WO2013175759A1

WO2013175759A1 - ヒト単核球由来の新規血管再生細胞群及びその分化誘導法

Info

Publication number: WO2013175759A1
Application number: PCT/JP2013/003200
Authority: WO
Inventors: 高後　裕; 蘆田　知史; 裕輔水上; 順平笹島; 祥晃杉山; 河本　徹
Original assignee: 国立大学法人旭川医科大学
Priority date: 2012-05-22
Filing date: 2013-05-20
Publication date: 2013-11-28
Also published as: JP2015154715A

Abstract

　本発明は、新生血管の安定化と成熟化を促進し、虚血や組織修復をもたらす細胞を単核球から安全かつ簡便に分化誘導する手法、ならびにかかる方法により得られる細胞群に関する。本発明の細胞は、単核球細胞群を、VEGF、bFGFおよび臨床使用可能なcMpl作動薬を含む培地（特に、無血清培地）を用いて培養することにより分化誘導し、CD11bを発現している細胞群を回収することにより調整することができる。

Description

ヒト単核球由来の新規血管再生細胞群及びその分化誘導法

　本発明は、ヒト単核球細胞群に由来する新規血管再生細胞群とその分化誘導法に関する。より詳しくは、新生血管の安定化と成熟化を促進し、虚血や組織修復をもたらす単核球由来の新規な血管再生細胞群と、その安全かつ簡便な分化誘導方法に関する。

　動脈硬化に伴う様々なヒト虚血性疾患の治療において自家骨髄細胞（単核球）の局所ないし経静脈的な移植による血管再生治療が先端医療として行われている。現状では、多くの場合CD34陽性細胞やCD133陽性細胞などの造血幹細胞を含む分画が虚血改善効果を担うと考えられているため（特許文献１参照）、これらの表面抗原を有する細胞の純化による治療成績の向上が期待されている。骨髄や臍帯血は未分化細胞を比較的多数含み、前述した細胞の供給源となりうるが、末梢血に含まれるCD34陽性細胞やCD133陽性細胞は極めて少ない。そのため、末梢血を用いる場合には、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）等による骨髄前駆細胞の多量動員が一般に行われるが、それでも一定の治療効果を得るのに必要な細胞数を回収することが困難な場合もある。

　動脈硬化や糖尿病等の基礎疾患を有する患者や高齢者の場合、骨髄採取が困難なことに加えて、細胞の機能そのものが低下していることが懸念される（非特許文献１及び２参照）。新たな試みとして、臍帯血に含まれる前駆細胞をex　vivoで細胞増幅して用いる方法も報告されている（特許文献２参照）。また、将来的には、胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）を、このような未分化細胞（幹細胞）のソースとして利用することも期待されている。しかしながら、現実化への道のりはまだ遠い。

　希少な（造血）幹細胞を血管再生治療のソースとする方法に対し、骨髄あるいは末梢血に含まれる単核球を分化誘導して得られる血管内皮前駆細胞（endothelial progenitor cell;　EPC）の利用を示唆する報告もある（非特許文献３参照）。この報告では、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）をはじめとするサイトカインを含み、血管内皮細胞の培養に最適化されたEBM2（Lonza Cologne Gmbh社　United States）等の培地を用いて単核球を培養し、付着細胞あるいは浮遊細胞として回収される細胞をEPCと称している。

　マウスの末梢血あるいは骨髄単核球を、ラットvitronectin処理した培養皿で10　% ウシ胎児血清（Fetal　bovine serum; FBS）を添加したEGM2-MV培地（Lonza　Cologne Gmbh社　United　States）にて分化誘導培養して得られる付着細胞は、アセチル化低密度リポタンパク質（acetylated　LDL）を取り込み、レクチン（lectin）に親和性を示す。この付着細胞には、紡錘形の形態を呈する細胞と類円形の形態を呈する細胞が混在している。培養開始１週間以内では前者の割合が多いが、より長期間培養すると後者に由来すると推察される敷石状の形態を呈する細胞が密に増殖してくる。すなわち、上記した方法で得られる付着細胞は異なる細胞群を含み、EPCは後者の分画に含まれると考えるのが妥当である。しかしながら、敷石状のコロニー形成から継代可能な細胞が出現する頻度は極めて低く、分化誘導培養の初期段階で多く見られる紡錘形の細胞は膨化・伸展し、その生存率は著しく低下する。

　マウス単核球を１週間程度の短期間培養して得られる細胞を、心筋あるいは下肢が虚血状態に陥ったマウスなどの小動物に移植（局所ならびに全身投与）すると、虚血の改善が得られることが知られている。すなわち、単核球から分化誘導された細胞（群）は血管新生を促進する効果を有することが知られている。一方で、単核球から分化誘導された細胞は、腫瘍（がん）組織の低酸素領域の縮小効果（特許文献３参照）や、肝線維化の抑制効果（特許文献４参照）などを有することも知られている。しかしながら、これらの細胞は、必ずしも細胞膜上にCD34及びVEGF受容体2（VEGFR2/Flk-1/KDR）などのEPCマーカーと呼ばれる抗原（非特許文献４参照）を発現していない。これらは造血幹細胞の分化過程に伴い幹細胞抗原を失ったものか、あるいは当初より幹細胞抗原を発現しない非造血幹細胞に由来する細胞群なのかは不明である。

　同様に、ヒト末梢血単核球をヒトフィブロネクチン処理した培養皿で10% FBSを添加したEGM2-MV培地にて分化誘導培養して得た付着細胞は、１週間程度の培養期間においては類円形から紡錘形の形態を良く維持し、HUVECなどのヒト血管内皮細胞の管腔形成を促進する能力を有し（非特許文献５参照）、ヌードマウスの下肢虚血に伴う壊死を抑制することが報告されている（非特許文献６参照）。同様の分化誘導処理を施したヒト末梢血単核球を自家移植することで、心筋梗塞後の心機能が改善したことを示す臨床試験成績も報告されており、移植された細胞はFlk-1、CD31、CD105、VE-cadherin等の表面抗原を発現するEPCと定義されている（非特許文献７参照）。しかしながら、培養期間が３日間と短いことから、造血幹細胞が大量に増幅された可能性はむしろ少ないと考えるのが妥当であり、同時に存在する他の細胞である可能性が否定できない。

　単核球の長期間の分化誘導培養によって、効率よく目的とする細胞が得られるか、またこれらの細胞機能と細胞の品質が良好に保たれるかについては明らかにされていない。分化誘導に際して、低酸素環境がEPCの未分化性の保持（非特許文献８参照）、抗酸化作用等（非特許文献９参照）が知られているが、これまでの報告の大部分はFBSを含有するEGM2-MV培地を用いているため、そのまま臨床応用（ヒトへの投与）することはできない。

　単核球をソースとして血管内皮細胞への分化能を有するEPCを分化誘導することは、CD34あるいはCD113陽性の造血幹細胞による血管再生治療の代替方法として期待される。しかしながら、単核球から分化誘導される細胞（群）には非付着細胞（群）と付着細胞（群）からなるヘテロな群で、血管再生治療に好適なEPCと称されてきた細胞（群）が、どの細胞（群）にあたるか、またその細胞（群）を効率的に分化誘導する臨床応用可能な手法は未だ確立されていない。

　CD11bは、主として単球及びリンパ球に発現している血球分化抗原のひとつである。CD11b陽性細胞にはマクロファージや樹状細胞、natural killer細胞（NK細胞）等のように免疫監視機構を担う細胞やリンパ球の一部も含まれる。一方で、がん等において見られる異常な血管新生の起きている局所では、CD11b抗原とともにVE-cadherin、VEGF受容体１（VEGFR1）、SDF-1受容体（CXCR4）、angiopoietin-1受容体（Tie-2）などの血管新生因子に対する受容体の発現がみられる細胞が間質に誘導されていることが知られている。すなわち、これらのマーカーを発現している非幹細胞が血管新生促進効果を有する細胞に分化するなど、血管新生において重要な役割を担っている可能性が示唆されている（非特許文献１０参照）。

　一方で、CD11b陽性細胞のなかには比較的未分化な分画も存在する。骨髄中のCD11b陽性細胞の一部は血管内皮細胞増殖因子（vascular　endothelial growth factor;　VEGF）や血小板由来成長因子（platelet-derived　growth　factor; PDGF）などの血管新生因子の存在下では、CD31抗原陽性の血管内皮細胞あるいはsmooth　muscle　actin（SMA）抗原陽性の壁細胞へと分化することが可能であることが報告されている（非特許文献１１参照）。また、ES細胞の分化誘導によって得られたvascular　progenitor　cell; VPC（非特許文献１２参照）などの比較的幼弱な細胞は、これらと同様の性質を有すると考えられ、その最終的な分化方向は環境に依存する可能性がある。

　以上の事実は、CD11b陽性細胞の一部が直接的に新生血管の構成要素となる、あるいはサイトカイン産生等を介して間接的に血管新生の促進、あるいは新生血管の安定化に関わっている可能性を示唆する。しかし、単核球に比較的多く含まれるCD11b等の単球系分化マーカーを発現する非造血幹細胞をソースとして、血管再生、血管修復、血管安定化などの働きのある細胞を分化誘導するための、ウシ胎児血清（FBS、FCS）等の動物由来の試料を含まない分化誘導システムは確立されていない。また、前述したCD11bを発現する細胞は、腫瘍（がん）を有する生体内において腫瘍血管において内皮細胞へと分化する場合（非特許文献１３参照）と、血管内皮細胞には分化せずに血管周囲に存在する場合（たとえば、Tie2などを共発現するCD11b陽性細胞；非特許文献１４参照）があり、その特性や役割を厳密に区別して考えることは便宜上難しい（非特許文献１５参照）。すなわち、CD11b発現単核球を分化誘導して得られる細胞が最終的に直接血管内皮細胞へ分化する機能を有しているか間接的に血管新生の促進あるいは安定化にかかわっているかは明らかではない。

　本発明者らは先に、この単核球の分化培養法で誘導される血管新生誘導能を有した細胞は単球/マクロファージ系の細胞であり、各種分化・増殖刺激因子、特にヒト組み替え型トロンボポイエチン（trombopoietin；TPO）を添加すると効果的に血管新生誘導性単球の分化・増殖を誘導できることを見いだした（特許文献５）。しかしながらヒト組み替え型TPOは臨床使用が許可されていない薬剤であるため、ヒト組み替え型TPOに代わる有効な誘導剤を用いた培養法が求められている。さらに、従来の培養法ではフィブロネクチンコートが必要であったが、一般に用いられているフィブロネクチンは動物由来製品であり、感染の危険性などから臨床応用にはあまり適していない。またヒト由来フィブロネクチンもあるものの感染因子の完全な除外にはいたっていない。

特表2001-503427号 WO2006/90882 WO2008/142862 特開2008-266220号 WO2010/116665

Ii　M,　et　al: Circ Res　98;697-704, 2006 Chang EI,　et　al: Circulation　116;　2818-2829,　2007 Gulati　R,　et　al: Circ Res　93;1023-1025, 2003 Asahara T, et al:　Science275; 964-967, 1997 Yamazaki　M,　et　al: Cancer Sci　99;1131,　2008 Kalka C, et al:　PNAS　97; 3422-7,　2000 Assmus　B,　et　al: Circulation　106;　3009-3017,　2002 第104回日本内科学会講演会シンポジウム　3．細胞療法の可能性と限界　３）血管再生療法の現状と展望．日本内科学会雑誌　Vol.　96, No.　9,　pp29-136, 2007 Kubo　M,　et　al: Am J　Physiolheat Circ Physiol　294;　H590-5, 2008 Kerbel　RS. N　Engl　J Med　358;　2039-49,　2008 Yamada　T,　Takakura　N.　JEM 203;1055-65, 2006 Yurugi-Kobayashi　T,　et　al: Blood　101;　2675-2678,　2003 Yang　L,　et　al: Cancer Cell 6; 409-421, 2004 De　Plama M, et al.:Cancer Cell 8; 211-226, 2005 Rehman　J,　et　al.:　Circulation 107; 1164-169,　2003

　本発明の課題は、量的に限られたCD34陽性あるいはCD133陽性の造血幹細胞に代えて、新生血管の安定化と成熟化を促進し、虚血や組織修復をもたらす細胞を単核球から安全かつ簡便に分化誘導するために、TPOに代わる臨床使用可能な誘導剤を見いだして、血管再生治療の新たな手段を提供することと、フィブロネクチンコートが不要な培養法を提供することである。

　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ロミプレート（Romiplostim）に代表される臨床使用可能なcMpl作動薬（TPO受容体作動薬）を用いることにより、TPOおよびフィブロネクチンを使用せずに、CD11b、CD31、CD14及びCXCR4を発現し、かつより強力な血管新生誘導能を有する単球を得ることが出来る新規培養法を確立した。

　本発明の方法により得られた細胞は、血管内皮細胞には直接分化しないが、新生血管の安定化と成熟化を促進することで、血管再生を促し虚血や組織修復をもたらした。すなわち、下肢虚血モデルマウスに対する治療実験にて、虚血領域への局所移植を行ったところ、血流の改善を認め、下肢切断を免れた。また、この細胞は、CD31、CXCR4に加えてCD11bを発現し、EPCマーカーとして知られているVE-cadherinの発現は低下しており、TPO受容体であるcMplマーカーが著名に上昇していた。以上の特徴から、単核球から分化誘導された細胞は、従来EPCと定義されている細胞とは異なる部類に属する単球系の細胞（群）であることが示唆された。

　すなわち、本発明は、単核球細胞群を、血管内皮細胞増殖因子（vascular　endothelial growth factor;　VEGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor:　bFGF）、及びロミプレート(Romiplostim)、レボレード（Revolade：Eltrombopag olamine）等に代表される臨床使用可能なcMpl作動薬を含む無血清培地を用い、かつフィブロネクチンコートなしで培養することにより分化誘導される、CD11b、CD31、CD14及びCXCR4を発現し、スフェロイド（sphere）形成能を有していることを特徴とする血管再生能を有する細胞群に関する。

　好ましくは、本発明の細胞群は半浮遊状の細胞群として得られる。

　用いられる単核球としては、末梢血、骨髄、又は臍帯血由来の単核球が挙げられる。

　培養は、低酸素条件下で行われることも好ましい。ここで、低酸素条件とは、1%～10%の酸素濃度の条件を意味する。

　本発明の細胞群は、血管再生能を有することを特徴とする。特に、本発明の細胞群は新生血管の安定化あるいは成熟化の促進を介して血管再生能を有する。

　本発明は、上記した本発明の細胞群を含む、血管再生治療用細胞製剤も提供する。本発明の細胞製剤は、虚血改善及び／又は血管成熟効果を有することを特徴とする。

　本発明はまた、上記した本発明の細胞群を含む、がんの局在診断剤も提供する。

　さらに本発明は、以下の工程を含む、血管再生能を有する細胞群の調製方法を提供する：
１）単核球細胞群を、血管内皮細胞増殖因子（vascular　endothelial
growth factor;　VEGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor:　bFGF）、およびロミプレート(Romiplostim)、レボレード（Revolade：Eltrombopag olamine）に代表される臨床使用可能なcMpl作動薬を含む培地を用いて培養する。
２）前記培養によって得られる細胞集塊からCD11bを発現している細胞群を回収する。

　上記方法において、培養は低酸素条件下で行われることも好ましい。なお、低酸素条件とは1%～10%の酸素濃度の条件を意味する。

　本発明の方法にしたがって、ロミプレート(Romiplostim)、レボレード（Revolade：Eltrombopag olamine）に代表される臨床使用可能なcMpl作動薬を添加した無血清培養系を用いることにより、臨床適用できないTPOおよびウイルス感染の潜在的危険性を有するフィブロネクチンを使用せずに、CD11b、CD31、CD14及びCXCR4を発現し、かつより強力な血管新生誘導能を有する単球を得ることができる。発明者らはTPOが血管新生誘導性単球の分化・増殖を誘導できることを見出してきたが、血小板増殖因子であるTPOがなぜ血管新生誘導性単球の分化・増殖を誘導できるかは不明であった。本発明ではcMplの発現上昇を端緒に、cMplアゴニスト作用こそが血管新生誘導能性単球の分化・誘導に必要な活性本体であることを見出し、臨床利用可能なcMpl作動薬を用いた本発明を完成するに至った。

　またTPOとロミプレートの培養液への添加量は、巨核球コロニー形成細胞を指標として行われた検討では、TPOは1～30ng/ml、ロミプレートは100～1000ng/mlと報告されているが、本発明では、TPOは30ng/mlの添加が必要であったのに対し、ロミプレートでは100ng/mlがもっとも好ましい結果を示しており、TPOに比較して添加量が少量ですむという利点を認めた。

　さらに下肢虚血モデルマウスを用いた血管新生誘導性単球の移植の評価において、TPO添加培養で得られた血管新生誘導性単球に比較してロミプレート添加培養で得られた血管新生誘導性単球の方がより強力な治療効果が認められた。すなわちTPOに比べてロミプレートはより効率的に、強力な血管新生誘導性単球を得ることが出来る。

　本発明にかかる細胞は、新生血管の安定化、成熟、保護機能を有し、成熟血管内皮細胞による管腔形成を促進するとともに、腫瘍血管をも機能的に正常化する。本発明は、末梢血から比較的容易に採取可能な単球系細胞をソースとするため、希少な（造血）幹細胞をソースとする従来の血管再生治療の代替方法として有用である。また、本発明にかかる細胞は、動物血清を使用せず、かつフィブロネクチンを必要としない条件下で単球系細胞から分化誘導されるため、感染の危険がなく、臨床応用可能な安全な細胞製剤を提供しうる。

図１は、末梢血から分離した単核球をX-VOVO 15を基本培地として、血清濃度、VEGF、bFGF濃度、フィブロネクチンコートの有無を変化させて培養し、得られた細胞像を示す。VEGFを増量することにより、bFGFを添加増量することによって、動物血清を使用せず、かつフィブロネクチンコートを必要としない培養が可能となった。図２は、ヒト末梢血単核球を50ng/mL VEGF、50ng/mL bFGFを添加したX-VIVO 15培地で4日間培養して得られた細胞のアセチル化ＬＤＬの取り込みと大腸菌由来粒子を使用した貪食能の評価を示す。大型のスフェロイドを形成する細胞はアセチル化LDLを取り込み、貪食能を有する単球であった。図３は、ヒト末梢血単核球を50ng/mL VEGF、50ng/mL bFGFを添加したX-VIVO 15培地で4日間培養して得られた細胞のフローサイトメトリーによる表面抗原解析を示す。前方散乱と側方散乱が高い大型の細胞はCD11b、CD31、CD14陽性であり、単球細胞であった。図４は、ヒト末梢血単核球を50ng/mL VEGF、50ng/mL bFGFを添加したX-VIVO 15培地で4日間培養して得られた細胞を、磁気ビーズを用いてCD11b陽性細胞のみを分離して得られた培養CD11b陽性細胞の遺伝子発現の評価を示す。ヒト末梢血単核球を培養せずに分離したCD11b陽性単核球と比較してTPO受容体であるcMplの発現が培養CD11b陽性細胞で著明に高い。図５－１は、ロミプレート添加による培養細胞像の変化を示す。50ng/ml VEGFと50ng/ml bFGFを添加したX-VIVO 15培地でロミプレートの添加量を変えて培養したところ、100ng/mlでもっともスフェロイドの大きさ・数が多い結果となった。図５－２は、ロミプレート添加による培養細胞像の変化を示す。50ng/ml VEGFと50ng/ml bFGFを添加したX-VIVO 15培地でロミプレートの添加量を変えて培養したところ、100ng/mlでもっともスフェロイドの大きさ・数が多い結果となった。図６は、培地へのロミプレート100ng/ml添加による培養CD11b陽性細胞の遺伝子発現の評価を示す。添加せずに培養した培養CD11b陽性細胞に比較し、IL-8、CXCR4、VASH2といった血管新生を促進する分子の発現の上昇が見られた。図７は、下肢虚血モデルマウスを用いた培養CD11b陽性細胞移植のロミプレート添加による虚血改善効果の評価を示す。ロミプレート100ng/mlを用いた培養法で得られた培養CD11b陽性細胞を移植した群では壊死、下肢切断を免れ、レーザードップラーによる血流評価においても血流改善効果が認められた。図８は、下肢虚血モデルマウスを用いた培養CD11b陽性細胞移植の虚血改善効果における、TPO添加培養とロミプレート添加培養との比較の結果を示す。TPO添加培養CD11b陽性細胞移植群に比較して、ロミプレート添加培養CD11b陽性細胞移植群では、壊死、下肢切断を免れ、レーザードップラーによる血流評価においても有意な血流改善効果が認められた。

　本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１２－１１６７７６号の明細書に記載された内容を包含する。

１．本発明の細胞群（Cell　Population）
　本発明の細胞群（Cell　Population）は、哺乳動物の単核球から分化誘導される、血管再生能を有するCD11b陽性の細胞集団である。

１．１　由来
　本発明の細胞群は「単核球」に由来する。「単核球」とは、結合組織、リンパ組織、血流中に広く分布する単核の間葉系細胞群で、単球やリンパ球に代表される遊走単核白血球と組織中に存在するマクロファージに代表される単核貪食系の細胞群に分類される。本発明で用いられる単核球としては、前者に属する末梢血、骨髄、又は臍帯血由来の単核球（白血球）が好ましい。特に、豊富に存在し、取得が容易である点において、末梢血由来の単核球が好ましい。

　用いられる単核球は、これを投与する患者由来のものとすることで、拒絶反応を回避した安全な再生医療用の細胞群（細胞製剤）を調製することができる。

１．２　分化誘導
　本発明の細胞群は、上記のようにして調製した単核球細胞群を、適切な「サイトカイン」を含む無血清培地を用いて分化誘導培養することにより調製される。サイトカインを添加することにより、単核球は無血清培地においても好適に増殖し、目的とする血管再生能を有する細胞へと分化誘導される。また、用いられる培地は血清を含まないため、感染等の恐れがなく、調製された細胞群（細胞製剤）は、そのまま臨床応用に供することができる。

　本発明の細胞群の分化誘導（調製）方法については、次項「２．本発明の細胞群の調製方法」において、詳細に説明する。

１．３　細胞群の形態
　本発明の細胞群は、無血清培地を用いた培養により、接着性の弱い、半浮遊（スフェロイド）状の細胞集塊として得られる。この細胞群は、再播種して血清（患者の自己血清等）存在下で培養すると接着性の強い紡錘形をした付着性細胞となる。

１．４　表面マーカー
　本発明の細胞群は、CD11bを発現していることを特徴とする。「CD11b」は、主として単球及びリンパ球に発現している血球分化抗原のひとつである。CD11b陽性細胞には、マクロファージや樹状細胞、NK細胞等のような免疫細胞やリンパ球のほか、がん等において見られる異常な新生血管の細胞、CD31抗原陽性の血管内皮細胞あるいはsmooth　muscle　actin（SMA）抗原陽性の壁細胞へと分化する比較的未分化な細胞も含まれる。これまでの報告は、CD11b発現細胞が血管新生促進効果を有する細胞に分化するなど、血管新生において重要な役割を担っている可能性は示唆するものの（前掲）、これが最終的に血管内皮細胞へと分化する場合とそうでない場合の両方がありうることを示す。なお、CD11b強陽性細胞とCD14強陽性細胞は、主として単球を含むことから、「CD14」をマーカーとして代用することは現実的に可能であり、GMPに準拠した施設で製造された磁気ビーズの結合した抗CD14抗体はCD11b陽性細胞純化に有用であることが予測される。

　本発明の細胞群は、CD11bのほか、CD31、CD14及びCXCR4を発現し、CD3/CD4陰性であり、また、cMpl発現の著名な上昇が認められる。　

　単核球細胞群や単核球細胞群に元々含まれるCD11b陽性細胞群には、in　vivoでの血管再生能力は低い。また、従来EPCと称されてきた細胞群は、単核球細胞群のCD11b陰性細胞群から分化誘導され、その表面マーカーの発現はCD45^-/CD11b^-/CD34⁺/CD133⁺/Flk-1⁺という点において、本発明の細胞群とは明らかに区別される。

１．５　血管再生能
　本発明の細胞群は、血管内皮細胞には直接分化しないが、新生血管の安定化と成熟化を促進することで、血管再生を促し虚血や組織修復をもたらす。すなわち、がんなどの虚血領域を有する生体に全身あるいは局所投与すると、新生血管の周辺に分布し、周被細胞による新生血管（微少血管）内皮細胞の裏打ちを増強すること等によって血管の安定化や成熟化を促進する。

　「血管再生能」とは、組織中にあらたな血管ができる機序を促すあるいは助ける機能を意味し、既存の血管内皮細胞が増殖・遊走し新しい血管が作られる血管新生、虚血部位の血管が再構築され（太くなり）、新生血管に血流を補給する導管を形成する側副血行路形成、骨髄由来の細胞が血流を介して虚血部位に到達し、血管内皮や周被細胞へと分化する脈管形成、そのいずれの段階における貢献をも含む。

　従来血管内皮前駆細胞（endothelial progenitor cell;　EPC）と定義される細胞は、骨髄などに由来し、最終的に血管内皮細胞への分化能を有することで血管新生を促し、血管再生治療に貢献する。これに対し、本発明の細胞群は、血管内皮細胞には直接分化しないが、新生血管の安定化と成熟化を促進することで、血管再生治療に貢献する。

２．細胞の調製方法
　本発明の細胞群は、単核球細胞群から以下の工程により調製される。
１）単核球細胞群を、血管内皮細胞増殖因子（vascular　endothelial
growth factor;　VEGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor:　bFGF）およびロミプレート(Romiplostim) に代表される臨床使用可能なcMpl作動薬を含む無血清培地を用いて培養する。
２）細胞集塊からCD11bを発現している細胞群を回収する。

２．１　単核球の調製
　各組織からの単核球の分離は、市販のキット等を用いて、周知の方法により容易に実施できる。たとえば、採取した血液を適宜希釈し、あらかじめ分離液が入った遠心管に入れ、1500rpm程度で遠心して、比重の違いにより分離する。リンパ球・単球から成る末梢血単核細胞は、血漿（黄色味を帯びる）と分離液（透明）の中間に、白い帯状の層として回収される。さらに遠心分離による血液成分分離装置を用いたアフェレーシスを行うことにより、単核球のみを安全、効率的にかつ大量に採取することができる。

２．２　培地－無血清培地
　本発明で用いられる培地は、単核球の培養に適した培地である限り、特に限定されない。標準的な培地としては、MEM培地、BME培地、DME培地、α-MEM培地、IMEM培地、ES培地、DM-160培地、Fisher培地、F12培地、WE培地、RPMI培地、StemSpan培地、StemPro培地及びこれらの混合物を挙げることができる。あるいは市販のリンパ球培養用培地：たとえばGT-T培地（タカラバイオ）、AIM V培地（インビトロジェン）、Tリンパ球培養用培養液（コスモバイオ）、X-VIVO培地（Lonza社製）、市販の血管内皮細胞用培地：たとえばEGM-2培地やEBM-2培地等を挙げることができる。

　前記培地は、特にFBS、FCS等の動物血清を含まない「無血清培地」であることが好ましい。「無血清培地」は、単核球の培養に適した培地である限り、特に限定されず、市販の無血清培地を用いてもよいし、適宜調製してもよい。本発明者らは、「無血清培地」を用いて、本発明の細胞群の簡便な分化誘導方法を確立した。動物血清を含まない無血清培地は、感染等の恐れがなく、調製された細胞群（細胞製剤）はそのまま臨床応用に供することができる。

２．３　サイトカイン
　単核球細胞群からの「分化誘導」は、適切な「サイトカイン」を、前記した無血清培地に添加して培養することにより行われる。サイトカインにより、単核球は無血清培地においても好適に増殖し、目的とする血管再生能を有する細胞へと分化誘導される。

　本発明では、血管内皮細胞増殖因子（vascular　endothelial　growth factor;　VEGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor:　bFGF）およびロミプレート(Romiplostim) に代表される臨床使用可能なcMpl動作薬を含む無血清培地を用いて培養する。

　「血管内皮細胞増殖因子（vascular　endothelial　growth factor;　VEGF）」は、脈管形成及び血管新生に関与する一群の糖タンパクである。VEGFは主に血管内皮細胞表面に存在するVEGF受容体　(VEGFR) に結合し、細胞分裂や遊走、分化を刺激したり、微小血管の血管透過性を亢進させたりするが、単球・マクロファージの活性化にも関与する。正常な体の血管新生に関わる他、腫瘍の血管形成や転移など、悪性化の過程にも関与する。本発明の方法において無血清培地に添加されるVEGFの濃度は、好ましくは1ng/mL～50ng/mL、より好ましくは50ng/mL前後である。

　脈管形成や血管新生、リンパ管新生に関与する増殖因子にはVEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-D、VEGF-E、PlGF-1、PlGF-2の7つがあり、これらをまとめて「VEGFファミリー」と呼び、VEGF-Aのみを単にVEGFと呼ぶこともある。さらにいくつかのVEGFファミリーメンバーには、いくつかの亜型も存在する。本発明で用いられる「血管内皮細胞増殖因子（vascular　endothelial growth factor;　VEGF）」には、本発明の目的と効果を損なわない限りにおいて、これらVEGFファミリーとその亜型を含む。なお、VEGFの添加は、低酸素環境での細胞調製によっても論理的に代用が可能である。

　「塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor:　bFGF）」は、ヘパリン結合分裂促進タンパク質で、強力な血管新生因子（ペプチド）として、血管新生及び動脈形成を促進する機能を有し、神経や骨の形成にも関与する。無血清培養あるいは血清量の少ない培養条件でさまざまな種類の細胞の増殖を高める効果を有することが知られている。本発明の方法において無血清培地に添加されるbFGFの濃度は、好ましくは0.1ng/mL～50ng/mL、より好ましくは50ng/mL前後である。

　「cMpl作動薬」とは、TPOレセプターであるcMplに対するアゴニストで、血小板造血刺激因子製剤とも記載される。発明者らは、このcMplアゴニスト作用が血管新生誘導能性単球の分化・誘導に必要な活性本体であることを見出した。ロミプレート(Romiplostim)は、cMpl作動薬の１つであり、cMplに結合して血小板造血を促進する遺伝子組み換えタンパク質である。ロミプレートのアミノ酸配列は内因性TPOのアミノ酸配列と相同性が無いにもかかわらず、cMplへの結合や細胞内シグナル伝達を引き起こすことができ、この特徴的な構造により、ヒト組み替え型TPOで見られた重篤な副作用（内因性TPOに対する中和抗体産生による血小板減少）を惹起しない。ヒト組み替え型TPOが抱えるこの大きな副作用を克服することにより、ロミプレートはその慢性特発性血小板減少性紫斑病の治療への使用が承認された。

　なお、そのほかのcMpl作動薬としては低分子化合物であるレボレード（Eltrombopag olamine）があるが、これは内服薬として開発され、同様に臨床使用が既に承認されている。レボレードはTPO受容体の膜貫通ドメインとの特異的な相互作用を介して、細胞内のJAK-STAT経路、MAPK 経路の活性化を通じて巨核球の増殖と分化を促進し、最終的に血小板数を増加させる。

　近い将来臨床での使用可能性がある化合物として、例えば、SB559457（http://search.engrant.com/project/MrxhBp/signaling_mechanisms_of_different_classes_of_thrombopoietin_receptor_agonists）、AKR-501（http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00441090）、NIP-004（http://bloodjournal.hematologylibrary.org/content/107/11/4300.full.pdf）が挙げられる。また、cMPl作動薬抗体（http://www.faqs.org/patents/app/20120053326#b；http://www.sec.gov/Archives/edgar/data/899866/000119312503096418/dex991.htm）についてもcMPl作動薬としての利用が期待される。さらに、特許第5104752（JP5107752B）に記載のピラゾール化合物はTPOレセプター活性化剤として有用であり、当該特許には、特開平11-1477(JPH11-1477A)及び特開平11-152276号（JPH11-152276A)記載の1,4-ベンゾジアゼピン誘導体、WO01/07423、WO01/53267、WO02/059099及びWO02/059100記載の化合物、WO00/35446、WO00/66112、WO01/34585、WO01/17349、WO01/39773、WO01/21180、WO01/89457、WO02/49413及びWO02/085343記載の化合物、特開2001-97948号（JP2001-97498A）記載の化合物、WO99/11262記載の化合物、WO2/062775及びWO03/062233記載の化合物、特開2003-238565号（JP2003-238565A）記載の化合物、WO04/033433及びWO04/108683記載の化合物もTPOレセプターに親和性を有することが報告されている。これらの化合物等もまた、本発明の臨床使用可能なcMPl作動薬に包含されうる。

　本発明の方法において無血清培地に添加されるロミプレートの濃度は、好ましくは50ng/mL～500ng/mL、より好ましくは50ng/mL～100ng/mLである。レボレードの場合は、好ましくは0.1μg/mL～100μg/mL、より好ましくは0.5μg/mL～50μg/mL程度である。

　本発明の方法では、無血清培地にさらに別のサイトカインを添加してもよい。そのようなサイトカインとしては、顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte-colony　stimulating factor;　G-CSF）、FMS-like　tyrosine　kinase　3 ligand（FLT3L）、マクロファージコロニー刺激因子（Macrophage-colony stimulating　factor; M-CSF）、hedgehogリガンド、CEACAM（癌胎児性抗原関連細胞接着因子）等を挙げることができるが、本発明の目的と効果に適合する限り、これらに限定されない。

　「顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte-colony　stimulating factor;　G-CSF）」は、顆粒球産出の促進、好中球の機能を高める作用がある。主にマクロファージより分泌され、GM-CSFの作用を経て分化がより顆粒球系に方向付けられた前駆細胞を標的とする。そのため、遺伝子組換えヒトG-CSF製剤は、がん化学療法による好中球減少症や再生不良性貧血に伴う好中球減少症に用いられている。

　「FMS-like　tyrosine　kinase　3 ligand（FLT3L）」は、チロシンキナーゼ3リガンドで、受容体型チロシンキナーゼの一種であるＦｌｔ３レセプター（CD135）を介したシグナル伝達により造血系の前駆細胞や幹細胞の増殖、分化を制御することが知られている。Ｆｌｔ３リガンドはCD34あるいはCD133陽性の造血幹細胞や樹状細胞などの単球系細胞に対して、増殖活性を有することが知られており、生体内あるいは生体外でこれらを増幅させることができる。

　本発明で用いられるVEGF、bFGF、FLT3L等のサイトカインは、天然のものであっても、組換え体であってもよい。これらサイトカインは、用いる単核球と同じ種に由来するものが好ましい。したがって、ヒトの単核球を利用する場合であれば、ヒトVEGFが好ましい。VEGFは、市販のもの（試薬あるいは医薬品）を用いてもよいし、公知の配列情報に基づいて組換え製造して用いてもよい。

　培地へのサイトカインの量は、用いる細胞に応じて適宜設定されるが、一般には1～100ng/ml程度である。

２．４　培養条件
　培養は、表面処理した培養皿等を用いて、通常リンパ球の培養に用いられる条件において行われる。すなわち、温度３７℃、酸素濃度２０％である。

　培養は、低酸素条件下で行われることが好ましい。ここで、「低酸素条件」とは、空気中の酸素含有量（約21％）を少なくとも下回る酸素濃度を意味し、具体的には、1%～10%の酸素濃度であることを意味する。低酸素条件下で培養することにより、細胞の生存率が向上し、目的とする血管再生能を有する細胞を高効率で得ることができる。

　細胞の培養は、好ましくはＧＭＰ基準の細胞調製施設「ＣＰＣ（Cell　Processing　Center）」で行う。対象へ投与する「臨床グレードの細胞」の調製は、無菌状態で細胞を操作すべく特別に設計された施設、より具体的には、空調制御、室圧制御、温湿度制御、パーティクルカウンター、ＨＥＰＡフィルターなどにより清潔度が担保されたＣＰＣで行うことが好ましい。また、ＣＰＣ施設自体のみならず、ＣＰＣ内で使用する全ての機器は、バリデーションにより性能が保障され、その機能を、随時モニタリング・記録することが好ましく、ＣＰＣでの細胞処理操作は、全て「標準手順書」によって厳格に管理・記録することが望ましい。

２．５　CD11b陽性細胞の分離
　無血清培地を用いた培養により、接着性の弱い、半浮遊（スフェロイド）状の細胞集塊として得られる。この細胞集塊からCD11bを発現している細胞を回収する。CD11bを発現している細胞の回収は、常法にしたがいCD11b抗体を用いて容易に実施できる。たとえば、CD11b抗体で標識された磁気ビーズ、蛍光標識されたCD11b抗体を用いたセルソーターによる分離、あるいはCD11b抗体を固相化したカラムなどを用いて、CD11b陽性細胞を分離すればよい。CD11b抗体は、市販のものを利用してもよいし、常法にしたがいCD11bあるいはその部分ペプチドを用いて作製してもよい。なお、CD11b強陽性細胞とCD14強陽性細胞は、主として単球を含むことから、「CD14」をマーカーとして代用することは現実的に可能であり、GMPに準拠した施設で製造された磁気ビーズの結合した抗CD14抗体はCD11b陽性細胞純化に有用であることが予測される。

３．細胞製剤
３．１　血管再生治療用細胞製剤
　本発明の細胞群は、血管内皮細胞には直接分化しないが、新生血管の安定化と成熟化を促進することで、血管再生を促し虚血や組織修復をもたらす。

　それゆえ、本発明の細胞群は、がんなどの虚血領域を有する患者に投与することで、血管の安定化や成熟化を促進する「血管再生治療用細胞製剤」として利用できる。本発明の細胞製剤は、それ自身が血管内皮細胞に直接分化するのではなく、新生血管の安定化あるいは成熟化の促進を介して血管再生能を発揮するという点で、EPCを用いた従来の血管再生治療用細胞製剤とは明確に区別される。

　本発明の細胞製剤の投与方法は特に限定されず、適用部位に応じて、外科的手段による局所移植、静脈内投与、腰椎穿刺投与、局所注入投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、脳内投与、脳室内投与、又は静脈投与などが考えられる。とくに、がんをはじめとする虚血部位への投与方法としては、局所投与あるいは経静脈投与が好ましい。

　がん等において見られる異常な血管新生の起きている局所では、CD11b抗原とともにVE-cadherin、VEGF受容体１（VEGFR1）、SDF-1受容体（CXCR4）、angiopoietin-1受容体（Tie-2）などの血管新生因子に対する受容体の発現がみられる細胞が間質に誘導されていることが知られている（前掲）。本発明の細胞群は、腫瘍組織や虚血領域への選択的指向性があり、経静脈的あるいは局所投与することで、腫瘍に局在し、腫瘍血管の有する構造的・機能的な血管を修復する可能性がある。

　高血圧や糖尿病、高脂血症などで生活習慣病を有する患者、あるいは高齢の患者の末梢血から得た単核球の有する血管新生能は障害を受けている可能性がある。このような様々な合併症を有する患者においても、その末梢血から得た単核球を用いて本発明の細胞製剤を調製することで、自己の細胞を用いた再生治療が可能となる。

　本発明の細胞製剤は、細胞の維持・増殖、患部への投与を補助する足場材料や成分、他の医薬的に許容しうる担体を含んでいてもよい。

　細胞の維持・増殖に必要な成分としては、炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラル、塩類、各種サイトカイン等の培地成分、あるいはマトリゲル^TM等の細胞外マトリックス調製品、が挙げられる。

　患部への投与を補助する足場材料や成分としては、生分解性ポリマー；例えば、コラーゲン、ポリ乳酸、ヒアルロン酸、セルロース、及びこれらの誘導体、ならびにその２種以上からなる複合体、注射用水溶液；例えば生理食塩水、培地、ＰＢＳなどの生理緩衝液、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液（例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム）等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０等と併用してもよいが挙げられる。

　その他、必要に応じて、医薬的に許容される有機溶剤、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤等を含んでいてもよい。

　実際の添加物は、本発明の治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、これらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばTween80、Tween20、ゼラチン等を加えたものを使用することができる。

　本発明の細胞製剤の対象となりうる疾患としては、例えば、床ずれ・皮膚潰瘍、手術瘢痕、難治性消化性潰瘍を含む創傷、潰瘍性大腸炎、クローン病などの慢性炎症性腸疾患を含む炎症性疾患、重症四肢虚血、心筋梗塞・狭心症・心不全を含む虚血性心疾患、脳梗塞、糖尿病性ニューロパチー、重症虚血を伴うがん等、血管再生を必要とするあらゆる疾患が含まれる。とくに、通常の医薬では治療が困難な、重症慢性下肢虚血（閉塞性動脈硬化症、バージャー病）、治療不応性虚血性心疾患、重症虚血を伴うがん、網膜症を含めた糖尿病性血管障害等が対象疾患として好ましい。

３．２　がんの局在診断剤
　本発明の細胞群は腫瘍組織や虚血領域への選択的指向性を有する。それゆえ、本発明の細胞群をナノ粒子等で標識すれば、虚血、転移巣を含むがんの局在をみる画像診断に応用することができる。細胞の標識は、常法にしたがい、磁性体や蛍光色素等で標識することにより簡単に行うことができる。

３．３　その他
　本発明の細胞群は腫瘍組織への選択的指向性があるため、抗がん剤や腫瘍細胞に対して細胞障害性を有するタンパク質や薬剤などのキャリアーとして利用できる可能性がある。

　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１－１
　健常ボランティアから得た末梢血30mLにEDTAを含有したDPBS(DPBS-E)20ｍLを添加して、20℃、400×g で　35分間遠心し、バフィーコートを回収して20mLのDPBS-Eに再懸濁した後に、Histopaque　1077（Sigma社製）を用いて密度勾配遠心分離（４００ｇ、２０分間、室温）した後、中間に層状になった細胞をピペットにより採取して、単核球を分離した。この単核球をX-VIVO 15培地を基本培地とし、添加する自家血清、VEGF、bFGFの量、フィブロネクチンコートの有無を変えて培養し、得られる培養細胞を観察した（図１）。

　自家血清20%、1ng/mlVEGFを添加し、フィブロネクチンコートされたプレートで4日間培養したところ、大型の紡錘形細胞と小型球形細胞の少なくとも2種類の細胞が混在する培養細胞が観察された。VEGF濃度を変えず、血清を減らしたところ、細胞数が著明に減少した。血清を代償するためにVEGF添加量を10ng/mlに増加したところ、培養細胞数は増加したものの、無血清状態では極めて少なく、不十分であった。そこで10ng/mlのbFGFを加えたところ、フィブロネクチンコートをしなくても培養可能となり、大型の紡錘形細胞からなるスフェロイドの形成を認めた。しかしながら無血清状態ではまだ得られる培養細胞の数は十分とはいえず、さらにVEGF、bFGFをそれぞれ50ng/mlに増量して培養したところ、20%自家血清・1ng/mlVEGFを添加したものと同程度の培養細胞を得ることができ、無血清化が達成できた。

実施例１－２
　50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF添加X-VIVO 15培地を用いてフィブロネクチンコートを行わずに4日間培養する無血清培養法で得られた培養細胞のアセチル化LDLの取り込みと大腸菌由来蛍光粒子を用いた貪食能の評価を行った（図２）。培養細胞のうち、スフェロイドを形成する大型紡錘形細胞のみがアセチル化LDLを取り込み（80.6%）、大腸菌由来蛍光粒子の貪食(78.3%)を示した。

実施例１－３
　50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF添加X-VIVO 15培地を用いてフィブロネクチンコートを行わずに4日間培養する無血清培養法で得られた培養細胞の表面抗原マーカーをフローサイトメトリーにて解析した（図３）。得られた細胞は複数の分画を有しており（A）、前方散乱と側方散乱からスフェロイドを形成する大型の細胞分画にゲートをかけたところ(B)、CD11b/CD31/CD14陽性であり、CD3/CD4が陰性であることから、単球であると考えられた。

実施例１－４
　スフェロイドを形成する培養細胞は単球であり、単球細胞に焦点を絞ってその遺伝子発現の解析を行った（図４）。50ng/ml　VEGF、50ng/ml bFGF添加X-VIVO　15培地を用いてフィブロネクチンコートを行わずに4日間培養する無血清培養法で得られた培養細胞を、磁気ビーズを用いてCD11b陽性細胞のみを分離し、RT-PCRを行った。未培養ですぐに分離したCD11b陽性単核球と比較して、EPCマーカーといわれているVE-cadherinの発現は低下しており、TPO受容体であるcMplの発現が著明に上昇していた。

実施例２
　cMpl発現が上昇していることから、ヒト組み替え型TPO以外の臨床使用可能なcMpl 作動薬の添加により、より効率的かつ安全に強い血管新生能を有する単球/マクロファージ系培養細胞を得ることができると考えた。実施例１と同様にして得られたヒト末梢血単核球を、代表的な臨床使用可能なcMplアゴニストであるロミプレートを、濃度を変えて添加した50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF添加X-VIVO 15培地で培養し、培養細胞の変化を観察した（図５－１）。添加量の増加により、スフェロイドの増加を認めたが、100ng/mlを超えて1000ng/mlにすると逆にスフェロイドが減少した（A）。またスフェロイドの数、大きさを評価したところ（B）同様に100ng/mlで最大に達し、1000ng/mlではかえって減少する結果となった。さらに詳細にロミプレート添加量を50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/mlと変えて検討したところ（図５－２A，B）、50ng/mlと100ng/mlがもっともスフェロイドの数、大きさが最大となり、好ましい結果となった。

実施例３
　ロミプレート添加によって得られる培養単球の血管新生を促進する可能性がある遺伝子の発現評価を行った（図６）。実施例１と同様にして得られたヒト末梢血単核球を、50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF添加X-VIVO 15培地に代表的な臨床使用可能なcMplアゴニストであるロミプレート100ng/mlを添加して得られた培養CD11b陽性細胞は、ロミプレートを添加していない培養CD11b陽性細胞に比べて、血管新生を促進する可能性のあるIL-8、VASH2、CXCR4の発現の亢進が認められた。

実施例４
　BALB/cヌードマウスの大腿動静脈を結紮し、作成した下肢虚血マウスモデルを用いて、(i)対照群（PBS局注）、(ii)未培養CD11b+単核球移植群、(iii)ロミプレート無添加培養CD11b+単球移植群、(iv)ロミプレート100ng/ml添加培養CD11b+単球移植群、(v)ロミプレート1000ng/ml添加培養CD11b+単球移植群の5群に分け、それらの移植効果を評価した。下肢壊死または下肢切断に陥ったマウスは(i)群85.7％、(ii)群75.0％、(iii)群100％、(iv)群25％、(v)群40%であり（図７Ａ）、レーザードプラー法による血流評価では臨床応用可能なcMplアゴニストであるロミプレート100ng/mlを添加した(iv)群で虚血の改善傾向が認められた（図７Ｂ）。

実施例５
　BALB/cヌードマウスの大腿動静脈を結紮し、作成した下肢虚血マウスモデルを用いて、(i)TPO 30ng/ml添加培養CD11b+単球移植群と(ii)ロミプレート100ng/ml添加培養CD11b+単球移植群の２群の移植効果を評価した。下肢壊死または下肢切断に陥ったマウスは(i)60％、(ii)25%であり（図８Ａ）、レーザードップラー法による血流評価ではTPO添加群に比べて臨床応用可能なcMplアゴニストであるロミプレート添加群のほうが良好な虚血改善効果が認められた（図８Ｂ）。

　本発明にかかる細胞群は、患者の末梢血から比較的容易に採取可能な単核球をソースとして、動物由来材料を使用しない条件下で分化誘導される。また、重篤な副作用の知られているTPOではなく、臨床使用可能なcMpl作動薬を用いている。したがって、本発明にかかる細胞群は、感染の危険がなく、臨床応用可能な安全な細胞製剤として有用である。また本発明は、希少な（造血）幹細胞を利用した従来の血管再生治療の代替方法として有用である。

　本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

Claims

　以下の工程を含む、血管再生能を有する細胞群の調製方法：
１）単核球細胞群を、VEGF、bFGFおよび臨床使用可能なcMpl作動薬を含む無血清培地を用いて培養する。
２）前記培養によって得られる細胞集塊からCD11bを発現している細胞群を回収する。
臨床使用可能なcMpl作動薬が、ロミプレートまたはレボレードであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
　CD11bを発現している細胞群が浮遊状の細胞群として得られることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
　単核球が末梢血、骨髄、又は臍帯血由来であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
　培養が低酸素条件下で行われることを特徴とする、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
　低酸素条件が1%～10%の酸素濃度の条件であることを特徴とする、請求項５記載の方法。
　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で得られる、血管再生能を有するCD11b、CD31及びCXCR4陽性細胞群。
　cMpl発現が増大していることを特徴とする、請求項７記載の細胞群。
　新生血管の安定化あるいは成熟化の促進を介して血管再生能を有することを特徴とする、請求項７又は８に記載の細胞群。
　請求項７～９のいずれか１項に記載の細胞群を含む、血管再生治療用細胞製剤。
　虚血改善及び／又は血管成熟効果を有することを特徴とする、請求項１０記載の細胞製剤。
　請求項７～９のいずれか１項に記載の細胞群を含む、がんの局在診断剤。