JP2005187435A - 血小板産生促進組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 グリコサミノグリカン、又はグリコサミノグリカンとトロンボポエチンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来CD34陽性巨核球前駆細胞増殖促進活性化剤、該巨核球成熟促進活性化剤、該巨核球血小板産生促進活性化剤、該活性化剤を含有する医薬。
【選択図】 図1
Description
発明者らは、ヒト臍帯血由来CD34陽性巨核球前駆細胞に対するトロンボポエチンとグリコサミノグリカンの作用を報告している。(例えば、非特許文献1参照)。
YAKUGAKU ZASSHI 121(9)691−699(2001)。
本発明の課題は、ヒト末梢血由来CD34陽性巨核球前駆細胞の増殖を促進する活性化剤を提供することにある。
本発明の課題は、ヒト末梢血由来CD34陽性巨核球の成熟を促進する活性化剤を提供することにある。
本発明の課題は、ヒト末梢血由来CD34陽性巨核球の血小板産生を促進する活性化剤を提供することにある。
1.グリコサミノグリカンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来CD34陽性巨核球前駆細胞増殖促進活性化剤。
4.グリコサミノグリカン及びトロンボポエチンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来CD34陽性巨核球前駆細胞増殖促進活性化剤。
5.グリコサミノグリカン及びトロンボポエチンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来CD34陽性巨核球成熟促進活性化剤。
6.グリコサミノグリカン及びトロンボポエチンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来CD34陽性巨核球血小板産生促進活性化剤。
7.上記1〜6の活性化剤を含有する医薬。
8.上記1〜6の活性化剤を含有する血小板産生医薬。
グリコサミノグリカンの1%水溶液5μlを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によるゲル濾過で分析した。カラムはTSKgel−(G4000+G3000+G2500)PWX(東ソー、7.8mm×30cm)を用い0.2M塩化ナトリウムを使用して、40℃、0.6ml/分の流速で展開した。各種グリコサミノグリカンの分子量標準品を対照にして求めた。
本発明で「トロンボポエチン活性」とは、巨核球前駆細胞の増殖、巨核球の成熟、血小板産生を促進する活性をいう。
本発明のグリコサミノグリカンを活性成分とする医薬は、活性成分として通常0.01〜100mg/kg体重を、病状、性別および投与経路等に応じて、1日1回〜数回程度に分けて投与することができる。
さらには、制癌剤や免疫抑制剤の投与による化学療法や放射線療法、あるいは骨髄移植(BMT)や末梢血幹細胞移植術(PBSCT)、臍帯血移植(CBSCT)施行患者における血小板減少症の治療剤が提供される。
例えば、先天性のファンコニ貧血、化学療法や放射線療法に伴う再生不良性貧血、骨髄異型性症候群、急性骨髄性白血病または骨髄移植のような骨髄形成不全による血小板減少症などが挙げられ、このような患者の血小板の回復を促進する為に用いることもできる。
また、トロンボポエチン産生異常による血小板減少症にも有用である。血小板や巨核球の寿命短縮による血小板減少症としては例えば、突発性血小板減少性紫斑病、後天性免疫不全症候群(AIDS)、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少症等があり、このような患者の血小板回復促進にも有用である。
さらに、例えば他の化学薬品または医薬品、または治療的処置による一過性の血小板の欠損または損傷によってもたらされた血小板障害の治療にも有用である。そのような患者で新しい無傷の血小板の放出を促進するのに用いることができる。さらにトロンボポエチンの主たる産生臓器の一つが肝臓であることが明らかにされていることから、血小板減少をきたす各種の肝臓病、例えば、胆道閉鎖症、肝臓移植、肝硬変、肝炎等にも投与の臨床応用が期待される。さらに、保存血小板の止血血栓形成能を回復させる用途としても有用である。
本発明では全て以下に示した生化学工業株式会社製のグリコサミノグリカンを使用した。
ヒアルロン酸ナトリウム塩(HA−h:from human umbilical cord、HA−p:from pig skin、HA−r:from rooster comb)、ケラタン硫酸ナトリウム塩(KS:from bovine cornea)、コンドロイチン硫酸(CS−A:from whale cartilage、CS−C:from shark cartilage、CS−D:from shark cartilage、CS−E:from squid cartilage)、デルマタン硫酸(DS:from hog skin)、ヘパラン硫酸(HS:from bovine kidney)をそれぞれDulbecco’s phosphate buffered salts(PBS)に5mg/mlになるように溶解後、メンブランフィルター(MILLEX−GP、0.22μm)に通してろ過滅菌し、サンプルとした。
遺伝子組換え型ヒトトロンボポエチン(TPO)および遺伝子組換え型ヒトstem cell factor(SCF)は、Biosource製を使用した。
Fluorescein isothiocyanate(FITC)−conjugated anti−human CD34(FITC−CD34)、FITC−conjugated anti−human CD41(FITC−CD41)、Phycoerythrin(PE)−conjugated anti−human CD41(PE−CD41)、PE−cyanin 5 fluorochrome tandem(PC5)−conjugated anti−human CD45(PC5−CD45)。
末梢血は、赤十字血液センターが採取したA型成人400ml献血由来血清学的検査済みBuffy coat(核酸検査未確定)の供与を受け用いた。
採取後48時間以内の末梢血を5mM EDTA−PBSを用いて約2倍に希釈後、Ficoll−Paque(Amersham Pharmacia Biotech AB、Uppsala、Sweden)15ml上に希釈試料20mlを積層し、遠心分離(300g、30min)した。Buffy coatを回収し、5mM EDTA−PBSで洗浄した。末梢血Buffy coatは希釈せず同様に積層した。得られたlight−density細胞より、MACS磁気ビーズカラム法(Miltenyi Biotec、Germany)によりCD34陽性細胞を分離・精製した。light−density細胞懸濁液にブロッキング試薬、CD34抗体を添加し、4℃、15分間インキュベートした。0.5%BSA 5mM EDTA−PBSを用いて洗浄遠心(4℃、250g、10min)、再懸濁後、マイクロビーズを添加し4℃、15分間インキュベートした。終了後、同様に洗浄、再懸濁し磁気ビーズカラムにかけ非吸着細胞を溶出した。プランジャーを用いて吸着細胞を回収し、CD34陽性細胞とした。生細胞数は、トリパンブルーを用い血球算定盤にて計算した。CD34細胞陽性率は、フローサイトメーターを用いて測定した。陽性率は、82〜92%であった。
CFU−Megの測定は、human AB platelet poor plasma(ヒト血漿)を用いたplasma clot法もしくは軟寒天法で行った。イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM、Gibco BRL)に100U/mlペニシリン(Gibco BRL、NY)、100μg/mlストレプトマイシン(Gibco BRL)、1mM MEMピルビン酸ナトリウム(Gibco BRL)、1% MEMビタミン混液(Gibco BRL)、1% MEMnonessentialアミノ酸(Sigma、MO)、1×10−3Mチオグリセロール(Sigma)、0.2μg/mlL−アスパラギン(和光純薬、東京)、7.4μg/ml塩化カルシウム(和光純薬)、0.2%ウシ血清アルブミン(bovine serum albumin、BSA、Sigma)を加えたIMDM混液に、造血因子として50ng/ml TPOおよび50〜200μg/ml各種グリコサミノグリカンを加え、さらに2%アプロチニン(Trasylol、バイエル薬品、大阪)および15%ヒト血漿を含む培地を調製し、CD34陽性細胞を1×103個/mlになるように懸濁した。この混合液を24wellsのプレート(Falcon、Becton Dickinson Labware、NJ)に300μl/wellになるように播き、37℃、5%CO2存在下11〜12日間培養した。培養後アセトン・メタノール混液(2:1)で固定、乾燥後、コロニー数測定まで−20℃で保存した。
固定処理後の各wellに、0.5%BSA−PBS400μl/wellを加え、室温で10分間インキュベートした。0.5%BSA−PBSにて100〜150倍に希釈調製したFITC−CD41抗体溶液200μl/wellを添加し、室温遮光下で60分間インキュベートした。処理後抗体溶液を捨て、PBSで2回洗浄後、0.1%クエン酸ナトリウム溶液で希釈調製したpropidium iodide(PI、Sigma)溶液(0.3μg/ml)200μl/wellを添加し、2分間インキュベートした。PI溶液を捨て、超純水で2回洗浄後、室温遮光下にて乾燥させた。処理後、蛍光顕微鏡(Olympus、東京)下、FITC陽性細胞3個以上50個未満の小型コロニーと50個以上の大型コロニーをそれぞれ計数した。
CD34陽性細胞2〜5×103個/mlを、TPO50ng/mlおよび20%ヒト血漿を含むIMDM混液に懸濁し、24wellsプレート(Falcon)に500μl/wellになるように捲き、37℃、5%CO2存在下11〜12日間培養した。このヒト血漿濃度ではplasma clotは形成されない。培養後細胞を回収し、フローサイトメーターを用いて表面抗原ならびにDNA ploidyの解析を行った。
培養前のCD34陽性細胞および液体培養後回収された細胞の懸濁液を、FITC−CD34、PE−CD41、PC5−CD45の抗体混合溶液に添加し、暗所室温にて20分間インキュベート後、5mM EDTA−PBSを用いて洗浄遠心(4℃、250g、10min)し、0.5%BSA−5mM EDTA−PBSに再懸濁した。細胞懸濁液を35μmのナイロンメッシュ(Falcon)に通し、フローサイトメーターを用いて測定した。
DNA Ploidyの測定は、萩原らの方法(Exp.Hematol.,26,228〜235,1998)により行った。培養前のCD34陽性細胞および液体培養後、回収された細胞懸濁液にFITC−CD41抗体を加え、室温にて20分間インキュベートした。0.5%BSA 5mM EDTA−PBSで洗浄遠心(4℃、250g、5min)し、沈殿をCATCH mediumに懸濁し、4℃、1時間インキュベートした。終了後、1%パラホルムアルデヒド(和光純薬)−CATCH medium溶液を当量添加し、5分間固定後PBSで洗浄遠心(4℃、250g、5min)した。沈殿を50μg/ml PI−0.7%クエン酸−0.6%塩化ナトリウム溶液で4℃、1時間処理後、50μg/ml RNAase(Sigma)を添加し、暗所室温にて30分間インキュベートした。その後、35μmのナイロンメッシュに通し、フローサイトメーターを用いて測定した。DNA ploidyの分布は、新鮮分離したヒト末梢血由来単核細胞の蛍光強度を2Nとして相対評価を行った。コントロール群と処理群間の有意差検定は、Studentのt検定で行った。
CFU−Meg 由来巨核球コロニー形成に対する各種グリコサミノグリカンの作用
末消血CD34陽性細胞の培養において、HA−h 50μg/mlの添加で巨核球コロニーはコントロールの1.3倍に増加した(表1)。CS−Aは、50,100μg/mlにおいても、コントロールの約1.3倍に増加させた。さらにDSは、いずれの濃度においても総コロニーをコントロールに比べおよそ1.5倍と有意に増加させた。ヒト末消血CD34陽性細胞は、臍帯血や骨髄にくらべ成熟した細胞集団であり、その分化増殖能も相対的に低いことが知られている。さらに、造血幹細胞移植後の造血回復に要する時間が、骨髄、臍帯血及び末梢血それぞれを使用した場合で大きく異なっている。これは、造血幹細胞表面に発現している各種接着因子の差に由来することが最近になって明らかにされている。このように標的細胞であるCD34陽性CFU−Megの違いやGAGの親和性との差が、本研究にてGAGの作用の違いになってあらわれた要因の一つである可能性が推察される。
ヒト末消血由来CD34陽性細胞の液体培養におけるDSの作用
液体培養(9日間)の結果、細胞数は培養開始時の1.2倍に増加したのに対し、DS添加では約2倍に増加した(表2)。また回収された各細胞に含まれる巨核球数およびCFU−Meg数は培養開始時のおよそ37倍、1.3倍にそれぞれ増加し、DSの添加では、およそ60倍、2.7倍に増加した。
末梢血CD34陽性細胞で巨核球コロニー形成促進作用の見られたHA−h,CS−A,DSについて巨核球からの血小板様粒子放出に対する影響を検討した(図1)。その結果、コロニー形成促進作用の見られたHA−h,CS−Aは、コントロールとの間に有意な差は示さなかった。一方DSの添加でおよそ40%の巨核球に血小板様粒子放出促進作用が認められた。しかし相互の組み合わせによる相乗作用は認められなかった。DSには成熟巨核球からの血小板放出を強く促進することが示された。
Claims (8)
- グリコサミノグリカンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来CD34陽性巨核球前駆細胞増殖促進活性化剤。
- グリコサミノグリカンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来CD34陽性巨核球成熟促進活性化剤。
- グリコサミノグリカンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来CD34陽性巨核球血小板産生促進活性化剤。
- グリコサミノグリカン及びトロンボポエチンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来CD34陽性巨核球前駆細胞増殖促進活性化剤。
- グリコサミノグリカン及びトロンボポエチンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来CD34陽性巨核球成熟促進活性化剤。
- グリコサミノグリカン及びトロンボポエチンを有効成分とすることを特徴とするヒト末梢血由来CD34陽性巨核球血小板産生促進活性化剤。
- 請求項1〜6の活性化剤を含有する医薬。
- 請求項1〜6の活性化剤を含有する血小板産生医薬。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017131230A1 (ja) * | 2016-01-29 | 2017-08-03 | 国立大学法人京都大学 | 血小板産生促進剤及びそれを用いた血小板の製造方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07506584A (ja) * | 1992-05-15 | 1995-07-20 | アンスティテュ デ ヴェソー エ ドウ サン | 血小板減少症治療における外因性グリコサミノグリカン類または誘導体の利用 |
JPH0853356A (ja) * | 1994-06-07 | 1996-02-27 | Genzyme Corp | 血小板の粘着及び凝集の阻害 |
JP2000309538A (ja) * | 1998-12-31 | 2000-11-07 | Rakaro Biopharmaceutical Inc | 子癇前症および関連疾患の新規治療法 |
JP2002535373A (ja) * | 1999-01-28 | 2002-10-22 | ボード・オヴ・リージェンツ,ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・テキサス・システム | トロンボポエチン組成物を使用した収集用および凍結保存のための循環血小板を増加させる方法 |
JP2003530867A (ja) * | 2000-04-25 | 2003-10-21 | プリバ フアルマセウトスカ インダストリヤ デイオニツコ ドルストヴオ | トロンボポエチン受容体モジュレートペプチド |
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07506584A (ja) * | 1992-05-15 | 1995-07-20 | アンスティテュ デ ヴェソー エ ドウ サン | 血小板減少症治療における外因性グリコサミノグリカン類または誘導体の利用 |
JPH0853356A (ja) * | 1994-06-07 | 1996-02-27 | Genzyme Corp | 血小板の粘着及び凝集の阻害 |
JP2000309538A (ja) * | 1998-12-31 | 2000-11-07 | Rakaro Biopharmaceutical Inc | 子癇前症および関連疾患の新規治療法 |
JP2002535373A (ja) * | 1999-01-28 | 2002-10-22 | ボード・オヴ・リージェンツ,ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・テキサス・システム | トロンボポエチン組成物を使用した収集用および凍結保存のための循環血小板を増加させる方法 |
JP2003530867A (ja) * | 2000-04-25 | 2003-10-21 | プリバ フアルマセウトスカ インダストリヤ デイオニツコ ドルストヴオ | トロンボポエチン受容体モジュレートペプチド |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017131230A1 (ja) * | 2016-01-29 | 2017-08-03 | 国立大学法人京都大学 | 血小板産生促進剤及びそれを用いた血小板の製造方法 |
JPWO2017131230A1 (ja) * | 2016-01-29 | 2018-11-22 | 国立大学法人京都大学 | 血小板産生促進剤及びそれを用いた血小板の製造方法 |
US10941382B2 (en) | 2016-01-29 | 2021-03-09 | Kyoto University | Platelet production promoter and method of producing platelets using same |
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