JP2023501520A - 造血前駆細胞の産生 - Google Patents

Abstract

本発明は、多能性幹細胞から造血前駆細胞を生成する改善された方法、及びその生成された造血前駆細胞を提供する。造血前駆細胞は、ＣＸＣＲ４を発現し、骨髄にホーミング及び／又は生着することができる。

Description

本発明は、特性が改善された、造血幹細胞の産生に関する。

造血細胞又は血液細胞は、臨床応用に、及び実験用に需要が大きい。診療現場では、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、抗がん治療などの造血を抑制する治療を受けた患者において、又は血液疾患を遺伝的に受け継いだ患者において、造血を再構成するために使用することができる。さらに、赤血球、血小板、及び好中性顆粒球は、輸血において、及びある特定の血液障害の処置において使用することができる。実験室では、血液細胞は、薬物スクリーニングを含む多くの応用に使用することができる。

現在、このような臨床及び実験用の応用のための血液細胞は、生体ドナーから得られる。しかしながら、ドナー血液の供給が限られると、特に遺伝的に適合性のドナーが必要な場合、治療応用及び薬物スクリーニングが限定される。したがって、ドナー血液以外の血液細胞の供給源を開発する必要性が依然として存在する。例えば、治療応用のための患者に特有のＨＳＣを含む、特徴が明確な機能的血液細胞型の無制限の供給が必要である。

骨髄系細胞は、骨髄中の多能性造血幹細胞に由来し、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）、並びに樹状細胞（ＤＣ）及び破骨細胞を含む単球／マクロファージ系譜の細胞からなる。これらの細胞は、先天免疫及び適応免疫、炎症反応、及び骨リモデリングにおいて重要な役割を果たす。

本発明者らは、造血幹細胞（ＨＳＣ）を生成するためのヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）分化プロトコルを確立した。造血は、胚発生の間の２つの相－原始相及び最終相において生じる。最終的な造血は、細胞治療及び疾患モデリングに広範な可能性を有する、長期にわたって再増殖するＨＳＣの生成を特徴とし、これまでにｈＰＳＣからは得られていない。

本発明は、一部には、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から造血幹細胞（ＨＳＣ）を産生する方法の発見に基づいている。一部の実施形態では、本発明は、以下のステップ：
ａ）多能性幹細胞の集団を得るステップ、
ｂ）０日目に、補足した無血清分化（ＳＦＤ）培地中で、第１の低酸素条件下で細胞を培養するステップ、
ｃ）ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で、第２の低酸素条件下で細胞を培養するステップ、
ｄ）ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で、非低酸素条件下で細胞を培養するステップ、及び
ｅ）ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で、非低酸素拡大条件下で細胞を培養するステップ、並びに
ｆ）造血前駆細胞の集団を回収するステップ
を含む、造血前駆細胞を産生する方法である。

一実施形態では、多能性幹細胞から、又は体細胞の分化転換から造血前駆細胞を産生する方法は、様々な造血系譜細胞に分化することができる造血前駆細胞を生成するための条件下で多能性幹細胞又は体細胞を培養するステップを含み、以下のステップ：（ａ）多能性幹細胞の集団を得るステップ、（ｂ）０日目に、ＳＦＤ培地、１０ｕＭ Ｙ－２７６３２、１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４及び２５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦの中で培養し；１～２日間、ＳＦＤ培地、１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４、５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、及び８ｕＭ ＣＨＩＲ９９０２１で培養し；１日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、１２．５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、及び２５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦで培養し；１～２日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、１２．５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、及び２５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦで培養し；２～４日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、１２．５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯで培養し；３～５日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、１２．５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、１２．５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１、２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍｌ ＳＨＨ、１０ｕｇ／ｍｌアンジオテンシンＩＩ、及び１００ｕＭロサルタンカリウムで、これらの培地を毎日交換しながら培養し；５～１０日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯで、これらの培地を３日毎に交換しながら培養することによって、造血分化を誘導するステップを含む。

一部の実施形態では、本発明は、上記の方法を使用して産生される、造血幹細胞などの造血前駆細胞である。一部の好ましい実施形態では、造血前駆細胞は、細胞表面にＣＸＣＲ４を発現させる。一部の実施形態では、造血前駆細胞は、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ９０＋、又はＴＨＹ１＋である。一部の実施形態では、造血前駆細胞は、ＣＤ３８－、Ｌｉｎ－、ＣＤ４３－、及びＣＤ７３－である。一部の実施形態では、造血前駆細胞は、細胞表面にＣＤ９０を発現させる。一部の実施形態では、造血前駆細胞はＲｕｎｘ１ｃを発現させる。一部の好ましい実施形態では、造血前駆細胞は、長期にわたって再増殖する造血前駆細胞を生成することができる。

以前のプロトコル及び実施例１に示されているプロトコルを使用した際の、ｉＰＳＣからの造血性内皮細胞の形成を示すＦＡＣＳプロットを示す。 ２１日目の、ｉＰＳＣから誘導された造血性内皮細胞からのＨＳＣ様細胞の生成を示す。 分化の２１日目の限界希釈アッセイの結果を示す。図３Ａは、ウェルに異なる数の細胞を入れた場合の、各細胞型を有するウェルのパーセントを示す。図３Ｂは、異なる数の細胞を入れた後に、形成された異なる細胞型のコロニーの数を示す。 分化の２１日目の限界希釈アッセイの結果を示す。図３Ａは、ウェルに異なる数の細胞を入れた場合の、各細胞型を有するウェルのパーセントを示す。図３Ｂは、異なる数の細胞を入れた後に、形成された異なる細胞型のコロニーの数を示す。 造血幹細胞（ＨＳＣ）の標識のためのＧＦＰ－２Ａ－Ｒｕｎｘ１ｃ ｈｉＰＳＣレポーター株の生成を示す。図４Ａは、Ｒｕｎｘ１ｃゲノム遺伝子座を標的とする戦略を示す概略図を示す。Ｒｕｎｘ１ｃは、遠位のプロモーターから固有のエクソンとともに転写される。ガイドＲＮＡは、正確なゲノム編集のために、Ｒｕｎｘ１ｃ転写物のＡＴＧ開始コドンを特異的に標的化するようにデザインした。ＧＦＰ－２Ａ配列をＮ末端に融合させて、分化中のＲｕｎｘ１ｃ陽性造血幹細胞を蛍光標識した。ＬｏｘＰ－ＰＧＫ－ＢＳＤ－ｐＡ－ＬｏｘＰ選択カセットをイントロン１に配置して、正確に標的された細胞集団の濃縮を促進した。ＰＣＲプライマー（表１を参照）は、相同組換えとＧＦＰ－２Ａ－Ｒｕｎｘ１ｃリンカー配列との左接合部を増幅するようにデザインした。図４Ｂは、４Ａで説明されているプライマーを、ゲノム編集後に陽性コロニーをスクリーニングするために使用したことを示す。ブラストサイジン選択の後に、合計４８の単細胞クローンを採取し、増殖させ、ＰＣＲ遺伝子型判定解析にかけた。３８クローンが、アガロースゲルに陽性の遺伝子型判定のバンドを示した（効率＝７９％）。図４Ｃは、ＧＦＰ－２Ａ－Ｒｕｎｘ１ｃ ｈｉＰＳＣ株の選択された陽性クローンの画像を示す。 造血幹細胞（ＨＳＣ）の標識のためのＧＦＰ－２Ａ－Ｒｕｎｘ１ｃ ｈｉＰＳＣレポーター株の生成を示す。図４Ａは、Ｒｕｎｘ１ｃゲノム遺伝子座を標的とする戦略を示す概略図を示す。Ｒｕｎｘ１ｃは、遠位のプロモーターから固有のエクソンとともに転写される。ガイドＲＮＡは、正確なゲノム編集のために、Ｒｕｎｘ１ｃ転写物のＡＴＧ開始コドンを特異的に標的化するようにデザインした。ＧＦＰ－２Ａ配列をＮ末端に融合させて、分化中のＲｕｎｘ１ｃ陽性造血幹細胞を蛍光標識した。ＬｏｘＰ－ＰＧＫ－ＢＳＤ－ｐＡ－ＬｏｘＰ選択カセットをイントロン１に配置して、正確に標的された細胞集団の濃縮を促進した。ＰＣＲプライマー（表１を参照）は、相同組換えとＧＦＰ－２Ａ－Ｒｕｎｘ１ｃリンカー配列との左接合部を増幅するようにデザインした。図４Ｂは、４Ａで説明されているプライマーを、ゲノム編集後に陽性コロニーをスクリーニングするために使用したことを示す。ブラストサイジン選択の後に、合計４８の単細胞クローンを採取し、増殖させ、ＰＣＲ遺伝子型判定解析にかけた。３８クローンが、アガロースゲルに陽性の遺伝子型判定のバンドを示した（効率＝７９％）。図４Ｃは、ＧＦＰ－２Ａ－Ｒｕｎｘ１ｃ ｈｉＰＳＣ株の選択された陽性クローンの画像を示す。 造血幹細胞（ＨＳＣ）の標識のためのＧＦＰ－２Ａ－Ｒｕｎｘ１ｃ ｈｉＰＳＣレポーター株の生成を示す。図４Ａは、Ｒｕｎｘ１ｃゲノム遺伝子座を標的とする戦略を示す概略図を示す。Ｒｕｎｘ１ｃは、遠位のプロモーターから固有のエクソンとともに転写される。ガイドＲＮＡは、正確なゲノム編集のために、Ｒｕｎｘ１ｃ転写物のＡＴＧ開始コドンを特異的に標的化するようにデザインした。ＧＦＰ－２Ａ配列をＮ末端に融合させて、分化中のＲｕｎｘ１ｃ陽性造血幹細胞を蛍光標識した。ＬｏｘＰ－ＰＧＫ－ＢＳＤ－ｐＡ－ＬｏｘＰ選択カセットをイントロン１に配置して、正確に標的された細胞集団の濃縮を促進した。ＰＣＲプライマー（表１を参照）は、相同組換えとＧＦＰ－２Ａ－Ｒｕｎｘ１ｃリンカー配列との左接合部を増幅するようにデザインした。図４Ｂは、４Ａで説明されているプライマーを、ゲノム編集後に陽性コロニーをスクリーニングするために使用したことを示す。ブラストサイジン選択の後に、合計４８の単細胞クローンを採取し、増殖させ、ＰＣＲ遺伝子型判定解析にかけた。３８クローンが、アガロースゲルに陽性の遺伝子型判定のバンドを示した（効率＝７９％）。図４Ｃは、ＧＦＰ－２Ａ－Ｒｕｎｘ１ｃ ｈｉＰＳＣ株の選択された陽性クローンの画像を示す。 ｈｉＰＳＣの分化におけるＧＦＰ陽性造血幹細胞を視覚化して示す。ＧＦＰ－２Ａ－Ｒｕｎｘ１ｃ ｉＰＳＣ（０日目、上段左パネル）は最初に内皮に分化し（９日目、上段右パネル）、次に内皮から造血への移行（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ：ＥＨＴ）が誘導され、ＧＦＰ陰性内皮層の選択された領域（破線の枠、「血島」）からＧＦＰ陽性造血幹細胞（１４日目、中段のパネル）が出現した。１７日目に、ＧＦＰ陽性ＨＳＣの産生は、もはやある特定の領域に限定されず、組織培養の全体にわたってより顕著になった（１７日目、下段パネル）。 造血分化中の、ＧＦＰ－２Ａ－Ｒｕｎｘ１ｃ ｉＰＳＣの表面マーカーの発現パターンの経時変化を示す。（Ａ）単一陽性集団。（Ｂ）Ｒｕｎｘ１ｃ＋ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋推定造血幹細胞集団。 造血分化中の、ＧＦＰ－２Ａ－Ｒｕｎｘ１ｃ ｉＰＳＣの表面マーカーの発現パターンの経時変化を示す。（Ａ）単一陽性集団。（Ｂ）Ｒｕｎｘ１ｃ＋ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋推定造血幹細胞集団。 ９日目及び１４日目のＨＳＣ ＣＤ３４対ＧＦＰ－Ｒｕｎｘ１ｃの発現を示す。 １６日目及び１７日目のＨＳＣ ＣＤ３４対ＧＦＰ－Ｒｕｎｘ１ｃの発現を示す。 ２０日目及び２１日目のＨＳＣ ＣＤ３４対ＧＦＰ－Ｒｕｎｘ１ｃの発現を示す。 ＬＴ－ｉＰＳＣ及びＧＦＰ－Ｒｕｎｘ１ｃ ｉＰＳＣからのＣＦＵアッセイのための細胞集団の選別を示す。 １６日目、１７日目、２０日目、及び２１日目のＣＦＵ全細胞数を示す。 １６日目、１７日目、２０日目、及び２１日目の共通前駆細胞マーカーのＣＦＵパネルを示す。 １６日目、１７日目、２０日目、及び２１日目のリンパ系前駆細胞マーカーのＣＦＵパネルを示す。 １６日目、１７日目、２０日目、及び２１日目の骨髄系前駆細胞マーカーのＣＦＵパネルを示す。 １６日目、１７日目、２０日目、及び２１日目の骨髄系前駆細胞マーカーのＣＦＵパネルを示す。

最近、多能性幹細胞株が、ｈＥＳＣの多能性の維持に不可欠なある特定の遺伝子の挿入により、ヒト線維芽細胞から得られた（Ｙｕ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．２００７，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１８：１９１７－１９２０、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．２００７，Ｃｅｌｌ．１３１：８６１－８７２、Ｐａｒｋ，Ｉ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．２００８，Ｎａｔｕｒｅ．４５１：１４１－１４６）。これらのいわゆるヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、ｈＥＳＣと同様に振る舞い、即ち、自己再生並びに大規模な増殖及び３種全ての胚葉への分化の能力がある。期待されるのは、様々な疾患の患者から生成したｉＰＳＣ株を使用して、細胞レベルで特定の遺伝形質を有する任意のタイプの前駆細胞又は分化細胞を得ることができ、したがって、疾患の発病機序をｉｎ ｖｉｔｒｏで解析する類のない機会がもたらされるかもしれないということである。

過去において、ＯＰ９骨髄間質細胞と共培養することによるｈＥＳＣの造血細胞への造血分化のシステムが確立され（Ｖｏｄｙａｎｉｋ，Ｍ．Ａ．，Ｂｏｒｋ，Ｊ．Ａ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｓｌｕｋｖｉｎ，１．１．２００５，Ｂｌｏｏｄ．１０５：６１７－６２６）、そのシステムは、最も原始的な多能性造血細胞の２つの亜集団が、それらに共通のＣＤ４３の発現及びＣＤ４５の差次的発現に基づいて、ｈＥＳＣのＯＰ９との共培養物中に出現することを特徴付けた。広範なリンパ系・骨髄系分化能を有するｌｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ＣＤ４５－細胞が、共培養中に最初に出現する。その後、骨髄系前駆細胞中に濃縮されたｌｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞が出現する（Ｖｏｄｙａｎｉｋ，Ｍ．Ａ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｓｌｕｋｖｉｎ，Ｉ．Ｉ．２００６，Ｂｌｏｏｄ．１０８：２０９５－２１０５）。Ｓｌｕｋｖｉｎ研究室は、ｉＰＳＣがＯＰ９との共培養中で血液細胞に分化する場合に、同様のパターンの造血分化が観察されることを立証した（Ｃｈｏｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．２００９，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２７：５５９－５６７）。

本発明のある特定の実施形態では、ヒト胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞を含む幹細胞を含む、造血細胞ではないヒト多能性細胞のフォワードプログラミングによって、又は造血細胞ではない体細胞の分化転換によって、造血細胞又は造血細胞の前駆体を提供するための方法及び組成物が開示されている。１つ又は複数の造血前駆細胞プログラミング因子遺伝子を含む外因性発現カセット及び／又は造血細胞若しくは造血前駆細胞の同定に特異的なレポーター発現カセットを含む細胞も提供される。一部の実施形態では、細胞は、胚性幹細胞、胎生幹細胞、又は成人幹細胞を含むがこれらに限定されない幹細胞とすることができる。さらなる実施形態では、細胞は、任意の体細胞とすることができる。

幹細胞は、全てではなくとも大多数の多細胞生物に見られる細胞である。それは、有糸細胞分裂により自己を再生する能力、及び様々な特殊化した細胞型に分化する能力を特徴とする。哺乳動物の幹細胞を大きく分けた２つのタイプは、胚盤胞に見られる胚性幹細胞、及び成体組織に見られる成人幹細胞である。発生中の胚において、幹細胞は、特殊化した胚組織の全てに分化することができる。成体において、幹細胞及び前駆細胞は、身体の修復系として作用し、特殊化した細胞を補充し、血液、皮膚又は腸組織などの再生器官の正常な代謝回転を維持したりもする。

ヒト多能性幹細胞（ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで長期の増殖をする能力があり、同時に造血細胞及び造血前駆細胞を含む、身体の全ての細胞型に分化する能力を保持している。このため、これらの細胞は、医薬品開発及び治療上の使用の両方に、患者に特有の機能的造血細胞及び造血前駆細胞の無制限の供給をもたらす可能性があると思われる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣの造血細胞及び造血前駆細胞への分化は、正常なｉｎ ｖｉｖｏ発生を再現する。即ち、それは中胚葉分化及び造血の特定化を含む正常な連続的発生段階を経る。その連続的発生プロセスには、分化の異なる段階で異なる成長因子の添加が必要である。本発明のある特定の態様は、ヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣからのフォワードプログラミングによって、又はｉＰＳＣの生成と類似の、造血細胞の分化／機能に重要な転写因子の組合せの発現による、全てではなくとも大部分の正常な発生段階をバイパスする体細胞からの分化転換によって、十分に機能的な造血前駆細胞を提供する。この手法は、時間効率及び費用効率をより高めて、ヒト成人造血細胞及び造血細胞の前駆体と同一ではなくとも高度に類似した機能を有する造血前駆細胞及び造血細胞を生成することができる。加えて、ヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣは、その無制限の増殖能により、造血前駆細胞の分化のための出発細胞集団として、体細胞より有利であり得る。本発明の一部として産生される造血細胞及び造血細胞の前駆体の例としては、ＣＸＣＲ４を発現する細胞、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ９０＋及びＴＨＹ１＋である細胞、ＣＤ３８－、Ｌｉｎ－、ＣＤ４３－又はＣＤ７３－である細胞、ＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ３８－、及びＬｉｎ－である細胞、ＣＤ９０を発現する細胞、Ｒｕｎｘ１ｃを発現する細胞、又は上記の任意の組合せが挙げられる。

胚性幹細胞株（ＥＳ細胞株）は、胚盤胞又は初期桑実期胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）の胚盤葉上層組織に由来する細胞の培養物である。胚盤胞は初期段階の胚であり、ヒトではおよそ４～５日齢で、５０～１５０細胞からなる。ＥＳ細胞は多能性であり、発生中に、３種の一次胚葉、即ち外胚葉、内胚葉及び中胚葉の全ての誘導を生じさせる。換言すると、ＥＳ細胞は、特定の細胞型に十分且つ必要な刺激が付与されると、成人の身体の細胞型の各々に発達し得る。ＥＳ細胞は、胚体外膜又は胎盤には寄与しない。

現在まで、ほとんどの研究が、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳ）又はヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を使用していた。両方とも幹細胞の本質的特性を有するが、未分化状態を維持するためには極めて異なる環境を必要とする。マウスＥＳ細胞は、ゼラチンの層上で成長させることができ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在を必要とする。ヒトＥＳ細胞は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）のフィーダー層上で成長させることができ、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ又はＦＧＦ－２）の存在を必要とすることが多い。最適な培養条件又は遺伝子操作（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）がなければ、胚性幹細胞は急速に分化することになる。

ヒト胚性幹細胞は、複数の転写因子及び細胞表面タンパク質の存在によっても定義され得る。転写因子Ｏｃｔ－４、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ－２は、分化及び多能性の維持につながる遺伝子の抑制を確実にする中心的な制御ネットワークを形成する（Ｂｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ｈＥＳ細胞を同定するために広く使用される細胞表面抗原には、糖脂質であるＳＳＥＡ３及びＳＳＥＡ４、並びにケラタン硫酸抗原であるＴｒａ－１－６０及びＴｒａ－１－８１が含まれる。

ヒトＥＳ細胞は、前述の方法を使用して胚盤胞から得ることができる（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｔｈｏｍｓｏｎ ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９８；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ，２０００）。一方法において、５日目のヒト胚盤胞をウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に曝露し、次いで、１：５に希釈されたモルモット補体に曝露して、栄養外胚葉細胞を溶解させる。溶解した栄養外胚葉細胞を、無傷の内部細胞塊から除去した後に、内部細胞塊を、ガンマ不活化マウス胚性線維芽細胞のフィーダー層上で、ウシ胎仔血清の存在下で培養する。９～１５日後、内部細胞塊に由来する細胞の凝集塊は、化学的に（即ちトリプシンに曝露して）又は機械的に分離し、ウシ胎仔血清及びマウス胚性線維芽細胞のフィーダー層を含有する新鮮培地に再播種することができる。さらに増殖させて、未分化形態を有するコロニーをマイクロピペットで選択し、機械的に分離して凝集塊にし、再播種する（米国特許第６，８３３，２６９号明細書を参照）。ＥＳ様形態は、細胞質に対する核の比が明らかに高く、顕著な核小体を有する密集したコロニーとして特徴付けられる。得られたＥＳ細胞は、短時間のトリプシン処理によって、又はマイクロピペットによる個々のコロニーの選択によって、普通に継代することができる。一部の方法において、ヒトＥＳ細胞は、血清を用いずに、線維芽細胞のフィーダー層上で、塩基性線維芽細胞成長因子の存在下でＥＳ細胞を培養することによって成長させることができる（Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，２０００）。他の方法において、ヒトＥＳ細胞は、フィーダー細胞層を用いずに、Ｍａｔｒｉｇｅｌ又はラミニンなどのタンパク質マトリックス上で、塩基性線維芽細胞成長因子を含有する「馴化」培地の存在下で細胞を培養することによって成長させることができる（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２００１）。培地は、事前に線維芽細胞とともに共培養することによって馴化させる。

ＥＳ細胞の別の供給源は、樹立されたＥＳ細胞株である。種々のマウス細胞株及びヒトＥＳ細胞株が知られており、それらの成長及び増殖のための条件は規定されている。例えば、マウスＣＧＲ８細胞株は、マウス１２９株の胚の内部細胞塊から樹立され、ＣＧＲ８細胞の培養物は、ＬＩＦの存在下で、フィーダー層を用いずに成長させることができる。さらなる例として、ヒトＥＳ細胞株であるＨｌ、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３及びＨ１４は、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらによって樹立された。加えて、Ｈ９株のサブクローンであるＨ９．１及びＨ９．２が開発された。当技術分野において公知のほぼ全てのＥＳ細胞株又は幹細胞株、例えば、Ｙｕ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（２００８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２２（１５）：１９８７－９７に記載されているものなどは、本発明に関して使用することができると考えられる。この文献は、参照により、本明細書に援用される。

本発明に関して使用するためのＥＳ細胞の供給源は、胚盤胞、胚盤胞の内部細胞塊の培養に由来する細胞、又は樹立細胞株の培養物から得られる細胞とすることができる。したがって、本明細書で使用する場合、「ＥＳ細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊細胞、内部細胞塊細胞の培養物から得られるＥＳ細胞、及びＥＳ細胞株の培養物から得られるＥＳ細胞を指すことができる。

人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、ＥＳ細胞の特性を有するが、分化した体細胞の初期化によって得られる細胞である。人工多能性幹細胞は、種々の方法によって得られてきた。一方法においては、レトロウイルス導入を使用して、成人ヒト真皮線維芽細胞に、転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ及びＫｌｆ４をトランスフェクトする（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）。トランスフェクトされた細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を補足した培地の中でＳＮＬフィーダー細胞（ＬＩＦを産生するマウス細胞線維芽細胞株）上に播種する。およそ２５日後に、ヒトＥＳ細胞コロニーに類似したコロニーが培養下で出現する。ＥＳ細胞様コロニーを採取し、フィーダー細胞上で、ｂＦＧＦの存在下で増殖させる。

細胞特性に基づくと、ＥＳ細胞様コロニーの細胞は、人工多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞はヒトＥＳ細胞と形態的に類似しており、種々のヒトＥＳ細胞マーカーを発現する。また、人工多能性幹細胞は、ヒトＥＳ細胞の分化をもたらすことが知られている条件下で成長させた場合、然るべく分化する。例えば、人工多能性幹細胞は、造血細胞構造及び造血細胞マーカーを有する細胞に分化することができる。例えば、Ｙｕ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，２００８に記載されているものを含むほぼ全てのｉＰＳ細胞又は細胞株を、本発明に関して使用することができると考えられる。

別の方法においては、レンチウイルス導入を使用して、ヒト胎児線維芽細胞又は新生児線維芽細胞に、４つの遺伝子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８をトランスフェクトする（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００７）。感染後１２～２０日で、ヒトＥＳ細胞の形態をもつコロニーが目に見えるようになる。コロニーを採取し、増殖させる。コロニーを構成する人工多能性幹細胞は、ヒトＥＳ細胞と形態的に類似しており、種々のヒトＥＳ細胞マーカーを発現し、マウスに注入後、神経組織、軟骨、及び腸上皮を有するテラトーマを形成する。

マウスから人工多能性幹細胞を調製する方法もまた知られている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，２００６）。ｉＰＳ細胞の誘導は、典型的には、Ｓｏｘファミリーの少なくとも１つのメンバー及びＯｃｔファミリーの少なくとも１つのメンバーの発現、又はそれらへの曝露を必要とする。Ｓｏｘ及びＯｃｔは、ＥＳ細胞のアイデンティティーを特定する転写制御階層の中心であると考えられる。例えば、Ｓｏｘは、Ｓｏｘ－１、Ｓｏｘ－２、Ｓｏｘ－３、Ｓｏｘ－１５、又はＳｏｘ－１８であり得、ＯｃｔはＯｃｔ－４であり得る。Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、又はｃ－Ｍｙｃのような追加の因子は、初期化効率を高め得る。初期化因子の特性のセットは、Ｓｏｘ－２、Ｏｃｔ－４、Ｎａｎｏｇ及び任意選択によりＬｉｎ－２８を含むセット、又はＳｏｘ－２、Ｏｃｔ４、Ｋｉｆ及び任意選択によりｃ－Ｍｙｃを含むセットとすることができる。

ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞のように、ＳＳＥＡ－１、ＳＳＥＡ－３及びＳＳＥＡ－４に対する抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．）、並びにＴＲＡ－１－６０及びＴＲＡ－１－８１に対する抗体（Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７）を使用して、免疫組織化学検査又はフローサイトメトリーによって同定又は確認することができる特徴的な抗原を有する。胚性幹細胞の多能性は、８～１２週齢の雄ＳＣＩＤマウスの後肢筋におよそ０．５～１０×ｌ０^６細胞を注入することによって確認することができる。３種の胚葉の各々の少なくとも１つの細胞型を示すテラトーマが発生する。

本発明のある特定の態様において、ｉＰＳ細胞は、上記のように、Ｏｃｔファミリーメンバー及びＳｏｘファミリーメンバー、例えばＯｃｔ４及びＳｏｘ２を、Ｋｉｆ又はＮａｎｏｇと組み合わせて含む初期化因子を使用して、初期化体細胞から作製される。初期化のための体細胞は、誘導されて多能性になり得る任意の体細胞、例えば、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉系細胞、肝臓細胞、胃細胞、又は～細胞とすることができる。ある特定の態様において、Ｔ細胞もまた、初期化のための体細胞の供給源として使用することができる（米国特許出願第６１／１８４，５４６号明細書を参照、これは参照により本明細書に援用される）。

初期化因子は、１つ又は複数のベクター、例えば、組込み型ベクター又はエピソームベクター、例えば、ＥＢＹエレメントベースの系（米国特許出願第６１／０５８、８５８号明細書、これは参照により本明細書に援用される。Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００９を参照）に含まれる発現カセットから発現させることができる。さらなる態様において、初期化タンパク質は、タンパク質導入によって、体細胞に直接導入することが可能である（米国特許出願第６１／１７２，０７９号明細書を参照、これは参照により本明細書に援用される）。

本発明のある特定の態様において、分化転換の方法、即ち、１つの体細胞型から別の体細胞型への直接的転換、例えば、非造血性体細胞から造血前駆細胞又は造血細胞を誘導する方法も提供される。しかしながら、ヒト体細胞、特に生体ドナーからのものは、供給が限定される場合がある。ある特定の態様において、プログラミングのための出発細胞の無制限の供給を提供するために、不死化遺伝子又は不死化タンパク質、例えばｈＴＥＲＴ又はがん遺伝子の導入によって、体細胞を不死化することができる。細胞の不死化は、可逆的（例えば、除去可能な発現カセットを使用して）又は誘導可能（例えば、誘導性プロモーターを使用して）にすることができる。

体細胞は、本発明のある特定の態様において、一次細胞（非不死化細胞）、例えば、動物から新鮮単離したものとしてもよく、又は細胞株（不死化細胞）由来としてもよい。細胞は、対象から単離された後に、細胞培養下で維持することができる。ある特定の実施形態では、細胞は、本発明の方法に使用される前に、１回又は２回以上（例えば、２～５回、５～１０回、１０～２０回、２０～５０回、５０～１００回の間又はそれ以上）継代される。一部の実施形態では、細胞は、本発明の方法に使用される前に、１、２、５、１０、２０、又は５０回以下継代されたことになる。細胞は、凍結、解凍などをしてもよい。

本明細書において使用される、又は記載される体細胞は、天然の体細胞としてもよく、又は操作された体細胞、即ち、遺伝子改変された体細胞としてもよい。本発明の体細胞は、通常、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、霊長類細胞又はマウス細胞などである。それらは、周知の方法によって得てもよいし、生体細胞を含有する任意の器官又は組織、例えば、血液、骨髄、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器、膀胱、腎臓、尿道及び他の泌尿器などから得ることもできる。

本発明において有用な哺乳動物の体細胞としては、以下に限定されないが、セルトリ細胞、内皮細胞、顆粒膜細胞、神経細胞、膵島細胞、表皮細胞、上皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（Ｂリンパ球及びＴリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、及び他の筋細胞などが挙げられる。

体細胞は、部分的に又は完全に分化し得る。分化は、あまり特殊化していない細胞がより特殊化した細胞型になるプロセスである。細胞分化は、サイズ、形状、極性、代謝活性、遺伝子発現及び／又は細胞のシグナルに対する応答性を変化させることができる。例えば、造血幹細胞は、分化して、骨髄系譜（単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、赤血球－巨核球系譜（赤血球、巨核球、血小板）、及びリンパ球系譜（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）を含む全ての血液細胞型を生じる。分化の経路に沿って進行する間に、細胞の最終的運命がより確定してくる。本明細書に記載されるように、部分的に分化した体細胞と完全に分化した体細胞との両方が、本明細書に記載されるようにプログラムされて、造血細胞及び造血前駆細胞などの所望の細胞型を産生することができる。

一実施形態では、本発明は、好中球、好酸球、マクロファージ、破骨細胞、樹状細胞及びランゲルハンス細胞を、哺乳動物の多能性幹細胞、好ましくはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ、例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９１７－１９２０を参照、これは、ｉＰＳＣを作製する一方法について、参照により援用される）から、記載された方法を使用する、ｈＥＳＣ又はｉＰＳＣからｌｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋骨髄系前駆細胞が濃縮された細胞への分化によって効率的に産生する方法である。一部の実施形態では、細胞は、ｌｉｎ＋ＣＤ３４－ＣＤ４３－ＣＤ４５＋前駆細胞へとさらに分化することができる。

ｌｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞集団の生成
本発明は、一部には、ヒト多能性幹細胞ｓ（ｈＰＳＣ）から造血幹細胞（ＨＳＣ）を産生する方法の発見に基づいている。ｈＰＳＣは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞、又は分化転換した体細胞とすることができる。本発明の方法から産生されたＨＳＣは、様々な造血系譜細胞に分化することができる。本発明の方法は、以下のステップを含む。

第１のステップは、上記のように、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、又は分化転換した体細胞から誘導することができるヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の細胞又は集団を得るステップである。

次のステップは、０日目に、補足した無血清分化（ＳＦＤ）培地（７５：２５のＩＭＤＭ：ハムＦ－１２、０．０５％ＢＳＡ、１×Ｂ２７、０．５×Ｎ２サプリメント、１×ＧｌｕｔａＭａｘ及び１×ペニシリン－ストレプトマイシン、０．５ｍＭアスコルビン酸、４５０μＭモノチオグリセロール、並びに１５０μｇ／ｍＬホロ－トランスフェリン）の中で細胞を培養するステップである。０日目は、分化プロトコルが開始される日、例えば、ＳＦＤ培地が細胞の集団に導入される日である。これは、細胞の均等な分布、及びｉＰＳＣの播種などのための待機期間の可能性を見込んでいる。このため、細胞は、ＳＦＤ培地の導入前のある期間、培養下で維持することができる。例えば、細胞は、ＳＦＤ培地の導入０日目の前に、７日間まで維持されてもよい。理論に縛られるものではないが、この補足したＳＦＤ培地の導入のステップは、造血分化及び中胚葉分化を誘導する。一部の実施形態では、細胞は、補足したＳＦＤ培地中で、３、４、５、６、又は７日間培養することができる。一部の実施形態では、細胞は、補足したＳＦＤ培地中で３日間培養される。本発明の一部の実施形態では、ＢＭＰ４を、ＳＦＤ培地に、０．１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１～１００ｎｇ／ｍｌ、より一層好ましくは５～２５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で添加してもよい。一部の実施形態では、他のＢＭＰ、又はＡＬＫ１、ＡＬＫ２、及び／若しくはＡＬＫ３シグナル伝達を活性化する低分子を、ＢＭＰ４の代わりに、又はそれに加えて添加することができる。一部の実施形態では、ＢＭＰ２又はＢＭＰ８ａを、ＢＭＰ４の代わりに、又はそれに加えて、１～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で添加してもよい。一部の実施形態では、ＢＭＰ４、他のＢＭＰ、並びに／又はＡＬＫ１、ＡＬＫ２、及び／若しくはＡＬＫ３シグナル伝達を活性化する低分子を、０日目～３日目に培地に添加してもよい。理論に縛られるものではないが、ＢＭＰ４及び他のＢＭＰ、又はＡＬＫ１、ＡＬＫ２、及び／若しくはＡＬＫ３シグナル伝達を活性化する低分子は、ＳＭＡＤシグナル伝達を活性化して中胚葉を形成する。一部の実施形態では、ＢＭＰ４、他のＢＭＰ並びに／又はＡＬＫ１、ＡＬＫ２、及び／若しくはＡＬＫ３シグナル伝達を活性化する低分子は、本発明のこのステップの必須の構成要素である。一部の実施形態では、ｂＦＧＦを、１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０～１００ｎｇ／ｍｌ、より一層好ましくは２０～５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で培地に添加してもよい。一部の実施形態では、他のＦＧＦ又はＭＡＰｋアゴニストを、ｂＦＧＦの代わりに、又はそれに加えて添加することができる。一部の実施形態では、ｂＦＧＦ、他のＦＧＦ及び／又はＭＡＰｋアゴニストを、０日目～３日目に培地に添加してもよい。理論に縛られるものではないが、ｂＦＧＦ、他のＦＧＦ又はＭＡＰｋアゴニストは、生存及び中胚葉へのパターニングにおいて助けとなる。一部の実施形態では、ｂＦＧＦ、他のＦＧＦ及び／又はＭＡＰｋアゴニストは、本発明のこのステップの必須の構成要素である。一部の実施形態では、Ｙ－２７６３２を、１００ｎＭ～３０μＭ、好ましくは１μＭ～２０μＭ、より一層好ましくは５μＭ～２０μＭの範囲で培地に添加してもよい。一部の実施形態では、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を、Ｙ－２７６３２の代わりに、又はそれに加えて添加することができる。一部の実施形態では、Ｙ－２７６３２及び／又はＲｈｏキナーゼ阻害剤を、０日目に培地に添加してもよい。理論に縛られるものではないが、Ｙ－２７６３２及び／又はＲｈｏキナーゼ阻害剤は、細胞が皿の中で均等に分布して単細胞として生存することを可能にする。一部の実施形態では、ＣＨＩＲ９９０２１を、０．１～２０μＭ、好ましくは１～１０、より一層好ましくは５～１０μＭの範囲で培地に添加してもよい。一部の実施形態では、ＷＮＴタンパク質、他のＧＳＫ３ｂ阻害剤、及び／又はβ－カテニンの安定化をもたらす低分子、例えば、Ｗｎｔ３ａ、ＦＺＭ１．８、ＢＩＯ、塩化リチウム、ＣＨＩＲ－９８０１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６を、ＣＨＩＲ９９０２１の代わりに、又はそれに加えて添加することができる。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａを、ＣＨＩＲ９９０２１の代わりに、又はそれに加えて、１～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で添加してもよく、ＦＺＭ１．８を、ＣＨＩＲ９９０２１の代わりに、又はそれに加えて、１００ｎＭ～１００μＭの濃度範囲で添加してもよく、ＢＩＯを、ＣＨＩＲ９９０２１の代わりに、又はそれに加えて、１００ｎＭ～１００μＭの濃度範囲で添加してもよく、塩化リチウムを、ＣＨＩＲ９９０２１の代わりに、又はそれに加えて、０．１ｍＭ～２０ｍＭの濃度範囲で添加してもよく、ＣＨＩＲ－９８０１４を、ＣＨＩＲ９９０２１の代わりに、又はそれに加えて、５００ｎＭ～５０μＭの濃度範囲で添加してもよく、ＳＢ２１６７６３を、ＣＨＩＲ９９０２１の代わりに、又はそれに加えて、５００ｎＭ～５０μＭの濃度範囲で添加してもよく、且つ／又はＳＢ４１５２８６を、ＣＨＩＲ９９０２１の代わりに、又はそれに加えて、５００ｎＭ～５０μＭの濃度範囲で添加してもよい。一部の実施形態では、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ３ａ、ＦＺＭ１．８、ＢＩＯ、塩化リチウム、ＣＨＩＲ－９８０１４、ＳＢ２１６７６３、及び／又はＳＢ４１５２８６を、０日目～２日目に、１日目～２日目に、又は２日目にのみ、培地に添加してもよい。理論に縛られるものではないが、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ３ａ、ＦＺＭ１．８、ＢＩＯ、塩化リチウム、ＣＨＩＲ－９８０１４、ＳＢ２１６７６３、及び／又はＳＢ４１５２８６は、ＧＳＫ３ｂを阻害することによってＷｎｔシグナル伝達を活性化する。一部の実施形態では、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ３ａ、ＦＺＭ１．８、ＢＩＯ、塩化リチウム、ＣＨＩＲ－９８０１４、ＳＢ２１６７６３、及び／又はＳＢ４１５２８６は、本発明のこのステップの必須の構成要素である。一部の実施形態では、ＳＢ－４３１５４２を、０．１～２０μＭの範囲で培地に添加してもよい。これは効率を高めることが判明した。一部の実施形態では、ＳＭＡＤシグナル伝達を阻害する他の手段、例えば、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、及び／又はＲｅｐＳｏｘなどを、ＳＢ－４３１５４２の代わりに、又はそれに加えて添加してもよい。一部の実施形態では、ＬＹ２１０９７６１を、ＳＢ－４３１５４２の代わりに、又はそれに加えて、５００ｎＭ～５０μＭの濃度範囲で添加してもよく、ＳＢ５２５３３４を、ＳＢ－４３１５４２の代わりに、又はそれに加えて、５００ｎＭ～５０μＭの濃度範囲で添加してもよく、ＳＢ５０５１２４を、ＳＢ－４３１５４２の代わりに、又はそれに加えて、５００ｎＭ～５０μＭの濃度範囲で添加してもよく、ＧＷ７８８３８８を、ＳＢ－４３１５４２の代わりに、又はそれに加えて、５００ｎＭ～５０μＭの濃度範囲で添加してもよく、ＬＹ３６４９４７を、ＳＢ－４３１５４２の代わりに、又はそれに加えて、５００ｎＭ～５０μＭの濃度範囲で添加してもよく、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）を、ＳＢ－４３１５４２の代わりに、又はそれに加えて、５００ｎＭ～５０μＭの濃度範囲で添加してもよく、且つ／又はＲｅｐＳｏｘを、ＳＢ－４３１５４２の代わりに、又はそれに加えて、５００ｎＭ～５０μＭの濃度範囲で添加してもよい。一部の実施形態では、ＳＢ－４３１５４２、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、及び／又はＲｅｐＳｏｘを、１日目～３日目に、２日目及び３日目に、又は３日目にのみ、培地に添加してもよい。理論に縛られるものではないが、ＳＢ－４３１５４２、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、及び／又はＲｅｐＳｏｘは、ＡＬＫ／ＳＭＡＤシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＳＦＤ培地に、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、及びＣＨＩＲ９９０２１を、上記の量及び時間で補足する。一部の実施形態では、ＳＦＤ培地に、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＣＨＩＲ９９０２１、及びＳＢ－４３１５４２を、上記の量及び時間で補足する。一実施形態では、ＳＦＤ培地に、１０μＭ Ｙ－２７６３２を０日目に；１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４を０日目、１日目、及び２日目に；２５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを０日目、１日目、及び２日目に；８μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を１日目及び２日目に；且つ６μＭ ＳＢ－４３１５４２を２日目に補足する。細胞を、この培地中で３日間まで培養する。このステップは、Ｏ_２濃度が１０％未満、好ましくは５％、及びＣＯ_２濃度が１％～１０％の間、好ましくは５％であり、３２～３９℃、好ましくは３７℃である低酸素条件下で行われる。

次のステップは、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で、Ｏ_２濃度が１０％未満、好ましくは５％、及びＣＯ_２濃度が１％～１０％の間、好ましくは５％であり、３２～３９℃、好ましくは３７℃である低酸素条件下で細胞を培養するステップである。理論に縛られるものではないが、このステップは、内皮の形成を誘導する。一部の実施形態では、細胞は、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で、低酸素条件下で、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、又は９日目まで培養することができる。一部の実施形態では、細胞は、補足したＳＦＤ培地中で、９日目まで培養される。本発明の一部の実施形態では、ｂＦＧＦを、１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０～１００ｎｇ／ｍｌ、より一層好ましくは２０～５０ｎｇ／ｍｌの範囲で、培地に添加してもよい。一部の実施形態では、他のＦＧＦ又はＭＡＰｋアゴニストを、ｂＦＧＦの代わりに、又はそれに加えて添加することができる。一部の実施形態では、ｂＦＧＦ、他のＦＧＦ又はＭＡＰｋアゴニストを、３日目から１４日目まで、又はそれより長期、例えば、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、１９日目、２０日目、又は２１日目まで、培地に添加してもよい。一部の実施形態では、ＳＢ－４３１５４２を、０．１～２０μＭの範囲で培地に添加してもよい。一部の実施形態では、ＳＭＡＤシグナル伝達を阻害する他の手段、例えば、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、及び／又はＲｅｐＳｏｘを、ＳＢ－４３１５４２の代わりに、又はそれに加えて添加してもよい。一部の実施形態では、ＬＹ２１０９７６１を、ＳＢ－４３１５４２の代わりに、又はそれに加えて、５００ｎＭ～５０μＭの濃度範囲で添加してもよく、ＳＢ５２５３３４を、ＳＢ－４３１５４２の代わりに、又はそれに加えて、５００ｎＭ～５０μＭの濃度範囲で添加してもよく、ＳＢ５０５１２４を、ＳＢ－４３１５４２の代わりに、又はそれに加えて、５００ｎＭ～５０μＭの濃度範囲で添加してもよく、ＧＷ７８８３８８を、ＳＢ－４３１５４２の代わりに、又はそれに加えて、５００ｎＭ～５０μＭの濃度範囲で添加してもよく、ＬＹ３６４９４７を、ＳＢ－４３１５４２の代わりに、又はそれに加えて、５００ｎＭ～５０μＭの濃度範囲で添加してもよく、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）を、ＳＢ－４３１５４２の代わりに、又はそれに加えて、５００ｎＭ～５０μＭの濃度範囲で添加してもよく、且つ／又はＲｅｐＳｏｘを、ＳＢ－４３１５４２の代わりに、又はそれに加えて、５００ｎＭ～５０μＭの濃度範囲で添加してもよい。一部の実施形態では、ＳＢ－４３１５４２、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９）、及び／又はＲｅｐＳｏｘを、３日目に、又は３日目～４日目に、又はそれより長期、例えば９日目まで、培地に添加してもよい。一部の実施形態では、ＶＥＧＦを、０．１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０～１００ｎｇ／ｍｌ、より一層好ましくは２０～５０ｎｇ／ｍｌの範囲で培地に添加してもよい。一部の実施形態では、血管新生を刺激する薬物、例えば、ＶＥＧＦ－Ｃ、アンジオポエチン－１、２、３、及び／又は４、ＫＤＲ／ＦＬＴ－１アゴニスト、ｉ／ｅＮＯＳアゴニスト及び／又は一酸化窒素を、ＶＥＧＦの代わりに、又はそれに加えて添加してもよい。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ｃ、アンジオポエチン－１、２、３、及び／又は４を、ＶＥＧＦの代わりに、又はそれに加えて、１～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で添加してもよい。一部の実施形態では、ＶＥＧＦを、３日目から１４日目まで、又はそれより長期、例えば、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、１９日目、２０日目、又は２１日目まで、培地に添加してもよい。理論に縛られるものではないが、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ｃ、アンジオポエチン－１、２、３、及び／若しくは４、ＫＤＲ／ＦＬＴ－１アゴニスト、ｉ／ｅＮＯＳアゴニスト並びに／又は一酸化窒素は、内皮細胞の形成及び生存を促進する。一部の実施形態では、ＨＳＣカクテルを、６日目から２１日目まで、培地に添加してもよい。ＨＳＣカクテルは、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－３、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＧＦ－１、ＩＬ－１１、及びＥＰＯのうち１つ又は複数を含有することができる。一部の実施形態では、ＨＳＣカクテルは、各々１～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－３、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＧＦ－１、及び／若しくはＩＬ－１１、並びに／又は０．１～２０Ｕ／ｍｌの濃度範囲のＥＰＯのうち１つ又は複数を含有することができる。一実施形態では、ＨＳＣカクテルは、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯを含有する。

次のステップは、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で、Ｏ_２濃度が１０％より高く３０％まで、好ましくは正常酸素圧のレベル又は１５～２０％、及びＣＯ_２濃度が１％～１０％の間、好ましくは５％であり、３２～３９℃、好ましくは３７℃である非低酸素条件下で細胞を培養するステップである。理論に縛られるものではないが、このステップは、内皮から造血への移行を誘導する。一部の実施形態では、細胞は、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中、低酸素条件下の後に（例えば、９日目から）、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中、非低酸素条件下で２１日目及びその先まで培養される。一部の実施形態では、細胞は、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で、非低酸素条件下で、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、又は１９日目まで培養することができる。一部の実施形態では、細胞は、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で、非低酸素条件下で、１４日目まで培養される。本発明の一部の実施形態では、ｂＦＧＦを、１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５～５０ｎｇ／ｍｌ、より一層好ましくは１０～２５ｎｇ／ｍｌの範囲で培地に添加してもよい。ｂＦＧＦの代わりに、又はそれに加えて添加してもよい他の化合物は、上に述べられている。一部の実施形態では、ｂＦＧＦを、３日目から１４日目まで、又はそれより長期（低酸素条件下及び非低酸素条件下の両方で施行）、例えば、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、１９日目、２０日目、又は２１日目まで、培地に添加してもよい。一部の実施形態では、ＶＥＧＦを、０．１～５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０～１００ｎｇ／ｍｌ、より一層好ましくは２０～５０ｎｇ／ｍｌの範囲で培地に添加してもよい。ＶＥＧＦの代わりに、又はそれに加えて添加してもよい他の化合物は、上に述べられている。一部の実施形態では、ＶＥＧＦを、３日目から１４日目まで、又はそれより長期、例えば、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、１９日目、２０日目、又は２１日目まで、培地に添加してもよい。一部の実施形態では、ＨＳＣカクテルを、６日目から２１日目まで、培地に添加してもよい。ＨＳＣカクテルは、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－３、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＧＦ－１、ＩＬ－１１、及びＥＰＯのうち１つ又は複数を含有することができる。ＨＳＣカクテルの構成要素の範囲は上に述べられている。一実施形態では、ＨＳＣカクテルは、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯを含有する。一部の実施形態では、ＥＨＴカクテルを、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中、低酸素条件下の後に（例えば、９日目から）、１４日目及びその先まで培地に添加してもよく、ＥＨＴカクテルは毎日交換することができる。ＥＨＴカクテルは、１～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＢＭＰ４、１～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＳＨＨ、０．１～１００μｇ／ｍｌの濃度範囲のアンジオテンシンＩＩ、及び／又は１μＭ～１０００μＭの濃度範囲のロサルタンカリウムのうち１つ又は複数を含有することができる。一部の実施形態では、ＳＡＧを、ＳＨＨの代わりに、又はそれに加えて、１～２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で添加してもよい。一実施形態では、ＥＨＴカクテルは、１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍｌ ＳＨＨ、１０ｕｇ／ｍｌアンジオテンシンＩＩ、及び１００ｕＭロサルタンカリウムを含有し、毎日交換される。

次のステップは、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で、Ｏ_２濃度が１０％より高く３０％まで、好ましくは正常酸素圧のレベル又は１５～２０％、及びＣＯ_２濃度が１％～１０％の間、好ましくは５％であり、３２～３９℃、好ましくは３７℃である非低酸素拡大条件下で細胞を培養するステップである。一部の実施形態では、細胞は、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で、非低酸素拡大条件下で、ＨＳＣカクテル単独を添加して培養される。ＨＳＣカクテルの構成要素の範囲は上に述べられている。一部の実施形態では、細胞は、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で、非低酸素拡大条件下で、ＥＨＴカクテルもＶＥＧＦもｂＦＧＦも添加せずに培養される。一部の実施形態では、ＨＳＣカクテルは３日毎に交換される。ＨＳＣカクテルは、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－３、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＧＦ－１、ＩＬ－１１、及びＥＰＯのうち１つ又は複数を含有することができる。一実施形態では、ＨＳＣカクテルは、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯを含有する。このステップの後にＨＳＣが産生される。一部の実施形態では、ＨＳＣは、細胞表面にＣＸＣＲ４を発現する。

例えば、本発明の方法は、次のステップ：（ａ）多能性幹細胞の集団を得るステップ、（ｂ）０日目に、ＳＦＤ培地、１０ｕＭ Ｙ－２７６３２、１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４及び２５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦの中で培養し；１～２日間、ＳＦＤ培地、１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４、５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、及び８ｕＭ ＣＨＩＲ９９０２１で培養し；１日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、１２．５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、及び２５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦで培養し；１～２日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、１２．５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、及び２５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦで培養し；２～４日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、１２．５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯで培養し；３～５日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、１２．５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、１２．５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１、２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍｌ ＳＨＨ、１０ｕｇ／ｍｌアンジオテンシンＩＩ、及び１００ｕＭロサルタンカリウムで、これらの培地を毎日交換しながら培養し；５～１０日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯで、これらの培地を３日毎に交換しながら培養することによって、造血分化を誘導するステップ、を含むことができる。

一実施形態では、上記の方法は、造血分化を誘導し、ｌｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞を生成する。一部の実施形態では、本発明の一部として産生される造血細胞及び造血細胞の前駆体には、ＣＸＣＲ４を発現する細胞、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ９０＋及びＴＨＹ１＋である細胞、ＣＤ３８－、Ｌｉｎ－、ＣＤ４３－又はＣＤ７３－である細胞、ＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ３８－、及びＬｉｎ－である細胞、ＣＤ９０を発現する細胞、Ｒｕｎｘ１ｃを発現する細胞、又は上記の任意の組合せが含まれる。Ｒｕｎｘ１は造血の発現のための必須遺伝子である。なぜなら、Ｒｕｎｘ１の欠失は胚性致死を引き起こすからである。Ｒｕｎｘ１ｃのアイソフォームは、最終的な造血のときに、より特異的に発現され、一方、Ｒｕｎｘ１ａ／ｂは、より広範に発現されることも示唆されている（Ｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４（１１）：１１６８－７９；Ｃｈａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ３８（５）：４０３－１６；Ｓｒｏｃｚｙｎｓｋａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ １１４（２６）：５２７９－８９；Ｂｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４２（１５）：２７１９－２４；Ｂｅｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ １１５（１５）：３０４２－５０）。

上記で明らかにした本発明を使用して、ｉＰＳＣから骨髄系譜の細胞を作り出すこともできる。例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９１７－１９２０に記載されているようにｉＰＳＣを得て、それをｌｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋骨髄系前駆細胞が濃縮された細胞に分化させることができる。この時点から出発し、次に上記のプロトコルを使用することができる。

一部の実施形態では、本発明は、最終的な造血、及び長期にわたって再増殖するＨＳＣの生成を提供する。一部の実施形態では、これらの長期にわたって再増殖するＨＳＣには、ＣＸＣＲ４を発現する細胞、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ９０＋及びＴＨＹ１＋である細胞、ＣＤ３８－、Ｌｉｎ－、ＣＤ４３－又はＣＤ７３－である細胞、ＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ３８－、及びＬｉｎ－である細胞、ＣＤ９０を発現する細胞、Ｒｕｎｘ１ｃを発現する細胞、又は上記の任意の組合せが含まれる。理論に縛られるものではないが、ＣＸＣＲ４の発現は、ＨＳＣ及びＨＳＣの長期の集団の骨髄へのホーミングに関与する。一部の実施形態では、本発明のＨＳＣは、本発明の方法を使用して生成されるＨＳＣを含み、当該ＨＳＣは、細胞表面にＣＸＣＲ４を発現する。

本発明は、その好ましい実施形態について、上記で説明されてきた。当概念の他の形態もまた、特許請求の範囲内にあるものとする。

造血細胞及びその前駆体の使用
本発明のある特定の態様の方法及び組成物によって提供される造血細胞及び造血前駆細胞は、様々な応用に使用することができる。これらには、以下に限定されないが、数例挙げると、ｉｎ ｖｉｖｏでの造血細胞及び造血前駆細胞の移植又はインプラント、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性化合物、発癌性物質、変異原の成長／制御因子、医薬化合物などのスクリーニング、血液の疾患及び損傷の機序の解明、薬物及び／又は成長因子が作用する機序の研究、患者におけるがんの診断及びモニタリング、遺伝子治療、及び生物学的に活性な製品の製造が含まれる。

本発明のプログラミングにより誘導された造血細胞及び造血前駆細胞は、本明細書において提供される造血細胞の特性に影響を及ぼす因子（溶媒、低分子薬物、ペプチド、及びポリヌクレオチドなど）又は環境条件（培養条件又は操作など）をスクリーニングするために使用することができる。

一部の応用において、幹細胞（分化又は未分化）は、造血細胞系譜に沿って細胞の成熟を促進する因子、又は長期の培養下でそのような細胞の増殖及び維持を促進する因子をスクリーニングするために使用される。例えば、造血細胞の成熟因子又は成長因子の候補を、異なるウェルの中でそれらを幹細胞に添加することによって試験し、次に、結果として生じる任意の表現型の変化を、細胞のさらなる培養及び使用にとって望ましい基準に従って判定する。

本発明の特定のスクリーニングの応用は、薬物研究における医薬化合物の試験に関する。読者は、一般に、標準的な教科書であるＩｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７、及び米国特許第５，０３０，０１５号明細書を参照されたい。本発明のある特定の態様において、造血系譜になるようにプログラムされた細胞は、以前に短期培養下で造血細胞及び造血前駆細胞に実行されたような、標準的な薬物スクリーニング及び毒性アッセイのための試験細胞の役目を果たす。候補医薬化合物の活性の評価は、一般に、本発明のある特定の態様において提供される造血細胞又は造血前駆細胞を候補化合物と組み合わせること、化合物に起因し得る、細胞の形態、マーカー表現型、又は代謝活性における任意の変化（未処理の細胞又は不活性化合物で処理された細胞と比較して）を判定すること、及び次に、化合物の効果を観察された変化と関連づけることを必要とする。スクリーニングは、化合物が、造血細胞又は造血前駆細胞に対して薬理学的な効果を有するようにデザインされているか、又は他で効果を有するようにデザインされた化合物が、造血細胞又は造血前駆細胞に対して意図せぬ効果を有し得るかのいずれかの理由で行われる場合がある。２種以上の薬物を組み合わせて試験して（同時又は逐次に細胞と組み合わせることにより）、あり得る薬物－薬物相互作用効果を検出することができる。

本発明はまた、おそらくは血液の疾患若しくは障害又は損傷が原因で機能の程度の回復の治療を必要とする対象に対する、機能の程度を回復させるための、本明細書において提供される造血細胞及び造血前駆細胞の使用も提供する。例えば、本明細書に開示されている方法によって誘導された造血細胞及び造血前駆細胞は、異常ヘモグロビン症、貧血などの血液の疾患及び障害を処置するために使用することができる。さらに、造血細胞及びその前駆体は、血液又は血液細胞（例えば、赤血球、血小板、及び好中性顆粒球など）の供給を、それを必要とする対象（例えば、輸血を必要とする対象、又は血液障害を有する対象など）に行うのに有用であり得る。そのような細胞は、化学治療などの細胞抑制治療に起因する造血細胞欠乏の処置に有用であり得る。

本明細書において提供される造血細胞及び造血前駆細胞の治療応用への適合性を判定するために、まず、細胞を、好適な動物モデルにおいて試験することができる。１レベルでは、細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏで、生存する能力及びその表現型を維持する能力について評価する。本明細書において提供されるプログラムされた細胞は、免疫不全の動物（ＮＯＧマウス、又は化学的に若しくは照射により免疫不全にした動物など）の、腎被膜下、脾臓内、肝小葉内、又は骨髄内など、さらなる観察に適した部位に投与される。数日から数週間以上経た後に、組織を採取し、多能性幹細胞などの出発細胞型がまだ存在しているかどうかについて評価する。これは、投与される細胞に検出可能な標識（緑色蛍光タンパク質、又はβ－ガラクトシダーゼなど）をつけることによって、又は投与されるヒト細胞に特異的な構成的マーカーを測定することによって、実行することができる。本明細書において提供されるプログラムされた細胞が齧歯動物モデルにおいて試験されている場合、投与される細胞の存在及び表現型は、ヒト特異的抗体を使用する免疫組織化学検査若しくはＥＬＩＳＡによって、又は増幅をヒトポリヌクレオチド配列に特異的にするプライマー及びハイブリダイゼーション条件を使用するＲＴ－ＰＣＲ解析によって、評価することができる。ｍＲＮＡ又はタンパク質レベルでの遺伝子発現を評価するのに好適なマーカーは、本開示の他の箇所に記載されている。

一部の実施形態では、本発明は以下のように説明される。

実施形態１．以下のステップ：
ａ）多能性幹細胞の集団を得るステップ、
ｂ）０日目に、補足した無血清分化（ＳＦＤ）培地中で、第１の低酸素条件下で細胞を培養するステップ、
ｃ）ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で、第２の低酸素条件下で細胞を培養するステップ、
ｄ）ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で、非低酸素条件下で細胞を培養するステップ、及び
ｅ）ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で、非低酸素拡大条件下で細胞を培養するステップ、並びに
ｆ）造血前駆細胞の集団を回収するステップ
を含む、造血前駆細胞を産生する方法。

実施形態２．多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、実施形態１に記載の方法。

実施形態３．多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、実施形態２に記載の方法。

実施形態４．多能性幹細胞が胚性幹細胞である、実施形態２に記載の方法。

実施形態５．補足したＳＦＤ培地が、ＳＦＤ培地に添加されるＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、Ｙ－２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１、及びＳＢ－４３１５４２のうち１つ又は複数を補足されている、実施形態１に記載の方法。

実施形態６．ＢＭＰ４が０．１～５００ｎｇ／ｍｌの範囲である、実施形態５に記載の方法。

実施形態７．ＢＭＰ４が、０日目、１日目、又は２日目に培地に添加される、実施形態５に記載の方法。

実施形態８．ＢＭＰ４が、０日目、１日目、及び２日目に培地に添加される、実施形態５に記載の方法。

実施形態９．ｂＦＧＦが１～５００ｎｇ／ｍｌの範囲である、実施形態５に記載の方法。

実施形態１０．ｂＦＧＦが、０日目、１日目、又は２日目に培地に添加される、実施形態５に記載の方法。

実施形態１１．ｂＦＧＦが、０日目、１日目、及び２日目に培地に添加される、実施形態５に記載の方法。

実施形態１２．Ｙ－２７６３２が１００ｎＭ～３０μＭの範囲である、実施形態５に記載の方法。

実施形態１３．Ｙ－２７６３２が０日目に培地に添加される、実施形態５に記載の方法。

実施形態１４．ＣＨＩＲ９９０２１が０．１～２０μＭの範囲である、実施形態５に記載の方法。

実施形態１５．ＣＨＩＲ９９０２１が、０日目、１日目、又は２日目に培地に添加される、実施形態５に記載の方法。

実施形態１６．ＣＨＩＲ９９０２１が、１日目及び２日目に培地に添加される、実施形態５に記載の方法。

実施形態１７．ＳＢ－４３１５４２が０．１～２０μＭの範囲である、実施形態５に記載の方法。

実施形態１８．ＳＢ－４３１５４２が、０日目、１日目、又は２日目に培地に添加される、実施形態５に記載の方法。

実施形態１９．ＳＢ－４３１５４２が２日目に培地に添加される、実施形態５に記載の方法。

実施形態２０．ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、Ｙ－２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１、及びＳＢ－４３１５４２が培地に添加される、実施形態５に記載の方法。

実施形態２１．ＢＭＰ４が５～２５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、０日目、１日目、及び２日目に培地に添加され、ｂＦＧＦが２０～５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、０日目、１日目、及び２日目に培地に添加され、Ｙ－２７６３２が５μＭ～２０μＭの濃度範囲であり、０日目に培地に添加され、ＣＨＩＲ９９０２１が５μＭ～２０μＭの濃度範囲であり、１日目及び２日目に培地に添加され、且つＳＢ－４３１５４２が０．１～２０μＭの濃度範囲であり、２日目に培地に添加される、実施形態２０に記載の方法。

実施形態２２．ＢＭＰ４が１０ｎｇ／ｍｌの濃度であり、０日目、１日目、及び２日目に培地に添加され、ｂＦＧＦが２５ｎｇ／ｍｌの濃度であり、０日目、１日目、及び２日目に培地に添加され、Ｙ－２７６３２が１０μＭの濃度であり、０日目に培地に添加され、ＣＨＩＲ９９０２１が５μＭ～２０μＭの濃度範囲であり、１日目及び２日目に培地に添加され、且つＳＢ－４３１５４２が０．１～２０μＭの濃度範囲であり、２日目に培地に添加される、実施形態２１に記載の方法。

実施形態２３．第２の低酸素条件下のＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地が、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地に第２の低酸素条件下で添加されるｂＦＧＦ、ＨＳＣカクテル、ＳＢ－４３１５４２、及びＶＥＧＦのうち１つ又は複数を補足される、実施形態１に記載の方法。

実施形態２４．ｂＦＧＦが２０～５０ｎｇ／ｍｌの範囲である、実施形態２３に記載の方法。

実施形態２５．ｂＦＧＦが、３日目から１４日目まで培地に添加される、実施形態２３に記載の方法。

実施形態２６．ＨＳＣカクテルが、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－３、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＧＦ－１、ＩＬ－１１、及びＥＰＯのうち１つ又は複数を含む、実施形態２３に記載の方法。

実施形態２７．ＨＳＣカクテルが、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－３、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＧＦ－１、及び／若しくはＩＬ－１１を、それぞれ１～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で、並びに／又はＥＰＯを０．１～２０Ｕ／ｍｌの濃度範囲で含む、実施形態２３に記載の方法。

実施形態２８．ＨＳＣカクテルが、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯを含む、実施形態２３に記載の方法。

実施形態２９．ＨＳＣカクテルが、６日目から２１日目まで培地に添加される、実施形態２３に記載の方法。

実施形態３０．ＳＢ－４３１５４２が０．１～２０μＭの範囲である、実施形態２３に記載の方法。

実施形態３１．ＳＢ－４３１５４２が、３日目～９日目に培地に添加される、実施形態２３に記載の方法。

実施形態３２．ＶＥＧＦが２０～５０ｎｇ／ｍｌの範囲である、実施形態２３に記載の方法。

実施形態３３．ＶＥＧＦが、３日目～１４日目に培地に添加される、実施形態２３に記載の方法。

実施形態３４．ｂＦＧＦ、ＨＳＣカクテル、ＳＢ－４３１５４２、及びＶＥＧＦが培地に添加される、実施形態２３に記載の方法。

実施形態３５．ｂＦＧＦが２０～５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、３日目から１４日目まで培地に添加され、ＨＳＣカクテルが、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯを含み、６日目から２１日目まで培地に添加され、ＳＢ－４３１５４２が０．１～２０μＭの濃度範囲であり、３日目～９日目に培地に添加され、且つＶＥＧＦが２０～５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、３日目～１４日目に培地に添加される、実施形態３４に記載の方法。

実施形態３６．ｂＦＧＦが１２．５ｎｇ／ｍｌの濃度であり、３日目～９日目に培地に添加され、ＨＳＣカクテルが、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯを含み、６日目～９日目に培地に添加され、ＳＢ－４３１５４２が６μＭの濃度であり、３日目に培地に添加され、且つＶＥＧＦが２５ｎｇ／ｍｌの濃度であり、３日目～９日目に培地に添加される、実施形態３４に記載の方法。

実施形態３７．非低酸素条件下のＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地が、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地に非低酸素条件下で添加されるｂＦＧＦ、ＨＳＣカクテル、ＶＥＧＦ、及びＥＨＴカクテルのうち１つ又は複数を補足される、実施形態１に記載の方法。

実施形態３８．ｂＦＧＦが１０～２５ｎｇ／ｍｌの範囲である、実施形態３７に記載の方法。

実施形態３９．ｂＦＧＦが、３日目～１４日目に培地に添加される、実施形態３７に記載の方法。

実施形態４０．ｂＦＧＦが、９日目～１４日目に培地に添加される、実施形態３７に記載の方法。

実施形態４１．ＨＳＣカクテルが、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－３、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＧＦ－１、ＩＬ－１１、及びＥＰＯのうち少なくとも１つを含む、実施形態３７に記載の方法。

実施形態４２．ＨＳＣカクテルが、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－３、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＧＦ－１、及び／若しくはＩＬ－１１を、それぞれ１～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で、並びに／又はＥＰＯを０．１～２０Ｕ／ｍｌの濃度範囲で含む、実施形態３７に記載の方法。

実施形態４３．ＨＳＣカクテルが、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯを含む、実施形態３７に記載の方法。

実施形態４４．ＨＳＣカクテルが、６日目～２１日目に培地に添加される、実施形態３７に記載の方法。

実施形態４５．ＶＥＧＦが２０～５０ｎｇ／ｍｌの範囲である、実施形態３７に記載の方法。

実施形態４６．ＶＥＧＦが、３日目～１４日目に培地に添加される、実施形態３７に記載の方法。

実施形態４７．ＥＨＴカクテルが、ＢＭＰ４、ＳＨＨ、アンジオテンシンＩＩ、及びロサルタンカリウムのうち少なくとも１つを含む、実施形態３７に記載の方法。

実施形態４８．ＥＨＴカクテルが、ＢＭＰ４を１～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で、ＳＨＨを１～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で、アンジオテンシンＩＩを０．１～１００μｇ／ｍｌの濃度範囲で、及び／又はロサルタンカリウムを１μＭ～１０００μＭの濃度範囲で含む、実施形態３７に記載の方法。

実施形態４９．ＥＨＴカクテルが、９日目～１４日目に培地に添加される、実施形態３７に記載の方法。

実施形態５０．ｂＦＧＦ、ＨＳＣカクテル、ＶＥＧＦ、及びＥＨＴカクテルが培地に添加される、実施形態２３に記載の方法。

実施形態５１．ｂＦＧＦが１０～２５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、３日目から１４日目まで培地に添加され、ＨＳＣカクテルが、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－３、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＧＦ－１、及び／又はＩＬ－１１を、それぞれ１～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で、及び／又はＥＰＯを０．１～２０Ｕ／ｍｌの濃度範囲で含み、６日目から２１日目まで培地に添加され、ＶＥＧＦが２０～５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、３日目～１４日目に培地に添加され、且つＥＨＴカクテルが、ＢＭＰ４、ＳＨＨ、アンジオテンシンＩＩ、及びロサルタンカリウムを含み、９日目～１４日目に培地に添加される、実施形態３４に記載の方法。

実施形態５２．ｂＦＧＦが１２．５ｎｇ／ｍｌの濃度であり、９日目～１４日目に培地に添加され、ＨＳＣカクテルが、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯを含み、６日目から２１日目まで培地に添加され、ＶＥＧＦが１２．５ｎｇ／ｍｌの濃度であり、９日目～１４日目に培地に添加され、且つＥＨＴカクテルが、ＢＭＰ４、ＳＨＨ、アンジオテンシンＩＩ、及びロサルタンカリウムを含み、９日目～１４日目に培地に添加される、実施形態３４に記載の方法。

実施形態５３．非低酸素拡大条件下のＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地が、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地に非低酸素拡大条件下で添加されるＨＳＣカクテルを補足される、実施形態１に記載の方法。

実施形態５４．ＨＳＣカクテルが、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－３、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＧＦ－１、ＩＬ－１１、及びＥＰＯのうち少なくとも１つを含む、実施形態５３に記載の方法。

実施形態５５．ＨＳＣカクテルが、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－３、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＧＦ－１、及び／又はＩＬ－１１を、それぞれ１～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で、及び／又はＥＰＯを０．１～２０Ｕ／ｍｌの濃度範囲で含む、実施形態５３に記載の方法。

実施形態５６．ＨＳＣカクテルが、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯを含む、実施形態５３に記載の方法。

実施形態５７．ＨＳＣカクテルが６日目～２１日目に培地に添加される、実施形態５３に記載の方法。

実施形態５８．第１の低酸素条件が、１０％未満のＯ_２濃度を含有する、実施形態１に記載の方法。

実施形態５９．第２の低酸素条件が、１０％未満のＯ_２濃度を含有する、実施形態１に記載の方法。

実施形態６０．ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で、非低酸素条件下で細胞を培養するステップが、１０％より高いＯ_２濃度を含有する、実施形態１に記載の方法。

実施形態６１．ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で、非低酸素拡大条件下で細胞を培養するステップが、１０％より高いＯ_２濃度を含有する、実施形態１に記載の方法。

実施形態６２．多能性幹細胞から、又は体細胞の分化転換から造血前駆細胞を産生する方法であって、様々な造血系譜細胞に分化することができる造血前駆細胞を生成するための条件下で多能性幹細胞又は体細胞を培養するステップを含み、以下のステップ：（ａ）多能性幹細胞の集団を得るステップ、（ｂ）０日目に、ＳＦＤ培地、１０ｕＭ Ｙ－２７６３２、１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４及び２５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦの中で培養し；１～２日間、ＳＦＤ培地、１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４、５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、及び８ｕＭ ＣＨＩＲ９９０２１で培養し；１日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、１２．５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、及び２５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦで培養し；１～２日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、１２．５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、及び２５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦで培養し；２～４日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、１２．５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯで培養し；３～５日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、１２．５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、１２．５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１、２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍｌ ＳＨＨ、１０ｕｇ／ｍｌアンジオテンシンＩＩ、及び１００ｕＭロサルタンカリウムで、これらの培地を毎日交換しながら培養し；５～１０日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯで、これらの培地を３日毎に交換しながら培養することによって、造血分化を誘導するステップを含む方法。

実施形態６３．ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、１２．５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、及び２５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦを有する培地が、６ｕＭ ＳＢ４３１５４２をさらに含む、実施形態６２に記載の方法。

実施形態６４．培地が、２日目、３日目、４日目、又は５日目に、６μｍ ＳＢ４３１５４２（ＴＯＣＲＩＳ）をさらに含む、実施形態６２又は６３に記載の方法。

実施形態６５．多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、実施形態１～６４のいずれか一項に記載の方法。

実施形態６６．多能性幹細胞が胚性幹細胞である、実施形態１～６４のいずれか一項に記載の方法。

実施形態６７．多能性幹細胞が骨髄にホーミングすることができる、実施形態１～６６のいずれか一項に記載の方法。

実施形態６８．造血前駆細胞がＣＸＣＲ４を発現する、実施形態６７に記載の方法。

実施形態６９．造血前駆細胞が細胞表面にＣＸＣＲ４を発現する、実施形態６８に記載の方法。

実施形態７０．造血前駆細胞がＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ９０＋、又はＴＨＹ１＋である、実施形態１～６９のいずれか一項に記載の方法。

実施形態７１．造血前駆細胞がＣＤ３４＋，ＣＤ４５＋、ＣＤ９０＋及びＴＨＹ１＋である、実施形態７０に記載の方法。

実施形態７２．造血前駆細胞がＣＤ３８－、Ｌｉｎ－、ＣＤ４３－又はＣＤ７３－である、実施形態１～７１のいずれか一項に記載の方法。

実施形態７３．造血前駆細胞がＣＤ３８－、Ｌｉｎ－、ＣＤ４３－、及びＣＤ７３－である、実施形態７２に記載の方法。

実施形態７４．造血前駆細胞がＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ３８－、及びＬｉｎ－である、実施形態１～７３のいずれか一項に記載の方法。

実施形態７５．造血前駆細胞がＣＤ９０＋である、実施形態１～７４のいずれか一項に記載の方法。

実施形態７６．造血前駆細胞がＲｕｎｘ１ｃを発現する、実施形態１～７５のいずれか一項に記載の方法。

実施形態７７．実施形態１～７６に記載の方法のうちいずれかを使用して産生される、造血前駆細胞。

実施形態７８．骨髄に長期生着することができる、実施形態７７に記載の造血前駆細胞。

参照による援用
本明細書に記載される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、又は特許出願が、具体的且つ個別に参照により援用されるように指定されているかのような場合と同程度まで、参照により本明細書に援用される。しかしながら、本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の先行技術であることを認めるものと解釈されるべきではない。参照により援用される参考文献において規定される定義又は用語のいずれかが、本明細書中で規定される用語及び考察と異なる場合、本明細書の用語及び定義が優先される。

均等物
上記の本明細書は、当業者が本発明を実施するのを可能にするのに十分であると考えられる。上記の説明及び例は、本発明のある特定の好ましい実施形態を詳細に説明し、本発明者らが企図する最良の形態を記載するものである。しかし当然のことながら、前述の内容がいかに詳細に本文中に説明されているとしても、本発明は多くの方法で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って本発明が解釈されるべきである。

実施した実験及び得られた結果を含む以下の実施例は、説明する目的でのみ提供されるものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。

実施例１：造血幹細胞の生成のプロセス
ｉＰＳＣを、ポリ－Ｌ－オルニチン（ＰＬＯ；Ｓｉｇｍａ）のＰＢＳ中１：７希釈物を各ウェルに１ｍｌずつコーティングした６ウェルプレートに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＬＯ溶液を、ラミニン（Ｓｉｇｍａ）のＤＭＥＭ／Ｆ１２中１：１５０希釈物の各ウェル１ｍｌずつに交換し、３７℃で２時間インキュベートした。

０日目に、ｉＰＳＣを、ＴｒｙｐＬＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して持ち上げ、ウェル当たり６００，０００細胞を、２ｍｌのＳＦＤ培地（７５：２５のＩＭＤＭ：ハムＦ－１２、０．０５％ＢＳＡ、１×Ｂ２７、０．５×Ｎ２サプリメント、１×ＧｌｕｔａＭａｘ及び１×ペニシリン－ストレプトマイシン、０．５ｍＭアスコルビン酸、４５０μＭモノチオグリセロール、並びに１５０μｇ／ｍＬホロ－トランスフェリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））＋１０ｕＭ Ｙ－２７６３２＋１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４＋２５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦの中に播種した。

１日目に、培地をＳＦＤ培地＋１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４＋２５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ＋８ｕＭ ＣＨＩＲ９９０２１に交換し、各ウェルに２ｍｌを添加した。２日目、３日目、４日目、及び５日目に、６μＭ ＳＢ－４３１５４２（ＴＯＣＲＩＳ）を、一部の試料において培地に添加した。３日目に、培地をＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地＋１２．５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ＋２５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ＋６ｕＭ ＳＢ４３１５４２に交換し、各ウェルに２ｍｌを添加し、２４時間インキュベートした。４日目に、培地をＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地＋１２．５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ＋２５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦに交換し、各ウェルに２ｍｌを添加し、４８時間インキュベートした。６～８日目に、培地をＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地＋１２．５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ＋２５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ＋５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ＋２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６＋２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３＋２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ＋２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１＋５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１＋２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯに交換し、各ウェルに２ｍｌを添加した。９～１３日目に、培地をＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地＋１２．５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ＋１２．５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ＋５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ＋２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６＋２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３＋２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ＋２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１＋５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１＋２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯ＋１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４＋１０ｎｇ／ｍｌ ＳＨＨ＋１０ｕｇ／ｍｌアンジオテンシンＩＩ＋１００ｕＭロサルタンカリウムに交換し、各ウェルに２ｍｌを添加し、培地を２～３日毎に交換した。１４～２１日目に、培地をＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地＋５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ＋２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６＋２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３＋２５ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ＋２５ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１＋５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１１＋２Ｕ／ｍｌ ＥＰＯに交換し、各ウェルに２ｍｌを添加し、培地を３日毎に交換した。２１日目に、細胞をＦＡＣＳ選別して、Ｌｉｎ－（ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１０、ＣＤ７、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ６６ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ３８－ＣＤ９０＋細胞にした。０～１０日目は、細胞を３７℃、５％Ｏ_２及び５％ＣＯ_２でインキュベートした。１１～２１日目は、細胞を３７℃、２０％Ｏ_２及び５％ＣＯ_２でインキュベートした。

実施例２：造血性内皮細胞及び造血幹細胞の存在を調べるアッセイ
実施例１に記載のプロトコルを使用して、培養９日目及び１０日目の細胞を、単細胞配列決定法を使用して配列決定した。造血性内皮細胞は、造血細胞に分化することができる内皮細胞のサブセットである。造血性内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＴＨＹ１＋ＣＤ４３－ＣＤ７３－として特徴付けられる。造血性内皮細胞の存在を示すＦＡＣＳのプロットが、以前のプロトコル、及び実施例１に示されている現在のプロトコルの両方において、図１に示されている。造血幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ７３－）についてのさらなる解析により、ｉＰＳＣ培養物における内皮から造血への移行の時間域が、分化の１９～２１日目と示された。これらの結果は図２に示されている。

実施例３：ｉＰＳＣから誘導されたＨＳＣの多分化能を測定するための限界希釈アッセイ
ＦＡＣＳを使用して、ｉＰＳＣから誘導された推定ＨＳＣ（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ３８－Ｌｉｎ－）を精製した。細胞を、２０、１０、５、２、又は１細胞／ウェルでウェルに入れ、各ウェルにメチルセルロースを許容性サイトカインとともに入れた。細胞を１４日間培養し、コロニーをコロニー形成単位でスコア化した。結果が図３に示されている。図３Ａは、ウェルに異なる数の細胞を入れた場合の、各細胞型を有するウェルのパーセントを示す。ウェル当たり入れた細胞の数に依存して、赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ－Ｅ）、マクロファージＣＦＵ（ＣＦＵ－Ｍ）、顆粒球－マクロファージＣＦＵ（ＣＦＵ－ＧＭ）、好酸球コロニー形成単位（ＣＦＵ－Ｅ）、顆粒球ＣＦＵ（ＣＦＵ－Ｇ）、及び多能性のＣＦＵ（ＣＦＵ－ＧＥＭＭ）を含む、異なる細胞の画分が、図３Ｂに示されているようにコロニーを形成した。

実施例４：Ｒｕｎｘ１Ｃ－ＧＦＰ遺伝子レポーターシステムの生成
Ｒｕｎｘ１は造血の発現のための必須遺伝子である。なぜなら、Ｒｕｎｘ１の欠失は胚性致死を引き起こすからである。Ｒｕｎｘ１ｃのアイソフォームは、最終的な造血のときに、より特異的に発現され、一方、Ｒｕｎｘ１ａ／ｂは、より広範に発現されることも示唆されている（Ｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４（１１）：１１６８－７９；Ｃｈａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ３８（５）：４０３－１６；Ｓｒｏｃｚｙｎｓｋａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ １１４（２６）：５２７９－８９；Ｂｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４２（１５）：２７１９－２４；Ｂｅｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ １１５（１５）：３０４２－５０）。

ＧＦＰ－２Ａ－Ｒｕｎｘ１ｃ遺伝子レポーター株を作り出す目的は、造血性内皮細胞から出現する新生の造血幹細胞（ＨＳＣ）を蛍光標識して、Ｒｕｎｘ１ｃの発現解析を可能にすることである。このレポーター株により、本発明のＨＳＣ分化プロトコルの効率を視覚的に判定することが可能になり、直接読み取りができるようになった。

標的のデザイン及びベクターを、次のステップを使用して構築した。Ｒｕｎｘ１ｃのＮ末端標的ガイドＲＮＡ５’－ＧＣＡＴＴＴＴＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＡ－３’（配列番号１）を、ＢａｍＨＩ／ＢｓｍＢＩを使用してｐＣａｓ９－Ｇｕｉｄｅベクター（ＯＲＩＧＥＮＥ）にクローニングした。造血幹細胞（ＨＳＣ）を標識するためのＧＦＰ－２Ａ－Ｒｕｎｘ１ｃ ｈｉＰＳＣレポーター株の生成は、図４に示されている。「ＧＦＰ－２Ａ」配列をＲｕｎｘ１ｃエクソン１のＡＴＧ開始コドンの前に挿入し、正確に標的されたヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）クローンの濃縮のために「ＬｏｘＰ－ＰＧＫ－ＢＳＤ－ｐＡ－ＬｏｘＰ」カセットもまた、イントロン１に挿入した。ノックイン配列に隣接するホモロジーアームは、ガイドＲＮＡ標的部位の１ｋｂ上流及び下流からなる。７．５ｕｇのｐＣａｓ９－Ｒｕｘｎ１ｃ－Ｇｕｉｄｅベクター及び７．５ｕｇのＧＦＰ－２Ａ－Ｒｕｎｘ１ｃドナーベクターを、２×１０^６ ｉＰＳＣに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用してトランスフェクトした。トランスフェクトから４８時間後に、２．５ｕｇ／ｍｌブラストサイジンを適用して、標的集団を濃縮した。細胞を５～７日間選択し、凍結保存のために増殖させた。図４Ａは、Ｒｕｎｘ１ｃゲノム遺伝子座を標的とする戦略を示す概略図を示す。一方、ブラストサイジンにより濃縮された１×１０^６ ｉＰＳＣを、ゲノムＤＮＡの単離及びＰＣＲ遺伝子型判定試験のために採取した。図４Ｂは、４Ａで説明されているプライマーを、ゲノム編集後に陽性コロニーをスクリーニングするために使用したことを示す。ブラストサイジン選択の後に、合計４８の単細胞クローンを採取し、増殖させ、ＰＣＲ遺伝子型判定解析にかけた。３８クローンが、アガロースゲルに陽性の遺伝子型判定のバンドを示した（効率＝７９％）。図４Ｃは、ＧＦＰ－２Ａ－Ｒｕｎｘ１ｃ ｈｉＰＳＣ株の選択された陽性クローンの画像を示す。

次の表１のプライマーを、標的したＲｕｎｘ１ｃ遺伝子座の異なる領域の遺伝子型判定及び配列決定のために使用した。

ＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用し、濃縮したトランスフェクションプールの１００ｎｇゲノムＤＮＡを使用して、ＰＣＲを行った。精製されたＰＣＲ産物の配列を、サンガー配列決定（Ｇｅｎｅｗｉｚ）によって確認した。

単細胞クローニングについては、ブラストサイジン耐性ｉＰＳＣをＴｒｙＰＬＥにより単細胞に分離し、単細胞密度（１０ｃｍ皿当たり約２５００細胞）でｍＴｅＳＲ培地中に播種した。ＣｌｏｎｅＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を最初の４日間添加して、単細胞クローンの生存及び成長を促進した。２回目のブラストサイジン選択を４～７日目に適用して、明確に標的したクローンをさらに濃縮した。８～１０日目頃に、単細胞から出現したコロニーを、組織培養キャビネット中で、顕微鏡下で採取し、培養を継続するために、Ｍａｔｒｉｇｅｌをコーティングした９６ウェルプレートに移した。

コロニーが９６ウェルプレート中でコンフルエント近辺まで成長したとき、コロニーのプレートを継代するために、細胞を、ＲｅＬｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して分離し、１０ｕＭ Ｙ－２７６３２（ＴＯＣＲＩＳ）を補足したｍＴｅＳＲ中に再懸濁させた。次いで、細胞懸濁液を、３×９６ウェルレプリケートプレートの中に、それぞれ、１：３、１：５及び１：８の比で分けて入れた。数日後、１：５のプレートを、凍結保存用に再度分離した。

１：３のプレート中の細胞が完全にコンフルエントに成長したときに、ＰＣＲスクリーニングを行うために、５０ｕｌ／ウェルのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を製造元の説明書に従って使用して、その細胞を溶解した。ＰＣＲスクリーニングのために、３ｕｌのＤＮＡ抽出溶液をＰＣＲテンプレートとして、プライマーセットＬＨ－Ｉｎ－Ｆ／ＧＦＰ－Ｒとともに使用した。選択されたＰＣＲ陽性コロニーを、ステップ３に列挙した追加のプライマーセットを用いるＰＣＲ及びサンガー配列決定によって確認した。

確認されたＧＦＰ－２Ａ－Ｒｕｎｘ１ｃ ｈｉＰＳＣクローンを、下流での応用のために、１：８のレプリケートプレートから増殖させた。本発明者らのデータは、Ｒｕｎｘ１ｃ－ＧＦＰの時間的発現が、存在するＨＳＣマーカーであるＣＤ３４及びＣＤ４５と高度に重複するが、ＣＤ３４／ＣＤ４５二重陽性集団の亜集団のみをマークすることを示した（図６を参照）。したがって、Ｒｕｎｘ１ｃ－ＧＦＰは、ＨＳＣ集団をさらに精製して純度及び有効性を高めるための、追加のマーカーとして役立つ。

図５は、ｈｉＰＳＣの分化におけるＧＦＰ陽性造血幹細胞を視覚化して示す。ＧＦＰ－２Ａ－Ｒｕｎｘ１ｃ ｉＰＳＣ（０日目、上段左パネル）は最初に内皮に分化し（９日目、上段右パネル）、次に内皮から造血への移行（ＥＨＴ）が誘導され、ＧＦＰ陰性内皮層の選択された領域（破線の枠、「血島」）からＧＦＰ陽性造血幹細胞（１４日目、中段のパネル）が出現した。１７日目に、ＧＦＰ陽性ＨＳＣの産生は、もはやある特定の領域に限定されず、組織培養の全体にわたってより顕著になった（１７日目、下段パネル）。

図６は、造血分化中の、ＧＦＰ－２Ａ－Ｒｕｎｘ１ｃ ｉＰＳＣの表面マーカーの発現パターンの経時変化を示す。（Ａ）単一陽性集団。（Ｂ）Ｒｕｎｘ１ｃ＋ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋推定造血幹細胞集団。

実施例５：長期のｉＰＳＣ細胞マーカー発現アッセイ
経時でのＣＤ３４及びＧＦＰ－Ｒｕｎｘ１ｃの発現
ＬＴ－ｉＰＳＣ、及びＧＦＰ－Ｒｕｎｘ１ｃを安定して発現したＬＴ－ｉＰＳＣを、実施例１のプロトコルを使用して分化させた。９日目の付着細胞及び１４、１６、１７、２０及び２１日目の懸濁細胞をＦＡＣＳ解析のために採取した。ＦＡＣＳ用の全ての試料群をＡＰＣ－ＣＤ３４及びＳＹＴＯＸ Ｂｌｕｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で染色した。ＦＡＣＳ解析は、ＳＹＴＯＸ Ｂｌｕｅのネガティブ染色で、単細胞をゲーティングした。図７は、９日目及び１４日目のＨＳＣ ＣＤ３４対ＧＦＰ－Ｒｕｎｘ１ｃの発現を示す。図８は、１６日目及び１７日目のＨＳＣ ＣＤ３４対ＧＦＰ－Ｒｕｎｘ１ｃの発現を示す。図９は、２０日目及び２１日目のＨＳＣ ＣＤ３４対ＧＦＰ－Ｒｕｎｘ１ｃの発現を示す。各図面において、左から右へ、ＬＴ－ｉＰＳＣ、ＧＦＰ－Ｒｕｎｘ１ｃが過剰発現したｉＰＳＣ、及び両細胞の重ね合わせとした。ＧＦＰ－Ｒｕｎｘ１ｃは１４日目に発現を示し始め、発現は経時で増加した。１４～１７日目には、全てのＧＦＰ－Ｒｕｎｘ１ｃ陽性細胞がＣＤ３４＋であった。２０日目から、ＧＦＰ－Ｒｕｎｘ１ｃ細胞はＣＤ３４－に変化した。

経時での異なる細胞集団の発現
様々なＨＳＣ集団を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）選別により、精製した。各集団の５０００ＨＳＣを、６ウェルプレート中、５ｍｌ ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）Ｈ４４３５ Ｅｎｒｉｃｈｅｄ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．製）の中で培養した（３７℃、５％ＣＯ_２）。２１日培養した後に、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）中の全ての細胞を回収し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中に希釈した。１０００ｇ×５分で遠心沈殿した後に、細胞ペレットを、Ｐ１０００ピペットにより反復で滴定し、単細胞数をＶｉａＣｅｌｌによりカウントした。ＬＴ－ｉＰＳＣ及びＧＦＰ－Ｒｕｎｘ１ｃ ｉＰＳＣに由来するＨＳＣを、上記のゲーティング戦略に基づいて選別した。１６、１７及び２０日目に、ＬＴ：ＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋のみがＬＴ－ｉＰＳＣ及びＲｕｎｘ１ｃ：ＣＤ３４＋／ＧＦＰ－から選別され、且つＲｕｎｘ１ｃ：ＣＤ３４＋／ＧＦＰ－が選別された。図１０に示されているように、２１日目に、６集団全てがＣＦＵアッセイ用に選別された。図１０は、ＬＴ－ｉＰＳＣ及びＧＦＰ－Ｒｕｎｘ１ｃ ｉＰＳＣからのＣＦＵアッセイのための細胞集団の選別を示す。Ｒｕｎｘ１ｃ－ＧＦＰからの全てのＨＳＣについては、最初に全てＣＤ４５＋細胞をゲーティングした。全ての集団がＣＤ４５＋細胞となる。初期段階では、ＧＦＰ－Ｒｕｎｘ１ｃを発現したＨＳＣは、全ＣＦＵ細胞と同等又はそれ以下を生成したが、２１日目に、ＨＳＣ ＧＦＰ－Ｒｕｎｘ１ｃ及びＣＤ３４＋の二重陽性ＨＳＣは、ＣＦＵからより多くの細胞を生成することにおいてよりロバストである（図１１に示されているとおり）。全ての群において、ＣＤ３４＋は、ＣＦＵの潜在能を維持するために不可欠である。

細胞型マーカー解析
上記のようにＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）培地中で２１日間培養されたＨＳＣを採取し、単細胞懸濁液中で滴定し、１％ＢＳＡ及びＦｃＲ受容体ブロッカーにより遮断し、抗体により染色し、ＦＡＣＳ解析を行って、全ての系譜の表面マーカーの発現をチェックした。図１２は、共通前駆細胞マーカーのＣＦＵパネルを示す。Ｒｕｎｘ１ｃの強発現を示し始める１６日目のＨＳＣは、ＣＦＵになるまで培養された後に、複数の共通前駆細胞マーカーを維持する。ＨＳＣがより成熟するにつれて、ＣＤ３４＋細胞におけるＲｕｎｘ１ｃ発現の減少が示され、ＣＦＵからの細胞は、最小限の共通前駆細胞マーカーを示す。図１３は、リンパ系マーカーのＣＦＵパネルを示す。ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）は、骨髄系細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させるようにデザインされたが、ごく一部のリンパ系譜細胞がＣＦＵの中に同定され、それにはＴ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞が含まれる。１６日目のＨＳＣは、リンパ系譜細胞を生成することにおいて２１日目のＨＳＣより強力であることが示されている。図１４は、骨髄系マーカーのＣＦＵパネルを示す。全ての段階のＨＳＣが、ＣＦＵアッセイにおいて、骨髄系譜細胞を生成することに対するロバストな潜在能を示す。血小板を除く全ての骨髄系譜細胞がＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞のＣＦＵの中に同定された。

Claims (27)

1. ａ）多能性幹細胞の集団を得るステップ、
   ｂ）０日目に、補足した無血清分化（ＳＦＤ）培地中で、第１の低酸素条件下で前記細胞を培養するステップ、
   ｃ）ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で、第２の低酸素条件下で前記細胞を培養するステップ、
   ｄ）ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で、非低酸素条件下で前記細胞を培養するステップ、
   ｅ）ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で、非低酸素拡大条件下で前記細胞を培養するステップ、及び
   ｆ）造血前駆細胞の集団を回収するステップ
   を含む、造血前駆細胞を産生する方法。
2. 前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 前記補足したＳＦＤ培地が、ＳＦＤ培地に添加されるＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、Ｙ－２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１、及びＳＢ－４３１５４２のうち１つ又は複数を補足されている、請求項１に記載の方法。
4. 前記ＢＭＰ４が５～２５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、０日目、１日目、及び２日目に前記培地に添加され、前記ｂＦＧＦが２０～５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、０日目、１日目、及び２日目に前記培地に添加され、前記Ｙ－２７６３２が５μＭ～２０μＭの濃度範囲であり、０日目に前記培地に添加され、前記ＣＨＩＲ９９０２１が５μＭ～２０μＭの濃度範囲であり、１日目及び２日目に前記培地に添加され、前記ＳＢ－４３１５４２が０．１～２０μＭの濃度範囲であり、２日目に前記培地に添加される、請求項３に記載の方法。
5. 前記ＢＭＰ４が１０ｎｇ／ｍｌの濃度であり、０日目、１日目、及び２日目に前記培地に添加され、前記ｂＦＧＦが２５ｎｇ／ｍｌの濃度であり、０日目、１日目、及び２日目に前記培地に添加され、前記Ｙ－２７６３２が１０μＭの濃度であり、０日目に前記培地に添加され、前記ＣＨＩＲ９９０２１が５μＭ～２０μＭの濃度範囲であり、１日目及び２日目に前記培地に添加され、前記ＳＢ－４３１５４２が０．１～２０μＭの濃度範囲であり、２日目に前記培地に添加される、請求項４に記載の方法。
6. 第２の低酸素条件下の前記ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地が、前記ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地に第２の低酸素条件下で添加されるｂＦＧＦ、ＨＳＣカクテル、ＳＢ－４３１５４２、及びＶＥＧＦのうち１つ又は複数を補足される、請求項１に記載の方法。
7. 前記ｂＦＧＦが２０～５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、３日目から１４日目まで前記培地に添加され、前記ＨＳＣカクテルが、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌのＥＰＯを含み、６日目から２１日目まで前記培地に添加され、前記ＳＢ－４３１５４２が０．１～２０μＭの濃度範囲であり、３日目～９日目に前記培地に添加され、前記ＶＥＧＦが２０～５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、３日目～１４日目に前記培地に添加される、請求項６に記載の方法。
8. 前記ｂＦＧＦが１２．５ｎｇ／ｍｌの濃度であり、３日目～９日目に前記培地に添加され、前記ＨＳＣカクテルが、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌのＥＰＯを含み、６日目～９日目に前記培地に添加され、前記ＳＢ－４３１５４２が６μＭの濃度であり、３日目に前記培地に添加され、前記ＶＥＧＦが２５ｎｇ／ｍｌの濃度であり、３日目～９日目に前記培地に添加される、請求項７に記載の方法。
9. 非低酸素条件下の前記ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地が、前記ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地に非低酸素条件下で添加されるｂＦＧＦ、ＨＳＣカクテル、ＶＥＧＦ、及びＥＨＴカクテルのうち１つ又は複数を補足される、請求項１に記載の方法。
10. 前記ｂＦＧＦが１０～２５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、３日目～１４日目に前記培地に添加され、前記ＨＳＣカクテルが、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌのＥＰＯを含み、６日目から２１日目まで前記培地に添加され、前記ＶＥＧＦが２０～５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、３日目～１４日目に前記培地に添加され、前記ＥＨＴカクテルが、ＢＭＰ４、ＳＨＨ、アンジオテンシンＩＩ、及びロサルタンカリウムを含み、９日目～１４日目に前記培地に添加される、請求項９に記載の方法。
11. 前記ｂＦＧＦが１２．５ｎｇ／ｍｌの濃度であり、９日目～１４日目に前記培地に添加され、前記ＨＳＣカクテルが、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌのＥＰＯを含み、６日目から２１日目まで前記培地に添加され、前記ＶＥＧＦが１２．５ｎｇ／ｍｌの濃度であり、９日目～１４日目に前記培地に添加され、前記ＥＨＴカクテルが、ＢＭＰ４、ＳＨＨ、アンジオテンシンＩＩ、及びロサルタンカリウムを含み、９日目～１４日目に前記培地に添加される、請求項１０に記載の方法。
12. 非低酸素拡大条件下の前記ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地が、前記ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地に非低酸素拡大条件下で添加されるＨＳＣカクテルを補足される、請求項１に記載の方法。
13. 前記ＨＳＣカクテルが、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌのＥＰＯを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記第１の低酸素条件が、１０％未満のＯ_２濃度を含有する、請求項１に記載の方法。
15. 前記第２の低酸素条件が、１０％未満のＯ_２濃度を含有する、請求項１に記載の方法。
16. 多能性幹細胞から、又は体細胞の分化転換から造血前駆細胞を産生する方法であって、様々な造血系譜細胞に分化することができる造血前駆細胞を生成するための条件下で前記多能性幹細胞又は体細胞を培養するステップを含み、
    （ａ）多能性幹細胞の集団を得るステップ、
    （ｂ）０日目に、ＳＦＤ培地、１０ｕＭのＹ－２７６３２、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び２５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦの中で培養し；１～２日間、ＳＦＤ培地、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、及び８ｕＭのＣＨＩＲ９９０２１で培養し；１日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、１２．５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、及び２５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦで培養し；１～２日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、１２．５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、及び２５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦで培養し；２～４日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、１２．５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌのＥＰＯで培養し；３～５日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、１２．５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１２．５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１１、２Ｕ／ｍｌのＥＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、１０ｕｇ／ｍｌのアンジオテンシンＩＩ、及び１００ｕＭのロサルタンカリウムで、これらの培地を毎日交換しながら培養し；５～１０日間、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３、２５ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３Ｌ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１１、及び２Ｕ／ｍｌのＥＰＯで、これらの培地を３日毎に交換しながら培養することによって、造血分化を誘導するステップを含む方法。
17. ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、１２．５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、及び２５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを有する前記培地が、６ｕＭのＳＢ４３１５４２をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記培地が、２日目、３日目、４日目、又は５日目に、６μｍのＳＢ４３１５４２（ＴＯＣＲＩＳ）をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
19. 前記多能性幹細胞が骨髄にホーミングすることができる、請求項１に記載の方法。
20. 前記造血前駆細胞がＣＸＣＲ４を発現する、請求項１９に記載の方法。
21. 前記造血前駆細胞がＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ９０＋、又はＴＨＹ１＋である、請求項１に記載の方法。
22. 前記造血前駆細胞がＣＤ３８－、Ｌｉｎ－、ＣＤ４３－又はＣＤ７３－である、請求項１に記載の方法。
23. 前記造血前駆細胞がＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ３８－、及びＬｉｎ－である、請求項１に記載の方法。
24. 前記造血前駆細胞がＣＤ９０＋である、請求項１に記載の方法。
25. 前記造血前駆細胞がＲｕｎｘ１ｃを発現する、請求項１に記載の方法。
26. 請求項１～２５に記載の方法のうちいずれかを使用して産生される、造血前駆細胞。
27. 骨髄に長期生着することができる、請求項２６に記載の造血前駆細胞。

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