione con HGF, IL6 e il suo recettore solubile (sIL6R), e/o NRG-1 durante tutto il processo di riprogrammazione (Fig. 1). HGF ? stato aggiunto da solo o con IL6/sIL6R dal primo giorno al giorno 5 della riprogrammazione e NRG-1 dal giorno 6 alla fine della riprogrammazione. Ci? ha comportato un ulteriore aumento dell'efficienza di riprogrammazione fino a tre volte (Fig. 2). Quando il terreno ? stato integrato con HGF, IL6, sIL6R e NRG1 insieme durante tutta la riprogrammazione, ? stata raggiunta la massima efficienza (cio? 5 volte rispetto ai controlli), suggerendo cos? che la combinazione di molecole aumenti ulteriormente la formazione di iPSC (Fig.2).
Nelle tabelle che seguono vengono riassunti i dati sull'efficienza della riprogrammazione in diverse condizioni sperimentali. In particolare, la Tabella 1 mostra l'efficienza di riprogrammazione quando al terreno viene fornito uno solo dei fattori (HGF, IL6, sIL6R e NRG1), mentre la Tabella 2 mostra i dati sull'efficienza quando i fattori sono utilizzati in diverse combinazioni. Dato che l'efficienza della riprogrammazione era troppo alta per consentire il conteggio di singole colonie, ? stata quantificata come il rapporto dell?area cellulare di TRA-1-60<+>/NANOG<+ >sull'area totale occupata dalle cellule, in seguito questo rapporto ? stato normalizzato dal valore medio del controllo.
Tabella 1.
Tabella 2.
DETTAGLI DEL METODO
Riprogrammazione di fibroblasti umani in colonie hiPSC
Sono state generate hiPSC da fibroblasti BJ di prepuzio umano. Un totale di 6 trasfezioni di mRNA ? stato eseguito utilizzando il kit di riprogrammazione StemRNA-NM (Stemgent, 00-0076) e kit di trasfezione mRNA StemMACS (Miltenyi, 130-104-463), in terreno di riprogrammazione (NutriStem? hPSC XF Medium SKU: 06-510001-1A, integrato con FGF2 (Peprotech, cat. n. 100-18B-1000) 20 ng/ml e opzionalmente con penicillina-streptomicina) o Pluriton Medium (Stemgent, Stemgent, 00-0070), passato a StemMACS iPSBrew XF medium (Miltenyi Biotec, 130-104-368) dal giorno 8.
Gli esperimenti sono stati eseguiti in piastre standard da 24 pozzetti secondo le istruzioni del produttore del kit di riprogrammazione StemRNA-NM.
Per migliorare l'efficienza di riprogrammazione, il terreno ? stato integrato con HGF 100 ng/mL (Peprotech, 100-39), IL650 ng/mL (Peprotech, 200-06), sIL6R 10 ng/mL (Peprotech, 200-06R), NRG1 100 ng/mL (R&D, 396-HB), durante l'intera durata del processo, secondo le specifiche condizioni di perturbazione.
Valutazione dell'efficienza di riprogrammazione
L'efficienza di riprogrammazione ? stata quantificata dopo l'immunocolorazione con marcatori TRA-1-60 e NANOG e calcolata come rapporto del numero di colonie TRA-1-60<+ >e NANOG<+ >e le cellule iniziali seminate.
Quando l'efficienza della riprogrammazione era troppo alta per rendere possibile il conteggio di singole colonie, ? stata quantificata come rapporto dell?area cellulare di TRA-1-60<+ >e NANOG<+ >con l'area totale occupata dalle cellule.
Protocollo di riprogrammazione
Sono state utilizzate cellule somatiche umane di pelle seminate ad una densit? di 60 cellule/mm<2>.
Giorno 1, 16h-24 h dopo la semina alle 9:00.
- Sostituire il terreno con terreno di riprogrammazione preriscaldato (NutriStem? hPSC XF SKU medio: 06-5100-01-1A), integrato con FGF2 (Peprotech, cat. n. 100-18B-1000) 20 ng/ml e facoltativamente con penicillina-streptomicina) o Pluriton Medium (Stemgent, Stemgent, 00-0070).
FASE CRITICA: Le cellule dovrebbero essere messe in terreno di riprogrammazione almeno 9 ore prima della trasfezione e dovrebbero aver raggiunto ~50-60% di confluenza prima della prima trasfezione.
Giorno 1, alle 19:00 (almeno 9 ore dopo).
- Preparare la soluzione di trasfezione a temperatura ambiente, utilizzando il kit di trasfezione StemMACS mRNA (Miltenyi Biotec, cat. n. 130-104-463) e mRNA dei fattori di trascrizione per la riprogrammazione (OCT4, SOX2, KLF4, C-MYC, NANOG, LIN28 (OSKMNL)).
- In particolare, preparare separatamente la soluzione 1 e la soluzione 2 (vedere la tabella sotto) e mescolarle delicatamente separatamente. Aggiungere la soluzione 2 alla soluzione 1, e mescolare pipettando delicatamente 10 volte.
FASE CRITICA: Utilizzare tubi e punte senza RNasi e aliquota di RNA appena scongelata ogni giorno.
- Incubare la soluzione di trasfezione a temperatura ambiente per 20 minuti.
- Aggiungere la soluzione di trasfezione al terreno di riprogrammazione (Nutristem+FGF2 o terreno Pluriton e facoltativamente penicillina-streptomicina), preriscaldato a temperatura ambiente e mescolare delicatamente.
- Togliere le cellule dall'incubatore, sostituire il terreno con il terreno con la soluzione di trasfezione.
- Incubare le cellule durante la notte a 37 ?C in un incubatore ipossico (5% O<2 >e 5% CO<2>).
Giorno 2-6
- Ripetere i passaggi precedenti del primo giorno al mattino (~ 9 del mattino) e alla sera (~ 19:00).
Giorno 7
- Sostituire il terreno al mattino (~9 AM) con terreno di riprogrammazione (Nutristem+FGF2 terreno o Pluriton e facoltativamente penicillina-streptomicina).
Giorno 8-12
- Sostituire il terreno al mattino (~9.00) con il terreno di espansione hiPSC (E8 Voden, n. 05991, o StemMACS iPSBREW XF Miltenyi Biotech, cat. n. 130.107.086 e facoltativamente penicillina-streptomicina).
Dal giorno 1 o giorno 2 al giorno 12 HGF, IL6, sIL6R e NRG1 sono stati aggiunti, da soli, tutti insieme o in combinazioni specifiche. Le concentrazioni finali erano HGF 100 ng/mL (Peprotech, 100-39), IL-6 50 ng/mL (Peprotech, 200-06), IL-6r 10 ng/mL (Peprotech, 200-06R), NRG-1100 ng/mL (R&D, 396-HB)
In particolare l'integrazione ? stata effettuata giornalmente dal giorno 1 o dal giorno 2 al giorno 12, quando da soli o tutti insieme.
Quando in combinazione, HGF e IL6 e Il6-r o solo HGF sono stati aggiunti giornalmente dal giorno 1 o dal giorno 2 al giorno 5 (fase iniziale) e NRG1 dal giorno 6 al giorno 12 (fase tardiva). L'inizio della fase tardiva ha coinciso con la comparsa dei gruppi cellulari epiteliali.
Le concentrazioni finali sono state HGF 100 ng/mL (Peprotech, 100-39), IL-650 ng/mL (Peprotech, 200-06), IL-6r 10 ng/mL (Peprotech, 200-06R), NRG-1100 ng/mL (R&D, 396-HB)
Giorno 13
- Le cellule sono state fissate con formaldeide al 4% (peso/volume) per 10 minuti a temperatura ambiente per procedere successivamente con l'immunocolorazione e la quantificazione dell'efficienza di riprogrammazione, altrimenti le hiPSC sono state utilizzate o estratte mediante prelievo per la successiva espansione.
Soluzione di trasfezione
TR= Reagente di Trasfezione
TB=Tampone di Trasfezione
TR e TB sono componenti del kit di trasfezione mRNA StemMACS.
Claims (19)
1. Un metodo di riprogrammazione delle cellule somatiche umane adulte in cellule staminali pluripotenti indotte umane (h-iPSCs), comprendente l?integrazione del terreno di riprogrammazione o il terreno di riprogrammazione e il terreno di espansione con almeno uno dei seguenti elementi:
fattore di crescita degli epatociti (HGF);
una combinazione di interleuchina 6 (IL6) e recettore solubile dell?interleuchina 6 (sIL6R);
neuregulina 1 (NRG1).
2. Il metodo secondo la rivendicazione 1 in cui detta integrazione ? effettuata per almeno 3 giorni in qualsiasi finestra temporale durante il processo di riprogrammazione.
3. Il metodo secondo la rivendicazione 1 in cui detta integrazione ? effettuata dal giorno 1 o dal giorno 2 di detta riprogrammazione.
4. Il metodo secondo la rivendicazione 3 in cui detta integrazione ? effettuata fino all'ultimo giorno della fase iniziale di detta riprogrammazione.
5. Il metodo secondo la rivendicazione 4 in cui detta integrazione ? effettuata con HGF; e/o una combinazione di IL6 e sIL6R.
6. Il metodo secondo la rivendicazione 5 comprendente l'integrazione per l'intera fase tardiva di detta riprogrammazione, del terreno di riprogrammazione e del terreno di espansione con NRG1.
7. Il metodo secondo la rivendicazione 2 in cui detta integrazione ? effettuata con ciascuno di HGF, una combinazione di IL6 e sIL6R, e NRG-1.
8. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, in cui detto terreno ? integrato con HGF a una concentrazione finale da 80 a 120 ng/mL.
9. Il metodo secondo la rivendicazione 8, in cui detta concentrazione finale ? di circa 100 ng/mL.
10. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9, in cui detto terreno ? integrato con IL6 a una concentrazione finale da 40 a 60 ng/mL e sIL6R a una concentrazione finale da 8 a 12 ng/mL.
11. Il metodo secondo la rivendicazione 10 in cui detta concentrazione finale di IL6 ? circa 50 ng/mL e detta concentrazione finale di sIL6R ? circa 10 ng/mL.
12. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11, in cui detto terreno ? integrato con NRG-1 a una concentrazione finale da 80 a 120 ng/mL.
13. Il metodo secondo la rivendicazione 12, in cui detta concentrazione finale ? circa 100 ng/mL.
14. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13, in cui detto HGF ? HGF umano ricombinante e/o in cui detto IL6 ? IL6 umana ricombinante e/o in cui detto sIL6R ? sIL6R umano ricombinante e/o in cui detto NRG-1 ? NRG-1 umana ricombinante.
15. Il metodo secondo le rivendicazioni da 1 a 15 in cui il processo viene eseguito in condizioni di ipossia (5%O2).
16. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 15, comprendente le seguenti fasi:
a. sostituire il terreno di coltura delle cellule somatiche umane precedentemente seminate e incubate a 37?C per circa 16-24 ore con un terreno di riprogrammazione adatto;
b. preparare una soluzione di trasfezione comprendente mRNA codificante per i fattori di trascrizione per la riprogrammazione OCT4, SOX2, KLF4 e MYC;
c. aggiungere detta soluzione di trasfezione ad un nuovo lotto di detto terreno di riprogrammazione adatto;
d. sostituire il mezzo usato in a. con il mezzo di riprogrammazione aggiunto con detta soluzione di trasfezione preparata in c.;
e. incubare le cellule durante la notte a 37 ?C;
f. sostituire il terreno usato in d. con un nuovo lotto di detto terreno di riprogrammazione adatto usato in a.;
g. ripetere i passaggi da b. a f. ogni giorno fino al primo giorno della fase tardiva di detta riprogrammazione;
h. sostituire, al secondo giorno della fase tardiva di detta riprogrammazione, il terreno del passaggio f. con detto terreno di riprogrammazione standard senza detti fattori di trascrizione e incubare le cellule durante la notte a 37?C;
i. sostituire quotidianamente l'ultimo terreno con un terreno di espansione hiPSC adatto e incubare le cellule durante la notte a 37?C fino alla fine di detta riprogrammazione;
17. Il metodo secondo la rivendicazione 16 in cui ciascuno di detti terreni ? ulteriormente integrato con antibiotici adatti.
18. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 16 o 17, in cui detta soluzione di trasfezione comprende ulteriormente mRNA codificanti per i fattori di trascrizione per la riprogrammazione NANOG e LIN28.
19. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 16 a 18, in cui le cellule somatiche precedentemente seminate sono state seminate ad una densit? da 40 a 80 cellule/mm<2>, preferibilmente, circa 60 cellule/mm<2>.
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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