JP5725509B2

JP5725509B2 - 単核球由来の新規血管再生細胞群及びその分化誘導法

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Publication number: JP5725509B2
Application number: JP2011508224A
Authority: JP
Inventors: 裕輔水上; 順平笹島; 祥晃杉山; 佐藤　一也; 一也佐藤; 高後　裕; 裕高後
Original assignee: Asahikawa Medical University
Current assignee: Asahikawa Medical University
Priority date: 2009-04-07
Filing date: 2010-03-29
Publication date: 2015-05-27
Anticipated expiration: 2030-03-29
Also published as: WO2010116665A1; US20120100610A1; EP2418272A1; US8951795B2; EP2418272A4; JPWO2010116665A1

Description

本発明は、単核球細胞群に由来する新規血管再生細胞群とその分化誘導法に関する。より詳しくは、新生血管の安定化と成熟化を促進し、虚血や組織修復をもたらす単核球由来の新規な血管再生細胞群と、その安全かつ簡便な分化誘導方法に関する。

動脈硬化に伴う様々な虚血性疾患の治療において自家骨髄細胞（単核球）の局所ないし経静脈的な移植による血管再生治療が先端医療として行われている。現状では、多くの場合CD34陽性細胞やCD133陽性細胞などの造血幹細胞を含む分画が虚血改善効果を担うと考えられているため（特許文献１参照）、これらの表面抗原を有する細胞の純化による治療成績の向上が期待されている。骨髄や臍帯血は未分化細胞を比較的多数含み、前述した細胞の供給源となりうるが、末梢血に含まれるCD34陽性細胞やCD133陽性細胞は極めて少ない。そのため、末梢血を用いる場合には、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）等による骨髄前駆細胞の多量動員が一般に行われるが、それでも一定の治療効果を得るのに必要な細胞数を回収することが困難な場合もある。

動脈硬化や糖尿病等の基礎疾患を有する患者や高齢者の場合、骨髄採取が困難なことに加えて、細胞の機能そのものが低下していることが懸念される（非特許文献１及び２参照）。新たな試みとして、臍帯血に含まれる前駆細胞をex vivoで細胞増幅して用いる方法も報告されている（特許文献２参照）。また、将来的には、胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）を、このような未分化細胞（幹細胞）のソースとして利用することも期待されている。しかしながら、現実化への道のりはまだ遠い。

希少な（造血）幹細胞を血管再生治療のソースとする方法に対し、骨髄あるいは末梢血に含まれる単核球を分化誘導して得られる血管内皮前駆細胞（endothelial progenitor cell; EPC）の利用を示唆する報告もある（非特許文献３参照）。この報告では、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）をはじめとするサイトカインを含み、血管内皮細胞の培養に最適化されたEBM2等の培地を用いて単核球を培養し、付着細胞あるいは浮遊細胞として回収される細胞をEPCと称している。

マウスの末梢血あるいは骨髄単核球を、ラットvitronectin処理した培養皿で10 % FBSを添加したEGM2-MV培地にて分化誘導培養して得られる付着細胞は、アセチル化低密度リポタンパク質（acetylated LDL）を取り込み、レクチン（lectin）に親和性を示す。この付着細胞には、紡錘形の形態を呈する細胞と類円形の形態を呈する細胞が混在している。培養開始１週間以内では前者の割合が多いが、より長期間培養すると後者に由来すると推察される敷石状の形態を呈する細胞が密に増殖してくる。すなわち、上記した方法で得られる付着細胞は異なる細胞群を含み、EPCは後者の分画に含まれると考えるのが妥当である。しかしながら、敷石状のコロニー形成から継代可能な細胞が出現する頻度は極めて低く、分化誘導培養の初期段階で多く見られる紡錘形の細胞は膨化・伸展し、その生存率は著しく低下する。

マウス単核球を１週間程度の短期間培養して得られる細胞を、心筋あるいは下肢が虚血状態に陥ったマウスなどの小動物に移植（局所ならびに全身投与）すると、虚血の改善が得られることが知られている。すなわち、単核球から分化誘導された細胞（群）は血管新生を促進する効果を有することが知られている。一方で、単核球から分化誘導された細胞は、腫瘍（がん）組織の低酸素領域の縮小効果（特許文献３参照）や、肝線維化の抑制効果（特許文献４参照）などを有することも知られている。しかしながら、これらの細胞は、必ずしも細胞膜上にCD34及びVEGF受容体2（VEGFR2/Flk-1/KDR）などのEPCマーカーと呼ばれる抗原（非特許文献４参照）を発現していない。これらは造血幹細胞の分化過程に伴い幹細胞抗原を失ったものか、あるいは当初より幹細胞抗原を発現しない非造血幹細胞に由来する細胞群なのかは不明である。

同様に、ヒト末梢血単核球をヒトfibronectin処理した培養皿で10 % FBSを添加したEGM2-MV培地にて分化誘導培養して得た付着細胞は、１週間程度の培養期間においては類円形から紡錘形の形態を良く維持し、HUVECなどのヒト血管内皮細胞の管腔形成を促進する能力を有し（非特許文献５参照）、ヌードマウスの下肢虚血に伴う壊死を抑制することが報告されている（非特許文献６参照）。同様の分化誘導処理を施したヒト末梢血単核球を自家移植することで、心筋梗塞後の心機能が改善したことを示す臨床試験成績も報告されており、移植された細胞はFlk-1、CD31、CD105、VE-cadherin等の表面抗原を発現するEPCと定義されている（非特許文献７参照）。しかしながら、培養期間が３日間と短いことから、造血幹細胞が大量に増幅された可能性はむしろ少ないと考えるのが妥当であり、単球系由来の細胞であった可能性が否定できない。

単核球の長期間の分化誘導培養によって、効率よく目的とする細胞が得られるか、またこれらの細胞機能と細胞の品質が良好に保たれるかについては明らかにされていない。分化誘導に際して、低酸素環境がEPCの未分化性の保持（非特許文献８参照）、抗酸化作用等（非特許文献９参照）が知られているが、これまでの報告の大部分はFBSを含有するEGM2-MV培地を用いているため、そのまま臨床応用（ヒトへの投与）することはできない。

単核球をソースとして血管内皮細胞への分化能を有するEPCを分化誘導することは、CD34あるいはCD113陽性の造血幹細胞による血管再生治療の代替方法として期待される。しかしながら、上述したとおり、単核球から分化誘導される付着細胞（群）はヘテロな群であって、血管再生治療に好適なEPCのみを効率的に分化誘導する臨床応用可能な手法の未だ確立されていない。

CD11bは、主として単球及びリンパ球に発現している血球分化抗原のひとつである。CD11b陽性細胞にはマクロファージや樹状細胞、natural killer細胞（NK細胞）等のように免疫監視機構を担う細胞やリンパ球の一部も含まれる。一方で、がん等において見られる異常な新生血管において、CD11b抗原とともにVE-cadherin、VEGF受容体１（VEGFR1）、SDF-1受容体（CXCR4）、angiopoietin-1受容体（Tie-2）などの血管新生因子に対する受容体の発現がみられることが知られている。すなわち、これらのマーカーを発現している非幹細胞が血管新生促進効果を有する細胞に分化するなど、血管新生において重要な役割を担っている可能性が示唆されている（非特許文献１０参照）。

一方で、CD11b陽性細胞のなかには比較的未分化な分画も存在する。骨髄中のCD11b陽性細胞の一部は血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor; VEGF）や血小板由来成長因子（platelet-derived growth factor; PDGF）などの血管新生因子の存在下では、CD31抗原陽性の血管内皮細胞あるいはsmooth muscle actin（SMA）抗原陽性の壁細胞へと分化することが可能であることが報告されている（非特許文献１１参照）。また、ES細胞の分化誘導によって得られたvascular progenitor cell; VPC（非特許文献１２参照）などの比較的幼弱な細胞は、これらと同様の性質を有すると考えられ、その最終的な分化方向は環境に依存する可能性がある。

以上の事実は、CD11b陽性細胞の一部が直接的に新生血管の構成要素となる、あるいはサイトカイン産生等を介して間接的に血管新生の促進、あるいは新生血管の安定化に関わっている可能性を示唆する。しかし、単核球に比較的多く含まれるCD11b等の単球系分化マーカーを発現する非造血幹細胞をソースとして、血管再生、血管修復、血管安定化などの働きのある細胞を分化誘導するための、ウシ胎児血清（FBS, FCS）等の動物由来の試料を含まない分化誘導システムは確立されていない。また、CD11bなどの単球マーカーを発現する細胞は、腫瘍（がん）を有する生体内において腫瘍血管において内皮細胞へと分化する場合（非特許文献１３参照）と、血管内皮細胞には分化せずに血管周囲に存在する場合（たとえば、Tie2などを共発現するCD11b陽性細胞；非特許文献１４参照）があり、その特性や役割を厳密に区別して考えることは便宜上難しい（非特許文献１５参照）。すなわち、CD11b発現単核球を分化誘導して得られる細胞が最終的にEPCとして機能しているか否かは明らかではない。

特表2001-503427号 WO2006/90882 WO2008/142862 特開2008-266220号

Ii M, et al: Circ Res 98; 697-704, 2006 Chang EI, et al: Circulation 116; 2818-2829, 2007 Gulati R, et al: Circ Res 93; 1023-1025, 2003 Asahara T, et al: Science 275; 964-967, 1997 Yamazaki M, et al: Cancer Sci 99; 1131, 2008 Kalka C, et al: PNAS 97; 3422-7, 2000 Assmus B, et al: Circulation 106; 3009-3017, 2002 第104回日本内科学会講演会シンポジウム 3．細胞療法の可能性と限界３）血管再生療法の現状と展望．日本内科学会雑誌 Vol. 96, No. 9, pp29-136, 2007 Kubo M, et al: Am J Physiol heat Circ Physiol 294; H590-5, 2008 Karbel RS. N Engl J Med 358; 2039-49, 2008 Yamada T, Takakura N. JEM 203; 1055-65, 2006 Yurugi-Kobayashi T, et al: Blood 101; 2675-2678, 2003 Yang L, et al: Cancer Cell 6; 409-421, 2004 De Plama M, et al.: Cancer Cell 8; 211-226, 2005 Rehman J, et al.: Circulation 107; 1164-169, 2003

本発明の課題は、量的に限られたCD34陽性あるいはCD133陽性の造血幹細胞に代えて、新生血管の安定化と成熟化を促進し、虚血や組織修復をもたらす細胞を単核球から安全かつ簡便に分化誘導する手法を確立し、血管再生治療の新たな手段を提供することにある。

発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、末梢血液中に比較的多く存在する単球・リンパ球分画を中心とした細胞（群）、具体的にはCD11b陽性細胞の一部から、目的とする細胞を分化誘導することに成功した。

得られた細胞は、血管内皮細胞には直接分化しないが、新生血管の安定化と成熟化を促進することで、血管再生を促し虚血や組織修復をもたらした。すなわち、がんなどの虚血領域を有する生体に全身投与すると、新生血管の周辺に分布して血管の安定化や成熟化を促進した。また、この細胞は、CD31、CXCR4に加えてCD11bを発現し、またわずかにc-Kitの表面抗原を発現していた。以上の特徴から、単核球から分化誘導された細胞は、従来EPCと定義されている細胞とは異なる部類に属する細胞（群）であることが示唆された。

すなわち、本発明は、単核球細胞群を、血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor; VEGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor: bFGF）、トロンボポイエチン（thrombopoietin; TPO）、顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor; G-CSF）、及びFMS-like tyrosine kinase 3 ligand（FLT3L）から選ばれる１以上を含む培地を用いて培養することにより分化誘導される、CD11bを発現していることを特徴とする細胞群に関する。
本発明の細胞群は、無血清培地を用いて培養されることが好ましい。
本発明の細胞群は、さらに、CD31及びCXCR4を発現していることを特徴とする。また、CD105も発現していることを特徴とする。
用いられる単核球としては、末梢血、骨髄、又は臍帯血由来の単核球が挙げられる。

培養は、低酸素条件下で行われることが好ましい。ここで、低酸素条件とは、1%〜10%の酸素濃度の条件を意味する。

ある実施形態において、単核球細胞群は、VEGF、bFGF、及びTPOを含む培地を用いて培養される。

本発明の細胞群は、血管再生能を有することを特徴とする。特に、本発明の細胞群は新生血管の安定化あるいは成熟化の促進を介して血管再生能を有する。

本発明は、上記した本発明の細胞群を含む、血管再生治療用細胞製剤も提供する。
本発明の細胞製剤は、虚血改善及び／又は血管成熟効果を有することを特徴とする。
本発明はまた、上記した本発明の細胞群を含む、がんの局在診断剤も提供する。

さらに本発明は、以下の工程を含む、血管再生能を有する細胞群の調製方法を提供する：
１）単核球細胞群を、血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor; VEGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor: bFGF）、トロンボポイエチン（thrombopoietin; TPO）、顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor; G-CSF）、及びFMS-like tyrosine kinase 3 ligand（FLT3L）から選ばれる１以上を含む培地を用いて培養する
２）前記培養によって得られる細胞集塊からCD11bを発現している細胞群を回収する。

上記方法において、培地は無血清培地であることが好ましく、また培養は低酸素条件下で行われることが好ましい。なお、低酸素条件とは1%〜10%の酸素濃度の条件を意味する。

本発明にかかる細胞は、新生血管の安定化、成熟、保護機能を有し、成熟血管内皮細胞による管腔形成を促進するとともに、腫瘍血管をも機能的に正常化する。本発明は、末梢血から比較的容易に採取可能な単球系細胞をソースとするため、希少な（造血）幹細胞をソースとする従来の血管再生治療の代替方法として有用である。また、本発明にかかる細胞は、動物血清を使用しない条件下で単球系細胞から分化誘導されるため、感染の危険がなく、臨床応用可能な安全な細胞製剤を提供しうる。

図１は、マウス骨髄単核球を10 % FBS添加EGM2-MV培地で分化誘導培養して得た付着細胞によるMS-1の管腔形成促進を示す。図２−１は、マウス骨髄単核球を10 % FBS添加EGM2-MV培地で分化誘導培養して得た付着細胞による血管成熟化を示す。図２−２は、マウス骨髄単核球を10 % FBS添加EGM2-MV培地で分化誘導培養して得た付着細胞の担がんヌードマウスへの移植結果を示す。図３は、TaqManプローブを用いた定量的RT-PCRによる遺伝子発現解析結果を示す（上左：CA9、上中：hENT1、上右：dCK、下左：Oct4、下中：MDR1、下右：ABCG2）。図４は、マウス骨髄単核球CD11b陽性分画とCD11b陰性分画の形態を示す。図５は、マウス骨髄単核球CD11b陽性分画を10 % FBS添加EGM2-MV培地で分化誘導培養した結果を示す。図６は、ヒト末梢血単核球を10 % FBS添加EGM2-MV培地で分化誘導培養した結果を示す。図７は、ヒト末梢血単核球を5 %又は1 % FBS添加EGM2-MV培地にて、低酸素環境で分化誘導培養した結果を示す。図８は、ヒト末梢血単核球を20%自家血清添加X-VIVO 15培地（1 ng/mL ヒトVEGFも添加）と20 %自家血清添加EGM2-MV培地で分化誘導培養した結果を示す。図９は、ヒト末梢血単核球を5 %自家血清、50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGF添加X-VIVO 15培地での分化誘導培養結果を示す。図１０は、ヒト末梢血単核球を5 %自家血清、50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGF添加X-VIVO 15培地で分化誘導培養して得た付着細胞の表面マーカーの発現を示す。図１１は、ヒト末梢血単核球を、0, 1, 5, 10 %自家血清存在下で、50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGF添加X-VIVO 15培地で分化誘導培養した結果を示す。図１２は、ヒト末梢血単核球を、10 %自家血清存在又は無存在下で、50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGF添加X-VIVO 15培地で分化誘導培養した結果を示す。図１３は、ヒト末梢血単核球を50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGF添加X-VIVO 15培地での分化誘導培養のFLT3L濃度依存性を示す。図１４は、ヒト末梢血単核球を50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGF、0-100 ng/mL G-CSF添加X-VIVO 15培地で分化誘導培養した結果を示す。図１５−１は、ヒト末梢血単核球を50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGF、0-100 ng/mL TPO添加X-VIVO 15培地で分化誘導培養した結果を示す。図１５−２は、ヒト末梢血単核球を50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGF、0-100 ng/mL TPO添加X-VIVO 15培地で分化誘導培養して得られる細胞集塊の定量的解析結果を示す。図１６は、ヒト末梢血単核球を50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGF、0-100 ng/mL TPOを添加X-VIVO 15培地にて分化誘導培養した結果を示す。図１７は、ヒト末梢血単核球を50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGF、100 ng/mL TPOを添加したX-VIVO 15培地で分化誘導培養して得た細胞集塊を20 % FBS添加EGM2-MV培地でさらに培養した結果を示す。図１８は、多発性骨髄腫患者の末梢血単核球（CD11b陽性細胞/CD11b陰性細胞）を50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGF添加X-VIVO 15培地で分化誘導培養した結果を示す。図１９−１は、ヒト末梢血単核球CD11b陽性分画の2 colorフローサイトメトリー解析の結果を示す。図１９−２は、ヒト末梢血単核球を50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGF添加X-VIVO 15培地で４日間分化誘導培養して得た細胞群のCD11b弱陽性分画（CD11b^dim）の2 colorフローサイトメトリー解析の結果を示す。図１９−３は、ヒト末梢血単核球を50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGF添加X-VIVO 15培地で４日間分化誘導培養して得た細胞群のCD11b強陽性分画（CD11b^bright）の2 colorフローサイトメトリー解析の結果を示す。図１９−４は、ヒト末梢血単核球、そのCD11b陽性分画、CD14陽性分画を50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGF添加X-VIVO 15培地で分化誘導培養して得た細胞群を示す。図１９−５は、ヒト末梢血単核球を50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGF添加X-VIVO 15培地で４日間分化誘導培養して得た細胞群のCD11b陽性分画を磁気ビーズを標識下抗体によって分離した2 colorフローサイトメトリー解析の結果を示す。図２０は、ヒト末梢血単核球（CD11b陽性分画/ CD11b陰性分画/単核球全体）におけるG-CSF受容体、TPO受容体、VE-cadherin mRNAの発現解析結果を示す。図２１−１は、多発性骨髄腫患者の末梢血単核球及びこれを50 ng/mLVEGF、50 ng/mL bFGF添加X-VIVO 15培地で分化誘導培養して得た細胞のうちCD11b陽性細胞の2 colorフローサイトメトリー解析結果（CD14、UEA-lectin親和性）を示す。図２１−２は、多発性骨髄腫患者の末梢血単核球CD11b陽性細胞を50 ng/mLVEGF、50 ng/mL bFGF添加X-VIVO 15培地で分化誘導培養して得た細胞における、TPO受容体、G-CSF受容体、CXCR4の発現解析結果を示す。図２２は、ヒト末梢血単核球を培養皿で50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGF、20 ng/mL TPOを添加したX-VIVO 15培地で分化誘導培養して得たCD11b陽性分画の、マトリゲル上（10 % FBS添加EGM2-MV培地で培養）での管腔形成を示す。図２３−１は、下肢虚血モデル試験の結果を示す。図２３−２は、抗BS1‐lectin抗体で免疫組織学的に検出した蛍光顕微鏡写真（対物２０倍）を示す（ヌードマウス下肢虚血モデル試験）。図２３−３は、BS1‐lectinによって可視化された虚血域近傍の機能血管をImageJ softwareで定量した結果を示す（ヌードマウス下肢虚血モデル試験）。図２４は、レーザードップラーによる血流評価（治療直後の虚血肢／健側肢比の改善割合）結果を示す（ヌードマウス下肢虚血モデル試験）。グラフ左から、マトリゲル移植群（control）、分化誘導培養を行わないCD11b陽性細胞移植群（fresh CD11b⁺）、分化誘導培養を行った単核球移植群（cultured MNC）、磁気ビーズによって純化したCD11b陽性細胞移植群（CD11b⁺from cultured MNC）。図２５は、化学療法後にG-CSFの投与を受けた多発性骨髄腫患者の末梢単核球由来CD11b陽性細胞における定量的RT-PCRによる遺伝子発現解析結果を示す。各グラフ左から、磁気ビーズによって純化したCD11b陽性細胞（fre CD11b）、前記CD11b陽性細胞を50 ng/mL VEGF、50 ng/mLbFGFを添加したX-VIVO 15培地にて20% 酸素下（cul CD11b in 20% O₂）、5% 酸素下（cul CD11b in 20% O₂）で培養した細胞。

本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００９−９３４５９号の明細書に記載された内容を包含する。

１．本発明の細胞群（Cell Population）
本発明の細胞群（Cell Population）は、哺乳動物の単核球から分化誘導される、血管再生能を有するCD11b陽性の細胞集団である。

１．１由来
本発明の細胞群は「単核球」に由来する。「単核球」とは、結合組織、リンパ組織、血流中に広く分布する単核の間葉系細胞群で、単球やリンパ球に代表される遊走単核白血球と組織中に存在するマクロファージに代表される単核貪食系の細胞群に分類される。本発明で用いられる単核球としては、前者に属する末梢血、骨髄、又は臍帯血由来の単核球（白血球）が好ましい。特に、豊富に存在し、取得が容易である点において、末梢血由来の単核球が好ましい。

用いられる単核球は、これを投与する患者由来のものとすることで、拒絶反応を回避した安全な再生医療用の細胞群（細胞製剤）を調製することができる。

１．２分化誘導
本発明の細胞群は、上記のようにして調製した単核球細胞群を、適切な「サイトカイン」を含む無血清培地を用いて分化誘導培養することにより調製される。サイトカインを添加することにより、単核球は無血清培地においても好適に増殖し、目的とする血管再生能を有する細胞へと分化誘導される。また、用いられる培地は血清を含まないため、感染等の恐れがなく、調製された細胞群（細胞製剤）は、そのまま臨床応用に供することができる。

本発明の細胞群の分化誘導（調製）方法については、次項「２．本発明の細胞群の調製方法」において、詳細に説明する。

１．３細胞群の形態
本発明の細胞群は、無血清培地を用いた培養により、接着性の弱い、半浮遊（スフェロイド）状の細胞集塊として得られる。この細胞群は、再播種して血清（患者の自己血清等）存在下で培養すると接着性の強い紡錘形をした付着性細胞となる。

１．４表面マーカー
本発明の細胞群は、CD11bを発現していることを特徴とする。
「CD11b」は、主として単球及びリンパ球に発現している血球分化抗原のひとつである。CD11b陽性細胞には、マクロファージや樹状細胞、NK細胞等のような免疫細胞やリンパ球のほか、がん等において見られる異常な新生血管の細胞、CD31抗原陽性の血管内皮細胞あるいはsmooth muscle actin（SMA）抗原陽性の壁細胞へと分化する比較的未分化な細胞も含まれる。これまでの報告は、CD11b発現細胞が血管新生促進効果を有する細胞に分化するなど、血管新生において重要な役割を担っている可能性は示唆するものの（前掲）、これが最終的に血管内皮細胞へと分化する場合とそうでない場合の両方がありうることを示す。

本発明の細胞群は、CD11bのほか、CD31及びCXCR4を発現し、さらにわずかではあるが、c-Kitの発現が認められる。また、CD105の発現も認められる。発明者らは、単核球から無血清培地を用いた特定の方法で分化誘導されるCD11b陽性細胞群が、in vivo及びin vitroにおいて優れた血管再生能力を有することを見出した。

さらに詳細に言えば、本発明の細胞群は、CD11b^dim/CD31^dim/CD14^-細胞群（主としてリンパ球）あるいは、CD11b^bright/CD31^bright/CD14^bright細胞群（主として単球）に由来すると考えられる。また、分化誘導後の表面マーカーの特性として、CD11b^dim/CD14^-/CD8^-/CD31^dim/CXCR4⁺を発現する集団と、CD11b^bright/CD14⁺/CD105⁺/CXCR4⁺を発現する集団が存在する。なお、「dim」は、免疫染色が弱く、マーカーの発現量が比較的少ないこと、「bright」は免疫染色が強く、マーカーの発現量が比較的多いことを示す。

同時に、単核球細胞群や単核球細胞群に元々含まれるCD11b陽性細胞群には、in vivoでの血管再生能力は低い。また、従来EPCと称されてきた細胞群は、単核球細胞群のCD11b陰性細胞群から分化誘導され、その表面マーカーの発現はCD45^-/CD11b^-/CD34⁺/CD133⁺/ Flk-1⁺という点において、本発明の細胞群とは明らかに区別される。

１．５血管再生能
本発明の細胞群は、血管内皮細胞には直接分化しないが、新生血管の安定化と成熟化を促進することで、血管再生を促し虚血や組織修復をもたらす。すなわち、がんなどの虚血領域を有する生体に全身あるいは局所投与すると、新生血管の周辺に分布し、周被細胞による新生血管（微少血管）内皮細胞の裏打ちを増強すること等によって血管の安定化や成熟化を促進する。

「血管再生能」とは、組織中にあらたな血管ができる機序を促すあるいは助ける機能を意味し、既存の血管内皮細胞が増殖・遊走し新しい血管が作られる血管新生、虚血部位の血管が再構築され（太くなり）、新生血管に血流を補給する導管を形成する側副血行路形成、骨髄由来の細胞が血流を介して虚血部位に到達し、血管内皮や周被細胞へと分化する脈管形成、そのいずれの段階における貢献をも含む。

従来血管内皮前駆細胞（endothelial progenitor cell; EPC）と定義される細胞は、骨髄などに由来し、最終的に血管内皮細胞への分化能を有することで血管新生を促し、血管再生治療に貢献する。これに対し、本発明の細胞群は、血管内皮細胞には直接分化しないが、新生血管の安定化と成熟化を促進することで、血管再生治療に貢献する。

２．細胞の調製方法
本発明の細胞群は、単核球細胞群から以下の工程により調製される。
１）単核球細胞群を、血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor; VEGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor: bFGF）、トロンボポイエチン（thrombopoietin; TPO）、顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor; G-CSF）、及びFMS-like tyrosine kinase 3 ligand（FLT3L）から選ばれる１以上を含む無血清培地を用いて培養する
２）細胞集塊からCD11bを発現している細胞群を回収する。

２．１単核球の調製
各組織からの単核球の分離は、市販のキット等を用いて、周知の方法により容易に実施できる。たとえば、採取した血液を適宜希釈し、あらかじめ分離液が入った遠心管に入れ、1500rpm程度で遠心して、比重の違いにより分離する。リンパ球・単球から成る末梢血単核細胞は、血漿（黄色味を帯びる）と分離液（透明）の中間に、白い帯状の層として回収される。

２．２培地−無血清培地
本発明で用いられる培地は、単核球の培養に適した培地である限り、特に限定されない。標準的な培地としては、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、α−ＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ培地、ＳｔｅｍＳｐａｎ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ培地及びこれらの混合物を挙げることができる。あるいは市販のリンパ球培養用培地：たとえばGT-T培地（タカラバイオ）、AIM V培地（インビトロジェン）、Tリンパ球培養用培養液（コスモバイオ）、X-VIVO培地（Lonza社製）、市販の血管内皮細胞用培地：たとえばEGM-2培地やEBM-2培地等を挙げることができる。

前記培地は、特にFBS, FCS等の動物血清を含まない「無血清培地」であることが好ましい。「無血清培地」は、単核球の培養に適した培地である限り、特に限定されず、市販の無血清培地を用いてもよいし、適宜調製してもよい。本発明者らは、「無血清培地」を用いて、本発明の細胞群の簡便な分化誘導方法を確立した。動物血清を含まない無血清培地は、感染等の恐れがなく、調製された細胞群（細胞製剤）はそのまま臨床応用に供することができる。

２．３サイトカイン
単核球細胞群からの「分化誘導」は、適切な「サイトカイン」を、前記した無血清培地に添加して培養することにより行われる。サイトカインにより、単核球は無血清培地においても好適に増殖し、目的とする血管再生能を有する細胞へと分化誘導される。

本発明で用いられる「サイトカイン」としては、血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor; VEGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor: bFGF）、トロンボポイエチン（thrombopoietin; TPO）、顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor; G-CSF）、FMS-like tyrosine kinase 3 ligand（FLT3L）、マクロファージコロニー刺激因子（Macrophage-colony stimulating factor; M-CSF）、hedgehogリガンド、CEACAM（癌胎児性抗原関連細胞接着因子）等を挙げることができるが、本発明の目的と効果に適合する限り、これらに限定されない。

「血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor; VEGF）」は、脈管形成及び血管新生に関与する一群の糖タンパクである。VEGFは主に血管内皮細胞表面に存在するVEGF受容体 (VEGFR) に結合し、細胞分裂や遊走、分化を刺激したり、微小血管の血管透過性を亢進させたりするが、単球・マクロファージの活性化にも関与する。正常な体の血管新生に関わる他、腫瘍の血管形成や転移など、悪性化の過程にも関与する。

脈管形成や血管新生、リンパ管新生に関与する増殖因子にはVEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-D、VEGF-E、PlGF-1、PlGF-2の7つがあり、これらをまとめて「VEGFファミリー」と呼び、VEGF-Aのみを単にVEGFと呼ぶこともある。さらにいくつかのVEGFファミリーメンバーには、いくつかの亜型も存在する。本発明で用いられる「血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor; VEGF）」には、本発明の目的と効果を損なわない限りにおいて、これらVEGFファミリーとその亜型を含む。

「塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor: bFGF）」は、ヘパリン結合分裂促進タンパク質で、強力な血管新生因子（ペプチド）として、血管新生及び動脈形成を促進する機能を有し、神経や骨の形成にも関与する。無血清培養あるいは血清量の少ない培養条件でさまざまな種類の細胞の増殖を高める効果を有することが知られている。

「トロンボポイエチン（thrombopoietin; TPO）」は、血小板の前駆細胞の増殖及び分化に関与する造血因子である。血小板は造血幹細胞から巨核球を経て分化し、血液凝固において重要な役割を果たすとともに、種々の免疫反応にも関与している。TPOは血小板の形成を促進する活性を有する因子として報告され、1994年にはじめてクローニングされた。その後、TPOは巨核球コロニーの形成を抑制する機能を持つc-mplのリガンドであることが解明され、造血系細胞の産生に重要な因子であると考えられている。

「顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor; G-CSF）」は、顆粒球産出の促進、好中球の機能を高める作用がある。主にマクロファージより分泌され、GM-CSFの作用を経て分化がより顆粒球系に方向付けられた前駆細胞を標的とする。そのため、遺伝子組換えヒトG-CSF製剤は、がん化学療法による好中球減少症や再生不良性貧血に伴う好中球減少症に用いられている。

「FMS-like tyrosine kinase 3 ligand（FLT3L）」は、チロシンキナーゼ3リガンドで、受容体型チロシンキナーゼの一種であるＦｌｔ３レセプター（CD135）を介したシグナル伝達により造血系の前駆細胞や幹細胞の増殖、分化を制御することが知られている。Ｆｌｔ３リガンドはCD34あるいはCD133陽性の造血幹細胞や樹状細胞などの単球系細胞に対して、増殖活性を有することが知られており、生体内あるいは生体外でこれらを増幅させることができる。

本発明で用いられるVEGF、bFGF、TPO、FLT3L等のサイトカインは、天然のものであっても、組換え体であってもよい。これらサイトカインは、用いる単核球と同じ種に由来するものが好ましい。したがって、ヒトの単核球を利用する場合であれば、ヒトVEGFが好ましい。VEGFは、市販のもの（試薬あるいは医薬品）を用いてもよいし、公知の配列情報に基づいて組換え製造して用いてもよい。

本発明では、上記したサイトカインのうち、少なくとも１種を含む無血清培地を用いる。好ましくは、無血清培地は、VEGF、bFGF、及びTPOを含む。CD11b陽性細胞でTPO受容体の発現が低いことから、CD11b陰性細胞を介したparacrine効果を介している可能性や、G-CSFで骨髄からの幼弱なCD11b陽性細胞の場合、分化誘導の過程でTPO受容体の発現上昇が見られることから直接的な効果も想定されるが、その作用機序は不明である。

培地へのサイトカインの量は、用いる細胞に応じて適宜設定されるが、一般には1〜100μg/ml程度である。

２．４培養条件
培養は、表面処理した培養皿等を用いて、通常リンパ球の培養に用いられる条件において行われる。すなわち、温度３７℃、酸素濃度２０％である。

培養は、低酸素条件下で行われることが好ましい。ここで、「低酸素条件」とは、空気中の酸素含有量（約21％）を少なくとも下回る酸素濃度を意味し、具体的には、1%〜10%の酸素濃度であることを意味する。低酸素条件下で培養することにより、細胞の生存率が向上し、目的とする血管再生能を有する細胞を高効率で得ることができる。

細胞の培養は、好ましくはＧＭＰ基準の細胞調製施設「ＣＰＣ（Cell Processing Center）」で行う。対象へ投与する「臨床グレードの細胞」の調製は、無菌状態で細胞を操作すべく特別に設計された施設、より具体的には、空調制御、室圧制御、温湿度制御、パーティクルカウンター、ＨＥＰＡフィルターなどにより清潔度が担保されたＣＰＣで行うことが好ましい。また、ＣＰＣ施設自体のみならず、ＣＰＣ内で使用する全ての機器は、バリデーションにより性能が保障され、その機能を、随時モニタリング・記録することが好ましく、ＣＰＣでの細胞処理操作は、全て「標準手順書」によって厳格に管理・記録することが望ましい。

２．５ CD11b陽性細胞の分離
無血清培地を用いた培養により、接着性の弱い、半浮遊（スフェロイド）状の細胞集塊として得られる。この細胞集塊からCD11bを発現している細胞を回収する。CD11bを発現している細胞の回収は、常法にしたがいCD11b抗体を用いて容易に実施できる。たとえば、CD11b抗体で標識された磁気ビーズ、蛍光標識されたCD11b抗体を用いたセルソーターによる分離、あるいはCD11b抗体を固相化したカラムなどを用いて、CD11b陽性細胞を分離すればよい。CD11b抗体は、市販のものを利用してもよいし、常法にしたがいCD11bあるいはその部分ペプチドを用いて作製してもよい。

３．細胞製剤
３．１血管再生治療用細胞製剤
本発明の細胞群は、血管内皮細胞には直接分化しないが、新生血管の安定化と成熟化を促進することで、血管再生を促し虚血や組織修復をもたらす。

それゆえ、本発明の細胞群は、がんなどの虚血領域を有する患者に投与することで、血管の安定化や成熟化を促進する「血管再生治療用細胞製剤」として利用できる。本発明の細胞製剤は、それ自身が血管内皮細胞に直接分化するのではなく、新生血管の安定化あるいは成熟化の促進を介して血管再生能を発揮するという点で、EPCを用いた従来の血管再生治療用細胞製剤とは明確に区別される。

本発明の細胞製剤の投与方法は特に限定されず、適用部位に応じて、外科的手段による局所移植、静脈内投与、腰椎穿刺投与、局所注入投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、脳内投与、脳室内投与、又は静脈投与などが考えられる。とくに、がんをはじめとする虚血部位への投与方法としては、局所投与あるいは経静脈投与が好ましい。

がん等において見られる異常な新生血管では、CD11b抗原とともにVE-cadherin、VEGF受容体１（VEGFR1）、SDF-1受容体（CXCR4）、angiopoietin-1受容体（Tie-2）などの血管新生因子に対する受容体の発現がみられることが知られている（前掲）。本発明の細胞群は、腫瘍組織や虚血領域への選択的指向性があり、経静脈的あるいは局所投与することで、腫瘍に局在し、腫瘍血管の有する構造的・機能的な血管を修復する可能性がある。

高血圧や糖尿病、高脂血症などで生活習慣病を有する患者、あるいは高齢の患者の末梢血から得た単核球の有する血管新生能は障害を受けている可能性がある。このような様々な合併症を有する患者においても、その末梢血から得た単核球を用いて本発明の細胞製剤を調製することで、自己の細胞を用いた再生治療が可能となる。

本発明の細胞製剤は、細胞の維持・増殖、患部への投与を補助する足場材料や成分、他の医薬的に許容しうる担体を含んでいてもよい。

細胞の維持・増殖に必要な成分としては、炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラル、塩類、各種サイトカイン等の培地成分、あるいはマトリゲル^TM等の細胞外マトリックス調製品、が挙げられる。

患部への投与を補助する足場材料や成分としては、生分解性ポリマー；例えば、コラーゲン、ポリ乳酸、ヒアルロン酸、セルロース、及びこれらの誘導体、ならびにその２種以上からなる複合体、注射用水溶液；例えば生理食塩水、培地、ＰＢＳなどの生理緩衝液、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液（例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム）等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０等と併用してもよいが挙げられる。

その他、必要に応じて、医薬的に許容される有機溶剤、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤等を含んでいてもよい。

実際の添加物は、本発明の治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、これらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばTween80、Tween20、ゼラチン等を加えたものを使用することができる。

本発明の細胞製剤の対象となりうる疾患としては、例えば、床ずれ・皮膚潰瘍、手術瘢痕、難治性消化性潰瘍を含む創傷、潰瘍性大腸炎、クローン病などの慢性炎症性腸疾患を含む炎症性疾患、重症四肢虚血、心筋梗塞・狭心症・心不全を含む虚血性心疾患、脳梗塞、糖尿病性ニューロパチー、重症虚血を伴うがん等、血管再生を必要とするあらゆる疾患が含まれる。とくに、通常の医薬では治療が困難な、重症慢性下肢虚血（閉塞性動脈硬化症、バージャー病）、治療不応性虚血性心疾患、重症虚血を伴うがん、網膜症を含めた糖尿病性血管障害等が対象疾患として好ましい。

３．２がんの局在診断剤
本発明の細胞群は腫瘍組織や虚血領域への選択的指向性を有する。それゆえ、本発明の細胞群をナノ粒子等で標識すれば、虚血、転移巣を含むがんの局在をみる画像診断に応用することができる。細胞の標識は、常法にしたがい、磁性体や蛍光色素等で標識することにより簡単に行うことができる。

３．３その他
本発明の細胞群は腫瘍組織への選択的指向性があるため、抗がん剤や腫瘍細胞に対して細胞障害性を有するタンパク質や薬剤などのキャリアーとして利用できる可能性がある。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：マウス単核球のEGM2-MV培地での分化誘導
マウス骨髄から、以下のようにして単核球を調製した。マウスの大腿骨などを乳鉢とＤＰＢＳＥ（５ｍＭの濃度でＥＤＴＡを含有したＰＢＳ）を用いて破砕し、骨髄液を採取した。採取した骨髄液から径７０μｍのメンブレンフィルターを用いてろ過して骨髄細胞懸濁液を集め、ＤＰＢＳＥ１０ｍｌに懸濁し、この懸濁液を４ｍｌのHistopaque 1083（Sigma社）が入った１５ｍｌの遠心チューブに静かに重層した。この混合物を用いて密度勾配遠心分離（４００ｇ、２０分間、室温）した後、中間に層状になった細胞をピペットにより採取して骨髄単核球（ＢＭ−ＭＮＣ）を単離した。

得られたマウス骨髄単核球をラットvitronectin処理した温度感受性培養皿（UpCell；セルシード社製；http://www.cellseed.com/product/004.html）で10 % FBSを添加したEGM2-MV培地にて１週間分化誘導培養し、付着細胞を得た。
・EGM2-MV培地：EGF, VEGF, IGF, bFGFを含む（増殖因子の濃度は非公開；Lonza社製）
・培養条件：20 %酸素、5 % CO²、37℃にて４日間培養し、付着細胞を室温にて浮遊させコーティング処理を施さない新しいUpCell培養皿に再播種して、３日後に付着細胞を再度浮遊させて回収した。
マウス骨髄単核球から分化誘導された付着細胞群の血管形成に対する影響について検討した。

（１）
前項で得られた付着細胞をGFPで標識し、増殖因子の含有量の少ないマトリゲル上でマウス血管内皮細胞株MS-1と同様の培地を用いて共培養した。その結果、培養単核球の添加により、MS-1の管腔形成が促進されることが確認された（図１）。

（２）
前項で得られた付着細胞10⁵個を４日の間隔で合計３回、ヒト膵癌細胞株KP-1Nを皮下移植した担がんヌードマウスに対して経静脈的に移植した。すなわち、腫瘍径が8 mm以上に達した時点で、培養単核球5 x 10⁵個を経静脈的に移植し、１週間後に腫瘍組織を回収して、腫瘍血管を免疫組織学的に解析した。

CD31抗体（血管内皮細胞；赤、BD社製）、NG2抗体（周皮細胞；緑、Millipore社製）、核染色（青）を行い、管腔面積と微少血管のうち周皮細胞の裏打ちを伴う成熟血管の割合を求めた。その結果、培養単核球の移植により、腫瘍血管の血管面積とNG2陽性のpericyteによる裏打ち（血管成熟化）が向上することが確認された（図２−１）。

（３）
また、CD31抗体（血管内皮細胞；赤）、核染色（青）を行い、GFPで蛍光標識（緑）して移植単核球の局在をみた。その結果、移植細胞は腫瘍血管の周辺（perivascular area）に分布するだけで、血管内皮細胞には分化しないことが確認された（図２−２）。

（４）
上記（２）で得られた腫瘍よりRNAを抽出し、TaqManプローブを用いた定量的RT-PCRによって癌細胞由来（ヒト膵癌細胞KP-1N）の遺伝子発現を解析した（図３）。その結果、CA9の発現が顕著に減少する一方、hENTの発現は上昇し、幹細胞マーカーであるOct4、薬剤耐性に関わるMDR-1、ABCG2などの発現が低下することが確認された。

考察：
以上の結果から、血清を添加したEGM2-MV培地を用いて単核球を分化誘導して得られる付着細胞は、新生血管の安定化を促進させ、腫瘍血管の構造的異常性を修正しうることが確認された。

定量的RT-PCRにおけるCA9の顕著な発現減少から、前記した方法（10 % FBSを添加したEGM2-MV培地での分化誘導培養）で培養したマウス骨髄細胞の移植に伴う腫瘍血管の構造的安定化に伴い、がん組織の低酸素環境が解除されることが示唆された。また、hENTの発現上昇から、膵癌の標準的な治療薬である塩酸ゲムシタビンの取り込みが改善することが示唆された。さらに、幹細胞マーカーの発現低下から、上記の培養マウス骨髄細胞の移植はがん幹細胞分画を減少させ、がん治療抵抗性を軽減することが示唆された。

実施例２：マウス単核球CD11b陽性分画の分化誘導
実施例１と同様にして、マウス骨髄から単核球を調製した。次いで、取得したマウス骨髄単核球からCD11b抗体を固定化した免疫磁気ビーズ（ミルテニーバイオテク社製）を用いてCD11b陽性分画を調製した。

（１）
CD11b陽性分画の細胞では、全単核球と同様に紡錘形の付着細胞が観察された。一方、同様の形態を有する細胞は、CD11b陰性分画を用いた場合には極めて少なかった（図４）。このことから、培養初期に見られる紡錘形細胞は単球由来であると考えられた。

（２）
CD11b陽性分画の細胞を、ラットvitronectin処理した培養皿で10 % FBSを添加したEGM2-MV培地において３週間培養したところ、細胞の膨化と進展がみられたが、増殖傾向は示さなかった。すなわち、CD11b陽性細胞は培養の早期段階より紡錘形の付着細胞として観察されるがコロニー形成が弱く、増殖能に乏しい（図５上段）。

一方、CD11b陰性分画のうち特にLineage陰性c-Kit陽性分画（造血幹細胞を含む分画）を、同様に10% FBSを添加したEGM2-MV培地によって３週間以上の分化誘導培養を行ったところ、コロニー形成を起点として増殖し、敷石状の形態を呈する細胞の出現が観察された（図５）。この細胞は継代可能であることから、増殖能を有するEPCに近いものと言え、CD11b陽性細胞由来の細胞とは異なるものと思われた（図５下段）。

考察：
以上の結果から、従来血管内皮前駆細胞（EPC）と呼ばれてきた細胞は、CD11b陰性分画のうち特にLineage陰性c-Kit陽性分画に由来し、一方初期付着細胞の多くは、CD11b発現細胞であると思われた。

実施例３：種々の条件下におけるヒト単核球の分化誘導
健常ボランティアから得た末梢血30mLにDPBSEを20ｍLを添加して、20℃、400×g で 35分間遠心し、バフィーコートを回収して20mLのDPBSEに再懸濁した後に、Histopaque 1077（Sigma社製）を用いて密度勾配遠心分離（４００ｇ、２０分間、室温）した後、中間に層状になった細胞をピペットにより採取して、単核球を単離し、ヒトフィブロネクチンをコーティングしたプレート上で、微小血管内皮細胞用培地ＥＧＭ２−ＭＶ培地キット（Lonza社製）で補完したＥＢＭ−２を用いて４〜７日間培養し、付着細胞を得た。

（１）
ヒト末梢血単核球をヒトfibronectin処理した培養皿で10 % FBSを添加したEGM2-MV培地にて分化誘導培養した。１週間程度の培養期間においては類円形から紡錘形の形態を良く維持するが、２週間程度の培養を行うと膨化・伸展といった老化現象を示し生存率は著しく低下することが確認された（図６）。EGM2-MV培地組成と培養条件は実施例１と同じである。

（２）
5 %又は1 % FBSを添加したEGM2-MV培地にアセチル化LDLでラベルしたDiI-acLDLを加え、前項と同様に、ヒト末梢血単核球をヒトfibronectin処理した培養皿で分化誘導培養した。アセチル化LDLの取り込みによって可視化した付着細胞は、5 %の低酸素環境で培養することによって、膨化や伸展などの老化現象が軽減され、細胞の生存率が向上すること、また血清依存性が低下することが確認された（図７）。

（３）
20%自家血清を添加したX-VIVO 15培地（1 ng/mL ヒトVEGFも添加）を用いて、ヒト末梢血単核球をヒトfibronectin処理した培養皿で分化誘導培養した。X-VIVO 15培地は末梢血及びヒト腫瘍から分離された精製CD3+リンパ球の他、ヒト単球、マクロファージ及び各種細胞株、顆粒球、及びナチュラルキラー（NK）細胞の培養に適している。培養は、20 %酸素、5 % CO_2、37℃にて実施した。得られた付着細胞は、20 %自家血清を添加したEGM2-MV培地によって得た細胞に比較して、培養開始から２週間後に観察される細胞の老化現象が低いレベルに抑えられることが確認された（図８）。

（４）
5 %自家血清と10 ng/mLのVEGF、10 ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor: bFGF）を添加したX-VIVO 15培地を用いて、前項と同様に、ヒト末梢血単核球をヒトfibronectin処理した培養皿で７日間分化誘導培養した。得られた付着細胞は、紡錘形の形態を示した（図９）。

（５）
5 %自家血清と10 ng/mLのVEGF、10 ng/mLのbFGFを添加したX-VIVO 15培地を用いて、前項と同様に、ヒト末梢血単核球をヒトfibronectin処理した培養皿で７日間分化誘導培養した。得られた付着細胞について、フローサイトメトリーを用いて表面マーカーの発現を確認した。その結果、付着細胞は細胞膜上にCD11b、CD14、CD31、CD105、CD146、VEGF受容体２（VEGFR2）、SDF-1受容体（CXCR4）,G-CSF受容体を発現することが確認された（図１０）。

（６）
0, 1, 5, 10 %自家血清と10 ng/mLのVEGF、10 ng/mLのbFGFを添加したX-VIVO 15培地に、アセチル化LDLでラベルしたDiI-acLDLを添加し、ヒト末梢血単核球をpoly-L-lysine（PLL）処理した培養皿で１４日間分化誘導培養を行った。その結果、無血清条件下においても接着は弱いがDiIラベルしたアセチル化LDLの取り込みによって可視化される生細胞が存在することが確認された（図１１）。

（７）
ヒト末梢血単核球を培養皿で50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGFを添加したX-VIVO 15培地にて１週間分化誘導培養した。その結果、無血清状態では半浮遊状（スフェロイド状）の細胞集塊が出現することが確認された。これらの細胞集塊は細胞接着性が弱いのに対し、10 %自家血清の存在下では、類円形から紡錘形の形態を示す細胞集塊が得られ、細胞の接着性が増強し、細胞面積は増大することが確認された（図１２）。これら、血清含有培地で見られる接着細胞はacLDLの取り込み能を有するものの、CD11b陽性かつ、単球系マーカーであるCD14などを発現するためEPCとは言えないと思われた。

（８）
ヒト末梢血単核球を培養皿で50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGF、0-100 ng/mL FMS-like tyrosine kinase 3 ligand（FLT3L）を添加したX-VIVO 15培地にて１週間分化誘導培養した。その結果、半浮遊状の細胞集塊の数はFLT3Lの濃度依存性に増加することが確認された（図１３）。

（９）
ヒト末梢血単核球を培養皿で50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGF、0-100 ng/mL 顆粒球増殖因子（granulocyte-colony stimulating factor; G-CSF）を添加したX-VIVO 15培地にて１週間分化誘導培養した。その結果、半浮遊状の細胞集塊の数がG-CSFの濃度依存性に増加することが確認された（図１４）。

（１０）
ヒト末梢血単核球を培養皿で50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGF、0-100 ng/mL TPOを添加したX-VIVO 15培地にて１週間分化誘導培養した。その結果、半浮遊状の細胞集塊の数がthrombopoietin（TPO）の濃度依存性に増加することが確認された（図１５−１）。また、培養４日目における細胞集塊の数をサイズごとに計測し、定量的に解析した結果、TPOの添加によって、サイズの大きな細胞集塊の数が増大し、特に10‐100 ng/mLを添加した際にサイズが大きな細胞集塊の出現頻度が増加する傾向が得られた（図１５−２）。この実験結果から、培地に添加するTPOの至適濃度は10‐100 ng/mLと考えられた。

（１１）
ヒト末梢血単核球を培養皿で50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGF、0-100 ng/mL TPOを添加したX-VIVO 15培地にて１週間分化誘導培養することで得た半浮遊状の細胞集塊を回収し、PLL処理した培養皿で20 % FBSを添加したEGM2-MV培地に再播種して３日間培養した。その結果、紡錘形の形態を呈する付着細胞が得られること、さらに100 ng/mL TPOの存在下で分化誘導培養を行った場合に、再播種後の付着細胞数が最も増加することが確認された（図１６）。

（１２）
ヒト末梢血単核球を培養皿で50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGF、100 ng/mL TPOを添加したX-VIVO 15培地にて、20%あるいは5%酸素濃度のもとで１週間分化誘導培養して得た半浮遊状の細胞集塊を回収し、PLL処理した培養皿で20 % FBSを添加したEGM2-MV培地に再播種して３日間培養した。その結果、紡錘形の形態を呈する付着細胞が得られること、さらにこれらがDiIをラベルしたアセチル化LDLの取り込みによって可視化されることが確認された。また、初期培養を5 %の酸素濃度下（低酸素培養）で行った場合に、再播種後の付着細胞数が増加することが確認された（図１７）。

（１３）
自家末梢血幹細胞移植のための細胞採取時に、化学療法後にG-CSFの投与を受けて、骨髄からの前駆細胞の動員を行った多発性骨髄腫の患者より得た末梢血単核球、磁気ビーズによって純化したCD11b陽性細胞及びCD11b陰性細胞を50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGFを添加したX-VIVO 15培地にて４日間分化誘導培養した。その結果、CD11b陽性細胞においてスフェロイド状の細胞集塊の形成が高頻度にみられた（図１８）。また、一部に紡錘形の付着細胞も観察された。

考察：
以上の結果から、目的とする血管新生能力を有する細胞の分化誘導には、EGM2-MV培地よりもX-VIVO 15培地のほうが適していること。また、低酸素条件下での培養やbFGFの添加によって、細胞の生存率が向上することが示唆された。
また、FLT3L、G-CSF、TPOの添加（無血清培養時）によって濃度依存的に目的とする血管新生能力の回収率が向上することが確認された。さらに低酸素条件下での分化誘導培養によって、血性存在下での接着性が飛躍的に高まることから、生体内においても目的とする虚血部位などにおける局在能が増強することが予測される。また、末梢血単核球の採取に際して、G-CSFの前投与が行われることで、スフェロイドの形成能が高まり、より効果的に目的とする血管安定化細胞が得られることが期待できる。

無血清培地で接着性が弱い細胞も環境次第では接着性を獲得する。特に血清含有培地へ再播種した際の接着性は、低酸素条件下（5 % O₂）での分化誘導を行った際に、劇的に高まる。ただし、培養皿に強く接着した細胞は、回収が困難で生存率も高くない。また半浮遊状態で培養することで、細胞の回収は容易になる。
さらに、単核球から分化誘導される細胞群のうち、CD11b陽性分画が初期付着細胞の主要なソースであることが示唆された。

実施例４：ヒト末梢血単核球CD11b陽性分画のフローサイトメトリー及び定量的RT-PCR解析
（１）
ヒト末梢血単核球を2 color フローサイトメトリーで解析した。ヒト末梢血単核球のCD11b陽性分画は、CD11b^dim及びCD11b^brightからなり、前者はCD31^dim/CD14^-（主としてリンパ球）、後者はCD31^bright/CD14^＋（主として単球）であった（図１９−１）。なお、「dim」は、免疫染色が弱く、マーカーの発現量が比較的少ないこと、「bright」は免疫染色が強く、マーカーの発現量が比較的多いことを示す。

（２）
ヒト末梢血単核球を培養皿で50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGFを添加したX-VIVO 15培地にて４日間分化誘導培養し、2 color フローサイトメトリーで解析した。CD11b^dim分画はCXCR4、CD31を発現しており、c‐Kit陽性細胞もわずかながら検出された（図１９−２）。また、CD11b^bright分画はCD14、CD31、CD105、CXCR4を発現しており、c‐Kit、Flk‐1陽性細胞もわずかながら検出された。（図１９−３）。

ヒト末梢血単核球、あるいはCD11b陽性細胞、CD14陽性細胞を磁気ビーズにてソーティングした細胞を血清を加えないX‐VIVO 15（50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGFを添加）で4日間分化誘導培養を行った。CD14陽性分画（CD11b^bright/CD31^bright/CD14^＋）のみ培養した場合には半浮遊状の細胞集塊の出現頻度が少ないことから、ヒト末梢血単核球のCD11b陽性分画のうちCD11b^dim/CD31^dim/CD14^-が分化誘導培養による血管安定化作用を有する細胞集塊の主たる細胞源となったか、あるいはCD11b^dim/CD31^dim/CD14^-の存在がCD11b^bright/CD31^bright/CD14^＋の血管安定化作用を有する細胞への分化に必要であることが予測された（図１９−４）。

（３）
ヒト末梢血単核球を血清を加えないX-VIVO 15（50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGFを添加）で4日間分化誘導培養を行い、CD11b陽性細胞を磁気ビーズにてソーティングした。
2 colorフローサイトメトリー法によってCD11b陽性分画の表面マーカーの発現を解析したところ、CD14陽性細胞が主体であった（図１９−５）

（４）
ヒト末梢血単核球から磁気ビーズによってCD11b陽性分画を純化し、これらにおけるG-CSF受容体、TPO受容体ならびにVE-cadherin mRNAの発現をCD11b陰性分画及び単核球全体と比較解析を行った結果、G-CSF受容体、VE-cadherinの発現がCD11b陽性分画に高かったが、逆にTPO受容体の発現はCD11b陰性分画で高かった（図２０）。

（５）
化学療法後にG-CSFの投与を受け、末梢血幹細胞移植の細胞採取時に回収された多発性骨髄腫患者の末梢血単核球、及びこれらを血清を加えないX-VIVO 15（50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGFを添加）で4日間分化誘導培養を行った細胞を、それぞれCD11b陽性細胞を磁気ビーズにてソーティングして、2 colorフローサイトメトリー法によってCD11b陽性分画のCD14の発現及びUEA-lectinに対する親和性を解析した（図２１−１）。

（６）
自家末梢血幹細胞移植のための細胞採取時に、化学療法後にG-CSFの投与を受けて、骨髄からの前駆細胞の動員を行った多発性骨髄腫の患者より得た末梢血単核球から磁気ビーズによってCD11b陽性細胞に分離した細胞（fresh CD11b⁺）と、これらを50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGFを添加したX-VIVO 15培地にて４日間分化誘導培養して得た細胞よりそれぞれRNAを抽出し、TPO受容体mRNAを定量的RT-PCRによって解析した。その結果、TPO受容体の発現量は培養前に比較して100倍以上となった。また、CD11b陽性細胞におけるG-CSF受容体の発現は分離前の単核球に比較して著しく高かったが、分化誘導培養による発現の増強はみられなかった。一方で、CD11b陽性細胞におけるCXCR4の発現は約３倍に増強した（図２１−２）。

考察：
以上より、CD11b陽性分画のうち、CD11b^dim/CD31^dim/CD14^-/CXCR4⁺又はCD11b^bright/CD14⁺/CD105⁺の存在が血管安定化作用を有する細胞集塊の分化誘導に重要である可能性が示唆された。
また、G-CSFの投与によって骨髄より動員された末梢血単核球のCD11b陽性分画はVEGF等を添加した無血清培地において高いコロニー形成能を有することから、新生血管の安定化を誘導する細胞のソースとしてより好ましいと考えられた。さらにCXCR4の発現増強がみられることから、虚血組織への局在能が増強されることが期待できる。分化誘導の過程においてCD14の発現が低下し、UEA-lectinに対する親和性が増強する意義については、さらなる検討が必要である。

実施例５：in vitroでの血管新生能及びマウス下肢虚血モデル移植実験
（１）
ヒト末梢血単核球を培養皿で50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGF、20 ng/mL TPOを添加したX-VIVO 15培地にて４日間分化誘導培養することで得た半浮遊状の細胞集塊を回収して、CD11b抗体を固定化した磁気ビーズを用いてCD11b陽性分画を純化した。このCD11b陽性分画にDiIをラベルしたアセチル化LDLを取り込ませ、マトリゲル上にて10 % FBSを添加したEGM2-MV培地で７日間培養した。その結果、可視化された細胞が管腔を形成することが確認された（図２２）。

（２）
ヒト末梢血単核球をX‐VIVO 15（50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGFを添加）に20 ng/mL TPOを添加して、４日間培養したときに得られるスフェロイド状の細胞集塊を回収してAnnexin‐Vを標識した磁気ビーズを用いて死細胞を除去した後に、CD11b陽性細胞を磁気ビーズによって純化した（CD11b⁺ cultured MNC）。PBS、分化誘導培養を行わないCD11b陽性細胞（fresh CD11b⁺）、分化誘導培養を行った単核球（cultured MNC）をコントロールとして用いた。８週齢、メスのBalb/c nude mouseを用いて右大腿動脈を２カ所結紮して作成した下肢虚血モデルを作成して、３日後に各群3 x10⁵個を増殖因子濃度の低いマトリゲル（growth factor reduced matrigel; BD354230）に懸濁して、５カ所に分けて虚血肢に局注した。２週間後の虚血肢及び健側肢の写真を示す（図２３−１）。

細胞移植の２週間後にBS1‐lectinを心注し、５分間放置後に4%パラフォルムアルデヒドを用いて環流固定し、虚血肢を回収した。4%パラフォルムアルデヒドによる後固定を行い（３時間、４℃）、パラフィンに包埋して組織切片を作成した。虚血近傍（虚血に伴う炎症性細胞浸潤がみられる領域の近傍；border ischemic zone）における反応性血管新生（機能血管）を抗BS1‐lectin抗体で免疫組織学的に検出した蛍光顕微鏡写真（対物２０倍）を示す（図２３−２：下段はDAPIによる核染色とのmerge imageである。スケールは100μm）。

BS1‐lectinによって可視化された虚血域近傍の機能血管をImageJ softwareを用いて定量した。筋線維に沿った微少血管をカウントし、血管密度を算出した（図２３−３）。

最終的に、コントロール（control; マトリゲルの移植）では全例（8/8）において阻血に伴う足部壊死が見られたが、治療群ではすべての個体で足部壊死に伴う下肢短縮を回避することができた（0/6）。一方で、ヒト末梢血単核球のうち磁気ビーズによって純化したCD11b陽性細胞（fresh CD11b⁺）、またヒト末梢血単核球を培養皿で50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGF、20 ng/mL TPOを添加したX-VIVO 15培地にて４日間分化誘導培養することで得た半浮遊状の細胞集塊のうち死細胞除去処理を施して得た細胞（cultured MNC）3 x10⁵個を同様に下肢虚血マウスに対して移植したが、虚血の改善効果は認められなかった。

（３）
上記した方法にしたがい、下肢虚血マウスに磁気ビーズによって純化したCD11b陽性細胞（CD11b⁺from cultured MNC）、分化誘導培養を行わないCD11b陽性細胞（fresh CD11b⁺）、分化誘導培養を行った単核球（cultured MNC）、マトリゲル（コントロール）を移植し、下肢結紮１４日後にレーザードップラーによる血流評価（治療直後の虚血肢／健側肢比の改善割合）を実施した。

その結果、コントロール群（n=11）22.6±8.3 %、分化誘導培養を行わないCD11b陽性細胞移植群（n=7）29.8±6.9 %、分化誘導培養を行った単核球移植群（n=7）27.9±5.7 %に対して、CD11b陽性細胞移植群（n=8）では42.6±10.9 %と、下肢虚血の有意な回復の促進が見られた（図２４）。

考察：
以上の結果から、ヒト末梢血単核球自体（CD11b陽性細胞群も含めて）が有する血管新生能に比較して、この細胞から分化誘導されるCD11b陽性細胞群は新生血管の構造的・機能的な安定化を促進する能力を有し、下肢虚血を著名に改善しうることが確認された。

実施例６：多発性骨髄腫患者末梢単核球由来CD11b陽性細胞における定量的RT-PCRによる遺伝子発現解析
化学療法後にG-CSFの投与を受け、末梢血幹細胞移植の細胞採取時に回収された多発性骨髄腫患者の末梢血単核球よりCD11b陽性細胞を磁気ビーズによって純化した分画（fre CD11b）、及びこれらのCD11b陽性細胞を50 ng/mL VEGF、50 ng/mLbFGFを添加したX-VIVO 15培地にて20% 酸素下（cul CD11b in 20% O₂）、5% 酸素下（cul CD11b in 20% O₂）で４日間の分化誘導培養を行った。

各分画における遺伝子発現をTaqMan法による定量的RT-PCRによって解析したところ、４日間の培養によってCXCR4、PDGFRbβ、Tie2の発現増強がみられ、この誘導は低酸素環境下での培養によってより増強された（図２５）。VE-cadherinの発現増強は認められなかった。

考察：
このことから、骨髄より動員された末梢血CD11b陽性単核球は特に低酸素環境下での分化誘導培養によって新生血管の安定化に関わる周皮細胞（pericyte）への分化が促進されることが示唆された。また、培養によってCXCR4やTie2の発現が高くなることから、SDF-1やAngiopoietin-1およびAngiopoietin-2が産生されるがん微少環境への集積能が高まること、さらに同部位に局在した後のこれらのリガンドによる活性化を受けやすい状態になると考えられる。

本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

本発明にかかる細胞群は、患者の末梢血から比較的容易に採取可能な単核球をソースとして、動物血清を使用しない条件下で分化誘導される。したがって、本発明にかかる細胞群は、感染の危険がなく、臨床応用可能な安全な細胞製剤として有用である。また本発明は、希少な（造血）幹細胞を利用した従来の血管再生治療の代替方法として有用である。

Claims

単核球細胞群を、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）、及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）を含む無血清培地を用いて培養することにより分化誘導される、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３１及びＣＸＣＲ４を発現していることを特徴とする血管再生能を有する細胞群。
無血清培地が、さらにトロンボポイエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＴＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ；Ｇ−ＣＳＦ）、及びＦＭＳ−ｌｉｋｅｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ３ｌｉｇａｎｄ（ＦＬＴ３Ｌ）から選ばれる１以上を含む、請求項１記載の細胞群。
半浮遊状の細胞群として得られることを特徴とする、請求項１又は２記載の細胞群。
単核球が末梢血、骨髄、又は臍帯血由来であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞群。
培養が低酸素条件下で行われることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞群。
低酸素条件が１％〜１０％の酸素濃度の条件であることを特徴とする、請求項５に記載の細胞群。
ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＴＰＯを含む培地を用いて培養することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞群。
新生血管の安定化あるいは成熟化の促進を介して血管再生能を有することを特徴とする、請求項７記載の細胞群。
請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞群を含む、血管再生治療用細胞製剤。
虚血改善及び／又は血管成熟効果を有することを特徴とする、請求項９記載の細胞製剤。
請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞群を含む、がんの局在診断剤。
以下の工程を含む、血管再生能を有する細胞群の調製方法：
１）単核球細胞群を、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）、及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）を含む無血清培地を用いて培養する
２）前記培養によって得られる細胞集塊からＣＤ１１ｂを発現している細胞群を回収する。
無血清培地が、さらにトロンボポイエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＴＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ；Ｇ−ＣＳＦ）、及びＦＭＳ−ｌｉｋｅｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ３ｌｉｇａｎｄ（ＦＬＴ３Ｌ）から選ばれる１以上を含む、請求項１２記載の方法。
半浮遊状の細胞群として得られることを特徴とする、請求項１３記載の方法。
培養が低酸素条件下で行われることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
低酸素条件が１％〜１０％の酸素濃度の条件であることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＴＰＯを含む培地を用いて培養することを特徴とする、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。