TW202132563A - 造血前驅細胞生產 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了用於從多能幹細胞產生造血前驅細胞的改進方法，及其產生的造血前驅細胞。該造血前驅細胞表現CXCR4或runx1c，並且能夠在骨髓中歸巢和/或移植。

Description

造血前驅細胞生產
本發明關於具有改善的特性的造血幹細胞之生產。
對於臨床應用和實驗室使用，造血細胞或血細胞需求很大。臨床中，在已經歷抑制造血作用的療法（例如抗癌療法）的患者中，或在患有遺傳性血液疾病的患者中，造血幹細胞（HSC）可以用於重建造血作用。此外，紅血球、血小板、和嗜中性粒細胞可以用於輸血，並且可以用於治療某些血液學障礙。在實驗室中，血細胞可以用於許多應用，包括藥物篩選。
目前，從活的供體獲得用於此類臨床和實驗室應用的血細胞。然而，供體血液的有限供應，尤其是當需要遺傳上相容的供體時，限制了治療性應用和藥物篩選。因此，仍然需要開發供體血液之外的血細胞來源。例如，需要無限供應良好表徵的功能性血細胞類型，包括用於治療性應用的患者特異性HSC。
髓樣細胞源自骨髓中的多能造血幹細胞並且由以下組成：粒細胞（嗜中性、嗜酸性、嗜鹼性）和單核細胞/巨噬細胞譜系的細胞（包括樹突細胞（DC）和破骨細胞）。在先天性免疫和適應性免疫、炎性反應、和骨重塑中，該等細胞都起到關鍵作用。
我們已經建立了人多能幹細胞（hPSC）分化方案，從而產生造血幹細胞（HSC）。造血作用在胚胎發育的兩個階段發生-原始階段和確定階段。確定的造血作用的特徵在於產生具有用於細胞治療和疾病建模的廣泛潛力的長期再生性HSC，先前並未從hPSC獲得過該HSC。
本發明部分基於以下發現：一種由誘導性多能幹細胞（iPSC）產生造血幹細胞（HSC）之方法。在一些實施方式中，本發明係一種產生造血前驅細胞之方法，其包括以下步驟： a) 獲得多能幹細胞群體； b) 在第0天，在第一缺氧條件下，在補充的無血清分化（SFD）培養基中培養該細胞； c) 在第二缺氧條件下，在StemPro-34培養基中培養該細胞； d) 在非缺氧條件下，在StemPro-34培養基中培養該細胞；以及 e) 在非缺氧擴增條件下，在StemPro-34培養基中培養該細胞；以及 f) 收集造血前驅細胞群體。
在一個實施方式中，由多能幹細胞或體細胞的轉分化產生造血前驅細胞之方法包括在用來產生可以分化成不同造血譜系細胞的造血前驅細胞的條件下，培養該多能幹細胞或體細胞，該方法包括以下步驟：(a) 獲得多能幹細胞群體，(b) 藉由以下來誘導造血分化：在第0天，在SFD培養基、10 uM Y-27632、10 ng/ml BMP4和25 ng/ml bFGF中培養；用SFD培養基、10 ng/ml BMP4、5 ng/ml bFGF、和8 uM CHIR99021培養1-2天；用StemPro34培養基、12.5 ng/ml bFGF、和25 ng/ml VEGF培養1天；用StemPro34培養基、12.5 ng/ml bFGF、和25 ng/ml VEGF培養1-2天；用StemPro34培養基、12.5 ng/ml bFGF、25 ng/ml VEGF、50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO培養2-4天；用StemPro34培養基、12.5 ng/ml bFGF、12.5 ng/ml VEGF、50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、2 U/ml EPO、10 ng/ml BMP4、10 ng/ml SHH、10 ug/ml血管張力素II、和100 uM氯沙坦鉀培養3-5天，每天更換一次；用StemPro34培養基、50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO培養5-10天，每3天更換一次。
在一些實施方式中，本發明係使用以上方法產生的造血前驅細胞，例如造血幹細胞。在一些較佳的實施方式中，造血前驅細胞在細胞表面上表現CXCR4。在一些實施方式中，造血前驅細胞係CD34+、CD45+、CD90+或THY1+。在一些實施方式中，造血前驅細胞係CD38-、Lin-、CD43-、和CD73-。在一些實施方式中，造血前驅細胞在細胞表面上表現CD90。在一些實施方式中，造血前驅細胞表現runx1c。在一些較佳的實施方式中，造血前驅細胞能夠產生長期再生性造血前驅細胞。
最近，已經藉由插入對於維持hESC的多能性而言關鍵的某些基因，從人成纖維細胞獲得多能幹細胞系（Yu, J.等人, 2007, Science [科學], 318:1917-1920；Takahashi, K., 等人, 2007，Cell [細胞], 131:861-872；Park, I. H., 等人, 2008, Nature [自然], 451:141-146）。該等所謂的人誘導性多能幹細胞（iPSC）行為類似於hESC，即它們能夠自我更新並且向所有三個胚層大規模擴增和分化。希望從患有各種疾病的患者產生的iPSC系可以用於獲得在細胞水平上攜帶特定遺傳性狀的任何類型的原細胞或分化細胞，由此為體外分析疾病發病機理提供極獨特的機會。
先前，已經建立了一個系統，該系統用於藉由與OP9骨髓基質細胞共培養將hESC造血分化為造血細胞（odyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, 1.1. 2005, Blood [血液], 105:617-626），並基於它們共同表現CD43和差異表現CD45表徵了在hESC的OP9共培養物中出現的兩個最原始的多能造血細胞亞群。具有廣泛淋巴骨髓分化潛能的lin-CD34+CD43+CD45-細胞首先出現在共培養物中。稍後，出現富集骨髓原細胞的lin-CD34+CD43+CD45+細胞（odyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. 2006, Blood [血液], 108:2095-2105）。Slukvin實驗室證明了當iPSC在與OP9的共培養物中分化為血細胞時，觀察到類似模式的造血分化（Choi, K.等人, 2009, Stem Cells [幹細胞], 27:559-567）。
在本發明的某些實施方式中，揭露了藉由非造血細胞的人多能細胞（包括幹細胞，其包括人胚胎幹細胞和誘導性多能幹細胞））的正向程式設計、或藉由非造血細胞的體細胞的轉分化來提供造血細胞或造血細胞前驅之方法和組成物。還提供了細胞，該細胞包含：包括一個或多個造血前驅程式設計因子基因的外源表現盒，和/或特異性針對造血細胞或造血前驅細胞鑒定的報告表現盒。在一些實施方式中，細胞可以是幹細胞，包括但不限於胚胎幹細胞、胎兒幹細胞、或成體幹細胞。在另外的實施方式中，細胞可以是任何體細胞。
幹細胞係在大多數（如果不是全部的話）多細胞生物中發現的細胞。它們的特徵在於藉由有絲分裂細胞分裂從而自我更新的能力，和分化成各種各樣的特化細胞類型的能力。兩種廣泛類型的哺乳動物幹細胞係：在囊胚中發現的胚胎幹細胞，和在成體組織中發現的成體幹細胞。在發育的胚胎中，幹細胞可以分化成所有特化胚胎組織。在成體生物中，幹細胞和原細胞充當身體的修復系統，補充特化細胞，並且還維持再生器官（例如血液、皮膚或腸組織）的正常轉換。
人多能幹細胞（包括人胚胎幹細胞（ESC）和誘導性多能幹細胞（iPSC））能夠在體外長期增殖，同時保留了分化成身體的所有細胞類型（包括造血細胞和造血前驅細胞）的潛力。因此，該等細胞可以潛在地為藥物開發和治療用途提供無限供應的患者特異性功能造血細胞和造血前驅細胞。人ESC/iPSC在體外分化成造血細胞和造血前驅細胞重演了正常體內發育；即它們經歷了正常順序發育階段，包括中胚層分化和造血特化。該順序發育過程需要在分化的不同階段添加不同生長因子。本發明的某些方面經由對於造血細胞分化/功能而言重要的轉錄因子的組合的表現，藉由從人ESC/iPSC的正向程式設計，或從體細胞的轉分化，提供了全功能造血前驅細胞，這類似於產生iPSC，繞開了大部分（如果不是所有的話）正常發育階段。此方法可以更具有時間和成本效益，並且產生了造血前驅細胞和造血細胞，它們的功能高度類似於（如果不是相同的話）人成體造血細胞和造血細胞的前驅。此外，作為造血前驅細胞分化的起始細胞群體，具有無限增殖能力的人ESC/iPSC可以比體細胞更有利。作為本發明的一部分產生的造血細胞和造血細胞的前驅的實例包括：表現CXCR4的細胞，CD34+、CD45+、CD90+和THY1+細胞，CD38-、Lin-、CD43-或CD73-細胞，CD45+、CD34+、CD90+、CD38-、和Lin-細胞，表現CD90的細胞，表現runx1c的細胞，或以上的任何組合。
胚胎幹細胞系（ES細胞系）係源自囊胚或更早桑椹胚期胚胎的內細胞團（ICM）的上胚層組織的細胞培養物。囊胚係人類約四至五日齡的早期胚胎，並且由50-150個細胞組成。ES細胞係多能的，並且在發育期間產生三個原胚層的所有衍生物：外胚層、內胚層和中胚層。換句話說，當對具體細胞類型給予充足並且必要的刺激時，它們可以發育為成體的每種細胞類型。它們並不構成胚外膜或胎盤。
迄今為止，大多數研究使用小鼠胚胎幹細胞（mES）或人胚胎幹細胞（hES）。兩種細胞具有基本的幹細胞特徵，但是它們需要非常不同的環境才能維持未分化狀態。小鼠ES細胞可以在明膠層上生長，並且需要存在白血病抑制因子（LIF）。人ES細胞可以在小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）的飼養層上生長，並且通常需要存在鹼性成纖維細胞生長因子（bFGF或FGF-2）。沒有最佳培養條件或基因操作（Chambers等人, 2003）的情況下，胚胎幹細胞將迅速分化。
人胚胎幹細胞還可以藉由存在若干轉錄因子和細胞表面蛋白來定義。轉錄因子Oct-4、Nanog、和Sox-2形成了核心調節網路，其確保導致分化的基因的抑制和多能性的維持（Boyer等人, 2005）。通常用於鑒定hES細胞的細胞表面抗原包括糖脂SSEA3和SSEA4，以及硫酸角質素抗原Tra-1-60和Tra-1-81。
可以使用先前描述之方法，從囊胚獲得人ES細胞（Thomson等人, 1995；Thomson等人, 1998；Thomson和Marshall, 1998；Reubinoff等人, 2000）。在一個方法中，將5天的人囊胚暴露於兔抗人脾細胞抗血清，然後暴露於1 : 5稀釋的豚鼠補體，從而裂解滋養外胚層細胞。從完整的內細胞團去除裂解的滋養外胚層細胞後，將內細胞團在γ滅活的小鼠胚胎成纖維細胞的飼養層上並在胎牛血清存在下培養。在9至15天後，可以將源自內細胞團的細胞的團塊化學地（即暴露於胰蛋白酶）或機械地解離並且重新鋪板於含有胎牛血清和小鼠胚胎成纖維細胞飼養層的新鮮培養基中。在進一步增殖後，藉由微量移液管選擇具有未分化的形態學的集落，並且機械解離成團塊，並且重新鋪板（參見美國專利號6,833,269）。ES樣形態學被表徵為緻密集落，具有明顯高的核質比和突出的核仁。所得ES細胞可以藉由短暫的胰蛋白酶消化或藉由借助微量移液管選擇單個集落來常規傳代。在一些方法中，可以藉由在鹼性成纖維細胞生長因子存在下，在成纖維細胞的飼養層上培養ES細胞來使人ES細胞在無血清的情況下生長（Amit等人, 2000）。在其他方法中，可以藉由在含有鹼性成纖維細胞生長因子的「條件」培養基存在下，在蛋白質基質（如基質膠或層黏連蛋白）上培養細胞來使人ES細胞在無飼養細胞層的情況下生長（Xu等人, 2001）。先前藉由與成纖維細胞共培養來調節培養基。
ES細胞的另一來源係建立的ES細胞系。已知各種小鼠細胞系和人ES細胞系，並且定義了它們的生長和增殖的條件。例如，從小鼠品系129胚胎的內細胞團建立小鼠CGR8細胞系，CGR8細胞的培養物可以在LIF存在下生長而不需要飼養層。作為另外的實例，Thompson等人建立了人ES細胞系Hl、H7、H9、H13和H14。此外，已經開發了H9系的亞殖株H9.1和H9.2。預期實際上，本領域已知的任何ES或幹細胞系可以用於本發明，例如Yu和Thompson (2008) Genes Dev[基因與發育], 22(15):1987-97中描述的那些，將其藉由引用併入本文。
用於本發明的ES細胞的來源可以是囊胚、源自培養囊胚的內細胞團的細胞、或從已建立的細胞系的培養物中獲得的細胞。因此，如本文所用，術語「ES細胞」可以指囊胚的內細胞團細胞、獲得自內細胞團的培養物的ES細胞、和獲得自ES細胞系的培養物的ES細胞。
誘導性多能幹細胞（iPSC）係具有ES細胞的特徵但藉由分化體細胞的重程式設計獲得的細胞。已經藉由各種方法獲得了誘導性多能幹細胞。在一個方法中，使用逆轉錄病毒轉導，用轉錄因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4轉染成年人真皮成纖維細胞（Takahashi等人, 2007）。將轉染的細胞鋪板在補充有鹼性成纖維細胞生長因子（bFGF）的培養基中的SNL飼養細胞（產生LIF的小鼠細胞成纖維細胞系）上。在大約25天後，在培養物中出現類似人ES細胞集落的集落。挑取ES細胞樣集落，並且在bFGF存在下，在飼養細胞上進行擴增。
基於細胞特徵，ES細胞樣集落的細胞係誘導性多能幹細胞。誘導性多能幹細胞在形態學上類似人ES細胞，並且表現各種人ES細胞標誌物。而且，當在已知導致人ES細胞分化的條件下生長時，誘導性多能幹細胞相應地分化。例如，誘導性多能幹細胞可以分化成具有造血細胞結構和造血細胞標誌物的細胞。預期實際上，任何iPS細胞或細胞系可以用於本發明，包括例如Yu和Thompson, 2008中描述的那些。
在另一種方法中，使用慢病毒轉導，用四個基因Oct4、Sox2、Nanog和Lin28轉染人胎兒或新生兒成纖維細胞（Yu等人, 2007）。在感染後12-20天，具有人ES細胞形態學的集落變得可見。挑取集落並且擴增。構成集落的誘導性多能幹細胞在形態學上類似人ES細胞，表現各種人ES細胞標誌物，並且在注射到小鼠中後，形成具有神經組織、軟骨、和腸上皮的畸胎瘤。
從小鼠製備誘導性多能幹細胞之方法也是已知的（Takahashi和Yamanaka, 2006）。iPS細胞的誘導典型地需要表現或暴露於來自Sox家族的至少一個成員和來自Oct家族的至少一個成員。Sox和Oct被認為對於指定ES細胞身份的轉錄調控層次而言係關鍵的。例如，Sox可以是Sox-1、Sox-2、Sox-3、Sox-15、或Sox-18；Oct可以是Oct-4。另外的因子可以增加重程式設計效率，如Nanog、Lin28、Klf4、或c-Myc；特定組的重程式設計因子可以是包括以下的組：Sox-2、Oct-4、Nanog和視需要Lin-28；或包括以下：Sox-2、Oct4、Kif和視需要c-Myc。
同ES細胞一樣，iPS細胞具有特徵性抗原，其可以使用針對SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4（發展研究雜交瘤細胞儲庫（Developmental Studies Hybridoma Bank），國家兒童健康和人類發展研究所（National Institute of Child Health and Human Development），貝塞斯達，馬里蘭州）、以及TRA-1-60和TRA-1-81（Andrews等人, 1987）的抗體，藉由免疫組織化學或流動式細胞測量術來鑒定或證實。胚胎幹細胞的多能性可以藉由向8-12週齡雄性SCID小鼠的後腿肌肉中注入約0.5-10 x106個細胞來證實。畸胎瘤發育表明了三個胚層中的每一個中的至少一種細胞類型。
在本發明的某些方面，使用包含Oct家族成員和Sox家族成員的重程式設計因子，例如如上所述之Oct4和Sox2與Kif或Nanog的組合，藉由重程式設計體細胞來製備iPS細胞。用於重程式設計的體細胞可以是可被誘導為多能性的任何體細胞，例如成纖維細胞、角質化細胞、造血細胞、間充質細胞、肝細胞、胃細胞、或~細胞。在某些方面，T細胞可以用作用於重程式設計的體細胞的來源（參見美國申請號61/184,546，藉由引用併入本文）。
可以從包含在一種或多種載體中的表現盒表現重程式設計因子，該等載體例如整合型載體或附加型載體，例如基於EBY元件的系統（參見美國申請號61/058, 858，藉由引用併入本文；Yu等人, 2009）。在另外的方面，可藉由蛋白轉導將重程式設計蛋白直接導入體細胞（參見美國申請號61/172,079，藉由引用併入本文）。
在本發明的某些方面，還可以提供轉分化之方法，即一種體細胞類型直接轉化成另一種類型，例如從非造血體細胞衍生造血前驅細胞或造血細胞。然而，人體細胞的供應可能是有限的，尤其是來自活供體的那些。在某些方面，為了提供無限供應的用於程式設計的起始細胞，可以藉由導入永生化基因或蛋白（例如hTERT或癌基因）來使體細胞永生化。細胞的永生化可以是可逆的（例如使用可去除的表現盒）或誘導性的（例如使用誘導型啟動子）。
在本發明的某些方面，體細胞可以是原代細胞（非永生化細胞），例如從動物新鮮分離的那些細胞，或可以源自細胞系（永生化細胞）。從受試者分離後，可以將細胞維持在細胞培養物中。在某些實施方式中，在將細胞用於本發明之方法之前，將細胞傳代一次或多次（例如2-5、5-10、10-20、20-50、50-100次或更多次）。在一些實施方式中，在將細胞用於本發明之方法之前，將細胞傳代不多於1、2、5、10、20、或50次。可以將它們冷凍、解凍等。
本文使用或描述的體細胞可以是天然的體細胞、或工程化的體細胞，即已經在遺傳上改變的體細胞。典型地，本發明的體細胞可以是哺乳動物細胞，例如人類細胞、靈長類細胞或小鼠細胞。它們可以藉由熟知之方法獲得，並且可以獲得自含有活體細胞的任何器官或組織，例如血液、骨髓、皮膚、肺、胰臟、肝臟、胃、腸、心臟、生殖器官、膀胱、腎臟、尿道和其他泌尿器官等。
可用於本發明的哺乳動物體細胞包括但不限於：支持細胞、內皮細胞、顆粒細胞、神經元、胰島細胞、表皮細胞、上皮細胞、肝細胞、毛囊細胞、角質化細胞、造血細胞、黑素細胞、軟骨細胞、淋巴細胞（B和T淋巴細胞）、紅血球、巨噬細胞、單核細胞（monocyte）、單核細胞（mononuclear cell）、心肌細胞、和其他肌肉細胞等。
體細胞可以是部分或完全分化的。分化係一個過程，藉由該過程，較不特化的細胞變成更特化的細胞類型。細胞分化可以涉及大小、形狀、極性、代謝活動、基因表現和/或對細胞訊號的應答性的變化。例如，造血幹細胞分化從而產生所有血細胞類型，包括脊髓（單核細胞和巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、紅血球、巨核細胞/血小板、樹突細胞）、紅-巨核細胞（紅血球、巨核細胞、凝血細胞）、以及淋巴譜系10（T細胞、B細胞、天然殺傷（NK）細胞）。在分化過程中，細胞的最終命運變得更加固定。如本文所描述的，部分分化的體細胞和完全分化的體細胞可以如本文所描述進行程式設計，從而產生所需細胞類型，例如造血細胞和造血前驅細胞。
在一個實施方式中，本發明係一種藉由使用該方法將hESC或iPSC分化成富集lin-CD34+ CD43+CD45+骨髓原細胞的細胞，從哺乳動物多能幹細胞（較佳的是人胚胎幹細胞（hESC）或誘導性多能幹細胞（iPSC，參見例如Yu等人, (2007) Science[科學], 318:1917-1920，藉由引用併入本文，針對製備iPSC的一種方法））有效地產生嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、破骨細胞、樹突細胞和朗格漢斯細胞之方法。在一些實施方式中，細胞可以進一步分化成lin+CD34-CD43-CD45+原細胞。 lin-CD34+CD43+CD45+細胞群體的產生
本發明部分基於以下發現：從人多能幹細胞（hPSC）產生造血幹細胞（HSC）之方法。hPSC可以是誘導性多能幹細胞（iPSC）、胚胎幹細胞、或轉分化的體細胞。由本發明之方法產生的HSC可以分化成不同造血譜系細胞。本發明之方法包括以下步驟：
第一步驟係：獲得人多能幹細胞（hPSC）的細胞或群體，其可以源自胚胎幹細胞、誘導性多能幹細胞、或轉分化的體細胞，如以上所描述。
下一步驟係：在第0天，在補充的無血清分化（SFD）培養基（75 : 25的IMDM : Ham's F-12，0.05% BSA，1x B27，0.5x N2補充劑，1X GlutaMax和1X青黴素-鏈黴素，0.5 mM抗壞血酸，450 µM單硫代甘油，和150 µg/mL全鐵轉鐵蛋白）中培養細胞。第0天代表開始分化方案的那一天，例如將SFD培養基引入細胞群體中。這允許用於細胞的均勻分佈、iPSC鋪板等的潛在等待期。因此，在引入SFD培養基之前，可以將細胞在培養物中維持一段時間。例如，在第0天引入SFD培養基之前，可以將細胞維持高達7天。不受理論束縛，引入補充的SFD培養基的這一步驟誘導造血和中胚層分化。在一些實施方式中，可以將細胞在補充的SFD培養基中培養3、4、5、6、或7天。在一些實施方式中，將細胞在補充的SFD培養基中培養3天。在本發明的一些實施方式中，可以將BMP4以0.1-500 ng/ml，較佳的是1-100 ng/ml，甚至更較佳的是5-25 ng/ml的濃度範圍添加到SFD培養基中。在一些實施方式中，可以添加其他激活ALK1、ALK2、和或ALK3傳訊的BMP或小分子來代替或補充BMP4。在一些實施方式中，可以以1-200 ng/ml的濃度範圍添加BMP2或BMP8a來代替或補充BMP4。在一些實施方式中，可以在第0天至第3天將BMP4，其他激活ALK1、ALK2、和或ALK3傳訊的BMP和/或小分子添加到培養基中。不受理論束縛，BMP4和其他激活ALK1、ALK2、和或ALK3傳訊的BMP或小分子激活SMAD傳訊，從而形成中胚層。在一些實施方式中，BMP4，其他激活ALK1、ALK2、和或ALK3傳訊的BMP和/或小分子係本發明的此步驟中的所需組分。在一些實施方式中，可以將bFGF以1-500 ng/ml，較佳的是10-100 ng/ml，甚至更較佳的是20-50 ng/ml的濃度範圍添加到培養基中。在一些實施方式中，可以添加其他FGF或MAPk促效劑來代替或補充bFGF。在一些實施方式中，可以在第0天至第3天將bFGF、其他FGF和/或MAPk促效劑添加至培養基。不受理論束縛，bFGF、其他FGF或MAPk促效劑有助於中胚層的存活和模式化。在一些實施方式中，bFGF、其他FGF和/或MAPk促效劑係本發明的此步驟中的所需組分。在一些實施方式中，可以將Y-27632以100 nM-30 μM，較佳的是1 μM-20 μM，甚至更較佳的是5 μM-20 μM的範圍添加到培養基中。在一些實施方式中，可以添加Rho激酶抑制劑來代替或補充Y-27632。在一些實施方式中，可以在第0天將Y-27632和/或Rho激酶抑制劑添加至培養基。不受理論束縛，Y-27632和/或Rho激酶抑制劑允許細胞作為單細胞存活以在培養皿中均勻分佈。在一些實施方式中，可以將CHIR99021以0.1-20 μM，較佳的是1-10，甚至更較佳的是5-10 μM的範圍添加到培養基中。在一些實施方式中，可以添加WNT蛋白、其他GSK3b抑制劑、和/或導致β-連環蛋白穩定的小分子，例如Wnt3a、FZM1.8、BIO氯化鋰、CHIR-98014、SB216763、SB415286來代替或補充CHIR99021。在一些實施方式中，可以以1-200 ng/ml的濃度範圍添加Wnt3a來代替或補充CHIR99021，可以以100 nM-100 μM的濃度範圍添加FZM1.8來代替或補充CHIR99021，可以以100 nM-100 μM的濃度範圍添加BIO來代替或補充CHIR99021，可以以0.1 mM-20 mM的濃度範圍添加氯化鋰來代替或補充CHIR99021，可以以500 nM-50 μM的濃度範圍添加CHIR-98014來代替或補充CHIR99021，可以以500 nM-50 μM的濃度範圍添加SB216763來代替或補充CHIR99021，和/或可以以500 nM-50 μM的濃度範圍添加SB415286來代替或補充CHIR99021。在一些實施方式中，可以在第0至2天、第1至2天，或僅在第2天將CHIR99021、Wnt3a、FZM1.8、BIO氯化鋰、CHIR-98014、SB216763、和/或SB415286添加至培養基。不受理論束縛，CHIR99021、Wnt3a、FZM1.8、BIO氯化鋰、CHIR-98014、SB216763、和/或SB415286藉由抑制GSK3b激活Wnt傳訊。在一些實施方式中，CHIR99021、Wnt3a、FZM1.8、BIO氯化鋰、CHIR-98014、SB216763、和/或SB415286係本發明的此步驟中的所需組分。在一些實施方式中，可以將SB-431542以0.1-20 μM的範圍添加至培養基。發現這改善了效率。在一些實施方式中，可以添加用來抑制SMAD傳訊的其他方式來代替或補充SB-431542，包括LY2109761、SB525334、SB505124、GW788388、LY364947、Galunisertib（LY2157299）、和/或RepSox。在一些實施方式中，可以以500 nM-50 μM的濃度範圍添加LY2109761來代替或補充SB-431542，可以以500 nM-50 μM的濃度範圍添加SB525334來代替或補充SB-431542，可以以500 nM-50 μM的濃度範圍添加SB505124來代替或補充SB-431542，可以以500 nM-50 μM的濃度範圍添加GW788388來代替或補充SB-431542，可以以500 nM-50 μM的濃度範圍添加LY364947來代替或補充SB-431542，可以以500 nM-50 μM的濃度範圍添加Galunisertib（LY2157299）來代替或補充SB-431542，和/或可以以500 nM-50 μM的濃度範圍添加RepSox來代替或補充SB-431542。在一些實施方式中，可以在第1至3天、在第2和3天、或僅在第3天，將SB-431542、LY2109761、SB525334、SB505124、GW788388、LY364947、Galunisertib（LY2157299）、和/或RepSox添加至培養基。不受理論束縛，SB-431542、LY2109761、SB525334、SB505124、GW788388、LY364947、Galunisertib（LY2157299）、和/或RepSox抑制ALK/SMAD傳訊。在一些實施方式中，向SFD培養基以上述量和時間補充BMP4、bFGF、和CHIR99021。在一些實施方式中，向SFD培養基以上述量和時間補充BMP4、bFGF、CHIR99021、和SB-431542。在一個實施方式中，在第0天，向SFD培養基補充10 μM Y-27632；在第0、1、和2天，補充10 ng/ml BMP4；在第0、1、和2天，補充25 ng/ml bFGF；在第1和2天，補充8 μM CHIR99021；並且在第2天，補充6 μM SB-431542。將細胞在此培養基中培養長達3天。此步驟係在缺氧條件下進行的，其中O2 濃度小於10%、較佳的是5%，並且CO2 濃度為1%至10%、較佳的是5%，在32°C-39°C，較佳的是37°C下。
下一步驟係在缺氧條件下，在StemPro-34培養基中培養細胞，其中O2 濃度小於10%、較佳的是5%，並且CO2 濃度為1%至10%、較佳的是5%，在32°C-39°C，較佳的是37°C下。不受理論束縛，此步驟誘導內皮形成。在一些實施方式中，可以在缺氧條件下將細胞在StemPro-34培養基中培養直至第4、5、6、7、8、或9天。在一些實施方式中，將細胞在補充的SFD培養基中培養直至第9天。在本發明的一些實施方式中，可以將bFGF以1-500 ng/ml、較佳的是10-100 ng/ml、並且甚至更較佳的是20-50 ng/ml的範圍添加至培養基。在一些實施方式中，可以添加其他FGF或MAPk促效劑來代替或補充bFGF。在一些實施方式中，可以在第3天直至第14天或更長時間，例如直至第15、16、17、18、19、20、或21天，將bFGF、其他FGF或MAPk促效劑添加到培養基中。在一些實施方式中，可以將SB-431542以0.1-20 μM的範圍添加至培養基。在一些實施方式中，可以添加用來抑制SMAD傳訊的其他方式來代替或補充SB-431542，包括LY2109761、SB525334、SB505124、GW788388、LY364947、Galunisertib（LY2157299）、和/或RepSox。在一些實施方式中，可以以500 nM-50 μM的濃度範圍添加LY2109761來代替或補充SB-431542，可以以500 nM-50 μM的濃度範圍添加SB525334來代替或補充SB-431542，可以以500 nM-50 μM的濃度範圍添加SB505124來代替或補充SB-431542，可以以500 nM-50 μM的濃度範圍添加GW788388來代替或補充SB-431542，可以以500 nM-50 μM的濃度範圍添加LY364947來代替或補充SB-431542，可以以500 nM-50 μM的濃度範圍添加Galunisertib（LY2157299）來代替或補充SB-431542，和/或可以以500 nM-50 μM的濃度範圍添加RepSox來代替或補充SB-431542。在一些實施方式中，可以在3天、或從第3天至第4天或更長時間，例如直到第9天，將SB-431542、LY2109761、SB525334、SB505124、GW788388、LY364947、Galunisertib（LY2157299）、和/或RepSox添加至培養基。在一些實施方式中，可以將VEGF以0.1-500 ng/ml、較佳的是10-100 ng/ml、並且甚至更較佳的是20-50 ng/ml的範圍添加至培養基。在一些實施方式中，可以添加刺激血管生成的藥物來代替或補充VEGF，例如VEGF-C、血管生成素-1、2、3、和/或4、KDR/FLT-1促效劑、i/eNOS促效劑和/或一氧化氮。在一些實施方式中，可以以1-200 ng/ml的濃度範圍添加VEGF-C、血管生成素-1、2、3、和/或4來代替或補充VEGF。在一些實施方式中，可以在第3天直到第14天或更長時間，例如直到第15、16、17、18、19、20、或21天，將VEGF添加到培養基中。不受理論束縛，VEGF、VEGF-C、血管生成素-1、2、3、和/或4、KDR/FLT-1促效劑、i/eNOS促效劑和/或一氧化氮促進內皮細胞形成和存活。在一些實施方式中，可以在第6天直到第21天，將HSC混合物添加至培養基。HSC混合物可以含有以下中的一種或多種：SCF、IL-6、IL-3、FLT3L、IGF-1、IL-11、和EPO。在一些實施方式中，HSC混合物可以含有以下中的一種或多種：SCF、IL-6、IL-3、FLT3L、IGF-1、和/或IL-11，各自的濃度範圍為1-200 ng/ml，和/或EPO，其濃度範圍為0.1-20 U/ml。在一些實施方式中，HSC混合物含有50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO。
下一步驟係在非缺氧條件下，在StemPro-34培養基中培養細胞，其中O2 濃度大於10%、高達30%、較佳的是常氧水平或15%-20%，並且CO2 濃度為1%至10%、較佳的是5%，32°C-39°C，較佳的是37°C。不受理論束縛，此步驟誘導內皮造血轉化。在一些實施方式中，將細胞在缺氧條件下在StemPro-34培養基中培養之後（例如從第9天）在非缺氧條件下在StemPro-34培養基中培養直到第21天及以後。在一些實施方式中，可以在非缺氧條件下，在StemPro-34培養基中培養細胞，直到第5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、或19天。在一些實施方式中，在非缺氧條件下，在StemPro-34培養基中培養細胞，直到第14天。在本發明的一些實施方式中，可以將bFGF以1-500 ng/ml、較佳的是5-50 ng/ml、並且甚至更較佳的是10-25 ng/ml的範圍添加至培養基。以上描述了可以添加來代替或補充bFGF的其他化合物。在一些實施方式中，可以在第3天直到第14天或更長時間（在缺氧和非缺氧兩種條件下投與），例如直到第15、16、17、18、19、20、或21天，將bFGF添加到培養基。在一些實施方式中，可以將VEGF以0.1-500 ng/ml、較佳的是10-100 ng/ml、並且甚至更較佳的是20-50 ng/ml的範圍添加至培養基。以上描述了可以添加來代替或補充VEGF的其他化合物。在一些實施方式中，可以在第3天直到第14天或更長時間，例如直到第15、16、17、18、19、20、或21天，將VEGF添加到培養基中。在一些實施方式中，可以在第6天直到第21天，將HSC混合物添加至培養基。HSC混合物可以含有以下中的一種或多種：SCF、IL-6、IL-3、FLT3L、IGF-1、IL-11、和EPO。以上描述了HSC混合物組分的範圍。在一些實施方式中，HSC混合物含有50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO。在一些實施方式中，可以將EHT混合物在缺氧條件下在StemPro-34培養基中培養之後（例如從第9天）添加至培養基直到第14天及以後，並且可以每天更換一次。EHT混合物可以含有以下中的一種或多種：濃度範圍為1-200 ng/ml的BMP4，濃度範圍為1-200 ng/ml的SHH，濃度範圍為0.1-100 μg/ml的血管張力素II，和/或濃度範圍為1 μM-1000 μM的氯沙坦鉀。在一些實施方式中，可以以1-200 ng/ml的濃度範圍、較佳的是10 ng/ml添加SAG來代替或補充SHH。在一個實施方式中，EHT混合物含有10 ng/ml BMP4、10 ng/ml SHH、10 ug/ml血管張力素II和100 uM氯沙坦鉀，每天更換一次。
下一步驟係在非缺氧擴增條件下，在StemPro-34培養基中培養細胞，其中O2 濃度大於10%、高達30%、較佳的是常氧水平或15-20%，並且CO2 濃度為1%至10%、較佳的是5%，32°C-39°C，較佳的是37°C。在一些實施方式中，將細胞在非缺氧擴增條件下僅用HSC混合物在StemPro-34培養基中培養。以上描述了HSC混合物組分的範圍。在一些實施方式中，將細胞在非缺氧擴增條件下在無EHT混合物、VEGF或bFGF的StemPro-34培養基中培養。在一些實施方式中，每3天更換HSC混合物一次。HSC混合物可以含有以下中的一種或多種：SCF、IL-6、IL-3、FLT3L、IGF-1、IL-11、和EPO。在一些實施方式中，HSC混合物含有50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO。在此步驟後，產生HSC。在一些實施方式中，HSC在細胞表面上表現CXCR4。
例如，本發明之方法可以包括以下步驟：(a) 獲得多能幹細胞群體，(b) 藉由在第0天，在SFD培養基、10 uM Y-27632、10 ng/ml BMP4和25 ng/ml bFGF中培養來誘導造血分化；用SFD培養基、10 ng/ml BMP4、5 ng/ml bFGF、和8 uM CHIR99021培養1-2天；用StemPro34培養基、12.5 ng/ml bFGF、和25 ng/ml VEGF培養1天；用StemPro34培養基、12.5 ng/ml bFGF、和25 ng/ml VEGF培養1-2天；用StemPro34培養基、12.5 ng/ml bFGF、25 ng/ml VEGF、50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO培養2-4天；用StemPro34培養基、12.5 ng/ml bFGF、12.5 ng/ml VEGF、50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、2 U/ml EPO、10 ng/ml BMP4、10 ng/ml SHH、10 ug/ml血管張力素II、和100 uM氯沙坦鉀培養3-5天，每天更換一次；用StemPro34培養基、50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO培養5-10天，每3天更換一次。
在一個實施方式中，以上所描述之方法誘導造血分化，並且產生lin-CD34+CD43+CD45+細胞。在一些實施方式中，作為本發明的一部分產生的造血細胞和造血細胞前驅包括：表現CXCR4的細胞，CD34+、CD45+、CD90+和THY1+細胞，CD38-、Lin-、CD43-或CD73-細胞，CD45+、CD34+、CD90+、CD38-、和Lin-細胞，表現CD90的細胞，表現runx1c的細胞，或以上的任何組合。Runx1係造血作用發作的必需基因，因為RUNX1的缺失引起胚胎死亡。還已經表明，Runx1c同種型在確定的造血時更特異地表現，而Runx1a/b更廣泛地表現（Ng等人, (2016) Nat Biotechnol[自然生物技術], 34(11):1168-79；Challen等人, (2010) Exp Hematol [實驗血液學], 38(5):403-16；Sroczynska等人, (2009) Blood [血液], 114 (26): 5279-89；Bos等人, (2015) Development [發育], 142 (15):2719-24；Bee等人, (2010) Blood [血液], 115 (15):3042-50）。
還可以使用以上鑒定的發明來從iPSC產生骨髓譜系的細胞。例如，可以如Yu等人, (2007) Science[科學], 318:1917- 1920中所描述獲得iPSC，並將它們分化成富集lin-CD34+CD43+CD45+骨髓原細胞的細胞。從這點開始，然後可以使用以上所描述的方案。
在一些實施方式中，本發明提供了確定的造血，並且產生長期再生性HSC。在一些實施方式中，該等長期再生性HSC包括表現CXCR4的細胞，CD34+、CD45+、CD90+和THY1+細胞，CD38-、Lin-、CD43-或CD73-細胞，CD45+、CD34+、CD90+、CD38-、和Lin-細胞，表現CD90的細胞，表現runx1c的細胞，或以上的任何組合。不受理論束縛，CXCR4的表現涉及HSC和HSC的長期群體歸巢到骨髓中。在一些實施方式中，本發明的HSC包括使用本發明之方法產生的HSC，其中該HSC在細胞表面上表現CXCR4。
上面已經參照其較佳的實施方式描述了本發明。此概念的其他形式也旨在落入請求項的範圍內。 造血細胞及其前驅的用途
由本發明的某些方面之方法和組成物提供的造血細胞和造血前驅細胞可以用於多種應用。該等包括但不限於在體內移植或植入造血細胞和造血前驅；在體外篩選細胞毒性化合物、致癌物、誘變劑生長/調節因子、藥物化合物等；闡明血液疾病和損傷的機制；研究藥物和/或生長因子運作的機制；診斷和監測患者中的癌症；基因治療；以及產生生物活性產品，僅舉幾例。
本發明的程式設計衍生的造血和造血前驅細胞可以用於篩選影響本文提供的造血細胞的特徵的因子（例如溶劑、小分子藥物、肽、和多核苷酸）或環境條件（例如培養條件或操作）。
在一些應用中，幹細胞（分化的或未分化的）用於篩選以下因子，該因子促進細胞沿著造血細胞譜系成熟，或促進此類細胞在長期培養中的增殖和維持。例如，藉由將候選造血細胞成熟因子或生長因子添加至不同孔中的幹細胞中，並且然後根據細胞的進一步培養和使用的所需標準確定導致的任何表型改變來測試該候選造血細胞成熟因子或生長因子。
本發明的具體篩選應用關於在藥物研究中測試藥物化合物。讀物通常參考標準教科書（In vitro Methods in Pharmaceutical Research [藥物研究中的體外方法], 學術出版社（Academic Press）, 1997），和美國專利號5,030,015。在本發明的某些方面，被程式設計為造血譜系的細胞起到用於標準藥物篩選和毒性測定的測試細胞的作用，如先前在短期培養中對造血細胞和前驅所進行的。候選藥物化合物活性的評估通常涉及將在本發明的某些方面中提供的造血細胞或前驅與候選化合物組合，確定歸因於化合物的細胞的形態學、標誌物表型、或代謝活動的任何變化（與未處理的細胞或用惰性惰性化合物處理的細胞相比），並且然後將化合物的作用與觀察到的變化關聯。可以進行篩選，因為該化合物被設計為對造血細胞或前驅具有藥理作用，或因為被設計為在其他地方具有作用的化合物可能對造血細胞或前驅具有意想不到的作用。可以組合測試兩種或更多種藥物（藉由同時地或順序地與細胞組合），從而檢測可能的藥物-藥物相互作用。
本發明還提供了本文提供的造血細胞和造血前驅細胞用以恢復可能由於血液疾病或障礙或損傷而需要這種治療的受試者的一定程度的功能的用途。例如，藉由本文揭露之方法衍生的造血細胞和造血前驅細胞可以用於治療血液疾病和障礙，例如血紅蛋白病、貧血等。此外，造血細胞及其前驅可以用於向有此需要的受試者（例如需要輸血的受試者或患有血液學障礙的受試者）供應血液或血細胞（例如紅血球、血小板、和嗜中性粒細胞）。此類細胞可用於治療由細胞抑制療法（例如化學療法）引起的造血細胞缺乏。
為了確定本文提供的造血細胞和前驅對於治療性應用的適合性，可以首先在適合的動物模型中測試細胞。在一個水平上，評估細胞在體內存活和維持其表型的能力。在適合進一步觀察的部位（例如腎包膜下、脾內、肝小葉內、或骨髓內），向免疫缺陷動物（例如NOG小鼠，或化學地或藉由輻射造成免疫缺陷的動物）投與本文提供的程式設計的細胞。在數天至數週或更長的時段後，收穫組織，並且評估是否仍然存在起始細胞類型，例如多能幹細胞。這可以藉由向投與的細胞提供可檢測標誌物（例如綠色螢光蛋白、或β-半乳糖苷酶）；或藉由測量特異性針對投與的人類細胞的組成型標誌物來進行。在齧齒動物模型中測試本文提供的程式設計的細胞的情況下，可以藉由使用人特異性抗體進行免疫組織化學或ELISA，或藉由使用引起對人多核苷酸序列特異的擴增的引物和雜交條件進行RT-PCR分析來評估投與的細胞的存在和表型。在本揭露的其他地方提供了適合在mRNA或蛋白水平上評估基因表現的標誌物。
在一些實施方式中，本發明可以如以下所描述：
實施方式1.一種產生造血前驅細胞之方法，該方法包括以下步驟： a) 獲得多能幹細胞群體； b) 在第0天，在第一缺氧條件下，在補充的無血清分化（SFD）培養基中培養該細胞； c) 在第二缺氧條件下，在StemPro-34培養基中培養該細胞； d) 在非缺氧條件下，在StemPro-34培養基中培養該細胞；以及 e) 在非缺氧擴增條件下，在StemPro-34培養基中培養該細胞；以及 f) 收集造血前驅細胞群體。
實施方式2.如實施方式1所述之方法，其中該多能幹細胞係人多能幹細胞。
實施方式3.如實施方式2所述之方法，其中該多能幹細胞係誘導性多能幹細胞。
實施方式4.如實施方式2所述之方法，其中該多能幹細胞係胚胎幹細胞。
實施方式5.如實施方式1所述之方法，其中向該補充的SFD培養基補充以下中的一種或多種：添加至SFD培養基的BMP4、bFGF、Y-27632、CHIR99021、和SB-431542。
實施方式6.如實施方式5所述之方法，其中BMP4處於0.1-500 ng/ml的範圍。
實施方式7.如實施方式5所述之方法，其中在第0、1、或2天將BMP4添加至培養基。
實施方式8.如實施方式5所述之方法，其中在第0、1、和2天將BMP4添加至培養基。
實施方式9.如實施方式5所述之方法，其中bFGF處於1-500 ng/ml的範圍。
實施方式10.如實施方式5所述之方法，其中在第0、1、或2天將bFGF添加至培養基。
實施方式11.如實施方式5所述之方法，其中在第0、1、和2天將bFGF添加至培養基。
實施方式12.如實施方式5所述之方法，其中Y-27632處於100 nM-30 μM的範圍。
實施方式13.如實施方式5所述之方法，其中在第0天將Y-27632添加至培養基。
實施方式14.如實施方式5所述之方法，其中CHIR99021處於0.1-20 μM的範圍。
實施方式15.如實施方式5所述之方法，其中在第0、1、或2天將CHIR99021添加至培養基。
實施方式16.如實施方式5所述之方法，其中在第1和2天將CHIR99021添加至培養基。
實施方式17.如實施方式5所述之方法，其中SB-431542處於0.1-20 μM的範圍。
實施方式18.如實施方式5所述之方法，其中在第0、1、或2天將SB-431542添加至培養基。
實施方式19.如實施方式5所述之方法，其中在第2天將SB-431542添加至培養基。
實施方式20.如實施方式5所述之方法，其中將BMP4、bFGF、Y-27632、CHIR99021、和SB-431542添加至培養基。
實施方式21.如實施方式20所述之方法，其中BMP4處於5-25 ng/ml的濃度範圍，並且在第0、1、和2天將其添加至培養基；bFGF處於20-50 ng/ml的濃度範圍，並且在第0、1、和2天將其添加至培養基；Y-27632處於5 μM-20 μM的濃度範圍，並且在第0天將其添加至培養基；CHIR99021處於5 μM-20 μM的濃度範圍，並且在第1和2天將其添加至培養基；並且SB-431542處於0.1-20 μM的濃度範圍，並且在第2天將其添加至培養基。
實施方式22.如實施方式21所述之方法，其中BMP4處於10 ng/ml的濃度，並且在第0、1、和2天將其添加至培養基；bFGF處於25 ng/ml的濃度，並且在第0、1、和2天將其添加至培養基；Y-27632處於10 μM的濃度，並且在第0天將其添加至培養基；CHIR99021處於5 μM-20 μM的濃度範圍，並且在第1和2天將其添加至培養基；並且SB-431542處於0.1-20 μM的濃度範圍，並且在第2天將其添加至培養基。
實施方式23.如實施方式1所述之方法，其中在第二缺氧條件下向StemPro-34培養基補充以下中的一種或多種：在第二缺氧條件下，添加至StemPro-34培養基的bFGF、HSC混合物、SB-431542、和VEGF。
實施方式24.如實施方式23所述之方法，其中bFGF處於20-50 ng/ml的範圍。
實施方式25.如實施方式23所述之方法，其中在第3天直到第14天，將bFGF添加至培養基。
實施方式26.如實施方式23所述之方法，其中該HSC混合物包含以下中的一種或多種：SCF、IL-6、IL-3、FLT3L、IGF-1、IL-11、和EPO。
實施方式27.如實施方式23所述之方法，其中該HSC混合物包含SCF、IL-6、IL-3、FLT3L、IGF-1、和/或IL-11，各自為1-200 ng/ml的濃度範圍，和/或EPO，其濃度範圍為0.1-20 U/ml。
實施方式28.如實施方式23所述之方法，其中該HSC混合物包含50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO。
實施方式29.如實施方式23所述之方法，其中在第6天直到第21天，將該HSC混合物添加至培養基。
實施方式30.如實施方式23所述之方法，其中SB-431542處於0.1-20 μM的範圍。
實施方式31.如實施方式23所述之方法，其中在第3天至第9天，將SB-431542添加至培養基。
實施方式32.如實施方式23所述之方法，其中VEGF處於20-50 ng/ml的範圍。
實施方式33.如實施方式23所述之方法，其中在第3天至第14天，將VEGF添加至培養基。
實施方式34.如實施方式23所述之方法，其中將bFGF、HSC混合物、SB-431542、和VEGF添加至培養基。
實施方式35.如實施方式34所述之方法，其中bFGF處於20-50 ng/ml的濃度範圍，並且在第3天直到第14天將其添加至培養基；該HSC混合物包含50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO，並且在第6天直到第21天將其添加至培養基；SB-431542處於0.1-20 μM的濃度範圍，並且在第3天至第9天將其添加至培養基；並且VEGF處於20-50 ng/ml的濃度範圍，並且在第3天至第14天將其添加至培養基。
實施方式36.如實施方式34所述之方法，其中bFGF處於12.5 ng/ml的濃度，並且在第3天至第9天將其添加至培養基；該HSC混合物包含50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO，並且在第6天至第9天將其添加至培養基；SB-431542處於6 μM的濃度，並且在第3天將其添加至培養基；並且VEGF處於25 ng/ml的濃度，並且在第3天至第9天將其添加至培養基。
實施方式37.如實施方式1所述之方法，其中在非缺氧條件下，向StemPro-34培養基補充以下中的一種或多種：在非缺氧條件下，添加至StemPro-34培養基的bFGF、HSC混合物、VEGF、和EHT混合物。
實施方式38.如實施方式37所述之方法，其中bFGF處於10-25 ng/ml的範圍。
實施方式39.如實施方式37所述之方法，其中在第3天至第14天，將bFGF添加至培養基。
實施方式40.如實施方式37所述之方法，其中在第9天至第14天，將bFGF添加至培養基。
實施方式41.如實施方式37所述之方法，其中該HSC混合物包含SCF、IL-6、IL-3、FLT3L、IGF-1、IL-11、和EPO中的至少一種。
實施方式42.如實施方式37所述之方法，其中該HSC混合物包含SCF、IL-6、IL-3、FLT3L、IGF-1、和/或IL-11，各自為1-200 ng/ml的濃度範圍，和/或EPO，其濃度範圍為0.1-20 U/ml。
實施方式43.如實施方式37所述之方法，其中該HSC混合物包含50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO。
實施方式44.如實施方式37所述之方法，其中在第6天至第21天，將該HSC混合物添加至培養基。
實施方式45.如實施方式37所述之方法，其中VEGF處於20-50 ng/ml的範圍。
實施方式46.如實施方式37所述之方法，其中在第3天至第14天，將VEGF添加至培養基。
實施方式47.如實施方式37所述之方法，其中該EHT混合物包含BMP4、SHH、血管張力素II、和氯沙坦鉀中的至少一種。
實施方式48.如實施方式37所述之方法，其中該EHT混合物包含濃度範圍1-200 ng/ml的BMP4，濃度範圍為1-200 ng/ml的SHH，濃度範圍為0.1-100 μg/ml的血管張力素II，和/或濃度範圍為1 μM-1000 μM的氯沙坦鉀。
實施方式49.如實施方式37所述之方法，其中在第9天至第14天，將該EHT混合物添加至培養基。
實施方式50.如實施方式23所述之方法，其中將bFGF、HSC混合物、VEGF、和EHT混合物添加至培養基。
實施方式51.如實施方式34所述之方法，其中bFGF處於10-25 ng/ml的濃度範圍，並且在第3天直到第14天將其添加至培養基；該HSC混合物包含SCF、IL-6、IL-3、FLT3L、IGF-1、和/或IL-11，各自為1-200 ng/ml的濃度範圍，和/或EPO，其濃度範圍為0.1-20 U/ml，並且在第6天直到第21天將該HSC混合物添加至培養基；其中VEGF處於20-50 ng/ml的濃度範圍，並且在第3天至第14天將其添加至培養基；並且該EHT混合物包含BMP4、SHH、血管張力素II、和氯沙坦鉀，並且在第9天至第14天將其添加至培養基。
實施方式52.如實施方式34所述之方法，其中bFGF處於12.5 ng/ml的濃度，並且在第9天至第14天將其添加至培養基；該HSC混合物包含50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO，並且在第6天直到第21天將其添加至培養基；VEGF處於12.5 ng/ml的濃度，並且在第9天至第14天將其添加至培養基；並且該EHT混合物包含BMP4、SHH、血管張力素II、和氯沙坦鉀，並且在第9天至第14天將其添加至培養基。
實施方式53.如實施方式1所述之方法，其中在非缺氧擴增條件下，向該StemPro-34培養基補充在非缺氧擴增條件下添加至該StemPro-34培養基的HSC混合物。
實施方式54.如實施方式53所述之方法，其中該HSC混合物包含SCF、IL-6、IL-3、FLT3L、IGF-1、IL-11、和EPO中的至少一種。
實施方式55.如實施方式53所述之方法，其中該HSC混合物包含SCF、IL-6、IL-3、FLT3L、IGF-1、和/或IL-11，各自濃度範圍為1-200 ng/ml，和/或EPO，其濃度範圍為0.1-20 U/ml。
實施方式56.如實施方式53所述之方法，其中該HSC混合物包含50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO。
實施方式57.如實施方式53所述之方法，其中在第6天至第21天，將該HSC混合物添加至培養基。
實施方式58.如實施方式1所述之方法，其中該第一缺氧條件含有小於10%的O2 濃度。
實施方式59.如實施方式1所述之方法，其中該第二缺氧條件含有小於10%的O2 濃度。
實施方式60.如實施方式1所述之方法，其中在非缺氧條件下、在StemPro-34培養基中培養細胞的步驟含有大於10%的O2 濃度。
實施方式61.如實施方式1所述之方法，其中在非缺氧擴增條件下、在StemPro-34培養基中培養細胞的步驟含有大於10%的O2 濃度。
實施方式62.一種由多能幹細胞或體細胞的轉分化產生造血前驅細胞之方法，該方法包括在用來產生可以分化成不同造血譜系細胞的造血前驅細胞的條件下，培養多能幹細胞或體細胞，該方法包括以下步驟：(a) 獲得多能幹細胞群體，(b) 藉由以下來誘導造血分化：在第0天，在SFD培養基、10 uM Y-27632、10 ng/ml BMP4和25 ng/ml bFGF中培養；用SFD培養基、10 ng/ml BMP4、5 ng/ml bFGF、和8 uM CHIR99021培養1-2天；用StemPro34培養基、12.5 ng/ml bFGF、和25 ng/ml VEGF培養1天；用StemPro34培養基、12.5 ng/ml bFGF、和25 ng/ml VEGF培養1-2天；用StemPro34培養基、12.5 ng/ml bFGF、25 ng/ml VEGF、50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO培養2-4天；用StemPro34培養基、12.5 ng/ml bFGF、12.5 ng/ml VEGF、50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、2 U/ml EPO、10 ng/ml BMP4、10 ng/ml SHH、10 ug/ml血管張力素II、和100 uM氯沙坦鉀培養3-5天，每天更換一次；用StemPro34培養基、50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO培養5-10天，每3天更換一次。
實施方式63.如實施方式62所述之方法，其中具有StemPro34培養基、12.5 ng/ml bFGF、和25 ng/ml VEGF的培養基進一步包含6 uM SB 431542。
實施方式64.如實施方式62或63所述之方法，其中第2、3、4、或5天的培養基進一步包含6 μm SB 431542（TOCRIS公司）。
實施方式65.如實施方式1-64中任一項所述之方法，其中該多能幹細胞係誘導性多能幹細胞。
實施方式66.如實施方式1-64中任一項所述之方法，其中該多能幹細胞係胚胎幹細胞。
實施方式67.如實施方式1-66中任一項所述之方法，其中該多能幹細胞能夠歸巢到骨髓中。
實施方式68.如實施方式67所述之方法，其中該造血前驅細胞表現CXCR4。
實施方式69.如實施方式68所述之方法，其中該造血前驅細胞在細胞表面上表現CXCR4。
實施方式70.如實施方式1-69中任一項所述之方法，其中該造血前驅細胞係CD34+、CD45+、CD90+、或THY1+。
實施方式71.如實施方式70所述之方法，其中該造血前驅細胞係CD34+、CD45+、CD90+、和THY1+。
實施方式72.如實施方式1-71中任一項所述之方法，其中該造血前驅細胞係CD38-、Lin-、CD43-或CD73-。
實施方式73.如實施方式72所述之方法，其中該造血前驅細胞係CD38-、Lin-、CD43-和CD73-。
實施方式74.如實施方式1-73中任一項所述之方法，其中該造血前驅細胞係CD45+、CD34+、CD90+、CD38-、和Lin-。
實施方式75.如實施方式1-74中任一項所述之方法，其中該造血前驅細胞係CD90+。
實施方式76.如實施方式1-75中任一項所述之方法，其中該造血前驅細胞表現runx1c。
實施方式77.使用如實施方式1-76中任一項所述之方法產生的造血前驅細胞。
實施方式78.如實施方式77所述之造血前驅細胞，其中所述細胞能夠長期進行骨髓移植。藉由引用結合
本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請都藉由引用併入本文，如同每一單獨的出版物、專利或專利申請具體且單獨地藉由引用併入本文。然而，本文的參考文獻的引用不能理解為承認此類參考文獻係本發明的先前技術。就引用結合的參考文獻中提供的任何定義或術語與本文提供的術語和討論不同來說，以為本術語和定義為准。等效物
前述書面說明書被認為足以使熟悉該項技術者實踐本發明。本發明的某些較佳的實施方式中詳細描述了前述描述和實例並描述了諸位發明人考慮的最佳模式。然而，將領會到的是，不論前述事項可以在文中看起來如何詳盡，本發明都可以按多種方式進行實踐，並且應該依據所附申請專利範圍及其任何等效物來解釋。
以下實例，包括進行的實驗和實現的結果，僅提供解釋說明目的，並且不應被解釋為限制本發明。實例 實例 1 ：用於產生造血幹細胞之方法
將iPSC添加到6孔板（塗覆有PBS中以1 : 7稀釋的聚-L-鳥胺酸（PLO；西格瑪公司（Sigma）））中，其中每個孔1 ml，並且在37°C下孵育2小時。將PLO溶液更換為DMEM/F12中以1 : 150稀釋的層黏連蛋白（西格瑪公司（Sigma）），其中每個孔1 ml，並且在37°C下孵育2小時。
在第0天，使用TrypLE（賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher））提起iPSC，並且每孔接種在2 ml SFD培養基（75 : 25的IMDM : Ham's F-12、0.05% BSA、1x B27、0.5x N2補充劑、1X GlutaMax和1X青黴素-鏈黴素、0.5 mM抗壞血酸、450 µM單硫代甘油、和150 µg/mL全鐵轉鐵蛋白（R&D系統公司（R&D Systems））） + 10 uM Y-27632 + 10 ng/ml BMP4 + 25 ng/ml bFGF中的600,000個細胞。
在第1天，將培養基更換為SFD培養基 + 10 ng/ml BMP4 + 25 ng/ml bFGF + 8 uM CHIR99021，每孔添加2 ml。在第2、3、4、和5天，將6 μM SB-431542（TOCRIS公司）添加至一些樣本中的培養基中。在第3天，將培養基更換為StemPro34培養基 + 12.5 ng/ml bFGF + 25 ng/ml VEGF + 6 uM SB 431542，每孔添加2 ml，並且孵育24小時。在第4天，將培養基更換為StemPro34培養基 + 12.5 ng/ml bFGF + 25 ng/ml VEGF，每孔添加2 ml，並且孵育48小時。在第6-8天，將培養基更換為StemPro34培養基 + 12.5 ng/ml bFGF + 25 ng/ml VEGF + 50 ng/ml SCF + 25 ng/ml IL-6 + 25 ng/ml IL-3 + 25 ng/ml FLT3L + 25 ng/ml IGF-1 + 5 ng/ml IL-11 + 2 U/ml EPO，每孔添加2 ml。在第9-13天，將培養基更換為StemPro34培養基 + 12.5 ng/ml bFGF + 12.5 ng/ml VEGF + 50 ng/ml SCF + 25 ng/ml IL-6 + 25 ng/ml IL-3 + 25 ng/ml FLT3L + 25 ng/ml IGF-1 + 5 ng/ml IL-11 + 2 U/ml EPO + 10 ng/ml BMP4 + 10 ng/ml SHH + 10 ug/ml血管張力素II + 100 uM氯沙坦鉀，每孔添加2 ml，每2-3天更換培養基一次。在第14-21天，將培養基更換為StemPro34培養基 + 50 ng/ml SCF + 25 ng/ml IL-6 + 25 ng/ml IL-3 + 25 ng/ml FLT3L + 25 ng/ml IGF-1 + 5 ng/ml IL-11 + 2 U/ml EPO，每孔添加2 ml，每3天更換培養基一次。在第21天，對該細胞進行FACS分選以獲得Lin-(CD45RA, CD10, CD7, CD3, CD19, CD33, CD66b)CD34+CD45+CD38-CD90+細胞。在第0-10天，在37°C、5% O2 和5% CO2 下，孵育細胞。在第11-21天，在37°C、20% O2 和5% CO2 下，孵育細胞。實例 2 ：生血內皮和造血幹細胞的存在的測定
使用實例1中所描述的方案，使用單細胞定序，對來自培養第9天和第10天的細胞進行定序。生血內皮係能夠分化成造血細胞的內皮細胞的子集。生血內皮的特徵為CD34+ THY1+ CD43- CD73-。圖1中示出FACS圖，其示出了使用較早的方案以及實例1中示出的當前方案的生血內皮的存在。對造血幹細胞（CD34+ CD45+ CD73-）的進一步分析示出了在iPSC培養物中至分化第19-21天的內皮向造血的轉變窗。該等結果示出在圖2中。實例 3 ：用來測量 iPSC 衍生的 HSC 的多譜系潛力的有限稀釋測定
將FACS用於純化iPSC衍生的假定的HSC（CD34+ CD45+ CD90+ CD38- Lin-）。將細胞以20、10、5、2或1個細胞/孔載入到孔中，每個孔載入有具有允許的細胞介素的甲基纖維素。將細胞培養14天，並且對集落計分集落形成單位。結果示出在圖3中。圖3A示出當孔中載入有不同數量的細胞時，具有每種細胞類型的孔的百分比。取決於每孔載入的細胞的數量，細胞的不同級分（包括紅血球系爆裂樣形成單位（BFU-E）、巨噬細胞CFU（CFU-M）、粒細胞-巨噬細胞CFU（CFU-GM）、嗜酸性粒細胞集落形成單位（CFU-E）、粒細胞CFU（CFU-G）、和多能CFU（CFU-GEMM））形成集落，如圖3B中示出。實例 4 ： Runx1C-GFP 遺傳報告系統的產生
Runx1係造血作用發作的必需基因，因為RUNX1的缺失引起胚胎死亡。還已經表明，Runx1c同種型在確定的造血時更特異地表現，而Runx1a/b更廣泛地表現（Ng等人, (2016) Nat Biotechnol[自然生物技術], 34(11):1168-79；Challen等人, (2010) Exp Hematol [實驗血液學], 38(5):403-16；Sroczynska等人, (2009) Blood [血液], 114 (26): 5279-89；Bos等人, (2015) Development [發育], 142 (15):2719-24；Bee等人, (2010) Blood [血液], 115 (15):3042-50）。
創建GFP-2A-Runx1c遺傳報告系的目的是將從生血內皮中出現的新生造血幹細胞（HSC）進行螢光標記，從而允許runx1c的表現分析。該報告系使我們能夠視覺上確定我們的HSC分化方案的效率，並且提供簡單的讀數。
藉由使用以下步驟，構建靶向設計和載體。使用BamHI/BsmBI，將Runx1c N-末端靶向指導RNA 5’-GCATTTTCAGGAGGAAGCGA-3’（SEQ ID NO:1）選殖到pCas9指導載體（ORIGENE公司）中。用於標記造血幹細胞（HSC）的GFP-2A-Runx1c hiPSC報告系的生成如圖4所示。將「GFP-2A」序列插入在Runx1c外顯子1的ATG起始密碼子之前，也將「LoxP-PGK-BSD-pA-LoxP」盒插入內含子1中，用於富集正確靶向的人誘導性多能幹細胞（hiPSC）殖株。敲入序列側翼的同源臂由指導RNA靶向位點的上游和下游1 kb組成。使用Lipofectamine 3000，將7.5 ug pCas9-Ruxn1c-指導載體和7.5 ug GFP-2A-Runx1c供體載體轉染到2 x 106 個iPSC中。轉染後48小時，施加2.5 ug/ml殺稻瘟素，從而富集靶向群體。將細胞選擇5-7天，並且擴增用於冷凍保存。圖4A示出了示意圖，該示意圖示出了用來靶向Runx1c基因組座位的策略。同時，收穫1 x 106 個富集殺稻瘟素的iPSC，用於基因組DNA分離和PCR基因分型測試。圖4B示出了使用圖4A中描述的引物來篩選基因組編輯後的陽性集落。在殺稻瘟素選擇後，挑取總計48個單細胞殖株，擴增並且進行PCR基因分型分析。38個殖株在瓊脂糖凝膠上表現出陽性基因分型帶（效率 = 79%）。圖4C示出了GFP-2A-Runx1c hiPSC系的選擇的陽性殖株的圖像。
表1中的以下引物用於靶向的Runx1c基因座的不同區域的基因分型和定序：
[表1].用於基因分型的引物
P1 LH-Out-F 5’-CTGAAAGAGATACATACTAAAGTTGTCC（SEQ ID NO:2） 使用P1/P3來擴增左臂
P2 LH-In-F 5’- AGTCCCAGAGGTATCCAGCAGAGG（SEQ ID NO:3） 使用P2/P3來擴增左側連接點
P3 GFP-R 5’- GTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAG（SEQ ID NO:4）   
           
P4 BSD-F 5’- GCCATAGTGAAGGACAGTGATGGAC（SEQ ID NO:5）   
P5 RH-In-R 5’- TCACAAACAAGACAGGGAACTGGCA（SEQ ID NO:6） 使用P4/P5來擴增右側連接點
P6 RH-Out-R 5’- CAGATACAATTTGGGTGCTCAAGAGAG（SEQ ID NO:7） 使用P4/P6來擴增右臂
           
P7 GFP-F 5’- CTTCTTCAAGGACGACGGCAACTAC（SEQ ID NO:8） 使用P7/P8來擴增敲入區域
P8 BSD-R 5’- GTCCATCACTGTCCTTCACTATGGC（SEQ ID NO:9）
使用富集的轉染池的100 ng基因組DNA，使用PfuUltra II Hotstart PCR主混合物（安捷倫科技有限公司（Agilent））進行PCR。藉由桑格（Sanger）定序（蘇州金唯智生物科技有限公司（Genewiz））證實純化的PCR產物序列。
對於單細胞選殖，藉由TryPLE將殺稻瘟素抗性iPSC解離成單細胞，並且以單細胞密度（約2500個細胞/10-cm培養皿）接種到mTeSR培養基中。在前4天添加CloneR（幹細胞技術公司（Stem Cell Technologies）），從而促進單細胞殖株的存活和生長。從第4-7天施加第二輪的殺稻瘟素選擇，從而富集陽性靶向殖株。約第8-10天，在顯微鏡下在組織培養櫃中挑取從單細胞出現的集落，並且轉移到96孔基質膠塗覆的板上，用於繼續培養。
對於將集落板傳代，當96孔板中的集落生長至接近匯合時，使用ReLeSR（幹細胞技術公司（Stem Cell Technologies））解離細胞，並且重懸在補充有10 uM Y-27632（TOCRIS公司）的mTeSR中。然後將細胞懸液分別以1 : 3、1 : 5和1 : 8的比率分成3 x 96孔重複板。幾天後，將1 : 5板再次解離，用於冷凍保存。
為了進行PCR篩選，當1 : 3板中的細胞生長至完全匯合時，根據製造商的說明，使用50 ul/孔QuickExtract™ DNA提取溶液（Lucigen公司）將它們裂解。將3 ul的DNA提取溶液用作PCR模板，採用引物組LH-In-F/GFP-R進行PCR篩選。藉由PCR和步驟3中列出的其他引物組以及桑格定序來證實選擇的PCR陽性集落。
從1 : 8重複板擴增證實的GFP-2A-Runx1c hiPSC殖株，用於下游應用。我們的資料示出了RUNX1C-GFP的時序性表現與現有HSC標誌物CD34和CD45高度重疊，但是僅標誌著CD34/CD45雙陽性群體的亞群（參見圖6）。因此Runx1c-GFP用作另外的標誌物，來進一步精製HSC群體以獲得更高純度和功效。
圖5示出了在hiPSC分化中，GFP陽性造血幹細胞的視覺化：首先將GFP-2A-Runx1c iPSC（d0，左上圖）分化成內皮（d9，右上圖），隨後誘導內皮-造血轉化（EHT），該EHT導致GFP陰性內皮層的選定區域（虛線框，「血島」）出現GFP陽性造血幹細胞（d14，中圖）。在第17天，GFP陽性HSC的產生不再受限於某些區域，而是在整個組織培養物中變得更加顯著（d17，下圖）。
圖6示出了在造血分化期間，GFP-2A-Runx1c iPSC的表面標誌物表現模式的時程：(A) 單一陽性群體。(B) Runx1c+CD34+CD45+假定的造血幹細胞群體。實例 5 ：長期 iPSC 細胞標誌物表現測定
CD34和GFP-Runx1c隨時間的表現
使用實例1的方案，使LT-iPSC和GFP-Runx1c穩定表現的LT-iPSC分化。收穫D9的貼壁細胞以及第14、16、17、20和21天的懸浮細胞用於FACS分析。將所有用於FACS的樣本組用APC-CD34和sytox藍（賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher））進行染色。在具有陰性sytox藍染色的單細胞上閘控FACS分析。圖7示出了在第9天和第14天的HSC CD34相對於GFP-Runx1c表現。圖8示出了在第16天和第17天的HSC CD34相對於GFP-Runx1c表現。圖9示出了在第20天和第21天的HSC CD34相對於GFP-Runx1c表現。在每幅圖中，從左到右係LT-iPSC、GFP-Runx1c過表現的iPSC和兩種細胞的重疊。在第14天，GFP-Runx1c開始示出表現，並且表現隨時間增加。從第14-17天，所有GFP-Runx1c陽性細胞均為CD34+。從第20天開始，GFP-Runx1c細胞變為CD34-。
不同細胞群體隨時間的表現
藉由流動式細胞測量術（FACS）分選，純化不同HSC群體。在6孔板中，在富集的5 ml MethoCult™ H4435（來自幹細胞技術公司（STEMCELL Technologies Inc.））中，培養來自每個群體的5000個HSC（37°C，5% CO2 ）。培養21天後，收集MethoCult™中的所有細胞，並在DMEM/F12中稀釋。在1000g x 5 min下旋轉後，用P1000移液管反復滴定細胞沈澱，並且藉由ViaCell對單細胞數量進行計數。基於以上所描述的閘控策略，對來自LT-iPSC和GFP-Runx1c iPSC的HSC進行分選。在第16、17和20天，僅從LT-iPSC中分選LT:CD45+/CD34+，並且分選Runx1c: CD34+/GFP-和Runx1c: CD34+/GFP-。在第21天，分選所有六個群體用於CFU測定，如圖10中示出。圖10示出了來自LT-iPSC和GFP-Runx1c iPSC的用於CFU測定的細胞群體分選。所有來自Runx1c-GFP的HSC首先都對CD45+細胞進行閘控。所有群體代表CD45+細胞。在早期階段，GFP-Runx1c表現的HSC產生類似的或更低的總CFU細胞；然而，在第21天，在從CFU產生更多細胞方面，HSC GFP-Runx1c和CD34+雙陽性HSC更穩健（如圖11中示出）。在所有組中，CD34+對於維持CFU潛力係至關重要的。
細胞類型標誌物分析 收穫如以上所描述的在MethoCult™培養基中培養21天的HSC，在單細胞懸液中滴定，用1% BSA和FcR受體阻斷劑進行封閉，用抗體染色，並且進行FACS分析以檢查所有譜系表面標誌物的表現。圖12示出了常見原細胞標誌物的CFU圖。在第16天開始顯示強Runx1c表現的HSC在培養成CFU後保持幾種常見原細胞標誌物。隨著HSC變得更成熟，其在CD34+細胞中示出減少的Runx1c表現，來自CFU的細胞示出最少的常見原細胞標誌物。圖13示出了淋巴標誌物的CFU圖。儘管MethoCult™被設計為在體外擴增髓樣細胞，但在CFU中鑒定了小部分的淋巴譜系細胞。包括T細胞、B細胞和NK細胞。在產生淋巴譜系細胞方面，第16天的HSC示出比第21天的HSC更有效。圖14示出了骨髓標誌物的CFU圖。所有階段的HSC在CFU測定中顯示出產生骨髓譜系細胞的強大潛力。在來自CD34+ HSC細胞的CFU中鑒定了除血小板以外的所有骨髓譜系細胞。
無
[圖1]示出了FACS圖，該FACS圖示出了使用較早的方案以及實例1中示出的方案，由iPSC形成生血內皮。
[圖2]示出了在第21天，由iPSC來源的生血內皮產生HSC樣細胞。
[圖3]示出了在分化的第21天，有限稀釋測定的結果。圖3A示出當孔中載入有不同數量的細胞時，具有每種細胞類型的孔的百分比。圖3B示出了在載入不同數量的細胞後，由不同細胞類型形成的集落的數量。
[圖4]示出了用於標記造血幹細胞（HSC）的GFP-2A-Runx1c hiPSC報告基因系的產生。圖4A示出了示意圖，該示意圖示出了用來靶向Runx1c基因組座位的策略：Runx1c係用獨特的外顯子從遠端啟動子轉錄的。將指導RNA設計為特異性靶向Runx1c轉錄物的ATG起始密碼子，用於精確的基因組編輯。將GFP-2A序列在N-末端融合，從而在分化期間螢光標記Runx1c陽性造血幹細胞。將LoxP-PGK-BSD-pA-LoxP選擇盒放置在內含子1中，從而促進正確靶向的細胞群體的富集。設計PCR引物（參見表1）來擴增同源重組和GFP-2A-Runx1c連接子序列的左側連接點。圖4B示出了使用圖4A中描述的引物來篩選基因組編輯後的陽性集落。在殺稻瘟素選擇後，挑取總計48個單細胞殖株，擴增並且進行PCR基因分型分析。38個殖株在瓊脂糖凝膠上表現出陽性基因分型帶（效率 = 79%）。圖4C示出了GFP-2A-Runx1c hiPSC系的選擇的陽性殖株的圖像。
[圖5]示出了在hiPSC分化中，GFP陽性造血幹細胞的視覺化：首先將GFP-2A-Runx1c iPSC（d0，左上圖）分化成內皮（d9，右上圖），隨後誘導內皮-造血轉化（EHT），該EHT導致GFP陰性內皮層的選定區域（虛線框，「血島」）出現GFP陽性造血幹細胞（d14，中圖）。在第17天，GFP陽性HSC的產生不再受限於某些區域，而是在整個組織培養物中變得更加顯著（d17，下圖）。
[圖6]示出了在造血分化期間，GFP-2A-Runx1c iPSC的表面標誌物表現模式的時程：(A) 單一陽性群體。(B) Runx1c+CD34+CD45+假定的造血幹細胞群體。
[圖7]示出了在第9天和第14天的HSC CD34相對於GFP-Runx1c表現。
[圖8]示出了在第16天和第17天的HSC CD34相對於GFP-Runx1c表現。
[圖9]示出了在第20天和第21天的HSC CD34相對於GFP-Runx1c表現。
[圖10]示出了來自LT-iPSC和GFP-Runx1c iPSC的用於CFU測定的細胞群體分選。
[圖11]示出了在第16、17、20、和21天的CFU總細胞計數。
[圖12]示出了在第16、17、20、和21天的常見原細胞標誌物的CFU圖。
[圖13]示出了在第16、17、20、和21天的淋巴原細胞標誌物的CFU圖。
[圖14]示出了在第16、17、20、和21天的骨髓原細胞標誌物的CFU圖。
無
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003

Claims (27)

  1. 一種產生造血前驅細胞之方法，該方法包括以下步驟： a) 獲得多能幹細胞群體； b) 在第0天，在第一缺氧條件下，在補充的無血清分化（SFD）培養基中，培養該等細胞； c) 在第二缺氧條件下，在StemPro-34培養基中培養該等細胞； d) 在非缺氧條件下，在StemPro-34培養基中培養該等細胞；以及 e) 在非缺氧擴增條件下，在StemPro-34培養基中培養該等細胞；以及 f) 收集造血前驅細胞群體。
  2. 如請求項1之方法，其中該等多能幹細胞係人多能幹細胞。
  3. 如請求項1之方法，其中向該補充的SFD培養基補充以下中的一種或多種：BMP4、bFGF、Y-27632、CHIR99021、和SB-431542，添加至該SFD培養基中。
  4. 如請求項3之方法，其中該BMP4的濃度範圍為5-25 ng/ml，並且在第0、1、和2天添加至該培養基；該bFGF的濃度範圍為20-50 ng/ml，並且在第0、1、和2天添加至該培養基；該Y-27632的濃度範圍為5 μM-20 μM，並且在第0天添加至該培養基；該CHIR99021的濃度範圍為5 μM-20 μM，並且在第1和2天添加至該培養基；及該SB-431542的濃度範圍為0.1-20 μM，並且在第2天添加至該培養基。
  5. 如請求項4之方法，其中該BMP4的濃度為10 ng/ml，並且在第0、1、和2天添加至該培養基；該bFGF的濃度為25 ng/ml，並且在第0、1、和2天添加至該培養基；該Y-27632的濃度為10 μM，並且在第0天添加至該培養基；該CHIR99021的濃度範圍為5 μM-20 μM，並且在第1和2天添加至該培養基；及該SB-431542的濃度範圍為0.1-20 μM，並且在第2天添加至該培養基。
  6. 如請求項1之方法，其中在第二缺氧條件下，向該StemPro-34培養基補充以下中的一種或多種： bFGF、HSC混合物、SB-431542、和VEGF，在第二缺氧條件下，添加至該StemPro-34培養基。
  7. 如請求項6之方法，其中該bFGF的濃度範圍為20-50 ng/ml，並且在第3天直到第14天添加至該培養基；該HSC混合物包含50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO，並且在第6天直到第21天添加至該培養基；該SB-431542的濃度範圍為0.1-20 μM，並且在第3天至第9天添加至該培養基；及該VEGF的濃度範圍為20-50 ng/ml，並且在第3天至第14天添加至該培養基。
  8. 如請求項7之方法，其中該bFGF的濃度為12.5 ng/ml，並且在第3天至第9天添加至該培養基；該HSC混合物包含50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO，並且在第6天至第9天添加至該培養基；該SB-431542的濃度為6 μM，並且在第3天添加至該培養基；及該VEGF的濃度為25 ng/ml，並且在第3天至第9天添加至該培養基。
  9. 如請求項1之方法，其中在非缺氧條件下，向該StemPro-34培養基補充以下中的一種或多種： bFGF、HSC混合物、VEGF、和EHT混合物，在非缺氧條件下，添加至該StemPro-34培養基。
  10. 如請求項9之方法，其中該bFGF的濃度範圍為10-25 ng/ml，並且在第3天直到第14天添加至該培養基；該HSC混合物包含50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO，並且在第6天直到第21天添加至該培養基；該VEGF的濃度範圍為20-50 ng/ml，並且在第3天至第14天添加至該培養基；並且該EHT混合物包含BMP4、SHH、血管張力素II、和氯沙坦鉀(Losartan potassium)，並且在第9天至第14天添加至該培養基。
  11. 如請求項10之方法，其中該bFGF的濃度為12.5 ng/ml，並且在第9天至第14天添加至該培養基；該HSC混合物包含50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO，並且在第6天添加至該培養基直到第21天；該VEGF的濃度為12.5 ng/ml，並且在第9天至第14天添加至該培養基；並且該EHT混合物包含BMP4、SHH、血管張力素II、和氯沙坦鉀，並且在第9天至第14天添加至該培養基。
  12. 如請求項1之方法，其中在非缺氧擴增條件下，向該StemPro-34培養基補充在非缺氧擴增條件下添加至該StemPro-34培養基的HSC混合物。
  13. 如請求項12之方法，其中該HSC混合物包含50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO。
  14. 如請求項1之方法，其中該第一缺氧條件含有小於10%的O2 濃度。
  15. 如請求項1之方法，其中該第二缺氧條件含有小於10%的O2 濃度。
  16. 一種由多能幹細胞或體細胞的轉分化產生造血前驅細胞之方法，該方法包括在用來產生可以分化成不同造血譜系細胞的造血前驅細胞的條件下，培養該多能幹細胞或體細胞，該方法包括以下步驟：(a) 獲得多能幹細胞群體，(b) 藉由以下來誘導造血分化：在第0天，在SFD培養基、10 uM Y-27632、10 ng/ml BMP4和25 ng/ml bFGF中培養；用SFD培養基、10 ng/ml BMP4、5 ng/ml bFGF、和8 uM CHIR99021培養1-2天；用StemPro34培養基、12.5 ng/ml bFGF、和25 ng/ml VEGF培養1天；用StemPro34培養基、12.5 ng/ml bFGF、和25 ng/ml VEGF培養1-2天；用StemPro34培養基、12.5 ng/ml bFGF、25 ng/ml VEGF、50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO培養2-4天；用StemPro34培養基、12.5 ng/ml bFGF、12.5 ng/ml VEGF、50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、2 U/ml EPO、10 ng/ml BMP4、10 ng/ml SHH、10 ug/ml血管張力素II、和100 uM氯沙坦鉀培養3-5天，每天更換一次；用StemPro34培養基、50 ng/ml SCF、25 ng/ml IL-6、25 ng/ml IL-3、25 ng/ml FLT3L、25 ng/ml IGF-1、5 ng/ml IL-11、和2 U/ml EPO培養5-10天，每3天更換一次。
  17. 如請求項16之方法，其中含有StemPro34培養基、12.5 ng/ml bFGF、和25 ng/ml VEGF的該培養基進一步包含6 uM SB 431542。
  18. 如請求項16之方法，其中該第2、3、4、或5天的培養基進一步包含6 μm SB 431542（TOCRIS公司）。
  19. 如請求項1之方法，其中該多能幹細胞能夠歸巢到骨髓中。
  20. 如請求項19之方法，其中該造血前驅細胞表現CXCR4。
  21. 如請求項1之方法，其中該造血前驅細胞係CD34+、CD45+、CD90+、或THY1+。
  22. 如請求項1之方法，其中該造血前驅細胞係CD38-、Lin-、CD43-、或CD73-。
  23. 如請求項1之方法，其中該造血前驅細胞係CD45+、CD34+、CD90+、CD38-、和Lin-。
  24. 如請求項1之方法，其中該造血前驅細胞係CD90+。
  25. 如請求項1之方法，其中該造血前驅細胞表現runx1c。
  26. 一種使用如請求項1至25中任一項之方法產生的造血前驅細胞。
  27. 如請求項26之造血前驅細胞，其中所述細胞能夠進行長期骨髓移植。
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