JPWO2010116665A1 - 単核球由来の新規血管再生細胞群及びその分化誘導法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の細胞群は、無血清培地を用いて培養されることが好ましい。
本発明の細胞群は、さらに、CD31及びCXCR4を発現していることを特徴とする。また、CD105も発現していることを特徴とする。
用いられる単核球としては、末梢血、骨髄、又は臍帯血由来の単核球が挙げられる。
本発明の細胞製剤は、虚血改善及び/又は血管成熟効果を有することを特徴とする。
本発明はまた、上記した本発明の細胞群を含む、がんの局在診断剤も提供する。
1)単核球細胞群を、血管内皮細胞増殖因子(vascular endothelial growth factor; VEGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth factor: bFGF)、トロンボポイエチン(thrombopoietin; TPO)、顆粒球コロニー刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor; G-CSF)、及びFMS-like tyrosine kinase 3 ligand(FLT3L)から選ばれる1以上を含む培地を用いて培養する
2)前記培養によって得られる細胞集塊からCD11bを発現している細胞群を回収する。
本発明の細胞群(Cell Population)は、哺乳動物の単核球から分化誘導される、血管再生能を有するCD11b陽性の細胞集団である。
本発明の細胞群は「単核球」に由来する。「単核球」とは、結合組織、リンパ組織、血流中に広く分布する単核の間葉系細胞群で、単球やリンパ球に代表される遊走単核白血球と組織中に存在するマクロファージに代表される単核貪食系の細胞群に分類される。本発明で用いられる単核球としては、前者に属する末梢血、骨髄、又は臍帯血由来の単核球(白血球)が好ましい。特に、豊富に存在し、取得が容易である点において、末梢血由来の単核球が好ましい。
本発明の細胞群は、上記のようにして調製した単核球細胞群を、適切な「サイトカイン」を含む無血清培地を用いて分化誘導培養することにより調製される。サイトカインを添加することにより、単核球は無血清培地においても好適に増殖し、目的とする血管再生能を有する細胞へと分化誘導される。また、用いられる培地は血清を含まないため、感染等の恐れがなく、調製された細胞群(細胞製剤)は、そのまま臨床応用に供することができる。
本発明の細胞群は、無血清培地を用いた培養により、接着性の弱い、半浮遊(スフェロイド)状の細胞集塊として得られる。この細胞群は、再播種して血清(患者の自己血清等)存在下で培養すると接着性の強い紡錘形をした付着性細胞となる。
本発明の細胞群は、CD11bを発現していることを特徴とする。
「CD11b」は、主として単球及びリンパ球に発現している血球分化抗原のひとつである。CD11b陽性細胞には、マクロファージや樹状細胞、NK細胞等のような免疫細胞やリンパ球のほか、がん等において見られる異常な新生血管の細胞、CD31抗原陽性の血管内皮細胞あるいはsmooth muscle actin(SMA)抗原陽性の壁細胞へと分化する比較的未分化な細胞も含まれる。これまでの報告は、CD11b発現細胞が血管新生促進効果を有する細胞に分化するなど、血管新生において重要な役割を担っている可能性は示唆するものの(前掲)、これが最終的に血管内皮細胞へと分化する場合とそうでない場合の両方がありうることを示す。
本発明の細胞群は、血管内皮細胞には直接分化しないが、新生血管の安定化と成熟化を促進することで、血管再生を促し虚血や組織修復をもたらす。すなわち、がんなどの虚血領域を有する生体に全身あるいは局所投与すると、新生血管の周辺に分布し、周被細胞による新生血管(微少血管)内皮細胞の裏打ちを増強すること等によって血管の安定化や成熟化を促進する。
本発明の細胞群は、単核球細胞群から以下の工程により調製される。
1)単核球細胞群を、血管内皮細胞増殖因子(vascular endothelial growth factor; VEGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth factor: bFGF)、トロンボポイエチン(thrombopoietin; TPO)、顆粒球コロニー刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor; G-CSF)、及びFMS-like tyrosine kinase 3 ligand(FLT3L)から選ばれる1以上を含む無血清培地を用いて培養する
2)細胞集塊からCD11bを発現している細胞群を回収する。
各組織からの単核球の分離は、市販のキット等を用いて、周知の方法により容易に実施できる。たとえば、採取した血液を適宜希釈し、あらかじめ分離液が入った遠心管に入れ、1500rpm程度で遠心して、比重の違いにより分離する。リンパ球・単球から成る末梢血単核細胞は、血漿(黄色味を帯びる)と分離液(透明)の中間に、白い帯状の層として回収される。
本発明で用いられる培地は、単核球の培養に適した培地である限り、特に限定されない。標準的な培地としては、MEM培地、BME培地、DME培地、α−MEM培地、IMEM培地、ES培地、DM−160培地、Fisher培地、F12培地、WE培地、RPMI培地、StemSpan培地、StemPro培地及びこれらの混合物を挙げることができる。あるいは市販のリンパ球培養用培地:たとえばGT-T培地(タカラバイオ)、AIM V培地(インビトロジェン)、Tリンパ球培養用培養液(コスモバイオ)、X-VIVO培地(Lonza社製)、市販の血管内皮細胞用培地:たとえばEGM-2培地やEBM-2培地等を挙げることができる。
単核球細胞群からの「分化誘導」は、適切な「サイトカイン」を、前記した無血清培地に添加して培養することにより行われる。サイトカインにより、単核球は無血清培地においても好適に増殖し、目的とする血管再生能を有する細胞へと分化誘導される。
培養は、表面処理した培養皿等を用いて、通常リンパ球の培養に用いられる条件において行われる。すなわち、温度37℃、酸素濃度20%である。
無血清培地を用いた培養により、接着性の弱い、半浮遊(スフェロイド)状の細胞集塊として得られる。この細胞集塊からCD11bを発現している細胞を回収する。CD11bを発現している細胞の回収は、常法にしたがいCD11b抗体を用いて容易に実施できる。たとえば、CD11b抗体で標識された磁気ビーズ、蛍光標識されたCD11b抗体を用いたセルソーターによる分離、あるいはCD11b抗体を固相化したカラムなどを用いて、CD11b陽性細胞を分離すればよい。CD11b抗体は、市販のものを利用してもよいし、常法にしたがいCD11bあるいはその部分ペプチドを用いて作製してもよい。
3.1 血管再生治療用細胞製剤
本発明の細胞群は、血管内皮細胞には直接分化しないが、新生血管の安定化と成熟化を促進することで、血管再生を促し虚血や組織修復をもたらす。
本発明の細胞群は腫瘍組織や虚血領域への選択的指向性を有する。それゆえ、本発明の細胞群をナノ粒子等で標識すれば、虚血、転移巣を含むがんの局在をみる画像診断に応用することができる。細胞の標識は、常法にしたがい、磁性体や蛍光色素等で標識することにより簡単に行うことができる。
本発明の細胞群は腫瘍組織への選択的指向性があるため、抗がん剤や腫瘍細胞に対して細胞障害性を有するタンパク質や薬剤などのキャリアーとして利用できる可能性がある。
マウス骨髄から、以下のようにして単核球を調製した。マウスの大腿骨などを乳鉢とDPBSE(5mMの濃度でEDTAを含有したPBS)を用いて破砕し、骨髄液を採取した。採取した骨髄液から径70μmのメンブレンフィルターを用いてろ過して骨髄細胞懸濁液を集め、DPBSE10mlに懸濁し、この懸濁液を4mlのHistopaque 1083(Sigma社)が入った15mlの遠心チューブに静かに重層した。この混合物を用いて密度勾配遠心分離(400g、20分間、室温)した後、中間に層状になった細胞をピペットにより採取して骨髄単核球(BM−MNC)を単離した。
・EGM2-MV培地:EGF, VEGF, IGF, bFGFを含む(増殖因子の濃度は非公開;Lonza社製)
・培養条件:20 %酸素、5 % CO2、37℃にて4日間培養し、付着細胞を室温にて浮遊させコーティング処理を施さない新しいUpCell培養皿に再播種して、3日後に付着細胞を再度浮遊させて回収した。
マウス骨髄単核球から分化誘導された付着細胞群の血管形成に対する影響について検討した。
前項で得られた付着細胞をGFPで標識し、増殖因子の含有量の少ないマトリゲル上でマウス血管内皮細胞株MS-1と同様の培地を用いて共培養した。その結果、培養単核球の添加により、MS-1の管腔形成が促進されることが確認された(図1)。
前項で得られた付着細胞105個を4日の間隔で合計3回、ヒト膵癌細胞株KP-1Nを皮下移植した担がんヌードマウスに対して経静脈的に移植した。すなわち、腫瘍径が8 mm以上に達した時点で、培養単核球5 x 105個を経静脈的に移植し、1週間後に腫瘍組織を回収して、腫瘍血管を免疫組織学的に解析した。
また、CD31抗体(血管内皮細胞;赤)、核染色(青)を行い、GFPで蛍光標識(緑)して移植単核球の局在をみた。その結果、移植細胞は腫瘍血管の周辺(perivascular area)に分布するだけで、血管内皮細胞には分化しないことが確認された(図2−2)。
上記(2)で得られた腫瘍よりRNAを抽出し、TaqManプローブを用いた定量的RT-PCRによって癌細胞由来(ヒト膵癌細胞KP-1N)の遺伝子発現を解析した(図3)。その結果、CA9の発現が顕著に減少する一方、hENTの発現は上昇し、幹細胞マーカーであるOct4、薬剤耐性に関わるMDR-1、ABCG2などの発現が低下することが確認された。
以上の結果から、血清を添加したEGM2-MV培地を用いて単核球を分化誘導して得られる付着細胞は、新生血管の安定化を促進させ、腫瘍血管の構造的異常性を修正しうることが確認された。
実施例1と同様にして、マウス骨髄から単核球を調製した。次いで、取得したマウス骨髄単核球からCD11b抗体を固定化した免疫磁気ビーズ(ミルテニーバイオテク社製)を用いてCD11b陽性分画を調製した。
CD11b陽性分画の細胞では、全単核球と同様に紡錘形の付着細胞が観察された。一方、同様の形態を有する細胞は、CD11b陰性分画を用いた場合には極めて少なかった(図4)。このことから、培養初期に見られる紡錘形細胞は単球由来であると考えられた。
CD11b陽性分画の細胞を、ラットvitronectin処理した培養皿で10 % FBSを添加したEGM2-MV培地において3週間培養したところ、細胞の膨化と進展がみられたが、増殖傾向は示さなかった。すなわち、CD11b陽性細胞は培養の早期段階より紡錘形の付着細胞として観察されるがコロニー形成が弱く、増殖能に乏しい(図5上段)。
以上の結果から、従来血管内皮前駆細胞(EPC)と呼ばれてきた細胞は、CD11b陰性分画のうち特にLineage陰性c-Kit陽性分画に由来し、一方初期付着細胞の多くは、CD11b発現細胞であると思われた。
健常ボランティアから得た末梢血30mLにDPBSEを20mLを添加して、20℃、400×g で 35分間遠心し、バフィーコートを回収して20mLのDPBSEに再懸濁した後に、Histopaque 1077(Sigma社製)を用いて密度勾配遠心分離(400g、20分間、室温)した後、中間に層状になった細胞をピペットにより採取して、単核球を単離し、ヒトフィブロネクチンをコーティングしたプレート上で、微小血管内皮細胞用培地EGM2−MV培地キット(Lonza社製)で補完したEBM−2を用いて4〜7日間培養し、付着細胞を得た。
ヒト末梢血単核球をヒトfibronectin処理した培養皿で10 % FBSを添加したEGM2-MV培地にて分化誘導培養した。1週間程度の培養期間においては類円形から紡錘形の形態を良く維持するが、2週間程度の培養を行うと膨化・伸展といった老化現象を示し生存率は著しく低下することが確認された(図6)。EGM2-MV培地組成と培養条件は実施例1と同じである。
5 %又は1 % FBSを添加したEGM2-MV培地にアセチル化LDLでラベルしたDiI-acLDLを加え、前項と同様に、ヒト末梢血単核球をヒトfibronectin処理した培養皿で分化誘導培養した。アセチル化LDLの取り込みによって可視化した付着細胞は、5 %の低酸素環境で培養することによって、膨化や伸展などの老化現象が軽減され、細胞の生存率が向上すること、また血清依存性が低下することが確認された(図7)。
20%自家血清を添加したX-VIVO 15培地(1 ng/mL ヒトVEGFも添加)を用いて、ヒト末梢血単核球をヒトfibronectin処理した培養皿で分化誘導培養した。X-VIVO 15培地は末梢血及びヒト腫瘍から分離された精製CD3+リンパ球の他、ヒト単球、マクロファージ及び各種細胞株、顆粒球、及びナチュラルキラー(NK)細胞の培養に適している。培養は、20 %酸素、5 % CO2、37℃にて実施した。得られた付着細胞は、20 %自家血清を添加したEGM2-MV培地によって得た細胞に比較して、培養開始から2週間後に観察される細胞の老化現象が低いレベルに抑えられることが確認された(図8)。
5 %自家血清と10 ng/mLのVEGF、10 ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth factor: bFGF)を添加したX-VIVO 15培地を用いて、前項と同様に、ヒト末梢血単核球をヒトfibronectin処理した培養皿で7日間分化誘導培養した。得られた付着細胞は、紡錘形の形態を示した(図9)。
5 %自家血清と10 ng/mLのVEGF、10 ng/mLのbFGFを添加したX-VIVO 15培地を用いて、前項と同様に、ヒト末梢血単核球をヒトfibronectin処理した培養皿で7日間分化誘導培養した。得られた付着細胞について、フローサイトメトリーを用いて表面マーカーの発現を確認した。その結果、付着細胞は細胞膜上にCD11b、CD14、CD31、CD105、CD146、VEGF受容体2(VEGFR2)、SDF-1受容体(CXCR4),G-CSF受容体を発現することが確認された(図10)。
0, 1, 5, 10 %自家血清と10 ng/mLのVEGF、10 ng/mLのbFGFを添加したX-VIVO 15培地に、アセチル化LDLでラベルしたDiI-acLDLを添加し、ヒト末梢血単核球をpoly-L-lysine(PLL)処理した培養皿で14日間分化誘導培養を行った。その結果、無血清条件下においても接着は弱いがDiIラベルしたアセチル化LDLの取り込みによって可視化される生細胞が存在することが確認された(図11)。
ヒト末梢血単核球を培養皿で50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGFを添加したX-VIVO 15培地にて1週間分化誘導培養した。その結果、無血清状態では半浮遊状(スフェロイド状)の細胞集塊が出現することが確認された。これらの細胞集塊は細胞接着性が弱いのに対し、10 %自家血清の存在下では、類円形から紡錘形の形態を示す細胞集塊が得られ、細胞の接着性が増強し、細胞面積は増大することが確認された(図12)。これら、血清含有培地で見られる接着細胞はacLDLの取り込み能を有するものの、CD11b陽性かつ、単球系マーカーであるCD14などを発現するためEPCとは言えないと思われた。
ヒト末梢血単核球を培養皿で50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGF、0-100 ng/mL FMS-like tyrosine kinase 3 ligand(FLT3L)を添加したX-VIVO 15培地にて1週間分化誘導培養した。その結果、半浮遊状の細胞集塊の数はFLT3Lの濃度依存性に増加することが確認された(図13)。
ヒト末梢血単核球を培養皿で50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGF、0-100 ng/mL 顆粒球増殖因子(granulocyte-colony stimulating factor; G-CSF)を添加したX-VIVO 15培地にて1週間分化誘導培養した。その結果、半浮遊状の細胞集塊の数がG-CSFの濃度依存性に増加することが確認された(図14)。
ヒト末梢血単核球を培養皿で50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGF、0-100 ng/mL TPOを添加したX-VIVO 15培地にて1週間分化誘導培養した。その結果、半浮遊状の細胞集塊の数がthrombopoietin(TPO)の濃度依存性に増加することが確認された(図15−1)。また、培養4日目における細胞集塊の数をサイズごとに計測し、定量的に解析した結果、TPOの添加によって、サイズの大きな細胞集塊の数が増大し、特に10‐100 ng/mLを添加した際にサイズが大きな細胞集塊の出現頻度が増加する傾向が得られた(図15−2)。この実験結果から、培地に添加するTPOの至適濃度は10‐100 ng/mLと考えられた。
ヒト末梢血単核球を培養皿で50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGF、0-100 ng/mL TPOを添加したX-VIVO 15培地にて1週間分化誘導培養することで得た半浮遊状の細胞集塊を回収し、PLL処理した培養皿で20 % FBSを添加したEGM2-MV培地に再播種して3日間培養した。その結果、紡錘形の形態を呈する付着細胞が得られること、さらに100 ng/mL TPOの存在下で分化誘導培養を行った場合に、再播種後の付着細胞数が最も増加することが確認された(図16)。
ヒト末梢血単核球を培養皿で50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGF、100 ng/mL TPOを添加したX-VIVO 15培地にて、20%あるいは5%酸素濃度のもとで1週間分化誘導培養して得た半浮遊状の細胞集塊を回収し、PLL処理した培養皿で20 % FBSを添加したEGM2-MV培地に再播種して3日間培養した。その結果、紡錘形の形態を呈する付着細胞が得られること、さらにこれらがDiIをラベルしたアセチル化LDLの取り込みによって可視化されることが確認された。また、初期培養を5 %の酸素濃度下(低酸素培養)で行った場合に、再播種後の付着細胞数が増加することが確認された(図17)。
自家末梢血幹細胞移植のための細胞採取時に、化学療法後にG-CSFの投与を受けて、骨髄からの前駆細胞の動員を行った多発性骨髄腫の患者より得た末梢血単核球、磁気ビーズによって純化したCD11b陽性細胞及びCD11b陰性細胞を50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGFを添加したX-VIVO 15培地にて4日間分化誘導培養した。その結果、CD11b陽性細胞においてスフェロイド状の細胞集塊の形成が高頻度にみられた(図18)。また、一部に紡錘形の付着細胞も観察された。
以上の結果から、目的とする血管新生能力を有する細胞の分化誘導には、EGM2-MV培地よりもX-VIVO 15培地のほうが適していること。また、低酸素条件下での培養やbFGFの添加によって、細胞の生存率が向上することが示唆された。
また、FLT3L、G-CSF、TPOの添加(無血清培養時)によって濃度依存的に目的とする血管新生能力の回収率が向上することが確認された。さらに低酸素条件下での分化誘導培養によって、血性存在下での接着性が飛躍的に高まることから、生体内においても目的とする虚血部位などにおける局在能が増強することが予測される。また、末梢血単核球の採取に際して、G-CSFの前投与が行われることで、スフェロイドの形成能が高まり、より効果的に目的とする血管安定化細胞が得られることが期待できる。
さらに、単核球から分化誘導される細胞群のうち、CD11b陽性分画が初期付着細胞の主要なソースであることが示唆された。
(1)
ヒト末梢血単核球を2 color フローサイトメトリーで解析した。ヒト末梢血単核球のCD11b陽性分画は、CD11bdim及びCD11bbrightからなり、前者はCD31dim/CD14-(主としてリンパ球)、後者はCD31bright/CD14+(主として単球)であった(図19−1)。なお、「dim」は、免疫染色が弱く、マーカーの発現量が比較的少ないこと、「bright」は免疫染色が強く、マーカーの発現量が比較的多いことを示す。
ヒト末梢血単核球を培養皿で50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGFを添加したX-VIVO 15培地にて4日間分化誘導培養し、2 color フローサイトメトリーで解析した。CD11bdim分画はCXCR4、CD31を発現しており、c‐Kit陽性細胞もわずかながら検出された(図19−2)。また、CD11bbright分画はCD14、CD31、CD105、CXCR4を発現しており、c‐Kit、Flk‐1陽性細胞もわずかながら検出された。(図19−3)。
ヒト末梢血単核球を血清を加えないX-VIVO 15(50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGFを添加)で4日間分化誘導培養を行い、CD11b陽性細胞を磁気ビーズにてソーティングした。
2 colorフローサイトメトリー法によってCD11b陽性分画の表面マーカーの発現を解析したところ、CD14陽性細胞が主体であった(図19−5)
ヒト末梢血単核球から磁気ビーズによってCD11b陽性分画を純化し、これらにおけるG-CSF受容体、TPO受容体ならびにVE-cadherin mRNAの発現をCD11b陰性分画及び単核球全体と比較解析を行った結果、G-CSF受容体、VE-cadherinの発現がCD11b陽性分画に高かったが、逆にTPO受容体の発現はCD11b陰性分画で高かった(図20)。
化学療法後にG-CSFの投与を受け、末梢血幹細胞移植の細胞採取時に回収された多発性骨髄腫患者の末梢血単核球、及びこれらを血清を加えないX-VIVO 15(50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGFを添加)で4日間分化誘導培養を行った細胞を、それぞれCD11b陽性細胞を磁気ビーズにてソーティングして、2 colorフローサイトメトリー法によってCD11b陽性分画のCD14の発現及びUEA-lectinに対する親和性を解析した(図21−1)。
自家末梢血幹細胞移植のための細胞採取時に、化学療法後にG-CSFの投与を受けて、骨髄からの前駆細胞の動員を行った多発性骨髄腫の患者より得た末梢血単核球から磁気ビーズによってCD11b陽性細胞に分離した細胞(fresh CD11b+)と、これらを50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGFを添加したX-VIVO 15培地にて4日間分化誘導培養して得た細胞よりそれぞれRNAを抽出し、TPO受容体mRNAを定量的RT-PCRによって解析した。その結果、TPO受容体の発現量は培養前に比較して100倍以上となった。また、CD11b陽性細胞におけるG-CSF受容体の発現は分離前の単核球に比較して著しく高かったが、分化誘導培養による発現の増強はみられなかった。一方で、CD11b陽性細胞におけるCXCR4の発現は約3倍に増強した(図21−2)。
以上より、CD11b陽性分画のうち、CD11bdim/CD31dim/CD14-/CXCR4+又はCD11bbright/CD14+/CD105+の存在が血管安定化作用を有する細胞集塊の分化誘導に重要である可能性が示唆された。
また、G-CSFの投与によって骨髄より動員された末梢血単核球のCD11b陽性分画はVEGF等を添加した無血清培地において高いコロニー形成能を有することから、新生血管の安定化を誘導する細胞のソースとしてより好ましいと考えられた。さらにCXCR4の発現増強がみられることから、虚血組織への局在能が増強されることが期待できる。分化誘導の過程においてCD14の発現が低下し、UEA-lectinに対する親和性が増強する意義については、さらなる検討が必要である。
(1)
ヒト末梢血単核球を培養皿で50 ng/mLのVEGF、50 ng/mLのbFGF、20 ng/mL TPOを添加したX-VIVO 15培地にて4日間分化誘導培養することで得た半浮遊状の細胞集塊を回収して、CD11b抗体を固定化した磁気ビーズを用いてCD11b陽性分画を純化した。このCD11b陽性分画にDiIをラベルしたアセチル化LDLを取り込ませ、マトリゲル上にて10 % FBSを添加したEGM2-MV培地で7日間培養した。その結果、可視化された細胞が管腔を形成することが確認された(図22)。
ヒト末梢血単核球をX‐VIVO 15(50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGFを添加)に20 ng/mL TPOを添加して、4日間培養したときに得られるスフェロイド状の細胞集塊を回収してAnnexin‐Vを標識した磁気ビーズを用いて死細胞を除去した後に、CD11b陽性細胞を磁気ビーズによって純化した(CD11b+ cultured MNC)。PBS、分化誘導培養を行わないCD11b陽性細胞(fresh CD11b+)、分化誘導培養を行った単核球(cultured MNC)をコントロールとして用いた。8週齢、メスのBalb/c nude mouseを用いて右大腿動脈を2カ所結紮して作成した下肢虚血モデルを作成して、3日後に各群3 x105個を増殖因子濃度の低いマトリゲル(growth factor reduced matrigel; BD354230)に懸濁して、5カ所に分けて虚血肢に局注した。2週間後の虚血肢及び健側肢の写真を示す(図23−1)。
上記した方法にしたがい、下肢虚血マウスに磁気ビーズによって純化したCD11b陽性細胞(CD11b+ from cultured MNC)、分化誘導培養を行わないCD11b陽性細胞(fresh CD11b+)、分化誘導培養を行った単核球(cultured MNC)、マトリゲル(コントロール)を移植し、下肢結紮14日後にレーザードップラーによる血流評価(治療直後の虚血肢/健側肢比の改善割合)を実施した。
以上の結果から、ヒト末梢血単核球自体(CD11b陽性細胞群も含めて)が有する血管新生能に比較して、この細胞から分化誘導されるCD11b陽性細胞群は新生血管の構造的・機能的な安定化を促進する能力を有し、下肢虚血を著名に改善しうることが確認された。
化学療法後にG-CSFの投与を受け、末梢血幹細胞移植の細胞採取時に回収された多発性骨髄腫患者の末梢血単核球よりCD11b陽性細胞を磁気ビーズによって純化した分画(fre CD11b)、及びこれらのCD11b陽性細胞を50 ng/mL VEGF、50 ng/mLbFGFを添加したX-VIVO 15培地にて20% 酸素下(cul CD11b in 20% O2)、5% 酸素下(cul CD11b in 20% O2)で4日間の分化誘導培養を行った。
このことから、骨髄より動員された末梢血CD11b陽性単核球は特に低酸素環境下での分化誘導培養によって新生血管の安定化に関わる周皮細胞(pericyte)への分化が促進されることが示唆された。また、培養によってCXCR4やTie2の発現が高くなることから、SDF-1やAngiopoietin-1およびAngiopoietin-2が産生されるがん微少環境への集積能が高まること、さらに同部位に局在した後のこれらのリガンドによる活性化を受けやすい状態になると考えられる。
Claims (17)
- 単核球細胞群を、血管内皮細胞増殖因子(vascular endothelial growth factor; VEGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth factor: bFGF)、トロンボポイエチン(thrombopoietin; TPO)、顆粒球コロニー刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor; G-CSF)、及びFMS-like tyrosine kinase 3 ligand(FLT3L)から選ばれる1以上を含む培地を用いて培養することにより分化誘導される、CD11bを発現していることを特徴とする細胞群。
- 培地が無血清培地であることを特徴とする、請求項1記載の細胞群。
- さらに、CD31及びCXCR4を発現していることを特徴とする、請求項1又は2記載の細胞群。
- 単核球が末梢血、骨髄、又は臍帯血由来であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の細胞群。
- 培養が低酸素条件下で行われることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の細胞群。
- 低酸素条件が1%〜10%の酸素濃度の条件であることを特徴とする、請求項5に記載の細胞群。
- VEGF、bFGF、及びTPOを含む培地を用いて培養することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の細胞群。
- 血管再生能を有することを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の細胞群。
- 新生血管の安定化あるいは成熟化の促進を介して血管再生能を有することを特徴とする、請求項8記載の細胞群。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の細胞群を含む、血管再生治療用細胞製剤。
- 虚血改善及び/又は血管成熟効果を有することを特徴とする、請求項10記載の細胞製剤。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の細胞群を含む、がんの局在診断剤。
- 以下の工程を含む、血管再生能を有する細胞群の調製方法:
1)単核球細胞群を、血管内皮細胞増殖因子(vascular endothelial growth factor; VEGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth factor: bFGF)、トロンボポイエチン(thrombopoietin; TPO)、顆粒球コロニー刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor; G-CSF)、及びFMS-like tyrosine kinase 3 ligand(FLT3L)から選ばれる1以上を含む培地を用いて培養する
2)前記培養によって得られる細胞集塊からCD11bを発現している細胞群を回収する。 - 培地が無血清培地であることを特徴とする、請求項13記載の方法。
- 培養が低酸素条件下で行われることを特徴とする、請求項14記載の方法。
- 低酸素条件が1%〜10%の酸素濃度の条件であることを特徴とする、請求項15記載の方法。
- VEGF、bFGF、及びTPOを含む培地を用いて培養することを特徴とする、請求項13〜16のいずれか1項に記載の方法。
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