KR101132858B1 - 내피전구세포의 체외 증폭방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 내피전구세포(Endothelial Progenitor Cells, EPC)의 선택적 증폭 또는 분화를 향상시키는 생체외(ex vivo) 배양 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 SCF, FLT-3L, IL-3 및 bFGF를 함유하는 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 CD34+ 세포 분획을 배양하는 내피전구세포의 증폭방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 내피전구세포의 증폭방법은 내피전구세포를 효과적으로 증폭시킬 수 있을 뿐만 아니라 내피세포로의 분화율도 향상시킬 수 있으므로 신생혈관형성 및 허혈성질환을 예방 또는 치료하는데 매우 유용하게 사용할 수 있다.

Description

내피전구세포의 체외 증폭방법{A Method for ex vivo expansion of Endothelial Progenitor Cells}

본 발명은 내피전구세포(Endothelial Progenitor Cells, EPC)의 증폭 또는 분화를 증강시키는 생체외(ex vivo) 배양 방법 및 증폭된 내피전구세포 집단을 함유하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

성인의 혈관 신생 과정은 기존의 혈관으로부터 성숙된 내피세포가 증식, 이동, 분화함으로써 진행되는 혈관신생(angiogenesis)에 의하여 주로 발생하는 것으로 알려져 있다. 이와 대조적으로 배아(embryo) 초기에는 내피세포의 전구세포인 혈관모세포(angioblast)가 in situ로 분화하는 혈관형성(vasculogenesis) 과정으로 일차 혈관망을 형성한다. 배아낭에서는 조혈모 줄기세포가 중앙에 위치하고 혈관모세포가 주위를 둘러싸는 혈도(blood island)를 이루는 특징을 나타낸다. 그러나 이러한 패러다임은 Asahara 등이 성인의 말초 혈액에서 순환하는 혈관내피 전구세포(EPC：endothelial progenitor cell)의 존재와 허혈성 실험동물 모델 및 암 이식 실험 동물모델에 EPC를 투여하여 이종, 동종 및 자가 EPC들이 신혈관 형성이 활발한 부위에 존재하는 것을 증명한 뒤, 성인의 신생 혈관 형성에는 혈관신생 뿐만 아니라 혈관형성도 관여한다는 새로운 국면을 맞게 되었다.

말초 혈액에 순환하는 성숙된 내피세포가 존재한다는 기존의 여러 연구 보고에서 이들 세포는 아마도 혈관벽으로부터 탈락한 뒤 순환하는 것으로 생각되었고, 수술 후 손상이나 혈관내 혈류의 와류가 증가함에 따라 유발될 수 있는 것으로 생각되었다. 그러나, 성인 말초혈액에서 연구된 혈관내피 전구세포(EPC)도 순환하고 증식하며 이동하고, 성숙된 내피세포로 분화할 수 있는 능력을 갖춘 혈관모세포와 성격이 유사하다.

혈관내피 전구세포(EPC)로 분화할 수 있는 일부 혈액 단핵구 세포들에 대한 연구 결과들로, 골수 이식 동물 모델을 이용하여 허혈을 유발하거나, 암 이식후, 신혈관형성에 기여한 세포가 공여자 타입인 것을 증명하여 순환하는 EPC가 골수에서 유래한다는 보고도 있었다. 또한, 혈관내피 전구세포는 말초 혈액뿐만 아니라 골수 또는 제대혈에서도 존재하고 이는 성인 줄기세포의 주요한 공급원이라는 내용이 보고된 바 있다.

제대혈이 조혈모세포의 풍부한 원천으로 알려진 이후, 임상적으로 제대혈 이식을 통해 혈액 관련 질환을 치료하고자 하는 시도가 많이 이루어지고 있으며, 자가이식 치료를 위하여 제대혈을 냉동시켜 수년 후 사용가능한 상태로 보존하는 제대혈 은행이 국내에서도 활성화되고 있다. 제대혈은 골수와는 달리 분만 과정에서 버려지는 제대(Umbilical cord)에서 간단한 시술을 통해 얻을 수 있으며, 그 양에 비해 수많은 조혈모세포 및 줄기세포를 포함하고 있다.

한편, 허혈성 심혈관질환은 미국에서는 성인 사망률이 1위인 질환이며, 국내에서도 유병률과 사망률이 증가 추세에 있는 현대 의학의 미해결 분야이다. 새로운 치료법으로 대두한 유전자 치료법도 협심증, 허혈성 하지질환등 허혈성 심혈관질환에서 치료적 신생혈관 조성술의 목적으로 angiogenic growth factor(VEGF ：vascular endothelial growth factor, bFGF：basic fibro-blast growth factor)를 이용한 유전자치료의 Phase I/II 임상 실험에서 비교적 긍정적인 결과들을 보고하고 있으나, 아직은 안전성 및 효능성에 많은 문제점이 있다. 그러나 21세기는 체외증폭된 혈관내피 전구세포를 이용한 효율적인 세포 치료 또는 유전자 치료에서 혈관내피 전구세포가 자가 벡터로서 사용 가능한 차세대 치료적 신생혈관 조성술로 임상적용이 가능하리라 사료된다.

현재 혈관내피 전구세포 연구 분야에서 혈관내피 전구세포의 배양시 증폭 및 분화 과정에 대한 자세한 연구는 부족한 실정이며, 단지 증폭방법이나 분화 및 성장 기간의 차이점 등을 서로 다르게 관찰하여 보고한 논문들이 있을 뿐이다(Asahara T et al., Cir Res, 1999;85:221-8; Shi Q et al., Blood 1998;92:362-7; Boyer M et al., J Vasc Surg 2000;31:181-9). EPC에는 현재까지 두 가지 타입의 세포들이 존재한다고 보고되었는데, 부착 배양시 1-7일 만에 방추형 모양으로 성장하고 증폭이 잘되지 않아 4 주 후에는 죽는 양상을 보이는 early EPC와 2-3 주 후부터 클로날 증폭(clonal expansion)하여 자갈 모양으로 나타나게 되는 late EPC가 있으며(Hur et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol , 2004:24:288-293), 현재 까지 임상에 적용된 체외배양된 EPC는 early EPC이다 (Schachinger et al., J Am Coll Cardiol, 2004;44:1690-1699). 그러나, 종래의 early EPC 증폭 방법은 부착 배양법으로 임상에서 사용하기에 충분히 효율적이지 않고, CD34 양성세포 분획의 부착성 배양(adhesive culture) 효율 역시 높지 못한 문제가 있다(Murohara et al., J Clin Invest, 2000:105:1527-1536).

이에, 본 발명자들은 임상 적용에 유리한 무혈청 배지를 기본으로 제대혈에서 유래하는 혈관내피 전구세포 중 임상 적용이 보다 유력한 early EPC의 생체외 증폭 및 분화방법에 대한 연구를 거듭한 결과, 세포 치료에 주요한 체외 증폭(ex vivo expansion) 기술과 관련하여 비부착 배양과 특정 사이토카인의 조합 효과를 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 내피전구세포(Endothelial Progenitor Cells, EPC)를 선택적으로 증폭시킬 수 있는 사이토카인의 조합 및 이에 근거한 내피전구세포의 증폭방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 CD34 양성세포의 비율이 높게 유지되도록 CD34+ 세포분획을 증폭시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 증폭된 내피전구세포 집단 및 이를 유효성분으로 함유하는 신생혈관 형성용 조성물 또는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 내피전구세포의 혈관내피세포로의 효과적인 분화 유도 조건을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CD34+ 세포 분획을, SCF(Stem Cell Factor), FLT-3L(FLT-3 ligand), IL-3(interleukin-3) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 함유하는 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 내피전구세포의 증폭(expansion) 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배양은 비-부착성(non-adhesive) 체외(ex vivo)배양일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CD34+세포 분획은 CD34+세포가 30~82%로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 내피전구세포의 증폭은 CD34+세포 분획의 증폭 배양에 의해 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 내피전구세포의 증폭은 증폭 전의 64~1468 배로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 내피전구세포는 골수, 말초혈액 및 제대혈로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 조직으로부터 유래될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 내피전구세포는 인간 제대혈로부터 유래된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은, CD34+ 세포를 SCF, FLT-3L, IL-3 및 bFGF를 함유하는 무혈청 배지에서 비-부착성 체외 배양함으로써 내피전구세포를 선택 증폭(증식)시키는 단계; 및 상기 증폭된 내피전구세포 집단을 내피세포 분화 조건에 두는 단계를 포함하는, 내피전구세포의 내피세포로의 분화방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 총 CD34+ 세포가 30~82%로 이루어진 CD34+ 세포 분획; 및 SCF, FLT-3L, IL-3, bFGF를 함유하는 것을 특징으로 하는 내피전구세포(EPC)의 증폭 또는 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 내피전구세포의 증폭방법에 의해 제조되고, CD34+ 세포, SCF, FLT-3L, IL-3 및 bFGF를 함유하며, 증폭 전의 64~1468 배로 증폭된 내피전구세포 집단을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 증폭된 내피전구세포 집단은, 증폭전보다 높은 비율의 아세포(blast), 미성숙 단핵구 및 비만 세포로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 세포를 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 증폭된 내피전구세포 집단을 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

나아가 본 발명은 본 발명의 방법으로 증폭된 내피전구세포 집단을 유효성분으로 포함하는 신생혈관 형성용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 내피전구세포의 체외 증폭방법은 내피전구세포를 효과적으로 증폭시킬 수 있을 뿐만 아니라 내피세포로의 분화율도 향상시킬 수 있는 효과가 있고, 특히, 제대혈에서 유래한 일부 CD34+ 분획 세포들은 내피전구세포의 증폭 및 분화에 크게 기여할 수 있는 효과가 있어 혈관형성을 위한 세포치료에 응용할 수 있을 뿐만 아니라 신생혈관형성에 의한 허혈성 질환의 치료 및 예방에도 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 각 사이토카인의 조합으로 ULA plate에서 배양된, CD34+ 세포, CD34-세포 및 MNC 분획의 TNC 계수 결과이다.
도 2는 CD34+ 세포 분획으로부터 증폭된 세포들에 대한 세포 노화-관련 β-gal 분석결과이다.
도 3은 CD34+ 분획-유래 및 MNC-유래 증폭된 세포들의 부착 분화 유도 후 ac-LDL 섭취능 및 UEA-1 결합양상을 관찰한 결과이다.
도 4는 증폭 전후 세포에 대해 부착 분화 유도 후 ac-LDL 및 UEA-1 양성 반응을 나타내는 세포들을 계수한 결과이다.
도 5는 CD34+ 분획-유래 증폭된 세포들의 부착 분화 유도 후 부착성 세포들에 대해 CD31, VE-Cadherin, KDR (VEGFR 2), 및 vWF의 발현여부를 관찰한 결과이다.
도 6은 bFGF 첨가가 EPC 증폭 배율 및 분화율에 미치는 영향과, SFIb, STG 두 사이토카인 조합간의 차이를 살펴본 결과이다.
도 7은 LDPI 분석을 이용하여 대퇴부위에서 허혈성/비-허혈성 대퇴 혈류의 비율을 관찰한 결과이다.
도 8은 fluorescein BS lectin I를 이용하여 수행한 허혈성 조직의 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis)에 따른 혈관 밀도(vessel density)의 변화를 관찰한 결과이다.
도 9는 증폭된 세포들이 in vivo 신혈관신생서 혈관에 삽입되는 지 알아보기 위한 BS-lectin I 염색 결과이다.
도 10은 EPC 증폭 배양조건에서 다른 타입의 혈구세포로의 분화가 일어났는지 형태학적으로 조사한 결과이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 하기에 기술된 바와 같다.

본 발명에서 '전구세포(progenitor cell)'는 자기 복제능 및 분화능(differentiation potency)을 가진 미분화 세포이지만, 최종적으로 분화하는 세포의 종류가 이미 결정되어 있는 궁극적으로 분화된 세포를 말한다. 전구세포는 분화 경로가 예정되어 있지만, 일반적으로 성숙한 완전히 분화된 세포의 마커를 발현하지 않거나, 성숙한 완전히 분화된 세포로서는 기능하지 않는다. 따라서 전구세포는 관련 세포 타입으로 분화되지만 정상적인 상태에서는 매우 다양한 세포 타입을 형성할 수 없으며, 대표적인 전구세포의 종류로는 신경전구세포 또는 내피전구세포 등이 있다.

또한, '혈관내피세포'는 혈관의 내피를 구성하는 세포를 말하는 것으로, Tie-1, Tie-2, Flk-1, PECAM-1, CD34, VE-cadherin, eNOs 등의 마커를 발현시키는 세포를 말한다.

'배지'는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외에서 세포 등의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 말한다. 특히, 본 발명의 배지는 내피전구세포의 증폭 및 이의 혈관내피세포로의 분화를 위한 배지이다.

'기본배지'는 세포가 살아가기 위해 필요한 필수적인 당, 아미노산, 물 등이 포함된 혼합물로서, 혈청, 영양 물질 및 각종 성장인자를 제외한 혼합물이다. 본 발명의 기본배지는 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 배지는 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EDM(Endothelial differentiation medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시예에서는 Stemline-II와 M199를 사용하였다.

'혈청'은 동물 또는 사람의 혈액으로부터 원심분리하여 얻을 수 있는 상층액을 말하는 것으로서, 상기 혈청은 세포의 성장시 필요한 필수 영양소 이외에 성장에 필수적이나 명확히 규명되지 않은 각종 무기염, 폴리펩타이드성 성장인자, 및 폴리펩타이드성 호르몬 등의 각종 인자를 포함하는 미량원소를 포함할 수 있다.

'분화(differentiation)'는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.

'증식(proliferation)' 또는 '증폭(expansion)'이라는 용어는 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다. 세포수가 증식(증폭)되어 어느 시기에 이르면, 형질이 변화(분화)되어 가는 것과 동시에 제어되고 있는 것이 일반적이다. 체내에서 세포가 증가되어 가는 것과, 또한 세포 내에서 세포질이 신생(新生)되어 가는 경우에는 생장으로 구별하는 경우가 많다. 그러나 생물학적으로 세포수가 증가된다는 점에서 보면, 다세포생물의 발생기에서 분화가 일어나지 않는 시기는 증식(증폭)으로 보는 것이 타당하며, 본 발명에서는 상기 세 용어가 혼용되어 사용된다.

'체외증폭'(ex vivo expansion)‘이란 생체로부터 세포를 분리하여 배양시키는 경우 유의한 줄기세포를 시험관 내에서 높은 수준으로 증식 또는 증폭시키는 것을 말한다.

한편, 본 발명자들은 내피전구세포를 임상적으로 유용할 수 있을 정도로 개체수를 증폭시킬 수 있는 방법을 연구하던 중, 특히, 제대혈 유래의 내피전구세포에서 CD34 양성세포 분획을 특정 사이토카인의 조합에 의해 비-부착성 배양(non-adhesive culture)시킴으로써 내피전구세포를 현저히 증폭시킬 수 있을 뿐만 아니라 이렇게 증폭된 내피전구세포가 내피세포로의 분화가 더욱 용이함을 발견하였고 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 일 관점에서, CD34+ 분획(세포)을 SCF(stem cell factor), FLT-3L, IL-3(Interleukin-3) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 함유하는 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 내피전구세포를 증폭시키는 방법을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명은 내피전구세포의 증폭을 위해 CD34 양성세포를 비-부착성 증폭(non-adhesive expansion)배양시킬 수 있는데, 특히 본 발명은 단핵구세포(mononuclear cells) 또는 CD34 음성세포보다 CD34 양성세포의 증폭으로 인해 약 64 ~ 1468배에 이르는 내피전구세포의 증폭효과를 얻을 수 있다.

일반적으로 CD34 항원은 분자량이 116 kDa의 글리코포스포프로테인으로서, 1번 염색체의 장완에 그 유전자가 존재하고 있으며, 정상 골수 세포의 1?2% 정도에서 발현 되는데, 특히 초기 조혈 전구세포에서 발현된다. 최근 인간의 조혈 줄기세포의 표면형 중 하나인 CD34 양성 세포가 베토 활성(veto activity)을 가진다는 것이 보고된 바 있는데, 베토 세포는 전통적으로 CD8 양성이면서, Fas 리간드와 class I MHC를 발현하는 세포로서, 동종 줄기 세포 이식에서 면역거부반응을 담당하는 T 임파구 클론에 대해 선택적으로 세포사를 유발하여 이식된 생착편의 생존을 증가시키는 기능을 가지는 세포라하여 일명 촉진 세포(facilitating cell)라고 불리기도 한다. 이러한 베토 세포 활성은 골수의 CD34 양성세포에 거의 편중되어 나타난다.

또한, 본 발명에서 CD34 양성세포는 말초혈액, 골수 또는 제대혈(umbilical cord blood) 등으로부터 채취할 수 있다.

말초혈액은 간편하게 채취할 수 있다는 장점이 있고, 골수는 채취하는데 환자에게 고통 주는 어려운 점이 있으나 효율이 좋은 장점이 있다. 또한, 제대혈은 골수와는 달리 분만 과정에서 버려지는 제대(Umbilical cord)에서 간단한 시술을 통해 얻을 수 있으며, 그 양에 비해 수많은 조혈모세포 및 줄기세포를 포함하고 있다. 그러므로 바람직하게는 인간 제대혈 유래 혈액에서 분리한 CD34 양성세포를 사용할 수 있다.

본 발명은 CD34 양성세포(CD34+ 세포)의 증식에 의해 내피전구세포(EPC)의 증폭효과를 얻을 수 있는 바, 제대혈로부터 수득한 CD34+ 세포분획은 30~82%의 CD34+ 세포로 구성되어 있는 것이 바람직하다.

'제대혈’이란 출산 때 탯줄에서 나오는 탯줄혈액을 말하는 것으로서, 백혈구와 적혈구 및 혈소판 등을 만드는 조혈모세포 및 혈관내피전구세포를 다량 함유하고 있으며, 연골과 뼈근육신경 등을 만드는 간엽줄기세포도 가지고 있어 의료가치가 매우 높다. 나아가 제대혈의 특성은 조혈모세포 수가 골수나 말초혈에 비하여 높은 농도로 존재할 뿐 아니라, 골수에서 발견되는 조혈모세포보다 증식, 자기 복제 및 분화능력이 훨씬 뛰어나다.

제대혈로부터 CD34 양성세포를 분리할 수 있는 방법은 이미 당업계에 공지되어 있는데, 일 구체예로서 이하의 방법을 들 수 있다.

먼저 제대혈에서 단핵세포구(Mononuclear cells)를 분리하기 위해 피콜 용액(Ficoll-Hypaque, Pharmacia, Sweden)위에 인산염완충용액(PBS) 또는 RPMI 배지로 희석된 제대혈을 섞이지 않게 조심스레 넣어주고(overlay) 원심분리한 후, 상층액을 일부 제거한 다음, 단핵세포를 포함하는 버퍼층을 조심스럽게 분리하여 인산염 완충용액(PBS)으로 세척하여 단핵세포구를 분리할 수 있다. 그리고, 분리된 단핵세포구로부터 CD34 양성 세포를 분리하기 위하여 면역자기 세포 분리 시스템(Immunomagnetic cell separation system, MiniMACS, Miltenyi Biotec GmbH, Germany)을 이용하는 CD34+ 세포 분리 시약(Direct CD34 Progenitor cell isolation kit, Miltenyi Biotec GmbH, Germany)을 사용할 수 있다. 상기 설명은 공지되어 있는 방법 중 일례에 불과할 뿐, 당업자가 임의로 선택한 방법에 의해 단핵구 및 CD34+세포를 분리할 수 있음은 자명한 사항이다.

또한, 상기 분리한 CD34 양성 세포를 배양하기 위하여 사용하는 기본배지는 동물세포 배양용 기본배지로서, 무기염류, 아미노산, 비타민류 및/또는 보조인자를 포함하는 포유동물 세포요법용 배지를 사용할 수 있으며, 동물세포 배양 기술분야에서 동물세포 배양을 위해 통상적으로 사용하는 배지라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서는 Stemline II 배지를 사용하였다.

다만, 본 발명에서는 CD34+ 세포의 증폭 및 내피전구세포의 선택적 증폭을 위해서 특정 사이토카인의 조합인 "SCF, FLT-3L, IL-3 및 bFGF(SFIb combination)"를 첨가하여 배양하였다는 점이 주요한 특징이라 할 수 있다.

상기에서 SCF(stem cell factor)는 미분화된 세포에 작용하여 세포의 증식 및 분화세포로의 유도에 사용되는 인자로서, 조혈작용을 하는 조혈모세포의 생존, 성장, 분화를 조절하는 사이토카인으로 조혈 전구세포를 가동화시켜 세포 및 조직의 회복에 관여하여 상처치유에 영향을 주는 것으로 알려져 있으며, 또한 다른 사이토카인과 함께 작용했을 때에는 조혈세포나 원모세포의 복제효율을 증가시켜 과립구 감소증을 빨리 회복시키며, 조직의 형성 및 영향물질의 전달을 향상시키는 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

상기 FLT-3L은 Fms와 유사한 티로신 키나제 3 리간드를 의미하고, IL-3(Interleukin-3)는 T세포, 자연살해(NK) 세포 등에서 분비되며 모든 조혈세포의 성장과 분화에 관여한다. 또한, bFGF(basic fibroblast growth factor)는 강력한 혈관 생성유발인자의 하나로 종양의 성장과 전이를 촉진시키는 물질로 알려져 있고, 혈관형성과 창상치유를 촉진시키며 특히 태생기 발생 초기에 크게 영향을 미친다. 또한, FGF 수용체-1이 EPC에서 발현된다고 보고된 바도 있다. 이외에도 상기 bFGF는 세포의 부착, 신경의 분화 등에도 영향을 미치며 섬유아세포, 상피세포, 혈관 내피세포, 골아세포, 근육세포 등의 유사분열을 유발시키고 섬유아세포, 대식세포, 내피세포 등의 세포에서 생성되는 것으로 알려져 있다

따라서 본 발명은 상기 특정 사이토카인의 조합, 즉 SCF, FLT-3L, IL-3 및 bFGF의 조합(일명 ‘SFIb combination’)이 CD34 양성세포 분획의 폭발적인 증식을 통해 내피전구세포(EPC)의 선택적 증폭 및 분화능 향상을 가져온다는 사실의 발견에 기초한 것이다.

그러므로 CD34+세포를 SCF, FLT-3L, IL-3 및 bFGF를 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 본 발명의 내피전구세포의 증폭(expansion) 방법은 CD34 양성세포에서 260~333배 증폭시킴으로써 궁극적으로 단핵구세포(mononuclear cells) 또는 CD34 음성세포보다 약 64 ~ 1468배에 이르는 내피전구세포의 증폭효과를 얻을 수 있다는 장점이 있다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서, 총 CD34+ 세포가 30~82%를 이루는 CD34+ 세포 분획; 및 SCF, FLT-3L, IL-3, bFGF를 함유하는 것을 특징으로 하는 내피전구세포(EPC) 증폭 촉진용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서,

(a) CD34+ 세포 분획을 SCF, FLT-3L, IL-3 및 bFGF를 함유하는 무혈청 배지에서 비-부착성 체외 배양함으로써 내피전구세포를 선택 증폭시키는 단계; 및

(b) 상기 증폭된 내피전구세포 집단을 내피세포 분화 조건에 두는 단계를 포함하는, 내피전구세포의 내피세포로의 분화방법을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 (a)단계에 대한 내피전구세포의 증폭단계는 앞서 설명한 바와 같으며, 상기 (b) 단계에서의 '내피세포 분화 조건'이란, 당업자에게 알려져 있는 내피전구세포를 내피세포로 분화시킬 수 있는 어떠한 상황 또는 방법을 모두 포함하며, 예컨대, 내피전구세포를 무기염류, 아미노산, 비타민류 또는 보조인자를 포함하는 동물세포 배양 기술분야에서 동물세포 배양을 위해 통상적으로 사용되는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 방법을 통해 분화시킬 수 있다.

특히, 본 발명의 방법에 따라 증폭된 내피전구세포는 증폭 전과 비교하여 내피세포로의 분화능이 현저히 향상되는 특성을 지니므로, 특정 사이토카인의 조합의 사용은 내피전구세포의 효율적인 분화 방법의 특징이 될 수 있다.

따라서 본 발명은 다른 관점에서, 총 CD34+세포가 30~82%를 이루는 CD34+세포 분획; 및 SCF, FLT-3L, IL-3, bFGF를 함유하는 것을 특징으로 하는 내피전구세포(EPC) 분화 촉진용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법에 의해 제조되고, CD34+세포, SCF, FLT-3L, IL-3 및 bFGF를 함유하며, 증폭 전의 64~1468 배로 확장된 내피전구세포 집단을 제공할 수 있으며, 상기 증폭된 세포들에는 높은 비율의 아세포(blast), 미성숙 단핵구 및 비만 세포로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 세포를 함유하고 있는 것을 특징으로 한다.

특히, 상기 아세포는 CD34+ 세포와 높은 상관관계를 가지며, 아세포 수에 대한 비율이 높은 SFIb 배양조건이 EPC 증폭에 월등히 우수하므로, 상기 아세포의 수가 EPC 증폭 조건 선택에 대한 좋은 지표자(indicator)가 될 수 있음을 시사한다. 또한, SFIb-증폭된 세포에서는 골수세포(myelocytes), 메타골수세포(metamyelocytes) 및 호중구(neutrophils)는 거의 포함되어 있지 않은 반면, 미성숙 단핵구(monocytes) 및 비만 세포(mast cells)를 함유하고 있는 것에 특징이 있다.

즉, 본 발명의 SCF, FLT-3L, IL-3 및 bFGF 조합에 따른 CD34+세포의 증폭 및 내피전구세포의 증폭 조건은 아세포(blast)의 높은 비율을 야기하는 효과가 있고, 이는 결국 특정 사이토카인의 조합에 의한 것인 바, 본 발명 고유의 효과라고 할 수 있다.

나아가, 본 발명은 다른 관점에서 CD34+세포, SCF, FLT-3L, IL-3 및 bFGF를 함유하는, 증폭된 내피전구세포의 집단을 제공할 수 있으며, 상기 증폭된 내피전구세포의 집단에 대한 용도 역시 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 특히, 본 발명의 내피전구세포 집단은 증폭 전에 비해 64~1468배로 증폭되어 있는 것을 특징으로 한다.

그러므로 증폭된 내피전구세포 집단에 대한 용도의 예로서, 상기 세포집단 또는 이를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 질환을 예방 또는 치료하는 방법, 또는 신생혈관을 형성하는 방법을 제공할 수 있다.

내피전구세포 자체(in situ)의 증식 및/또는 생존을 증강시키기 위해 '증폭된 CD34+ 세포를 함유하는, 증폭된 내피전구세포 집단' 또는 이를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 방법은, 이식물 또는 장치내와 같이 국소로, 전신으로 또는 국지적으로(topically) 이루어질 수 있다. 예컨대, 피하 또는 근육에 직접 주입하는 방법으로 투여할 수 있다.

본 발명의 일 특정 예에서, 증폭된 내피전구세포 집단을 국소 부위에 투여함으로써, 허혈성 질환을 앓는 대상체에서 내피세포로의 분화 및 신생혈관에 대한 형성 효과를 확인한 바 있다.

상기에서 ‘허혈성(ichemia) 질환’이란 동맥이 협착하거나 수축 또는 수술시 혈관을 묶었을 때 또는 혈전이나 색전 등에 의하여 일어나는 부분적인 혈액 부족 증상을 일컫는 질환으로서, 예를 들어, (i) 관상동맥에 동맥경화증에 의한 협착 현상이 생기게 되면 필요한 만큼의 혈액이 충분히 공급되지 못해 심장근육(심근)에 혈액순환 부족 현상이 나타나게 되는데, 이렇게 관상동맥의 이상으로 인해 발생하는 질환들을 포괄적으로 일컫는 '관상동맥 질환'; (ii) 뇌 속의 혈관이 파열되었거나 뇌동맥이 막히는 등의 혈액순환장애가 일어날 경우 뇌에 필요한 산소와 포도당을 공급받지 못해 기능이 떨어지며, 심할 경우 뇌조직이 죽게 되는 '허혈성 뇌졸증'; 및 말초 동맥에 허혈 증상이 나타날 경우 말단 조직에 산소가 제대로 공급되지 못하게 되어 말단조직의 괴사가 발생하는 '사지 말단 조직 괴사' 등이 대표적인 허혈성 질환이라고 할 수 있다.

또한, 본 발명에 따라 증폭된 내피전구세포 집단의 용도에 대한 다른 예로는, 상기 증폭된 내피전구세포 집단을 치료학적 유효량으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있으며, 증폭된 내피전구세포 집단을 유효성분으로 포함하는 신생혈관 형성용 조성물을 제공할 수 있다.

상기에서 '치료하는'이란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 허혈성 질환의 "치료" 또는 "치료요법" 은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 허혈성 질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 허혈성 질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 허혈성 질환을 경감시킴, 즉, 허혈성 질환의 퇴행을 야기시킴,

(4) 허혈성 질환의 재발을 예방함, 및

(5) 허혈성 질환의 증상을 완화함(palliating)

또한, 상기 "치료학적 유효량"은 내피전구세포의 증식 및/또는 분화의 증강을 달성하거나 죽음을 예방 또는 저해하는 것과 같은 원하는 예방 결과를 달성하기에 필요한 투약 및 시간동안의 유효한 함량을 의미한다.

확장된 내피전구세포집단의 내피세포로의 분화를 활성화시켜 신생혈관 형성 및 허혈성 질환을 치료하기 위해, 본 발명의 조성물을 약리학적 유효량으로 투여한다. 바람직하게는 내피세포로의 분화를 활성화시켜 신생혈관을 미리 형성시키기 위해 또는 허혈성 질환 발병 초기에 투여하는 것이 시기적으로 바람직하다.

'약리학적 유효량(therapeutically effective amount)'은 투여되는 화합물의 양이 치료하는 장애의 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감하는 것을 의미한다. 따라서 약리학적 유효량은, (1) 질환의 진행 속도를 역전시키거나 (2) 질환의 그 이상의 진행을 어느 정도 금지시키게 하는 것을 의미하며, (3) 질환과 관련된 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감(바람직하게는, 제거)하는 효과를 가지는 량을 의미한다.

본 발명의 조성물(세포치료제)은 임상투여시에 근육 또는 정맥 주사제와 같은 형태의 비경구 투여 뿐 아니라 직접 질환 부위에 투여할 수 있으나, 가장 바람직하게는 근육 주사에 의한 투여일 수 있다.

주사를 위해서, 바람직하게는 Hank 용액, Ringer 용액, 또는 생리 식염수 버퍼와같은 약리학적으로 맞는 버퍼로 제형될 수 있다. 점막 투과 투여를 위해서, 통과할 배리어에 적합한 비침투성제가 제형에 사용된다. 그러한 비침투성제들은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서, 세포치료제의 통상적인 투여량은 10⁴?10¹⁰ cells/body, 바람직하게는 10⁶?10⁸ cells/body, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 1 x 10⁵cells/100㎕ 내지 3 x 10⁵cells/100㎕ 인 것이 바람직한데, 2 x 10⁵cells/100㎕인 경우가 가장 바람직하다.

그러나 활성 성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

투약 요법은 최적인 치료 반응을 제공하도록 조절할 수 있다. 예로, 일회(bolus)만을 투여하거나, 여러번 분할하여 경시적으로 투여하거나, 또는 투여량은 치료 상태의 위급성에 따라 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 투여 용이성 및 투약 균일성에 있어서 투약 단위 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 이로울 수 있다. "투약 단위 형태"는 본원에서 처리되는 대상체에게 단일 투약으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 필요한 약학적 담체와 조합하여 원하는 치료 효과를 형성하도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 함량을 포함한다.

또한, 본 발명의 증폭된 내피전구세포 집단을 포함하는 본 발명의 세포 조성물은 골, 연골, 힘줄, 인대, 근육, 피부 및 그외 연결 조직뿐만 아니라, 신경, 심장, 간, 폐, 신장, 췌장, 뇌 및 그외 다른 기관 조직을 포함하여, 내피세포로의 분화에 따른 다양한 종류의 조직 재생에 유용하게 사용할 수 있다.

일부 예에서, 본 발명의 세포집단 조성물은 예컨대 증폭된 내피전구세포를 지지하고, 골, 연골, 근육, 신경, 상피 및/또는 그외 연결 조직 성장을 위한 표면을 제공하기 위하여, 적절한 매트릭스와 조합하여 투여할 수 있다. 상기 매트릭스는 전통적인 매트릭스 생물질의 형태일 수 있다. 매트릭스는 발현된 단백질 및 분화된 세포 및/또는 그의 존재를 위한 적합한 환경의 느린 방출을 제공할 수 있다. 일부 예에서, 다양한 콜라겐성 및 비-콜라겐성 단백질은 상향 조절되어 확장된 내피전구세포로부터 방출되는 것으로 예상된다. 이러한 현상은 매트릭스 침착(deposition)을 증강함으로써 조직 재생을 가속화시킨다. 또한, 매트릭스 단백질은 유전자 조작된 세포에서 발현시킬 수 있으며, 이식 부위로 형질전환된 세포의 생착 및 부착을 증강시킬 수 있다.

매트릭스 재료의 선택은 생체적합성, 생분해성, 기계적 특성, 표면 외양(cosmetic appearance) 및 인터페이스 특징을 기초로 한다. 세포성 조성물의 특정한 적용은 적합한 제형을 제한할 것이다. 조성물에 대해 사용가능한 매트릭스는 생분해성이며, 화학적으로 칼슘 설페이트, 트리칼슘 포스페이트, 하이드록시아파티트, 폴리락트산 및 폴리안하이드라이드로 규정될 수 있다. 그외 가능성 있는 물질은 생분해성이며, 골 또는 진피 콜라겐과 같이 생물학적으로 잘 규정된 것이다. 다른 매트릭스는 순수한 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분으로 구성되어 있다. 그외 가능성 있는 매트릭스는 비-생분해성이며, 소결된 하이드록시아파티트, 바이오글라스, 알루미네이트 또는 다른 세라믹류와 같이 화학적으로 규정된다. 매트릭스는 폴리락트산 및 하이드록시아파티트 또는 콜라겐 및 트리칼슘 포스페이트와 같이, 전술한 타입의 물질의 임의 조합으로 구성될 수 있다. 바이오세라믹류는 칼슘-알루미네이트-포스페이트와 같은 조성물중에서 변형될 수 있으며, 이를 가공하여 기공 크기, 입자 크기, 입자 형태 및 생분해성을 변경시킬 수 있다.

본 발명의 세포 조성물은 단독으로 또는 다른 세포와 혼합물로서 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 투여할 수 있는 세포는 그외 다잠재력 또는 다능성 세포, 줄기세포 등이, 이로 한정되는 것은 아니다. 여러 가지 타입의 세포는 투여하기 바로 전 또는 곧 본 발명의 조성물과 혼합할 수 있으며, 또는 투여하기 이전에 일정기간 동안 함께 배양할 수 있다.

본 발명의 세포 조성물은 다른 유익한 약물이나 생물 분자(성장 인자, 영양 인자)함께 투여할 수 있다. 확장된 내피전구세포를 다른 물질와 함께 투여하였을때, 이들은 단일 약학 조성물로 함께 또는 개별적인 약학 조성물로, 다른 물질과 동시에, 또는 연속적으로(다른 물질의 투여 전 또는 후) 투여할 수 있다. 함께 투여할 수 있는 생활성 인자로는 항-세포사멸제(예, EPO, EPO 항체모방체(mimetibody), TPO, IGF-I 및 IGF-II, HGF, 카스파제 저해제); 항-염증제(예, p38 MAPK 저해제, TGF-beta 저해제, 스타틴, Fasudil, IL-6 및 IL-1 저해제, PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIROLIMUS, 및 NSAID (비스테로이드성 항-염증제; 예, TEPOXALIN, TOLMETIN, SUPROFEN); 면역억제제/면역조절제(예, 사이클로스포린, 타크롤리무스와 같은 칼시뉴린(calcineurin) 저해제; mTOR 저해제(예, SIROLIMUS, EVEROLIMUS); 항-증식제(예, 아자티오프린(azathioprine), 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)); 코르티코스테로이드(예, 프레드니솔론 (prednisolone), 하이드로코르티손(hydrocortisone)); 단일클론 항-IL-2Rα 리셉터 항체와 같은 항체(예, 바실릭시맵(basiliximab), 다클리주맵(daclizumab)), 다클론성 항-T- 세포 항체(예, 항-흉선 세포 글로불린(ATG); 항-림프구 글로불린(ALG); 단일클론 항-T 세포 항체 OKT3)); 항-혈전제(anti-thrombogenic agents)(예, 헤파린, 헤파린 유도체, 유로키나제, PPack(덱스트로페닐알라닌 프롤린 아르기닌 클로로메틸케톤), 항트롬빈 화합물, 혈소판 리셉터 길항제, 항-트롬빈 항체, 항-혈소판 리셉터 항체, 아스피린, 디피리다몰, 프로타민, 히루딘, 프로스타글란딘 저해제 및 혈소판 저해제); 및 항-산화제(예, 프로부콜(probucol), 비타민(vitamin) A, 아스코르브산, 토코페롤, 코엔자임 Q-1O, 글루타티온, L-시스테인, N-아세틸시스테인) 뿐만 아니라 국소 마취제를 포함할 수 있다.

이러한 일 예로, 본 발명의 세포 조성물은 미분화된 세포로서, 그 중에서도 내피세포로의 분화를 자극하는 조건으로 배양물을 노출시킨 다음 투여할 수 있다.

본 발명의 세포 조성물은 복구 또는 확장이 필요한 부위에, 수술을 통해 이식, 주사, 전달(예, 카테터나 또는 주사 바늘을 이용하여)하거나, 그렇지 않다면 직접 또는 간접적으로 투여할 수 있다. 세포는 매트릭스에 의해 투여될 수 있다(예, 3차원의 골격(scaffold)). 세포는 기존의 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 세포, 그의 조성물 또는 성분(예, ECM, 세포 융해물, 적응용 배지(conditioned medium))의 투여 경로는 근육내, 눈, 비경구(정맥내 포함), 동맥내, 피하, 경구 및 코 투여를 포함한다. 비경구 투여의 특정 경로로는 근육내, 피하, 복막내, 뇌내, 뇌실내(intraventricular), 대뇌뇌실내(intracerebroventricular), 경막내, 수조내(intracisternal), 척추내 및/또는 말초-척추 투여 경로가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

세포를 반고형 또는 고형 장치내에 투여하는 경우에는, 신체에 정확한 위치에 외과 이식하는 것이 전형적으로 적합한 투여방식이다. 그러나, 액체 또는 유체상 약학 조성물은 이들이 예컨대 화학적 신호에 대한 반응으로 특정 위치로 이동하는 1곳 이상의 일반적인 위치(예, 확산시키는 부위를 통해)에 투여할 수 있다.

다른 예는 세포 조성물(예, 세포 융해물 또는 그 성분) 또는 산물(예, 유전자 변형을 통해 생산된 세포외 매트릭스, 영양인자 및 그외 생물학적 인자)를 포함하는 약학 조성물의 투여에 의한 치료 방법을 포함한다.

본원에 개시된 세포 조성물을 투여하기 위한 투약 형태 및 요법은 각 환자의 상태, 예로 치료중인 증상의 특성 및 정도, 연령, 성별, 체중 및 일반적인 의학적인 상태와 의료 실무자들에게 공지되어 있는 그 외 인자를 고려하는 우수한 의학 실무에 따라 개발된다. 따라서 환자에게 투여되는 약학 조성물의 유효량은 당업계에 공지된 바와 같이 이러한 고려사항에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 일부 예에서, 본 발명의 세포 조성물을 이용한 치료 개시 전에, 환자의 면역을 억제하는 것이 필수적이거나 또는 바람직하지 않을 수 있다. 따라서 동종이형 또는 이종의 MPC 또는 그 자손의 이식은 일부 경우에서는 허용될 수 있다.

그러나 다른 경우에서는, 세포 요법을 개시하기 전에 환자의 면역을 약물학적으로 억제하는 것이 바람직하거나 적절할 수 있다. 이는 전신성 또는 국소 면역억제제를 이용하여 달성할 수 있으며, 또는 캡슐화된 장치를 통해 세포를 전달함으로써 수행할 수 있다. 확장된 내피전구세포가 필요로하는 영양분 및 산소와 치료 인자가 투과가능하지만, 면역 체액성 인자 및 세포에는 비투과성인 캡슐에 캡슐화될 수 있다. 바람직하게는, 캡슐화제는 저자극성이며, 표적 조직에 용이하고 안정적으로 위치시킬 수 있으며, 이식된 구조물에 대한 방어를 제공한다. 이식된 세포에 대한 면역반응을 감소 또는 없애기 위한 이러한 및 다른 방법은 당업계에 공지되어 있다. 대안적으로, 증폭된 내피전구세포는 유전자 변형시켜 그들의 면역원성을 감소시킬 수 있다.

이식된 증폭된 내피전구세포의 살아있는 환자에서의 생존성은 CAT(computerized axial tomography) 또는 CT 스캔, MRI(magnetic resonance imaging), 또는 PET(positron emission tomography) 스캔과 같이 다양한 스캐닝 기법을 이용하여 결정할 수 있다. 또한, 이식물의 생존 측정은 사후 표적 조직을 축출하여 이를 가시화하거나 또는 현미경으로 검경하여 주사할 수 있다. 대안적으로는, 세포를 특정 계통의 세포에 특이적인 염료로 처리할 수 있다. 이식된 세포는 또한 로다민-또는 플루오레세인-표지된 미세구, 패스트 블루, 비스벤즈아미드, 페릭 마이크로파티클과 같은 트레이서 염색제의 전처리나, 또는 β-갈락토시다제 또는 β-글루코로니다제와 같이 유전자 도입된 리포터 유전자 산물에 의해 동정할 수 있다.

대상 개체에 이식된 증폭된 내피전구세포의 기능적 통합(functional integration)은 손상 또는 질병에 걸린 기능의 회복, 예컨대 신생 혈관 형성 기능회복 또는 기능 증대를 조사함으로써 평가할 수 있다.

본 발명의 세포 조성물은 하나 이상의 생활성 인자를 포함할 수 있으며, 그 예로는 성장 인자, 분화-유도 인자, 카스파제 저해제와 같은 세포 생존 인자, p38 키나제 저해제와 같은 항-염증제, VEGF 또는 bFGF와 같은 혈관신생 인자가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 생활성 인자의 일부 예로 PDGF-bb, EGF, bFGF, IGF-1 및 LIF를 포함한다. 대안적으로 이식되는 증폭된 내피전구세포는 성장 인자, 항산화제, 항- 세포사멸제, 항-염증제 또는 혈관신생 인자를 발현하기 위해 유전자 변형될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체내에 동질적인 또는 이종적인, 증폭된 내피전구세포 집단, 그의 세포 외 기질이나 세포 융해물, 또는 적응용 배지를 포함할 수 있다.

본 발명의 세포에 대한 약학적으로 허용가능한 담체로는 본 발명의 세포, 그 조성물 또는 성분과 유해하게 반응하지 않는 적합한 유기 또는 유기 담체 물질을 포함한다. 생체이용가능한 범위에서, 적합한 약학적으로 허용가능한 담체로는 물, 염 용액(링거액), 알코올, 오일, 젤라틴 및 락토스, 아밀로스 또는 전분과 같은 탄수화물, 지방산 에스테르, 하이드록시메틸셀룰로스 및 폴리비닐 피롤리돈이 있다. 이러한 조제물들은 멸균할 수 있으며, 적절한 경우에 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 에멀젼화제, 삼투압을 위한 염, 완충액 및 발색제와 같은 보조제와 혼합할 수 있다. 본 발명에 이용하기 적합한 약학 담체는 당업계에 공지되어 있다.

그 외 하나 이상의 성분을 이식된 세포에 첨가할 수 있으며, 상기 성분은 당업계에 공지된 한가지 타입 이상의 콜라겐과 같은 선택된 세포외 기질 성분, 및/또는 성장 인자, 혈소판이 풍부한 혈장 및 약물을 포함한다.

이처럼, 본 발명은 SCF, FLT-3L, IL-3 및 bFGF의 조합에 의해 CD34+ 세포 분획으로부터 선별 증폭하여 궁극적으로 내피전구세포를 효과적으로 증폭시킨다는 사실에 근거하여 내피전구세포를 높은 효율로 크게 증폭시키는 방법을 제공한다.

뿐만 아니라, 상기 증폭된 내피전구세포 집단은 보다 향상된 분화능 및 신생혈관형성 능력을 가지므로 본 발명은 당업계에 공지된 임의의 다양한 기술을 사용하여 상기 특성을 활용할 수 있는 이와 관련된 상기 언급한 용도를 모두 포함할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 >

하기 실시예는 인간 제대혈 유래 내피전구세포에 관한 것이나, 제대혈 외에도 인간 말초혈액 또는 골수 유래의 내피전구세포를 사용할 수 있다는 것 또한 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명할 것이다.

따로 언급하지 않는 한, 하기의 모든 결과 데이타는 적어도 3개의 독립적 실험으로부터 평균±표준오차(SE)로 표시되었고, 2개의 사이토카인 조합사이의 차이를 비교하기 위해서 각 제대혈 및 전체 제대혈에서 상호작용 모델 또는 그렇지 않은 Student's t-test 및 two-way ANOVA를 사용하였다. 아세포(blast cells) 및 CD34 양성세포 사이의 관계는 Spearman 상관계수로 분석하였고, 또한, 통계 분석 시스템(SAS, version 9.1, SAS Institute, Cary, NC, USA)을 사용하였으며 P<0.05 경우를 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.

< 실시예 1>

제대혈 유래 혈액으로부터 CD34 + 세포의 분리 및 정제

인간 제대혈 샘플은 가톨릭 대학 병원 임상시험심사위원회(IRB)에 의해 승인된, 산모 동의하에 분만 직후 제대 정맥에서 채혈하였으며, 항응고액이 들어있는 표준 채혈백(녹십자, 대한민국)을 이용하였다. 제대혈 유래 단핵세포구(mononuclear cells, MNCs)는 표준 시험법에 따라 피콜-팩 프리미엄(ficoll-Paque premium) 밀도구배 원심분리(밀도 1.077; GE Healthcare)에 의해 분리하였다. 그 후, 상기 MNC로부터 MiniMACS 시스템(CD34+ 마이크로 비드 키트, Miltenyi Biotec; Bergisch-Gladbach, Germany)을 이용하여 사용 설명서에 따라 CD34⁺세포 분획을 분리하였다. 즉, MNCs를 세척하고 PBS에서 0.5% 소 혈청 알부민(BSA, Sigma, St.Louis. MO) 및 2mM EDTA에 재현탁한 후, 10⁸ 세포수 당 100μl FcR 블로킹 시약(blocking agent)과 100μl 항-CD34 마이크로비드 (Anti-CD34 microbead)를 가하여 4℃에서 30분간 반응시켰다. 또한, 자기장에 설치한 컬럼에 로딩(loading)시켜 표지된 세포들을 분리하고, 자기장으로부터 컬럼을 제거한 후 붙잡힌 세포들을 희석하였다. 트립판 블루용액(Trypan blue)으로 세포들을 염색 한 후, 유핵세포들의 수를 혈구계수기(hemacytometer)를 이용하여 계수하였다.

< 실시예 2>

CD34 양성세포의 비- 부착성 증폭( Non - adhesive expansion )

상기 실시예 1에서 분리한 CD34+ 세포들을 10,000 cell/ml의 밀도로 분주(seeding)하여 3-5ml 무혈청 Stemline-II medium (Sigma)를 함유하는 6 웰 ULA(ultra low attachment) 플레이트(Corning Inc, Corning, NY)에서 37℃ 및 5% CO₂하 7-9일 동안 배양하였다. 성장인자 칵테일 보충물로서, SCF(stem cell factor, 100 ng/ml), FLT3-리간드(FLT-3L, 50 ng/ml), 인터루킨-3(IL-3, 20 ng/ml), TPO(thrombopoietin, 100 ng/ml), GCSF(granulocyte colony-stimulating factor, 100 ng/ml), 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor, 10 ng/ml (CB #9), 또는 50 ng/ml)를 첨가하였다. 체외 증폭(ex vivo expansion)에 사용되는 모든 사이토카인 및 성장인자는 Peprotech Inc. (Rocky Hill, NJ)로부터 구입하였다. 세포수는 트립판 블루 색소 배제법(trypan blue exclusion method)을 이용하여 계수하였다. 증폭 후, 상기 세포들에 대하여 유세포분석기(flow cytometry)로 특성을 조사하였고 Wright-stain (Sigma) 염색으로 형태학적 성질을 분석하였다.

< 비교예 1>

비- 부착성 EPC 증폭에 있어서 CD34 +, CD34 - 및 MNC 분획의 비교

(1) 유핵세포수의 증폭률 비교

CD34+, CD34- 세포 및 MNCs를, 비-부착적으로 SFI(SCF, FLT-3L, IL-3), SFIb (SCF, FLT-3L, IL-3, 및 bFGF), 또는 STG (SCF, TPO 및 GCSF) 사이토카인 조합을 포함하는 Stemline II에서 9일 동안 배양한 후, 각 세포들의 증폭 정도를 비교 측정하였으며, 결과는 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다.

또한, 본 발명자들은 CD34+ 세포로부터 확장된 세포들에 대하여 세포 노화-관련 β-gal 분석을 수행하였는데, 분리한 CD34+ 세포를 Stemline II에서 9일 동안 상기 사이토카인의 조합으로 비-부착성 배양시키고 사이토스핀(cytospin)으로 수거하였다. 그 후, 상기 세포들을 실온에서 10분 동안 4% PFA로 고정시키고, 16-20 시간 동안 37℃에서 신선한 β-gal 염색 용액(1mg/ml의 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-갈락토피라노사이드(USB, Cleveland, Ohio), 5 mM 페로시안칼륨(potassium ferrocyanide) (Sigma), 2 mM MgCl₂, and 0.1 M 인산나트륨(sodium phosphate), pH 6.0)으로 배양하였다. 이후, 상기 세포들을 현미경 하에서 사진을 촬영하였다(Olympus AX70, x 400). 신선한 MNCs를 피브로넥틴-코팅된 플레이트상에서 7일 또는 14일 동안 배양하였다. 배양 후 세포에 대하여 노화 관련-β-갈락토시다제 분석하고 현미경으로 사진을 찍었다(Leica, x200).

상기와 같은 분석 결과, 먼저 하기 표 l 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 3가지 형태의 사이토카인 조합 모두에서 전체 유핵세포수(total nucleated cells, TNC)의 증폭률이 가장 높은 것은 260~333배로 증폭된 CD34+세포 분획인 것으로 나타났고, MNC 분획 역시 15~19배로 유핵세포가 증폭된 것으로 나타났다. 반면, CD34- 분획은 TNC의 수에서 오히려 감소된 것으로 나타났다.

또한, CD34+ 세포로부터 증폭된 세포들에 대하여 세포 노화-관련 β-gal 분석을 수행한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 7일 또는 14일 배양된 부착성 세포들과 대조적으로 세포노화를 보이지 않는 것으로 나타났다. 또한, 비-부착성 배양에서 14일 동안 증폭시킨 세포들에 대해서 세포노화를 보이지 않는 것으로 나타났다(결과 미도시).

따라서 상기와 같은 결과들을 통해 본 발명자들은 4 내지 5달 동안 텔로머라아제의 높은 활성이 지속되고 장기간 현탁 배양에서 수반되는 텔로머라아제의 짧아짐이 없이 제대혈 CD34+의 대량증식 및 자가-재생(self-renewal)이 가능하다는 이전 보고와 일치한다는 사실을 알 수 있었다(Piacibello W et al., Folia Histochem Cytobiol. 2005;43:197-202).

(2) 내피세포로의 분화능 비교

비-부착성 증폭된 세포들이 내피세포(endothelial cells)로 분화할 수 있는지의 여부를 알아보기 위하여 내피세포 배양 배지에서 FN-코팅된 플레이트 상에서 상기 세포들을 5일 동안 배양시킨 후, 분화능을 관찰하였다. 한편, 본 발명자들은 부착성 세포가 다른 내피세포 표현형을 가지는지 알아보기 위하여, CD31, VE-Cadherin, KDR (VEGFR 2), 및 vWF의 발현을, 각 항원에 특이적인 1차 항체 및 Cy3-결합된 2차 항체를 이용하여 조사하였는데, 먼저 9일 동안 체외 증폭된 세포를 20 μg/ml의 FN-코팅된 8 웰 챔버 슬라이드(Nunc, Rochester, NY)상에서 5일 동안 배양하고, CD31, VE-Cadherin, KDR, 및 vWF에 대해 면역형광염색하여 관찰하였다. 상기 세포들은 4% PFA로 10분 동안 실온에서 고정시키고 PBS로 한 번 세척하였다. 30분 동안 1% BSA로 블로킹한 후, 항-VEGF 수용체 2 및 항-vWF 항체로 염색하기 위해서, 2-3분 동안 0.1% Triton-X100로 침투시켰다. anti-VE-Cadherin(clone BV6, Chemicon, Temecula, CA), anti-CD31(clone JC70A , DakoCytomation), anti-KDR(KDR, clone KDR-1, Sigma) 및 anti-vWF(clone F8/86, Dako)에 대한 일차 항체들을 밤새 4°C에서 반응시켰다. 이후 상기 세포들을 1% BSA로 3번 세척하고 Cy3-결합된 이차 항체들과 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. DAPI(Sigma)로 염색한 후, 표지된 세포들을 형광 현미경으로 관찰하였다(Carl Zeiss, x200).

상기와 같은 실험수행에서, 먼저 분화능 관찰 결과, 도 3 및 4에 나타낸 바와 같이, CD34+ 분획-유래 및 MNC-유래 증폭된 세포들의 경우 부착성 세포들을 생성하였고, ac-LDL/UEA-1 이중 양성 세포들을 비교할 수 있는 수준에서 생성하였다. 특히, 방추형 세포(spindle shaped cells)는 SFIb 조합에서 풍부한 것으로 나타났고, 이와 대조적으로 증폭 전 신선한 CD34- 분획은 일정 수준에서 부착성 혈관내피 전구세포를 야기하였지만(2.77±0.40%)(도 4 및 표 1 참조), CD34- 분획의 증폭은 부착성으로 분화된 혈관내피 전구세포를 생성하지 않는 것으로 나타났다.

즉, 혈관내피 전구세포의 증폭은 상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 각 세포의 분획 및 사이토카인 조합에 따라 다르게 나타났으며, 특히, 혈관내피 전구세포는 CD34+세포로부터 평균적으로 MNC 보다 약 20배 더 많이 증폭되는 것으로 나타났다.

또한, 면역형광염색법을 통한 표현형 관찰 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 부착성 세포들은 CD31, VE-Cadherin, KDR 및 vWF를 발현하는 것으로 나타났고(양성 반응), 세 가지 조합 그룹들 사이에서 유의한 차이를 나타내지 않았다.

이상과 같은 결과들을 통해 본 발명자들은 CD34+세포들이 혈관내피 전구세포의 증폭에 있어서 MNC 보다 더욱 효과적이라는 사실을 확인할 수 있었고, 부착성 배양의 경우에는 혈관내피 전구세포의 세포노화를 빠르게 유도하는 반면, 본 발명에 따른 비-부착성 현탁 배양방법은 혈관내피 전구세포를 세포노화의 유도 없이 매우 효과적으로 증폭할 수 있는 방법임을 확인할 수 있었다.

< 비교예 2>

CD34 + 분획으로부터 혈관내피 전구세포의 증폭에서 사이토카인 조합 비교

CD34+분획 및 MNCs의 혈관내피 전구세포(EPC) 증폭 정도를 사이토카인들의 각 조합에 의한 배지들에 대해 조사하였다. 즉, STG, SFI 및 SFIb의 조합에 대한 세포의 증폭 정도를 측정하였다.

그 결과, 표 1에서 알 수 있듯이, STG 조합보다는 SFI 또는 SFIb 조합이 내피 세포로 분화할 수 있는 기능적 혈관내피 전구세포를 효과적으로 증폭할 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 CD34+ 세포 분획으로부터 EPC 증폭에 있어서 사이토카인 조합의 효과를 더 알아보기 위해, 다른 개인의 아기로부터 채취한 제대혈의 여러가지 기원(origins) 유래의 CD34+세포 분획의 재생능력을 테스트하여 개인별 다양성이 존재하는지 알아보았다. 이는 비록 동일한 분리 방법이라 할지라도 분리된 CD34+세포의 정제수율이 상당히 넓은 범위의 퍼센트에 속하였기 때문이다(30% ~ 82%).

이를 위해, 먼저 bFGF 첨가가 EPC 확장에 유리한지 알아보았다. 즉, 9개의 제대혈 기원의 CD34+ 세포들을 테스트하였는데, 상기 bFGF 첨가는 통계학적으로 의미가 있도록 약 10%까지 TNC 수를 증가시켜서 17%까지의 EPC 증폭을 나타내었다. 그러나, 증폭 후 CD34+ 세포 비율 (%) 및 EPC 분화율 (%) 상에서는 증강 효과를 나타내지 못했다(표 2 및 도 6 참조).

또한, 본 발명자들은 CD34+ 세포로부터의 EPC 증폭에서 STG 및 SFIb 사이토카인 조합의 효과를 살펴보았는데, 그 결과, 하기 표 3에서 나타낸 바와 같이, 전체적으로 SFIb 조합은 STG 조합과 비교하여(도 6 참조), in vitro에서 ac-LDL/UEA-1 양성 세포로 분화할 수 있는 EPC를 약 2.43배 증폭시켰으며, p<0.0001, 9 cord bloods), 또한, 비록 낮은 수준이긴 하지만, STG 조합과 비교하여 SFIb 조합은 TNC를 약 13%까지 증가시켰다(p<0.0001). 뿐만 아니라, SFIb 조합에서의 증폭은 통계학적으로 유의하게 CD34+ 세포의 비율(%), CD34+ 증폭 배율 및 EPC 분화율에서 월등히 우수한 것으로 나타났다. 또한, EPC 증폭 배율 측정은 증폭 전에 각 신선한 MNCs 또는 CD34+ 세포로부터 수득한 EPC 수를 고려하여 계산하였는데, 비록 일부 경우에서 EPC가 MNC와 상이하게 신선한 CD34+ 세포로부터 생성되지 않았지만, 흥미롭게도 본 발명자들은 CD34+세포의 증폭 후에는 부착성 EPC를 항상 수득할 수 있었다(표 2 및 표 3 참조).

따라서 이러한 결과들을 통해, 전체적으로 SFIb 조합에서 CD34+세포로부터 증폭시킨 혈관내피 전구세포는 약 64 ~ 1,468 배의 범위로 증폭되는 것으로 나타났으며, 또한, STG 조합과 비교하여 볼 때, SFIb 조합에서 비-부착성 현탁 배양에 의해 보다 효과적으로 혈관내피 전구세포를 증폭시킬 수 있음을 알 수 있다. 이는 특정 사이토카인의 조합이 혈관내피 전구세포의 선택적 증폭에 있어서 매우 중요한 요소임을 시사한다.

또한, 상기 결과로부터 본 발명자들은 본 연구의 사이토카인 조합에 의한 현탁 배양, 즉, 비 부착 배양이 전구세포를 보다 빨리 내피세포로 분화될 수 있게 함으로써, 더욱 분화된 세포를 많이 생성할 수 있게 한다는 사실을 알 수 있었으며, 나아가 혈관내피 전구세포 증폭용 사이토카인의 조성물이 혈소판 또는 호중구(neutrophil)의 보충에 의한 HSC 확장과는 명백히 상이함을 추측할 수 있게 한다.

또한, 본 발명자들은 증폭 후 CD34+ 세포 비율(%)과 EPC 분화율 사이의 상관관계를 조사하기 위하여 16개의 제대혈 및 상기 3가지 사이토카인 조합을 이용하였는데, 그 결과, 제대혈 기원에 따라 CD34+ 세포 정제 수율의 넓은 범위에 일치하게 EPC 분화율에도 큰 차이가 확인되었다(표 2 및 표 3 참조). 그럼에도 불구하여 전반적으로, SFIb 조합 그룹은 STG 조합 그룹보다 높은 CD34+세포 비율(%)(2.17 fold, p=0.0002) 및 EPC 분화율(1.69 fold, p<0.0001)을 나타내었다(표 3 및 도 6 참조). 또한, 도 6은 표 2 및 3의 데이터를 요약하여 그래프로 나타낸 것으로서, TNC 증폭배율, CD34+세포 비율(%), CD34+ 증폭배율, EPC 분화율(%) 및 EPC 증폭배율(expansion fold)을 SFIb vs. STG (n=9) 및 SFIb vs. SFI (n=9)로 비교하였으며, P 값은 CD34+세포 비율(%) 및 CD34+ 증폭배율에서는 상호작용에 따른 two-way ANOVA 모델에 의해 수득하였고, 모든 다른 비교는 상호작용 없이 획득하였다.

그 결과, 비록 EPC 분화율이 다른 오염된 세포 또는 알려지지 않은 다른 인자들에 의해 영향을 받을 수 있다고 하더라도, 전반적으로 증폭 후 CD34+ 세포비율(%)은 테스트한 제대혈 및 사이토카인 조합들 전체적으로 EPC 분화율과 양성적 상관관계에 있었다(Spearman 상관계수=0.54913, p=0.0009, 16 제대혈, n= 35).

< 실시예 3>

피브로넥틴 매트릭스상에서의 부착성 배양( adhesive culture )

상기 실시예 2에서 증폭된 세포들을 20 μg/ml 인간 피브로넥틴(Sigma)으로 코팅된 디쉬에 2,000 cells/mm² 의 밀도로 플레이팅하고, 10% FBS(Gibco), 30 μg/ml의 내피세포 성장 보충물(endothelial cell growth supplements, Sigma), 90 μg/ml 헤파린(Sigma) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)을 첨가한 M199 (Gibco, Grand Island, NY)배지에서 5%의 CO₂ 및 37℃ 온도 하에 배양하였다. 배양 3일 후, 비-부착된 세포들을 PBS로 세척하여 제거하고, 부착되어 있는 세포들을 5일 또는 7일까지 추가 배양하였다.

< 실시예 4>

부착성 분화된 혈관내피 전구세포의 특성분석

내피세포계열(endothelial lineage) 세포들의 특성을 살피기 위하여, 상기 실시예 3의 방법으로 부착성 배양을 통해 배양된 부착성 세포들의 Dil-acLDL(1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine-labeled acetylated low-density lipoprotein, Invitrogen, Eugene, Oregon)의 섭취능 및 UEA-1(Ulex europaeus agglutinin I, Sigma) 결합양상을 조사하였다. 상기 조사를 위해 먼저 세포들을 37°C에서 4시간 동안 Dil-acLDL(2.4 μg/ml)로 배양한 후, 10분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정시켰다. 세척한 다음, 세포들을 밤새 FITC-표지된 UEA-I (10 μg/ml)와 4°C에서 반응시켰다. 염색 후, 형광 현미경(Carl Zeiss, Axiovert200, Germany) 하 세포들을 관찰하여 사진을 찍었다. 각 웰마다 임의적으로 선택된 5 필드에서 acLDL 섭취능 및 UEA-1 결합 모두에 대해 양성반응을 나타내는 세포들을 계수하였다.

< 실시예 5>

FACS ( Fluroescence Activated Cell Sorting ) 분석

유세포 분석을 위하여, 먼저 인간 IgG (Sigma)를 전처리하여 Fc 수용체 및 면역글로불린의 비특이적 결합 부위를 블로킹한 후에, 분리한 CD34+ 세포 또는 증폭 배양된 세포(2 x 10⁵)에 FITC가 결합된 CD34 단일클론 항체(clone 581, BD Pharmingen, San Jose, CA)를 가해 30분 동안 4℃에서 표지시켰다(labeling). 면역형광-표지된 세포들을 FACS 버퍼(0.5% BSA and 0.09% sodium azide in PBS, pH 7.4)로 세척하고, 4% PFA로 고정시킨 다음, FACS Calibur (BD Biosciences)로 샘플마다 10,000 개 세포를 측정하였고, 분석은 Cell Quest software를 사용하여 실시하였다. 모든 샘플에 대하여 게이팅(gating)은 적용되지 않았다. 음성 대조군으로 Isotype-identical IgG1κ-FITC가 사용되었다.

< 실시예 6>

생쥐의 만성 사지허혈 ( hindlimb ischemia ) 모델에서의 세포 이식

실시하는 모든 공정은 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)의 규정에 의거하여 수행하였으며, 8주령의 수컷 Balb/c Slc-nu 마우스(Japan Slc Inc, Japan)를 ketamine hydrochloride (100 mg/kg i.p.)로 마취시켰다. 대퇴동맥 및 주위혈관 절제술(operative resection)에 의해 사지허혈(Hindlimb ischemia)을 유도하였다. 수술 후 6시간 이내에, 상기 생쥐들에 대하여 PBS내의 증폭된 세포 또는 이를 PKH26 (Sigma)으로 표지한 세포(SFIb, 10⁶ cells/mouse)를 허혈성 대퇴부위의 근육내로 이식하였다. 수술 후 3주 째, 상기 생쥐들을 CO₂ 흡입에 의해 희생시킨 후, 허혈성 뼈대 근육을 분리하여 OCT 화합물(Tissue-Tek, Sakura Finetek Japan Co., Japan)에 넣어 두었다. 그리고, 액체 질소에서 냉동상태로 유지시켰다. 여러 개의 연속적인 5 μm 두께의 냉동 절편을 연속해서 각 표본으로부터 잘라내어 실란-코팅된 유리 슬라이드(Muto pure chemicals Co. Ltd, Japan)에 올려놓았다. 이후 형광 현미경 하에서 이식된 PKH26-표지된 세포들이 검출되었다. 혈관밀도의 평가를 위하여 조직 절편을 이하와 같이 Fluorescein Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia (BS) Lectin I (Vector Laboratories, Burlingame, CA)으로 염색하였다: 5 μm 두께의 근육 조직을 100% 아세톤으로 5분 동안 고정시키고 PBS로 2번 세척한 후, 5 % 정상 염소 혈청(Vector laboratories)으로 30분 동안 블로킹하고, 실온에서 1시간 동안 플루오레세인(fluorescein) BS lectin I (20 μg/ml)으로 반응시켰다. 혈관 밀도 정량분석은 이미지 J 소프트웨어를 사용하였다(http://rsbweb.nih.gov/ij/). 우선, 잡힌 칼라 이미지를 RGB stack에 적용하여 각 채널내로 이미지를 분리시켰고, 각 개별적인 이미지를 thresholding (mouse=3/each group, 4-6 sections/mouse, 46 images for PBS group, 55 images for SFIb group, and 48 images for STG group)을 적용하여각 필드마다 혈관 영역의 퍼센트를 이미지 J에 의해 계산하였다.

< 실시예 7>

허혈성 혈류의 레이저 도플러 혈류 이미징화( Laser Doppler perfusion imaging )

허혈성(좌)/비-허혈성(우) 대퇴 혈류의 비율을 측정하기 위하여 3주 경과 뒤에 LDPI(Laser Doppler perfusion imaging; Perimed Periscan PIM III, Jarfalla, Sweden)을 사용하였는데, 각 마우스에서 해당 동일 부위(다리와 발)을 2번씩 스캐닝한 다음, 이미지들을 혈류 정량분석하고, 허혈성 및 비-허혈성 대퇴 혈류의 평균을 계산하였다. 디지털 칼라-코딩된 이미지에서, 붉은 색깔은 최대혈류(maximum perfusion)를 나타내고, 노란색은 중간 혈류값(medium perfusion), 푸른색은 가장 낮은 혈류값을 나타낸 것이다.

< 실험예 1>

증폭된 혈관내피 전구세포의 생체내 ( in vivo ) 효율

누드 마우스의 허혈성 대퇴부위에 비-부착성 증폭된 세포의 국부 이식이 출생후 신혈관형성(postnatal neovascularization)을 증가시킬 수 있는지의 여부 및 증폭된 세포의 생체외 혈관내피 전구세포 분화율이 in vivo 효과와의 상관 관계가 있는지 알아보았다. 이를 위해 대퇴동맥 및 주위혈관을 절제수술한 다음, 6시간 이내에 9일 동안 CD34+ 세포 분획으로부터 증폭된 세포들을 국부적으로 허혈성 대퇴부위의 근육내로 4개의 다른 투여 지점에서 주입(injection)하였다. 또한, 상기 실험에서 SFIb 또는 STG 조합에서 증폭된 세포들을 사용하여 치료적 신혈관형성의 효율을 비교하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 연속적인 LDPI 분석 결과, 시술 후 3, 7, 14 및 21일에 PBS-처리한 대조군 그룹과 비교하여 SFIb 조합에서 증폭시킨 세포들을 주입한 대퇴부위에서는 허혈성/비-허혈성 대퇴 혈류의 비율이 현저히 증가하는 것으로 나타났다. STG 배지에서 증폭된 세포의 경우, SFIb 조합과 비교하여 시술 후 혈류 회복은 3일, 7일, 14일 및 21일째 낮은 수준으로 관찰되었다. 허혈의 초기 단계(3일 및 7일)에서의 혈류 회복이 SFIb-증폭된 세포들이 주입된 대퇴에서 눈에 띄게 현저한 것으로 나타났다. 또한, 21일 경과 후에는, fluorescein BS lectin I를 이용하여 수행한 허혈성 조직의 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis) 결과, PBS-처리한 대조군과 비교하여 SFIb 또는 STG-조합에서 증폭된 세포 이식에 의해 혈관 밀도(vessel density)는 현저하게 증가된 것으로 나타났고(도 8 참조), 혈관 밀도(vessel density)는 STG-그룹보다 SFIb-그룹에서 더욱 높은 것으로 나타났다(통계학적 의미 없음). 반대쪽-측면 비허혈성 대퇴에서 3가지 그룹 사이에 관찰되는 혈관 밀도 차이는 큰 차이가 없는 것으로 나타났다(결과 미도시).

따라서 이러한 결과를 통해, SFIb 조합은 in vivo에서 허혈성-유도 신혈관형성 증가 및 혈류 회복에 보다 효과적이라는 사실을 알 수 있었고, 또한 in vitro 혈관내피 전구세포의 분화율이 in vivo 효과와 일치한다는 사실도 알 수 있었다.

나아가 in vivo 신혈관신생에 있어서 주입된 증폭 세포의 역할을 조사하기 위해, 수술 후 21일째 PKH26-표지된 증폭 세포를 주입한 허혈성 대퇴부위로부터 수득한 조직절편을 BS-lectin I 염색에 의해 검사하였다.

그 결과, 붉게 표지된 세포들이 녹색-형광 BS lectin I으로 염색된 혈관 벽에서 발견되었으며(도 9 참조), 이는 CD34+ 세포 분획으로부터 증폭된 세포들이 새로운 혈관내로 통합되어 혈관 형성에 기여할 수 있음을 알 수 있었다. 반면, 비-허혈성 대퇴부위에서는 표지된 세포들이 검출되지 않았다.

< 실험예 2>

증폭된 세포의 분화 상태에 대한 특성검토

앞서 수행한 실시예에서 SFIb 조합에서 증폭된 세포가 in vitro에서 내피 세포로 분화할 수 있는 EPC를 더 함유하고 있는 것과 STG에서 증폭된 세포들과 비교하여 in vivo 신혈관형성이 더욱 증가하는 것을 확인하였다.

반면, 동일 기원의 CD34+세포 분획이 증폭 배양 배지에 의존하여 상이한 효과를 나타내기 때문에, 이는 다른 타입의 혈구세포로의 다른 분화가 2가지의 배양 그룹에서 일어나서 이것이 EPC 증폭에도 영향을 끼칠 수 있으므로, 이를 확인하기 위해 4가지의 제대혈 기원으로부터 수득한 증폭된 세포들을 이용하여 실험하였다.

그 결과, 비록 TNC 증폭 배율은 124 ~ 368배의 범위로 다양화되어 있지만, 전반적으로 SFIb에서 증폭된 세포(34.50±3.01%)는 STG 배지에서 배양된 세포(14.50±1.32 %)보다 2.4 배의 아세포(blasts)를 일정하게 함유하고 있었고, 반면 전골수구(promyelocyte)의 수는 SFIb-배양된 세포(55.50±4.59 %)와 비교하여 STG 배지에서 증폭된 세포(31.75±4.03 %)에서 실질적으로 높게 나타났다(도 10 참조). 7일의 짧은 기간 동안 증폭된 세포에서는 유사한 분화 패턴이 관찰되었다(결과 미도시).

또한, 증폭 후 아세포 비율(%)은 CD34+ 세포 비율(%)과 높은 상관관계를 보였고(Spearman 상관계수=0.83333, p=0.0102), 아세포 수 비율이 높은 SFIb 배양조건이 EPC 증폭에 월등히 우수하므로, 상기 아세포의 수가 EPC 증폭 조건 선택에 대한 좋은 지표자(indicator)가 될 수 있음을 시사하였다.

비록 다른 세포 형태의 전체 퍼센트가 상대적으로 낮지만, 미성숙 단핵구(monocytes) 및 비만 세포(mast cells)가 SFIb-증폭된 세포에서 보다 많이 존재하였고, 반면에 골수세포(myelocytes), 메타골수세포(metamyelocytes) 및 호중구(neutrophils)가 STG-증폭된 세포에서 더 많이 존재하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

1. CD34+ 세포 분획을, SCF(Stem Cell Factor), FLT-3L(FLT-3 ligand), IL-3(interleukin-3) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 함유하는 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 내피전구세포의 증폭(expansion) 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 배양은 비-부착성(non-adhesive) 체외(ex vivo)배양인 것을 특징으로 하는 증폭방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 CD34+세포 분획은 CD34+세포가 30~82%로 이루어진 것을 특징으로 하는 증폭방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 내피전구세포의 증폭은 CD34+세포 분획의 증폭 배양에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 증폭방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 내피전구세포의 증폭은 증폭 전의 64~1468 배로 이루어지는 것을 특징으로 하는 증폭방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 내피전구세포는 골수, 말초혈액 및 제대혈로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 조직으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 증폭방법.
7. 제6항에 있어서,
   상기 내피전구세포는 인간 제대혈로부터 유래된 것을 특징으로 하는 증폭방법.
8. CD34+ 세포를 SCF, FLT-3L, IL-3 및 bFGF를 함유하는 무혈청 배지에서 비-부착성 체외 배양함으로써 내피전구세포를 선택 증폭(증식)시키는 단계; 및
   상기 증폭된 내피전구세포 집단을 내피세포 분화 조건에 두는 단계
   를 포함하는, 내피전구세포의 내피세포로의 분화방법.
9. 총 CD34+ 세포가 30~82%로 이루어진 CD34+ 세포 분획; 및 SCF, FLT-3L, IL-3, bFGF를 함유하는 것을 특징으로 하는 내피전구세포(EPC)의 증폭 또는 분화 촉진용 조성물.
10. 제1항의 방법에 의해 제조되고 증폭 전의 64~1468 배로 증폭된 내피전구세포를 포함하는 세포집단.
11. 제10항에 있어서,
    상기 증폭된 세포집단은, 아세포(blast)를 34.5% 이상으로 함유하는 것을 특징으로 하는 내피전구세포를 포함한 세포집단.
12. 제10항의 증폭된 내피전구세포를 포함하는 세포집단을 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
13. 제10항의 증폭된 내피전구세포를 포함하는 세포집단을 유효성분으로 포함하는 신생혈관 형성용 조성물.

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