JP2002535373A - トロンボポエチン組成物を使用した収集用および凍結保存のための循環血小板を増加させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、一般に、患者の血小板産生および患者から単離した血小板の凍結保存の分野に関する。より特定すると、本発明は、血小板減少症を予防または管理するための、患者への同種凍結保存血小板の自己輸血に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景 政府は、国立心臓、肺および血液研究所からの助成金番号ＲＯ１ ＨＬ５６４
１６、ＲＯ１ ＨＬ５４０３７およびＰＯ１ ＨＬ５３５８６並びに米国海軍協
定Ｎ０００１４−９６−Ｃ−０１２０に基づく本発明に権利を所有する。

【０００２】 １．発明の分野 本発明は、一般に、患者中での血小板産生および患者から単離した血小板の凍
結保存の分野に関する。より特定すると、本発明は、血小板減少症を予防または
管理するために、同種凍結保存血小板を患者に自己輸血することに関する。本発
明は、トロンボポエチンの投与により、血小板減少症に罹患しているかまたはそ
の危険性のある患者または哺乳動物を処置する方法にも関する。

【０００３】 ２．関連技術の記載 血小板減少症は、血液学および腫瘍学医療における患者の管理の上での重要な
臨床問題である。特に、骨髄抑制は、細胞毒性治療を受けている癌患者において
最も重度な合併症の１つである。血小板減少症は、主に、血小板輸血および化学
療法の用量変更により管理されている。米国では、重度の血小板減少症の管理に
おける血小板輸血の使用が、着実に増加している。１９８２年に約４００万単位
が輸血され、１９９２年に８００万単位以上が輸血されている（Ｓｕｒｇｅｎｏ
ｒら、１９９０；Ｗａｌｌａｃｅら、１９９２）。シングルドナーアフェレーシ
ス（除去療法）血小板の使用は６倍近く増加し、これは主に、感染因子の伝達お
よび同種免疫化の危険性に関連した懸念による（ＨａｙｍａｎおよびＳｃｈｉｆ
ｆｅｒ、１９９０；Ｓｃｈｉｆｆｅｒ、１９９７）。血小板の必要性のこの顕著
な増加は、臓器移植、骨髄移植、心臓手術の進歩、および化学的敏感性悪性容態
の治療における用量集中強化治療の使用に対応している。血小板輸血は出血性合
併症の危険性を低下し得るが、その反復使用により、輸血反応、同種免疫化、お
よび感染因子の伝達の危険性は増加し得、保健費用の増加の一因となる（Ｈｅｙ
ｍａｎおよびＳｃｈｉｆｆｅｒ、１９９０）。このような血小板の必要性の莫大
な増加は、患者、医療保険制度および血液バンク源に慢性的な負担を課し、改良
された血小板の獲得、加工および貯蔵の方法、および血小板産生を刺激する新規
薬剤の探索への動機付けとなった。

【０００４】 過去十年間、骨髄成長因子は好中球（Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ）および
赤血球（エリスロポエチン）の産生を制御するという認識により、骨髄抑制療法
を受けている癌患者の管理に、これらの因子が臨床的に適用された（Ｎｅｍｕｎ
ａｉｔｉｓら、１９９１；Ｃｒａｗｆｏｒｄら、１９９１；Ｖｏｓｅら、１９９
１；Ａｍ．Ｓｏｃ．ｏｆ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９９４）。顆粒球コロニー
刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ
−ＣＳＦ）などの骨髄成長因子の使用により、熱性好中球減少症の発症は減少し
ている（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、１９９１；Ｎｅｕｍｕｎａｉｔｉｓら、１９９１
）。インターロイキン−１、インターロイキン−３、インターロイキン−６、イ
ンターロイキン−１１、およびＰＩＸＹ３２１を含む、血小板新生能を有する数
個のサイトカインも、臨床評価を受けている（Ｓｍｉｔｈら、１９９２；Ｖａｄ
ｈａｎ−Ｒａｊら、１９９４；Ｄ'Ｈｏｎｄｔら、１９９３；Ｗｅｂｅｒら、１
９９３；Ｔｅｐｌｅｒら、１９９６；Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊら、１９９４）。多
くのこれらの薬剤の臨床開発は、その低い血小板新生活性および／または支持薬
剤に好ましくない毒性プロフィールにより制限されている。ＩＬ−１１は、現在
までに臨床使用に認可されている唯一の血小板新生サイトカインである。無作為
化プラセボ対照試験において、二次予防としてのＩＬ−１１（５０ｍｃｇ／ｋｇ
）の使用は、様々な化学療法措置から生じた血小板減少症（＜２０，０００／ｍ
ｍ^３）のために血小板をすでに輸血した患者の３０％（２７人中８人）において
、血小板輸血を回避する見込みを減少させることが示された（これに対しプラセ
ボ４％）。しかし血小板減少症の期間は減少したが、統計学的に有意ではなかっ
た。ＩＬ−１１で報告された有意な副作用は、心房性不整脈、失神、呼吸困難お
よび浮腫を含んだ。

【０００５】 （血小板および巨核球前駆体上に見られる）ｃ−Ｍｐ１受容体のリガンドであ
るトロンボポエチンは、近年、数名の研究者によりクローニングされ、in vivo
で血小板産生の主な調節因子であることが示された（ｄｅ Ｓａｕｖａｇｅら、
１９９４；Ｂａｒｔｌｅｙら、１９９４；Ｌｏｋら、１９９４；Ｋａｕｓｈａｎ
ｓｋｙら、１９９４；Ｗｅｎｄｌｉｎｇら、１９９４）。トロンボポエチン（th
rombopoietin; ＴＰＯ）は、初期骨髄幹細胞および巨核球前駆細胞に直接作用す
る成長因子である（ｄｅ Ｓａｕｖａｇｅら、１９９４；Ｌｏｋら、１９９４；
Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙら、１９９４；Ｗｅｎｄｌｉｎｇら、１９９４；Ｂａｒｔ
ｌｅｙら、１９９４；ＫｕｔｅｒおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、１９９４；Ｓｏｕ
ｙｒｉら、１９９０）。ＴＰＯは、増殖および分化を誘導し、成熟巨核球の産生
を増加させ、よって、循環中の血小板数は増加する。増殖および分化に対するＴ
ＰＯの作用は、細胞内シグナル伝達分子のＪＡＫ／ＳＴＡＴファミリーに関与す
るようである（Ｇｒｕｎｅｙら、１９９５）。

【０００６】 正常なマウスおよびヒト以外の霊長類で実施した前臨床試験において、トロン
ボポエチンは、以前に他のトロンボポエチンサイトカインで達成されたレベルよ
りも高いレベルまで、血小板数を増加させた（Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ、１９９５
；Ｆａｒｅｓｅら、１９９５）。さらに、骨髄抑制ネズミモデルでは、１用量と
して投与した組換えトロンボポエチンは、致死量以下の照射および化学療法によ
り汎血球減少させたマウスにおいて、最下点を減少させ、血小板回復を促進した
（Ｔｈｏｍａｓら、１９９６）。これらの試験で、より延長した処置（８日間と
いう長さ）により、追加の利点は全く得られず、回復期中の顕著な血小板増多症
を伴った。

【０００７】 トロンボポエチン（Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊら、１９９６）並びにポリエチレン
グリコール複合型の分子（Ｆａｎｕｃｃｈｉら、１９９７；Ｌｅｖｉｎ、１９９
７）を使用した昔の試験の結果により臨床活性が実証される。ｒｈＴＰＯは、よ
り長い半減期（２０〜３０時間）を有し遅延ピーク応答（中央値１２日目）を示
す（Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊら、１９９７；Ｂｌｏｅｄｏｗら、１９９６）。昔の
臨床試験により、全長分子（組換えヒトトロンボポエチン［ｒｈＴＰＯ］と称す
る）または切断短縮されたＰＥＧ結合型分子（巨核球増殖および発達因子［ＰＥ
Ｇ−ｒＨｕＭＧＤＦ］と称する）の両方の投与により、化学療法前の循環血小板
数は用量関連的に増加し、そして、中程度の骨髄抑制措置後に血小板回復を基線
まで増強することが実証された（Ｆａｎｕｃｃｈｉら、１９９７；Ｖａｄｈａｎ
−Ｒａｊら、１９９７；Ｏ'Ｍａｌｌｅｙら、１９９６；Ｂａｓｓｅｒら、１９
９７；Ｓｕｚｕｋｉら、１９９５）。しかし、成長因子を用いた以前の研究によ
り、最大臨床利点を得るためには、化学療法に関連した成長因子投与の時期の臨
床的重要性が示される（Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊ、１９９２；Ｎｅｉｄｈａｒｔら
、１９９２；Ｃｒａｗｆｏｒｄら、１９９２）。重度の血小板減少症の予防、お
よび、血小板輸血の必要性の回避におけるこれらの薬剤の価値は、確立されてい
ない。

【０００８】 自己血小板の輸血は、自己免疫化、感染因子の伝達の危険性、および血液バン
クの慢性的供給危機を含む多くの問題を克服し得る。正常なドナーの血小板フェ
レーシスでの以前の経験により、集中的多ユニット血小板フェレーシスは、輸血
用の大量の血小板を得る安全で実践的な手段であることが示される（Ｓｃｈｉｆ
ｆｅｒら、１９７６；Ｓｃｈｉｆｆｅｒら、１９７４）。現在の血液バンク慣行
下では、血小板は、細菌汚染の危険性のために僅か５日間のみ２２℃で貯蔵でき
る（Ｌａｚａｒｕｓら、１９８２；Ｍｕｒｐｈｙ、１９８５；Ｏｗｅｎｓら、１
９９２）。別法として、献血された血小板を凍結保存して、より長期の貯蔵時間
を達成できる。残念なことに、血小板凍結保存に現在認可されている方法は、手
間がかかり、高濃度の凍結保存剤ＤＭＳＯ（５〜６％）を必要とする。さらに、
この方法による血小板の凍結保存により、細胞数および機能的活性は減少する（
Ｄａｌｙら、１９７９；Ｂａｌｄｕｉｎｉら、１９９３；Ｂｏｃｋら、１９９５
；Ｔｏｗｅｌｌら、１９８６）。凍結解凍手順後の血小板の回収率は、典型的に
は、５０〜７０％である。これらの血小板の輸血後に、回収率は最初の血小板数
の２０〜３０％まで減少する。さらに、凍結保存血小板は、活性マーカーＣＤ−
６２の発現上昇、および機能的パラメータ-の有意な減少を示す。血小板に対す
る凍結保存のこれらの有害な効果は、セカンドメッセンジャー経路を介する血小
板の生化学的活性化から生じると考えられる、貯蔵病変の誘導に起因する。トロ
ンボソール、血小板に内因性の特異的活性化経路を阻害する選択したセカンドメ
ッセンジャーエフェクターからなる、新規に開発された血小板貯蔵溶液であり、
よって、生化学的に安定で冷貯蔵病変に対して保護された細胞が得られる。

【０００９】 用量強度の増加は、全体的な結果を向上させるのに重要であり得るという概念
から、化学的敏感性悪性疾患に、より積極定な療法が使用されている。これらの
考察から、血小板減少症を減弱し、血小板輸血の必要性を減少させ得る薬剤また
は方法が探索されている。さらに、血小板産生を増加させ、輸血用の血小板のよ
り良好な貯蔵を可能とする、薬剤または方法は重要な進展となろう。

【００１０】発明の要旨 本発明は、ＭＧＤＦ、ｍｐｌリガンド、およびメガポエチンとしても知られる
、トロンボポエチン（thrombopoietin; ＴＰＯ）の投薬の新規方法により、動物
中での血小板産生を増強する方法を提供することによって、従来技術に固有なこ
れらおよび他の欠点を克服する。本発明の方法により動物で産生された血小板を
収集し、その後、適切な薬剤を用いて保存し得る。さらに、保存血小板を、血小
板減少症に罹患しているかまたはその危険性のある動物に注入できる方法が提供
される。またこれらのＴＰＯ投与法を使用して、血小板減少症を引き起こすまた
は増強する薬剤に因る、動物の血小板減少症を寛解できる。本発明は、ＴＰＯを
含む血小板用の凍結保存組成物を提供する。

【００１１】 本発明は、第一に、血小板を保存する方法を提供し、これは、１またはそれ以
上の用量の、ＴＰＯまたは他の血小板上昇組成物含有組成物を哺乳動物に投与す
るステップと、アフェレーシスにより哺乳動物により産生された血小板を収集す
るステップと、血小板を適切な薬剤を用いて保存するステップとを含む。追加の
態様において、該方法はさらに、哺乳動物への血小板の輸血を含む。好ましくは
、輸血は、血小板減少症に罹患しているかまたはその危険性のある哺乳動物に行
う。好ましい実施形態において、該方法は、ＴＰＯまたは他の血小板上昇組成物
による循環血小板の上昇、アフェレーシスによる血小板の収集、凍結保存による
血小板の貯蔵、および、血小板減少症を引き起こすことが知られる薬剤により引
き起こされるまたは増強される血小板減少症の期間中での哺乳動物への血小板の
輸血を含む。この方法は、好ましくは、薬剤が、血小板減少症を引き起こす化学
療法薬、放射線曝露外科処置である場合に使用する。１つの態様において、血小
板上昇組成物は、ＴＰＯ、ＭＧＤＦ、キメラ受容体アゴニスト、またはその組合
せであり得るが、これらに限定されない。好ましい態様において、血小板は、約
２０，０００／μＬ（血液）未満の血小板数を有する哺乳動物に移行または輸血
する。他の態様において、血小板は、約２０，０００／μＬ未満から約１５，０
００／μＬ（血液）の血小板数を有する哺乳動物に輸血し得る。他の態様におい
て、血小板は、約１５，０００／μＬ未満から約１０，０００／μＬ（血液）の
血小板数を有する哺乳動物に輸血し得る。他の態様において、血小板は、約２０
，０００／μＬ未満から約１，０００／μＬ（血液）の血小板数を有する哺乳動
物に輸血し得る。勿論、この記載および本明細書の開示に鑑みて、当業者は、重
度の血小板減少症を有するとして動物を診断でき、よって、血小板の輸血を決定
した場合の１μＬあたりの血小板の絶対数は、列挙した値とは異なり得る。

【００１２】 １つの態様において、ＴＰＯは、血小板を収集する前、最中、および／または
後に、少なくとも１つのサイトカインと共に投与し得る。別の好ましい態様にお
いて、ＴＰＯは、血小板を患者に輸血または投与する前、最中および／または後
に投与し得る。これらの態様において、ＴＰＯは、少なくとも１つのサイトカイ
ンと共に投与し得る。ＴＰＯおよび／または少なくとも１つのサイトカインの投
与の用量および時間スケジュールは、本明細書に記載した任意であり得る。

【００１３】 本発明は、次に、ＴＰＯを含む、血小板の凍結保存用の組成物を提供する。好
ましい態様において、組成物はＴＰＯおよびＤＭＳＯを含む。別の好ましい態様
において、組成物はＴＰＯおよびトロンボソールを含む。特に好ましい態様にお
いて、組成物は、ＴＰＯ、ＤＭＳＯおよびトロンボソールを含む。本発明の態様
において、約１％から約１０％のＤＭＳＯ、トロンボソールおよび／またはＴＰ
Ｏを、血小板の保存に使用し得る。好ましい態様において、血小板の保存に使用
するＤＭＳＯの量は、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３
．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７
％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、約１０％までのＤ
ＭＳＯであり得る。特に好ましい態様において、ＤＭＳＯの量は、約２％から約
６％である。別の好ましい態様において、ＤＭＳＯの量は、約５％から約６％で
ある。ある態様において、トロンボポエチンの量は、凍結保存溶液または混合物
中、約０．０００１％、約０．０００２％、約０．０００３％、約０．０００４
％、約０．０００５％、約０．０００６％、約０．０００７％、約０．０００８
％、約０．０００９％、約０．００１％、約０．００２％、約０．００３％、約
０．００４％、約０．００５％、約０．００６％、約０．００７％、約０．００
８％、約０．００９％、約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％
、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％
、約０．９％、約１．０％、約１．２％、約１．４％、約１．６％、約１．８％
、約２．０％、約２．２％、約２．４％、約２．６％、約２．８％、約３．０％
、３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、
約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、約１０％まで
またはそれ以上であり得る。ある態様において、トロンボソールの量は、凍結保
存溶液または混合物中、約０．０００１％、約０．０００２％、約０．０００３
％、約０．０００４％、約０．０００５％、約０．０００６％、約０．０００７
％、約０．０００８％、約０．０００９％、約０．００１％、約０．００２％、
約０．００３％、約０．００４％、約０．００５％、約０．００６％、約０．０
０７％、約０．００８％、約０．００９％、約０．０１％、約０．０５％、約０
．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０
．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．２％、約１．４％、約１
．６％、約１．８％、約２．０％、約２．２％、約２．４％、約２．６％、約２
．８％、約３．０％、３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約
６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．
５％、約１０％までまたはそれ以上であり得る。血液の保存または凍結保存につ
いて当業者に公知の全ての他の方法および組成物はまた、本明細書に記載の方法
および組成物と合わせ得る。

【００１４】 本発明は、次に、血小板減少症に罹患またはその危険性のある哺乳動物の処置
法を提供し、これは、哺乳動物に、血小板減少症を引き起こし得る薬剤を投与す
るステップと、哺乳動物に、薬剤の投与前に、１またはそれ以上の初回刺激(pri
med)用量のＴＰＯ含有組成物を投与するステップと、哺乳動物に、薬剤の投与後
に、１またはそれ以上の後用量のＴＰＯ組成物を投与するステップとを含む。好
ましい実施形態において、初回刺激用量または後用量は、毎日以外で投与する。
本明細書である実施形態では、毎日以外とは、薬剤、ＴＰＯ含有組成物、他のト
ロンボエチン組成物、サイトカイン、ホルモン、またはその組合せの投与と、１
つまたはそれ以上のかかる調製物の別の投与の間の、約２、約３、約４、約５、
約６、約７、約８、約９、約１０までまたはそれ以上の日数を意味し得る。特に
好ましい実施形態において、用量は、隔日に投与する。患者が血小板減少症に罹
患しているかまたはその危険性のある場合には常に、複数の用量のＴＰＯを投与
し得る。本明細書のある実施形態で使用したような、「血小板減少症に罹患して
いる」とは、動物が、血液１μＬあたり、約１００，０００未満の血小板を有す
ることを意味する。従って、この定義内で、血液１μＬあたり、約９５，０００
、約９０，０００、約８５，０００、約７５，０００、約７０，０００、約６５
，０００、約６０，０００、約５５，０００、約５０，０００、約４５，０００
、約４０，０００、約３５，０００、約３０，０００、約２５，０００、約２０
，０００、約１５，０００、約１０，０００、約５，０００、約１，０００まで
の血小板またはそれ以下を有する動物も血小板減少症を有すると理解する。勿論
、この定義および本明細書の開示に鑑みて、当業者は、血小板減少症を有すると
して動物を診断でき、よって、１μＬあたりの血小板の絶対数は、列挙した数値
とは異なる。本明細書のある実施形態で使用したような、「血小板減少症の危険
性のある」とは、動物が、疾病容態、処置、または動物の血液１μＬあたりの血
小板数を減少させることが知られるまたは疑われる薬剤の曝露に因り血小板減少
症を発達することが予見して期待されることを意味する。患者は、より長期間の
血小板減少症中または予期される血小板減少症中に、ＴＰＯを含む用量を受け得
ると考えられる。急性期は、数時間、数日および／または数週間続き得る。また
、患者は、血小板減少症または血小板減少症の危険性が慢性である場合には、半
永久的にＴＰＯ用量を受け得ると考えられる。これらの慢性期間は、数ヶ月また
は数年続き得、そしてＴＰＯは、血小板減少症容態を減少させるに必要なように
断続的に投与し得る。当業者は、容態の重度および持続性、疾病、血小板減少症
を引き起こしたり、悪化させたり、または増強する薬剤への曝露の危険性、また
は、血小板減少症の処置における本発明の方法に対する哺乳動物の応答に基づい
て、延長された半永久的期間、ＴＰＯ含有組成物を投与する必要性を確認できる
。従って、ＴＰＯを含む、少なくとも約２、約３、約４、約５、約６、約７、約
８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７
、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６
、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５
、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０
、約８５、約９０、約９５、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４
０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０
、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約３００までのまたはそれ以上の
用量を本発明の方法で投与し得る。周期性血小板減少症、慢性筋異形成、再生不
良性貧血、または骨髄疾患を含むがこれに限定されない容態に好ましい用量は、
約１０から約１５０用量、および勿論、ＴＰＯ含有組成物の上記の間の全ての数
である。しかし、化学療法または放射線療法のサイクルなどの多くの適用におい
て、投与するＴＰＯの全用量数は、好ましくは、約２０用量未満である。用量は
、回復血小板数が、ＴＰＯ用量の投与を中止する前に、血液１μＬあたり、約５
０，０００またはそれ以上の血小板となるまで患者に投与し得ると考えられる。
しかし、当業者は、ＴＰＯ用量の投与を中止する前に、哺乳動物の血小板数が、
血液１μＬあたり、約５５，０００、約６０，０００、約６５，０００、約７０
，０００、約７５，０００、約８０，０００、約８５，０００、約９０，０００
、約９５，０００、約１００，０００またはそのあたりまでの血小板となるまで
ＴＰＯを投与し得ると理解する。勿論、この記載および本明細書の開示に鑑みて
、当業者は、血小板減少症の容態は軽減したとして動物を診断でき、よって、Ｔ
ＰＯの投与の中止を決定した場合の１μＬあたりの血小板の絶対数は、列挙した
数値とは異なるだろう。さらに、患者が血小板減少症を発達させた場合に、特に
、哺乳動物の血小板数が、血液１μＬあたり５０，０００未満またはそのあたり
に下降した場合に、または哺乳動物が血小板減少症を有すると別様に診断された
場合には、ＴＰＯを再投与すべきである。当業者は、連続用量の全体数が増加す
るにつれて、各用量中の投与されるＴＰＯの量が少なくなることが好ましいと認
識する。患者の血小板レベルに対する最適効果を得るための用量レベルの調整は
、本開示に鑑みて日常的なことであろう。用量は毎日以外で投与することが好ま
しい。別の好ましい実施形態において、用量は隔日に投与する。

【００１５】 １つの好ましい実施形態において、薬剤は、化学療法剤または放射線療法であ
る。この実施形態において、薬剤への曝露は、急性期の血小板減少症をもたらす
と期待される。少なくとも約２、約３、約４、約５、約６までのまたはそれ以上
のプライム用量を投与すると考えられる。本発明の１つの態様において、少なく
とも約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０までの後用量の
ＴＰＯ組成物を投与する。本発明のある態様において、少なくとも約２、約３、
約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２までの全用量の
ＴＰＯ組成物を投与する。好ましい実施形態において、初回刺激用量は毎日以外
で投与する。別の好ましい実施形態において、用量は隔日に投与する。

【００１６】 １つの好ましい態様において、初回刺激用量または前用量の全数は、約３から
約６用量であり得る。好ましい態様において、後用量の全数は、約４から約８用
量である。別の好ましい態様において、前および後用量の両方を投与する場合、
全用量数は約４用量から約１０用量である。本明細書に使用したように、前用量
または初回刺激用量と明記しない場合、ＴＰＯの「用量」は、前または後用量を
意味し得る。

【００１７】 本発明はさらに、血小板減少症に罹患またはその危険性のある哺乳動物の処置
法を提供し、これは、哺乳動物に、血小板減少症を引き起こし得る薬剤を投与す
るステップと、薬剤の投与前に、１つまたはそれ以上のプライム用量のＴＰＯ含
有組成物を哺乳動物に投与するステップとを含む。本発明の１つの態様において
、初回刺激用量は、約１、約２、約３、約４、約５、および約６までであり得、
またはそれ以上の初回刺激用量のＴＰＯ組成物を投与する。好ましい実施形態に
おいて、初回刺激用量は毎日以外で投与する。別の好ましい実施形態において、
用量は隔日に投与する。

【００１８】 本発明は次に、血小板減少症に罹患またはその危険性のある哺乳動物の処置法
を提供し、これは、哺乳動物に、血小板減少症を引き起こし得る薬剤を投与し；
そして、薬剤の投与後に、２またはそれ以上の後用量のＴＰＯ含有組成物を哺乳
動物に投与することを含み、ここでの後用量は、約２、約３、約４、約５、約６
、約７、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５までの用量で
あり得る。別に、化学療法後に、ＴＰＯ用量は、ＴＰＯ用量の投与中止前に、回
復（最下点後）血小板数が血液１μＬあたり約５０，０００から約１００，００
０となるまで患者に投与し得る。患者の血小板数が、血液１μＬあたり約５０，
０００未満に下降した場合、または動物が、本開示に鑑みて当業者に理解される
ような血小板減少症を発達させた場合には、再度ＴＰＯを投与すべきである。好
ましい態様において、用量は、毎日以外で投与する。別の好ましい態様において
、後用量は隔日に投与する。

【００１９】 本発明は次に、血小板減少症を誘導することが知られる薬剤による哺乳動物の
処置数を増加させる方法を提供し、これは、哺乳動物に、少なくとも１つのＴＰ
Ｏ含有治療組成物を投与するステップと、血小板減少症を誘導することが知られ
る少なくとも１つの薬剤を哺乳動物に投与するステップと、哺乳動物の血小板数
をモニタリングするステップとを含み、ここでの、測定された少なくとも約７５
，０００／μＬ（血液）の血小板数は、哺乳動物が、血小板減少症を誘導するこ
とが知られる薬剤での追加の処置サイクルを受け得ることを示す。この方法の１
つの態様において、哺乳動物は薬剤での１つまたはそれ以上の処置サイクルを受
ける。本発明の好ましい態様において、少なくとも約５０，０００から約１００
，０００／μＬ（血液）、そして勿論、上記のこの範囲内の全ての整数の血小板
数は、追加のＴＰＯ用量は必要でないことを示し、一方、約２０，０００／μＬ
（血液）未満の血小板数は、追加用量のＴＰＯを投与し得および／または血小板
を哺乳動物に輸血し得ることを示す。当業者は、動物での血小板減少症の診断は
また、ＴＰＯおよび／または血小板輸血を投与すべきであることを示すことを理
解し、一方、血小板減少症容態の減少の診断、すなわち約間の血小板数。１つの
態様において、哺乳動物は癌を有する。

【００２０】 上記の段落に記載の本発明の方法のある態様において、薬剤は、ＴＰＯ含有組
成物としての投与とほぼ実質的に同時に（すなわち約１分未満以内に）投与し得
る。他の態様において、薬剤は、ＴＰＯ含有治療組成物を投与する前または後の
、約１分から、約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約４５分、約６０分、
約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約
９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１
５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２
１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２
７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３
３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約３７時間、約３８時間、約３
９時間、約４０時間、約４１時間、約４２時間、約４３時間、約４４時間、約４
５時間、約４６時間、約４７時間、約４８時間、約４９時間、約５０時間、約５
１時間、約５２時間、約５３時間、約５４時間、約５５時間、約５６時間、約５
７時間、約５８時間、約５９時間、約６０時間、約６１時間、約６２時間、約６
３時間、約６４時間、約６５時間、約６６時間、約６７時間、約６８時間、約６
９時間、約７０時間、約７１時間、約７２時間、約７３時間、約７４時間、約７
５時間、約７６時間、約７７時間、約７８時間、約７９時間、約８０時間、約８
１時間、約８２時間、約８３時間、約８４時間、約８５時間、約８６時間、約８
７時間、約８８時間、約８９時間、約９０時間、約９１時間、約９２時間、約９
３時間、約９４時間、約９５時間、約９６時間、約９７時間、約９８時間、約９
９時間、約１００時間までまたはそれ以上以内に投与し得る。ある他の実施形態
において、薬剤は、ＴＰＯ含有治療組成物を投与する前の、約１日から、約２日
、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１
１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８
日、約１９日、約２０日、約２１まで以内に投与し得る。ある他の実施形態にお
いて、薬剤は、ＴＰＯ含有治療組成物の投与後の、約１日、約２日、約３日、約
４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日まで以内に投与し得
る。いくつかの実施形態において、哺乳動物に、１つまたはそれ以上のＴＰＯ含
有治療組成物を投与する。他の実施形態において、治療組成物は、ＴＰＯを含む
１用量として投与する。他の実施形態において、１用量以上のＴＰＯ含有治療組
成物を投与する。

【００２１】 本発明の方法のある態様において、各用量は、ＴＰＯを含む先行用量の、約２
４から約７２時間後に投与する。いくつかの実施形態において、各用量は、ＴＰ
Ｏを含む先行用量の、約３６から約６０時間後に投与する。いくつかの実施形態
において、各用量は、ＴＰＯを含む先行用量の、約４２から約５４時間後に投与
する。いくつかの実施形態において、各用量は、ＴＰＯを含む先行用量の、約４
８時間後に投与する。いくつかの好ましい実施形態において、各用量は、ＴＰＯ
を含む先行用量の後、隔日に投与する。他の好ましい実施形態において、各用量
は、ＴＰＯを含む先行用量の後、毎日以外で投与する。当業者は、用量スケジュ
ールは、投与のタイミングにおいて上記の様々な態様を合わせるために変化し得
ることを認識する。例えば、第二用量は、先行用量の約３６から約６０時間後に
投与し得、その後の用量は、第二用量の約４８時間後に投与し得る。かかる変更
は本発明により包含され、これは本明細書の開示に鑑みて当業者により実践され
る。

【００２２】 本発明の方法の他の態様において、薬剤での処置後の最下点すなわち最も低い
血小板数の点は、比較的に早く、約７、約８、約９、約１０、約１２、約１３か
ら約１４日目である。ある実施形態において、血小板数の最下点は、約１０から
約１４日目であり、薬剤での処置後の最下点の中央値は約１２日である。これら
の実施形態において、薬剤を、ＴＰＯ含有治療組成物の投与後に最初に投与する
ことが好ましい。この態様において、１用量以上のＴＰＯ含有治療組成物を投与
することが好ましい。この態様において、各用量を、先行用量のＴＰＯ含有治療
組成物の後に、隔日に投与することが好ましい。約３から約６用量を投与するこ
とが特に好ましく、約３から約４用量が特に好ましいと考えられる。この態様に
おいて、ＴＰＯを含む約１から約８用量を、薬剤の投与後に投与することが好ま
しい。この実施形態において、約１、約２、約３、約４、約５、約６またはその
あたりまでの用量を投与し得る。１つの態様において、ＴＰＯ含有組成物は、血
小板数が血液１μＬあたり約１００，０００未満である場合に投与する。

【００２３】 本発明の方法の他の態様において、薬剤を、約３から約６日間の期間かけて投
与する。この実施形態において、薬剤を、最初に、ＴＰＯ含有治療組成物後に投
与することが好ましい。この実施形態において、また、１用量以上のＴＰＯ含有
治療組成物を投与することが好ましい。各用量は、先行用量のＴＰＯ含有治療組
成物の後に隔日に投与することが好ましい。この態様において、各用量は、先行
用量のＴＰＯ含有治療組成物の後に隔日に投与することが好ましい。約３から約
６用量を投与することが特に好ましく、４用量が特に好ましいと考えられる。こ
の実施形態において、約１、約２、約３、約４、約５、約６またはそのあたりま
での用量を投与し得る。この態様において、ＴＰＯを含む１用量を、薬剤の投与
後に投与することが好ましい。１つの態様において、ＴＰＯ含有組成物は、血小
板数が、血液１μＬあたり約１００，０００未満である場合に投与する。

【００２４】 本発明の方法の他の態様において、薬剤の最下点は、比較的遅く、約１５、約
１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約
２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約
３４、約３５日目までまたはそれ以上である。この態様において、薬剤は、ＴＰ
Ｏ含有治療組成物の投与前に投与することが好ましい。しかし、約１２目から約
２５日目までなどの、早い最下点をもつ薬剤も、この実施形態に好ましくあり得
ると考えられる。ＴＰＯを含む１用量以上を投与することが好ましい。この態様
において、各用量は、先行用量のＴＰＯ含有治療組成物の後に隔日に投与するこ
とが好ましい。約３から約６用量を投与することが特に好ましく、約３から約４
用量が特に好ましいと考えられる。この実施形態において、約１、約２、約３、
約４、約５、約６またはそのあたりまでの用量を投与し得る。１つの態様におい
て、ＴＰＯ含有組成物は、血小板数が血液１μＬあたり約１００，０００未満で
ある場合に投与する。

【００２５】 本発明の方法の他の態様において、薬剤は、約１から約５日間、より好ましく
は約１から約２日間の期間におよび投与する。この実施形態において、薬剤は、
最初に、ＴＰＯ含有治療組成物の投与前に投与することが好ましい。ＴＰＯを含
む１用量以上を投与することが好ましい。この態様において、各用量は、先行用
量のＴＰＯ含有治療組成物の後に隔日に投与することが好ましい。約３から約６
用量を投与することが特に好ましく、約４から約６用量が特に好ましいと考えら
れる。この実施形態において、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約
８、約９、約１０またはそのあたりまでの用量を投与し得る。この態様において
、ＴＰＯを含む少なくとも１用量を、薬剤の投与後に投与することが好ましい。
１つの態様において、ＴＰＯ含有組成物は、血小板数が血液１μＬあたり約１０
０，０００未満である場合に投与する。

【００２６】 ある実施形態において、前用量、後用量、およびその組合せを、最下点が中間
である場合、すなわち約１２、約１３、約１４日目までである場合に投与し得る
。この実施形態において、好ましい処置は、早い最下点薬剤または遅い最下点薬
剤のいずれかに記載したものであり得る。

【００２７】 本発明の方法のある態様において、処置サイクルは、哺乳動物への薬剤の複数
回の投与を含む。他の態様において、処置サイクルは、血小板減少症を誘導する
ことが知られる１つ以上の薬剤での哺乳動物の処置を含む。哺乳動物は、１つま
たはそれ以上のサイクルで、または複数のサイクルで処置し得、ここでの薬剤は
、１サイクルあたり、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９
、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８
、約１９、約２０までまたはそれ以上の日数かけて投与する。薬剤は、投与スケ
ジュールにおいて、連続的に、毎日、または毎日以外で投与し得る。１つ以上の
薬剤を、処置スケジュールまたはサイクルで投与し得る。１つの実施形態におい
て、薬剤は、１サイクルあたり、約１から約５日間投与することが好ましい。従
って、この態様において、薬剤は、１サイクルあたり、約１、約２、約３、約４
、または約５日間またはそのあたりで投与し得る。

【００２８】 本発明の方法のある態様において、ＴＰＯ含有治療組成物は、ヒトまたは別の
動物から単離した、ＴＰＯタンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチド
であり得る。ＴＰＯタンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチドは、組
換えＤＮＡ技術により産生されたタンパク質でも、化学合成されたものでもよく
、そして、当業者に既知の任意の技術により修飾し得、その血小板新生および／
または凍結保存活性のいくらかまたは全てを残しつつ、ＴＰＯタンパク質、ポリ
ペプチド、および／またはペプチドの野生型配列を変化または修飾し得る。かか
る修飾ＴＰＯは、ＰＥＧ結合型ＴＰＯ分子を含むがこれに限定されない。ＴＰＯ
組成物は、修飾および非修飾の両方のＴＰＯタンパク質、ポリペプチド、および
／またはペプチドの組合せを含み得、不活性形のＴＰＯをさらに取り込み得る。
本明細書に使用したような、「ＴＰＯ」または「トロンボポエチン」なる語は、
この段落の先の一節に記載したこれらの組成物のいずれかを意味し得る。他のペ
プチド、タンパク質、またはポリペプチドは、トロンボポエチン受容体アゴニス
トとしての作用により、ＴＰＯ活性を模倣し得ると考えられる。ＴＰＯ活性のか
かるＴＰＯ活性ペプチド模倣体またはトロンボポエチン受容体アゴニストは、Ｃ
ｗｉｒｌａら、１９９７の開示したペプチドを含むがこれに限定されない。かか
るＴＰＯペプチド模倣体または受容体アゴニストは、本明細書に開示した任意の
組成物および方法に使用し得ると考えられる。さらに、かかる受容体アゴニスト
またはＴＰＯ活性ペプチド模倣体または他の受容体アゴニストは、本明細書に開
示したまたは当業者には公知である任意の技術により産生、単離、合成、変化、
または別様に修飾し得、依然としてその血小板新生および／または凍結保存活性
を維持すると考えられる。

【００２９】 様々な本組成物および方法の内容において本明細書に使用したような、「タン
パク質」なる語は、約２０１よりも長い連続アミノ酸であり、ほとんどの態様に
おいて、遺伝子のコード領域によりコードされるアミノ酸の約７０％よりも多く
含む、タンパク質性セグメントを意味すると理解される。従って、ＴＰＯタンパ
ク質は、約２０１、約２０２、約２０３、約２０４、約２０５、約２０６、約２
０７、約２０８、約２０９、約２１０、約２１１、約２１２、約２１３、約２１
４、約２１５、約２１６、約２１７、約２１８、約２１９、約２２０、約２２１
、約２２２、約２２３、約２２４、約２２５、約２２６、約２２７、約２２８、
約２２９、約２３０、約２３１、約２３２、約２３３、約２３４、約２３５、約
２３６、約２３７、約２３８、約２３９、約２４０、約２４１、約２４２、約２
４３、約２４４、約２４５、約２４６、約２４７、約２４８、約２４９、約２５
０、約２５１、約２５２、約２５３、約２５４、約２５５、約２５６、約２５７
、約２５８、約２５９、約２６０、約２６１、約２６２、約２６３、約２６４、
約２６５、約２６６、約２６７、約２６８、約２６９、約２７０、約２７１、約
２７２、約２７３、約２７４、約２７５、約２７６、約２７７、約２７８、約２
７９、約２８０、約２８１、約２８２、約２８３、約２８４、約２８５、約２８
６、約２８７、約２８８、約２８９、約２９０、約２９１、約２９２、約２９３
、約２９４、約２９５、約２９６、約２９７、約２９８、約２９９、約３００、
約３０１、約３０２、約３０３、約３０４、約３０５、約３０６、約３０７、約
３０８、約３０９、約３１０、約３１１、約３１２、約３１３、約３１４、約３
１５、約３１６、約３１７、約３１８、約３１９、約３２０、約３２１、約３２
２の連続アミノ酸長であり得る。好ましいＴＰＯタンパク質は、配列番号１の配
列を含む。様々な本組成物および方法の内容で本明細書に使用したような、「ポ
リペプチド」なる語は、約１００ないし約２００連続アミノ酸長である、タンパ
ク質性セグメントを意味すると理解される。従って、ＴＰＯポリペプチドは、約
１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１
０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１
５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、約１２０、約１２１、約１２２
、約１２３、約１２４、約１２５、約１２６、約１２７、約１２８、約１２９、
約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約
１３７、約１３８、約１３９、約１４０、約１４１、約１４２、約１４３、約１
４４、約１４５、約１４６、約１４７、約１４８、約１４９、約１５０、約１５
１、約１５２、約１５３、約１５４、約１５５、約１５６、約１５７、約１５８
、約１５９、約１６０、約１６１、約１６２、約１６３、約１６４、約１６５、
約１６６、約１６７、約１６８、約１６９、約１７０、約１７１、約１７２、約
１７３、約１７４、約１７５、約１７６、約１７７、約１７８、約１７９、約１
８０、約１８１、約１８２、約１８３、約１８４、約１８５、約１８６、約１８
７、約１８８、約１８９、約１９０、約１９１、約１９２、約１９３、約１９４
、約１９５、約１９６、約１９７、約１９８、約１９９、約２００連続アミノ酸
長であり得る。好ましいポリペプチドは、成熟ヒトＴＰＯの最初のＮ末端１５３
アミノ酸を含む、ポリペプチドである。特に好ましいポリペプチドは、配列番号
１の残基１〜１５３を含む。「ペプチド」なる語は、約３、約４、約５、約６、
約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６
、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５
、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４
、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３
、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２
、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１
、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０
、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９
、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８
、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７
、約９８、約９９、約１００までの連続アミノ酸長の間の、タンパク質性セグメ
ントを意味すると理解される。従って、調節または血小板新生特性および機能を
保持した、様々な全長のＴＰＯタンパク質性セグメントが、本明細書に開示した
方法および組成物に有用であると考えられる。当業者は、組換え（ｒＴＰＯ）ペ
プチド、ポリペプチド、またはタンパク質の産生においてアミノ酸配列を付加、
変異、変化、修飾、および／または除去し得ることを認識し、血小板新生活性ま
たは凍結保存活性を促進する活性ＴＰＯ分子が、本発明に使用するために産生さ
れる。かかる変異形の産生法は、本明細書に記載される。

【００３０】 本発明の方法のある態様において、治療組成物を投与する経路は、非経口投与
により得る。非経口投与は、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、髄内注射また
はその組合せであり得る。ある態様において、ＴＰＯ含有組成物は、１用量あた
り、約０．１〜約１０μｇ／ｋｇ／体重で投与する。ある態様において、ＴＰＯ
含有組成物は、１用量あたり、約１〜約５μｇ／ｋｇ／体重で投与する。ある態
様において、ＴＰＯ含有組成物は、１用量あたり、約１．２〜約３．６μｇ／ｋ
ｇ／体重で投与する。ある態様において、ＴＰＯ含有組成物は、１用量あたり、
約１．２〜約２．４μｇ／ｋｇ／体重で投与する。好ましい態様において、１用
量あたりに投与するＴＰＯの量は、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、
約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約
１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１
．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．
６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３
、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、
約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約
４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５
．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．
２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９
、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、
約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約
８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、約９．０、約９
．１、約９．２、約９．３、約９．４、約９．５、約９．６、約９．７、約９．
８、約９．９、約１０．０μｇ／ｋｇ／体重までまたはそれ以上であり得る。

【００３１】 本発明の方法のある態様において、血小板減少症を誘導することが知られる薬
剤は、骨髄抑制処置、骨髄異形成、再生不良性貧血、先天性血小板減少症、免疫
性血小板減少症、周期性血小板減少症、化学物質、放射線への曝露、またはその
組合せである。ある態様において、化学物質は薬物または毒物であり得る。ある
態様において、骨髄抑制処置は、前駆細胞動員療法および白血球除去療法手順、
化学療法または放射線療法、またはその組合せに使用した細胞毒性剤であり得る
。ある好ましい態様において、骨髄抑制処置は、前駆細胞動員療法および白血球
除去療法手順に使用した細胞毒性剤であり得る。前駆細胞動員療法および白血球
除去療法手順に使用した細胞毒性剤は、幹細胞移植用であり得る。特に好ましい
態様において、骨髄抑制処置は化学療法である。これらの態様において、化学療
法は、自己骨髄移植のための骨髄切除化学療法、同種骨髄移植のための骨髄切除
化学療法、白血病処置のための骨髄毒性化学療法、または固形腫瘍の処置のため
の骨髄毒性化学療法、またはその組合せであり得る。ある態様において、化学療
法は、化学療法剤の投与を含み、ここでの薬剤は、アドリアマイシン、アスパラ
ギナーゼ、ブレオマイシン、カルシウムロイコボリン、カルムスチン、カルボプ
ラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダク
チノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、
フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ヘキサメチルメラミン
、ヒドロキシ尿素、イフォスファミド、ゲンシタビン、レバミソール、ブスルフ
ァン、ロムスチン、メクロルエタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メト
トレキサート、メチル−ＣＣＮＵ、トポアシン、マイトマイシンＣ、ミトキサン
トロン、プレドニゾロン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、タキソール、タ
キサン、タキソテア、チオグアニン、トリエチレン−トリホスホルアミド、ビン
ブラスチン、ビンクリスチン、またはその組合せを含むがこれに限定されない。
好ましい実施形態において、化学療法は、カルボプラチン、イフォスファミド、
アドリアマイシンまたはその組合せの投与による。

【００３２】 ある態様において、早い最下点剤は、アザシタジン、クロラムブシル、２−ク
ロロデオキシアデノシン、シタラビン、デカルバジン、ダウノルビシン、エピル
ビシン、フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド
、メクロレタミン、メトトレキサン、ミトキサントロン、タキソール、タキソテ
ア、テニポシド、チオテパ、トリメトレキサート、ビンブラスチン、ビンクリス
チン、化学療法剤の措置、例えばＡＩ、ＭＡＩＤ、ＣｙａＤＩＣ、タキソールと
プラチナ、プラチナを伴うまたは伴わないＣＴＸ、トパテカン、イフェックス、
ＥＳＨＡＰ、ＤＨＡＰ、またはその組合せを含み得るが、これに限定されない。
この態様において、最下点は、好ましくは、約１０〜約１４日目である。ＥＳＨ
ＡＰまたはＤＨＡＰについて、最下点は、好ましくは、約１４〜約１５日目であ
る。これらの薬剤および薬剤の任意の治療組合せを、当業者に公知の任意の方法
または措置に従って投与し得る。投与、措置およびかかる薬剤の組合せの例の参
考文献は、「Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐ
ｙ Ｒｅｇｉｍｅｎｔｓ」、Ｒｏｇｅｒ Ｗ．ａｎｄｅｒｓｏｎおよびＷｉｌｌ
ｉａｍ Ｊ．Ｄａｎａ編、Ｌａｄｅｒｌｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（１９
９１）および「Ｃｅｒｅｎｅｘ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｂｅ
ｎｊａｍｉｎ編、Ｃｅｒｅｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，Ｎ．Ｃ．（１９９３）を含む。

【００３３】 ある態様において、遅い最下点剤は、ブスルファン、カルボプラチン、カルム
スチン、ダクチノマイシン、エトポシド、フルダラビン、ロムスチン、メルファ
リン、マイトマイシン、プロカルバジン、チオグアニン、チオテパ、化学療法剤
の措置、例えばＣＥＰ、ＩＣＥ（イフォスファミド、カルボプラチン、エトポシ
ド）、カルボプラチンおよびタキソール、カルボプラチンおよびエトポシド、Ｂ
ＵＣＡＴ（ブスルファン、チオテパ、カルボプラチン）、およびその組合せを含
み得るがこれに限定されない。この態様において、最下点は、約１５〜約３５日
目であることが好ましい。

【００３４】 本発明の方法のある態様において、骨髄抑制処置は放射線療法である。放射線
療法は、哺乳動物への照射、または、哺乳動物への放射活性物質を含む治療組成
物の投与を含み得る。

【００３５】 本発明の方法のある態様において、血小板減少症に罹患またはその危険性のあ
る哺乳動物は、肝疾患、白血病、固形腫瘍、骨髄異形成、再生不良性貧血、先天
性血小板減少症、細菌またはウイルス感染、肝炎およびＨＩＶ免疫性血小板減少
症または結核、またはその組合せに罹患しているかまたはその危険性がある。

【００３６】 本発明の方法のある態様において、サイトカイン、ヘマトポエチン、コロニー
刺激因子、インターロイキン、成長因子、またはその組合せを含む治療に効果的
な組成物を投与する段階をさらに含む。好ましい態様において、その組合せは、
サイトカイン、コロニー刺激因子およびインターロイキンを含む治療に効果的な
組成物である。本明細書に使用したある実施形態のように、「サイトカイン」、
「系統特異的サイトカイン」、「治療」、および「哺乳動物」なる語は、米国特
許第５，８５１，９８４号に記載のと同じであり、これは、その全体を参照する
ことにより本明細書に組み込み、関連部分を以下に記載する。

【００３７】 『「サイトカイン」なる語は、細胞内メディエーターとして別の細胞に作用す
る、１つの細胞個体群により放出されたタンパク質の一般名である。かかるサイ
トカインの例は、リンホカイン、モノカイン、成長因子および伝統的なポリペプ
チドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メ
チオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲
状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；リラキシン；プ
ロリラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲
状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝成長因子；
線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊
死因子−α、および−β；ミュラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプ
チド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポ
エチン（ＴＰＯ）；神経成長因子、例えばＮＧＦ−β：血小板成長因子；トラン
スフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β；イン
シュリン様成長因子−ＩおよびＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子
；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β、および−ｙ；コロニ
ー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばマクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球
−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳ
Ｆ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、Ｉ
Ｌ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ
−１１、ＩＬ−１２；および白血病阻害因子（ＬＩＦ）およびキットリガンド（
ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。本明細書に使用したような、サイト
カインなる語は、天然源由来または組換え細胞培養液由来のタンパク質および天
然配列サイトカインの生物活性等価体を含む。

【００３８】 「系統特異的サイトカイン」とは、造血カスケードで比較的傾倒した細胞に作
用し、単一系統の血球の増殖をもたらすものである。かかるサイトカインの例は
、ＥＰＯ、ＴＰＯ、およびＧ−ＣＳＦを含む。

【００３９】 「治療」とは、治療処置および予防または防護尺度の両方を意味する。処置の
必要な者は、疾病または疾患にすでに罹患した者、並びに、疾病または疾患を予
防したい者を含む。』

【００４０】 上記のサイトカインに加えて、「サイトカイン」は、造血成長因子、ＳＣＦ、
ＦＬＴ−３リガンドまたは本明細書に列挙した任意のサイトカインのその組合せ
であり得る。特に好ましい態様において、サイトカインは、血小板新生活性を有
する。好ましいサイトカインは、キット−リガンド、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ
−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＦＬＴ−３、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、
ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１
またはＩＬ−１２を含むがこれに限定されない。他の特に好ましいサイトカイン
は、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦである。ある実施形態において、成長ホルモ
ンは、インシュリン様成長因子、ヒト成長ホルモンまたはウシ成長ホルモンであ
り得る。いくつかの態様において、糖タンパク質ホルモンは、卵胞刺激ホルモン
、甲状腺刺激ホルモンまたは黄体形成ホルモンである。本発明のいくつかの態様
において、腫瘍壊死因子は、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βである。本発明のある
態様において、神経成長因子はＮＧＦ−βである。本発明のある態様において、
インターフェロンは、インターフェロン−α、インターフェロン−βまたはイン
ターフェロン−γである。本発明のある態様において、コロニー刺激因子は、Ｍ
−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦであり得るがこれに限定されない。本
発明のある態様において、インターロイキンは、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−
２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９
、ＩＬ−１１またはＩＬ−１２であり得るがこれに限定されない。

【００４１】 本発明の方法のある態様において、ＴＰＯ含有治療組成物の投与は好中球減少
症を低下させる。

【００４２】 本明細書に使用したような「投与」は、記載のまたは当業者に公知の任意の技
術を使用した、薬剤、サイトカイン、ＴＰＯ分子、または本明細書の本発明の方
法および組成物で記載した他の組成物の送達またはその接触を意味する。かかる
方法は、医薬的に許容される担体内の投与を含む。

【００４３】 本明細書に定義したような「動物」は、脊椎動物または無脊椎動物の動物とし
て分類された任意の生物を意味する。本明細書に記載した本発明の方法および組
成物と共に使用するに好ましい動物は、「哺乳動物」を含み、これは、ヒト、家
庭内および農場動物、および動物園の動物、スポーツ用動物、またはペット動物
、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ネズミ等を含む哺乳動物として分類された任
意のものを含む。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。さらに、「患者」は、
本明細書に記載の方法を使用して処置を受ける者である。好ましい患者は、哺乳
動物、特に好ましい患者はヒトである。

【００４４】 本発明の方法のある態様において、哺乳動物は癌を有する。癌は、乳癌、大腸
癌、胃癌、尿生殖器癌、頭頸部癌、白血病、肺癌、リンパ腫、悪性メラノーマ、
多発性骨髄腫、卵巣癌、子宮体癌、膵臓癌、小児癌、肉腫、卵巣癌、原発性腹膜
悪性疾患、前立腺癌、脳腫瘍、ホジキン病、胚細胞腫瘍、婦人科悪性疾患、内分
泌腫瘍、またはその組合せを含み得るがこれに限定されない。

【００４５】 本明細書に使用したような、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、１つま
たは１つ以上を意味し得ると理解される。

【００４６】 以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある態様をさらに実証する
ために含まれる。本発明は、本明細書に提示した具体的な実施形態の詳細な説明
と組合せて、これらの１つ以上の図面を参照することによりより良く理解され得
る。

【００４７】例示的実施形態の説明 Ｉ．血小板の凍結保存 本発明は、ＴＰＯの新規方法および組成物に関する。ＴＰＯは、循環血小板を
非常に高く産生でき、よってアフェレーシスの収率を数倍増加させ、そして顕著
にフェレーシス時間を減少させることのできる、新規に発見された血小板新生サ
イトカインである。この領域での臨床開発を探究するために、発明者は、ＴＰＯ
処置患者由来の血小板を、凍結保存により長期間保存できるかどうかを調査した
。研究により、ＴＰＯ処置患者由来の凍結保存血小板は、正常ドナー由来の凍結
保存血小板に比較して、形態および機能の有意な高い保持が示されたことが実証
された。研究により、ＴＰＯは血小板を数倍増加させ、そして、細胞数および機
能の優れた回復をもって長期に（６ヶ月まで）凍結保存できる複数の単位の血小
板の収集が潜在的に可能となることが示される。

【００４８】 従って、本発明は、ＴＰＯ処置による血小板増多の誘導、多単位の血小板の収
集、救急使用用の自己血小板、シングルドナーまたは指定ドナー血小板、ランダ
ムドナー血小板の長期貯蔵および備蓄のための血小板の凍結保存、およびＨＬＡ
適合血小板用の貯蔵バンクの創製を包含する。従って、凍結保存血小板の備蓄は
、救急状況での適合血小板の入手可能性、供給危機、および血液バンクの在庫問
題を含む、輸血医学の数個の問題を軽減し得る。多サイクル骨髄抑制または骨髄
切除療法前のこの備蓄自己血小板は、迅速に入手可能な自己細胞を用いて重度の
血小板減少症の期間を支持するのに有用であり得る。

【００４９】 ランダムドナーからの複数回の血小板輸血の有用性を制限する一般的な問題の
１つは、自己免疫化である。この問題を最小限にするために、最小限のドナーへ
の曝露が好ましい。ＴＰＯ誘導血小板増多は、必要であれば特に高度に自己免疫
化した患者に使用するために利用可能な、ＨＬＡ適合血小板の貯蔵バンクを創製
するための、多くの血小板の獲得を容易にする。

【００５０】 ｒｈＴＰＯ誘導血小板の凍結保存戦略はまた、血小板減少症が計画した処置（
例えば心臓手術）の予期される合併症である、他の非腫瘍学的領域にも適用でき
る（Ａｌｖａｒｅｚら、１９９２；Ｇｒａｙｌｅｅら、１９９４）。この設定に
おける自己血小板の使用は、過度の不安および感染因子の伝達の懸念も軽減する
。正常ドナーでは、強力な生物学的効果および有意な毒性の欠失により、ＴＰＯ
を正常ドナーまたは家族メンバーに使用でき、凍結保存でき必要であれば利用可
能である多くの血小板の獲得を容易にする。従って、この新規戦略は、現在利用
可能な方法の限界を克服できる。

【００５１】 癌患者をＴＰＯおよび／またはｒｈＴＰＯで処置し、化学療法前、最中、また
は後に血小板を上昇させ得、そして、血小板をアフェレーシスにより収集し得、
それらを本明細書に記載の方法で凍結保存により保存し得、そしてそれらを患者
に輸血して戻し得ると考えられる。患者は、好ましくは、化学療法を受けている
癌患者などの血小板減少症に罹患した患者である。

【００５２】 トロンボソールは、特異的活性化経路を阻害し、冷貯蔵の有害な作用から保護
する、新規に開発された血小板安定化溶液である。本発明の方法は、アフェレー
シス用の血小板収率を顕著に増加させるためにＴＰＯを使用する点で（自己並び
に同種使用用）、および、それが新規な血小板凍結保存法を使用する点で（すな
わち、好ましくはトロンボソールおよび２％ＤＭＳＯ）独特である。発明者のin vitro研究により、ＴＰＯ処置患者由来の血小板は、慣用的な方法（５％または
６％ＤＭＳＯ）を用いてまたはトロンボソール＋２％ＤＭＳＯを用いて凍結保存
した正常ドナー由来の血小板と比較して、細胞機能の保持増強を示すことが示さ
れる。ＴＰＯは、血小板保存用の凍結保存剤として使用し得ると考えられる。さ
らに、ＴＰＯは、血小板活性の増強または保持を補助するために、血小板の投与
前、最中および／または後に投与し得る。

【００５３】 プロトコルは、確実な原理および以前の観察に基づいて設計するが、患者の処
置中になされる重要な観察に基づいて改良および微調整を受け得るようである。
以前の経験に基づき、収集のタイミングおよび収率、凍結保存、および自己血小
板の輸血を最適化するために、最初の設計の変更が必要であり得ることも可能で
ある。例えば、患者が、化学療法前に十分な単位の血小板を供与するために、血
小板数において適切な応答を増加できない設定において、または、患者が迅速な
進行性疾病に罹患し、化学療法前にＴＰＯを受け、血小板フェレーシスを有する
ことを待てない設定において、発明者は、回復リバウンド血小板増多中に、化学
療法＋ＴＰＯ後に血小板を収集し得る。臨床試験および近年の実験室での研究に
より、それが支持されている。同じように、追加用量のＴＰＯ投与が、輸血血小
板の生存／機能を向上させるために、凍結保存血小板の輸血前、最中、および後
に必要であり得る。

【００５４】 ＩＩ．血小板減少症を低下させるためのＴＰＯの投与 化学療法前の癌患者への組換えヒトＴＰＯ（ｒｈＴＰＯ）の１用量の投与は、
血小板産生延長の強力な刺激であり、数人の患者において１００万またはそれ以
上まで循環血小板数を増加する。この知見により、ｒｈＴＰＯは、多サイクル骨
髄抑制療法または骨髄切除処置の前に自己供与のために癌患者に与えることがで
きる可能性が生じる。従って、本発明は、血小板減少症を減少または予防するた
めのＴＰＯの投与を含む。本発明は、最適ＴＰＯ用量スケジュールは、毎日以外
の投与であることを実証する。

【００５５】 骨髄抑制処置に関連したＴＰＯの投与のタイミングは、要約に上記し、具外的
実施例で下記したような、使用する薬剤に最適の結果をもたらす。長く（例えば
ＡＩ−＞４日間）、および／または早い最下点（例えばＡＩ−約１２日目）を有
する措置を用いて、後用量と共に前用量のｒｈＴＰＯが有益であり得る。一方、
短い（例えば単一薬剤としてのカルボプラチン−１または２日の措置）、および
／または遅延最下点（＜１２日目、約１６日、例えばカルボプラチンを用いて）
を有する措置では、ｒｈＴＰＯの後用量（単独）が効果的であり得る。これらの
知見により、ｒｈＴＰＯのより早い投与（すなわち化学療法前すなわち前用量）
が有益であり得ることが示される。一例で、１用量のｒｈＴＰＯを、ＡＩの前に
投与し（前用量）、２用量をＡＩ後に（後用量）投与した場合、ｒｈＴＰＯは、
この方法により血小板回復を増強し、最下点血小板数は数人の患者でより高かっ
た。これらの知見により、ｒｅＴＰＯでの複数回の前用量は、血小板の最下点お
よび回復に向上した効果を提供し得ることが示される。

【００５６】 ＩＩＩ．トロンボポエチン核酸 Ａ．遺伝子およびＤＮＡセグメント 本発明は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む方法および組成物に関する。Ｔ
ＰＯおよび他のサイトカインおよびペプチドホルモンの、ヌクレオチドおよびタ
ンパク質、ポリペプチドおよびペプチド配列は以前に開示されており、国立セン
ターのバイオテクノロジー情報ＧｅｎｂａｎｋおよびＧｅｎＰｅｐｔデータベー
ス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に見出し得
る。特に、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＢ０１４６８３、ＡＢ０１４６８２、ＡＢ
０１４６８１、Ｌ３６０５２、Ｌ３６０５１、Ｅ１２２１５、Ｅ１２２１４、Ｅ
１２１８３、Ｅ１２１８２およびＥ１２１８１を含むがこれに限定されないヌク
レオチド配列が、本発明の方法および組成物のための組換えＴＰＯ（ｒＴＰＯ）
の産生に有用であると考えられる。Ｇｅｎｅｂａｎｋ寄託番号ＡＢ０１４６８３
、ＡＢ０１４６８２、ＡＢ０１４６８１、Ｌ３６０５２、Ｌ３６０５１、Ｅ１２
２１５、Ｅ１２２１４、Ｅ１２１８３およびＥ１２１８２を含むがこれに限定さ
れない、ヒトＴＰＯ配列から得られたヌクレオチド配列が、本発明の方法および
組成物のための組換えＴＰＯ（ｒｈＴＰＯ）の産生に特に有用であると考えられ
る。

【００５７】 本発明はまた、トロンボポエチンをコードする単離ＤＮＡセグメントおよび組
換えベクター、および、ＤＮＡ技術の適用による、配列番号１およびその生物学
的等価体を使用した、野生型、多形または変異トロンボポエチンを発現する組換
え宿主細胞の創製および使用に関する。本明細書に記載したＴＰＯ、ｒＴＰＯお
よび関連トロンボポエチンヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、得る、単離する
、合成する、変異する、化学修飾する、発現する、精製する、その活性を検出す
る、および投与および／または使用する方法に加えて、かかる方法は、米国特許
第５，６４１，６５５号、第５，８３０，６４７号、第５，７９５，５６９号、
第５，７６６，８９７号、第５，７６６，５８１号、第５，７５６，０８３号、
第５，７４４，５８７号、第５，７３３，７４６号、第５，６９６，２５０号、
第５，５９３，６６６号、第５，５７１，６８６号、第５，２５０，７３２号お
よび第４，８９４，４４０号により例示され、これはその全体を参照することに
より本明細書に組み込む。

【００５８】 本発明は、全ゲノムＤＮＡを含まず、トロンボポエチン活性を有するタンパク
質、ポリペプチド、またはペプチドを発現できる、哺乳動物細胞、特にブタ、ネ
ズミおよびヒト細胞から単離可能なＤＮＡセグメントに関する。

【００５９】 本明細書に使用したような、「ＤＮＡセグメント」なる語は、特定の種の全ゲ
ノムＤＮＡを含まないように単離されたＤＮＡ分子を意味する。それ故、ＴＰＯ
をコードするＤＮＡセグメントは、全哺乳動物、特にブタ、ネズミまたはヒトの
ゲノムＤＮＡから単離された、または含まないように精製された、ＴＰＯコード
配列を含むＤＮＡセグメントを意味する。「ＤＮＡセグメント」に含まれるのは
、ＤＮＡセグメントおよび該セグメントのより小さな断片、および、例えばプラ
スミド、コスミド、ファージ、ウイルス等を含む組換えベクターである。

【００６０】 同様に、単離または精製トロンボポエチン遺伝子を含むＤＮＡセグメントは、
トロンボポエチンタンパク質コード配列および、ある態様において、他の天然遺
伝子またはタンパク質コード配列から実質的に単離された調節配列を含むＤＮＡ
セグメントを意味する。この態様において、「遺伝子」なる語は、簡明化するた
めに、機能的タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドコード単位を意味するた
めに使用される。当分野で理解されるように、この機能的用語は、ゲノム配列、
ｃＤＮＡ配列および、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タ
ンパク質および変異体を発現する、または発現するように適合し得るより小さな
操作された遺伝子セグメントの両方を含む。

【００６１】 「他のコード配列から実質的に単離」なる語は、目的の遺伝子が、この場合ト
ロンボポエチン遺伝子が、ＤＮＡセグメントのコード領域の重要な部分を形成し
、そして、ＤＮＡセグメントは、天然コードＤＮＡの大部分、例えば大染色体断
片または他の機能的遺伝子またはｃＤＮＡコード領域を含まないことを意味する
。勿論、これは、最初に単離されたＤＮＡセグメントを意味し、ヒトの手により
セグメントに後に付加された遺伝子またはコード領域を除外しない。

【００６２】 特定の実施形態において、本発明は、配列番号２による、または配列番号２に
本質的に示した連続アミノ酸配列をそのアミノ酸配列内に含む、ＴＰＯタンパク
質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするＤＮＡ配列を取り込んだ単離ＤＮ
Ａセグメントおよび組換えベクターに関する。

【００６３】 「配列番号２に本質的に示した配列」なる語は、配列は実質的に配列番号２の
一部に対応し、配列番号２に、またはその生物学的機能等価体に同一ではない比
較的少数のアミノ酸を有することを意味する。

【００６４】 「生物学的機能等価体」なる語は、当分野でよく理解されており、本明細書で
さらに詳細に定義する。従って、配列番号２のアミノ酸に同一または機能的に等
価な約７０％ないし約８０％；またはより好ましくは、約８１％ないし約９０％
；またはさらにより好ましくは、約９１％ないし約９９％のアミノ酸を有する配
列は、生物活性、すなわちタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの血小板新
生および／または凍結保存活性が維持される場合、「配列番号２に本質的に示し
た配列」である。

【００６５】 ある他の実施例において、本発明は、配列番号１に本質的に示した核酸配列を
その配列内に含む、単離ＤＮＡセグメントおよび組換えベクターに関する。「配
列番号１に本質的に示した」なる語は、上記したのと同じ意味で使用され、核酸
配列が実質的に配列番号１の一部に対応し、配列番号１のコドンに同一ではない
か、または機能的に等価ではない、比較的少数のコドンを有することを意味する
。ここでも、血小板新生および／または凍結保存活性を示すタンパク質をコード
するＤＮＡセグメントが最も好ましい。

【００６６】 「機能的に等価なコドン」なる語は、本明細書で、アルギニンまたはセリンの
６つのコドンなどの、同じアミノ酸をコードするコドンを意味するために使用し
、また、生物学的に等価なアミノ酸をコードするコドンも意味する。ヒト細胞に
おけるＴＰＯ発現を最適化するための、コドンを、表１に、使用優先度の順に、
左から右に示す。従って、アラニンの最も好ましいコドンは「ＧＣＣ」であり、
最も好ましくないのは「ＧＣＧ」である（以下の表１参照）。

【００６７】

【表１】

【００６８】 アミノ酸および核酸配列は、付加ＮまたはＣ末端アミノ酸または５'または３'
配列などの付加残基を含み得、タンパク質発現が関与する場合の生物学的タンパ
ク質活性の維持を含む、上記に示した基準に配列が合致する限り、依然として本
明細書に開示した配列の１つで本質的に示されることが理解される。末端配列の
付加は、特に、例えば、コード領域の５'または３'部分のいずれかにフランキン
グする様々な非コード配列を含み得るか、または、様々な内部配列、すなわち遺
伝子内に存在することが知られるイントロンを含み得る、核酸配列に適用する。

【００６９】 イントロンまたはフランキング領域を除き、および遺伝子コードの縮重を可能
として、配列番号１のヌクレオチドに同一である、約７０％ないし約７９％、ま
たはより好ましくは、約８０％ないし約８９％、またはさらにより好ましくは、
約９０％ないし約９９％のヌクレオチドを有する配列は、「配列番号１に本質的
に示した」配列である。

【００７０】 配列番号１に示したものと本質的に同じ配列はまた、比較的ストリンジェント
（厳密）な条件下で、配列番号１の相補物を含む核酸セグメントにハイブリッド
できる、配列として機能的に定義し得る。適切な比較的ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件は、本明細書に開示したように、当業者に公知である。

【００７１】 ハイブリダイゼーションは、二本鎖分子または部分的二本鎖性質を有する分子
の形成を意味すると理解される。ストリンジェントな条件は、２つの相同的核酸
配列間のハイブリダイゼーションを可能とするが、ランダム配列のハイブリダイ
ゼーションは除く条件である。例えば、低温および／または高イオン強度でのハ
イブリダイゼーションは、低ストリンジェンシーと称される。高温および／また
は低イオン強度でのハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシーと称され
る。低ストリンジェンシーは、一般に、０．１５Ｍ〜０．９Ｍの塩（例えばＮａ
Ｃｌ）で、２０℃〜５０℃の温度範囲で実施する。高ストリンジェンシーは、一
般に、０．０２Ｍ〜０．１５Ｍの塩（例えばＮａＣｌ）で５０℃〜７０℃の温度
範囲で実施する。所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、一部に
は、具体的なプローブの長さ、標的配列の長さおよび塩基含有量、およびハイブ
リダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまた
は他の溶媒の存在により決定されると理解される。また、これらの範囲は、単な
る例として記載し、特定のハイブリダイゼーション反応の所望のストリンジェン
シーは、しばしば、陽性および陰性対照とに比較により経験的に決定されると理
解される。

【００７２】 従って、開示のヌクレオチド配列は、相補的な遺伝子またはＲＮＡのひと配列
と二重鎖分子を選択的に形成できること、または、組織由来ＤＮＡまたはＲＮＡ
の増幅用プライマーを提供できることから使用され得る。想定される適用に応じ
て、標的配列に対する様々な程度のプローブの選択性を達成するために様々なハ
イブリダイゼーション条件を使用することが好ましい。

【００７３】 高い選択性を必要とする適用のために、ハイブリッドを形成するために比較的
ストリンジェントな条件を使用することが好ましい。例えば、約０．０２Ｍ〜約
０．１０ＭのＮａＣｌで、約５０℃〜約７０℃の温度により提供されるような、
比較的低塩および／または高温条件。かかる高ストリンジェンシー条件は、プロ
ーブと鋳型または標的鎖の間のミスマッチを、あるとしてもほとんど許容しない
ので、特異的遺伝子の単離または特異的ｍＲＮＡ転写物の検出に特に適切である
。一般に、条件は、漸増量のホルムアミドの添加により、よりストリンジェント
にし得ると理解される。

【００７４】 天然には、本発明はまた、配列番号１に示した配列に相補的、または本質的に
相補的なＤＮＡセグメントを包含する。「相補的」である核酸配列は、標準的な
ワトソン−クリック相補則に従って塩基対を形成できるものである。本明細書に
使用したような、「相補配列」なる語は、実質的に相補的な核酸配列を意味し、
これは、上記に示した同じヌクレオチド比較により評価し得るか、または、本明
細書に記載したような比較的ストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸セグ
メントにハイブリッドできるとして定義し得る。

【００７５】 コード配列自体の長さに関係なく、核酸セグメントは、他のＤＮＡ配列、例え
ばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、付加制限酵素部位、
マルチクローニングサイト、他のコードセグメント等と合わせ得、よってその全
長はかなり変化し得る。それ故、ほとんどどの長さの核酸断片も使用し得、全長
は好ましくは目的の組換えＤＮＡプロトコルでの調製および使用のし易さにより
制限されると考えられる。

【００７６】 例えば、配列番号１と同一または相補的な連続的なヌクレオチドのひと配列を
含む、例えば、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５
、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４
、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３
、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２
、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１
、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０
、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９
、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８
、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７
、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６
、約９７、約９８、約９９、約１００、約１２５、約１５０、約２５０、約３０
０、約４００、約６００、約７５０、約８００または約９００ヌクレオチド、お
よび約１，０００，０００、約７５０，０００、約５００，０００、約２５０，
０００、約１００，０００、約５０，０００、約２０，０００、または約１０，
０００、または約５０，０００塩基対長までの核酸断片を調製し得、約３，００
０のセグメントがある場合に好ましい。ある場合では、ＤＮＡの染色体サイズ片
を含む、１００万またはそれ以上の塩基のヌクレオチドセグメントが、有用であ
ると考えられる。全長約１，０００、約５００、約２００、約１００および約５
０塩基対長（全ての中間の長さを含む）を有するＤＮＡセグメントも有用である
と考えられる。

【００７７】 これらの内容での「中間の長さ」は、引用した範囲間の全ての長さ、２００〜
５００；５００〜１，０００；１，０００〜２，０００；２，０００〜３，００
０；３，０００〜５，０００；５，０００〜１０，０００の範囲、約１２，００
１、１２，００２、１３，００１、１３，００２、１５，０００、２０，０００
等を含みこれ以下の全ての整数を含む；例えば１０、１１、１２、１３、１４、
１５、１６、１７、１８、１９、２０等；２１、２２、２３等；３０、３１、３
２等；５０、５１、５２、５３等；１００、１０１、１０２、１０３等；１５０
、１５１、１５２、１５３等を意味すると容易に理解されよう。

【００７８】 開示したヌクレオチド配列あたりで設計した様々なプローブおよびプライマー
は任意の長さであり得る。例えば、最初の残基は１であり、第二の残基は２であ
る等と、数値を配列に割当てることにより、全てのプライマーを定義するアルゴ
リズムを提案できる。 ｎからｎ＋ｙ ここでのｎは、１から配列の最後の数までの整数であり、ｙは、プライマーの長
さから１を引いたものであり、ここでのｎ＋ｙは、配列の最後の数を超えない。
従って、１０ｍｅｒでは、プローブは、塩基１〜１０、２〜１１、３〜１２．．
．等々に対応する。１５ｍｅｒでは、プローブは、塩基１〜１５、２〜１６、３
〜１７．．．等々に対応する。２０ｍｅｒでは、プローブは、塩基１〜２０、２
〜２１、３〜２２．．．等々に対応する。

【００７９】 本発明は、配列番号１の特定の核酸およびアミノ酸配列に限定されないことが
理解される。それ故、組換えベクターおよび単離ＤＮＡセグメントは、様々に、
これらのコード領域自体（コード領域は基本コード領域に選択した変化または修
飾を有する）を含み得るか、または、かかるコード領域をそれにもかかわらず含
むより大きなポリペプチドをコードし得るか、または、変異形アミノ酸配列を有
する生物機能等価タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードし得る。

【００８０】 ＤＮＡセグメントは、生物機能等価ＴＰＯタンパク質、ポリペプチドおよびペ
プチドを包含する。かかる配列は、核酸配列内およびかくしてコードされるタン
パク質に存在することが知られる、コドン重複性および機能等価性の結果として
生じ得る。別に、機能等価タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、交換す
るアミノ酸の特性の考慮に基づいて、タンパク質構造の変化を操作し得る、組換
えＤＮＡ技術の適用により創製し得る。人により設計された変化は、例えば、本
明細書の下記に議論したような部位特異的変異誘発技術の適用により導入し得、
例えば、タンパク質の抗原性の改良を導入、すなわち、患者への投与時のその抗
原性を減少し得るか、または、分子レベルでのタンパク質トロンボポエチン活性
を調べるために変異体を試験し得る。

【００８１】 融合タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを調製し得、例えば、ここでは
トロンボポエチンタンパク質コード領域は、精製または免疫検出目的用などの、
所望の機能を有する他のタンパク質またはペプチドを有する同じ発現ユニット内
にアラインしている（例えば、アフィニティークロマトグラフィーおよび酵素標
識コード領域によりそれぞれ精製され得るタンパク質）。

【００８２】 「標準的」ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチド塩基に加えて、修飾塩基も、本発
明の特定の適用での使用に考えられる。例示的であり限定するものではない修飾
塩基の表を、本明細書の以下に示す。

【００８３】

【表２】

【表２（つづき）】

【００８４】 Ｂ．組換えベクター、宿主細胞および発現 「発現ベクターまたは作成物」なる語は、核酸コード配列の一部または全部を
転写できる、遺伝子産物をコードする核酸を含む、任意の型の遺伝子作成物を意
味する。転写物は、タンパク質に翻訳され得るが、必要ではない。従って、ある
実施形態において、発現は、遺伝子の転写およびＲＮＡの遺伝子産物への翻訳の
両方を含む。他の実施形態において、発現のみが、例えば、アンチセンス作成物
を作成するための、核酸の転写を含む。

【００８５】 特に有用なベクターは、ＤＮＡセグメントのコード部分（全長タンパク質、ポ
リペプチドまたはより小さなペプチドをコードする）が、プロモーターの転写制
御下に位置するベクターであると考えられる。「プロモーター」は、遺伝子の特
異的転写の開始に必要な、細胞の合成機械または導入合成機械により認識される
ＤＮＡ配列を意味する。「作動可能に位置」、「制御下」、または「転写制御下
」なる語句は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を
制御するために核酸に関して正しい位置および配向にあることを意味する。

【００８６】 プロモーターは、本明細書に開示した組成物に関連して、例えば、組換えクロ
ーニングおよび／またはＰＣＲ^ＴＭ技術を使用して、コードセグメントまたはエ
キソンの上流に位置する５'非コード配列を単離することにより得られ得る、ト
ロンボポエチン遺伝子と天然に関連した、プロモーター形であり得る（ＰＣＲ^{Ｔ Ｍ} 技術は、米国特許第４，６８３，２０２号および米国特許第４，６８２，１９
５号に開示され、各々を参照することにより本明細書に組み込む）。

【００８７】 他の実施形態において、ある利点は、組換えプロモーターまたは異種プロモー
ターの制御下に、コードＤＮＡセグメントを配置することにより得られると考え
られる。本明細書に使用したような、組換えまたは異種プロモーターは、その天
然環境ではトロンボポエチン遺伝子に普通関連していないプロモーターを意味す
ると捉えられる。かかるプロモーターは、他の遺伝子と普通に関連したプロモー
ター、および／または任意の他の細菌、ウイルス、真核細胞、または哺乳動物細
胞から単離したプロモーター、および／または「天然」ではない、すなわち、異
なるプロモーターからの異なるエレメント、または発現を増加、減少または変化
させる変異を含む、人の手により作成されたプロモーターを含み得る。

【００８８】 天然には、発現に選択した、細胞型、生物、またはさらには動物でのＤＮＡセ
グメントの発現を効果的に指示するプロモーターを使用することが重要である。
タンパク質発現のためのプロモーターおよび細胞型組合せの使用は、一般に、分
子生物学の分野の専門家には公知であり、例えば、参照することにより本明細書
に組み込んだＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照する。使用するプロモータ
ーは、構成性または誘導性であり得、適切な条件下で使用して、組換えタンパク
質またはペプチドの大規模での産生には有利であるような、導入ＤＮＡセグメン
トの高レベルの発現を指示できる。

【００８９】 プロモーターの少なくとも１つのモジュールが、一般に、ＲＮＡ合成のための
開始部位を位置づけるように機能する。最もよく知られるこの例は、ＴＡＴＡボ
ックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠いたあるプロモーター、例えば哺乳動物
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳ
Ｖ４０後期遺伝子のプロモーターでは、開始部位自体に存在する別個のエレメン
トが開始の位置を固定するのに役立つ。

【００９０】 追加のプロモーターエレメントは、転写開始頻度を調節する。典型的には、こ
れらは開始部位の上流の３０〜１１０ｂｐの領域に位置するが、多くのプロモー
ターが、同様に開始部位の下流に機能的エレメントを含むことが示されている。
プロモーターエレメント間のスペーシングは、エレメントが反転または互いに相
対的に移動した場合にプロモーター機能が保存されるように、柔軟である。ｔｋ
プロモーターでは、プロモーターエレメント間のスペーシングは、活性が下降し
始める前に、５０ｂｐまで離れるように増加できる。プロモーターに応じて、個
々のエレメントは、共同的にまたは独立的に機能して、転写を活性化できるよう
である。

【００９１】 核酸の発現を制御するために使用する特定のプロモーターは、標的細胞で核酸
を発現できる限り、重要であるとは考えられていない。従って、ヒト細胞を標的
化する場合、ヒト細胞で発現できるプロモーターに隣接して、およびその制御下
に、核酸コード領域を配置することが好ましい。一般的に言えば、かかるプロモ
ーターは、ヒトまたはウイルスプロモーターのいずれかを含み得る。

【００９２】 様々な他の実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺
伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス末端反
復配列を使用して、本核酸の高レベル発現を得ることができる。発現を達成する
ための当分野で公知の他のウイルスまたは哺乳動物細胞または細菌ファージプロ
モーターの使用は、発現レベルがある目的に十分である場合には、同様に考えら
れる。以下の表３および４は、トロンボポエチン遺伝子の発現を調節するための
、本発明の内容において使用し得る、数個のエレメント／プロモーターを列挙す
る。このリストは、発現の促進に関与する全ての可能性あるエレメントの網羅と
は捉えられず、単に、その例である。

【００９３】 エンハンサーは、最初、ＤＮＡの同じ分子上の遠い位置に位置したプロモータ
ーからの転写を増加させる遺伝エレメントとして検出された。長い距離におよび
作用できるこの能力は、原核転写調節の古典的な研究において以前にはほとんど
見られなかった。その後の研究により、エンハンサー活性を有するＤＮＡ領域は
、プロモーターのように構成されることが示された。すなわち、それらは多くの
個々のエレメントからなり、その各々が１つ以上の転写タンパク質に結合する。

【００９４】 エンハンサーとプロモーターの間の基本的な違いは作動である。エンハンサー
領域は全体として、遠くの転写を刺激しなければならず、これはプロモーター領
域またはその成分エレメントについてはそうである必要はない。一方、プロモー
ターは、特定の部位および特定の配向でＲＮＡ合成の開始を指示する１つ以上の
エレメントを有さなければならず、一方、エンハンサーはこれらの特異性を欠失
している。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば、重複し連続的であり
、しばしば非常に類似したモジュラー構成を有するようである。

【００９５】 さらに、任意のプロモーター／エンハンサー組合せ（真核プロモーターデータ
ベースＥＰＤＢのように）も、発現の駆動に使用できる。Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ
６細胞質発現系の使用は別の可能な実施形態である。真核細胞は、適切な細菌ポ
リメラーゼが、送達複合体の一部としてまたは追加の遺伝子発現作成物として提
供される場合、ある細菌プロモーターからの細胞質転写を支持できる。

【００９６】

【表３】

【表３（つづき）】

【００９７】

【表４】

【００９８】 トロンボポエチンタンパク質の発現に戻り、一旦適切なクローンまたはクロー
ン群が得られれば、それらがｃＤＮＡまたはゲノムをベースとしていようと、発
現系の調製に進め得る。原核または真核系での発現用のＤＮＡセグメント（群）
の操作を、組換え発現で当業者には一般に既知の技術により実施し得る。任意の
発現系をタンパク質の発現に使用し得ると考えられる。

【００９９】 ｃＤＮＡおよびゲノム配列の両方が、真核発現に適している。なぜなら、宿主
細胞は、一般に、ゲノム転写物を処理し、タンパク質に翻訳するために機能的ｍ
ＲＮＡを生成するからである。一般的に言えば、組換え遺伝子としてｃＤＮＡ形
の遺伝子を使用することがより簡便であり得る。ｃＤＮＡ形の使用は、遺伝子の
サイズが、一般にはるかに小さく、標的細胞をトランスフェクトするのに、ゲノ
ム遺伝子（これは典型的には、ｃＤＮＡ遺伝子よりも一次元またはそれ以上大き
い）よりも容易に使用される点で利点を提供すると考えられる。しかし、特定の
遺伝子のゲノム形を所望であれば使用し得ると考えられる。

【０１００】 発現では、典型的には、転写物の適切なポリアデニル化を行うためにポリアデ
ニル化シグナルを含む。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の成功裡の実
施には重要であるとは考えられず、任意のかかる配列を使用し得る。好ましい実
施形態は、簡便で様々な標的細胞でよく機能することが知られる、ＳＶ４０ポリ
アデニル化シグナルおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。ま
た、発現カセットのエレメントとして終結因子も考えられる。これらのエレメン
トは、メッセージレベルを増強およびカセットから他の配列への解読を最小限に
するのに役立ち得る。

【０１０１】 具体的な開始シグナルも、コード配列の効率的翻訳に必要であり得る。これら
のシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含
む、外来性翻訳制御シグナルも提供される必要があり得る。当業者は、容易にこ
れを決定し、必要なシグナルを提供することができる。開始コドンは、全挿入断
片の翻訳を確実にするために、所望のコード配列の読み枠と「インフレーム」で
なければならないことは公知である。外来性翻訳制御シグナルおよび開始コドン
は、天然でも合成でもよい。発現の効率は、適切な翻訳エンハンサーエレメント
の包含により増強し得る。

【０１０２】 ＴＰＯタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、他の選択したタンパク質
と共に共発現し得、ここでのタンパク質は、同じ細胞で共発現し得るか、または
ＴＰＯ遺伝子（群）が、すでに別の選択タンパク質を有する細胞に提供され得る
ことが提案される。共発現は、細胞を、２つの別個の組換えベクター（各々、そ
れぞれのＤＮＡのいずれかのコピーを有する）と共トランスフェクトすることに
より達成され得る。別に、単一組換えベクターを、両方のタンパク質のコード領
域を含むように作成し得、これを次いで、単一ベクターでトランスフェクトした
細胞で発現できる。いずれの場合にも、本明細書の「共発現」なる語は、同じ組
換え細胞でのＴＰＯ遺伝子（群）および他の選択タンパク質の両方の発現を意味
する。

【０１０３】 本明細書に使用したような、「操作」および「組換え」細胞または宿主細胞な
る語は、ＴＰＯタンパク質をコードするｃＤＮＡまたは遺伝子などの外来性ＤＮ
Ａセグメントまたは遺伝子が導入された細胞を意味すると捉えられる。それ故、
操作された細胞は、組換え導入外来性ＤＮＡセグメントまたは遺伝子を含まない
、天然細胞から識別可能である。従って、操作された細胞は、人の手により導入
された遺伝子または遺伝子群を有する細胞である。組換え細胞は、導入ｃＤＮＡ
またはゲノム遺伝子を有するものを含み、そしてまた、特定の導入遺伝子と天然
には関連していないプロモーターに隣接して位置した遺伝子を含む。

【０１０４】 本発明に従って、野生型または天然型の、組換えＴＰＯタンパク質、ポリペプ
チドまたはペプチドを発現するために、１つまたはそれ以上のプロモーターの制
御下で、野生型、または変異型トロンボポエチンタンパク質コード核酸を含む発
現ベクターを調製する。コード配列をプロモーターの「制御下」にもってくるた
めに、転写読み枠の転写開始部位の５'末端を、一般に選択したプロモーターの
約１ないし約５０ヌクレオチド「下流」（すなわち３'）に配置する。「上流」
プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コード組換えタンパク質の発現を促進
する。これは、この内容で「組換え発現」の意味である。

【０１０５】 様々な宿主発現系でのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド発現を達成す
るための、適切な核酸および転写／翻訳制御配列を含む発現ベクターを作成する
、多くの標準的な技術が利用可能である。発現に利用可能な細胞型は、組換えバ
クテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクター
で形質転換した、細菌、例えば大腸菌および枯草菌を含むがこれに限定されない
。

【０１０６】 原核宿主のある例は、大腸菌株ＲＲ１、大腸菌ＬＥ３９２、大腸菌Ｂ、大腸菌
Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ番号３１５３７）、並びに、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ−、λ
−、原栄養株、ＡＴＣＣ番号２７３３２５）；桿菌、例えば枯草菌；および他の
腸内細菌、例えばサルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)、セ
ラチア・マルケセンス(Serratia marcescens)、および様々なシュードモナス種
である。

【０１０７】 一般に、宿主細胞と適合性の種に由来するレプリコンおよび制御配列を含むプ
ラスミドベクターを、これらの宿主に関連して使用する。ベクターは、普通、複
製部位、並びに、形質転換細胞での表現型選択を提供できる標識配列を有する。
例えば、大腸菌は、しばしば、大腸菌種由来のプラスミドである、ｐＢＲ３２２
の誘導体を使用して形質転換する。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラ
サイクリン耐性遺伝子を含み、従って、形質転換細胞の容易な同定手段を提供す
る。ｐＢＲプラスミド、または他の微生物プラスミドまたはファージはまた、そ
れ自体のタンパク質の発現のために微生物の使用できるプロモーターを含むか、
または含むように修飾しなければならない。

【０１０８】 さらに、宿主微生物と適合性であるレプリコンおよび制御配列を含むファージ
ベクターを、これらの宿主と関連して形質転換ベクターとして使用できる。例え
ば、ファージλＧＥＭ^ＴＭ−１１は、大腸菌ＬＥ３９２などの宿主細胞の形質転
換に使用できる、組換えファージベクターの作成に利用し得る。

【０１０９】 さらに有用なベクターは、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅら、１９８５）；お
よび後の精製および分離または切断のための、グルタチオンＳ−トランスフェラ
ーゼ（ＧＳＴ）可溶性融合タンパク質の作成に使用するためのｐＧＥＸベクター
を含む。他の適切な融合タンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、ユビキチン等を
有するものである。

【０１１０】 組換えＤＮＡ作成に最も一般的に使用されるプロモーターは、β−ラクタマー
ゼ（ペニシリン）、ラクトースおよびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系
を含む。これらは最も一般的に使用されるが、他の微生物プロモーターも発見お
よび使用され、そのヌクレオチド配列に関する詳細が発表され、これにより、当
業者はプラスミドベクターとそれらを機能的に連結できる。

【０１１１】 細菌細胞、例えば大腸菌での組換えタンパク質産生に関する以下の詳細が、一
般に組換えタンパク質産生に関する例示的情報により提供され、特定の組換え発
現系へのその適用は、当業者には公知である。

【０１１２】 発現ベクターを含む、細菌細胞、例えば大腸菌は、多くの適切な培地のいずれ
かで、例えばＬＢで増殖する。組換えタンパク質の発現は、例えば、ＩＰＴＧの
培地への添加により、またはインキュベートをより高温に切り替えることにより
誘導し得る。細菌をさらなる期間、一般に約２〜２４時間培養した後、細胞を遠
心分離により収集し、洗浄して残留培地を除去する。

【０１１３】 次いで、細菌細胞を、例えば細胞ホモジナイザー中での破壊により溶解し、遠
心分離して、可溶性細胞成分から高密度の封入体および細胞膜を分離する。この
遠心分離は、高密度の封入体が、スクロースなどの糖の、緩衝液への取り込みに
より選択的に濃縮される条件下および選択的スピードでの遠心分離により実施で
きる。

【０１１４】 多くの場合のように、組換えタンパク質が、その封入体で発現される場合、こ
れらを、数個の溶液のいずれかで洗浄して、汚染宿主タンパク質を除去し、次い
で、高濃度の尿素（例えば８Ｍ）またはカオトロッピック剤、例えばグアニジン
塩酸塩を含む溶液に、β−メルカプトエタノールまたはＤＴＴ（ジチオトレイト
ール）などの還元剤の存在下で可溶化できる。

【０１１５】 いくつかの環境下で、タンパク質が、天然タンパク質のコンフォメーションに
より密接に類似したコンフォメーションへの再フォールディングプロセスを受け
るに適切な条件下で、数時間タンパク質をインキュベートすることが有利であり
得る。かかる条件は、一般に、低タンパク質濃度、５００ｍｇ／ｍｌ未満、低レ
ベルの還元剤、２Ｍ以下の尿素濃度、およびしばしば、タンパク質分子内のジス
ルフィド結合の交換を容易にする還元および酸化グルタチオンの混合物などの還
元剤の存在を含む。

【０１１６】 再フォールディングプロセスは、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、または天
然分子に特異的な抗体（天然分子またはより少量の組換えタンパク質を用いてワ
クチン接種した動物から得ることできる）を用いてモニタリングできる。再フォ
ールディング後、次いで、タンパク質をさらに精製し、イオン交換レジン、ゲル
透過レジンを含む数個の支持体のいずれかまたは様々なアフィニティーカラム上
でのクロマトグラフィーにより、再フォールディング混合物から分離できる。

【０１１７】 サッカロミセスでの発現のために、例えば、プラスミドＹＲｐ７を一般的に使
用する。このプラスミドは、トリプトファン中での増殖能を欠失した酵母変異株
、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１の選択マーカーを提供する
ｔｒｐ１遺伝子をすでに含む。次いで、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒ
ｐ１病変の存在は、トリプトファンの非存在下での増殖による、形質転換を検出
するための効率的な環境を提供する。

【０１１８】 酵母ベクター中の適切なプロモーター配列は、３−ホスホグリセレートキナー
ゼまたは他の解糖酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフル
クトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレート
ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコ
ースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのプロモーターを含む。適切な発現プ
ラスミドの作成において、これらの遺伝子に関連した終結配列を、ｍＲＮＡのポ
リアデニル化および終結を提供するために発現されることが望ましい配列の３'
の発現ベクターにライゲートする。

【０１１９】 増殖条件により制御される転写の追加の利点を有する他の適切なプロモーター
は、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒
素代謝に関連した分解酵素、および前記グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒド
ロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモ
ーター領域を含む。

【０１２０】 微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞の培養液も宿主として使用し得る。原
則では、脊椎動物培養液由来であれ無脊椎動物培養液由来であれ、任意のかかる
細胞培養液を使用可能である。哺乳動物細胞に加えて、これらは、１つまたはそ
れ以上のＴＰＯタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドコード配列を含む、組
換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で感染した昆虫細胞系；
および組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、Ｃ
ａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染した、または組換えプラスミ
ド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系を含む。

【０１２１】 有用な昆虫系で、オートグラフ・カリフォルニカ核多核体病ウイルス群（Ａｃ
ＮＰＶ）は、外来遺伝子の発現のためのベクターとして使用される。ウイルスは
、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で増殖する。ＴＰＯタン
パク質、ポリペプチドまたはペプチドコード配列は、ウイルスの非必須領域（例
えばポリヘドリン遺伝子）にクローン化され、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば
ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置する。コード配列の挿入により、ポ
リヘドリン遺伝子の失活および非閉鎖組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン
遺伝子によりコードされるタンパク質性被膜を欠失したウイルス）の産生がもた
らされる。次いで、これらの組換えウイルスを、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕ
ｇｉｐｅｒｄａ細胞に感染し、挿入遺伝子を発現する（例えば米国特許第４，２
１５，０５１号、Ｓｍｉｔｈ、参照することにより本明細書に組み込む）。

【０１２２】 有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニー
ズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、
ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮおよびＭＤＣＫ細胞系である。さらに、挿入配列の
発現を調節するか、または所望の特異的様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシ
ングする、宿主細胞株を選択し得る。タンパク質産物のかかる修飾（例えばグリ
コシル化）およびプロセシング（例えば切断）は、タンパク質の機能に重要であ
り得る。

【０１２３】 異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシングおよび修飾に特徴的かつ
特異的機序を有する。適切な細胞系または宿主系は、発現される外来タンパク質
の正しい修飾およびプロセシングを確実にするように選択できる。

【０１２４】 哺乳動物細胞で使用するための発現ベクターは、普通、複製起点（必要であれ
ば）、発現する遺伝子の前に位置するプロモーターを、任意の必要なリボソーム
結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列と
共に含む。複製起点は、例えばＳＶ４０または他のウイルス（例えばポリオーマ
、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）源から得られ得る、外来性起点を含むようなベクタ
ーの作成により提供され得るか、または、宿主細胞染色体複製機序により提供さ
れ得る。ベクターが宿主細胞染色体に取り込まれる場合、しばしば後者で十分で
ある。

【０１２５】 プロモーターは、哺乳動物細胞（例えばメタロチオネインプロモーター）のゲ
ノムから、または哺乳動物ウイルス（例えばアデノウイルス後期プロモーター、
ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）から得られ得る。さらに、ＴＰＯ遺
伝子配列（群）に正常に関連したプロモーターまたは制御配列を使用可能であり
、使用することが望ましくあり得、ただし、かかる制御配列は、宿主細胞系と適
合性である。

【０１２６】 多くのウイルスをベースとした発現系を使用し得、例えば一般的に使用される
プロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、および最も頻繁にはシミアン
ウイルス４０（ＳＶ４０）由来である。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロ
モーターが特に有用である。なぜなら、両方共、ＳＶ４０ウイルス複製起点を含
む断片としてウイルスから容易に得られるからである。ＨｉｎｄＩＩＩ位からウ
イルス複製起点に位置するＢｇｌＩ部位に向けて伸長している約２５０ｂｐの配
列が含まれる場合、より小さなまたは大きなＳＶ４０断片を使用し得る。

【０１２７】 アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、コード配列を、アデノウ
イルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３分節系リーダ配
列にライゲートし得る。次いで、このキメラ遺伝子を、in vitroまたはin vivo
組換えにより、アデノウイルスゲノムに挿入し得る。ウイルスゲノムの非必須領
域（例えば領域Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４）での挿入により、生存可能で、ＴＰＯタンパ
ク質、ポリペプチドまたはペプチドを感染宿主で発現できる組換えウイルスが得
られる。

【０１２８】 特異的開始シグナルも、ＴＰＯタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドコー
ド配列の効率的な翻訳に必要であり得る。これらのシグナルは、ＡＧＴ開始コド
ンおよび隣接配列を含む。ＡＴＧコドンを含む、外来性翻訳制御シグナルをさら
に提供する必要があり得る。当業者は、容易にこれを決定し、必要なシグナルを
提供できるだろう。開始コドンは、全挿入断片の翻訳を確実にするために、所望
のコード配列の読み枠と「インフレーム」（またはインフェース）でなければな
らないことは公知である。これらの外来性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは
、天然および合成の両方の、様々な起源であり得る。発現の効率は、適切な翻訳
エンハンサーエレメントおよび転写終結因子の包含により増強し得る。

【０１２９】 真核発現において、最初のクローン化セグメントに含まれない場合、典型的に
は、転写単位に適切なポリアデニル化部位（例えば５'−ＡＡＴＡＡＡ−３'）を
取込むことが望ましい。典型的には、ポリＡ付加部位は、転写終結の前の位置の
タンパク質の終結部位の約３０〜２０００ヌクレオチド「下流」に位置する。

【０１３０】 長期の高収率の組換えＴＰＯタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの産生
のために、安定な発現が好ましい。例えば、ＴＰＯタンパク質、ポリペプチドま
たはペプチドをコードする作成物を安定に発現する細胞系を操作し得る。ウイル
ス複製起点を含む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞を、適切な制御エレ
メント（例えばプロモーター配列、エンハンサー配列、転写終結因子、ポリアデ
ニル化部位等）により制御されるベクターおよび選択マーカーで形質転換できる
。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞を、栄養強化培地で１〜２日間増殖させ
、次いで、選択培地に切り替え得る。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選
択に対する耐性を付与し、細胞はプラスミドをその染色体に安定に組込むことが
可能となり、増殖して増殖巣を形成し、これを次いでクローン化し、細胞系に増
殖できる。

【０１３１】 ｔｋ⁻、ｈｇｐｒｔ⁻またはａｐｒｔ⁻細胞のそれぞれ単純ヘルペスウイルス
チミジンキナーゼ（ｔｋ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランス
フェラーゼ（ｈｇｐｒｔ）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（
ａｐｒｔ）遺伝子を含むがこれに限定されない、多くの選択系を使用し得る。ま
た、抗代謝耐性を、メトトレキサートに対する耐性を付与する、ジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ（ｄｈｆｒ）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｔｐ；ア
ミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するネオマイシン（ｎｅｏ）；お
よびヒグロマイシンに対する耐性を付与するヒグロマイシン（ｈｙｇｒｏ）の選
択の基礎として使用できる。

【０１３２】 動物細胞を、２つの形態、すなわち、培養液のバルクを通じて懸濁液中で増殖
できる非足場依存性細胞、またはその増殖（すなわち、単層型の細胞増殖）に固
体基質への付着を必要とする足場依存性細胞でin vitroで増殖できる。

【０１３３】 連続的に確立した細胞系からの非足場依存性すなわち懸濁培養液は、最も広く
使用されている大規模な細胞および細胞産物の産生手段である。しかし、懸濁培
養細胞は、腫瘍原性および付着細胞よりも低いタンパク質産生などの限界を有す
る。

【０１３４】 撹拌タンク中の哺乳動物細胞の大規模懸濁培養液は、一般的な組換えタンパク
質産生法である。２つの懸濁培養反応器設計が広く使用されている−撹拌反応器
およびエアリフト反応器。撹拌設計は、インターフェロンの産生に８０００リッ
トルの容量で成功裡に使用されている。細胞を、高さ対直径の比が１：１から３
：１のステンレス鋼タンク中で増殖させる。培養液は、通常、ブレードの付いた
ディスクまたは船のプロペアパターンに基づいた、１つまたはそれ以上の撹拌器
を用いて混合する。ブレードよりもより低い剪断力を与える撹拌系が記載されて
いる。撹拌は、磁気共役装置により直接的にまたは間接的に駆動し得る。間接装
置は、撹拌軸上の封により微生物汚染の危険性を低下させる。

【０１３５】 エアリフト反応器、これは最初に微生物発酵について記載され、後に哺乳動物
培養液に適合したが、これは、培養液の混合および酸化の両方において、気流に
依拠する。気流は、反応器の上区分に侵入し、循環を駆動する。気体は培養表面
で自由になり、気体を含まない、より濃い液体が泡立ち、反応器の降下管区分に
下流に移動する。この設計の主な利点は、単純性および機械混合の必要がないこ
とである。典型的には、高さ対直径の比は１０：１である。エアリフト反応器は
比較的容易にスケールアップし、良好な大量の気体の移動を有し、比較的低い剪
断力を生じる。

【０１３６】 本発明のＴＰＯタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、細胞において、
「過剰発現」、すなわち、天然発現に比べて、増加したレベルで発現され得ると
考えられる。かかる過剰発現は、放射標識および／またはタンパク質精製を含む
、様々な方法により評価し得る。しかし、簡単で直接的な方法が好ましく、例え
ば、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびタンパク質染色またはウェスタンブロット、その後
の定量分析、例えば得られたゲルまたはブロットの濃度測定走査を含む。天然細
胞でのレベルと比較した、組換えタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの比
増加は、過剰発現の指標であり、宿主細胞により産生される、そして例えばゲル
上で可視の他のタンパク質に関する、特異的タンパク質、ポリペプチドまたはペ
プチドの相対的豊富度である。

【０１３７】 Ｃ．核酸検出 ＴＰＯタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現の指示におけるその使
用に加えて、本明細書に開示した核酸配列はまた、様々な他の用途を有する。例
えば、それらは、核酸ハイブリダイゼーション実施形態においてプローブまたは
プライマーとしての有用性を有する。

【０１３８】 １．ハイブリダイゼーション １７ないし１００ヌクレオチド長の、または本発明のある態様においてさらに
は１〜２ｋｂまたはそれ以上の長さまでのハイブリダイゼーションプローブの使
用により、安定で選択的の両方である、二重鎖分子の形成が可能となる。２０塩
基長以上の配列におよび相補配列を有する分子が、ハイブリッドの安定性および
選択性を増加させ、よって、得られる具体的なハイブリッド分子の品質および程
度を向上させるために一般に好ましい。一般に、２０〜３０ヌクレオチド、また
は所望であればさらにより長い配列を有する核酸分子を設計することが好ましい
。かかる断片は、例えば、化学的手段により断片を直接合成することにより、ま
たは、組換え産生用の組換えベクターに選択した配列を導入することにより容易
に調製し得る。

【０１３９】 従って、本発明のヌクレオチド配列は、相補的な遺伝子またはＲＮＡのひと配
列と二重鎖分子を選択的に形成できること、または、組織由来ＤＮＡまたはＲＮ
Ａの増幅用プライマーを提供できることから使用され得る。想定される適用に応
じて、標的配列に対する様々な程度のプローブの選択性を達成するために様々な
ハイブリダイゼーション条件を使用することが望ましい。

【０１４０】 高い選択性を必要とする適用には、典型的には、ハイブリッドの形成に比較的
ストリンジェントな条件を使用することを所望し、例えば、約０．０２Ｍ〜約０
．１０ＭのＮａＣｌで、約５０℃〜約７０℃の温度により提供されるような、比
較的低い塩および／または高温条件を選択する。かかる高ストリンジェンシー条
件は、プローブと鋳型または標的鎖の間のミスマッチを、あるとしてもほとんど
許容しないので、特異的遺伝子の単離または特異的ｍＲＮＡ転写物の検出に特に
適切である。一般に、条件は、漸増量のホルムアミドの添加により、よりストリ
ンジェントにし得ると理解される。

【０１４１】 ある適用、例えば、部位特異的変異誘発によるヌクレオチドの置換では、低い
ストリンジェンシー条件が必要であることが理解される。これらの条件下で、ハ
イブリダイゼーションは、プローブおよび標的鎖の配列が完全に相補的でなくて
も起こり得るが、１つまたはそれ以上の位置でミスマッチしている。条件は、塩
濃度の増加および温度の低下により、より低いストリンジェントとし得る。例え
ば、中程度のストリンジェンシー条件は、約０．１〜０．２５ＭのＮａＣｌで、
約３７℃〜約５５℃の温度により提供し得、一方、低いストリンジェンシー条件
は、約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩で、約２０℃〜約５５℃の範囲の温度により
提供し得る。従って、ハイブリダイゼーション条件は、所望の結果に応じて、容
易に操作できる。

【０１４２】 他の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、例えば、５０ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１．０ｍＭ
ジチオトレイトールで、約２０℃〜約３７℃の温度の条件下で達成し得る。使用
する他のハイブリダイゼーション条件は、約１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２で、約４０℃〜約７２℃の範
囲の温度を含み得る。

【０１４３】 ある実施形態において、ハイブリダイゼーションの決定のための、標識などの
適切な手段と組合せて核酸配列を使用することが有利である。検出可能な、蛍光
、放射活性、酵素または他のリガンド、例えばアビジン／ビオチンを含む、多種
多様な適切な指示薬手段が当分野で公知である。好ましい実施形態において、放
射活性または他の環境的に望ましくない試薬の代わりに、蛍光標識または酵素タ
グ、例えばウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼを使用
することが望ましくあり得る。酵素タグの場合、相補的核酸含有サンプルとの特
異的ハイブリダイゼーションの同定のために、人の眼に可視または分光光度的な
検出手段を提供するために使用できる、比色指示薬基質が知られている。

【０１４４】 一般に、本明細書に記載のハイブリダイゼーションプローブは、対応する遺伝
子の発現の検出のための、ＰＣＲ^ＴＭのような溶液中ハイブリダイゼーション、
並びに、固相を使用する実施形態の両方の試薬として有用であると考えられる。
固相を含む実施形態において、試験ＤＮＡ（またはＲＮＡ）を、選択マトリック
スまたは表面に吸着または別様に固定する。次いで、この固定した一本鎖核酸を
、所望の条件下で選択したプローブとのハイブリダイゼーションにかける。選択
した条件は、必要な特定の条件に基づいた特定の環境に依存する（例えば、Ｇ＋
Ｃ含量、標的核酸の型、核酸源、ハイブリダイゼーションプローブのサイズ等に
依存する）。非特異的結合プローブ分子を除去するためにハイブリダイズした表
面を洗浄した後、標識を用いて、ハイブリダイゼーションを検出するか、または
さらに定量する。

【０１４５】 ２．増幅およびＰＣＲ^ＴＭ 増幅の鋳型として使用する核酸を、標準的な方法に従って（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、１９８９）、生物学的サンプルに含まれる細胞から単離する。核酸は、ゲノ
ムＤＮＡまたは分画または全細胞ＲＮＡであり得る。ＲＮＡを使用する場合、Ｒ
ＮＡを相補的ＤＮＡに変換することが望ましくあり得る。１つの実施形態におい
て、ＲＮＡは、全細胞ＲＮＡであり、増幅の鋳型として直接使用する。

【０１４６】 トロンボポエチン遺伝子に対応する核酸に選択的にハイブリッドするプライマ
ー対を、選択的ハイブリダイゼーションの可能な条件下で、単離核酸と接触させ
る。本明細書に定義した「プライマー」なる語は、鋳型依存的プロセスで、新生
核酸の合成を開始できる任意の核酸を包含することを意味する。典型的には、プ
ライマーは、１０から２０または３０塩基対長のオリゴヌクレオチドであるが、
より長い配列も使用できる。プライマーは、二本鎖または一本鎖形で提供され得
るが、一本鎖形が好ましい。

【０１４７】 一旦ハイブリダイズすると、核酸：プライマー複合体を、鋳型依存的核酸合成
を容易にする１つまたはそれ以上の酵素と接触させる。複数回の増幅（「サイク
ル」とも称される）を、十分量の増幅産物が産生されるまで実施する。

【０１４８】 次に、増幅産物を検出する。ある適用では、検出は、可視手段により実施し得
る。別に、検出は、取り込んだ放射標識または蛍光標識の、化学発光、放射活性
シンチグラフィーを介して、または、さらには電気または熱インパルスシグナル
を使用した系（アフィマックス技術）を介した、産物の間接的同定を含み得る。

【０１４９】 ある鋳型サンプルに存在するマーカー配列を増幅するために、多くの鋳型依存
的プロセスを利用できる。最もよく知られた増幅法の１つは、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ^ＴＭと称される）であり、これは、米国特許第４，６８３，１９５
号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号に詳述され、各々の全体
を本明細書に参照することにより組み込む。

【０１５０】 簡潔には、ＰＣＲ^ＴＭにおいて、マーカー配列の反対の相補鎖上の領域に相補
的な、２つのプライマー配列を調製する。過剰のデオキシヌクレオチド三リン酸
を、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼと共に混合物に添加する。
マーカー配列がサンプルに存在する場合、プライマーはマーカーに結合し、ポリ
メラーゼは、プライマーを、ヌクレオチド上への添加によりマーカー配列に沿っ
て伸長させる。反応混合物の温度を上昇および下降させることにより、伸長プラ
イマーは、マーカーから解離し、反応産物を形成し、過剰のプライマーはマーカ
ーおよび反応産物に結合し、プロセスが反復される。

【０１５１】 逆転写酵素ＰＣＲ^ＴＭ増幅手順を、増幅したｍＲＮＡの量を定量するために実
施し得る。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法は公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、１９８９に記載されている。逆転写の別の方法は、熱安定性のＲＮＡ依存性
ＤＮＡポリメラーゼを利用する。これらの方法は、１９９０年１２月２１日に提
出された、ＷＯ９０／０７６４１に記載され、これは本明細書に参照することに
より組み込む。ポリメラーゼ連鎖反応法は当分野で公知である。

【０１５２】 別の増幅法は、ＥＰＡ３２０３０８号に開示されたリガーゼ連鎖反応（「ＬＣ
Ｒ」）であり、これはその全体を本明細書に参照することにより組み込む。ＬＣ
Ｒでは、２つの相補プローブ対を調製し、標的配列の存在下で、各対が、接する
ように標的の反対の相補鎖に結合する。リガーゼの存在下で、２つのプローブ対
は、連結して１つのユニットを形成する。ＰＣＲ^ＴＭでのような温度サイクリン
グにより、結合したライゲートユニットは標的から解離し、次いで、過剰のプロ
ーブ対のライゲーションのための「標的配列」として作用する。米国特許第４，
８８３，７５０号は、プローブ対を標的配列に結合させるためのＬＣＲに類似し
た方法を記載する。

【０１５３】 ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０（本明細書に参照することにより組
み込む）に記載のＱベータレプリカーゼも、本発明のさらに別の増幅法として使
用し得る。この方法では、標的の領域に対して相補的な領域を有するＲＮＡの複
製配列を、ＲＮＡポリメラーゼの存在下でサンプルに加える。ポリメラーゼは、
複製配列をコピーし、これを次いで検出できる。

【０１５４】 制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを使用して、制限部位の一方の鎖にヌ
クレオチド５'−［α−チオ］−３リン酸を含む標的分子の増幅を達成する、等
温増幅法も、本発明の核酸の増幅に有用であり得る。

【０１５５】 鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、複数回の鎖置換および合成、すなわちニックトラン
スレーションを含む、核酸の等温増幅を実施する別の方法である。修復連鎖反応
（ＲＣＲ）と呼ばれる類似法は、増幅に標的化した領域を通じて数個のプローブ
をアニールさせ、次いで、４つ中２つの塩基しか存在しない修復反応を行うこと
を含む。他の２つの塩基は、容易に検出するために、ビオチン化誘導体として添
加できる。類似アプローチがＳＤＡで使用される。標的特異的配列はまた、環状
プローブ反応（ＣＰＲ）を使用して検出できる。ＣＰＲでは、非特異的ＤＮＡの
３'および５'配列および特異的ＲＮＡの中間配列を有するプローブを、サンプル
中に存在するＤＮＡにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション時に、反
応液をＲＮａｓｅＨで処理し、プローブの産物を、消化後に放出された別個の産
物として同定する。最初の鋳型を別のサイクリングプローブにアニールし、反応
を反復する。

【０１５６】 ＧＢ出願第２２０２３２８号およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５
（その各々のその全体を本明細書に参照することにより組み込む）に記載のさら
に別の増幅法を、本発明に従って使用し得る。前者の出願では、「修飾」プライ
マーを、ＰＣＲ^ＴＭ様、鋳型依存的合成、および酵素依存的合成に使用する。プ
ライマーは、捕獲部分（例えばビオチン）および／または検出部分（例えば酵素
）で標識することにより修飾し得る。後者の出願では、過剰の標識プローブをサ
ンプルに加える。標的配列の存在下、プローブは結合し、触媒的に切断される。
切断後、標的配列は、過剰のプローブに結合して無傷で放出される。標識プロー
ブの切断は、標的配列の存在を伝える。

【０１５７】 他の核酸増幅手順は、核酸をベースとした増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲ（
Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＰＣＴ出願ＷＯ８８／１０３１５、本明細書に参照するこ
とにより組み込む）を含む、転写をベースとした増幅系（ＴＡＳ）を含む。ＮＡ
ＳＢＡでは、核酸は、標準的なフェノール／クロロホルム抽出、臨床サンプルの
熱変性、溶解緩衝液での処理、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離用のミニスピンカラム
またはＲＮＡの塩化グアニジニウム抽出により、増幅用に調製できる。これらの
増幅技術は、標的特異的配列を有するプライマーのアニーリングを含む。重合後
、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを、ＲＮａｓｅＨで消化し、一方、二本鎖ＤＮＡ
分子は再度熱変性する。どちらの場合でも、一本鎖ＤＮＡは、第二の標的特異的
プライマーの添加、その後の重合により完全に二本鎖となる。次いで、二本鎖Ｄ
ＮＡ分子は、Ｔ７またはＳＰ６などのＲＮＡポリメラーゼにより複数回転写され
る。等温サイクリック反応では、ＲＮＡは一本鎖ＤＮＡに逆転写され、次いで二
本鎖ＤＮＡに変換され、次いで、Ｔ７またはＳＰ６などのＲＮＡポリメラーゼで
再度転写される。得られた産物は、切断短縮であれ完全であれ、標的特異的配列
を示す。

【０１５８】 Ｄａｖｅｙら、ＥＰＡ３２９８２２号（その全体を本明細書に参照することに
より組み込む）は、本発明に従って使用し得る、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」
）、ｓｓＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を循環的に合成することを
含む、核酸増幅プロセスを開示する。ｓｓＲＮＡは、最初のプライマーオリゴヌ
クレオチドの鋳型であり、これは逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
）により伸長される。次いで、ＲＮＡは、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ、
ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかと二重鎖であるＲＮＡに特異的なＲＮａｓｅ）の
作用により生じたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖から除去される。得られたｓｓＤＮＡは
、第二のプライマーの鋳型であり、これはまた、鋳型に相同な５'にＲＮＡポリ
メラーゼプロモーター（例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）の配列を含む。次いで
、このプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
の大「クレノウ」断片）により伸長され、プライマー間の最初のＲＮＡの配列と
同一な配列を有し、一端にプロモーター配列をさらに有する、二本鎖ＤＮＡ（「
ｄｓＤＮＡ」）分子が得られる。このプロモーター配列は、適切なＲＮＡポリメ
ラーゼにより使用され、ＤＮＡの多くのＲＮＡコピーを作成できる。次いで、こ
れらのコピーはサイクルに再度入り、非常に迅速な増幅をもたらす。適切な酵素
に選択により、この増幅は、各サイクルで酵素を添加せずに、等温的に実施でき
る。このプロセスの循環性質から、開始配列を、ＤＮＡまたはＲＮＡの形かを選
択できる。

【０１５９】 Ｍｉｌｌｅｒら、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０６７００（その全体を本明細書に参
照することにより組み込む）は、標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのプロ
モーター／プライマー配列のハイブリダイゼーション、次いで、配列の多くのＲ
ＮＡコピーの転写をベースとした、核酸配列増幅スキームを開示する。このスキ
ームは循環ではない、すなわち、新規鋳型は、得られたＲＮＡ転写物から産生さ
れない。他の増幅法は、「ＲＡＣＥ」および「片側ＰＣＲ^ＴＭ」を含む（Ｆｒｏ
ｈｍａｎ、１９９０、本明細書に参照することにより組み込む）。

【０１６０】 得られた「ジ−オリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下での２つ（
またはそれ以上）のオリゴヌクレオチドのライゲーション、それによるジ−オリ
ゴヌクレオチドの増幅をベースとした方法も、増幅段階に使用し得る。

【０１６１】 任意の増幅後、特異的増幅が生じたかどうかを決定する目的で、鋳型および過
剰のプライマーから増幅産物を分離することが望ましくあり得る。１つの実施形
態において、増幅産物は、アガロース、アガロース−アクリルアミドまたはポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８
９）を使用して分離する。

【０１６２】 別に、クロマトグラフィー技術を使用して分離を行ってもよい。本発明に使用
し得る多くの種類のクロマトグラフィーが存在する：吸着、分配、イオン交換お
よびモレキュラーシーブ、および、カラム、ペーパー、薄層およびガスクロマト
グラフィーを含むそれらを使用するための多くの特殊技術。

【０１６３】 増幅産物は、マーカー配列の増幅を確認するために可視化しなければならない
。１つの典型的な可視化法は、臭化エチジウムでのゲルの染色およびＵＶ光下で
の可視化を含む。別に、増幅産物を放射または蛍光定量標識ヌクレオチドで内部
標識する場合、次いで、増幅産物を分離後Ｘ線フィルムに露光するか、適切な刺
激スペクトル下で可視化できる。

【０１６４】 可視化は間接的に達成し得る。増幅産物の分離後、標識された核酸プローブを
増幅マーカー配列と接触させる。プローブは好ましくは発色団にコンジュゲート
するが、放射標識してもよい。別の実施形態において、プローブは、抗体または
ビオチンなどの結合対にコンジュゲートし、結合対の他のメンバーは検出可能な
部分を有する。

【０１６５】 検出は、標識プローブを用いたサザンブロットおよびハイブリダイゼーション
により得る。サザンブロットに関与する技術は当業者に公知であり、分子プロト
コルに関する多くの標準的な本に見出し得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９参照
。簡潔には、増幅産物はゲル電気泳動により分離する。次いで、ゲルをニトロセ
ルロースなどの膜と接触させ、核酸を転写および非共有結合的に結合させる。続
いて、膜を、標的増幅産物とハイブリッドできる、発色団コンジュゲートプロー
ブと共にインキュベートする。検出は、膜のＸ線フィルムへの露光またはイオン
放射装置による。

【０１６６】 前記の一例は、米国特許第５，２７９，７２１号（参照することにより本明細
書に組み込む）に記載され、これは、自動電気泳動および核酸の転写の装置およ
び方法を開示する。装置により、ゲルを外部で操作することなく、電気泳動およ
びブロッティングが可能となり、本発明に記載の方法の実施に理想的に適してい
る。

【０１６７】 ３．他のアッセイ ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡサンプル中の変異を正確に検出する遺伝
的スクリーニングの他の方法も、具体的状況に応じて使用し得る。

【０１６８】 歴史的に、変性勾配ゲル電気泳動（「ＤＧＧＥ」）、制限酵素多形解析、化学
的および酵素的切断法、およびその他を含む、多くの異なる方法が、点変異の検
出に使用されてきた。現在使用されているより一般的な手順は、ＰＣＲ^ＴＭ（上
記参照）により増幅された標的領域の直接的シークエンスおよび一本鎖コンフォ
メーション多形解析（「ＳＳＣＰ」）を含む。

【０１６９】 点変異をスクリーニングする別の方法は、ＲＮＡ／ＤＮＡおよびＲＮＡ／ＲＮ
Ａヘテロ二重鎖における塩基対ミスマッチのＲＮａｓｅ切断をベースとする。本
明細書に使用したような「ミスマッチ」なる語は、二本鎖ＲＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮ
Ａ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡ分子の１つまたはそれ以上の非対形成または誤
対合ヌクレオチドの領域として定義する。従って、この定義は、挿入／欠失変異
、並びに、単一および複数塩基点変異によるミスマッチを含む。

【０１７０】 米国特許第４，９４６，７７３号は、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ試験サンプル
のＲＮＡプローブへのアニーリング、およびその後の核酸二重鎖のＲＮａｓｅＡ
による処理を含む、ＲＮａｓｅＡミスマッチ切断アッセイを記載する。ＲＮａｓ
ｅ切断反応後、ＲＮａｓｅを、タンパク質分解消化および有機抽出により不活性
化し、切断産物を加熱により変性させ、変性ポリアクリルアミドゲル上での電気
泳動により解析する。ミスマッチの検出のために、サイズに従って電気泳動によ
り分離した、ＲＮａｓｅＡ処理の一本鎖産物を、同じように処理した対照二重鎖
と比較する。対照二重鎖には見られない、より小さな断片（切断産物）を含むサ
ンプルを、陽性として評価する。

【０１７１】 米国特許第４，９４６，７７３号に従って実施するものを含む、現在利用可能
なＲＮａｓｅミスマッチ切断アッセイは、放射標識ＲＮＡプローブの使用を必要
とする。米国特許第４，９４６，７７３号のＭｙｅｒｓおよびＭａｎｉａｔｉｓ
は、ＲＮａｓｅＡを使用した塩基対ミスマッチの検出を記載する。他の研究者は
、ミスマッチアッセイでの、大腸菌酵素であるＲＮａｓｅＩの使用を記載してい
る。ＲＮａｓｅＡよりも広い切断特異性を有するので、ＲＮａｓｅＩは、成分が
、非特異的切断の程度を減少させ、ミスマッチの切断頻度を増加させることを見
出し得る場合、塩基対ミスマッチの検出に使用する望ましい酵素である。ミスマ
ッチ検出におけるＲＮａｓｅＩの使用は、プロメガバイオテックによる文献に記
載されている。プロメガは、酵素レベルが十分に高い場合、４つの既知のミスマ
ッチ中３つを切断するとその文献に示されている、ＲＮａｓｅＩ含有キットを市
販している。

【０１７２】 ＲＮａｓｅ保護アッセイは、最初、溶液中の特異的ｍＲＮＡ標的の末端を検出
および位置づけるために使用された。アッセイは、in vitro転写による目的のｍ
ＲＮＡに相補的な高い比活性放射標識ＲＮＡプローブを容易に作成できることに
依拠する。当初、in vitro転写の鋳型は、バクテリオファージプロモーターを含
む組換えプラスミドであった。プローブを全細胞ＲＮＡサンプルと混合し、その
相補標的へのハイブリダイゼーションを可能とし、次いで、混合物をＲＮａｓｅ
で処理して、過剰のハイブリッド非形成プローブを分解する。また、最初に考え
られていたように、使用するＲＮａｓｅは、一本鎖ＲＮＡに特異的であり、よっ
て、ハイブリッドした二本鎖プローブは分解から保護される。ＲＮａｓｅの不活
性化および除去後に、保護プローブ（これは、存在する標的ｍＲＮＡの量に量的
に比例する）が回収され、ポリアクリルアミドゲル上で解析する。

【０１７３】 ＲＮａｓｅ保護アッセイは、一塩基変異の検出に適応した。この型のＲＮａｓ
ｅＡミスマッチ切断アッセイでは、野生型配列からin vitroで転写された放射標
識ＲＮＡプローブは、試験サンプル由来の相補標的領域にハイブリッドする。試
験標的は、一般に、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡまたはプラスミド中のクローニングに
よりまたはＰＣＲ^ＴＭにより増幅したＤＮＡ）を含むが、ＲＮＡ標的（内因性ｍ
ＲＮＡ）が、時折使用される。単一ヌクレオチド（またはより多くの）配列差異
が、ハイブリッドプローブと標的の間に生じ、その位置（「ミスマッチ」）での
ワトソン−クリック水素結合の生じた破壊が、認識でき、ある場合には一本鎖特
異的リボヌクレアーゼにより切断できる。現在までに、ＲＮａｓｅＡは、一塩基
ミスマッチの切断にほとんど排他的に使用されているが、ＲＮａｓｅＩは、近年
、ミスマッチ切断にも有用であることが示された。一塩基ミスマッチの検出に、
ＭｕｔＳタンパク質および他のＤＮＡ修復酵素を使用すると近年記載されている
。

【０１７４】 Ｄ．変異誘発 部位特異的変異誘発は、根底のＤＮＡの特異的変異誘発を介した、個々のペプ
チド、または生物学的機能等価タンパク質またはペプチドの調製に有用な技術で
ある。技術はさらに、１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列変化をＤＮＡに導
入することにより、前記の考慮の１つまたはそれ以上を取り込んで、配列変異形
を調製および試験する能力を提供する。部位特異的変異誘発により、所望の変異
のＤＮＡ配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列、並びに、十分数の隣
接オリゴヌクレオチドの使用による変異体の産生が可能となり、横切る欠失接合
部の両方の側上で安定な二重鎖を形成する、十分なサイズおよび配列複雑性のプ
ライマー配列が提供される。典型的には、約１７〜２５ヌクレオチド長のプライ
マーが好ましく、配列の接合部の両方の側上の約５〜約１０残基が変化する。

【０１７５】 一般に、部位特異的変異誘発の技術は当分野で公知である。理解されるように
、技術は、典型的には、一本鎖および二本鎖形の両方で存在するバクテリオファ
ージベクターを使用する。部位特異的変異誘発で有用な典型的なベクターは、Ｍ
１３ファージなどのベクターを含む。これらのファージベクターは市販で入手可
能であり、その使用は一般に当業者には公知である。二本鎖プラスミドも、部位
特異的変異誘発に慣例的に使用され、これにより、目的の遺伝子をファージから
プラスミドに移行する段階が省略される。

【０１７６】 一般に、部位特異的変異誘発は、最初に、一本鎖ベクターを得るか、またはそ
の配列内に所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む二本鎖ベクターの２
つの鎖の融解により実施される。所望の変異配列を有するオリゴヌクレオチドプ
ライマーは、合成的に調製する。次いで、このプライマーを、一本鎖ＤＮＡ調製
物とアニールさせ、大腸菌ポリメラーゼＩクレノウ断片などのＤＮＡ重合酵素に
かけて、変異を有する鎖の合成を完了する。従って、ヘテロ二重鎖が形成され、
ここでの１つの鎖は、最初の非変異配列をコードし、第二の鎖は所望の変異を有
する。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターを使用して、大腸菌細胞などの適切な
細胞を形質転換し、そして、変異配列配置を有する組換えベクターを含むクロー
ンを選択する。

【０１７７】 部位特異的変異誘発を使用した選択した遺伝子の配列変異形の調製は、潜在的
に有用な種の産生手段として提供され、制限する意味はなく、遺伝子の配列変異
形が得られ得る他の方法も存在する。例えば、所望の遺伝子をコードする組換え
ベクターを、ヒドロキシルアミンなどの変異原性物質で処理し得、配列変異形が
得られ得る。修飾核酸およびＴＰＯのアミノ酸配列を調製する方法は、米国特許
第５，７５３，０８３号、第５，６９６，２５０号、第５，６４１，６５５号、
第５，７９５，５６９号、第５，７６６，５８１号および第５，７６６，８９７
号に例示され、これはその全体を本明細書に参照することにより組み込む。

【０１７８】 ＩＶ．ＴＰＯタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド 本発明はまた、精製された、そして好ましい実施形態において、実質的に精製
されたＴＰＯタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを提供する。本明細書に
使用した「精製ＴＰＯタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド」なる語は、哺
乳動物細胞または組換え宿主細胞から単離可能な、ＴＰＯタンパク質性組成物を
意味すると捉えられ、ここでのＴＰＯタンパク質、ポリペプチド、またはペプチ
ドは、その天然で得られる状態に比較して、すなわち細胞抽出物内でのその純度
に比較して、任意の程度まで精製されている。それ故、精製ＴＰＯタンパク質、
ポリペプチドまたはペプチドはまた、野生型、または、天然に存在する環境には
存在しない変異ＴＰＯタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを意味する。

【０１７９】 変異トロンボポエチンタンパク質は、全長タンパク質、例えば３２２アミノ酸
長であり得る。ＴＰＯおよび他のサイトカインおよびペプチドホルモンのヌクレ
オチドおよびタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド配列は以前に開示され、
国立センターのバイオテクノロジー情報ＧｅｎｂａｎｋおよびＧｅｎＰｅｐｔデ
ータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に
見出し得る。本発明に有用であると考えられるＴＰＯのアミノ酸配列は、Ｇｅｎ
Ｐｅｐｔ寄託番号ＡＲＯＯ４２２１、ＡＲ００４２２０、３９８６１３９、３９
８６１３７、３９８６１３５、５３３２１７、５３３２１５、Ｐ４０２２５、Ｐ
４９７４５、Ｐ４２７０６、Ｐ４２７０５、Ｐ４０２２６、Ｉ５０２６４、Ｉ５
０２６３、Ｉ５０２６２、２３５１１１８、９７１２７７、５７７３２０、ＪＣ
４１２５、Ｉ５８３５０、ＪＣ４２２７、Ｓ４５３３０、Ｉ８０１０５、１１１
０５７９、９１４２２６、２０１３３４５Ａ、１４０１２５０、１４０１２４８
、１４０１２４６、および５０８５４１を含むがこれに限定されない。本発明に
有用であると考えられるヒトＴＰＯのアミノ酸配列は、ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号
ＡＲＯＯ４２２１、３９８６１３９、３９８６１３７、３９８６１３５、５３３
２１７、５３３２１５、Ｐ４０２２５、Ｉ５０２６４、Ｉ５０２６３、２３５１
１１８、５７７３２０、Ｉ８０１０５、９１４２２６、１４０１２５０、１４０
１２４８、および１４０１２４６を含むがこれに限定されない。ＴＰＯの好まし
いアミノ酸配列は、配列番号２に示す。トロンボポエチンタンパク質、ポリペプ
チドおよびペプチドはまた、全長未満のタンパク質、例えば個々のドメイン、領
域またはさらにはエピトープペプチドでもよい。全長未満のトロンボポエチンタ
ンパク質に関する場合、最も好ましいのは、予測免疫原性部位を含むもの、およ
び、本明細書に同定した機能的ドメインを含むものである。

【０１８０】 一般に、「精製」は、分画にかけて、様々な非トロンボポエチンタンパク質、
ポリペプチドまたはペプチドを除去した、ＴＰＯタンパク質、ポリペプチド、ま
たはペプチド組成物を意味し、その組成物は、例えば、本明細書に下記したよう
なタンパク質トロンボポエチンアッセイにより評価すると、実質的にそのトロン
ボポエチン活性を保持している。

【０１８１】 「実質的に精製」なる語を使用する場合、これは、ＴＰＯタンパク質、ポリペ
プチドまたはペプチドが組成物の主成分を形成している、例えば、組成物中のタ
ンパク質の約５０％またはそれ以上を構成している、組成物を意味する。好まし
い実施形態において、実質的に精製されたタンパク質は、組成物中のタンパク質
の６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはさらにはそれ以上を
構成する。

【０１８２】 本発明に適用したような「精製して均一に」したペプチド、ポリペプチドまた
はタンパク質は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、ペプチド、ポリ
ペプチドまたはタンパク質が他のタンパク質および生物学的成分を実質的に含ま
ない純度のレベルを有することを意味する。例えば、精製ペプチド、ポリペプチ
ドまたはタンパク質はしばしば、十分に、他のタンパク質成分を含まず、よって
、分解シークエンスを成功裡に実施し得る。

【０１８３】 トロンボポエチンタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの精製度を定量す
る様々な方法が、本開示に鑑みて当業者には既知である。これらは、例えば、画
分のトロンボポエチンタンパク質比活性の決定、または、ゲル電気泳動による画
分内のポリペプチドの数の評価を含む。

【０１８４】 トロンボポエチンタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを精製するために
、少なくともいくつかのトロンボポエチンタンパク質、ポリペプチドまたはペプ
チドを含む天然または組換え組成物を、分画にかけて、組成物から様々な非トロ
ンボポエチン成分を除去する。本明細書の以下に詳述した技術に加えて、タンパ
ク質精製に使用するに適した様々な他の技術が当業者には公知である。これらは
、例えば、硫安沈殿、ＰＥＧ、抗体等、または熱変性、その後の遠心分離；イオ
ン交換、ゲルろ過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、レクチン親和性および他の
アフィニティークロマトグラフィー段階などのクロマトグラフィー段階；等電点
電気泳動；ゲル電気泳動；およびこのようなおよび他の技術の組合せを含む。

【０１８５】 別の例は、特異的結合対を使用した、トロンボポエチン融合タンパク質の精製
である。かかる精製法は、当分野で慣例的である。本発明がトロンボポエチンタ
ンパク質のＤＮＡ配列を提供するので、任意の融合タンパク質精製法をここで実
施できる。これは、トロンボポエチン−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
融合タンパク質の作成、大腸菌での発現、およびグルタチオン−アガロースでの
アフィニティークロマトグラフィーを使用した均一への単離、または、タンパク
質のＮまたはＣ末端でのポリヒスチジンタグの作成、および続くＮｉアフィニテ
ィークロマトグラフィーを使用した精製により例示される。しかし、ＴＰＯ Ｄ
ＮＡおよびタンパク質が既知であるので、任意の精製法をここで使用できる。

【０１８６】 ある実施形態での使用には好ましいが、ＴＰＯタンパク質、ポリペプチドまた
はペプチドが常にその最も精製した状態で提供される一般的な必要性はない。実
際、あまり実質的に精製されていないＴＰＯタンパク質、ポリペプチドまたはペ
プチド（しかし、トロンボポエチンタンパク質組成物中には、天然状態に比べる
と豊富である）は、ある実施形態において有用性を有すると考えられる。

【０１８７】 低い程度の相対精製を示す方法は、タンパク質産物の全回収率において、また
は、発現タンパク質の活性の維持に利点を有し得る。不活性産物はまた、ある実
施形態において、例えば、抗体産生を介した抗原性の決定に有用性を有する。

【０１８８】 Ｖ．トロンボポエチンタンパク質に対する抗体 Ａ．エピトープコア配列 トロンボポエチンタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの１つ以上の抗原
性決定基に対応するペプチド、すなわち「エピトープコア領域」も調製できる。
かかるペプチドは、一般に、少なくとも５または６アミノ酸残基長であり、好ま
しくは約１０、１５、２０、２５または約３０アミノ酸残基長であり、約３５〜
５０残基またはその程度までを含み得る。

【０１８９】 合成ペプチドは、一般に、約３５残基長であり、これはアプライドバイオシス
テムズ（フォスターシティー、ＣＡ）から入手可能な機械などの自動ペプチド合
成機械のおよその上限長である。より長いペプチドも、例えば、組換え手段によ
り調製し得る。

【０１９０】 本明細書に参照することにより組み込む、米国特許第４，５５４，１０１号（
Ｈｏｐｐ）は、親水性に基づく、一次アミノ酸配列からのエピトープの同定およ
び調製を教義する。Ｈｏｐｐに開示された方法により、当業者は、配列番号２の
ＴＰＯ配列のような、アミノ酸配列内からエピトープを同定できるだろう。

【０１９１】 数多くの科学文献が、アミノ酸配列の解析からの、二次構造の予測、およびエ
ピトープの同定に充てられている（ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ、１９７４ａ，
ｂ；１９７８ａ，ｂ、１９７９）。米国特許第４，５５４，１０１号のＨｏｐｐ
の教義の補充のために、所望であれば、これらの任意を使用し得る。

【０１９２】 さらに、タンパク質の抗原性部分およびエピトープコア領域を推定するのを補
助するために、コンピュータープログラムが現在利用可能である。例は、Ｊａｍ
ｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ解析（ＪａｍｅｓｏｎおよびＷｏｌｆ、１９８８；Ｗｏｌｆ
ら、１９８８）に基づいたプログラム、ＰｅｐＰｌｏｔ^ＴＭ（Ｂｒｕｔｌａｇら
、１９９０；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９８５）、およびタンパク質三次構造
予測用の他の新規プログラム（ＦｅｔｒｏｗおよびＢｒｙａｎｔ、１９９３）を
含む。かかる解析を実施できる別の市販で入手可能なソフトウェアプログラムは
ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＩＢＩ、ニューヘブン、ＣＴ）である。

【０１９３】 さらなる実施形態において、ポリペプチドの主要な抗原性決定基は、ポリペプ
チドをコードする遺伝子の部分が組換え宿主で発現される経験的なアプローチに
より同定し得、得られたタンパク質を免疫応答の誘発能について試験し得る。例
えば、ＰＣＲ^ＴＭを使用して、タンパク質のＣ末端の連続的なより長い断片を欠
失した一連のペプチドを調製できる。これらの各ペプチドの免疫活性は、主要抗
原であるポリペプチドの断片またはドメインを同定するために決定する。次いで
、ほんの少数のアミノ酸が各反復で除去されているさらなる研究により、ポリペ
プチドの抗原性決定基の位置を、より正確に決定することができる。

【０１９４】 ポリペプチドの主要抗原性決定基を決定する別の方法は、ＳＰＯＴ^ＴＭシステ
ム（Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｔｈｅ Ｗ
ｏｏｄｌａｎｄｓ、ＴＸ）である。この方法では、重複ペプチドをセルロース膜
上で合成し、合成および脱保護後、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を
使用してスクリーニングする。最初に同定したペプチドの抗原性決定基を、より
大きな重複を有するより小さいペプチドの合成をその後実施することにより、お
よび、免疫反応性ペプチドに沿って各位置の個々のアミノ酸を最終的に置換する
ことによりさらに位置づけることができる。

【０１９５】 一旦１つまたはそれ以上のかかる解析が完了すれば、１つまたはそれ以上の抗
原性決定基の少なくとも重要な特徴を除去した、ポリペプチドを調製する。次い
で、ペプチドを、本発明の豊富に使用して、ＴＰＯを哺乳動物に投与する場合の
抗ＴＰＯ抗体の産生を減少させる。これらの決定基をコードするミニ遺伝子また
は遺伝子融合物も作成し、標準的な方法により、例えばＰＣＲ^ＴＭクローニング
法を使用して、発現ベクターに挿入できる。

【０１９６】 本明細書に使用した「抗体」なる語は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよ
びＩｇＥなどの任意の免疫原性結合物質を広く意味すると捉えられる。一般に、
ＩｇＧおよび／またはＩｇＭが好ましい。なぜなら、それらは、生理学的状況で
最も一般的な抗体であり、それらは実験室の環境で最も容易に作成されるからで
ある。

【０１９７】 「抗体」なる語は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を意味するために
使用され、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）_２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆ
ｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）等の抗体断片を含む。様々な抗体をベースとした作成
物および断片を調製および使用する技術は当分野で公知である。抗体を調製およ
び特徴づける手段も当分野で公知である（例えば、抗体：実験マニュアル、コー
ルドスプリングハーバーラボラトリー、１９８８参照；本明細書に参照すること
により組み込む）。

【０１９８】 Ａ．免疫検出法 一般に、免疫結合法は、トロンボポエチンタンパク質、ポリペプチドまたはペ
プチドを含有することが疑われるサンプルを得、そして、場合に応じて、免疫複
合体の形成を可能とするに効果的な条件下で、サンプルを最初の抗ＴＰＯ抗体と
接触させることを含む。抗原性領域の除去は、ＴＰＯに結合することが知られる
抗体への、変化または変異ＴＰＯ分子の検出可能な結合の欠失により決定し得る
。

【０１９９】 これらの方法は、患者のサンプルからの野生型または変異トロンボポエチンタ
ンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの精製に使用したような、野生型または
変異トロンボポエチンタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの精製法、また
は、組換え発現野生型または変異トロンボポエチンタンパク質、ポリペプチドま
たはペプチドの精製法を含む。これらの場合、抗体は、抗原性野生型または変異
トロンボポエチンタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド成分をサンプルから
除去する。抗体は、好ましくは、例えばカラムマトリックスの形で、固相支持体
に連結させ、そして、野生型または変異トロンボポエチンタンパク質抗原性成分
を含むことが疑われるサンプルを固定抗体に適用する。望ましくない成分をカラ
ムから洗浄し、固体抗体に免疫複合体形成した抗原が残され、次いで、その野生
型または変異トロンボポエチンタンパク質抗原を、野生型または変異トロンボポ
エチンタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをカラムから除去することによ
り収集する。

【０２００】 免疫結合法はまた、サンプル中の、野生型または変異トロンボポエチンタンパ
ク質反応性成分の量を検出または定量する方法を含み、この方法は、結合プロセ
ス中に形成された任意の免疫複合体の検出または定量を必要とする。ここで、野
生型または変異トロンボポエチンタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含
むことが疑われるサンプルを得、サンプルを、野生型または変異トロンボポエチ
ンに対する抗体と接触させ、次いで、特定の条件下で形成された免疫複合体の量
を検出または定量する。

【０２０１】 選択した生物学的サンプルを抗体と、効果的な条件下、免疫複合体（一次免疫
複合体）の形成を可能とするに十分な時間接触させることは、一般に、抗体組成
物をサンプルに加え、そして混合物を、抗体が、存在する任意のトロンボポエチ
ンタンパク質抗原と免疫複合体を形成する、すなわちそれに結合するに十分な時
間インキュベートすることである。この期間の後、サンプル−抗体組成物、例え
ば組織切片、エリザプレート、ドットブロットまたはウェスタンブロットを、一
般に、洗浄して、全ての非特異的結合抗体種を除去し、一次免疫複合体内に特異
的に結合した抗体のみを検出できるようにする。

【０２０２】 一般に、免疫複合体の検出は当分野で公知であり、数多くのアプローチの適用
により達成し得る。これらの方法は、一般に、放射活性、蛍光、生物学的または
酵素的タグのいずれかなどの、標識またはマーカーの検出に基づく。かかる標識
の使用に関する米国特許は、第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号
；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号
；第４，２７５，１４９号および第４，３６６，２４１号を含み、各々、本明細
書に参照することにより組み込む。勿論、当分野で公知の、二次結合リガンド、
例えば二次抗体またはビオチン／アビジンリガンド結合配置の使用によりさらな
る利点を見出し得る。

【０２０３】 検出に使用するトロンボポエチン抗体はそれ自体、検出可能な標識に連結し得
、ここで、次いで、この標識を簡単に検出し、よって組成物中の一次免疫複合体
の量を決定することが可能となる。別に、一次免疫複合体内に結合するようにな
る第一抗体は、抗体に結合親和性を有する第二結合リガンドを用いて検出し得る
。これらの場合、第二結合リガンドは、検出可能な標識に連結させ得る。第二結
合リガンドはそれ自体しばしば抗体であり、これは、従って「第二」抗体と称さ
れ得る。一次免疫複合体を、標識した二次結合リガンド、すなわち抗体と、効果
的な条件下、二次免疫複合体の形成を可能とするに十分な時間接触させる。次い
で、二次免疫複合体を、一般に、洗浄して、全ての非特異的に結合した標識二次
抗体またはリガンドを除去し、二次免疫複合体中に残っている標識を検出する。

【０２０４】 さらなる方法は、２段階アプローチによる一次免疫複合体の検出を含む。抗体
に結合親和性を有する、抗体などの二次結合リガンドを使用して、上記のような
二次免疫複合体を形成する。洗浄後、二次免疫複合体を第三結合リガンドすなわ
ち第二抗体に結合親和性を有する抗体と、ここでも効果的な条件下で、免疫複合
体（三次免疫複合体）の形成を可能とするに十分な時間接触させる。第三リガン
ドすなわち抗体を検出可能な標識に連結させ、かくして形成された三次免疫複合
体の検出が可能となる。このシステムは、所望であればシグナル増幅を提供し得
る。

【０２０５】 １．エリザ(Elisa) 上記したようなイムノアッセイは、最も簡単で直接的な意味において、結合ア
ッセイである。ある好ましいイムノアッセイは、当分野で公知の、様々な種類の
酵素結合イムノソルベントアッセイ（エリザ）およびラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ）である。組織切片を使用した免疫組織化学的検出も特に有用である。しか
し、検出は、かかる技術に限定されず、ウェスタンブロット、ドットブロット、
ＦＡＣＳ解析等も使用し得ると理解される。

【０２０６】 １つの例示的エリザにおいて、本発明の抗ＴＰＯ抗体を、ポリスチレンマイク
ロタイタープレート中のウェルなどの、タンパク質親和性を示す選択表面に固定
する。次いで、臨床サンプルなどの、野生型または変異トロンボポエチンタンパ
ク質抗原を含むことが疑われる試験組成物を、ウェルに加える。結合および洗浄
して、非特異的結合免疫複合体を除去した後、結合した野生型または変異トロン
ボポエチンタンパク質抗原を検出し得る。検出は、一般に、検出可能な標識に連
結した、別の抗ＴＰＯ抗体の添加により達成される。この種類のエリザは、簡単
な「サンドイッチエリザ」である。検出はまた、第二抗ＴＰＯ抗体の添加、次い
で、第二抗体に結合親和性を有する第三抗体（第三抗体は、検出可能な標識に連
結している）の添加により達成され得る。

【０２０７】 別の例示的エリザにおいて、野生型または変異トロンボポエチンタンパク質抗
原を含むことが疑われるサンプルを、ウェル表面に固定し、抗ＴＰＯ抗体と接触
させる。結合および洗浄して、非特異的結合免疫複合体を除去した後、結合した
抗ＴＰＯ抗体を検出する。最初の抗ＴＰＯ抗体が検出可能な標識に連結すると、
免疫複合体を直接検出し得る。ここでも、免疫複合体は、第一抗ＴＰＯ抗体に結
合親和性を有する第二抗体（第二抗体は検出可能な標識に連結している）を使用
して検出し得る。

【０２０８】 野生型または変異トロンボポエチンタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド
が固定された別のエリザは、検出における抗体競合の使用に関与する。このエリ
ザでは、野生型または変異トロンボポエチンタンパク質組成物に対する標識抗体
をウェルに加え、結合させ、その標識により検出する。次いで、未知サンプル中
の野生型または変異トロンボポエチンタンパク質抗原の量を、サンプルを、野生
型または変異トロンボポエチンに対する標識抗体と、コーティングウェルと共に
インキュベートする前または最中に、混合することにより決定する。サンプル中
の野生型または変異トロンボポエチンタンパク質の存在は、ウェルへの結合に利
用可能な、野生型または変異トロンボポエチンタンパク質、ポリペプチドまたは
ペプチドに対する抗体の量を減少させるように作用し、従って最終的シグナルを
減少させる。これはまた、未知サンプル中の野生型または変異トロンボポエチン
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに対する抗体を検出するのに適切であ
り、ここで、非標識抗体は抗原コーティングウェルに結合し、また、標識抗体へ
の結合に利用可能な抗原の量を減少させる。

【０２０９】 使用する形式に関係なく、エリザは、コーティング、インキュベートまたは結
合、洗浄して非特異的結合種の除去、および結合免疫複合体の検出などの、共通
のある特徴を有する。これらを下記する。

【０２１０】 抗原または抗体でプレートをコーティングするにおいて、一般に、プレートの
ウェルを、抗原または抗体の溶液と共に、一晩または特定の時間、インキュベー
トする。次いで、プレートのウェルを洗浄して不完全に吸着した物質を除去する
。次いで、ウェルの全ての残りの利用可能な表面を、試験抗血清に関して抗原的
に中性である、非特異的タンパク質で「コーティング」する。これらは、ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインおよび乳汁粉末溶液を含む。コーティングに
より、固定表面上の非特異的吸着部位の遮断が可能となり、従って、表面上への
抗血清の非特異的結合により引き起こされるバックグラウンドは減少する。

【０２１１】 エリザでは、直接的な手順よりも、二次または三次検出手段を使用することが
より慣用的であろう。従って、タンパク質または抗体のウェルへの結合、バック
グラウンドを減少させる非反応性物質でのコーティング、および非結合物質を除
去するための洗浄後、固定表面を、免疫複合体（抗原／抗体）形成に効果的な条
件下で、試験すべき生物学的サンプルと接触させる。次いで、免疫複合体の検出
は、標識二次結合リガンドまたは抗体、または、標識三次抗体または三次結合リ
ガンドと共に二次結合リガンドまたは抗体を必要とする。

【０２１２】 「免疫複合体（抗原／抗体）形成を可能とするに効果的な条件下」は、条件は
、好ましくは、抗原および抗体を、ＢＳＡ、ウシγグロブリン（ＢＧＧ）および
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎなどの溶液で希釈することを含むこと
を意味する。これらの添加された物質はまた、非特異的バックグラウンドの減少
を補助する傾向がある。

【０２１３】 「適切な」条件はまた、インキュベートは、効果的な結合を可能とするに十分
な温度および期間であることを意味する。インキュベート段階は、典型的には、
約１〜２〜４時間またはそのあたりで、好ましくは２５℃〜２７℃の次元の温度
であるか、または約４℃またはそのあたりで一晩であり得る。

【０２１４】 エリザでの全インキュベート段階後、接触表面を洗浄して、非複合体形成物質
を除去する。好ましい洗浄手順は、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ、またはホウ酸緩衝液な
どの溶液での洗浄を含む。試験サンプルと最初に結合した物質の間の特異的免疫
複合体の形成、およびその後の洗浄後、ほんの僅かな量の免疫複合体の存在も決
定し得る。

【０２１５】 検出手段を提供するために、第二または第三抗体は、検出を可能とする会合標
識を有する。好ましくは、これは、適切な色素生産性基質と共にインキュベート
すると発色する酵素である。従って、例えば、第一または第二免疫複合体を、ウ
レアーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたは水素ペルオ
キシダーゼ−コンジュゲート抗体と、さらなる免疫複合体形成の発達に好ましい
期間および条件下で、接触およびインキュベートすることが望ましい（例えば、
ＰＢＳ−ＴｗｅｅｎなどのＰＢＳ含有溶液中で２時間室温でインキュベート）。

【０２１６】 標識抗体と共にインキュベート、および続いて洗浄して非結合物質を除去した
後、標識の量を、例えば、尿素およびブロモクレゾール紫または２，２'−アジ
ノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）および
酵素標識としてペルオキシダーゼの場合Ｈ_２Ｏ_２などの色素生産性基質と共にイ
ンキュベートすることにより、定量する。次いで、定量は、例えば、可視スペク
トル分光光度計を使用して、発色の程度を測定することにより達成される。

【０２１７】 ＶＩ．生物学的機能等価体 修飾および変化を、トロンボポエチン遺伝子およびタンパク質の構造になし得
、依然として同様または別様に望ましい特徴を有する分子が得られるので、かか
る生物学的機能等価体も本発明内に包含される。

【０２１８】 例えば、タンパク質構造中のあるアミノ酸を、例えば、抗体の抗原結合領域、
基質分子または受容体上の結合部位、またはそのようなものなどの、構造におけ
る相互作用結合能力の認め得る減少を伴うことなく、他のアミノ酸と置換し得る
。タンパク質の生物機能活性を定義するのは、タンパク質の相互作用能力の性質
であるので、あるアミノ酸配列置換をタンパク質配列（または、勿論、その根底
のＤＮＡコード配列）に実施し得、それにも関わらず、同様な（アゴニスト）特
性を有するタンパク質が得られる。従って、様々な変化を、トロンボポエチンタ
ンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、または根底の核酸の配列に、その生物
学的有用性または活性の認め得る減少を伴うことなく実施し得ることが、発明者
により考えられる。

【０２１９】 同等に、同じ考察を用いて、対抗する、すなわちアンタゴニスト特性を有する
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを創製し得る。これは、トロンボポエ
チン変異体または類似体を作成し得る本発明に関連する。例えば、トロンボポエ
チン変異体を作成し、トロンボポエチン活性に重要な残基を同定するために、タ
ンパク質のトロンボポエチン活性について試験し得る。トロンボポエチン変異体
はまた、抗原性がより低いが、依然として血小板新生および／または凍結保存活
性を保持したトロンボポエチン変異体を反映するために合成し得る。

【０２２０】 機能的等価体に関して、「生物学的機能等価」タンパク質、ポリペプチドまた
はペプチドまたは遺伝子の定義に固有なのは、分子の一定の部分内に実施し得、
依然として許容可能なレベルの等価な生物活性を有する分子が得られる、変化の
数には限界があるという概念であることが当業者によりよく理解される。従って
、生物学的機能等価ペプチドは、本明細書で、ほとんどまたは全てではなく特定
のアミノ酸を置換し得るペプチドとして定義される。

【０２２１】 特に、より短い長さのペプチドに関する場合、より少ないアミノ酸変化を、あ
るペプチド内で実施すべきであると考えられる。より長いドメインは、中間数の
変化を有する。全長タンパク質は、より多くの変化に最大の耐容性を有する。勿
論、異なる置換基を有する複数の別個のタンパク質／ポリペプチド／ペプチドを
容易に作成し得、本発明に従って使用し得る。

【０２２２】 ある残基が、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの生物学的または構造
特性に特に重要である場合（例えば、結合領域または活性部位中の残基）、かか
る残基は一般に交換されないだろう。このように、機能的等価体は、本明細書で
、かなりの量のその天然生物活性を維持したペプチドとして定義される。

【０２２３】 アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、その
疎水性、親水性、荷電、サイズ等をベースとする。サイズ、形、およびアミノ酸
側鎖置換基の種類の解析により、アルギニン、リジンおよびヒスチジンは全て正
に荷電した残基であり；アラニン、グリシンおよびセリンは全て類似のサイズで
あり；そして、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは全て一般に
類似した形を有することが判明する。それ故、これらの考慮に基づき、アルギニ
ン、リジンおよびヒスチジン：アラニン、グリシンおよびセリン；およびフェニ
ルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、本明細書で、生物学的機能等価
体として定義される。

【０２２４】 より定量的な変化を奏効するために、アミノ酸の疎水性親水性指標係数を考慮
し得る。各アミノ酸は、その疎水性および荷電特徴に基づいて、疎水性親水性指
標係数を割当てられ、これらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２
）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シス
チン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン
（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン
（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−
３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテー
ト（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアル
ギニン（−４．５）である。

【０２２５】 タンパク質に相互作用生物機能を付与する上での、疎水性親水性指標アミノ酸
係数の重要性は、一般に、当分野で理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉ
ｔｔｌｅ、１９８２、本明細書に参照することにより組み込む）。あるアミノ酸
は、類似の疎水性親水性指標係数またはスコアを有する他のアミノ酸で置換し得
、依然として類似の生物活性を有することが知られている。疎水性親水性指標係
数に基づいた変化の作成において、疎水性親水性指標係数が±２内であるアミノ
酸の置換が好ましく、±１内のものが特に好ましく、±０．５内のものがさらに
より特に好ましい。

【０２２６】 類似アミノ酸の置換は、特に、それにより創製された生物学的機能等価タンパ
ク質、ポリペプチドまたはペプチドが、本発明のある実施形態のような免疫学的
実施形態での使用を目的とする場合、親水性に基づいて効率的に実施できること
が理解される。米国特許第４，５５４，１０１号（本明細書に参照することによ
り組み込む）は、その隣接アミノ酸の親水性により支配される、タンパク質の最
大局所平均親水性は、その免疫原性および抗原性、すなわち、タンパク質の生物
学的特性に相関すると記述する。

【０２２７】 米国特許第４，５５４，１０１号に詳述したように、以下の親水性値が、アミ
ノ酸残基に割当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アス
パルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．
３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；
トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；
ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；
バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロ
シン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４
）。

【０２２８】 類似親水性値に基づいた変化の作成において、親水性値が±２内であるアミノ
酸の置換が好ましく、±１内のものが特に好ましく、±０．５内のものがさらに
より特に好ましい。

【０２２９】 議論はアミノ酸変化から生じた機能的等価ポリペプチドに焦点を当ててきたが
、これらの変化は、遺伝子コードは縮重し、２つまたはそれ以上のコドンが同じ
アミノ酸をコードし得ることも考慮して、コードＤＮＡの変化によっても奏効し
得ることが理解される。アミノ酸およびそのコドンの表は、かかる実施形態に使
用するために、並びに、例えばプローブおよびプライマー等の設計における他の
使用のために本明細書で上記に提示する。

【０２３０】 本明細書に記載のトロンボポエチンペプチジル化合物に加えて、発明者はまた
、他の立体的に類似の化合物を、ペプチド構造の重要な部分を模倣するように製
剤化し得ることを考える。かかる化合物（ペプチド模倣体と称され得る）は、本
発明のペプチドとして同じように使用し得、従ってこれも機能的等価体である。

【０２３１】 タンパク質二次構造のエレメントを模倣したある模倣体は、Ｊｏｈｎｓｏｎら
（１９９３）に記載されている。ペプチド模倣体の使用の背後の根底の原理は、
タンパク質のペプチド骨格が、分子相互作用、例えば抗体および抗原の分子相互
作用を容易にするように、アミノ酸側鎖を配向するように主に存在することであ
る。従って、ペプチド模倣体は、天然分子に類似した分子相互作用を可能とする
ように設計される。

【０２３２】 ペプチド模倣体の概念のいくつかの成功裡の適用は、抗原性が高いことが知ら
れる、タンパク質内のβ−ターンの模倣体に焦点を当てている。同様にポリペプ
チド内のβ−ターン構造は、本明細書で議論したようなコンピューターをベース
としたアルゴリズムにより予測できる。一旦ターンの成分アミノ酸が決定される
と、アミノ酸側鎖の必須エレメントに類似した空間配向を達成するように、模倣
体を作成できる。

【０２３３】 さらなる構造的等価体または模倣体の作成は、当業者に公知のモデリングおよ
び化学設計の技術により達成し得る。受容体モデリングの分野は、現在公知であ
り、かかる方法により、トロンボポエチンタンパク質、ポリペプチドまたはペプ
チドに結合する化学物質を設計し、次いで合成できる。全てのかかる立体的に設
計された作成物は、本発明の範囲内に該当すると理解される。

【０２３４】 遺伝子コードにより提供される２０の「標準的」アミノ酸に加えて、修飾また
は異常アミノ酸も、本発明の使用に考えられる。例示的であり制限的ではない修
飾または異常アミノ酸の表を、本明細書の以下に提供する。

【０２３５】

【表５】

【０２３６】 ＶＩＩ．医薬組成物 Ａ．医薬的に許容される担体 水性組成物は、医薬的に許容される担体または水性媒体中に溶解または分散し
た、有効量のトロンボポエチンタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはその
ようなものを含む。「医薬的または薬理学的に許容される」なる語句は、適宜、
動物またはヒトに投与した場合に、副作用、アレルギー反応または他の望ましく
ない反応を引き起こさない、分子部分および組成物を意味する。

【０２３７】 本明細書に使用したような「医薬的に許容される担体」は、任意および全ての
溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤
等を含む。医薬的活性物質におけるかかる媒体および薬剤の使用は、当分野で公
知である。任意の慣用的媒体または薬剤が活性成分と不適合でない限り、治療組
成物における使用が考えられる。補助活性成分も組成物に取込むことができる。
ヒト投与では、調製物は、生物物質標準物質についてＦＤＡ局により要求される
、無菌、発熱物質性、全般的安全性および純度標準を満たすべきである。

【０２３８】 生物学的物質は、十分に透析して、適宜、望ましくない小分子量分子を除去す
るおよび／または所望のベヒクルにより容易に製剤化するために凍結乾燥すべき
である。次いで、活性化合物は、一般に、非経口投与用に製剤化され、例えば、
静脈内、筋肉内、皮下、病巣内、またはさらには腹腔内経路を介した注入用に製
剤化する。活性構成成分または成分としてトロンボポエチン剤を含む水性組成物
の調製は、本開示に鑑みて当業者には公知である。典型的には、かかる組成物は
、液体溶液または懸濁液として注射液として調製でき；注射前の液体の添加によ
る溶液または懸濁液の調製に使用するに適した固体形も調製でき；そして調製物
はまた乳化できる。

【０２３９】 注射使用に適した医薬形は、無菌水溶液または分散液；ゴマ油、落花生油また
は水性ポリエチレングリコールを含む製剤；および無菌注射溶液または懸濁液の
即時調製用の無菌粉末を含む。全ての場合において、形は無菌でなければならず
、シリンジが容易に使用できる程度に流体でなければならない。製造および保存
の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対
して防御されなければならない。

【０２４０】 遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロ
キシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中で調製できる。
分散液もグリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物および油
中で調製できる。普通の保存および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の
増殖を防ぐ保存剤を含む。

【０２４１】 トロンボポエチンタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドは、中性
すなわち塩の形で組成物に製剤化できる。医薬的に許容される塩は、酸付加塩（
タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成）を含み、これは、例えば、塩酸または
リン酸などの無機酸、または、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸
を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、例えば
、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または鉄などの無
機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイ
ン等の有機塩基から得ることができる。活性成分としてペプチド治療薬を使用す
るに関して、米国特許第４，６０８，２５１号；第４，６０１，９０３号；第４
，５９９，２３１号；第４，５９９，２３０号；第４，５９６，７９２号；およ
び第４，５７８，７７０号（各々本明細書に参照することにより組み込む）の技
術を使用し得る。

【０２４２】 担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、
プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、適切なその混
合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例
えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合、必要な粒子サ
イズの維持により、および界面活性剤の使用により維持できる。微生物の作用の
防御は、様々な抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、
フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によりもたらすことができる。多くの
場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射
組成物の延長吸収は、組成物中に吸収を遅延する物質、例えばモノステアリン酸
アルミニウムおよびゼラチンを使用することによりもたらすことができる。

【０２４３】 無菌注射溶液は、活性化合物を、必要量、適切な溶媒に、必要であれば上記に
列挙した様々な他の成分と共に取込み、次いで滅菌ろ過することにより調製され
る。一般に、分散液は、様々な無菌活性成分を、基本分散媒体および上記に列挙
した成分からの必要な他の成分を含む、無菌ベヒクルに取込むことにより調製さ
れる。無菌注射溶液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製法は、以前に滅菌
ろ過したその溶液から活性成分の粉末と任意の追加の所望の成分を生成する、真
空乾燥および凍結乾燥技術である。直接注射用の、より、または高度に濃縮され
た溶液の調製も考えられ、溶媒としてＤＭＳＯの使用が、極めて迅速な浸透、小
領域への高濃度の活性物質の送達をもたらすと考えられる。

【０２４４】 製剤時に、溶液は、投与製剤に適合性の様式で、および治療に効果的な量で投
与する。製剤は、上記の注射溶液の形などの様々な投与形で容易に投与されるが
、薬物放出カプセル等も使用できる。

【０２４５】 水溶液での非経口投与では、例えば、溶液は、必要であれば適切に緩衝化し、
液体希釈剤は最初に十分な食塩水またはグルコースで等張にすべきである。これ
らの特定の水溶液は特に、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に適切である
。これに関連して、使用できる無菌水性媒体は、本開示に鑑みて当業者には公知
である。例えば、１用量を、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶かし、１０００ｍｌ
の皮下注入液に加えるか、または提案された注入部位に注射できる（例えば、「
レミントンの医薬科学」第１５版、１０３５〜１０３８項および１５７０〜１５
８０項参照）。投与量のいくらかの変動が、処置する被検者の容態に応じて必然
的に生じる。投与の責任者は、いずれにしても、個々の被検者の適切な用量を決
定する。

【０２４６】 静脈内または筋肉内注射などの、非経口投与用に製剤化された化合物に加えて
、他の医薬的に許容される形は、例えば、経口投与用の錠剤または他の固体；リ
ポソーム製剤；徐放性カプセル；およびクリームを含む、現在使用されている任
意の他の形を含む。

【０２４７】 また、鼻腔溶液またはスプレー、エアゾールまたは吸入剤を本発明に使用し得
る。鼻腔溶液は、通常、液滴またはスプレーで鼻腔経路に投与するように設計さ
れた水溶液である。鼻腔溶液は、多くの態様において鼻腔分泌物と類似している
ように調製され、よって通常の線毛作用が維持される。従って、水性鼻腔溶液は
通常、等張性であり、僅かに緩衝化されてｐＨ５．５〜６．５を維持する。さら
に、眼調製物に使用するものと類似した抗微生物保存剤、および必要であれば、
適切な薬物安定化剤を、製剤に含め得る。様々な市販の鼻腔調製物が知られ、例
えば、抗生物質および抗ヒスタミン剤を含み、喘息予防に使用される。

【０２４８】 他の投与形態に適した追加の製剤は、膣坐剤およびペッサリーを含む。直腸ペ
ッサリーまたは坐剤も使用し得る。坐剤は、通常、直腸、膣または尿道への挿入
に投薬される、様々な重量および形の固体投与形である。挿入後、坐剤は軟らか
くなり、腔液で融解または溶解する。一般に、坐剤では、伝統的な結合剤および
担体は、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含み得；か
かる坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の活性成分を含む
混合物から形成され得る。

【０２４９】 経口製剤は、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステ
アリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリド、セルロース、炭酸マグネシウム
等の、通常使用される添加剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、
丸剤、カプセル剤、持続放出製剤または散剤の形をとる。ある一定の実施形態に
おいて、経口医薬製剤は、不活性希釈剤または同化可能な食用担体を含むか、ま
たは、硬または軟殻ゼラチンカプセルに封入し得るか、または、圧縮して錠剤に
し得るか、または、食事の食物と共に直接取込み得る。経口治療投与では、活性
化合物は、添加剤と共に取込み得、消化可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カ
プセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハース等の形で使用し得る。かか
る組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含むべきである。
組成物および調製物の比率は、勿論、変化し得、簡便には約２〜約７５％、また
は好ましくは２５〜６０％の単位重量であり得る。かかる治療に有用な組成物中
の活性化合物の量は、適切な投与量が得られるものである。

【０２５０】 錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤等はまた、以下を含み得る：結合剤、例え
ばトラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチン；添加剤、例
えばリン酸二カルシウム；崩壊剤、例えばコーンスターチ、馬鈴薯デンプン、ア
ルギン酸等；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；および甘味剤、例えば
スクロース、ラクトースまたはサッカリン、または芳香剤、例えばペパーミント
、冬緑油、またはチェリー芳香を添加し得る。投与単位形がカプセルである場合
、それは、上記の種類の物質に加えて、液体担体を含み得る。様々な他の物質が
、コーティングとして、または投与単位の物理形を別様に修飾するために存在し
得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤を、シェラック、糖またはその両方
でコーティングし得る。エリキシルシロップは、活性化合物、甘味剤としてのス
クロース、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、ダイおよびチェリー
またはオレンジ芳香などの芳香剤を含み得る。

【０２５１】 Ｂ．リポソームおよびナノカプセル ある実施形態において、リポソームおよび／またはナノ粒子の使用は、トロン
ボポエチンタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは薬剤、または、野生型お
よびアンチセンスベクターの両方を含む遺伝子療法ベクターの、宿主細胞への導
入に考えられる。リポソームの形成および使用は、一般に、当業者には公知であ
り、下記している。

【０２５２】 ナノカプセルは、一般に、安定で再現的に化合物を包接できる。細胞内ポリマ
ー過剰添加による副作用を回避するために、かかる超微粒子（約０．１μｍのサ
イズ）を、in vivoで分解できるポリマーを使用して設計すべきである。これら
の必要条件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、本
発明での使用に考えられ、かかる粒子は容易に作成し得る。

【０２５３】 リポソームは、水性媒体中に分散されたリン脂質から形成され、自発的に多重
ラメラ濃縮二重層小胞（多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）とも称される）を形成する。
ＭＬＶは、一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理によ
り、コアに水溶液を含む、２００〜５００Åの範囲の直径をもつ小さな単ラメラ
小胞（ＳＵＶ）が形成される。

【０２５４】 以下の情報も、リポソーム製剤の作成に使用し得る。リン脂質は、脂質対水の
モル比に応じて、水中に分散された場合に、リポソーム以外の様々な構造を形成
できる。低い比では、リポソームが好ましい構造である。リポソームの物理的特
徴は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。リポソームは、
イオンおよび極性物質に対して低い透過性を示すが、高温では、相転位を受け、
顕著にその透過性を変化させる。相転位は、ゲル状態として知られる、緊密に充
填された秩序ある構造から、液体状態として知られる緩く充填されより秩序の低
い構造への変化を含む。これは、特徴的な相転位温度で起こり、これにより、イ
オン、糖および薬物への透過性は増加する。

【０２５５】 リポソームは、４つの異なる機序を介して細胞と相互作用する：マクロファー
ジおよび好中球などの網内系の食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱
い疎水性または静電力による、または細胞表面成分との特異的相互作用による、
細胞表面への吸着；リポソーム内容物の細胞質への同時放出を伴う、リポソーム
の脂質二重層の形質膜への挿入による形質細胞膜との融合；および、リポソーム
内容物の会合を伴わない、リポソーム脂質の細胞または亜細胞膜への移行または
その逆。リポソーム製剤の変化により、どの機序が作動するかを変化し得るが、
１つ以上が同時に作動する場合もある。

【０２５６】 Ｃ．キット 本発明の治療キットは、トロンボポエチンタンパク質、ポリペプチド、ペプチ
ドおよび／または他のトロンボポエチンエフェクターを含むキットである。キッ
トは、さらに、本発明の方法におけるその使用の説明書、および／または血小板
凍結保存剤を含む。かかるキットは、一般に、適切な容器手段に、医薬的に許容
されるトロンボポエチンタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの製
剤を医薬的に許容される製剤中に含む。キットは、１つの容器手段を有し得るか
、または、各化合物について別個の容器手段を有し得る。

【０２５７】 キットの成分が１つまたはそれ以上の液体溶液で提供される場合、液体溶液は
水溶液であり、無菌水溶液が特に好ましい。トロンボポエチン組成物はまた、シ
リンジ使用可能な組成物に製剤化し得る。その場合、容器は、それ自体シリンジ
、ピペット、または他のそのような装置であり得、それから、製剤を生体の患部
領域に適用し、動物に注射し、またはさらにはキットの他の成分に適用およびそ
れと混合し得る。

【０２５８】 しかし、キットの成分は、乾燥粉末（群）として提供してもよい。試薬または
成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適切な溶媒の添加により復元で
きる。溶媒はまた、別の容器手段に提供し得ると考えられる。

【０２５９】 容器手段は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験チューブ、フラスコ、
瓶、シリンジまたは他の容器手段を含み、それに、トロンボポエチンタンパク質
、ポリペプチド、ペプチドおよび／または他のトロンボポエチンエフェクター製
剤を入れ、好ましくは適切に割当てる。キットはまた、無菌で医薬的に許容され
る緩衝剤または他の希釈剤を含めるための、第二容器手段を含み得る。

【０２６０】 本発明のキットはまた、典型的には、所望のバイアルを保持する注射または中
空成形プラチック容器などの、市販の厳密に閉じ込めてバイアルを含む手段を含
む。

【０２６１】 容器の数または種類に関係なく、本発明のキットはまた、最終的なトロンボポ
エチンタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび／または他のトロンボポエチ
ンエフェクター組成物を注射／投与または動物の生体内に配置するのを補助する
装置を含み得るか、またはそれでパッケージングされ得る。かかる装置は、シリ
ンジ、ピペット、ピンセット、または任意のかかる医学的に認可された送達ベヒ
クルであり得る。

【０２６２】 以下の例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実
施例で開示した技術は、本発明の実施によく機能すると発明者により発見された
技術を示し、従って、その実施の好ましい態様を構成すると考えることができる
ことを当業者は理解すべきである。しかし、当業者は、本開示に鑑みて、多くの
変更を、開示した具体的な実施形態に実施でき、依然として同様または類似の結
果が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく得られることを理解する。

【０２６３】 実施例１ 癌患者における１用量の組換えヒトトロンボポエチンによる巨核球および血小
板産生の刺激 近年クローン化された新規サイトカインである組換えヒトトロンボポエチンに
対する造血応答およびその臨床耐容性を評価するために、発明者は、重度の化学
療法誘導血小板減少症の危険性の高い癌患者において、組換えヒトトロンボポエ
チンの第ＩおよびＩＩ相臨床および実験室試験を開始した。この試験は２部に分
けた。Ｉ部は、化学療法前に投与したトロンボポエチンを試験し、ＩＩ部は化学
療法後に投与したトロンボポエチンを試験した。Ｉ部の目的（その結果をここで
報告する）は、化学療法前に正常な造血機能を示していた患者における、造血効
果、薬物動態学、およびこの新規薬剤の臨床耐容性を評価することであった。

【０２６４】 方法 患者 化学療法を受けたことがない肉腫に罹患した患者が、その後の化学療法の適切
な候補であり、速やかな進行性疾病を有さない患者がこの試験に適格であった。
患者は、８０またはそれ以上のカルノフスキー動作状態スコア、適切な骨髄（好
中球の絶対数＞１．５×１０^９／Ｌ；血小板数＞１５０×１０^９／Ｌおよび＞４
５０×１０^９／Ｌ）、適切な腎機能（血清中クレアチニンレベル＞１２０μｍｏ
ｌ／Ｌ）、および適切な肝機能（アラニンアミノトランスフェラーゼレベル＜正
常の３倍；ビリルビンレベル＜正常の１．５倍）を有することが必要とされた。
血栓塞栓または出血疾患、顕著な心疾患、または以前の骨盤放射線照射の病歴を
有する患者は除外した。書面によるインフォームドコンセントを、試験施設内の
ガイドラインに従って、試験に入る前に全ての患者から得た。

【０２６５】 計画 この臨床コホート試験の第Ｉ相用量範囲部分中に、トロンボポエチンを、化学
療法の３週間前に、１回の静脈内用量として投与した。試験に入る時に、３人の
患者を、４つの各用量レベル（０．３、０．６、１．２、および２．４μｇ／ｋ
ｇ（体重））に割当てた。用量限界毒性を示さず、トロンボポエチンに対する中
和抗体を発生しなかった患者が、化学療法後に同じ用量でトロンボポエチンを受
けるのに適格であった。

【０２６６】 組換えヒトトロンボポエチン この試験に使用したトロンボポエチンは、ジェネンテック社（サウスサンフラ
ンシスコ、カルフォルニア州）により提供された。トロンボポエチンは、遺伝的
に修飾された哺乳動物細胞系で産生され、標準的な技術により精製された、全長
グリコシル化分子である。それは、注射用に希釈剤として保存剤を含まない普通
の食塩水と混合した。

【０２６７】 臨床および実験室モニタリング 臨床試験の前および最中に、患者を、全病歴；身体的検査；および、白血球百
分率数を含む全血球計算値、血清化学、凝固プロフィル、検尿、トロンボポエチ
ン抗体形成の評価、胸部Ｘ線撮影、および心電図検査を含む実験室試験によりモ
ニタリングした。血球数を、最初の５日間は毎日、その後、少なくとも１週間に
３回得た。周辺のスミアを血小板形態について連続的に調べた。血小板数および
血小板の平均サイズ（平均血小板容量）を、６４チャネル血小板ヒストグラムか
ら得た。

【０２６８】 骨髄穿刺および生検を、トロンボポエチン処置の前および１週間後に実施した
。骨髄標本を、最初に、１０％中性ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋し、
５μｍ厚の切片に切断し、形態解析用にヘマトキシリン−エオシンでおよびコラ
ーゲン繊維含量解析用に３色マッソンで染色した。骨髄の新鮮で風乾させたスミ
アを、ライトギームザで染色した。骨髄サンプルを、盲検的に全体的な細胞性お
よび形態について調べた。巨核球数を、人為ゾーンまたは小柱を含まない領域で
、１０倍の（４０×）倍率を選択することにより測定した。巨核球の相対サイズ
を、Ｍａｇｉｓｃａｎイメージアナリシスシステム（Ｃｏｍｐｉｘ、クランベリ
ー、ペンシルバニア州）を使用して、骨髄穿刺スミアを調べることにより評価し
た。骨髄穿刺液も、骨髄前駆細胞数および周期状態、ＣＤ３４^＋およびＣＤ４１ ^＋ 細胞サブセットの含有量（フローサイトメトリーにより）、および巨核球倍数
性（フローサイトメトリーにより）についてアッセイした。血液サンプルを、造
血前駆細胞数および血小板機能についてアッセイした。

【０２６９】 薬物動態プロフィル 血清サンプルを、トロンボポエチン投与の前、および２、５、１０、６０、お
よび９０分、および２、４、６、８、１０、１２、２４、４８、７２、９６、お
よび１２０時間後に収集した。各用量レベルでの濃度−時間プロフィルを、標準
的な薬物動態法を使用することにより評価した。血清トロンボポエチンレベルを
、トロンボポエチンについて酵素結合イムノソルベントアッセイにより定量した
（Ｅｍｍｏｎｓら、１９９６）。

【０２７０】 造血前駆細胞アッセイ 低密度骨髄（Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊら、１９９５）および末梢血細胞（Ｍｕｒ
ｒａｙら、１９９６）を使用した、コロニー形成単位−顆粒球−マクロファージ
（ＣＦＵ−ＧＭ）；バースト形成単位−赤血球系（ＢＦＵ−Ｅ）；およびコロニ
ー形成単位−顆粒球、赤血球系、マクロファージ、巨核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）
についてのアッセイを、メチルセルロースアッセイを用いて実施した。ＤＮＡ合
成（細胞周期のＳ期）における骨髄ＣＦＵ−ＧＭおよびＢＦＵ−Ｅの比率を、高
い比活性のトリチウム化チミジン自殺技術（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒら、１９８９）
により測定した。コロニー形成単位−巨核球（ＣＦＵ−ＭＫ）およびバースト形
成単位−巨核球（ＢＦＵ−ＭＫ）のアッセイを、フィブリン凝固アッセイ（Ｂｒ
ｕｎｏら、１９８８）を使用して実施した。

【０２７１】 倍数性解析 巨核球濃縮細胞画分を、パーコール勾配技術を使用することにより骨髄細胞懸
濁液から調製した。倍数性は、低張クエン酸溶液中ヨウ化プロピジウムでの染色
後に（Ｋｒｉｓｈａｎ、１９７５）、相対ＤＮＡ含量のフローサイトメトリー測
定により決定した。細胞はまた、抗ＣＤ４１ｂ（８Ｄ９）−ＦＩＴＣ（ＳｙＳｔ
ｅｍｉｘ、パロアルト、カリフォルニア州）で染色して、ＣＤ４１ｂ^＋巨核球上
での開口を可能とした。少なくとも３０００のＣＤ４１^＋事象が、各サンプルか
ら収集された。倍数性クラスのＣＤ４１^＋細胞の比率は、蛍光活性化細胞選別ド
ットプロットから決定した。

【０２７２】 血小板機能 血小板凝集は、３つのアゴニストに対する応答で測定した：アデノシン二リン
酸（最終濃度、２０μｇ／ｍＬ）、コラーゲン（６μｇ／ｍＬ）、およびトロン
ビン（５μｇ／ｍＬ）。標準的な方法を使用した（Ｒｏｄａｋ、１９９５）。ア
ゴニストの濃度は、正常な対照からの血液で実施した以前のin vitro試験に基づ
いて選択した。アッセイに使用した装置は、バイオ／データパップ４Ａ（Ｈｏｒ
ｓｈａｍ、ペンシルバニア）およびクロノ−ログ５６０ＣＡ（Ｈａｖｅｒｔｏｗ
ｎ、ペンシルバニア）であった。

【０２７３】 免疫表現解析 免疫表現解析は、抗ＣＤ３４（ベクトンディキンソン、サンホセ、カリフォル
ニア州）および抗ＣＤ４１モノクローナル抗体（イムノテック、ウェストブルッ
ク、メイン州）を使用して、標準的な二色フローサイトメトリー技術（Ｋｏｒｂ
ｌｉｎｇら、１９９５）により実施した。

【０２７４】 統計解析 連続的な変数を、ウィルコクソン順位和検定法の使用により比較した。あり得
る用量応答関係の傾向は、用量と結果の間のスペルマン順位相関係数（ｒＳｕｂ
Ｓ）を使用して評価した。

【０２７５】 産業規則 トロンボポエチンおよび研究の部分的な基金は、ジェネンテック社により提供
された。試験は、発明者と産業スポンサーの間の共同的努力であった。データ収
集、データ解析、原稿の記載、および原稿の発表の決定は、発明者の管理下にあ
った。原稿は、提出前に、産業スポンサーにより論評された。

【０２７６】 結果 多様な病歴サブタイプの肉腫に罹患した１２人の化学療法未処置患者（男性７
人および女性５人）が、化学療法前のトロンボポエチンを試験する、この第Ｉ相
試験の用量範囲部分に入った。全患者が、臨床耐容性およびトロンボポエチンに
対する応答について評価可能であると考えられた。これらの患者の中間年齢は、
４２歳（１６〜６３歳の範囲）であり、中間カルノフスキー動作状態スコアは９
０（８０〜１００の範囲）であった。４人の患者が、以前に放射線療法を受け、
８人が以前に手術を受けていた。

【０２７７】 末梢血球数 １用量のトロンボポエチンでの処置は、血小板数の増加（１．３倍〜３．６倍
）に関連していた（基線平均、２６４×１０^９／Ｌ、最大平均、５９２×１０^９ ／Ｌ）（Ｐ＝０．００２）。血小板数の増加は、全患者の全用量レベルで見られ
た。データは、各用量で全患者について平均±ＳＥとしてとった。血小板数のピ
ーク応答は、用量関連であり；６１％、１０７％、１１８％、および２１２％の
基線からの増加が、それぞれ０．３、０．６、１．２、および２．４μｇ／ｋｇ
用量レベルで見られた（ｒＳｕｂＳ＝０．７２０、Ｐ＝０．０１）。試験した最
も高い用量レベル（２．４μｇ／ｋｇ）では、血小板数は、処置した患者３人中
２人において、約１００万またはそれ以上まで増加した（一方の患者で９７０×
１０^９／Ｌおよび他方の患者で１３９２×１０^９／Ｌ）。

【０２７８】 血小板数の増加は、早くに見られ、患者１２人中１０人が、４日目までに基線
からの増加を示し（平均増加、１．２倍；Ｐ＝０．００５）、全患者が８日目ま
でに基線からの増加を示した（平均増加、１．８倍；Ｐ＝０．００２）。血小板
数は中間の１２日目にピークに達した（１０〜１５日の範囲）（平均増加、２．
２倍；Ｐ＝０．００２）。最大応答後、血小板数は次第に基線へと下降した。２
１日目までに（化学療法開始前）、血小板数は、特に最大用量レベルで（それら
は１．５倍に増加）基線より依然として高かった。

【０２７９】 全体的な血小板形態は、処置後、正常のようであった。ピーク血小板数の時に
、平均血小板容量は、基線より僅かに低く（８．５ｆＬに対して７．６ｆＬ）；
２１日目までにそれは基線に近づいた（８．２ｆＬ）。

【０２８０】 血小板機能 トロンボポエチン処置後に得られた血小板が、恒常性に重要な機能を媒介でき
るかどうかを決定するために、３つのアゴニストに応答した血小板凝集試験を、
トロンボポエチン処置（７日目）の前後の患者からおよび正常対照から得られた
血小板で実施した（表６）。血小板凝集に統計的に有意な変化は、アデノシン二
リン酸、コラーゲンおよびトロンビンに応答したトロンボポエチン処置後に基線
または対照サンプルに関連して見られなかった（Ｐ＞０．２）。

【０２８１】

【表６】

【０２８２】 他の造血細胞系統 トロンボポエチン処置後に僅かな上向きの傾向が白血球数に見られたが、数は
正常限界内で維持され；これらの変化は、臨床的に有意ではなかった。同様に、
ヘモグロビン値は、どの用量レベルでも変化しなかった。ヘモグロビンレベルの
小さな全体的減少が、時間につれて見られ（基線平均、１３．４±０．４、２１
日目に平均、１２．８±０．４）、これは、おそらく試験中に頻繁に実施した静
脈切開に関連しただろう。

【０２８３】 薬理動態 処置前に、内因性血清トロンボポエチンは、患者１２人中４人に検出可能であ
った（０．０９６〜０．２４ｎｇ／ｍＬ）。トロンボポエチン投与後、最初の最
大トロンボポエチン濃度は、用量に比例し、５〜５０ｎｇ／ｍＬの範囲であった
。データは、１用量レベルあたり、３人の患者について平均±ＳＥとしてとった
。トロンボポエチン濃度は、より高い用量後によりゆっくりと下降した。

【０２８４】 例えば、６時間目に、平均血清トロンボポエチンレベルは、２．４μｇ／ｋｇ
用量後に５０％まで、および０．３μｇ／ｋｇ後に８０％まで下降した。より高
い用量（１．２〜２．４μｇ／ｋｇ）の終末血清半減期は、１８〜３２時間の範
囲であった。全体的に、トロンボポエチンは、静脈内大量瞬時投与後に５〜６日
間循環中に維持された。

【０２８５】 臨床耐容性 トロンボポエチンでの処置は、全患者がよく耐容し、トロンボポエチンが原因
の有意な副作用はなかった。６人の患者が、その症状記録ダイアリーに時折の軽
度の頭痛を報告したが、これらの頭痛は、トロンボポエチン投与のタイミングに
密接に関連していなかった。試験薬物に関連した局所皮膚反応、骨疼痛、恒常的
症状、体重増加、浮腫、または化学変化は、この期間中に全く見られなかった。

【０２８６】 抗体解析 トロンボポエチン療法が、トロンボポエチンの造血効果を妨害し得る抗体の発
達に関連しているかをどうかを決定するために、全患者の血清サンプルを１週間
毎にスクリーニングした。試験した患者１２人中１人からの、投与後１３日目お
よび２２日目に得られた血清サンプルは、全長トロンボポエチンに反応性の抗体
について陽性であった。これらの抗体力価は、一過性であり、非中和性であり、
臨床続発症には関連していなかった。

【０２８７】 骨髄に対する効果 トロンボポエチンに対する造血応答の細胞基礎をより理解するために、発明者
は、前駆細胞の増殖、系統特異性、および成熟のために、トロンボポエチン処置
した前および７日後に、骨髄を調べた。

【０２８８】 骨髄形態 血小板数の増加は、用量依存的に、骨髄巨核球数の有意な増加に関連し（Ｐ＝
０．００３）；最も低い用量レベルでの１．２倍増加から、最も高い用量レベル
での４倍増加までの範囲であった（ｒＳｕｂＳ＝０．８６７、Ｐ＜０．００１）
。ほとんどの巨核球は正常な形態を示したが、豊富な細胞質および多小葉核をも
つ数個の大きな巨核球が同定された。全体的に、巨核球のサイズは、基線から有
意に増加した（３６μｍの平均直径［１７〜６４μｍの範囲］から平均４４μｍ
まで［２０〜８７μｍの範囲］；Ｐ＜０．００１）。

【０２８９】 顆粒球および赤血球シリーズは、骨髄、赤血球細胞比または骨髄細胞性に有意
な変化を起こすことなく、正常な成熟を示した（表７）。調べた全ての標本にお
いて、トロンボポエチン処置後に、骨髄コラーゲンには、全く有意な増加は同定
されなかった。

【０２９０】

【表７】

【０２９１】 巨核球倍数性解析 トロンボポエチン処置が巨核球成熟に影響を及ぼしたかどうかを決定するため
に、骨髄巨核球倍数性を全用量レベルで評価した。様相倍数性ピークは１６Ｎの
ままであったが、巨核球比率の増加が、全用量レベルで、より低い倍数性クラス
（４Ｎおよび８ＮにおいてＰ＜０．００１）で見られた。データは、患者につい
て平均±ＳＥとしてとった。処置開始時により高い倍数性分布を示した患者は含
まれなかった。さらに、増加したより高い倍数性レベルへの傾向が、より高い用
量で見られた（６４ＮについてはＰ＝０．０６そして１２８ＮについてはＰ＝０
．０６）。従って、トロンボポエチン処置は、巨核球の増殖およびより未熟な巨
核球の増殖の両方を増強した。

【０２９２】 骨髄前駆体およびＣＤ３４^＋細胞 トロンボポエチンが、前駆体細胞レベルで系統特異的効果を有するかどうかを
決定するために、骨髄前駆細胞頻度を、巨核球（ＣＦＵ−ＭＫおよびＢＦＵ−Ｍ
Ｋ）、骨髄（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）および多分化能（ＣＦＵ−
ＧＥＭＭ）細胞についてアッセイした。骨髄ＣＦＵ−ＭＫ（２．７倍〜３３倍）
の頻度は、調べた患者１１人中５人で増加した。有意な増加が、骨髄（１．８倍
；Ｐ＝０．００５）および赤血球（１．７倍；Ｐ＝０．０１６）前駆体の成熟サ
ブセット数で見られ、類似の傾向が、骨髄および赤血球前駆体および多分化能前
駆体の成熟サブセットで見られた。Ｓ相での骨髄細胞の比率も、基線から有意に
増加した（Ｐ＝０．０１３）。データは、試験した全ての患者について平均±Ｓ
Ｅとしてとった。さらに、骨髄ＣＤ３４^＋（Ｐ＝０．０１２）およびＣＤ４１^＋ （Ｐ＝０．００２）細胞の比率は、数が平均２倍増加した。

【０２９３】 前駆体の動員に対する効果 骨髄前駆体の増加が、動員効果に関連しているかどうかを決定するために、末
梢血を前駆細胞についてアッセイした。有意な増加が、骨髄（ＣＦＵ−ＧＭ）、
赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）、および骨髄−赤血球（ＣＦＵ−ＭＩＸ）細胞の数に見ら
れた。データは、３〜７日に見られた、ピーク応答（平均±ＳＥ）としてとった
。個々の患者応答は変動したが、用量依存的傾向が見られた。最も高い用量レベ
ルで、前駆細胞頻度の平均最大増加は、ＣＦＵ−ＧＭでは５．７倍、ＢＦＵ−Ｅ
では７．８倍、そしてＣＦＵ−ＭＩＸでは１０倍という高さで見られた。

【０２９４】 議論 発明者の目的は、臨床耐容性および薬物動態を含む、トロンボポエチンのin v
ivoでの生物学的効果を評価すること、および、化学療法を受ける前には正常な
造血機能を有していた癌患者におけるこのサイトカインに対する造血応答の性質
を定義することであった。発明者は、１用量のトロンボポエチンでの処置により
、用量依存的に循環血小板数の顕著な増加がもたらされたことを示す。血小板応
答（１．３倍から３．６倍に増加）が、最も低い用量のトロンボポエチンを受け
たコホートを含む、全患者で見られた。トロンボポエチンに応答して産生された
血小板は、正常な形態外見を有し、様々な刺激に応答して正常な凝集機能を示し
た。従って、この研究により、トロンボポエチンは、ヒトにおいて正常な機能を
もつ血小板の産生の強力な刺激であることが示される。

【０２９５】 発明者は、これらの患者において、トロンボポエチンに対する造血応答の数個
の興味深い面を観察した。血小板数の増加は、大半の患者で４日目までに見られ
、これは、応答の初期成分は、巨核球成熟増強、血小板放出またはその両方に関
連することを示唆する。血小板数は増加し続けるが、１０〜１５日でピークに達
する。これにより、応答の第二成分は、巨核球区分の増殖に関連し得ることが示
唆される。最大応答後、血小板数は基線に向けて下降した。しかし、化学療法前
の２１日目の血小板数は、特に最も高い用量レベルで、基線数よりも依然として
高く、この試験により、長期生物学的効果が示される。

【０２９６】 １用量のトロンボポエチン後のこの持続応答は、数個のあり得る機序により説
明できる。第一に、発明者は、トロンボポエチンが、約２０〜３０時間の延長さ
れた血清半減期を有し、約５〜６日間循環中に維持されることを観察した。さら
に、ピーク血清濃度は、用量に比例し、終末半減期は、より高い用量で延長され
、おそらくこれは、トロンボポエチンクリアランスプロセスの飽和による（受容
体媒介エンドサイトーシスにより血小板で最初に起こると考えられる）（Ｆｉｅ
ｌｄｅｒら、１９９６）。

【０２９７】 第二の説明は、骨髄レベルでのトロンボポエチンの増殖効果に関連し得る。幾
人かの患者は、巨核球前駆体（ＣＦＵ−ＭＫ）の数に増加を示した。骨髄に対す
るトロンボポエチンの増殖効果も、ＣＤ３４^＋細胞の比率の２倍増加およびＣＤ
４１^＋サブセットの同時２倍増加により示され、これは、巨核球経路に沿った選
択的成熟を反映する。事実、巨核球の数は、用量に比例して増加し、巨核球は正
常な形態を示した。さらに、倍数性解析により、トロンボポエチンの成熟効果が
示されただけでなく、未成熟巨核球サブセットの増殖も示され、これは、増殖効
果に関連し得る。第三に、血小板の寿命は９〜１０日間であるので、多くの血小
板の応答は、数日間持続すると期待される。

【０２９８】 骨髄に対するトロンボポエチンの増殖効果は、巨核球系統に限定されなかった
。有意な増加が、骨髄、赤血球、および多分化能細胞系統の前駆体の頻度に見ら
れた。さらに、Ｓ相の前駆体の比率も、トロンボポエチンでの処置後に増加した
。骨髄前駆体に対するトロンボポエチンの多系統刺激物質の効果にも関わらず、
末梢白血球数またはヘマトクリット値に大きな効果は見られなかった。従って、
前駆体レベルでの増殖効果は、主に巨核球経路に沿った分化と共役するようであ
った。

【０２９９】 骨髄での前駆体プールの増殖にも関わらず、全体的な細胞性は未変化のままで
あり、これはおそらく、末梢血への前駆体の延髄外放出による。臨床効果を示す
造血増殖因子の生物学的特性の１つは、収集でき、用量集中強化または骨髄切除
療法後に再灌流できる造血前駆体の移動能である（Ｓｏｃｉｎｓｋｉら、１９８
８；Ｓｈｅａら、１９９２；Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒら、１９９３）。この試験で、
１用量のトロンボポエチンは、多系統の前駆体を強く動員した。前駆細胞の循環
プール中のこの見かけの増加は、さらに、末梢血中の非常に原始的な造血細胞（
ＣＤ３４^＋／Ｔｈｙ−１^＋／Ｌｉｎ）の数倍増加によりさらに支持された（Ｍｕ
ｒｒａｙら、１９９６）。

【０３００】 トロンボポエチンでの処置は、全患者がよく耐容性を示し；トロンボポエチン
または血小板増多に関連した有意な副作用は見られなかった。他のサイトカイン
と異なり、トロンボポエチンは、発熱、恒常性症状、骨疼痛、炎症症状、液体停
留、または任意の他の毒性に関連していなかった（Ｓｍｉｔｈら、１９９３；Ｖ
ａｄｈａｎ−Ｒａｊら、１９９４；Ｂｉｅｓｍａら、１９９２；Ｖｅｌｄｈｕｉ
ｓら、１９９５；Ｖａｈｄｍａｎ−Ｒａｊら、１９９４；Ｔｅｐｌｅｒら、１９
９６）。従って、有意な毒性がないことおよびトロンボポエチンの系統優先的生
物学的効果は、トロンボポエチン能を有する他のサイトカインよりも良好な治療
比を提供し得る。

【０３０１】 血小板増多症の誘導に関連した１つのあり得る関心は、血栓症の危険性の増加
であり、これは、頻繁に、骨髄増殖疾患の患者に見られる。しかし、形態および
機能的血小板異常の欠如および誘導血小板増多症の一過性性質により、この臨床
設定での危険性は制限され得る。

【０３０２】 要約すると、この試験により、トロンボポエチンは、ヒトの巨核球形成および
血小板新生の強力な刺激物質であることが示される。１用量として投与したトロ
ンボポエチンは、循環中血小板数の増加を延長した。それは末梢血球数に対する
系統優先的効果を示したが、それは骨髄前駆体細胞レベルで多系統効果を媒介し
、末梢血に多系統の前駆体を動員した。これらの観察は、数個のあり得る分枝を
有する。例えば、骨髄増殖因子の臨床適用の様式に類似した様式で、トロンボポ
エチンは、化学療法誘導血小板減少症を減弱する能力を有する。ここで報告され
た試験により、ピーク血小板応答は、１０日から１５日に起こることが示される
。従って、化学療法前のトロンボポエチンでの処置は、血小板産生が化学療法後
に再開され、おそらく、化学療法後に投与されたトロンボポエチンによりさらに
増強されるまでの持ち越し期間を提供し得る。

【０３０３】 第二の興味深い可能性は、１用量の強力な生物学的効果により、末梢幹細胞移
植用に前駆細胞を動員するためだけでなく、アフェレーシス製品として輸血でき
、従って複数のドナーへの曝露に関連した同種免疫化の危険性を潜在的に減少さ
せる血小板を収集するために、患者または正常ドナーにトロンボポエチンを投与
できる。しかし、試験は、正常な造血の混乱していない、小さな限定された肉腫
患者群を含むことに注意すべきである。

【０３０４】 実施例２ 細胞毒性化学療法を受けている患者における、組換えヒトトロンボポエチン（ｒ
ｈＴＰＯ）を用いた１用量療法 背景 集中的な化学放射線療法の前臨床モデルにより、１用量のｒｈＴＰＯは、血小
板最下点を上昇させ、重度の血小板減少症の期間を短縮することが実証された。
１用量のｒｈＴＰＯを、化学療法を受けている癌患者に投与した、２つの第Ｉ相
試験の中間結果を提示する。

【０３０５】 患者および方法 両方の試験を、０．３、０．６、または１．２ｍｃｇ／ｋｇの１回の静脈内瞬
時大量注射後の、ｒｈＴＰＯ安全性および血小板応答の評価のために、２１日間
の化学療法前期間（サイクル０）で開始した（各試験において１群あたり患者３
人）。次いで、患者は、選択したその後のサイクルにおいて、化学療法後に同じ
用量のｒｈＴＰＯを受けた。最初の試験個体群は、２つの各々の連続的な化学療
法サイクルにおいて、サルベージチオテパ化学療法（６５ｍｇ／ｍ２ ｑ２８ｄ
）の次の日にｒｈＴＰＯを受けた進行悪性疾患に罹患した患者から構成された。
第二の試験は、ＡＩ化学療法（ドキソルビシン９０ｍｇ／ｍ２、イフォスファミ
ド１０ｇ／ｍ２ ｑ２１ｄ）での誘導処置を受けている肉腫に罹患した化学療法
未処置患者を含んだ。サイクル０の後、この試験の患者を、最初の化学療法サイ
クル中にモニタリングし、第二およびその後のサイクル中の化学療法（ｄ５）完
了の次の日に１回のｒｈＴＰＯ注射を受けた。

【０３０６】 結果 １４人の患者が現在までに処置された。ｒｈＴＰＯは十分な耐容性を示し、試
験薬物に起因する重度な副作用は報告されなかった。ｒｈＴＰＯに対する抗体は
観察されなかった。サイクル０で、最も低い（０．３ｍｃｇ／ｋｇ）用量は活性
が弱く、以下に示したようにより高い用量で活性は増加した。

【０３０７】

【表８】

【０３０８】 サイクル０中の最大血小板数は、中間日１１日（７〜１４の範囲）に起こった
。ＷＢＣまたはＨＣＴに有意な変化は認められなかった。骨髄のＦＡＣＳ解析に
より、０．６ｍｃｇ／ｋｇ後に、２人中２人の患者に、全ｃＤ３４＋サブセット
の増加が示された。末梢血ＣＤ３４＋細胞の増加も、これらの患者に見られ、こ
れは、ＴＰＯが幹細胞移動活性を有し得ることを示唆する。用量増大および化学
療法後の処置が進行中である。

【０３０９】 結論 これらの第Ｉ相試験と共に、１用量のｒｈＴＰＯの投与は、安全で十分に耐容
性を示すことが示唆される。０．３、０．６および１．２ｍｃｇ／ｋｇの用量レ
ベルにより血小板新生活性の増加が示される。より高用量レベルでの患者の処置
により、１用量のｒｈＴＰＯは、集中的な化学療法後に血小板減少症の寛解に効
果があるという仮定を試験する。

【０３１０】 実施例３ アドリアマイシン（Ａ）およびイフォスファミド（Ｉ）を用いた高用量化学療法
（ＣＴ）を受けている肉腫患者における、組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴ
ＰＯ）の第Ｉ〜ＩＩ相調査 ＡＩは、肉腫処置の非常に有効な措置であるが；しかし、骨髄抑制が累積性お
よび多系統である。重度の骨髄抑制の前臨床モデルで、１用量として投与したｒ
ｈＴＰＯ（ジェネンテック社）は、窪み最下点を上昇させ、重度の血小板減少症
の期間を減少させた。これらの観察に基づき、発明者は、ｒｈＴＰＯ単独の第Ｉ
〜ＩＩ相調査およびＡＩ後に耐容性の評価および生物学的効果の調査を開始した
。ｒｈＴＰＯは、ＡＩ前（サイクル０）および第二サイクルのＡＩ後（サイクル
２）に、腕Ａ上に１用量として静脈内大量瞬時投与として（０．３、０．６、１
．２、２．４μｇ／ｋｇ）、または腕Ｂ上に２用量として（０．３、０．６、１
．２μｇ／ｋｇ×２）投与した。２３人の患者がｒｈＴＰＯ（１６の腕Ａ、７の
腕Ｂ）を受けた。ＡＩ前のｒｈＴＰＯは、血小板数を有意に増加させた（腕Ａ（
ｎ＝１２）およびＢ（ｎ＝７）においてそれぞれ３．６および４．４倍まで）。
血小板の増加は維持され、中間日１２日目にピークに達した。この持続応答は、
１用量のｒｈＴＰＯ後の延長された血清半減期（２０〜３０時間）に関連してい
た。血小板は、普通の形態および凝集機能を示した。血小板の応答は、ＢＭ巨核
球の４倍上昇、ＣＤ３４＋、ＣＤ４１＋細胞サブセットの２倍上昇、並びに、Ｂ
Ｍ前駆体の頻度およびサイクル率の有意な増加を伴った。さらに、複数の細胞系
統の前駆細胞の移動が観察された。化学療法後のデータ（平均±ＳＥＭ）は、ｒ
ｈＴＰＯを受けた１９人の患者について以下に示す。

【０３１１】

【表９】

【０３１２】 これらのデータにより、ｒｈＴＰＯは、血小板産生延長の強力な刺激であり、
前駆細胞レベルで多系統刺激効果を示すことが示される。

【０３１３】 実施例４ ヒトにおける骨髄巨核球に対する組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）の
効果 骨髄巨核球（ＭＫ）形態に対するｒｈＴＰＯ（ジェネンテック社）のin vivo
での効果を評価するために、発明者は、第Ｉ〜ＩＩ相調査の一部として化学療法
未処置肉腫患者において１用量のｒｈＴＰＯ（０．３〜２．４ｍｃｇ／ｋｇ）を
受けた１２人の患者からの骨髄標本を調べた（Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊ、１９９６
）。ｒｈＴＰＯの前および後（７日目）の両方で得られたＢＭ標本を染色し［Ｈ
およびＥ（生検）；ライト−ギームザ（穿刺）］、サイズおよび形態における処
置関連変化について調べた。巨核球のサイズは、Ｍａｇｉｓｃａｎイメージアナ
リシスシステム（Ｃｏｍｐｉｃ、ＰＡ）の使用により、骨髄穿刺スミアを調べる
ことにより評価した。明瞭に定められた境界および無傷核および細胞質膜を有す
る２５の巨核球を、細胞および核領域について評価した。巨核球の数は、用量関
連的に増加した（Ｐ＜０．０１）。大半の巨核球が豊富な細胞質中で正常に見え
たが、多小葉核が見られた。全体的な巨核球は基線値以上に有意に増加した（平
均直径３６μｍ〜４４μｍ、ｐ＜０．００１）。細胞および核領域でのデータ（
平均±ＳＥＭ）およびＮ／Ｃ比を以下に示す。

【０３１４】

【表１０】

【０３１５】 これらの結果により、１用量として投与したｒｈＴＰＯは、巨核球の数および
サイズの両方を増加することが実証される。核および細胞領域の両方のサイズが
増加したが、その増加は、細胞質領域でより顕著のようであった。

【０３１６】 実施例５ 癌患者における静脈内投与後の組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）の薬
物動態 ｒｈＴＰＯ薬物動態および血小板応答を、第Ｉ／ＩＩ相用量増大臨床試験の一
部として、１２人の化学療法未処置肉腫患者（年齢１６〜６３歳）で試験した（
Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊ、１９９６）。

【０３１７】 方法 ｒｈＴＰＯは、化学療法の３週間前に、１回の静脈内瞬時大量投与として投与
した。３人の患者を、各用量レベル（０．３、０．６、１．２または２．４μｇ
／ｋｇ）で処置した。血清薬物動態サンプルを、投与後の５日間におよび集めた
。ＴＰＯ濃度を、ＴＰＯの捕獲のために組換えｃ−ｍｐｌ受容体を使用するエリ
ザにより測定した。薬物動態解析を、非コンパートメントモデルを使用して実施
した。血小板数を慣例的に２１日間測定した。

【０３１８】 結果 ｒｈＴＰＯ投与前に、内因性血清ＴＰＯを患者１２人中４人に検出した。ｒｈ
ＴＰＯ投与後に、血清ＴＰＯは、全ての用量群で５日間検出可能であった。平均
初期最大血清ＴＰＯレベル（０．３および２．４μｇ／ｋｇ用量について、それ
ぞれ約５および５０ｎｇ／ｍＬ）により、僅かに血清容量よりも多い、容量６０
ｍＬ／ｋｇへの初期の分布が反映された。各用量群内で、初期最大ＴＰＯレベル
は、より高い基線血小板数を有する患者でより低い傾向があったが、これはおそ
らく血小板へのＴＰＯの初期の結合を反映する。血清ＴＰＯレベルは、より低い
用量を受けた患者に比べて、１．２および２．４μｇ／ｋｇ用量を受けた患者で
よりゆっくりと下降した。１．２および２．４μｇ／ｋｇ用量後に推定される最
終血清ＴＰＯ半減期は、１８〜３２時間の範囲であった。血小板がＴＰＯを排除
する能力に一致して、各用量レベル内のＴＰＯ濃度対時間の曲線下の面積（ＡＵ
Ｃ）は、より高い基線血小板数を有する患者においてより低かった。血清ＴＰＯ
クリアランスは、ｒｈＴＰＯ用量の増加につれて減少した。血小板数の最大変化
（０．３および２．４μｇ／ｋｇの用量群について、それぞれ、基線よりも６１
％および２１２％上）は、ｒｈＴＰＯ用量におよびＴＰＯ ＡＵＣに比例した。
血小板数の増加は、４日目という早くに観察され、ｒｈＴＰＯ投与後に中間の１
２日目までに（１０〜１５日の範囲）最大に達した。最大血小板数までの時間は
、ｒｈＴＰＯ用量レベルにより影響を受けなかった。血小板は、２１日まで幾人
かの患者において上昇を維持した。

【０３１９】 要約 ＴＰＯは、１回の静脈内大量瞬時投与後に少なくとも５日間循環中に維持され
、ＴＰＯレベルは下降し約１８〜３２時間の終末半減期であった。各用量群内で
、ＴＰＯ最大レベルおよびＡＵＣは、基線血小板数に反比例した。１用量のｒｈ
ＴＰＯの静脈内用量は、血小板数の用量比例的増加をもたらし、血小板数は数日
間上昇を維持した。

【０３２０】 実施例６ 組換えヒトトロンボポエチン（ＲＨＴＰＯ）は、婦人科悪性疾患に罹患した患
者における、高用量カルボプラチン（Ｃ）誘導血小板減少症を減弱する。

【０３２１】 カルボプラチンは、進行段階のプラチン感受性再発疾病に効果的であるが；し
かし、累積血小板減少症は、頻繁に用量限界性である。前臨床試験で、ＴＰＯは
、ＲＴ＋カルボプラチンにより汎血球減少となったマウスにおける、最下点を減
少させ、血小板（ＰＬＴ）回復を促進した。この観察に基づき、発明者は、ｒｈ
ＴＰＯ単独の第Ｉ〜ＩＩ相試験およびカルボプラチン（ＡＵＣ＝１１）後に耐容
性および生物学的効果の評価を実施した。用量漸増期中に、ｒｈＴＰＯは、１用
量（０．６、１．２、２．４、３．６ｍｃｇ／ｋｇ）としてカルボプラチン前に
、および第二サイクルのカルボプラチン後に４用量を皮下注射により投与した。
用量増量中に、６人の追加の患者が、重度の血小板減少症の二次予防としてのみ
最適の生物学的用量（ＯＢＤ）でｒｈＴＰＯを受け、カルボプラチン前のｒｈＴ
ＰＯは血小板数を有意に増加させ（３．５倍まで、ｐ＜０．００１）、ピーク効
果は中間の１５日目で得られた。血小板応答は、骨髄巨核球および赤血球エレメ
ントの増加を伴った。全用量でｒｈＴＰＯを受けた２２人の患者に関する化学療
法後のデータ（平均±ＳＥＭ）を以下に示す（表１１）。

【０３２２】

【表１１】

【０３２３】 サイクル−２でＯＢＤ（１．２ｍｃｇ／ｋｇ）のｒｈＴＰＯを受けた１１人の
患者において、ｒｈＴＰＯにより、患者の７１％に（サイクル−１で患者７人に
対してサイクル−２で患者２人）に血小板輸血の必要性が回避された。ｒｈＴＰ
Ｏに関連した有意な副作用は全く見られなかった。これらのデータにより、ｒｈ
ＴＰＯは、カルボプラチン誘導血小板減少症の減弱に効果的であり、二次予防と
して使用した場合に血小板輸血を防ぐことができることが示される。

【０３２４】 実施例７ 肉腫患者における組換えヒトトロンボポエチン（ＲＨＴＰＯ）を用いたアドリア
マイシン＋イフォスファミドの予備試験 本実施例は、ｒｈＴＰＯとアドリアマイシンおよびイフォスファミド（ＡＩ）
の組合せを投与する最適用量スケジュールを決定する方法、および、ＡＩ誘導血
小板減少症の減少に提案されたスケジュールでのｒｈＴＰＯの効力に関する予備
情報を得る方法を記載する。

【０３２５】 アドリアマイシンおよびイフォスファミドは、肉腫の処置に現在使用されてい
る２つの最も活性のある化学療法剤である。入手可能なデータにより、これらの
両方の薬剤について正の用量応答関係が示唆される。しかし、累積的骨髄抑制は
、しばしば、用量限界的である。ｒｈＴＰＯは、血小板新生の系統優先的調節因
子であり、累積的血小板減少症を減弱し得る。連続的な予備試験およびより近年
の第Ｉ〜ＩＩ相試験の結果により、この措置は、６０％以上の応答率で活性であ
ることが示唆される。発明者の試験で使用した用量では（９０ｍｇ／ｍ^２アドリ
アマイシンおよび１０ｇｍ／ｍ^２イフォスファミド）、累積骨髄抑制以外は、措
置は十分に耐容性を示す。それ故、発明者は、造血毒性を減弱するための造血増
殖因子（Ｇ−ＣＳＦおよびｒｈＴＰＯ）の使用を調査している。

【０３２６】 Ｃ−Ｍｐｌ受容体のリガンドであるトロンボポエチン（ＴＰＯ）が近年精製さ
れ、クローン化された。ＴＰＯは、巨核球前駆体の増殖および血小板産生巨核球
へのその成熟を促進することにより、血小板産生の発達の全段階を調節する。前
臨床試験では、ＴＰＯの投与により、血小板数は数倍、迅速に上昇する。骨髄抑
制のネズミモデルにおいて、組換えネズミＴＰＯが、カルボプラチンおよび放射
線照射により汎血球減少となったマウスの血小板減少症を抑止するのに効果的で
あることが示された。徹底的な前臨床試験の結果として生じた主要な安全に関す
る懸念は、免疫原性および生じる血小板減少症を含む。

【０３２７】 組換えヒトＴＰＯ（ｒｈＴＰＯ）は、現在、骨髄抑制および骨髄切除化学療法
の両方を受けている患者において、数個の第Ｉ〜ＩＩ相臨床試験の試験を受けて
いる。進行中の試験において、１および複数の用量の静脈内ｒｈＴＰＯが安全で
あり、恒常的な毒性（例えば発熱、硬直、低血圧）の証拠がないことが実証され
た。処置した１５０人以上の被検者の中、ｒｈＴＰＯにおそらく関連すると考え
られる２つの血栓事象（深静脈血栓症）が報告されている。抗ＴＰＯ抗体が、静
脈内ｒｈＴＰＯ処置被検者の１０％に観察され；これらの抗体は、一過性であり
、非中和性であった。現在までに、２５人以上の被検者が皮下（ＳＣ）注射によ
りｒｈＴＰＯを受け、抗ＴＰＯ抗体がこれらの１０％に観察されている。潜在的
な中和抗体は、５ヶ月間におよびｒｈＴＰＯの複数回の皮下注射を受けた１人の
被検者に観察され、回復前に血小板減少症の延長を経験した。血小板減少症は、
抗体の存在に起因するのか、または骨髄抑制化学療法の累積効果に起因するのか
は不明である。

【０３２８】 患者包含基準 試験に含めるためには、患者は以下の基準を満たしていなければならない。患
者は、ＡＩでの処置が指示される、手術不能で局所的に進行し、再発または転移
の危険性の高い、肉腫を有さなければならない。患者の年齢は１５〜６５歳であ
るべきである（１３歳から１５歳未満については発明者は慎重となる）。出産可
能な女性は、効果的な避妊の手段を使用していなければならない。患者は、適切
な血液、腎、および肝機能、カルノフスキー動作状態＞８０、およびインフォー
ムドコンセントのサインを有していなければならない。

【０３２９】 患者排除基準 患者は以下の理由から排除すべきである。患者は、妊娠または授乳中の女性、
患者の処置合併症の危険性を高くする同時罹患容態を有する患者、非制御転移疾
病を有する患者、顕著な心疾患（ＮＹＨＡクラスＩＩＩまたはＩＶ）、律動異常
、または近年にＭＩまたは虚血の病歴を有する患者、ＨＢｓＡＧ陽性の患者、以
前に化学療法または手術前に造血増殖因子または試験に入る２週間以内にＲＴの
使用、以前に骨盤放射線照射の病歴、または任意の血小板疾患（ＩＴＰ、ＴＴＰ
等）の病歴、出血疾患、または任意の出血の危険性の増加を有していた患者であ
る。

【０３３０】 処置計画 患者の群を、各５つのスケジュールで処置した。

【０３３１】

【表１２】

【０３３２】 ｒｈＴＰＯは、静脈内瞬時大量注射により投与する。４日目に、最初のｒｈＴ
ＰＯ用量の約１２時間後に５ｍｃｇ／ｋｇ／日のＧ−ＣＳＦで開始し、ＡＮＣ＞ １５００／ｍｍ^３となるまで最下点後に２日連続して続ける。

【０３３３】 少なくとも安定または応答疾病を有し、過剰な造血毒性（すなわち、＞７日間
の間、血小板数＜２０，０００／ｍｍ^３または臨床的に意義ある出血に関連した
血小板減少症）のない患者において、ｒｈＴＰＯ処置を用いた化学療法を計６サ
イクルまで続けることができる。

【０３３４】 化学療法サイクルは、ＡＮＣが＞１５００／ｍｍ^３に回復し、血小板は＞１０
０，０００／ｍｍ^３である場合、３週間毎に反復する。

【０３３５】 統計学的考察 ｒｈＴＰＯの効力に関する予備情報は、サイクル−１（ｒｈＴＰＯ無し）およ
びサイクル−２（ｒｈＴＰＯ有り）の間および異なる群間の最下点数および血小
板の回復を比較することにより得られる。作成されたデータを使用して、将来の
第ＩＩ〜ＩＩＩ相臨床試験を設計するのに役立てる。

【０３３６】 特許評価：（前処置および暫定試験） 患者の病歴、ＰＥ、動作状態、各種ＣＢＣ、血小板、血清化学、電解液、マグ
ネシウム、血清バンク、骨髄穿刺および生検（選択した患者）、胸部Ｘ線、腫瘍
処置およびＥＫＧのための放射線学試験を評価する。

【０３３７】 推定自然増加 自然増加は、約３０の評価可能な参加者であると推定される。

【０３３８】 試験計画 ｒｈＴＰＯの安全性および効力は、ＡＩ（アドリアマイシン９０ｍｇ／ｍ^２お
よびイフォスファミド１０ｇｍ／ｍ^２）を受けている肉腫患者で評価した。試験
に参入した７９人の患者の中、７４人の患者がｒｈＴＰＯを受けた。ｒｈＴＰＯ
が原因の重度の副作用は、この試験で観察されなかった。１用量または２用量と
して化学療法前に投与されたｒｈＴＰＯは、循環血小板数の用量依存的増加に関
連していた。化学療法後、ｒｈＴＰＯの５つの異なる投与スケジュールを調べた
：化学療法後に１用量（Ａ）、化学療法後に２用量（Ｂ）、化学療法後に７用量
（Ｃ）、化学療法前に１用量および後に２用量（Ｄ）および、化学療法前、最中
およびその後に１用量（Ｆ）。Ｄスケジュール（−１、４および５日目）として
１．２〜２．４ｍｃｇ／ｋｇの用量で投与したｒｈＴＰＯは、血小板減少症を減
少させ、血小板回復を加速するようである。しかし、特に免疫無防備状態の患者
においてこの措置を使用する場合には（すなわち、二次予防として、女性患者ま
たは年齢＞５０歳の患者において）、血小板減少症の減少に均一に効果的ではな
い。

【０３３９】 試験計画の原理： 最下点はＡＩ措置で早く起こり（すなわち１２日目）、ｒｈＴＰＯのピーク効
果も約１２日目（１０〜１５日目）で見られるので、ｒｈＴＰＯの早い投与が役
立ち得る。婦人科悪性疾患に罹患した患者の臨床試験からの発明者の知見により
、４用量のｒｈＴＰＯ（化学療法後の日にはじめて隔日に、または化学療法前に
１用量、化学療法の日に１用量および化学療法後に２用量）が、カルボプラチン
誘導血小板減少症の減少に効果的であることが示される。それ故、発明者は、３
つの僅かに異なるスケジュールにより、３群の患者に、４用量について１．２ｍ
ｃｇ／ｋｇで投与したｒｈＴＰＯの可能性を評価したい：ｒｈＴＰＯを、−３、
−１、４および６日目に（Ｉ）、−５、−３、−１、および４日目に（ＩＩ）、
および−１、４、６、および８日目に（ＩＩＩ）。

【０３４０】 化学療法前または最中に増殖因子を使用する１つのあり得る懸念は、骨髄前駆
細胞が、化学療法投与時に活発に増殖し得、細胞毒性薬物に感受性であり得るこ
とであり得る。前駆細胞増殖動力学に関する発明者の実験室の知見により、ｒｈ
ＴＰＯの８日後には前駆細胞の増殖速度の有意な増加が示されるが、４日目では
示されないことが示唆される。さらに、発明者は、肉腫および婦人科悪性疾患の
両方における化学療法投与の日の前およびその日のｒｈＴＰＯ投与のスケジュー
ルを評価した。これらのデータにより、化学療法前のｒｈＴＰＯ投与の有害な効
果は明白に示唆されない。安全性の理由から、発明者は、化学療法前に（すなわ
ち−３および−１日目）１用量追加して開始する。このスケジュールが、安全で
、期待されるよりも造血毒性の増加に関連していないようである場合、発明者は
次の群で化学療法前（すなわち−５、−３、および−１日目）にさらに１用量追
加する。

【０３４１】 臨床アップデート 現在までに２１人の患者（１８人が評価可能）をこの試験で処置した。ｒｈＴ
ＰＯでの処置は十分に耐容性を示す。造血パラメータの予備解析により、平均血
小板最下点は、３用量のｒｈＴＰＯを化学療法前に１用量を化学療法後に投与す
るスケジュールにより、サイクル−１よりもサイクル−２でより高いことが示さ
れる。発明者は、以前に、カルボプラチン（ＡＵＣ＝１１）のようなより短い措
置では、化学療法後に４用量として投与したｒｈＴＰＯは、血小板減少症を有意
に減少させることを示した。それ故、発明者は、さらに２つのコホートを処置し
たく、ここでの全４用量のｒｈＴＰＯは、ＡＩ化学療法後（スケジュールＩＶ）
に投与され、全４用量のｒｈＴＰＯは化学療法前（スケジュールＶ）に投与する
。これは、全用量のｒｈＴＰＯを化学療法後に投与することを計画している、第
ＩＩＩ相の実行前の有用な情報であろう。

【０３４２】 背景の薬物情報 ｒｈＴＰＯ以外の全ての薬物は、市販で入手できる。ｒｈＴＰＯは、ジェネン
テック社、４６０ポイント・サン・ブルーノ大通り、サウスサンフランシスコ、
ＣＡ９４０８０により、非経口投与用に準備の整った無菌液体として提供される
。各３ｍＬのガラスバイアルの活性化合物は、２ｍＬを含む。ｒｈＴＰＯは、緩
衝溶液中０．１ｍｇ／ｍＬで提供される。ｒｈＴＰＯは船で送られ、２℃〜８℃
（３５°Ｆ〜４６°Ｆ）の冷蔵下で保存しなければならない。製剤は、保存剤を
含まず、１用量投与のみに適している。明るい光への曝露は避けるべきである。
凍結してはならない。バイアル上にスタンプした有効期限を過ぎて使用してはな
らない。

【０３４３】 ｒｈＴＰＯ調製物および投与 試験を通じて、臨床薬剤師または他の設計した試験スタッフは、基線で測定し
た被検者の体重に基づいてｒｈＴＰＯ注射液を調製する。臨床薬剤師は、被検者
ＩＤ番号（および任意の他の同定要素）で標識されたｒｈＴＰＯのシリンジ、プ
ロトコル番号およびｒｈＴＰＯの量（ｍｇおよびｍＬ）を試験スタッフに提供す
る。希釈ｒｈＴＰＯの注射は、調製の４時間以内に投与しなければならない。

【０３４４】 患者包含基準 含まれるためには、患者は、ＡＩでの処置が指示される、手術不能で局所的に
進行し、再発または転移の危険性の高い、肉腫を有するべきである。患者の年齢
は１５〜６５歳であるべきである（１３歳から１５歳未満については発明者は慎
重となる）。出産可能な女性は、効果的な避妊の手段を使用していなければなら
ない。患者は、適切な骨髄機能、および好中球絶対数＞１５００／μＬ、血小板
数＞１５０，０００／μＬ、およびＨｇｂ＞１０ｇｍ／ｄＬを有するべきである
。患者は、適切な腎機能、すなわち血清クレアチニン＜１．５ｍｇ％を有するべ
きである。患者は、適切な肝機能、すなわちＳＧＰＴ＜３×正常およびビリルビ
ン＜１．５×正常を有するべきである。患者のカルノフスキー動作状態は＞８０
であるべきである。患者は、サインしたインフォームドコンセント形を有するべ
きである。

【０３４５】 患者排除基準 患者は、妊娠または授乳中の女性である場合に排除される。患者は、患者の処
置合併症の危険性を高くする同時罹患容態を有する場合に排除される。患者は、
ＣＮＳに対する非制御転移疾病を有する場合に排除される。顕著な心疾患（ＮＹ
ＨＡクラスＩＩＩまたはＩＶ）、律動異常、または近年にＭＩまたは虚血の病歴
を有する患者は排除される。ＨＢｓＡＧ陽性の患者は排除される。患者は、以前
に化学療法または手術前に造血増殖因子または試験に入る２週間以内にＲＴの使
用、以前に骨盤放射線照射の病歴、または任意の血小板疾患（ＩＴＰ、ＴＴＰ等
）の病歴、出血疾患、または任意の出血の危険性の増加を有する場合に排除され
る。

【０３４６】 処置計画 全患者は、患者データ管理システム（ＰＤＭＳ）に登録される。

【０３４７】 試験設計 ６人の患者の群を、各３つのスケジュールで処置する。

【０３４８】

【表１３】

【０３４９】

【表１４】

【０３５０】 化学療法 アドリアマイシンは、０〜２日目に、７２時間の連続静脈内注射として９０ｍ
ｇ／ｍ^２の用量で投与する。イフォスファミドは、０〜３日目に、２．５ｇ／ｍ ^２ ／ｄ×４日間（全用量１０ｇ／ｍ^２）で各日３時間かけて投与する。Ｍｅｓｎ
ａ（５００ｍｇ／ｍ^２またはイフォスファミドの用量の２０％）を、０日目のイ
フォスファミドの初回用量を用いて３時間かけて静脈内投与し、最終用量のイフ
ォスファミドの２４時間後まで、連続注入（１５００ｍｇ／ｍ^２／日で計６ｇｍ
／ｍ^２）として維持した。

【０３５１】 ４日目の、最初のｒｈＴＰＯ用量の約１２時間後に、５ｍｃｇ／ｋｇ／日のＧ
−ＣＳＦで開始し、ＡＮＣ＞１５００ｍｍ^３となるまで最下点後２日間連続して
続ける。さらに、全患者が、５日目から開始して、抗微生物予防としてＡＮＣの
回復まで、シプロフロキサシン５００ｍｇ経口Ｂｌ１）を受ける。

【０３５２】 少なくとも安定または応答疾病を有し、過剰な造血毒性（すなわち、＞７日間
の間、血小板数＜２０，０００／ｍｍ^３または臨床的に意義ある出血に関連した
血小板減少症）のない患者において、ｒｈＴＰＯ処置を用いた化学療法を計６サ
イクルまで続けることができる。化学療法サイクルは、ＡＮＣが＞１，５００／
ｍｍ^３まで回復し、血小板が＞１００，０００ｍｍ^３である場合、３週間毎に反
復する。患者に、血小板数が＜１５，０００／ｍｍ^３まで下降した場合またはよ
り高いレベルで任意の臨床的に意義ある出血がある場合に、血小板を輸血する。
赤血球輸血は、Ｈｂ＜８ｇｍｓ／ｄＬ、またはより高いレベルで臨床的に指示さ
れる場合に使用する。

【０３５３】 用量変更 試験のどの被検者にも６サイクルの全用量化学療法を送達するためにあらゆる
試みを行う。表１５に列挙した特異的副作用の場合、ドキソルビシンおよび／ま
たはイフォスファミドの注入期間の減少または変化は、以下のパラメータを使用
して、記載したように実施し得る：

【０３５４】

【表１５】

【０３５５】 さらなる用量減少／変更が必要であれば、被検者は試験から退ける。全ての被
検者を、ｒｈＴＰＯを用いた最後サイクルの最後の日から少なくとも２８日間追
跡する。

【０３５６】 前処置評価 患者を、標準的な病歴および腫瘍測定と身体的検査について評価する。実験室
試験は、各種ＣＢＣ、血小板数、電解液、マグネシウムおよび化学を含む。胸部
Ｘ線、心電図、腫瘍測定のための放射線学的試験、およびＴＰＯに対する抗体を
測定する。

【０３５７】 試験中の評価 被検者は、安全性、身体所見、および腫瘍応答を試験中に緊密にモニタリング
する。被検者を、試験および追跡期間中に来診毎に副作用について評価する。バ
イタルサインを、各来診時に、並びに各ｒｈＴＰＯ投与の前後に測定する。さら
に、各種ＣＢＣおよび血小板数の実験室評価を、化学療法前および化学療法後少
なくとも１週間に３回モニタリングする。さらに、ＡＮＣ＜５００／μＬおよび
血小板数＜５０，０００／μＬ（約９〜１３日目）の場合、毎日カウントを実施
する。化学的には、電解液およびマグネシウムは、各経過の前におよび必要であ
ると推定される頻度で反復する。各サイクル前のＴＰＯに対する抗体を測定する
。選択した患者でのサイクル−２での（基線）より前およびｒｈＴＰＯ投与後の
ＢＭ穿刺を実施する。

【０３５８】 応答および毒性の基準 標準的な肉腫基準を使用する。

【０３５９】 療法中止の基準 療法は、進行性疾病が初期応答を変化させる場合、または患者が最小２クール
の療法の後に応答しない場合、中止する。療法は、予測不可能、不可逆、または
等級４の非血液学的毒性として定義される許容不可能な毒性が患者に見出される
場合、中止する。療法は、プロトコルの要求または患者の拒絶で患者による服薬
遵守がなされないために中止する。

【０３６０】 他のパラメータ 約３０人の評価可能な患者を処置する。任意の提案したスケジュールでのｒｈ
ＴＰＯが、重度の血小板減少症を減弱するか、または一様に輸血必要性を排除す
る場合、公式の第ＩＩ〜ＩＩＩ相プロトコルを作成する。データを集め、試験に
割当てられた研究看護婦によりＰＤＭＳに入る。処置または予期されない生命に
危険を及ぼす毒性に明らかに関連した死亡は、直ちに試験主任に報告し、次に、
その人は監視委員会に知らせなければならない。

【０３６１】 実施例８ アドリアマイシン（Ａ）およびイフォスファミド（Ｉ）を用いる高用量の化学
療法（ＣＴ）を受けている肉腫患者における、組換えヒトトロンボポエチン（ｒ
ｈＴＰＯ）による血小板減少症のスケジュール依存的減少 アドリアマイシンおよびイフォスファミド（ＡＩ）は、肉腫の処置の有効な措
置であるが；しかし、骨髄抑制が累積する。発明者は、以前に、ｒｈＴＰＯは、
高用量のカルボプラチン後に４用量を投与した場合に重度の血小板減少症の減少
に効果的であるが（Ｂｌｏｏｄ ９０（１０）：５８０ａ、１９９７）、ＡＩ後
に１、２、または７用量を投与した場合には均一に効果的ではない（Ｖａｄｈａ
ｎ−Ｒａｊら、１９９６）ことを示した。ＡＩの最下点が早く（〜１２日目）、
Ｓ相の血小板および前駆体に対するｒｈＴＰＯのピーク効果は遅いという知見に
より、ｒｈＴＰＯのより早い投与が有利であり得ることが示される。それ故、発
明者は、ｒｈＴＰＯのスケジュールを最適化する臨床試験を開始した。ＡＩの最
初のサイクルは、ｒｈＴＰＯを用いずに投与した。サイクル−２（Ｃ−２）では
、ｒｈＴＰＯは、３つのスケジュールで、ＡＩの前（投与前）および後（投与後
）（０〜３日）の両方に、静脈内瞬時大量投与として投与した：−１、４、６、
８日目（Ｓ−１）、−３、−１、４、６日目（Ｓ−ＩＩ）、および−５、−３、
−１、４日目（Ｓ−ＩＩＩ）。化学療法後データ（平均±ＳＥＭ）を示す：

【０３６２】

【表１６】

【０３６３】 Ｓ−ＩＩＩからの患者６人中僅か１人において、血小板最下点は、ＳＩおよび
Ｓ−ＩＩの両方の患者６人のうち５人に比べてサイクル−１よりもサイクル−２
において低かった。ＣＴおよび最後のｒｈＴＰＯ用量後のＢＭ前駆細胞アッセイ
により、４人中３人（Ｓ−ＩＩＩ）、２人中１人（Ｓ−ＩＩ）、および２人中０
人（Ｓ−Ｉ）の患者にコロニーの存在が示された。これらの試験により、化学療
法に関連したｒｈＴＰＯ投与のタイミングが重要であり、ｒｈＴＰＯでの前投与
が、より長期で（＞４日間）より早い最下点を引き起こす措置に有益であり得る
ことが示される。

【０３６４】 実施例９ カルボプラチンを受けている反復性または進行性婦人科悪性疾患に罹患した被
検者に皮下注射を介して投与した組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）の
第Ｉ相試験 本実施例は、トロンボポエチンを用いた前臨床動物試験の結果、および実施し
たヒトでの試験に合理的な設計を記載する。

【０３６５】 前臨床安全性試験の結果により、１および複数用量後に、組換えヒトトロンボ
ポエチン（ｒｈＴＰＯ）は、マウス、アカゲザル、およびチンパンジーでの巨核
球および／または循環血小板の数の期待された増加をもたらすことが示される。
マウスでの４週間の試験で、臨床および解剖病理における軽度から中程度の変化
が明らかであり；多くの場合、これらは、血小板数の観察された増加に関連して
いた。アカゲザルおよびチンパンジーでの反復皮下（ＳＣ）投与後、血小板に対
する効果とは別の、軽度な血液学的効果が観察されたが、生物学的に有意な効果
を示すとは考えられなかった。

【０３６６】 アカゲザルでは、ｒｈＴＰＯに対する血小板応答は、投与２週間後にピークに
達したが、連続的投与にも関わらず基線に向けて下降した。またアカゲザルにお
いて、処置の開始５〜８週間後に開始する、血小板数の減少が、１用量の静脈内
／皮下投与の５０００μｇ／ｋｇまたは複数の用量の静脈内／皮下投与の１００
０μｇ／ｋｇ後に観察された。この観察に一致して、巨核球形成不全が、５００
０μｇ／ｋｇの用量レベルでの１用量の静脈内または皮下処置の８週間後に数匹
の動物の骨髄に見られた。類似の組織病理学的所見、しかしより重度なものが、
静脈内または皮下投与ｒｈＴＰＯ（１０００μｇ／ｋｇ）による複数回の処置を
受けているアカゲザルで観察された。

【０３６７】 血小板数の投与後の減少が、２週間毎日ｒｈＴＰＯ（３または５０μｇ／ｋｇ
皮下投与）を投与したチンパンジーにも認められたが、その効果は、開始が幾分
遅れ、３μｇ／ｋｇの用量レベルでは一過性であった。血小板数の有意な増加が
また、８週間の処置を実施しない期間の後、１匹のチンパンジーで３μｇ／ｋｇ
の再投与後に観察され、これは、この動物のｒｈＴＰＯの薬理作用に対する応答
が、以前の曝露の結果、劇的に減少しなかったことを示す。

【０３６８】 血小板数の減少の原因は、ＴＰＯに対する正の抗体力価に関連するようであり
、これは、血小板値の低い全動物に認められた。１用量試験において、最も低い
投与後血小板値および巨核球形成不全を有するアカゲザルは、最も高い個々の力
価を示した。組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、イヌに抗Ｃ
ＳＦ抗体形成を引き起こすことができ、その結果、内因性イヌＧ−ＣＳＦの中和
が起こり、好中球減少に至ることが以前に報告されている（Ｈａｍｍｏｎｄら、
１９９１）。類似の機序が、アカゲザルおよびチンパンジー試験に観察された効
果を説明し得る。ＴＰＯ特異的ＩｇＥが、複数回の投与後にチンパンジーに存在
した。

【０３６９】 チンパンジーにおけるこれらの知見により、組換えヒトタンパク質に対する免
疫応答およびヒトとチンパンジーＴＰＯの間の相同性の評価における、この種の
推定値に基づいた、ヒトにおける抗体形成および／または投与後血小板数下降の
危険の可能性が示唆される（ＨｏｂｓｏｎおよびＦｕｌｌｅｒ、１９８７）。

【０３７０】 免疫原性および効力は、ＣＤ−１マウスで組換えネズミトロンボポエチン（ｒ
ｍＴＰＯ）を使用して試験でさらに評価した。正常ＣＤ−１マウスにおいて、１
４日投与群と比較して、有意に少ないマウスが、１回の皮下投与群において、Ｔ
ＰＯに対する抗体を発達した。類似レベルの抗ＴＰＯ抗体が、１４日間毎日また
は３日毎に皮下投与を受けている群で観察された。しかし、ｒｍＴＰＯを３日毎
に静脈内投与により受けた群では、僅か２匹のマウスが、抗ＴＰＯ抗体を３１日
目に発達させた。これらの結果により、ｒｍＴＰＯ投与の頻度の減少、または静
脈内投与の使用は、組換えＴＰＯの免疫原性を減少させ得ることが示される。別
々の効力試験において、１用量のｒｍＴＰＯが、マウスモデルにおいて放射線照
射およびカルボプラチンの組合せにより誘導された血小板減少症を減弱させた。
これらの結果により、免疫原性の非存在下での効力の治療窓が存在することが示
唆される。

【０３７１】 要約すると、ｒｈＴＰＯは、動物に静脈内投与した場合よりも、皮下投与した
場合において、僅かにより免疫原性が高いようである。皮下経路は、ヒトにおい
てより免疫原性が高いかは不明である。前臨床データは、動物における血小板効
果の可逆性の原因、期間、および／または程度に関して限定される。血小板数の
基線以下の減少は、化学療法処置を計画している患者の潜在的に重要な危険であ
ることは明らかである。それ故、血小板減少症に関する具体的な安全計画と緊密
なモニタリングがこの試験で実施される。

【０３７２】 前臨床薬物動態 ｒｈＴＰＯの静脈内および皮下投与薬物動態が、数個の動物種で研究されてい
る。アカゲザルでの静脈内試験からの血漿ＴＰＯプロフィルの薬物動態解析によ
り、血漿から他の組織への分布の限定が示された（律速分布容量６２〜６６ｍＬ
／ｋｇ）。低い血漿ＴＰＯクリアランス（３．３〜５．４ｍＬ／時間／ｋｇ）は
、比較的長い終末血漿ｒｈＴＰＯ半減期（１１〜１８時間）に反映される。マウ
スでの組織分布研究からのデータにより、血小板が、ＴＰＯの分布およびクリア
ランスに関与し得ることが示された。アカゲザルでの皮下注射後に、〜４３％の
用量が吸収され、血漿ＴＰＯレベルは〜６時間でピークに達した。皮下注射後の
ｒｈＴＰＯの終末半減期は、１３時間であった。薬物動態薬物相互作用は、皮下
投与ｒｈＴＰＯおよび皮下投与Ｇ−ＣＳＦを毎日１４日間アカゲザルに同時投与
した場合に観察されなかった。

【０３７３】 円錐経験：臨床試験 ｒｈＴＰＯは、いくつかのオープン・ラベル第Ｉ相試験での試験を受けた。第
一試験は、１９９５年１０月に開始した。静脈内投与ｒｈＴＰＯを、チオテパを
用いた中程度から高用量の化学療法を受けている被検者において；軟組織肉腫の
ためにドキソルビシンおよびイフォスファミドでの用量集中的な慣用的化学療法
を受けている被検者において；危険性の高い乳癌のための高用量化学療法の前に
、末梢前駆細胞動員を受けている被検者において；および、自己または同種移植
後に血小板回復の遅延を経験している被検者において評価する。

【０３７４】 ｒｈＴＰＯは、０．３〜２．４μｇ／ｋｇの用量を通じて十分に耐容性を示し
た。抗体形成が起こったが、中和抗ＴＰＯ抗体は臨床試験で観察されなかった。
抗ＴＰＯ抗体は、被検者３３人中僅か２人に観察され；これらは非中和性であり
、自発的に回復し、どの臨床的続発症にも関連していなかった。現在の静脈内投
与によるｒｈＴＰＯ投与は、高用量レベルで生物活性を示したが、末梢ＣＦＵ−
ＧＭおよびＢＦＵ−Ｅｓの早期動員以外には造血系統に対するどの効果にも関連
していなかった。血栓事象または構成性副作用の兆しは全くなく、用量限界毒性
（ＤＬＴ）の証拠もなかった。

【０３７５】 臨床薬物動態 血清ＴＰＯ濃度は、化学療法前のサイクルおよび再度化学療法サイクル中に、
肉腫または悪性新生物に罹患した被検者へのｒｈＴＰＯの静脈内大量瞬時注射後
に測定した（ｒｈＴＰＯは、チオテパまたはドキソルビシン／イフォスファミド
の後の日に投与した）。化学療法前のサイクル中に、初期最大ＴＰＯ濃度（Ｃ_{ｍ ａｘ} ）は、０．３および２．４μｇ／ｋｇ用量の後に、それぞれ〜５から５０ｎ
ｇ／ｍＬの範囲で、用量に比例する。これにより、ｒｈＴＰＯは、血漿容量に類
似した初期分布容量（６０ｍＬ／ｋｇ）に分布するようであることが示される。
ＴＰＯの見かけの終末消失半減期は〜２０から３０時間である。ＴＰＯ濃度−時
間プロフィル下の面積（ＡＵＣ）は、用量の増加と不相応に増加し、おそらくこ
れは、ＴＰＯクリアランスプロセスの用量関連飽和を反映し、これは主に受容体
媒介エンドサイトーシスにより血小板で起こると考えられる。化学療法後に、ｒ
ｈＴＰＯの初期分布は、化学療法前のサイクル中に観察されたものと類似するが
、見かけの終末半減期は、化学療法サイクル中に延長している。血清ＴＰＯのこ
のより遅い終末下降は、内因性血清中ＴＰＯの増加を反映し得、この増加は、血
小板減少症の間に観察された。

【０３７６】 カルボプラチン カルボプラチンは、広域の抗腫瘍活性を有し、卵巣癌、子宮頸癌、胚細胞腫瘍
、中皮腫、小細胞肺癌、膀胱癌、および頭頸部癌の処置に使用される。

【０３７７】 カルボプラチンは、１６００ｍｇ／ｍ^２の用量まで非造血毒性がないので、こ
の試験に適切な化学療法剤である。その主要な毒性は骨髄抑制、特に血小板減少
症である。Ｏｚｏｌｓら（Ｏｚｏｌｓら、１９８７）は、サイトカインの支持を
用いずに、高用量のカルボプラチン（８００ｍｇ／ｍ^２）で反復性卵巣癌の３０
人の患者を処置した。主な応答が患者の２７％に見られ；骨髄抑制が、観察され
た最も一般的な毒性であった。Ｇｏｒｅら（Ｇｏｒｅら、１９８７）は、１６０
０ｍｇ／ｍ^２までの用量を、肺癌および中皮腫患者に送達した。比較的少ない胃
腸、神経、および聴器毒性が観察されたが、かなり顕著な骨髄抑制が見られた。
高用量の場合、カルボプラチンは、用量限界血小板減少症に対するｒｈＴＰＯの
効果の評価において利用するために適切な化学療法剤である。

【０３７８】 主目的 この試験の主目的は、カルボプラチンを受けている反復性婦人科悪性疾患に罹
患した被検者に皮下注射を介して投与したｒｈＴＰＯの、安全性および耐容性を
決定し、薬物動態プロフィルを特徴づけ、そして、免疫原性を決定することであ
った。

【０３７９】 第二の目的 この試験の第二の目的は、化学療法後の血小板最下点の深さおよび期間に対す
る効果により測定される、薬物動態を評価すること、カルボプラチンを受けてい
る反復性婦人科悪性疾患に罹患した被検者に皮下注射を介して投与したｒｈＴＰ
Ｏの、最大耐容用量（ＭＴＤ）を決定すること、またはＭＴＤがない場合、その
最適生物学的用量（ＯＢＤ）を決定することであった。

【０３８０】 試験設計：概論 これは、反復性婦人科悪性疾患患者がその疾病の処置のためにカルボプラチン
を受ける、オープン・ラベルの用量漸増試験である。３０人までの被検者がｒｈ
ＴＰＯの皮下投与のこの第Ｉ相試験に含まれる。３人の被検者が、各６つの用量
レベルに割当てられ、最も低い用量レベルで開始する。一旦ＯＢＤが確立される
と、１２人の追加の被検者を処置する。６人の被検者が、ＭＴＤ以下またはＯＢ
Ｄでの１用量のｒｈＴＰＯと共にカルボプラチン化学療法を受ける。他の６人の
被検者は、ｒｈＴＰＯを用いずにカルボプラチンを受けるが、多くは、被検者が
血小板減少症（血小板＜３０，０００／μＬ）を経験する任意のサイクル後のそ
の後のサイクルでｒｈＴＰＯを受け得る。

【０３８１】 試験は、１４日間のスクリーニング期間、３つの２１日間のサイクル、および
２８日間の追跡期間に分ける。最初のサイクル（サイクル０）は、１日目、およ
び、用量レベル４、５および６のみに関与する被検者に４日目に投与したｒｈＴ
ＰＯを有する。第二サイクル（サイクル１）は、１日目のみに投与したカルボプ
ラチン化学療法を有する。第三サイクル（サイクル２）は、１日目に投与したカ
ルボプラチン、２日目に投与したｒｈＴＰＯ、および用量レベル４、５および６
に関与する被検者のみに５日目に投与したｒｈＴＰＯを有する。２８日間の追跡
期間は、サイクル２に続く。

【０３８２】 ＭＴＤまたはＯＢＤが決定されない場合、用量レベル漸増が全６つの用量レベ
ルを通じて進行する。ＭＴＤは、以下のいずれかが観察される用量レベルに先行
する用量レベルとして定義される：１用量レベル内で＞１／３または＞２／６の
被検者が、ｒｈＴＰＯに関連し、支持指標により軽減されない、等級＞３の非造
血活性を発達する；＞１の被検者が、ｒｈＴＰＯに関連し、支持指標により軽減
されない、等級４の非造血毒性を発達する；１用量レベル内で＞２／３または＞ ４／６の被検者が、等級＞３の非造血毒性（軽減に関わらず）を発達するか、ま
たは任意の被検者が中和抗ＴＰＯ抗体を発達する。

【０３８３】 ＯＢＤは、用量レベル間の比較により、先行用量レベルでの応答に比較して、
血小板応答の傾向がサイクル２中にプラトーになることが示される、用量レベル
として定義される。

【０３８４】 記載および原理 これは、６３日間の試験であり、その後に２８日間の追跡期間がある。カルボ
プラチン化学療法から利点が得られるようである適格な被検者に、ｒｈＴＰＯに
よる化学療法の追加サイクルを含む、試験期間と追跡期間の間の任意選択の延長
期間（ＯＥＰ）を与える。サイクル０での初回ｒｈＴＰＯ投与後、抗ＴＰＯ抗体
レベルのために血清サンプルを１週間毎に得る。

【０３８５】 全被検者が、最後の周期（その間ｒｈＴＰＯを受ける）の後の少なくとも２８
日間、副作用および安全性について評価され続ける。関連血小板減少症と中和抗
ＴＰＯ抗体形成を有する被検者を、血小板減少症が寛解するまで追跡する。

【０３８６】 現在までのｒｈＴＰＯの全ての臨床試験が静脈内投与を含む。この経路は、常
に実践的ではなく、化学療法を受けている患者において、静脈アクセスは常に容
易に確立されるわけではない。現在の試験は、皮下経路により投与されたｒｈＴ
ＰＯの安全性、耐容性、薬力学、薬物動態、およびあり得る免疫原性を評価する
。

【０３８７】 試験概略 ａ．スクリーニング期間 試験は、１４日間のスクリーニング期間が先にある。このスクリーニング期間
中、可能性ある被検者を、適格性について評価し、インフォームドコンセントを
得る。

【０３８８】 ｂ．試験期間（サイクル０〜２） サイクル０は、最初のｒｈＴＰＯ投与後の最初の２１日間からなる。用量レベ
ル１、２および３の被検者は、１日目に１回の皮下注射としてｒｈＴＰＯを受け
る。用量レベル４、５、および６の被検者は、１および４日目に皮下注射として
ｒｈＴＰＯを受ける。サイクル０の間、被検者は、化学療法を受けず；これによ
り、化学療法非存在下での薬力学およびあり得る抗ＴＰＯ抗体形成の観察が可能
となる。サイクル０の被検者３人中２人が、血小板応答＞１，０００，０００／
μＬを有する場合、サイクル０は、その後の被検者において、医学モニターと発
明者の間の議論後に削除し得る。

【０３８９】 試験の残りは、２つの２１日間の化学療法サイクルからなる。サイクル１では
、被検者は、化学療法に対する各被験者の基線血小板応答を確立するために、ｒ
ｈＴＰＯを含まないカルボプラチン化学療法を受ける。サイクル２では、全被検
者が、ｒｈＴＰＯ後にカルボプラチン化学療法を受ける。用量レベル１、２、お
よび３の被検者は、２日目に１回の皮下注射後にｒｈＴＰＯを受ける。用量レベ
ル４、５、および６の被検者は、２および５日目に皮下注射としてｒｈＴＰＯを
受ける。サイクル１および２は、それぞれサイクル０および１の開始後２１〜３
５日以内に始めなければならない。

【０３９０】 ｃ．任意延長期間（サイクル３６） 試験期間の完了後（サイクル０〜２）、重度の血小板減少症（すなわち＞７日
間、血小板数＜２０，０００／μＬ）を経験せず、中和抗ＴＰＯ抗体を発達して
いない、安定または応答疾病を有する被検者が、全部で最大６サイクルの間、サ
イクル２のスケジュールに従って、カルボプラチン化学療法およびｒｈＴＰＯの
２１日間のサイクルを受け続けるに適格である。全てのＯＥＰサイクルは、以前
のサイクルの開始後２１〜３５日以内に始めなければならない。

【０３９１】 ｄ．追跡期間 被検者は、ｒｈＴＰＯを用いたその最後のサイクル後、さらに２８日間追跡さ
れ、その間に、安全性、継続および新規副作用（血小板減少症を含む）、および
あり得る抗ＴＰＯ抗体形成について評価し続ける。これは追跡期間である。

【０３９２】 試験終点 以下の変数は、第一試験終点である：副作用の発症率および重度により測定さ
れる、皮下投与したｒｈＴＰＯの安全性および耐容性；試験フローシート毎に測
定したＴＰＯの連続血清レベル；ＴＰＯに対する抗体の形成の発現率。以下の変
数は第二試験終点である：連続的血小板数および化学療法投与後の血小板最下点
の深さおよび期間。

【０３９３】 安全性評価および追跡 全被検者を、試験の経過中に、副作用について緊密に追跡および観察する。被
検者を各来診時に副作用について評価する。全ての望ましくない医学的出来事お
よび臨床的に意義ある基線からの変化（実験室結果およびバイタルサインを含む
）を副作用と考える。

【０３９４】 発明者およびその設計者は、以下の基準から全ての副作用を評価する：重度；
ＮＣＩ一般的毒性等級；疾病との関係；およびｒｈＴＰＯとの関係。 副作用に関する上記の情報、並びに、開始、回復、ｒｈＴＰＯ投与に対する効
果および関連処置を、症例報告形式（ＣＲＦ）に記録する。全ての副作用は、追
跡期間の終了時に回復の状態を有する。任意の抗ＴＰＯ抗体関連血小板減少症を
回復まで追跡する。

【０３９５】 原因に関係なく全ての副作用をＣＲＦに記録する。副作用は、経験した最大強
度で報告する。報告された副作用の重度または頻度が増加する場合、新規事象と
考える。報告された副作用の重度または頻度が減少する場合、完全に回復するま
で継続していると考える。

【０３９６】 安全性計画 この試験でｒｈＴＰＯ投与に関する主要な安全性問題は、以下の通りである：
中和抗ＴＰＯ抗体の形成、アナフィラキシーを含むアレルギー反応、および、血
栓事象の危険性の増加を伴うあり得る血小板増多症。 ａ．抗体形成 この試験の全被検者は、抗ＴＰＯ抗体試験を１週間毎に受ける。抗ＴＰＯ抗体
レベルの３つの血清サンプルを、抗ＴＰＯ抗体形成の確実な基線の確立を補助す
るために得る。これらのサンプル（基線評価としての２つ、およびサイクル０の
１日目に１つの前投与量）を、互いに少なくとも１日離して得なければならない
。抗ＴＰＯ抗体形成が検出される場合、追加の試験を実施して、抗ＴＰＯ抗体が
中和性であるかを決定する。抗ＴＰＯ抗体が中和性である場合、被検者は、ｒｈ
ＴＰＯの追加注射を受けない。全被検者が、試験中に頻繁に血小板数を測定する
。血小板減少症に罹患した被検者は、中和抗ＴＰＯ抗体が存在するかどうかに関
わらず、血小板輸血で支持される。抗ＴＰＯ抗体が非中和性である場合、その被
検者は、試験を続け、プロトコルに従って追加のｒｈＴＰＯを受ける。

【０３９７】 ｂ．アレルギー反応 動物試験におけるＩｇＥを含む、抗ＴＰＯ抗体の形成により、あり得るアレル
ギー反応の危険性が示唆される。どの動物試験または進行中のヒト試験でもアナ
フィラキシー反応は報告されていないが、再投与の経験は限定される。この試験
に関与する全被検者は、適宜アナフィラキシーに注意して、緊密にモニタリング
される病院環境でｒｈＴＰＯを受ける。

【０３９８】 ｃ．血小板増多症 ｒｈＴＰＯの投与は、血小板数の増加をもたらすと期待される。劇的に増加し
た血小板数（血小板増多症）は、血栓の危険性を高め得る。血栓事象の既知の病
歴を有する被検者は、この試験から除外される。追加のｒｈＴＰＯ投与は、医学
モニターと発明者の間の議論後に、血小板数＞１，０００，０００／μＬの任意
の被検者において中止し得る。被検者が血小板増多症を経験する場合、医学モニ
ターおよび発明者は処置選択肢を議論し、これは血小板アフェレーシスおよび／
またはアスピリン療法を含み得る。

【０３９９】 ｄ．用量限界毒性 ＤＬＴは、以下のいずれかとして定義される：中和抗ＴＰＯ抗体形成；アナフ
ィラキシー；臨床的に意義ある血栓事象；ｒｈＴＰＯに関連して決定され、支持
指標により軽減されない、等級＞３の任意の非造血毒性（ＮＣｌ共通毒性基準を
使用）；または、ｒｈＴＰＯに関連すると決定され、支持指標により軽減される
等級＞３のＮＣｌ非造血毒性は、あり得る健康害を示すか、または許容不可能な
毒性であるのでなければ、必ずしも用量限界ではない。

【０４００】 ｅ．用量レベル増大 ＤＬＴの非存在下で、増大は全ての用量レベルを通じて進行する。用量レベル
１が関与した後、各用量レベルの少なくとも被検者３人中２人が、次の用量レベ
ルが割当てられる前に、ｒｈＴＰＯ投与に安全耐容性を示さなければならない。
安全耐容性は、初回ｒｈＴＰＯ投与（１日目、サイクル０）後２１日以内のＤＬ
Ｔの非存在として定義される。

【０４０１】 最初の３回の用量レベルは、１用量措置である。複数用量の措置（用量レベル
４ ６）は、全ての１投与措置が安全に耐容性を示すまで、含まれない。１用量
レベルのいずれかがＤＬＴの結果取り除かれる場合、１またはそれ以上の複数用
量レベルを割当て得る。複数用量措置の累積用量は、議論および同意前には、１
用量措置でＭＴＤを超えないことがある。

【０４０２】 用量および期間 この試験の全ての用量レベルが、有効であると期待される。被検者は、各サイ
クルの（その間にｒｈＴＰＯ投与をスケジュールされる）１回のｒｈＴＰＯの皮
下注射を受ける。血小板数応答は、７〜１０日間以内に起こると期待される。被
検者は、最大６サイクルのｒｈＴＰＯが可能である。

【０４０３】 法律および規則の遵守 この試験は、現在の米国食品医薬品局（ＦＤＡ）優良臨床試験基準（ＧＣＰ）
、ヘルシンキの宣言、および地方倫理および法律要件に従って実施する。

【０４０４】 物質および方法 被検者：被検者選択 この試験の可能性ある被検者は、任意の反復性婦人悪性疾患と診断され、カル
ボプラチンが指示される、患者である。被検者は、３つまでの以前の療法を受け
得る。これらの３つの措置に加えて、被検者は、＜２５％の骨髄産生領域が処置
されている場合、前放射線療法を受け得る。測定可能な疾病が強く推奨されるが
、試験適格性には必要でない。被検者は、化学療法の開始のために少なくとも２
１日間待つことができなければならず、＞１２週間の寿命を有さなければならな
い。

【０４０５】 包含基準 全ての可能性ある被検者は、この試験に適格であるためには、以下の基準を満
たさなければならない：サインしたインフォームドコンセントを提供することこ
とができる；組織学的または細胞学的に確認された婦人科悪性疾患を有する；１
８〜６５歳の年齢である；出産可能な被検者は、サイクル０、１日目の前の７日
間以内の血清妊娠試験が陰性でなければならず、出産可能な全ての被検者は、試
験者の意見では、効果的な避妊の手段を使用していなければならない；カルノフ
スキー動作状態＞８０％；適切な骨髄機能；すなわちＷＢＣ数＞３０００／μＬ
および血小板数＞１５０，０００／μＬおよび＜４５０，０００／μＬ、適切な
肝機能、すなわち全ビリルビン＜１．５ｍｇ％およびＳＧＯＴまたはＳＧＰＴ＜ 正常の３倍；適切な腎機能、すなわち血清クレアチニン＜１．５ｍｇ／ｄＬまた
は計算クレアチニンクリアランス＞６０ｍＬ／分；および寿命＞１２週間。

【０４０６】 排除基準 可能性ある被検者を、以下の基準のいずれかを満たす場合にこの試験から排除
する：白血病の病歴または診断；迅速な進行性の疾病；非制御の臨床的に意義あ
る律動異常；妊娠または授乳中の女性である；特発性血小板減少性紫斑病、血栓
性血小板減少性紫斑病、出血体質、または任意の出血の危険性増加を含む任意の
血小板疾患の病歴を有する；顕著な血栓事象の病歴を有する（肺静脈塞栓症およ
び深静脈血栓性静脈炎を含む）；サイクル０、１日目の前の６ヶ月以内に、心筋
梗塞、虚血、一過性虚血発作、または脳血管発作の病歴を有する；中枢神経系（
ＣＮＳ）転移の病歴を有する；以前に３回以上の化学療法措置を受けたことがあ
る；サイクル０、１日目の前の６週間以内に、任意のニトロソ尿素（ＢＣＮＵ、
ＣＣＮＵ）化学療法またはマイトマイシン−Ｃを使用していた；サイクル０、１
日目の前の２週間以内に、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ
ＳＦ）またはＧ−ＣＳＦを使用していた；エリスロポエチン（エポゲン^ＴＭ、プ
ロクリット^ＴＭ）をサイクル０、１日目の前の４週間以内に使用していた；サイ
クル０、１日目の前の４週間以内に任意の実験薬物を使用していた；サイクル０
、１日目の前の４週間以内に任意の細胞毒性化学療法または免疫療法を使用して
いた；サイクル０、１日目の前の２週間以内に任意の放射線療法を、または以前
に任意の骨盤放射線照射を使用していた；サイクル０、１日目の前の２週間以内
に、線配置を除き、任意の手術手段を使用していた；調査薬物の摂取が禁忌であ
るか、またはこの試験の結果の解釈に影響を及ぼし得る、疾病または容態の妥当
な疑いを与える任意の他の有意な病歴または身体的所見を有する。

【０４０７】 処置割当の方法 ３人の被検者を、表１７に同定した６つの各用量レベルに割当てる。用量レベ
ル割当は、用量レベルの上昇順であり、用量レベル１から始める。少なくとも被
検者３人中２人が、その後の用量レベルが割当てられ得る前に、ｒｈＴＰＯ投与
に安全耐容性を示さなければならない。計１８人の被検者が、用量増大期に関与
する。一旦ＯＢＤが確立されると、１２人の追加の被検者を処置する。６人の被
検者が、ＭＴＤ以下またはＯＢＤでの１用量のｒｈＴＰＯと共にカルボプラチン
化学療法を受ける。他の６人の被検者は、ｒｈＴＰＯを含まないカルボプラチン
を受けるが、被検者が血小板減少症（血小板＜３０，０００／μＬ）を経験する
任意のサイクル後のその後のサイクルでｒｈＴＰＯを受け得る。各用量レベルで
２人以下の被検者がサイクル２の２２日目の評価を完了した場合、被検者を再配
置する。これはｒｈＴＰＯのオープンラベル試験であるので、盲検はない。

【０４０８】 試験処置 被検者は、ｒｈＴＰＯと共に、その疾病の処置のために、カルボプラチン化学
療法を受ける。

【０４０９】 ｒｈＴＰＯ ｒｈＴＰＯは、３ｍＬガラスバイアル中の非経口投与に準備の整った無菌液体
として、ジェネンテック社により提供される。各バイアルは、等張緩衝溶液（ｐ
Ｈ７．４）中２ｍＬの０．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＴＰＯを送達する。保存剤非含有
正常食塩水が、ｒｈＴＰＯの唯一の適合性の希釈剤および洗い流し溶液である。
製剤は保存剤を含まず、１用量投与のみに適している。

【０４１０】 ａ．用量、投与および保存 被検者を、表１７に示した用量レベルに割当てる。

【０４１１】

【表１７】

【０４１２】 用量レベル１、２、および３の被検者は、サイクル０の１日目におよびサイク
ル２の２日目に、１回の皮下注射として、割当てられた用量のｒｈＴＰＯを受け
る。用量レベル４、５、および６の被検者は、サイクル０の１および４日目およ
びサイクル２の２および５日目に１回の皮下注射としてｒｈＴＰＯを受ける。被
検者がＯＥＰに参加する場合、サイクル２のようにｒｈＴＰＯを受ける。追跡期
間中にはｒｈＴＰＯは投与されない。全てのｒｈＴＰＯ注射を調製し、アナフィ
ラキシーに注意して投与する。ｒｈＴＰＯは船で送られ、２℃〜８℃（３５°Ｆ
〜４６°Ｆ）の冷蔵下で保存しなければならない。ｒｈＴＰＯを希釈して、正確
な投与を容易にし得る。

【０４１３】 ｂ．投与変更 この試験ではｒｈＴＰＯの用量変更はない。正確な用量は、スクリーニング中
に被検者の実際の体重に基づいて計算する。

【０４１４】 カルボプラチン化学療法 カルボプラチンは、市販の業者から得る。 ａ．用量、投与および保存 被検者は、各化学療法サイクルの１日目に１時間かけてカルボプラチン（静脈
内投与）を受ける。実際の用量は、カルベルト式：全用量＝標的ＡＵＣ×（ＧＦ
Ｒ＋２５）を使用して、ＡＵＣ＝１１として計算する。被検者の最初のコホート
がカルボプラチン処置に十分に耐容性を示す場合（すなわち血小板最下点＞１０
０，０００／μＬ）、カルボプラチンの用量レベルは増加し得る（例えばＡＵＣ
＝１３）。カルボプラチン化学療法は、試験施設慣行および製造業者のガイドラ
インに従って投与し、製造業者のガイドラインに従って保存しなければならない
。

【０４１５】 ｂ．用量変更 造血毒性に起因する化学療法の用量減少はない。被検者が造血毒性を経験する
場合、Ｇ−ＣＳＦは、その後の化学療法サイクルのあり得る好中球減少を消失す
るのを補助するために臨床的に指示されるように投与され得る。被検者が、サイ
クル２またはそれ以上で、重度の血小板減少症（すなわち、＞７日間、血小板最
下点＜２０，０００／μＬ）を経験する場合、被検者は試験から除き、２８日間
の追跡期間に置く。

【０４１６】 併用療法 併用医薬は、試験期間の２８日前から追跡期間の最後の日の間に被検者により
使用された、薬局での任意の処方医薬、または医学療法である。経口避妊薬、ホ
ルモン置換療法、または他の維持療法を使用している被検者は、試験を通して一
貫してその使用を続けることを要請される。全ての併用医薬の使用および療法は
、調査者に報告され、ＣＲＦに記録されるべきである。

【０４１７】 許可医薬 被検者は、排除療法に記載のものを除く、臨床的に指示されるＦＤＡ認可医薬
を投与され得る。本実施例で記載した試験で回避すべき（なぜならそれらが血小
板の機能を含む、血液凝固の機能を妨害し得るからである）薬物のリストは、ア
キュプリン^ＴＭ、アルカセルツァー^ＴＭ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｆｏｕｎｄａｔ
ｉｏｎ^ＴＭ安全コーティングアスピリン錠剤、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｓｔｒｅｎ
ｇｔｈ ＢＣ^ＴＭ散剤、アサコール^ＴＭ遅延放出錠剤、アスピリン（アセチルサ
リチル酸）、アスクリプチン^ＴＭ、アキソタール^ＴＭ、アゾドン^ＴＭ、バイエル ^ＴＭ アスピリン、ＢＣ^ＴＭ散剤、ＢＣ^ＴＭ冷散剤、バファリン^ＴＭ、カリソプロ
ドール^ＴＭおよびアスピリン錠剤、ダマソン−Ｐ、ダーボンコンパウンド６５^{Ｔ Ｍ} 、ジフルニサル^ＴＭ、ドロビッド^ＴＭ、エコトリン^ＴＭ腸溶錠、エンピリン^{Ｔ Ｍ} 、エクワジェシック錠剤、エキセドリン^ＴＭ、フィオリナール^ＴＭカプセル剤
、錠剤、およびコデイン含有錠剤、ゲルピリン^ＴＭ、ハーフプリン^ＴＭ、ロルタ
ブＡＳＡ^ＴＭ錠剤、メサラミン、メトカルバモール^ＴＭおよびアスピリン錠剤、
モノ−ジェシック^ＴＭ錠剤、ノルジェシック^ＴＭ錠剤およびノルジェシックフォ
ルテ^ＴＭ錠剤、パナサール５／５００^ＴＭ、ＰＣ−ＣＡＰ^ＴＭプロポキシフェン
ヒドロクロリド化合物、ＵＳＰ、ペンタサ^ＴＭ、ペルコダン^ＴＭ、ロバキシサー
ル^ＴＭ、ロワサ^ＴＭ腸坐剤または浣腸、ロキシプリン^ＴＭ、サフレックス^ＴＭ錠
剤、サリチルサリチル酸（経口）、サルサラート、サルサタブ^ＴＭ錠剤、ソーマ ^ＴＭ 化合物、およびコデイン含有、スルファサラジン、シナルロゴス−ＤＣ^ＴＭ カプセル剤、タルウィン^ＴＭ化合物、トリリサート^ＴＭ液剤または錠剤、を含む
サリチレート；アドビル^ＴＭ、Ｃｏ−アドビル^ＴＭクランプ−エンド^ＴＭ錠剤、
ジメタップ^ＴＭサイナスカプセル剤、ハルトラン^ＴＭ、イブプロフェン、イブプ
ローム^ＴＭ、ＩＢＵ^ＴＭ錠剤、モトリン^ＴＭ、ヌプリン^ＴＭ、サイン−エイド^{Ｔ Ｍ} ＩＢ、イブプロフェン含有ヴィックスデイ−クイル^ＴＭ、を含むイブプロフェ
ン；アリーブ^ＴＭを含む、ナプロキセンナトリウム；オルディス^ＴＭを含むケト
プロフェン；アナプロックス^ＴＭ、アナプロックス^ＴＭＤＳ、アナサイド^ＴＭ、
カタフラム^ＴＭ、クリノリル^ＴＭ、ダイプロ^ＴＭ、ジクロフェナク、エトドラッ
ク、フェルデン^ＴＭ、フェノプロフェン、フルビプロフェン、インドシン^ＴＭ、
インドメタシン、ケトロラック、ロジン^ＴＭ、メフェナム酸、ナブメトン、ナル
フォン^ＴＭ錠剤およびナルフォン２００^ＴＭｐｕｖｕｌｅｓ、ナプロシン^ＴＭ懸
濁液および錠剤、オルバイル^ＴＭカプセル剤、ピロキシカム、ポンステル^ＴＭ、
レラフェン^ＴＭ錠剤、スリンダク、トレクチン^ＴＭ、トルメチン、トラドール^{Ｔ Ｍ} 、ボルタレン^ＴＭを含む、他の非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；クマジ
ン、ジピリダモール、エノキサパリン、ヘパリン（抗凝固療法）、レベノックス ^ＴＭ 、ペルサンチン^ＴＭ、チクリッド^ＴＭおよびチクロピジンを含む他の薬剤を
含む。

【０４１８】 血小板輸血 予防血小板輸血は、血小板数＜２０，０００／μＬで、出血のために臨床的に
指示または出血の危険性が知覚される、全被検者に投与し得る。血小板輸血は、
朝の血小板計測および可能であれば薬力学サンプリングの後に投与すべきである
。

【０４１９】 排除療法 アスピリンは、血小板増多症の処置に使用しない場合、試験中は許容されない
。非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）およびアスピリン含有製品は、この試験
中は避けなければならない。疼痛管理は、抗血小板効果を有さないことが知られ
る薬剤を含む。ｒｈＴＰＯおよびＧ−ＣＳＦ以外の造血剤も、試験期間中は排除
される。全実験（その適応症についてＦＤＡ非認可）薬物の使用が、試験中は避
けなければならない。放射線療法は、認可がなければ試験中には許可されないだ
ろう。

【０４２０】 試験評価 被検者は、最初のｒｈＴＰＯ投与の前の１４日間のスクリーニング期間中に、
適格性について評価する。被検者を、試験期間、ＯＥＰ（適用可能であれば）、
および追跡期間中に、緊密にモニタリングする。被検者を、各来診時に副作用に
ついて評価する。試験来診の実際の日にちは、被検者の便宜に応じて±２日変動
し得る。表１８は、スクリーニングおよび試験評価のフローシートを含む。薬力
学サンプリング時間点を表１９に示し、ＯＥＰおよび追跡期間評価を表２０に示
す。

【０４２１】

【表１８】

【０４２２】

【表１９】

【０４２３】

【表２０】

【０４２４】 スクリーニングおよび前処置評価 全スクリーニング評価は、特記しない限り、サイクル０の１日目の初回ｒｈＴ
ＰＯ投与前に１４日間以内に完了しなければならない。前処置（基線）評価は、
サイクル０の１日目のｒｈＴＰＯ投与前に得られる。

【０４２５】 ａ．スクリーニング評価 以下のスクリーニング評価を実施する：インフォームドコンセントにサイン；
個体群統計学および併用医薬使用を含む、過去／現在の病歴；身体的検査；心電
図（サイクル０の１日目の２８日以内）；胸部Ｘ線（サイクル０の１日目の２８
日以内）；各種ＣＢＣ、および血小板数；血清化学；および血清妊娠試験（適用
可能である場合）。

【０４２６】 ｂ．前処置評価（基線） 以下の評価を実施して、基線値を確立する：バイタルサイン、各種ＣＢＣ、お
よび血小板数；検尿；抗ＴＰＯ抗体レベル（３つのサンプル、その少なくとも２
つは＞２４時間離れており、１つのサンプルは初回ｒｈＴＰＯ投与の５分前）；
および骨髄生検および穿刺。

【０４２７】 処置中の評価 ａ．サイクル０ サイクル０で、以下の評価を実施する：バイタルサイン（ｒｈＴＰＯ投与の前
および１時間後）；各種ＣＢＣ、および血小板数（１〜５日目は毎日、その後、
１週間に少なくとも３回）；血清化学（２２日目）；検尿（２２日目）；抗ＴＰ
Ｏ抗体レベル（８；１５、および２２日目）；骨髄生検および穿刺（８日目；追
加の骨髄検査を実施して、前駆細胞動力学を評価し得る）；および血清ＴＰＯレ
ベル（選択した被検者において）。

【０４２８】 評価は、１日目のｒｈＴＰＯ投与の前および０．５、１、２、４、６、８、１
０、２４、４８、７２、９６、および１２０時間後に用量レベル１、２および３
で実施する（表１９参照）。評価は、１日目のｒｈＴＰＯ投与前に用量レベル４
、５、および６で；４日目のｒｈＴＰＯ投与前および０．５、１、２、４、６、
８、１０、２４、４８、９６、および１２０時間後に実施する（表１９参照）。
副作用、医薬変更、および血液製剤使用を記録する。

【０４２９】 ｂ．サイクル１および２ サイクル０で、以下の評価を実施する：バイタルサイン（ｒｈＴＰＯ投与の前
および１時間後）；各種ＣＢＣ、および血小板数（１週間に少なくとも３回；血
小板数が＜５０，０００／μＬの場合には毎日計数）；血清化学（２２日目）；
抗ＴＰＯ抗体レベル（１、８、１５、２２日目）；および血清ＴＰＯレベル（選
択した被検者において）。

【０４３０】 評価は、用量レベル１、２、および３で：２日目のｒｈＴＰＯ投与の前および
０．５、１、２、４、６、８、１０、２４、４８、７２、９６および１２０時間
後に実施する（サイクル２のみ；表１９参照）。評価は、用量レベル４、５およ
び６で：２日目のｒｈＴＰＯ投与の前；５日目のｒｈＴＰＯ投与の前および０．
５、１、２、４、６、８、１０、２４、７２、９６、および１２０時間後に実施
する（表１９参照）。

【０４３１】 腫瘍状態を評価するＸ線撮影試験（サイクル１の１日目の４週間以内）、副作
用記録、医薬変更、および血液製剤使用を記録する。

【０４３２】 ｃ．任意延長期間（サイクル３〜６） 評価は、バイタルサイン（前サイクルおよびｒｈＴＰＯ投与の前および１時間
後）；各種ＣＢＣ、および血小板数（１週間に少なくとも３回；血小板数が＜５
０，０００／μＬの場合毎日計測）；血清化学（２２日目）；抗ＴＰＯ抗体レベ
ル（１、８、１５、および２２日目）；副作用、医薬変更、および血液製剤使用
について実施する。

【０４３３】 追跡評価 被検者を、ｒｈＴＰＯを用いてその最後のサイクルを超えて少なくとも２８日
間追跡する。被検者はまた、臨床的に指示されるように診察する。抗ＴＰＯ抗体
関連血小板減少症に罹患した被検者を回復まで追跡する。追跡評価は、以下を含
む：バイタルサイン；症候特異的身体的検査；各種ＣＢＣ、および血小板数；血
清化学；抗ＴＰＯ抗体レベル；副作用記録、医薬変更および血液製剤使用。

【０４３４】 被検者中止 被検者は、試験中のいずれの時点でも試験参加を自由に中止できる。被検者が
試験を中止したいと願えば、早期終了評価のために病院に戻ることを薦められる
べきである。早期終了来診は、そのサイクルの１日目または追跡期間２８日目に
スケジュールされた全評価を含む。早期終了来診は、実際に計画された来診日に
できるだけ近くにスケジュールすべきである。

【０４３５】 被検者は、ＤＬＴ、中和抗ＴＰＯ抗体形成、またはサイクル２の終了時での疾
病進行の場合にはｒｈＴＰＯ投与を中止する。被検者がｒｈＴＰＯ投与を中止す
る場合、そのサイクルの全ての規則的にスケジュールされた評価を完了し、追跡
期間を完了することが推奨されるべきである。

【０４３６】 試験中止 試験を終結する理由は、以下を含み得る：これまたは他の試験での副作用の発
症または重度は、被検者への潜在的な健康の害を示す；被検者関与が不満足であ
る；データ記録が不正確または不完全である。

【０４３７】 統計学的方法 試験の実施の解析 被検者関与は、用量レベルにより要約される。被検者素質は用量レベルおよび
化学療法サイクルにより作表し；ｒｈＴＰＯまたは試験中止の理由を列挙する。
化学療法およびｒｈＴＰＯ投与も、用量レベルおよびサイクルにより要約する。
投与の遅延の頻度および期間を要約する。プロトコル変動および偏差のｌｏｇを
維持し、用量レベルにより要約する。最後に、被検者の個体群統計的および疾病
関連特徴を、用量レベルにより要約し、被検者の比較を評価する。

【０４３８】 活性解析 試験サンプルのサイズおよび焦点が与えられているので、活性の統計学的解析
は主に記述的なものである。血小板数は、主な目的の薬物動態終点である。血小
板、ＷＢＣ、および好中球の時間プロフィルを、化学療法サイクルにおよび各被
験者について調製する。基線からの絶対および相対最大血小板変化を、用量レベ
ルに対してグラフに要約し、用量応答を評価する。

【０４３９】 薬力学解析 血清ＴＰＯ濃度−時間プロフィルは、サイクル０および２で各被験者について
グラフで提示する。最大の測定血清濃度（Ｃ_ｍａｘ）および最大ＴＰＯ濃度の時
間（Ｔ_ｍａｘ）は、各プロフィルについて記録する。各プロフィルは、標準的な
薬力学解析法により評価する。計算する薬力学パラメータは、血清ＴＰＯ濃度−
時間プロフィル下面積（ＡＵＣ）、平均残留時間（ＭＲＴ_ＳＣ）、および血清Ｔ
ＰＯ濃度下降の半減期を含む。

【０４４０】 薬力学パラメータは、用量比例性の調査のために６つの用量レベルで比較する
。選択した薬力学パラメータおよび応答測定間の関係を調べる。

【０４４１】 安全性解析 個体群統計、身体的検査、臨床実験室、および副作用データを作表し、適宜、
用量レベルおよび化学療法サイクルにより要約する。重度の副作用およびＮＣｌ
共通毒性基準に従って等級＞３と分類された毒性の発症には特別な注意を払う。
正常範囲を逸脱した臨床実験値を同定する。１またはそれ以上の用量のｒｈＴＰ
Ｏを受けている任意の被検者を、安全性について評価できると考える。

【０４４２】 ＴＰＯに対する抗体の発生を作表し、抗体力価を、用量レベルおよび前のｒｈ
ＴＰＯ用量の数により要約する。抗体力価とその後の血小板数の間の関係を調査
する。

【０４４３】 例示的サイズの決定 各用量レベルでの被検者の数を、潜在的な被検者の危険性、および、安全性、
薬力学、および活性の予備評価を提供するのに必要な情報を平衡化するように選
択した。試験は、ＭＴＤが到達したかまたはＯＢＤが定義されたので、増大が完
了または停止するまで、各用量レベルで３人の被検者を包含する。特異的な副作
用の発症、ＤＬＴ、またはＴＰＯに対する抗体の形成などの事象について、この
サンプルサイズは、真の事象確率が＞４１％である場合に、１つ以上の事象を検
出するために、各用量レベルで少なくとも８０％の力を保証する。

【０４４４】 実施例１０ 組換え体ヒトトロンボポエチンはカルボプラチン誘導重症血小板減少症および
婦人科学的悪性腫瘍の患者での血小板輸血に対する必要性を弱める 血小板減少症は、出血合併症に対するリスクおよび血小板輸血の必要性を増加
させ、化学療法の用量効力に障害を生じさせる可能性のある、癌患者の治療にお
ける重要な臨床的問題である。広い用量範囲上での他のあきらかな非血液学的毒
性が欠如しているのでカルボプラチンは多重サイクルに対するカルボプラチンの
用量を障害を生じさせることなしに、累積血小板減少症を弱めるための血小板新
生性薬剤の潜在性を試験するための好適な薬剤となる。組換え体ヒトトロンボポ
エチン（ｒｈＴＰＯ）の、臨床的安全性および化学療法誘導重症血小板減少症を
改善する能力を査定するために、本発明者は、化学療法誘導重症血小板減少症に
対して高リスクである発達または再発婦人科学的悪性腫瘍の患者で、ｒｈＴＰＯ
の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験を開始した。本試験の目的は、化学療法の前にｒｈＴＰ
Ｏのみの臨床的な耐性および造血性効果を査定し、化学治療に関連した重症血小
板減少症を改善し、したがって化学療法に続く血小板輸血の必要性を減少させ、
患者に全用量での化学療法の多重サイクルを受けさせることを可能にすることに
おけるｒｈＴＰＯの臨床的安全性および活性を評価することである。ｒｈＴＰＯ
の使用は、二次予防として使用した場合に血小板輸血の必要性を特に減少させた
。

【０４４５】 方法 本発明者は、発達婦人化学的悪性腫瘍の２９人の患者においてカルボプラチン
の前およびそれに引き続いてｒｈＴＰＯの第Ｉ／ＩＩ相研究を実施した。用量段
階的拡大相の間、ｒｈＴＰＯを、カルボプラスチンの前に単一用量（０．６、１
．２、２．４および３．６ｍｃｇ／ｋｇ）として、およびカルボプラチンの第二
サイクルに続いて４用量、皮下注射にて投与した。用量拡大相（ｎ＝１２）の間
、ｒｈＴＰＯは、重症血小板減少症に対する二次予防として最適生物学的用量の
みで使用した。

【０４４６】 患者 カルボプラチンで処置することが指示された任意の再発または発達婦人化学的
悪性腫瘍を患う患者が本試験に対する適格者であった。患者には適合カルノフス
キー能力状況（＞８０％）、骨髄（ＷＢＣ数＞３×１０^３／ｍｍ^３、血小板数＞ １５０×１０^３／ｍｍ^３および＜４５０×１０^３／ｍｍ^３）、腎臓（血漿クレア
チニン１．５ｍｇ／ｄＬまたは計算クレアチニンクリアランス＞６０ｍＬ／分）
および肝臓（総ビリルビン＜１．５ｍｇ％およびＳＧＯＴまたはＳＧＰＴ 正常
値＜３倍）機能、および＞３ヶ月の平均余命が要求された。急速発達疾患、前白
金基礎治療への応答の欠如、骨盤照射または幹細胞移植を伴う高用量化学療法の
経歴、２週間以内の手術、４週間以内での化学療法または放射療法の使用、試験
開始の６週間以内でのニトロソウレアまたはマイトマイシン−Ｃ、＞３の異なる
型の前化学療法、血栓塞栓性または出血疾患の病歴、または明らかな心疾患をも
つ患者は本試験より除外した。書面によるインフォームドコンセントを、規定ガ
イダンスにしたがって研究開始の前にすべての患者より得た。

【０４４７】 試験設計 本試験設計の概要を図１に示す。本研究は、２つの要素、最適用量を使用した
用量段階的拡大（安全性）要素および用量拡大（活性）要素を含んだ。本試験の
用量段階的拡大部分の間、ｒｈＴＰＯは、ｒｈＴＰＯのみの臨床的耐性および造
血効果を評価するために化学療法前３週間、皮下注射にて単一用量として投与し
た。続いて患者に、カルバートの式［総用量＝標的ＡＵＣ×（糸球体濾過速度［
ＧＦＲ］＋２５）］を用いて１１の曲線下面積（ＡＵＣ）を提供するように計算
した用量で１時間にわたって静脈内でカルボプラチンを与えた。サイクル−１か
らの回収に際し、患者にはカルボプラチン（ＡＵＣ＝１１）を投与し、続いて同
一用量にてｒｈＴＰＯを４用量でそれぞれ他の日に投与した（２、４、６および
８日）。したがってサイクル−１（化学療法のみ）は、サイクル−２（ｒｈＴＰ
Ｏをともなう化学療法）に関するそれぞれの患者に対する内部標準として役立っ
た。

【０４４８】 少なくとも３人の患者は、それぞれのｒｈＴＰＯの用量レベル（０．６、１．
２、２．４および３．６ｍｃｇ／ｍ^２／ｄ）ではじめた。最適生物学的用量（Ｏ
ＢＤ）を、用量レベル間の比較が血小板応答での傾向が次の用量レベルと比較し
てサイクル−２の間で安定状態に達したことを示したような最低活性用量レベル
として定義した。いったんＯＢＤを見積もったならば、ｒｈＴＰＯの化学療法前
サイクルを削除し、１２人の患者を、重症血小板減少症（最下点血小板数 ＜３
０×１０^３／ｍｍ^３）が観察されるまで、カルボプラチンのみからなる化学療法
サイクルで処置した。続くサイクルにて、ｒｈＴＰＯを、同様のスケジュール［
２、４、６、８日（ｎ＝６）］にて、または改変スケジュール［−１、１、３、
５日（ｎ＝６）］にて二次予防としてＯＢＤにて使用した。後者のスケジュール
は、ＴＰＯのより早期の投与がさらに防御の度合いを増加させることができるか
どうかを査定するために使用した。このスケジュールの原理的説明は、霊長類で
の最近の前臨床試験および化学療法前のｒｈＴＰＯの投与が血小板回復を増強す
る可能性があることを示した肉腫での本発明者の前臨床実験に基づいた。

【０４４９】 化学療法の２つのサイクルが完了した後、サイクル−２において重度の血小板
減少症（すなわち＞７日間で、日血小板数 ＜２０，０００／ｍｍ^３）を経験し
なかった、および抗−ＴＰＯ抗体の中和が発展しなかった安定なまたは応答して
いる疾患を患っているすべての患者が、ｒｈＴＰＯと共に同用量のカルボプラチ
ンの追加サイクル（最大６サイクル）を受けるのに適応した。重症血小板減少症
（すなわち血小板数 ＜２０，０００／ｍｍ^３）に対して血小板輸血、貧血（す
なわちヘモグロビン ［Ｈｂ］＜８ ｇｍ／ｄＬ）に対してＲＢＣ輸血、好中球
減少熱（すなわち体温＞３８．３℃、絶対的好中球数 ＜５００／ｍｍ^３）また
は臨床的に指示された場合に対して抗生物質を患者に与えた。Ｇ−ＣＳＦの使用
は化学療法の最初の２サイクルの間は許可せず、臨床的に指示された場合（すな
わち、好中球減少症の延長または好中球回復の遅延を経験した患者での二次予防
として）のみその後のサイクル（３−６）で許可した。

【０４５０】 臨床的および実験室モニタリング 臨床試験の過程の前および間に、患者を、完全履歴、身体実験、完全血液細胞
数、血清化学、尿検査、胸部Ｘ線および心電図を含む研究室試験でモニタした。
血液計数は、予想される最下点期間に到達するまで１週間ごとに３回、次いで数
が回復するまで１日ごとに行った。血清サンプルを、研究の前に３回および研究
に際して週毎に全長ＴＰＯに対する抗体反応性について試験した。陽性血清（光
学密度比 ＞１．５）をさらに、抗短略化ＴＰＯ抗体アッセイ、Ｃ−ｍｐｌブロ
ッキングアッセイ、および細胞増殖生物学的アッセイによって解析した。すべて
のアッセイで陽性の患者を、抗体誘導血小板減少症に対してリスクがあると見な
した。骨髄（ＢＭ）吸引および生検をすべての患者において、ｒｈＴＰＯ処置の
前、および１週間後で行い、また前化学療法サイクルにてより遅い時間点（１０
または１４日）にて選択した患者で行った。腫瘍応答を、身体検査、腫瘍マーカ
ー（ＣＡ−１２５）評価にて評価し、イメージング研究を周期的な間隔で行った
。

【０４５１】 統計学的方法 化学療法のサイクル−１（ｒｈＴＰＯなし）からの造血毒性を、連続的に測定
した変数に関する対のＴ検定の方法によって、サイクル−２（ｒｈＴＰＯあり）
からの結果と比較した。解析に関して考慮した終点には、最下点血小板数、血小
板減少症（＜２０，０００／ｍｍ^３、＜５０，０００／ｍｍ^３および＜１００，
０００／ｍｍ^３）の期間、および血小板数の回復 ＞１００，０００／ｍｍ^３の
時間が含まれる。最下点数（Ｃ２−Ｃ１）での違いをまた、直線回帰解析を用い
て用量応答に関して解析した。血小板数の＞５０，０００／ｍｍ^３および＞１０
０，０００／ｍｍ^３への回復の時間を、マンホイットニー順位和検定を用いて比
較した。さらに、ｒｈＴＰＯ有りまたは無しでのサイクルにおいて血小板輸血を
必要とした患者の割合をマクネマー検定を用いて比較した。

【０４５２】 組換え体ヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ） 本研究で使用したｒｈＴＰＯは、ジェネテック社（南サウスサンフランシスコ
、カルフォルニア州）より入手した。ｒｈＴＰＯは全長で、遺伝的に改変された
哺乳動物細胞株で産出された糖鎖結合分子である。これは標準の技術によって精
製され、注射のための希釈液として保存料を含まない通常の食塩水中で提供され
た。

【０４５３】 結果 患者 発達した婦人科学的悪性腫瘍を患った２９人の患者を本試験に組み入れた（表
２１）。原発腹膜悪性腫瘍の１人の患者を除いて、すべての患者は卵巣癌の診断
を受けた。大部分の患者は少なくとも１回の白金に基づいた療法を受け、何人か
は、さらに全身性および／または腹膜内治療を受けた。１人を除くすべてが、ｒ
ｈＴＰＯに対する臨床的寛容および造血応答に対して評価可能であり、化学療法
１サイクルの後さらなる治療を断り、ｒｈＴＰＯを受けなかった１人の患者は評
価可能ではないと見なした。

【０４５４】

【表２１】

【０４５５】 前化学療法ｒｈＴＰＯ 血液数における効果：前化学療法サイクルでの単一用量のｒｈＴＰＯでの治療
（ｎ＝１６）は、循環している血小板数（基線平均、２７７×１０^３／ｍｍ^３、
最大平均、４６２×１０^３／ｍｍ^３；Ｐ＜０．００１）における用量依存的な増
加（図２）に関連した。血小板の増加は、中央日１５で観察されたピーク効果を
伴う漸進的なものであった（図２）。ピーク応答の後、血小板数は、漸進的に基
線まで下降した。（化学療法前）２１日周辺の血小板数は、基線レベルよりもい
くらか高いままであった（３４７対２７７×１０^３／ｍｍ^３ Ｐ＜０．０１）。
血小板は、形態学的には正常であるようにみえ、白血球細胞数またはヘマトクリ
ット値に大きな変化は見られなかった。

【０４５６】 骨髄における効果：血小板数の増加は、ＢＭ骨髄巨核球の数の由な増加と関連
した（３４±４対４８±５、１０ＨＰＥあたり、Ｐ＜０．０１）。骨髄巨核球波
形退学的には正常に見え、いくつかは多葉性核および成熟細胞質を持ち、大きさ
が大きかった。骨髄細胞および赤血球系細胞は正常の成熟を示した。７日目、１
５人の患者のうち６人からの骨髄が、赤血球系細胞の増加を示した一方で、前骨
髄系：赤血球系細胞比および細胞質は変化しないままであった。しかしながら、
その後の時点（１０および１４日目）でＢＭを試験したすべての６人の患者は、
赤血球系細胞の有意な増加を示した（平均正赤芽球、２１．８％対３１．３％、
Ｐ＜０．０１）。

【０４５７】 骨髄抑制におけるｒｈＴＰＯの効果 ２８人の患者にカルボプラスチンに続いてｒｈＴＰＯを与え、１６人は本研究
の用量段階的拡大部分であり、１２人は用量拡大相であった。

【０４５８】 用量段階的拡大相：患者の本集団において（ｎ＝１６）、ｒｈＴＰＯの投与は
、結果として血小板減少症の程度および期間両方の有意な減少を引き起こした。
ｒｈＴＰＯ用量と血小板減少症の程度の間の関係を表２２に示す。サイクル−１
（ｒｈＴＰＯなし）と比較して、サイクル−２（ｒｈＴＰＯあり）での平均最下
点血小板数は０．６ｍｃｇ／ｋｇで異ならず、１．２ｍｃｇ／ｋｇにて２倍、２
．４ｍｃｇ／ｋｇで１．７倍、３．６ｍｃｇ／ｋｇにて１．２倍高かった。デー
タを、その固有の対照（サイクル−２−サイクル−１の差異）としてそれぞれの
患者を使用して、対の様式で解析した場合に、直線用量応答の証拠はなかった。
しかしながら、最下点血小板数での差異は、０．６および３．６ｍｃｇ／ｋｇの
集団と比較して１．２および２．４ｍｃｇ／ｋｇを与えた集団で有意に高かった
（片側ｔ検定を使用してＰ＜０．０３）（それぞれ用量０．６、１．２、２．４
および３．６ｍｃｇ／ｋｇに対して平均差異Ｃ２−Ｃ１、−０．６、２６．８、
２６．６および７．０）。１．２および２．４ｍｃｇ／ｋｇコホート間で差異が
なかったので（Ｐ＞０．９９）、１．２ｍｃｇ／ｋｇが最低活性用量であるとし
、本化学療法に対するＯＢＤとして見なした。

【０４５９】

【表２２】

【０４６０】 併用したすべてのｒｈＴＰＯ用量（０．６〜３．６ｍｃｇ／ｋｇ）に対して、
サイクル−１と比較してサイクル−２において、最下点血小板数はより高く（５
３×１０^３／ｍｍ^３対３５×１０^３／ｍｍ^３、Ｐ＝０．００７）、血小板減少症
の期間はより短かった（日血小板数＜５０×１０^３／ｍｍ^３、６日間対３日間、
Ｐ＝０．００２、日血小板数＜１００×１０^３／ｍｍ^３、１０日間対７日間、Ｐ
＜０．００１）（表２３）。

【０４６１】

【表２３】

【０４６２】 用量拡大相（二次的予防）：（ＯＢＤでの）ｒｈＴＰＯの重症血小板減少症お
よび血小板輸血の必要性を和らげる能力をよりよく査定するために、６人の患者
のコホートに、重症血小板減少症を経験するまで、カルボプラスチンのみのサイ
クルを与えた。上述したものと同様のスケジュール（すなわち２、４、６および
８日目）を使用して、二次予防として続くサイクルでｒｈＴＰＯを使用した（１
．２ｍｃｇ／ｋｇ）。図３に示すように、本患者群におけるｒｈＴＰＯは血小板
最下点の程度を減少させ（１６×１０^３／ｍｍ^３対４９×１０^３／ｍｍ^３）、最
下点の開始を遅延させ、重症血小板減少症＜２０×１０^３／ｍｍ^３が有意に減少
したように（４．２日間対１．２日間、Ｐ＜０．０１）血小板回復を促進した。
６人の患者のうち５人が、血小板最下点＜２０×１０^３／ｍｍ^３を経験し、サイ
クル−１にて血小板輸血を必要とした。サイクル−２でのｒｈＴＰＯの投与は、
それらの患者のうちの３人で血小板輸血の必要性を排除し、４人目の患者では減
少させた。

【０４６３】 さらに、６人の患者のコホートを、化学療法の前日より開始して（−１、１、
３、５日）ｒｈＴＰＯで処置し、保護の程度がこのスケジュールにて増加されう
るかどうかを決定した。本コホートでの６人の患者のうち５人は、サイクル−１
でのカルボプラスチンのみにの後、重症血小板減少症を経験した。サイクル−２
でのｒｈＴＰＯの投与は、結果として６日間から２日間に重症血小板減少症＜２
０×１０^３／ｍｍ^３の期間を減少させ、血小板輸血の必要性をこれら５人の患者
のうち３人で除去した。図４Ａに示すように、１人の患者はサイクル−１にて重
症血小板減少症を経験し、血小板回復の前に２回の血小板輸血を必要とした。本
スケジュールによるサイクル−２でのｒｈＴＰＯの使用は、血小板最下点を押し
上げ、サイクル−２での血小板輸血の必要性を除去した。図４Ｂに示すように、
６人目の患者はサイクル−１にて重症血小板減少症を経験せず（血小板最下点、
４７×１０^３／ｍｍ^３）、したがってサイクル−２においてｒｈＴＰＯを与えな
かった。サイクル−２は、血小板輸血を必要とし、カルボプラチンで見られた造
血毒性の累積特性を表している重症血小板減少症（血小板最下点、１８×１０^３ ／ｍｍ^３）を伴った。サイクル３でのｒｈＴＰＯの投与は、血小板最下点を上昇
させ（１８対４７×１０^３／ｍｍ^３）、血小板輸血の必要性を排除した。したが
って、二次予防としてｒｈＴＰＯを与えた１２人の患者のうち、１１人にサイク
ル−２でｒｈＴＰＯを与え、１人にはサイクル３にて与えた。表２２に示すよう
に、二次予防として使用したｒｈＴＰＯは２倍まで血小板最下点を上昇させ、４
日間まで重症血小板減少症の期間を減少させた。

【０４６４】 血小板輸血：２８人の評価可能な患者のうち、２７人にサイクル−１にてカル
ボプラスチンのみを与え、サイクル−２でｒｈＴＰＯと共にカルボプラスチンを
与えた。患者に、ｒｈＴＰＯ有りまたはなしのサイクルに対して同一の血小板輸
血トリガー（＜２０，０００／ｍｍ^３）を使用して血小板輸血した。患者が実際
血小板輸血を受けた時点の記録された最下点血小板数は、サイクル−１（平均１
３．８、中間値１６×１０^３／ｍｍ^３）とサイクル−２（平均１４．４、中間値
１６×１０^３／ｍｍ^３）両方で同様であった。血小板輸血の必要性は、サイクル
−１と比較してサイクル−２で明らかに減少した（表２４）。特に、サイクル−
２でＯＢＤ（１．２ｍｃｇ／ｋｇ）にてｒｈＴＰＯを与えた群（ｎ＝１６）にお
いて、血小板輸血を必要とした患者の割合がサイクル−１での７５％からサイク
ル−２での２５％まで減少した（Ｐ＝０．０１）。この群で必要とした輸血の数
も、６９％まで減少した（それぞれサイクル−１およびサイクル−２での輸血、
１６対５）。

【０４６５】

【表２４】

【０４６６】 血小板回復：＞５０×１０^３／ｍｍ^３（Ｐ＜０．０１９）および＞１００，０
００／ｍｍ^３（Ｐ＜０．０１７）までの血小板の回復はまた、ｒｈＴＰＯで有意
に増加した（図５）。ｒｈＴＰＯなしのサイクル−１の３７％の患者と比較して
、サイクル−２でｒｈＴＰＯを与えた６７％の患者が、その血小板を２１日目ま
でに＞１００×１０^３／ｍｍ^３まで回復した。

【０４６７】 累積骨髄抑制におけるｒｈＴＰＯの効果 ２８人の患者のうち２３人に、安定または反応疾患の証拠および過剰血液学的
毒性の欠如に基づいて２サイクル以上のカルボプラチンを与えた。２３人の患者
のうち、１３人にサイクル−１で血小板輸血した。これらの１３人の患者のうち
１０人はｒｈＴＰＯありのサイクル−２で血小板輸血を必要とせず、これらの１
０人の高リスク患者のうち７人がサイクル３においても血小板輸血しないままで
あった。全体的に、より後ろのサイクル（サイクル−２〜６）でのすべての患者
での血小板輸血の必要性は４１％であった（９１サイクル中３７）。

【０４６８】 重症好中球減少症は、一般的にこの療法で観察されなかった。平均最下点好中
球数（ＡＮＣ）はサイクル−１および２に関して、それぞれ０．５８×１０３／
ｍｍ^３および０．７９×１０^３／ｍｍ^３（Ｐ＜０．０３）であった。熱性好中球
減少症の発生（ＡＮＣ＜５００／ｍｍ^３にて熱＞３８．３℃）は、両サイクルで
低く（サイクル−１および２でそれぞれ３対０）、全研究期間の間低いまま維持
された（サイクル−２〜６にて９１中１）。平均最下点ヘモグロビン値はサイク
ル−１および２でそれぞれ９．１および８．３（Ｐ＜０．０１）であった。貧血
はもともと累積性であり、後のサイクルでより高い割合の患者で赤血球細胞輸血
が必要である（サイクル−１で１９％、サイクル−２〜６で３７％）。

【０４６９】 腫瘍応答： ２８人の評価可能な患者に全用量にて１１９サイクル（中央値、５サイクル、
範囲２〜６）のカルボプラチンを与えた。２６人の患者が測定可能な疾患を持ち
、２人が顕微鏡的疾患を持った。主要な応答が１４人（５４％）の患者で見られ
た（４人の完全な、および１０人の部分的な応答）。９人の患者がマイナーな、
または安定疾患を持ち、４人が発展疾患を持った。さらに測定可能な疾患を持た
ない２人の患者のうち、１人は血清学的部分応答を示した（ＣＡ−１２５におい
て３５７から５５までの減少）。

【０４７０】 臨床寛容 ｒｈＴＰＯはすべての患者によってよく寛容であった。ｒｈＴＰＯまたは造血
に関連した有意な副作用事象は観察されなかった。前化学療法相の間、２、３の
患者はその症状記録日誌において、時折の頭痛、筋肉痛、食欲の緩やかな減少ま
たは疲労を報告した。しかしながら、その患っている疾患の症状と区別するため
の、一貫した症状はなく、またこれらの症状のｒｈＴＰＯ投与のタイミングとの
時間的関係は無かった。副作用は、ｒｈＴＰＯありまたはなしの化学療法の両方
のサイクルで同様であり（表２５）、カルボプラチンに関して報告されたものを
代表した。局部皮膚反応、流体停留、血栓塞栓事象または腫瘍期間毒性は見られ
なかった。

【０４７１】

【表２５】

【０４７２】 ６サイクルの化学療法すべてを終了した５０歳の患者は、最後のｒｈＴＰＯ用
量から６週間、右腕に虚弱を示した。脳のＣＴスキャンは陰性であり、患者は２
４時間以内にほとんどの運動不足を回復し、このことは穏やかな脳血管偶発症候
を示している。正常の血小板数（すなわち２２８，０００／ｍｍ^３）およびｒｈ
ＴＰＯ投与からの長期の間隔が存在することにより、この事象がｒｈＴＰＯに関
連しそうもないことが明らかである。

【０４７３】 血清サンプルを、本研究の前および間にＴＰＯに対する抗体が存在するか試験
した。７人の患者が、全長分子に対するアッセイで抗体活性を持つことが示され
た。これらの７人の患者のうち３人が、ｒｈＴＰＯでの処置を開始する前ですら
スクリーニングにおいて抗体活性を持っていた。残りの４人の患者のうち３人は
短略化した分子に対する抗体活性を示した。しかしながらＣ−ｍｐｌブロッキン
グ活性は、これらの患者のうち２人でのみ観察された。最初の患者は、カルボプ
ラチンおよびシクロホスファミドにて多量に前処置し、全用量カルボプラチン５
サイクルを与えた。サイクル５の２２日目に、ＴＰＯに結合した低タイターの抗
体（光学濃度比、１．６５、３０日目までに１．２９に減少した）が示された。
抗体は、Ｃ−ｍｐｌブロッキング活性を示しているけれども、細胞増殖バイオア
ッセイの結果は、非中和であったことを示唆している。この患者での血小板の１
００，０００／ｍｍ^３までのゆっくりとした回復（８４日目）は、この患者のカ
ルボプラチンへの累積曝露に起因した。第二の患者もまた先にカルボプラチンお
よびシクロホスファミドで処理した。６サイクルのカルボプラチンを与え、完全
寛解した。サイクル６の２３日目に、ＴＰＯに結合する抗体（ＯＤＲ、１．５１
、１１５日目に１．０５に減少した）が検出された。彼女はサイクル６にて遅延
血小板回復が起こり、陽性細胞増殖生物学的アッセイを持っていると示され、サ
イクル６での最後のＴＰＯ投与後５６日のもの（血小板数５５，０００／ｍｍ^３ ）と一致した。血小板数は、さらに４週間安定したままであり、次いで９９日目
までに＞１００，０００／ｍｍ^３まで回復した。したがって、抗体を持つ７人の
患者のうち、ただ２人がＣ−ｍｐｌ活性を持ち、（スクリーニング時のみの３人
の患者を含む）他の５人の患者は低タイターの一過性の断続する特性の抗体（Ｏ
ＤＲ１．５〜２．３）を持ち、細胞増殖生物学的アッセイと同様に陰性Ｃ−ｍｐ
ｌブロッキングに基づいて非中和していた。

【０４７４】 化学療法の前３週間でのｒｈＴＰＯの投与は、循環血小板数および骨髄巨核球
を有意に増加させた。化学療法の後のｒｈＴＰＯの投与は、血小板減少症の程度
および期間両方を減少させた。サイクル−２にて最適生物学的量のｒｈＴＰＯ（
１．２ｍｃｇ／ｋｇ）を与えた患者（ｎ＝１６）において、サイクル−１（ｒｈ
ＴＰＯなし）で観察されたものよりも、平均最下点血小板数が高く（４４，００
０対２０，０００／ｍｍ^３、Ｐ＜０．０１）、血小板減少症の期間は短かった（
日＜２０，０００／ｍｍ^３、１日間対４日間、日＜５０，０００／ｍｍ^３、４日
間対７日間、Ｐ＜０．０１）。このことは、この群での血小板輸血に対する必要
性を、サイクル−１での７５％からサイクル−２での２５％に減少させた（Ｐ＝
０．０１）。さらに、サイクル−１においてたった３３％であったのと比較して
、ｒｈＴＰＯで処置した全患者のうちの６７％において、サイクル−２において
２１日目までに＞１００，０００／ｍｍ^３までその血小板が回復した。

【０４７５】 議論 これらの結果は、ｒｈＴＰＯが重症血小板減少症の程度および期間の両方を有
意に減少させたことを示唆している。血小板輸血に対する必要性は、先の化学療
法のサイクル中にすでに重症血小板減少症を経験した患者においてさえも、明ら
かに減少した。さらに、ｒｈＴＰＯは＞１００，０００／ｍｍ^３までの血小板回
復までの時間を促進し、このことは化学療法の計画された用量効力を保持してい
る。

【０４７６】 本患者集団において、化学療法の前に単一用量で与えられたｒｈＴＰＯは、用
量依存的様式で循環血小板数を上昇させた。血小板応答は形態学的に正常に見え
る骨髄巨核球の数の有意な増加と関連した。興味深いことに、赤血球系成分の増
加もまた何人かの患者の骨髄で見られ、ＴＰＯが造血を増加させることができる
というin vitroおよび前臨床的な発見、およびｒｈＴＰＯが骨髄赤血球系および
骨髄系始源細胞集団を拡大することができるという本発明者の先行臨床観察（Ｋ
ｏｂａｙａｓｈｉら、１９９５；Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙら、１９９５；Ｖａｄｈ
ａｎ−Ｒａｊら、１９９７）と一致している。この骨髄での多重系列刺激効果に
もかかわらず、白血球細胞数またはヘモグロビンレベルで主要な変化は見られな
かった。

【０４７７】 日常的に累積性血小板減少症を誘導する化学療法薬物の本臨床的設定において
、ｒｈＴＰＯは、用量依存的様式にて血小板減少症の深さおよび期間両方を減少
させた。主要な効果が最低用量レベル（０．６ｍｃｇ／ｋｇ）、中間用量レベル
（１．２〜２．４ｍｃｇ／ｋｇ）にて見られなかった一方で、ｒｈＴＰＯは、患
者を、少なくともｒｈＴＰＯなしのサイクル−１でのように不十分にすると予期
されたサイクル−２において、血小板最下点数をほぼ２倍に上昇させ、重症血小
板減少症の期間を半分まで減少させた。ｒｈＴＰＯの生物学的効果は、１．２ｍ
ｃｇ／ｋｇにて安定期であると見られているので、この用量を続く研究に関して
選択した。

【０４７８】 本試験の用量段階的拡大部分に関する１つの可能性は、化学療法前３週間のｒ
ｈＴＰＯ処置が、シスプラチンの第一サイクルに続く造血回復に影響を与え、対
照サイクルの造血毒性のレベルを鈍らせる可能性はあることである。しかしなが
ら、本発明者のデータは、２つの観察に基づいた化学療法前３週間与えたＴＰＯ
の任意の陽性または陰性効果の欠如を支持している。まず、血小板最下点は、前
化学療法サイクルでのｒｈＴＰＯの用量を増加したサイクル−１にて増加せず、
このことはｒｈＴＰＯの陽性効果の欠如を示唆している。第二に、用量拡大相で
のｒｈＴＰＯの前化学療法サイクルの削除がサイクル−１での血小板最下点を増
加させず、このことはｒｈＴＰＯの陰性効果が無いことを示唆している。したが
って、本発明者の発見は、化学療法３週間前に与えたＴＰＯが対照サイクルの血
小板最下点、および本研究の拡大相に関して本発明者が選択した効果的用量に影
響を与えなかったことを示唆している。

【０４７９】 ｒｈＴＰＯの血小板保護効果をさらに評価するために、前化学療法ｒｈＴＰＯ
を用量段階的拡大相で除き、患者のコホートに二次予防としてｒｈＴＰＯ（１．
２ｍｃｇ／ｋｇ）のみを与え、すでに先行化学療法サイクルで重症血小板減少症
を経験している患者での重症血小板減少症を予防した。この調停患者群において
さえ、ｒｈＴＰＯは血小板最下点の厳しさを減少させ、血小板輸血に対する必要
性を、先のサイクルで血小板輸血をすでに受けた１１人の患者のうち７人で排除
し、他の患者で減少するように、重症血小板減少症の期間を短くした。

【０４８０】 血小板輸血に対する必要性の減少に関する傾向が、本研究を通して観察された
。最適生物学的用量でｒｈＴＰＯを与えた患者において、血小板輸血を必要とし
ている患者の割合（７５％対２５％）および血小板輸血事象の回数は、サイクル
−１からサイクル−２で明らかに減少した（６９％まで）。さらに、ｒｈＴＰＯ
は血小板回復を促進し、より高い割合の患者がその血小板を、ｒｈＴＰＯなしの
サイクル−１と比較してｒｈＴＰＯありのサイクル−２で３週間までに＞１００
，０００／ｍｍ^３レベルまで回復した（６７％対３３％）。血小板回復を促進す
ることで、ｒｈＴＰＯはスケジュールにおける化学療法の伝送を許容し、用量効
力を保持する可能性がある。

【０４８１】 ｒｈＴＰＯの、全用量化学療法のサイクルを繰り返すことを許容する能力をさ
らに査定するために、抗腫瘍治療に応答している患者に６サイクルのカルボプラ
チンを継続させた。予想された累積性造血毒性にも関わらず、先のサイクルで血
小板輸血を必要とした患者の割合がより後のサイクルでの輸血要求を減少するこ
とに関して利点を示し続け、このことは累積性血小板減少症にうち勝つことにお
けるｒｈＴＰＯの潜在的な有益な効果を示唆している。重症好中球減少症は一般
的に本療法では見られなかった。実際、好中球最下点はｒｈＴＰＯ投与で改善し
たように見え、感染は本研究を通して低いままであった。

【０４８２】 本研究の設計に関する原理的な説明は、本サイトカインおよび本化学療法薬剤
での本発明者の臨床的実験に基づいている。カルボプラチンはサイクルの１６日
目近くに血小板最下点を遅延させ、ｒｈＴＰＯはピーク応答を遅らせて（中央値
１２日）半減期を引き延ばした（２０〜３０時間）（Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊら、
１９９７；Ｂｌｏｅｄｏｗら、１９９６）。したがって、ｒｈＴＰＯの４用量が
化学療法後の日に開始して１日おきに使用された。さらに、本発明者は、ｒｈＴ
ＰＯのより早期の投与（すなわち化学療法の前２日に開始する）がさらに最下点
を改善するかどうかを決定するしたいと考えた。ｒｈＴＰＯは両スケジュールに
よる血小板の緩やかな効果を示した一方で、さらなる利点はこの化学療法薬剤と
一緒のサイトカインの早期投与によっては観察され得なかった。それにも関わら
ず、より早期の血小板最下点を産出する組合せ化学療法によってｒｈＴＰＯのよ
り早期の投与から有益であり得ることが考慮されている。

【０４８３】 本発明者の研究において、ｒｈＴＰＯでの処置は、任意の保健上の症状、心臓
血管症状、局所皮膚反応および流体停留なしに極度によく寛容された。本発明者
の臨床試験の結果は、カルボプラチン−誘導重症血小板減少症にて二次予防とし
て使用したｒｈＴＰＯの有用性を示した。

【０４８４】 ほとんどが再発卵巣癌である本患者集団において、目的の腫瘍応答は患者の５
４％で見られた。白金用量効力の重要性が、すでにこれらの腫瘍型にて確立され
ている一方で、ｒｈＴＰＯの有益性がここで、この問題をさらに安全に処理する
ことを可能にする可能性がある。

【０４８５】 本実施例の結果は、組換え体ヒトトロンボポエチンが、先に化学療法治療患者
集団においてさえも血小板産出の増加を誘導できることを示唆している。この経
路およびスケジュールにて投与したｒｈＴＰＯは、カルボプラチンに関連した累
積性血小板減少症を弱め、血小板輸血に対する必要性を排除するのに効果的であ
った。本発明者の研究はまた、すでに血小板輸血の必要性を先に経験した高リス
クの患者において、ｒｈＴＰＯの二次的予防使用が、血小板減少症の程度および
期間を減少でき、化学療法の続くサイクルにて血小板輸血に対する必要性を防ぐ
ことができることを示している。したがって、用量効力を保持することが重要で
ある臨床設定において、ｒｈＴＰＯの二次予防使用は、患者がそのような治療よ
り利益を得ることを可能にする可能性がある。

【０４８６】 実施例１１ トロンボゾル（ＴｈｒｏｍｂｏＳｏｌ）および２％ ＤＭＳＯでの長期間低温保
存後の組換え体ヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）処置患者からの血小板のin
vitro機能活性の維持の増強 本実施例は、ｒｈＴＰＯ処置にしたがった患者由来の血小板におけるトロンボ
ゾル（ＴｈｒｏｍｂＳｏｌ^ＴＭ）低温保存の効果を示している。癌患者での重症
血小板減少症はしばしば多重サイクル化学療法での累積問題であるので、本発明
者は、保存した血小板のin vitro形態的および機能的特徴における長期間低温保
存の効果を決定しようと考えた。ｒｈＴＰＯ処置患者（ｎ＝２３）および正常ド
ナーからの血小板をトロンボゾル^ＴＭおよび２％ ＤＭＳＯで処置し、６ヶ月間
まで低温保存した。この血小板を異なる間隔で解凍し、機能の保持に関して試験
した。

【０４８７】 材料と方法 患者選別 第Ｉ−ＩＩ相試験の部分としてｒｈＴＰＯでの処置を与えた卵巣癌（ｎ＝１３
）または軟部組織肉腫（ｎ＝１０）のいずれかの診断を受けた２３人の患者を試
験した。卵巣癌の患者において、ｒｈＴＰＯは化学療法（シスプラチン）に続い
て４用量毎１日おきに皮下に１．２〜３．６ｍｃｇ／ｋｇの用量で投与した。肉
腫患者においては、ｒｈＴＰＯは３用量、１用量は化学療法の前、２用量は化学
療法（アドリアマイシンおよびイフォスファミド）に続いて、皮下に１．２ｍｃ
ｇ／ｋｇにて与えた。血小板形態および血小板の機能を査定するために（新鮮な
ものおよび低温保存したもの）、血液試料を血小板が化学療法およびｒｈＴＰＯ
処置に続いて回復した時点で得た。アスピリンまたは非ステロイド系坑炎症剤の
使用は、本研究の期間中許可しなかった。平行して、対照ボランティアより、患
者集団として同一の基準下で血液試料を提供いただいた。

【０４８８】 材料 血小板の保存のために使用したすべての薬剤はシグマ ケミカル（Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ，ＭＯ）より入手した。凝集アゴニストのアデノシンジスルフェート（Ａ
ＤＰ）、コラーゲンおよびレストセチンはクロノ−ログ社（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏ
ｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ，ＰＡ）より購入した。低温
保存のためのトロンボゾル^ＴＭ保存溶液を含むすべての薬剤（アミロリド、アデ
ノシンおよびニトロプルシドナトリウム）は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ
）内で５０倍の濃度にて調製した。フィコエリスリン−標識化（ＰＥ）ウサギモ
ノクローナル抗ヒト血小板Ｐ−セレクチンおよびフィコエリスリン−標識化対照
抗体はベクトン、ディッキンソン（Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より購入
した。フィコエリスリン−標識化マウスモノクローナル抗ヒトＧＰ−Ｉｂ抗体は
イムノテック（Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）より購入した。

【０４８９】 血小板単離および保存 患者または対照ドナーどちらかからの全血（７０ｍｌ）を静脈穿刺を介してＡ
ＣＤ（ベクトン ディッキンソン（Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））を含む
チューブ内に採取した。この全血を２〜６時間室温にて放置し、続いて２５０×
ｇにて１２分間２０℃で遠心した。次いで血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）を取り
除き、Ｔ−３１０１ １５０ｍｌ移動パック（カーターメド（Ｌａｋｅｗｏｏｄ
，ＮＪ）内に分注した（２０ｍｌｓ／バッグ）。新鮮な未処理ＰＲＰの一部分を
、以下に記述したような形態およびin vitroの機能活性の決定のために残した。
以下の薬剤を持つ２０ｍｌの試料を無菌ポートを通した注入で加えた。２％の最
終ＤＭＳＯ濃度を産出する１００μｌの５０倍濃度のトロンボゾル^ＴＭ、４００
μｌ。得られたトロンボゾル^ＴＭ−処置ＰＲＰは、以下の最終濃度の薬剤、アミ
ロリド（０．２５ｍＭ）、アデノシン（０．１ｍＭ）およびニトロプルシドナト
リウム（５０μＭ）を含んだ。次いで処理した血小板をゆっくり攪拌して混合し
、アルミニウムカセットないで直接８０℃フリーザー内に挿入した。患者から入
手可能な容量が決まっているので、低温保存した試料部分を無作為に、示した時
間保存するように振り分けた。

【０４９０】 保存の後、血小板試料を以下のように解析のために回収した。血小板試料を水
浴中３７℃にて解凍し、７０ｒｐｍにて設定した軌道シェーカー上に１５分間お
いた。バッグから一部分を取り出し、細胞数および平均血小板容量（ＭＰＶ）に
関してバイオチェム イムノシステムズ システム ９１１０ ＣＰ＋ ヘマト
ロジー アナライザー（Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡ）を用いて解析した。さらに
、新鮮な解凍した試料をＦＡＣＳ解析のために固定し、すでに記述されたように
（Ｃｕｒｒｉｅら、１９９８）光学顕微鏡によって円盤状形態に関して評価した
。血小板試料の新鮮な風乾したスミアーをライト−ギームサにて染色した。凍結
−解凍した血小板の超微細構造形態学的試験（Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊら、１９９
０）のために、試料を９５０×ｇにて２０分間遠心し、上清を取り除いた。試料
を１．５ｍｌの固定可能緩衝液（ＰＢＳ中１．５％パラホルムアミドおよび１．
５％グルタルアルデヒド）中に再懸濁し、４℃にてインキュベートした。残って
いる血小板試料は２２℃にて３０分間、８００×ｇで遠心し、トロンボゾル^ＴＭ およびＤＭＳＯを取り除いた。得られた血小板ペレットを自己血漿を用いて本来
の容量まで再懸濁させ、血小板細胞数を以上で記述したように決定した。血小板
試料を自己血漿と適合させ、３×１０^８細胞／ｍｌの血小板濃度を得、これを３
０分間３７℃にてインキュベートした。

【０４９１】 血小板機能研究 攪拌形状変化（ＳＳＣ）、形状変化の程度（ＥＳＣ）、低張ショック応答（Ｈ
ＳＲ）およびアゴニスト誘導凝集の機能的アッセイをすでに記述されたように（
Ｃｕｒｒｉｅら、１９９８；Ｈｏｌｍｅら、１９９８）実施した。攪拌速度また
はアゴニスト誘導活性化の変化に対する応答における血小板の形状変化の特性を
決定するために、光学測定を実施した。ＳＳＣは試料中に存在する円盤状集団の
光学測定である。攪拌速度の変化に対する応答において、球状血小板の均一な動
きが、光屈折をなくすことになる。反対に、円盤状の血小板の不均一な動きが光
屈折を引き起こす。ＳＳＣを以下のように行った。血小板凝集計を用い、血小板
試料をＰＰＰに対してブランクにし、基線を確定した。次いで攪拌子を止め、基
線からの屈折をそのピークにて測定した。

【０４９２】 ＥＳＣはアンタゴニスト誘導活性化に対する応答で起こる円盤状から球体形へ
変化する血小板の形態学的な光学測定である。ＥＳＣのために、５００μｌの試
料を血小板凝集計内に置いて、続いて２０μｌの０．１Ｍ ＥＤＴＡおよび１０
μｌの１ｍＭ ＡＤＰを連続的に添加した。ＥＳＣを基線からの屈折より決定し
、最大光学密度の増加の割合として表した（Ｈｏｌｍｅら、１９９８）。

【０４９３】 血小板の全生存力および代謝を査定するために、本発明者は血小板の、１５分
間時の低張に対して応答する能力を試験した。ＨＳＲのために、５００μｌの試
料をそれぞれ２つのキュベットに分注した。２５０μｌのＰＢＳを第一キュベッ
トに添加し、血小板凝集計を用いて希釈の結果としての伝達の増加を測定した。
第二の部分に２５０μｌの水を添加し、低張ショックからのパーセント回復を１
５分時に測定した。

【０４９４】 低温保存および解凍の工程が血小板の明らかな活性化を引き起こしたかどうか
を査定するために、新鮮なそして低温保存した血小板を、Ｐ−セレクチン（ＣＤ
−６２）および表面マーカーＧＰ−Ｉｂの表面発現に関してフローサイトメトリ
ー解析によって試験した。血小板表面マーカーのＦＡＣＳ解析のために、血小板
濃縮物（ＰＣ）の部分を２％パラホルムアルデヒド内で固定化した。ＰＥ−標識
化、抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体またはＰＥ−標識化抗ＧＰ−Ｉｂモノ
クローナル抗体を、固定化した血小板の洗浄試料に添加し、暗所にて室温で１時
間インキュベートした。相当する対照モノクローナル抗体を平行して使用し、基
線結合を確立した。試料を洗浄し、希釈し、次いでコールターＥＰＩＣＳ ＦＡ
ＣＳ解析器を用いて解析した。血小板表面マーカーの存在は、エピトープを発現
している細胞の割合として表した。

【０４９５】 低温保存した血小板が止血に対して重要な機能を仲介することができたかどう
かを決定するために、血小板凝集をさまざまなアゴニストを用いて試験した。血
小板試料を、アゴニストとしてレストセチン（２５ｍｇ／ｍｌ）またはＡＤＰ（
５μＭ）とコラーゲン（５μｇ／ｍｌ）の組合せを用いて、血小板凝集計（５６
０ ＶＳ、クロノ−ログ）にて凝集に関して査定した。凝集は基線としてＰＲＰ
を、１００％としてＰＰＰを用いてパーセント最大凝集として測定した。

【０４９６】 統計学的解析 データは平均値±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として表す。対照ドナーからおよびｒ
ｈＴＰＯを与えた患者からの新鮮なそして低温保存した血小板のin vitroの機能
活性の比較は、ｔ検定を用いて行った。患者の血小板と対照の血小板間の比較は
ｔ検定を用いて実施した。１週間保存した血小板と１ヶ月、３ヶ月および６ヶ月
保存した血小板間の比較はｔ検定を用いて実施した。

【０４９７】 結果 正常ドナーまたはｒｈＴＰＯ処置患者からの血液試料を、短期間（１週間）お
よび長期間（６ヶ月まで）の保存期間、トロンボゾル^ＴＭおよび２％ＤＭＳＯで
の低温保存前（新鮮）および後（凍結−解凍）両方での血小板の形態およびin v
itro機能活性に関して試験した。トロンボゾル^ＴＭおよび２％ＤＭＳＯとの短期
間低温保存前およびそれに続くもの両方の、患者および対照群から得られた血小
板の形態学的特性および機能活性を表２６に示す。

【０４９８】 新鮮な血小板集団の比較 対照ドナーおよびｒｈＴＰＯ処置患者からの新鮮に回収した血小板を、以上お
よび表２６で記述したように概略した連続したin vitroアッセイによって基線細
胞形態および機能活性に関して試験した。両方の供給源からの血小板はほとんど
の評価において同様の特徴を表示した。ｒｈＴＰＯ処置患者からの血小板は、お
そらくｒｈＴＰＯ処置の結果として有意により多い細胞数を産出した。２つの血
小板集団は、平均血小板容量（ＭＰＶ）または円盤形態を示している血小板集団
の割合を含む形態学的特性に有意な差を示さなかった（表２６）。表面ＧＰ−Ｉ
ｂおよびＰ−セレクチンの発現もまた、対照ドナーおよびｒｈＴＰＯ処置患者両
方に関して同様であった。これらの血小板集団の療法の機能活性は、ＳＳＣ、Ｈ
ＳＲまたはレストセチン誘導凝集において有意な差を示さなかった（表２６）。
しかしながら、対照ドナーからの細胞と比較して、ｒｈＴＰＯ処置患者からの血
小板はＥＳＣに関して有意に高い値、およびより少ないＡＤＰ／コラーゲン誘導
凝集を示した（表２６）。

【０４９９】 新鮮な血小板対低温保存した血小板の比較 トロンボゾル^ＴＭと２％ＤＭＳＯをともなう−８０℃での１週間の低温保存に
続いて、ｒｈＴＰＯ処置患者からの血小板は、ｒｈＴＰＯ処置患者からの新鮮な
血小板と同様の形態学的特性の保持を示した（表２６）。細胞数の回復、ＭＰＶ
、円盤形態レストセチン誘導凝集を示している血小板の割合または表面マーカー
ＧＰ−Ｉｂの発現に統計学的に有意な差はなかった（表２６）。対照ドナーから
の血小板もまた、対照ドナーからの新鮮な血小板と比較して、細胞数、円盤形態
およびＧＰ−Ｉｂの発現の統計学的に同一の保持を示した（表２６）。それぞれ
のドナー集団からの新鮮な細胞と比較して、ｒｈＴＰＯ処置患者および正常ドナ
ーからの低温保存した血小板は、ＳＳＣ、ＥＳＣ、ＨＳＲおよびＡＤＰ／コラー
ゲン誘導凝集を含む機能活性の統計学的に有意な欠失を示した（表２６）。Ｐ−
セレクチン発現もまた、両方のこれらの供給源からの血小板の低温保存の後に有
意に増加した。

【０５００】 正常ドナーとｒｈＴＰＯ処置患者からの低温保存血小板の比較 短期間低温保存の後の、ｒｈＴＰＯ処置患者からの血小板は、正常ドナーから
の血小板と比較して形態学的および機能活性パラメータ両方の統計学的に有意な
より高い維持を示した（表２６）。ｒｈＴＰＯ処置患者からの凍結−解凍した血
小板は、正常ドナーからの血小板に対する値と比較して、ＭＰＶ、円盤形態、Ｓ
ＳＣ、ＥＳＣおよびＨＳＲのよい維持を保持した（表２６）。低温保存前の間、
ＡＤＰ／コラーゲン誘導凝集は、対照ドナー血小板に関してより高く、２つの細
胞集団は低温保存の後、同様の凝集プロフィールを示した。このことは、対照血
小板による保持と比較してｒｈＴＰＯ処置患者からの血小板によるアゴニスト誘
導凝集のより高い保持による（７３％対６０％、それぞれ新鮮な血小板値に対し
て）。

【０５０１】

【表２６】

【０５０２】 血小板の長期低温保存 長期低温保存の効果を査定するために、ｒｈＴＰＯ処置した患者および正常ド
ナーからの血小板試料をトロンボゾル^ＴＭおよび２％ＤＭＳＯを用いて低温保存
し、１週間、１ヶ月、３ヶ月および６ヶ月間−８０℃にて保存した。表２７は、
長期保存の後のｒｈＴＰＯ−処置患者からの血小板の形態学的および機能的活性
の結果を示している。６ヶ月保存時間にわたって血小板は１週間低温保存した血
小板と比較して形態または機能活性の統計学的に有意な欠失は示さなかった（表
２７）。したがって、６ヶ月間保存したｒｈＴＰＯ処置した患者からの低温保存
血小板は、細胞数、円盤状の割合およびＧＰ−Ｉｂ発現を、ｒｈＴＰＯ処理した
患者からの新鮮な血小板と統計学的に同様に保持した。長期間低温保存した対照
ドナー血小板は、形態および機能活性のよい保持を示した（表２８）。トロンボ
ゾル^ＴＭおよび２％ＤＭＳＯ内での１ヶ月、３ヶ月および６ヶ月の低温保存の後
、対照ドナー血小板は、１週間低温保存した血小板と比較して統計学的に有意な
形態または機能活性の欠失は示さなかった。１つの例外は、６ヶ月間の保存時の
ＨＳＲの統計学的減少であった。

【０５０３】

【表２７】

【０５０４】

【表２８】

【０５０５】 光学および電子顕微鏡による低温保存した血小板の形態 ｒｈＴＰＯ−処置した患者からの低温保存した血小板の形態は光学顕微鏡下で
正常に見えた。新鮮な血小板およびトロンボゾル^ＴＭと２％ＤＭＳＯで低温保存
した血小板のライト−ギームザ染色した風乾スミアーを比較した。全般的に、形
態は光学顕微鏡下（１０００×倍率）で新鮮および低温保存した血小板に関して
正常に見えた。

【０５０６】 患者試料からの凍結−解凍した血小板を透過型電子顕微鏡下で試験し、低温保
存後の超微小構造形態の保持を査定した。ｒｈＴＰＯ処置患者からの、トロンボ
ゾル^ＴＭと２％ＤＭＳＯで低温保存した電子顕微鏡血小板を評価した。低出力（
１７，５００×倍率）下での保存された血小板は、もともとの膜をもつ円盤およ
び球形態の混合を示した。高出力（３５，０００×倍率）下で、α顆粒、密顆粒
、グリコーゲン粒子および微小管系を含む細胞質オルガネラが容易に明らかにな
った。血小板は円盤および球形態の混合を示した。ほとんどの部分に関してこれ
らの細胞は、もともとの微小管系、ファジーな被膜、α顆粒およびグリコーゲン
を持つ正常の形態を示した。いくつかの血小板において、ｃａｎｎａｌｉｃｕｌ
ａｒ系がいくらか拡張してみえ、しかし風船形態またはゴースト細胞はまれであ
った。

【０５０７】 議論 本発明者は、ｒｈＴＰＯ処理の後に由来した血小板におけるトロンボゾルと２
％ＤＭＳＯでの低温保存の効果を決定しようと考えた。本発明者の発見は、ｒｈ
ＴＰＯ処置患者からの低温保存した血小板が、細胞数の有意な欠失を示さず、１
００％保持円盤形態を示したことを示唆している。さらに、ｒｈＴＰＯ処置患者
からの低温保存した血小板は、相当する新鮮な細胞と比較してＳＳＣ、ＥＳＣお
よびさまざまなアゴニストに対する凝集応答を含む機能活性の７０％またはそれ
以上の保持を示した。本発明者の発見は、ｒｈＴＰＯ処置後の患者から由来した
血小板が、形態および機能活性をよく保持して低温保存できることを示唆してい
る。

【０５０８】 ｒｈＴＰＯ処置患者からの低温保存した血小板は、正常ドナーからの低温保存
した血小板と比較して、形態（大きさおよび円盤形態）および機能活性（ＳＳＣ
、ＥＣＳ、ＨＳＲ）の有意により高い保持を示した。さらに、１週間低温保存し
た血小板と比較して、６ヶ月までの長期保存において形態学的なおよび機能的な
特性の有意な欠失はなかった。短期間保存（１週間）の後、ｒｈＴＰＯ処置患者
からの低温保存した血小板は、対照からの低温保存した血小板と比較して、円盤
形態（７０％対５７％）、形状変化の程度（１９％対１３％）、攪拌形状変化（
１５％対１１％）および低張ショック応答（５６％対２５％）の有意に高い保持
を示した。６ヶ月までの間の低温保存の後、機能のさらなる有意な欠失はなかっ
た。これらの発見は、ｒｈＴＰＯ刺激患者からの血小板が、工程、低温保存およ
び解凍手順のストレスを相殺することがより可能であったことを示唆している。

【０５０９】 ２つの可能性ある機構がこの発見を説明できるかもしれない。第一に、ｒｈＴ
ＰＯは巨核球の細胞質成熟を増強し、その間、細胞質質量、顆粒性、細胞内オル
ガネラの形成、および機能的な血小板を産出するのに必要な生化学的特性の獲得
の増加が起こる。ＴＰＯの存在下でのマウス骨髄培養増殖における（Ｚｕｃｋｅ
ｒ−ＦｒａｎｋｌｉｎおよびＫａｕｓｈａｎｓｋｙ、１９９６）および本発明者
の臨床試験でのｒｈＴＰＯを与えた患者からのヒト骨髄における超微小構造解析
は、ＴＰＯが、血小板特異的顆粒、境界膜の形成および血小板内への細胞質断片
化によって明らかにされたような全巨核球成熟を刺激することを示した。したが
って、ｒｈＴＰＯ−由来血小板は、構造的および生化学的により成熟したもので
あり得る。第二にネズミまたはヒト研究におけるＴＰＯ処置の後に、循環におけ
る新規に合成された血小板の増加がある（Ｚｕｃｋｅｒ−Ｆｒａｎｋｌｉｎ、１
９９６；Ｏｍａｌｌｅｙら、１９９６）。より若い、新規に合成された血小板は
、より古い血小板よりもより機能的に振る舞う可能性がある。したがってｒｈＴ
ＰＯ由来血小板は、細胞に低温保存の後によりよい生存力および機能的効力をも
たらす可能性がある。

【０５１０】 本発明者の試験は、ｒｈＴＰＯがない状態で合成された、化学療法後の血小板
集団を比較しなかった。したがって、同様の結果が、化学療法の回復相の間に得
られた未刺激血小板で得られた可能性がある。重要に考えるに、ｒｈＴＰＯの使
用はさらに数を増強する可能性があり、続く血小板減少症の期間に低温保存でき
る血小板の産出を何倍も増加させる可能性がある。

【０５１１】 まとめると、ｒｈＴＰＯ処置ドナーからの血小板の低温保存は、処置に関連し
た血小板減少症を制御するための続く輸血に関する自己または同種移植に対する
有用な新規の戦略を提供する可能性がある。トロンボゾル^ＴＭと２％ＤＭＳＯを
使用したｒｈＴＰＯ刺激ドナーからの血小板の低温保存は、自己または正常ドナ
ーからの血小板保存に対する新規の、有用な戦略を提示する可能性がある。明ら
かに、この戦略のこの効力は、造血の重要な機能を仲介することができる生存力
のある血小板を循環させることを成し遂げることによって確立されうる。

【０５１２】 実施例１２ カルボプラチンを与えられている婦人科学悪性腫瘍の患者でのトロンボゾル（Ｔ
Ｃ）と２％ＤＭＳＯで低温保存したｒｈＴＰＯ誘導自己血小板の輸血の予備的研
究 本実施例は、自己輸血血小板の回復および機能活性における効果を評価するた
めの、ＴＣと２％ ＤＭＳＯで低温保存したｒｈＴＰＯ由来自己血小板の輸血の
安全性および可能性を決定する方法、およびＧＹＮ悪性腫瘍でのＡＵＣ＝１１で
のカルボプラチンに対する腫瘍応答を記録する方法を記述している。

【０５１３】 本発明者は、化学療法の前に癌患者において１または２用量の組換え体ヒトＴ
ＰＯ（ｒｈＴＰＯ）の投与が、血小板産出を引き延ばすための強力な刺激である
ことを示してきた。化学療法に陰性の患者において、単一または２つの分割用量
として投与された２．４ｍｃｇ／ｋｇの用量でのｒｈＴＰＯが、何人かの患者で
１００万（１０^６／μＬ）またはそれ以上まで血小板数を引き上げた。ｒｈＴＰ
Ｏに対する応答で産出された血小板は、正常の形態および凝集機能を示した。こ
の発見は、ｒｈＴＰＯが骨髄抑制治療の前の自己移植に対して正常ドナーまたは
癌患者に与えられ得る可能性を高める。

【０５１４】 トロンボゾル（ＴＣ）は、結果として生化学的に安定化され、冷保存障害に対
して保護された細胞となる、血小板への内因性の特定の活性化経路を阻害する選
択された第二メッセンジャー効果器からなる新しく発展した血小板保存溶液であ
る（Ｃｏｎｎｏｒら、１９９６；Ｃｕｒｒｉｅら、１９９７）。研究によりトロ
ンボゾル保存溶液が、４℃にて９日間の血小板濃縮物（ＰＣ）の保存を許容する
ことが示されてきた。さらに、トロンボゾルの正常ドナーからの血小板の低温保
存に対する適用は、処理の簡便さ、２％までのＤＭＳＯの減少および細胞数の優
れた保持およびin vitroでの機能活性を可能にする。

【０５１５】 本発明者は、第Ｉ−ＩＩ相臨床試験におけるｒｈＴＰＯを与えた患者由来の血
小板におけるトロンボゾル低温保存の効果を調査した。本発明者の発見は、ＴＣ
と２％ＤＭＳＯで低温保存した場合、ｒｈＴＰＯ処置の後の患者からの血小板が
、ＴＣと２％ＤＭＳＯまたは６％ＤＭＳＯのみで低温保存した対照血小板と比較
して、円盤形態、形状変化の程度、低張ショック応答、ＡＤＰ／コラーゲン誘導
凝集およびＰ−セレクチンの低発現の維持を含む機能活性のより高い回復を示し
たことを示している。この発見は、ｒｈＴＰＯ由来自己または同種血小板のＴＣ
と２％ＤＭＳＯでの低温保存が、処置に関連した血小板減少症を制御するための
引き続く輸血に対する有用なアプローチを提供する可能性があることを示唆して
いる。

【０５１６】 カルボプラチンは、広い抗腫瘍活性スペクトルをもち、卵巣癌、子宮頸癌、生
殖細胞腫瘍、中皮腫、小細胞肺癌、前立腺癌および頭および頸癌の治療で使用さ
れている。カルボプラチンは、１６００ｍｇ／ｍ^２までの用量において非造血毒
性を欠いているので、本研究に対する好適な化学療法剤である。その主要な毒性
は、骨髄抑制、とりわけ血小板減少症である。Ｏｚｏｌｓら（Ｏｚｏｌｓら、１
９８７）は、サイトカイの補佐なしに、高用量のカルボプラチン（８００ｍｇ／
ｍ^２）で再発卵巣癌の３０人の患者を処置した。主要な応答が、２７％の患者で
見られ、骨髄抑制が観察された最も共通の毒性であった。Ｇｏｒｅら（１９８７
）は、肺癌および中皮腫患者に対して１６００ｍｇ／ｍ^２までの用量を伝送した
。比較的副次的な胃腸管毒性、脂肪毒性、耳鼻科的毒性が観察されたが、ほとん
ど有意な骨髄毒性は見られなかった。

【０５１７】 本発明者は、ｒｈＴＰＯの補佐有りまたはなしでＡＵＣ１１にてカルボプラチ
ンを使用した再発婦人化学的悪性腫瘍の患者での臨床試験を完了した。主要な腫
瘍応答が本試験にて２５人の評価可能な患者（ＣＲである４人の患者を含む）の
うち５０％で観察された。しかしながら、血小板輸血を必要とする血小板減少症
の発生は、ｒｈＴＰＯなしのサイクル−１で高かった（二次予防としてのｒｈＴ
ＰＯでの処理１２人の患者のうち１０人）。

【０５１８】 試験設計 本研究において、本発明者は、回収し、ＴＣと２％ＤＭＳＯで低温保存し、婦
人科学的悪性腫瘍の患者におけるカルボプラチン誘導血小板減少症を制御するた
めの輸血に必要である場合に解凍する可能性のある血小板を増加させるために化
学療法の前にｒｈＴＰＯを使用する。カルボプラチンは、商業的に入手可能な化
学療法剤である。２０人の評価可能な患者を本研究で処置する。ＴＯと２％ＤＭ
ＳＯで低温保存したｒｈＴＰＯ由来自己血小板の輸血の本戦略が安全で効果的で
あるとわかった場合、正式な第ＩＩ−ＩＩＩ相プロトコールを作製する予定であ
る。データを回収し、本研究を補助する調査ナースによってＰＤＭＳ上に入力さ
れる。処置に明らかに関連した死または予期せぬ生命を脅かす毒性は、研究委員
長に対してすぐに報告すべきであり、続いて彼は監督委員会に届けなければなら
ない。

【０５１９】 前臨床安全性試験を正常のマウス、アカゲザルおよびチンパンジーにて構築し
た。前臨床試験において、ＴＰＯの投与は結果として、何倍までもの血小板数の
早期の上昇となった。骨髄抑制の海水モデルにおいて、組換え体ネズミＴＰＯは
、カルボプラチンと放射線照射による汎血球減少症を示したマウスで血小板減少
症を排除することに効果的であることが示された。広範囲の前臨床研究の結果と
して高まった主要な安全性の考慮には、免疫原性および結果としての血小板減少
症が含まれる。

【０５２０】 組換え体ヒトＴＰＯ（ｒｈＴＰＯ）は現在、骨髄抑制および骨髄遮断化学療法
の両方を受けている患者でのいくつかの第Ｉ−ＩＩ相臨床研究での試験が行われ
ている。ｒｈＴＰＯの単一および複数ＩＶ投与が、安全であり、（熱、吐き気ま
たは低血圧のような）健康上の毒性の証拠はないことが示された。３００人を超
える処置された対象においてｒｈＴＰＯに関連する可能性があると考えられたと
報告された２つの血栓事象（深静脈血栓）があった。抗ＴＰＯ抗体が、ＩＶ ｒ
ｈＴＰＯ処置対象者の１０％で観察され、これらの抗体は、一過性で非中和に反
転する。現在までに、２５人を超える対象者が皮下（ＳＣ）注射によってｒｈＴ
ＰＯを受けており、抗ＴＰＯ抗体はそれらの１０％で観察された。潜在的中和し
ている抗体が、５ヶ月間にわたってｒｈＴＰＯの多重ＳＣ注射で与えられており
、回復前に血小板減少症が引き延ばされたことを経験した１人の対象者で観察さ
れた。血小板減少症が抗体の存在または骨髄抑制化学療法の累積効果によるもの
であるかどうかは明らかではない。

【０５２１】 臨床的薬物動態学 血清ＴＰＯ濃度を、肉腫または悪性腫瘍の患者へのｒｈＴＰＯのＩＶボーラス
注射の後に測定した。前化学療法サイクルの間、初期最大ＴＰＯ濃度（Ｃ_ｍａｘ ）は、コードと比例し、それぞれ０．３および２．４μｇ／ｋｇ用量の後に５〜
５０ｎｇ／ｍＬの範囲である。このことは、ｒｈＴＰＯが、血漿容量と同様の初
期分布容量（６０ｍＬ／ｋｇ）に分配されたことが明らかなことを示唆している
。ＴＰＯの明白な末期除去半減期は２０〜３０時間である。ＴＰＯ濃度−時間プ
ロフィール下面積（ＡＵＣ）は、用量の増加と不均衡に増加し、おそらく、第一
にレセプター仲介エンドサイトーシスによって血小板で起こると考えられる、Ｔ
ＰＯクリアランス工程の用量依存飽和を反映している。

【０５２２】 ｒｈＴＰＯ前調製および投与 ｒｈＴＰＯは、非経口投与用に無菌液体としてジェネテック社（Ｏｎｅ ＤＮ
Ａ Ｗａｙ、南サンフランシスコ、カルフォルニア州 ９４０８０）によって提
供される予定である。活性成分の各３ｍＬガラスバイアルには２ｍＬ含まれる。
ｒｈＴＰＯは緩衝液中に０．１ｍｇ／ｍＬで提供される予定である。ｒｈＴＰＯ
は氷上で輸送され、２℃〜８℃（３５°Ｆ〜４６°Ｆ）にて冷蔵庫で保存されな
ければならない。処方には、保存剤は含まれず、単一投与のみに好適である。明
るい光への曝露は避けるべきである。溶液は凍結すべきでなく、バイアルに表記
された使用期限を過ぎて使用すべきでない。

【０５２３】 本研究を通して、臨床薬剤師または他の指定された研究スタッフが、基線で測
定したように患者の体重に基づいてｒｈＴＰＯ注射を調製する予定である。臨床
薬剤師は、対象者ＩＤナンバー（および任意に他の識別名）、プロトコールナン
バーおよびｒｈＴＰＯの量（マイクログラムおよびマイクロリッターで）を表記
したｒｈＴＰＯのシリンジを研究スタッフに提供する予定である。希釈したｒｈ
ＴＰＯの注射は、調製の４時間以内に投与されなければならない。

【０５２４】 トロンボゾル処方 トロンボゾルの開発は以下の原理に基づいている。体内で循環している血小板
は、組織障害の部分において形成される外来性のシグナルに応答するように保た
れている。内因性刺激のない状態で、循環している血小板は、特定のセカンドメ
ッセンジャー経路を介して相乗的に働く因子によって毒性阻害の状態で保持され
る。さまざまな物理的および生化学的刺激両方に対するそれらの急性感受性が、
血小板を循環系の環境外に保持することをきわめて難しくした。この血小板活性
化の内因性の毒性阻害は、続く血小板の回収および保存を不可能にする。したが
って、保存障害はほとんど、これらの活性化経路の特定の調節がないことによる
可能性がある。トロンボゾル処方の開発でとられたアプローチは、活性化を防止
する、したがって血小板を保存障害に対して抵抗性にする特定のセカンドメッセ
ンジャー経路を直接刺激することによって血小板の活性化の内因性阻害を模倣す
ることであった。

【０５２５】 トロンボゾルの開発において、それぞれの成分を、連続する公知のアゴニスト
に対する血小板の応答を可逆的に阻害する能力に関して、さまざまな組合せにそ
って試験した。この処方によって誘導された可逆的阻害は、血小板を低温保存し
た場合に血小板保存障害の発達を効果的に減少させた。以下は保存の間血小板の
活性化を制御するために保持されたセカンドメッセンジャー経路およびそれぞれ
の経路の阻害を排除するために使用した特異的阻害剤の簡単な記述である。それ
ぞれの薬剤の効力は、第二メッセンジャー効果器のin vitroでのＡＤＰおよびコ
ラーゲン誘導凝集を可逆的に阻害する能力を解析することによって示した。

【０５２６】 Ｎａ＋／Ｈ＋イオン交換体 機能的に活性なＮａ^＋−Ｈ^＋イオン交換体は、その両方が活性化事象を引き起
こす内部ｐＨを低下させ、Ｃａ＋＋を流通させる能力のために、血小板の活性化
に必要である。Ｎａ^＋−Ｈ^＋イオン交換体の阻害剤であるアミロリドは効果的に
、そして可逆的に血小板のin vitroでの凝集を阻害する。

【０５２７】 環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ） アデニル酸シクラーゼの刺激は、内因性の細胞質ｃＡＭＰ濃度を増加させ、こ
れは血小板の活性化を阻害する。この血小板阻害の系は、内皮細胞から放出され
た正常のin vivoの血小板効果器であるプロスタサイクリンが、ｃＡＭＰ産出の
刺激によって循環している血小板の活性化を阻害するということに生理学的に関
連性がある。アデノシンは、血小板ｃＡＭＰレベルを増加させ、血小板のin vit
roでの凝集を可逆的に阻害する他の薬剤である。

【０５２８】 環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ） ｃＡＭＰの系と同様に、ｃＧＭＰの細胞質濃度の増加を引き起こすグアニル酸
シクラーゼの刺激は、血小板の活性化経路を阻害する。ｃＧＭＰは、内皮細胞由
来弛緩因子の効果を生理学的に誘導するのと同様の経路を介して働く。血小板中
のｃＧＭＰの増加をおこす薬剤ニトロプルシドナトリウム（ＮＰ）は、アゴニス
ト誘導凝集を可逆的に阻害する。

【０５２９】 トロンボゾル−処置ＰＣ対対照ＰＣの優越の立証は、血小板機能を決定するた
めに、血小板領域で通常実施される連続するin vitroアッセイ系を使用して確立
された。第一に細胞数の回復であり、凍結／解凍サイクルの後の細胞数はＨｅｍ
ａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して測定し、新鮮な血小板に関する値
と比較した。第二は円盤形態であり、血小板を光学顕微鏡によって円盤形態の保
持について解析する。１００個の細胞を４０×レンズを用いて観察し、円盤形を
示している集団の割合を決定した。第三は形状変化の程度（ＥＳＣ）である。Ｅ
ＳＣは、アゴニスト刺激に対する応答で起こる血小板の円盤から球形への変化の
測定であり、ＥＳＣは血小板活性化機能の保持の測定である。第四は、低張ショ
ック応答（ＨＳＲ）である。ＨＳＲは血小板の、低張液の添加に対する応答での
平衡を回復する能力の測定である。ＨＳＲは血小板の生存力の決定であり、０〜
１００％を記録する。第五は血小板膜表面マーカーのＦＡＣＳ解析である。ＦＡ
ＣＳは特定の血小板タンパク質エピトープを発現している集団中の血小板の割合
を測定するのに使用される。測定した血小板海水は、すべての血小板に存在する
陽性マーカーであるＧＰＩｂと、活性化マーカーであるＣＤ６２（Ｐ−セレクチ
ン）である。ＧＰＩｂの欠失は血小板細胞膜障害の指標である。反対にＣＤ６２
の表面露出は、その発現が活性化誘導脱顆粒の結果であるので、自発的な活性化
の指標である。

【０５３０】 表２９は、６％ＤＭＳＯのみで、またはトロンボゾルと２％ＤＭＳＯで低温保
存した正常のドナーからの血小板でのこれらの機能的アッセイの結果を表してい
る。

【０５３１】

【表２９】

【０５３２】 これらの発見は、トロンボゾル安定化系が、細胞数の優れた回復を産出するこ
とを示唆している。さらに、トロンボゾル処置血小板に対する機能活性の保持は
、６％ＤＭＳＯで低温保存した血小板に比べてはっきりと高い。

【０５３３】 保存障害事象を排除するためのセカンドメッセンジャー処方の開発の結果は、
トロンボゾルが、細胞の障害および機能活性の欠失を典型的に引き起こす保存状
態下で血小板を保護することが可能であることを明らかに示唆している。低温保
存に対するトロンボゾル溶液の開発は、簡単に従来のフリーザーで保持できる温
度である−８０℃での血小板の保存を可能にするであろう。さらに、ＤＭＳＯ濃
度の減少またはＤＭＳＯのすでにヒトでの使用に関して承認されている他の無毒
性の凍結防止剤での置換が、保存したユニットの直接の輸血、したがって洗浄工
程の排除を可能にする可能性がある。洗浄手順の排除は、解凍工程に続く保存を
引き延ばすことを可能にする可能性があった。解凍後の保存を引き延ばした結果
、低温保存したユニットを保存および輸送することが可能であり得る。新鮮な血
小板と同様の特徴を表示している解凍後の細胞集団で、血小板の長期保存を提供
する能力によって、多くの血液バンク在庫供給問題が解決するであろう。

【０５３４】 患者包含基準 本研究に含めるために、患者は以下の基準を満たさなければならない。患者は
、シスプラチンでの処置を指示された婦人科学的悪性腫瘍を患っているべきであ
る。患者は＞１５歳の年齢である（本発明者の判断において、年齢は１３歳から
少なくとも１５歳）。十分な血液学的（ＡＮＣ＞１５００／ｍｍ^３、血小板数＞ １５０，０００／ｍｍ^３およびＨｂ＞１０ｇｍ／ｄｌ）、腎臓（血清Ｃｒ＞１．
５）、および肝臓機能（総ビリルビン＞１．５、ＳＧＰＴまたはＳＣＯＴ＞３×
正常）が示されなければならない。生存予想は＞３ヶ月であるべきであり、カモ
フスキー能力状態は＞８０であるべきである。患者はインフォームドコンセント
形式にサインすべきである。患者は、血液ドナー感染疾患試験を要求するＦＤＡ
に対して不応答性であるべきである。

【０５３５】 患者除外基準 患者は以下の理由で除外されるべきである。患者は早期の発達疾患を持つ。患
者は妊娠または授乳女性である。患者は患者を処置合併症の高リスクにするよう
な共存症状態である。患者はＣＮＳ転移の陽性経歴がある。患者は明らかな心臓
疾患（ＮＹＨＡ クラスＩＩＩまたはＩＶ）または不整脈であるか、研究に入る
６ヶ月以内に、ＭＩまたは虚血、一過性虚血性ショックまたはＣＶＡの病歴があ
る。患者は、４週間以内に先に化学療法、免疫療法および実験的薬剤を服用した
か、２週間以内に骨髄（Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ）成長因子または４週間
以内にエリスロポイエチンを使用した。患者は６週間以内にニトロソウレア（Ｂ
ＣＮＵ、ＣＣＮＵ）またはマイトマイシン−Ｃを使用した。患者は、研究に入る
２週間以内に先に手術またはＲＴを経験した。患者は骨盤放射線照射の前経歴を
持つ。患者は幹細胞移植での前高用量化学療法の経歴または長期化した血小板減
少症（＞２週間）の経歴を持つ。患者は白血病の病歴を持つ。患者はＩＴＰ、Ｔ
ＴＰを含む血小板不全または出血障害の経歴を持つ。患者は、＞３の先の化学療
法の経歴を持つ（すべての白金療法は１療法として計算する）。患者は白金に基
づいた治療への応答を欠くことを示している。

【０５３６】 処置計画 すべての患者を、患者データ処理系（ＰＤＭＳ）に登録した。患者を群Ａ（ｎ
＝１０）または群Ｂ（ｎ＝１０）に無作為化する。

【０５３７】 前化学療法相 すべての患者に以下のように血小板の前化学療法相アフェレーシスにおいてｒ
ｈＴＰＯを与える。まずｒｈＴＰＯを１．２ｍｃｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．×２用量（
１日目および４日目）で投与する。第二に、血小板フェレーシスを、１２日目ま
たは血小板数が＞７５０，０００／ｍｍ^３レベルまで到達するとき（いずれか最
初に来たとき）に開始する。フェレーシスは、最大４日間まで繰り返すことが可
能であり、２５０ユニットの血小板（〜３０×１０^１１血小板）を回収する。無
菌トロンボゾル／ＤＭＳＯ溶液を血小板濃縮物に添加し、混合してトロンボゾル
／ＤＭＳＯの均質分散を血小板内に確保する。最終ＤＭＳＯ濃度は容量にして２
％であろう。第３に、トロンボゾル保存溶液内の血小板を、５つの血小板保存バ
ッグ、それぞれおよそ６×１０^１１血小板に分割する。血小板バッグを冷凍カセ
ット内に置き、標準のフリーザー内の−８０℃に直接置く。

【０５３８】 第四に、輸血が必要なときに、冷凍カセットをフリーザーより取り出し、処置
した血小板ユニットを、ユニットが完全に解凍するまで直接３７℃水浴内に置く
。解凍した血小板試料をシェーカー上に置き、２２℃にて３０分間回転させ回復
を可能にさせる。第五に、血小板ユニットを９５０×ｇにて２０分間遠心して洗
浄し、トロンボゾルおよびＤＭＳＯを除去する。血小板を自己血漿内に懸濁させ
る。第六に、２ｍｌの部分をin vitro試験のために取り除く。この血小板試料を
記述したように機能活性の保持に関して試験する（円盤形態割合、ＥＳＣ、ＨＳ
Ｒ）。これらの試験はライフセル社にて実施する。第七に、（第一自己輸血事象
のために）選別患者において、トロンボゾル−処置低温保存血小板の一部分を標
準の技術にしたがって^１１１Ｉｎで放射標識した。標識の後、血小板試料を２回
、タイロード（ｐＨ＝７．２）緩衝液での遠心を介して洗浄し、最終的に自己血
漿で本来の容量まで懸濁させた。放射標識化血小板の特異的活性を試料に関して
測定した。最終血小板試料は３０ｕＣｉの^１１１Ｉｎを含む。血小板の放射標識
化試料を未標識化血小板と混合する。緩やかに攪拌して、２つの血小板集団の完
全な混合が起こるようにする。

【０５３９】 第八に、血小板を患者に再注入する。第九に、注入の後、血小板生存研究に参
加している患者において、１０ｍｌの血液試料を注入の２および２４時間後の時
点、および注入の２、４、６および１０日後の時点にバキュテイナーチューブ内
に吸い出す。注入した血小板集団の試料を放射標識化血小板の保持に関してガン
マ計数を介して解析するために保持した。全血の一部分を計数し、試料を４００
×ｇにて１２分間遠心して、血小板の豊富な血漿画分を作製する。このＰＲＰを
血小板機能におけるアイソトープの放射活性に関して測定する。最後に、血小板
の少ない血漿画分を９５０×ｇにて２２分間遠心して作製し、血漿中に残ってい
る全^１１１Ｉｎを測定する。初期クリアランス速度および循環の半減期を、さま
ざまな時間点で入手した放射標識化血小板に対する注射用量の比較によって決定
した。輸血後パーセント回復および生存の計算を、すでに記述したように血漿活
性に関する補正の後に多重ヒット解析を用いて実施した。コンピュータプログラ
ムを使用し、平均絶対数生存期間および残余生存期間を計算する。第十に、輸血
後血小板計数を１０分間、−１時および１８〜２４時点で行った。

【０５４０】 化学療法サイクル すべての患者にＡＵＣ１１にてカルバート式を用いて計算した用量でカルボプ
ラチンを与える。化学療法のサイクルは、血液数が回復する毎３週間毎に繰り返
す。化学療法の第一サイクルは、ｒｈＴＰＯの最初の投与から３週間で開始する
。

【０５４１】 血小板輸血 すべての患者に、以下のように最下点血小板数が＜１５，０００／ｍｍ^３であ
るときに血小板を輸血する。

【０５４２】 群Ａ サイクル−１：同種単一ドナー血小板 サイクル−２：自己低温保存血小板 群Ｂ サイクル−１：自己低温保存血小板 サイクル−２：同種単一ドナー血小板

【０５４３】 それぞれの活動は、サイクル−１（群Ａ）およびサイクル−２（群Ｂ）での同
種単一ドナー血小板を輸血するために行った。しかしながら、単一ドナー血小板
が入手不可能である場合、ほぼ同等のユニットの無作為ドナー血小板（１０ユニ
ット）を輸血する。使用する場合（群Ａに対するサイクル−２および群Ｂに対す
るサイクル−１）、自己血小板はまたほぼ同数の血小板（１０ユニット）を含む
。

【０５４４】 少なくとも安定であるか応答している疾患を患うすべての患者を、合計６サイ
クルのカルボプラチンまで続けてよい。サイクル３〜６の間、すべての患者（群
ＡおよびＢ）に、入手可能である限り、血小板減少症の間自己低温保存血小板を
輸血した。

【０５４５】 前処置評価 患者は、腫瘍測定での経歴および身体検査を完了する。研究室での研究には、
差でのＣＢＣ、血小板数、血清化学、（適用可能ならば）妊娠試験、尿解析、抗
ＴＰＯ抗体レベル、感染性疾患に関する血液バンクスクリーニング試験が含まれ
る。胸部ｘ線、ＥＫＧおよび腫瘍測定に関する他の放射線学研究を行う。

【０５４６】 研究中の評価 対象者を、研究中の安全性、身体的発見および腫瘍応答に関して綿密にモニタ
する。対象者は、研究の間の各訪問時に副作用に関して査定し、追跡調査する。
致命的な兆候を、それぞれの訪問時およびそれぞれのｒｈＴＰＯ投与前後に測定
した。さらに、研究室評価を以下のように行った。第一にＣＢＣ差異および血小
板数を少なくとも１週間に３回モニタした。さらに、日々の血小板数を、血小板
数が＜５０，０００／ｍｍ^３である場合に行う。第二に、血小板輸血の後、輸血
１時間および２時間後血小板数を確認する。第３に、血清化学および抗ＴＰＯ抗
体をそれぞれの化学療法サイクルの前に確認する。第四に血小板生存研究に参加
する意志のある５人の患者において、血液を抜き、記述する。第五に、選別患者
において、血小板機能（エクスビボ）を、同種および自己血小板の輸血の２４時
間後に試験する。

【０５４７】 評価の基準 安全性評価 患者を、上述のように安全性評価に関して綿密に試験する。患者を、試験期間
中および追跡調査での各訪問時に処置および血小板輸血に関連した副作用に関し
て査定する。

【０５４８】 輸血効力 血小板輸血の効力の第一の測定は、以下の式にしたがった訂正数増加量（ＣＣ
Ｉ）によって測定したような、輸血後１時間および２４時間時の血小板数の増加
であろう。 ＣＣＩ＝（Ｔｘ後数−Ｔｘ前数）ＢＳＡ／Ｐｌｔ ｔｘｅｄ数×１０^１１

【０５４９】 選別患者（〜５人の患者）において^１１１Ｉｎ標識化血小板生存研究を、自己
および同種血小板輸血後に行い、輸血後パーセント回復および生存を上述のよう
に計算する。選別患者（〜５人の患者）において、鋳型出血時間を、自己および
同種血小板の輸血後に行い、低血小板数と異常に関連した出血時間の補正を査定
する。

【０５５０】 腫瘍応答 婦人科学的悪性腫瘍に関する標準応答基準を使用する。

【０５５１】 治療中止の基準 婦人科学的悪性腫瘍に関する標準応答基準を使用する。治療は、初期応答また
は失敗の後に進行性の疾患がある場合、治療の２つの系、予期しない、不可逆性
のまたはグレード４非造血毒性、プロトコール必要条件を持つ患者またはプロト
コールの継続を拒んだ患者による非承諾として定義される許容不可能な毒性を最
小化するために中止する。

【０５５２】 統計学的考察 これはトロンボゾルと２％ＤＭＳＯで低温保存したｒｈＴＰＯ刺激自己血小板
の輸血の安全性および可能性を評価するための予備的臨床研究である。本研究の
予備的性質および試料サイズの小ささを考え、単純な記述統計学を試験結果とし
て準備する。形態、細胞回復および凍結−解凍した血小板の機能活性を査定する
。低温保存した自己血小板および新鮮な同種単一ドナー血小板で観察された血小
板増加量（輸血後１時間および２４時間）をサイクル数によって表にする。同様
に血小板生存（すなわち^１１１Ｉｎ標識化血小板研究）および血小板機能（すな
わち鋳型出血時間の補正）の他の測定もまた、自己低温保存した血小板および同
種の新鮮な血小板を使用したサイクルによって表にした。本試験より生成したデ
ータは、本戦略が安全で効果的であるとわかった場合、さらなる正式な第Ｉ−Ｉ
ＩＩ試験の設計の助けとなるであろう。

【０５５３】 実施例１３ トロンボゾル（ＴｒｏｍｂｏＳｏｌ^ＴＭ）と２％ＤＭＳＯを使用した組換え体ヒ
トトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）−処置ドナーからの血小板の低温保存 試験設計 血小板を化学療法後のｒｈＴＰＯ−処置患者から単離した。トロンボゾルとＤ
ＭＳＯ（最終２％）をＰＲＰに添加し、血小板を−８０℃フリーザー内で凍結さ
せた。血小板を４８時間後に解凍し、in vitro機能活性に関してアッセイした。

【０５５４】 結果 表３０は、トロンボゾルと２％ＤＭＳＯで低温保存した血小板の機能的パラメ
ータを表示している（平均＋／−標準偏差）。

【０５５５】

【表３０】

【０５５６】 結論 トロンボゾルおよび２％ＤＭＳＯで低温保存したｒｈＴＰＯ−刺激血小板は、
優れた細胞数および機能活性を保持し、自己血小板の保存に関する実現性のある
方法を表している可能性がある。

【０５５７】 実施例１４ トロンボゾル（ＴｈｒｏｍｂｏＳｏｌ^ＴＭ）と２％ＤＭＳＯでの低温保存の後の
ｒｈＴＰＯ誘導血小板のin vitro機能活性の保持の増強 ｒｈＴＰＯ−刺激血小板を低温保存する能力によって、化学療法後の血小板減少
症における自己血小板の使用が可能になる可能性があった。運悪く、５％または
６％ＤＭＳＯを用いた血小板低温保存のための現在の改善された方法は、労力が
大きく、結果として細胞数および機能活性の欠失となる。トロンボゾルは、血小
板に対して内因性の特異的活性化経路を阻害する第二メッセンジャー効果器から
なる血小板安定化溶液である。先行するデータは、トロンボゾルの血小板の低温
保存への適用が、工程の簡素化、ＤＭＳＯの２％までの減少および細胞数および
機能活性の優れた解凍後保持を可能にすることを示唆した。本研究は、ｒｈＴＰ
Ｏ処置後の患者由来の血小板におけるトロンボゾル低温保存の効果を調査する。
ｒｈＴＰＯ−処置患者または対照ボランティアから単離したＰＲＰを、in vitro
にて血小板機能活性に関して試験した。次いで試料をトロンボゾルと２％ＤＭＳ
Ｏで処理し、直接−８０℃フリーザー内に置いた。保存後、血小板を解凍し、in vitroで血小板機能活性の保持に関して試験した。表３１は、低温保存前および
後の、１０人の化学療法後ＴＰＯ処置患者から、および健康なボランティアから
の血小板より得られた結果を表示している。

【０５５８】

【表３１】

【０５５９】 ｒｈＴＰＯ−誘導および対照血小板両方が、新鮮な細胞としてアッセイした場
合に、in vitroにて同様の機能活性を示した。トロンボゾルと２％ＤＭＳＯでの
低温保存後、ｒｈＴＰＯ処置患者からの血小板は、多くのin vitroでの機能活性
のより高い保持を示し、光学および超微細構造形態によって全般的に形態学的に
正常に見えた。さらに、予備的データは、ｒｈＴＰＯ刺激血小板が、低温保存の
１ヶ月および３ヶ月後にその高いレベルのin vitro機能活性を保持することを示
唆している。トロンボゾルと２％ＤＭＳＯの使用はしたがって、化学療法後輸血
のための自己ｒｈＴＰＯ誘導血小板を低温保存するための本質的に有用な方法を
表している。

【０５６０】 本明細書で開示し、請求したすべての方法は、本開示物に照らし不適切な実験
なしに作製および実行可能である。本発明の組成物および方法は、好ましい実施
様態に関して記述したが、変形が、本発明の概念、意志および意図から逸脱しな
い限り、本明細書で記述した方法および工程内または連続した方法工程内で適用
してよいことが当業者に明らかであろう。さらにとりわけ、化学的および生理学
的両方で関連した特定の薬剤を、同一のまたは同様の結果が成し遂げられるなら
ば、本明細書に記述した薬剤と置換してもよいことが明らかになるであろう。当
業者に明らかであるそのような同様の置換物および変更は、付随する請求項によ
って定義されるような本発明の意志、意図および概念の範囲内であると考えられ
る。

【０５６１】 文献 以下の文献は、それが例示的手法または本明細書中に記載したものを補足する
他の詳細を提供する限りにおいて、具体的に引用して本明細書の記載の一部とす
る。 U.S. Patent No. 5,851,984 U.S. Patent No. 5,851,451 U.S. Patent No. 5,837,693 U.S. Patent No. 5,837,544 U.S. Patent No. 5,830,682 U.S. Patent No. 5,830,647 U.S. Patent No. 5,814,517 U.S. Patent No. 5,795,569 U.S. Patent No. 5,792,850 U.S. Patent No. 5,766,897 U.S. Patent No. 5,766,581 U.S. Patent No. 5,756,083 U.S. Patent No. 5,753,462 U.S. Patent No. 5,744,587 U.S. Patent No. 5,741,899 U.S. Patent No. 5,733,746 U.S. Patent No. 5,712,094 U.S. Patent No. 5,707,803 U.S. Patent No. 5,696,250 U.S. Patent No. 5,648,219 U.S. Patent No. 5,641,655 U.S. Patent No. 5,593,666 U.S. Patent No. 5,571,686 U.S. Patent No. 5,384,331 U.S. Patent No. 5,310,550 U.S. Patent No. 5,260,417 U.S. Patent No. 5,250,732 U.S. Patent No. 5,155,211 U.S. Patent No. 5,126,325 U.S. Patent No. 4,894,440 Alvarez, Gates, Brady, "Complications from intra-aortic balloon counterp
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【０５６２】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 治療スケジュールのスキーム。ｒｈＴＰＯを、３週間前および第二サイクルの
カルボプラチン（Ｃで標識）（ＡＵＣ＝１１）後に、単一用量として皮下注射に
より、用量レベル０．６、１．２、２．４、または３．６ｍｃｇ／ｋｇで投与し
た（ｒｈＴＰＯを矢印で標識）。各矢印は１用量を示す。

【図２】 左のパネルは、循環血小板数に対するｒｈＴＰＯの用量効果を示す。様々な用
量のｒｈＴＰＯ後の、基線からの最大比率増加（平均±ＳＥＭ）を示す。右のパ
ネルは、１用量のｒｈＴＰＯ後の血小板応答の動力学を示す。得られたデータは
、全患者（ｎ＝１６）の平均値を示す。

【図３】 サイクル−１（実践）のカルボプラチン単独と比較した、サイクル−２（点線
）のカルボプラチン後の平均血小板数に対する二次予防として使用したｒｈＴＰ
Ｏ（２、４、６、８日目に１．２ｍｃｇ／ｋｇ）の効果（ｎ＝６）。暗く影のあ
る領域は、サイクル２での血小板減少症の程度および期間を示し、軽く影のある
領域は、サイクル１での血小板減少症の程度および期間を示す。

【図４Ａ】 カルボプラチンのみを用いたサイクル−１（実線）（その間に患者が２回の血
小板輸血を必要とした）と比較した、サイクル−２（点線）におけるカルボプラ
チン後に二次予防として使用したｒｈＴＰＯ（−１、１、３、５日目に１．２ｍ
ｃｇ／ｋｇ）と血小板輸血の必要性を軽減する、血小板最下点の減少および血小
板回復の増強の例（Ｔｘを矢印で示す）。暗く影のある領域は、サイクル２での
血小板減少症の程度および期間を示し、軽く影のある領域は、サイクル１での血
小板減少症の程度および期間を示す。

【図４Ｂ】 カルボプラチン単独ではサイクル−２において重度の血小板減少症と記録され
、血小板輸血（Ｔｘを矢印で示す）を必要としている患者の二次予防として使用
したｒｈＴＰＯ（−１、１、３、５日目に１．２ｍｃｇ／ｋｇ）を用いたサイク
ル−３の、累積的な重度の血小板減少症および血小板輸血の必要性の抑止の例。
影のある領域は、各サイクルの血小板減少症の程度および期間を示す。

【図５】 左パネルは、＞５０，０００／ｍｍ^３（Ｐ＜０．０１９）まで血小板が回復す
るまでの時間を示し、右パネルは、サイクル−１（ｒｈＴＰＯを用いない）およ
びサイクル−２（ｒｈＴＰＯを用いる）での＞１００，０００ｍｍ^３（Ｐ＜０．
０１７）まで回復するまでの時間を示す。ＴＰＯは、サイクル−１に対して、サ
イクル−２において、＞５０，０００／ｍｍ^３（左パネル）、および＞１００，
０００／ｍｍ^３まで血小板回復を増強した。

【図６】 ＡＩ化学療法誘導血小板減少症に対するｒｈＴＰＯ（スケジュールＩ：１前用
量および３後用量）に対するｒｈＴＰＯの効果。詳細については実施例８参照。

【図７】 ＡＩ化学療法誘導血小板減少症に対するｒｈＴＰＯ（スケジュールＩＩ：２前
用量および２後用量）の効果。詳細については実施例８参照。

【図８】 ＡＩ化学療法誘導血小板減少症に対するｒｈＴＰＯ（スケジュールＩＩＩ：３
前用量および１後用量）の効果。詳細については実施例８参照。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 35/14 Ａ６１Ｋ 45/00 45/00 Ａ６１Ｐ 7/00 Ａ６１Ｐ 7/00 35/00 35/00 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ Ｆターム(参考） 4C076 AA29 BB12 CC14 FF65 4C084 AA02 AA19 BA44 CA26 DB55 MA01 MA02 MA44 MA65 NA06 NA14 ZA511 ZA512 ZB262 ZC022 4C086 AA01 AA02 DA35 EA10 MA02 MA04 MA07 MA44 MA65 NA06 NA14 ZA51 ZB26 ZC02 4C087 AA01 AA02 BB38 CA21 DA21 MA01 MA02 MA44 MA65 NA06 NA14 ZA51 ZB26 ZC02 4C206 AA01 AA02 JB14 MA02 MA04 MA24 MA28 MA64 MA85 NA06 NA14 ZA51 ZB26 ZC02

Claims (47)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血小板減少症に罹患しているかまたはその危険性のある哺乳
   動物を治療する方法であって、 （ａ）血小板減少症を引き起こし得る薬剤を哺乳動物に投与するステップと、 （ｂ）前記薬剤の投与前に、１またはそれ以上の初回刺激用量のトロンボポエ
   チン（ＴＰＯ）を含む組成物を哺乳動物に投与するステップと、 （ｃ）前記薬剤の投与後に、１またはそれ以上の後用量のＴＰＯ組成物を哺乳
   動物に投与するステップと を含む方法。
2. 【請求項２】 少なくとも２初回刺激用量のＴＰＯ組成物を投与する請求項
   １の方法。
3. 【請求項３】 少なくとも３初回刺激用量のＴＰＯ組成物を投与する請求項
   ２の方法。
4. 【請求項４】 少なくとも４初回刺激用量のＴＰＯ組成物を投与する請求項
   ３の方法。
5. 【請求項５】 少なくとも５初回刺激用量のＴＰＯ組成物を投与する請求項
   ４の方法。
6. 【請求項６】 少なくとも６初回刺激用量のＴＰＯ組成物を投与する請求項
   ５の方法。
7. 【請求項７】 少なくとも２後用量のＴＰＯ組成物を投与する請求項１の方
   法。
8. 【請求項８】 少なくとも３後用量のＴＰＯ組成物を投与する請求項７の方
   法。
9. 【請求項９】 少なくとも４後用量のＴＰＯ組成物を投与する請求項８の方
   法。
10. 【請求項１０】 少なくとも５後用量のＴＰＯ組成物を投与する請求項９の
    方法。
11. 【請求項１１】 少なくとも６後用量のＴＰＯ組成物を投与する請求項１の
    方法。
12. 【請求項１２】 初回刺激用量または後用量が、毎日以外で投与される請求
    項１の方法。
13. 【請求項１３】 用量が、隔日に投与される請求項１２の方法。
14. 【請求項１４】 前記薬剤の最下点が約１０〜約１４日目である請求項１の
    方法。
15. 【請求項１５】 前記薬剤は、イフォスファミド、アドリアマイシンまたは
    その組合せである請求項１４の方法。
16. 【請求項１６】 前記薬剤が、約３〜約５日間の期間にわたって投与される
    請求項１の方法。
17. 【請求項１７】 前記薬剤は、イフォスファミド、アドリアマイシンまたは
    その組合せである請求項１６の方法。
18. 【請求項１８】 血小板減少症に罹患しているかまたはその危険性のある哺
    乳動物を治療する方法であって、 （ａ）血小板減少症を引き起こし得る薬剤を哺乳動物に投与するステップと、 （ｂ）前記薬剤の投与前に、１またはそれ以上の初回刺激用量のＴＰＯ含有組
    成物を哺乳動物に投与するステップと を含む方法。
19. 【請求項１９】 ６までの初回刺激用量のＴＰＯ組成物を投与する請求項１
    ８の方法。
20. 【請求項２０】 プライム用量が毎日以外で投与される請求項１８の方法。
21. 【請求項２１】 用量が隔日に投与される請求項２０の方法。
22. 【請求項２２】 前記薬剤の最下点は、約１０〜約１４日目である請求項１
    ８の方法。
23. 【請求項２３】 前記薬剤は、イフォスファミド、アドリアマイシンまたは
    その組合せである請求項２２の方法。
24. 【請求項２４】 前記薬剤が、約３〜約５日間の期間にわたって投与される
    請求項１８の方法。
25. 【請求項２５】 前記薬剤は、イフォスファミド、アドリアマイシンまたは
    その組合せである請求項２４の方法。
26. 【請求項２６】 血小板減少症に罹患しているかまたはその危険性のある哺
    乳動物を治療する方法であって、 （ａ）血小板減少症を引き起こし得る薬剤を哺乳動物に投与するステップと、 （ｂ）前記薬剤の投与後に、２またはそれ以上の後用量のＴＰＯを含む組成物
    を哺乳動物に投与するステップと を含み、後用量が毎日以外で投与されることを特徴とする方法。
27. 【請求項２７】 １５までの後用量のＴＰＯ組成物を投与する請求項２６の
    方法。
28. 【請求項２８】 用量が隔日に投与される請求項２６の方法。
29. 【請求項２９】 前記薬剤の最下点は約１２〜約２５日目である請求項２６
    の方法。
30. 【請求項３０】 前記薬剤の最下点は約１５〜約１８日目である請求項２９
    の方法。
31. 【請求項３１】 前記薬剤はカルボプラチンである、請求項２９の方法。
32. 【請求項３２】 前記薬剤は約１〜約５日間の期間におよび投与する、請求
    項２６の方法。
33. 【請求項３３】 前記薬剤は約１〜約２日間の期間におよび投与する、請求
    項３２の方法。
34. 【請求項３４】 前記薬剤はカルボプラチンである請求項３２の方法。
35. 【請求項３５】 血小板を保存する方法であって、 （ａ）１またはそれ以上の用量以上の血小板上昇組成物を含む組成物を哺乳動
    物に投与するステップと、 （ｂ）哺乳動物により産生される血小板を収集するステップと、 （ｃ）適切な薬剤とともに血小板を保存するステップと を含む方法。
36. 【請求項３６】 前記血小板上昇組成物は、ＴＰＯ、ＮＧＤＦ、ｃ−ＭＰＬ
    リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＴＰＯ活性ペプチド模倣体、トロ
    ンボポエチン受容体アゴニスト、サイトカイン受容体アゴニスト、またはそれら
    の組合せである請求項３５の方法。
37. 【請求項３７】 前記適切な薬剤は、トロンボソール、ＴＰＯおよびＤＭＳ
    Ｏの組合せである請求項３５の方法。
38. 【請求項３８】 前記血小板を前記哺乳動物に輸血するステップをさらに含
    む請求項３５の方法。
39. 【請求項３９】 血小板減少症に罹患した哺乳動物を治療する方法であって
    、１またはそれ以上の用量のＴＰＯ含有組成物を哺乳動物に投与するステップを
    含み、前記用量は、毎日以外で投与される前記方法。
40. 【請求項４０】 前記用量は隔日に投与する、請求項３９の方法。
41. 【請求項４１】 前記血小板減少症は、筋異形成症、再生不良性貧血、先天
    性血小板減少症、免疫性血小板減少症、後天性血小板減少症、肝疾患、細菌感染
    、ウイルス感染、またはそれらの組合せにより引き起こされる請求項３９の方法
    。
42. 【請求項４２】 血小板減少症の治療のためにＴＰＯと共に投与される医薬
    の製造における凍結保存物の使用。
43. 【請求項４３】 血小板減少症を引き起こし得る薬剤を投与する約１０〜８
    日前または約１６〜約２１日後に、１回またはそれ以上、動物に投与する、医薬
    の製造におけるＴＰＯの使用。
44. 【請求項４４】 血小板減少症を引き起こし得る薬剤の投与の約１０〜２日
    前に１回またはそれ以上、およびかかる薬剤の投与後の２１日目までに１回また
    はそれ以上、動物に投与する医薬の製造におけるＴＰＯの使用。
45. 【請求項４５】 動物に１回またはそれ以上投与する医薬の製造におけるＴ
    ＰＯの使用であって、初回投与は、血小板減少症を引き起こし得る薬剤の治療サ
    イクルにおいて、前記薬剤の投与の８日以上前であることを特徴とする使用。
46. 【請求項４６】 血小板減少症を引き起こし得る薬剤の治療サイクルにおい
    て、前記薬剤の投与の約１０日前から１回またはそれ以上、および、かかる薬剤
    の投与後の２１日目までに１回またはそれ以上、動物に投与する医薬の製造にお
    けるＴＰＯの使用。
47. 【請求項４７】 血小板減少症を引き起こし得る薬剤の治療サイクルにおい
    て、１またはそれ以上の用量を、前記薬剤の投与の約１０日前から、かかる薬剤
    の投与後の２１日目までに１回またはそれ以上、動物に投与する医薬の製造にお
    けるＴＰＯの使用。