KR101228625B1 - 인간 유래 단핵구 세포의 활성화 배지, 및 활성화된 단핵구 세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단핵구 세포의 생존능과 신생혈관형성 능력을 향상시키기 위한 세포 활성화 배지에 관한 것이며, 또한 본 발명은 상기 활성화 배지로 활성화 되어 신생혈관형성 능력과 항어팝토시스 능력이 향상된 단핵구 세포 및 상기 단핵구 세포 또는 이로부터 분화된 내피전구세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료 조성물에 관한 것이다.

Description

인간 유래 단핵구 세포의 활성화 배지, 및 활성화된 단핵구 세포{Washing medium for mononuclear cell, and washed mononuclear cell}

본 발명은 세포 활성화 배지에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 단핵구 세포의 생존률과 신생혈관형성 능력 및 항어팝토시스 능력을 향상시키기 위한 세포 활성화 배지에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 활성화 배지로 활성화된 단핵구 세포에 관한 것이다.

줄기 세포 생물학 분야의 발달에 따라, 세포 기반 치료법이 질환의 치료와 조직 재생 등을 위한 유망한 전략이 되어 왔다. 하지만, 세포 기반 치료의 기술적 개발에 있어서 최근의 문제점은 이식된 무배양 단핵구 세포, 줄기 세포 또는 내피 전구 세포의 열등한 생착률(engraftment)과 이어지는 저조한 치료 효과로서 이로 인해 한계에 봉착해 있다. 이들 현상은 허혈성 환경에서 이식된 세포의 증가된 어팝토시스(apoptosis)와 열등한 생존능을 야기한다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자는 단핵구 세포의 생존 능력, 항어팝토시스(anti-apoptosis) 능력, 신생혈관형성 능력 등을 세포의 배양과정 없이 세척과정에서 최단시간에 향상시킬 수 있는 방법을 찾기 위한 연구를 실시한 결과, 세포의 세척 배지에 성장 인자들의 특정 조합을 첨가함으로써 단핵구 세포의 생존능, 항어팝토시스 능력, 신생혈관형성 능력이 향상됨을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 단핵구 세포(MNC)의 신생혈관형성 능력, 생존 능력, 및 항어팝토시스(anti-apoptosis) 능력을 향상시키는 세포 활성화 배지의 제공을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 신생혈관형성 능력, 생존 능력, 및 항어팝토시스 능력이 향상된 단핵구 세포의 제공을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 신생혈관형성 능력, 생존 능력, 및 항어팝토시스 능력이 향상된 단핵구 세포를 포함하는 세포치료 조성물의 제공을 목적으로 한다.

일 태양에서, 본 발명은 단핵구 세포의 항어팝토시스 능력, 신생혈관형성 능력 및 생존 능력을 향상시키는 세포 활성화 배지를 제공한다.

본 발명자는 단핵구 세포의 항어팝토시스 능력 및 신생혈관형성 능력 등을 향상시킬 수 있는 세척 배지를 찾기 위한 연구 결과, 단핵구 세포의 세척을 위한 기본 배지에 EGF(상피세포 성장 인자(Epidermal growth factor)), TPO(트롬보포이에틴(Thrombopoietin)), Flt-3L, IGF(인슐린-유사 성장 인자(Insulin-like growth factor))-1, GCP(과립구 주화성 단백질(granulocyte chemotactic protein))-2 및 안지오포이에틴(Angiopoetin)-1의 6가지 성장 인자를 첨가함으로써 단핵구 세포의 항어팝토시스 능력 및 신생혈관형성 능력이 크게 향상됨을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 활성화 배지는 단핵구 세포를 위한 기본 세척 배지(예를 들어, 포스페이트-완충 염수(phosphate-buffered saline) (PBS), pH7.2, + 0.5% BSA + 2 mM EDTA)에 더하여 EGF, TPO, Flt-3L, IGF-1, GCP-2 및 안지오포이에틴-1의 6가지 성장 인자를 추가로 포함한다. 상기 EGF, TPO, Flt-3L, IGF 및 GCP-2, 안지오포이에틴-1의 6가지 성장 인자는 각각 100-1000 ng/ml의 농도로 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 200-600 ng/ml의 농도로 첨가될 수 있으며, 보다 바람직하게는 400 ng/ml의 농도로 첨가될 수 있다. 단핵구 세포를 위한 기본 세척 배지는 예를 들어, 포스페이트-완충 염수 (PBS), pH7.2, + 0.5% BSA + 2 mM EDTA로 이루어질 수 있으며, 그 외에도 당업자에게 알려져 있는 임의의 단핵구용 기본 세척 배지가 이용될 수 있으며, 기본 세척 배지 및 상기 성장 인자 등은 상업적 공급원으로부터 쉽게 구매하여 이용할 수 있다.

단핵구 세포의 항어팝토시스 능력과 신생혈관형성 능력을 향상시키기 위하여 본 발명의 활성화 배지로 단핵구 세포를 활성화할 경우, 활성화 시간은 10분 내지 1시간이 적합하며, 활성화 시간이 10분 미만이거나 1시간을 초과할 경우, 항어팝토시스 능력과 신생혈관형성 능력의 향상 효과가 크지 않으며, 보다 바람직하게는 30분의 활성화 시간이 적합하다.

본 발명의 활성화 배지로 활성화할 수 있는 단핵구 세포는 임의의 단핵구 세포일 수 있으며, 바람직하게는 인간 단핵구 세포이며, 보다 바람직하게는 인간 제대혈 유래 단핵구 세포, 인간 말초혈액 단핵구 세포, 인간 골수 유래 단핵구 세포 등일 수 있다.

다른 태양에서, 본 발명은 상기한 본 발명의 활성화 배지로 활성화되어 항어팝토시스 능력과 신생혈관형성 능력이 향상된 단핵구 세포를 제공한다.

본 발명자들의 연구 결과, 단핵구 세포를 위한 기본 세척 배지에 더하여 상기한 6가지 성장 인자인 400 ng/ml EGF, 400 ng/ml TPO, 400 ng/ml Flt-3L, 400 ng/ml IGF-1, 400 ng/ml GCP-2 및 400 ng/ml 안지오포이에틴-1을 포함하는 본 발명의 활성화 배지로 30분간 활성화된 단핵구 세포(이하에서 P-0.5로 칭함)는 활성화되지 않은 단핵구 세포에 비하여 항어팝토시스 유전자와 신생혈관형성 유전자들의 발현이 크게 증가됨이 확인되었다(도 1).

또한 본 발명의 활성화 배지로 활성화된 단핵구 세포(P-0.5)의 생체내 이식후 안전성을 확인하기 위해 Nod/Scid 마우스를 이용하여 세포이식 실험을 실시하여, 마우스 머리쪽 피부 부위에 세포 이식 후 생체내 부작용 여부를 관찰한 결과, 생체내 부작용이 전혀 나타나지 않았다 (도 2).

또한 이식한 세포(P-0.5)가 이식한 피부 조직내에서 생착이 잘 이루어지는지를 확인하기 위해, CM-Dil를 이용하여 세포에 형광표지를 하고 P-0.5 (1x10⁶개 세포) 이식 후 5주 후에 관찰한 결과 이식한 P-0.5가 마우스의 두피 조직 내에 그대로 잘 생착되어 있음을 확인할 수 있었다 (도 3, 및 도 4).

본 발명의 활성화 배지로 활성화된 단핵구 세포는 VEGF-A, HGF, IGF-1, FGF-2, CTGF, PDGF-B, PIGF, TGF-b 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 비세척 단핵구 세포에 비하여 과량으로 발현한다.

상기 단핵구 세포는 임의의 단핵구 세포일 수 있으며, 인간 제대혈 유래 단핵구 세포, 인간 말초혈액 단핵구 세포, 및 인간 골수 유래 단핵구 세포 등이 바람직하다.

이와 같이 본 발명의 활성화 배지를 이용한 활성화에 의해 항어팝토시스 능력과 신생혈관형성 능력이 향상된 단핵구 세포는 세포 기반 치료에 이용될 경우, 기존의 단핵구 세포에 비하여 우수한 생착률과 생존능에 의해 치료 효과를 크게 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 단핵구 세포는 기존에 단핵구 세포를 이용한 세포 치료 방법이 이용되던 질환의 치료에서 효과적으로 이용될 수 있으며, 예를 들어, 당뇨 족부궤양, 버거씨병, 및 허혈성 하지 또는 심근경색과 같은 허혈성 심혈관계 질환, 및 상처(창상)의 치료에 효과적으로 이용될 수 있으며, 또한 피부 노화 방지(예를 들어, 주름 방지 또는 개선, 탈모 예방) 등을 위해 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 활성화 배지에 의해 활성화되어 항어팝토시스 능력과 신생혈관형성 능력이 향상된 단핵구 세포 또는 이로부터 분화되어 동일하게 항어팝토시스 능력과 신생혈관형성 능력이 향상된 내피전구세포를 포함하는 세포치료 조성물을 제공한다. 본 발명의 세포치료 조성물은 당뇨 족부궤양, 버거씨병, 및 허혈성 하지 또는 심근경색과 같은 허혈성 심혈관계 질환, 상처(창상), 및 척추손상의 치료, 및 피부 노화 방지(예를 들어, 주름 방지 또는 개선, 여드름 흉터 감소, 탈모 예방 등)를 위해 효과적으로 이용될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 세포치료 조성물은 본 발명의 활성화 배지로 활성화된 인간 제대혈 유래 단핵구 세포, 인간 말초혈액 단핵구 세포, 또는 인간 골수 유래 단핵구 세포 또는 이로부터 분화된 내피전구세포를 유효 성분으로 포함한다.

본 발명의 조성물은 1 ml 당 1.0 x 10⁴ 개 내지 1.0 x 10⁸ 개, 바람직하게는 1.0 x 10⁵ 개 내지 1.0 x 10⁷ 개, 더욱 바람직하게는 1.0 x 10⁶ 개의 세포를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 통상적인 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 치료 효과를 나타낼 수 있는 효과적인 투여량을 포함한다. 적합한 제형의 예로는 비경구 투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제 등을 들 수 있다. 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있다.

상기 약학 제제에는 유효 성분 외에 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체가 추가로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등이, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제(base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물 또는 약학 제제는 통상적인 투여 방법에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 비경구적 투여 방법에 의해 투여될 수 있으며, 예를 들어, 주사에 의해 투여되거나, 질환 부위에 직접 이식되거나 혈관 내 주입에 의한 이식도 가능하다.

본 발명의 세포의 1일 투여량은 1.0 x 10⁵ 내지 1.0 x 10⁷, 바람직하게는 1.0 x 10⁵ 내지 1.0 x 10⁶ 세포/kg체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 실제 투여량은 질환, 질환의 중증도, 투여 경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 활성화 배지는 단핵구 세포의 생존 능력과 신생혈관형성 능력을 단시간의 활성화 에 의해 향상시킬 수 있으며, 이러한 활성화 배지로 활성화되어 생존 능력과 신생혈관형성 능력이 향상된 단핵구 세포는 기존에 단핵구 세포를 이용한 세포치료법에서의 열등한 생착률과 생존능의 문제점을 해결하여 다양한 질환을 위한 효과적인 세포치료제를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 활성화 배지로 활성화된 단핵구 세포의 항어팝토시스 또는 피부 조직 재생에 관련된 유전자들의 발현 패턴을 보여준다.
도 2는 활성화 배지로 활성화된 단핵구 세포가 마우스 머리 피부 조직에 이식 후 피부 조직 또는 생체 내에서의 이상반응을 관찰한 그림이다.
도 3은 CM-Dil를 이용하여 세포에 형광표지를 한 후 마우스 두피 조직에 세포를 이식하였고, 이식한 P-0.5 단핵구 세포가 이식 후 35일에도 마우스의 진피조직에 잘 생착되어 있음을 보여 주는 그림이다.
도 4는 CM-Dil를 이용하여 세포에 형광표지를 한 후 마우스 머리 피부 조직에 세포이식 후 35일 후에도 이 P-0.5 단핵구 세포가 피부의 진피조직에 잘 생착되어 있음을 조직학적으로 보여 주는 그림이다.

이하에서 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다.

실시예.

실시예 1. 세포 분리

인간 말초혈액 단핵구 세포(MNC)는 론자사 (Lonza)(Walkersville, MD, USA)로부터 구입하였다. 각각의 말초혈액 샘플을 2% 소 혈청 알부민(BSA, Life Technologies)을 함유한 동일한 부피의 포스페이트-완충 염수(PBS) (Life Technologies, Gaithersburg, MD)로 희석하였다. 희석된 세포 현탁액을 히스토파크(Histopaque)(Pharmacia, Uppsala, Sweden) 상에 계층화시키고 30분 동안 800 g에서 원심분리하였다. 계면으로부터 단핵구 세포를 수집하여 자기-활성화 세포 분류(MACS) 버퍼(0.5% BSA 및 2 mM EDTA를 가진 PBS, pH 7.2)로 세척하였다.

실시예 2. 세포 활성화

단핵구 세포를 400 ng/ml EGF, 4000 ng/ml TPO, 400 ng/ml Flt-3L, 400 ng/ml IGF-1, 400 ng/ml GCP-2 및 400 ng/ml 안지오포이에틴-1의 농도로 보충된 PBS에서 상온에서 30분, 및 1시간 동안 활성화하였다. 활성화 후 단핵구 세포는 다시 PBS로 세척하였다. 활성화하지 않은 단핵구 세포(P-0)는 대조군으로 이용하였다.

실시예 3. 정량적 RT - PCR ( qRT - PCR ) 분석

qRT-PCR 분석을 이전에 개시된 대로 실시하였다. 간단히 요약하면, RNA-stat 프로토콜(Iso-Tex Diagnostics, Friendswood, TX)을 이용하여 각 세포 유형으로부터 총 RNA를 분리하였다. 추출된 RNA를 이어서 cDNA 합성을 위하여 Taqman 역전사 시약(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 역전사시켰다. 실시간 역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 위하여, 인간-특이적 프라이머와 프로브를 이용하였다. 이용된 프라이머는 Applied Biosystems로부터 구입하여 이용하였으며 프라이머의 제조사의 물품목록은 하기 표와 같다.

	인간
		물품목록(inventory)
1	EGF	Hs01099999_m1
2	FGF2	Hs00266645_m1
3	GAPDH	Hs99999905_m1
4	HGF	Hs00300159_m1
5	IGF1	Hs01547657_m1
6	PDGFb	Hs00966526_m1
7	PIGF	Hs01119262_m1
8	TGFBI	Hs00998133_m1
9	VEGF-A	Hs99999070_m1
10	CTGF	Hs00170014_m1

RNA의 양은 ABI PRISM 7000 서열 검출 시스템을 이용하여 정량하였다. 하우스키핑 대조 유전자 GAPDH에 정규화시키고 캘리브레이터에 상관시킨 후, 실험 샘플에서 표적 유전자의 상대적 발현 수준을 식 Rel Exp=2^{-Δ CT}(배수 차이)를 이용하여 결정하였으며, 여기서 ΔCt = (표적 유전자의 Ct) - (내인성 대조 유전자, GAPDH의 Ct)이다. PCR 사이클의 수는 Lightcycler 3.5 소프트웨어(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)를 이용하여 측정하였다.

qRT-PCR 분석 결과, 항어팝토시스 또는 피부재생 관련 인자로 잘 알려진 TGF-b1, FGF-2, HGF, 인슐린 성장 인자(insulin growth factor) (IGF-1), 결합 조직 성장 인자(connective tissue growth factor) (CTGF), 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor) (PDGF)-b 및 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor) (VEGF)-A의 관련 인자들이 비활성화한 MNC 그룹(P-0)에 비하여 30분 활성화한 그룹(P-0.5)에서 통계적으로 유의하게 약 1.5배 및 2배만큼 상승하였다 (도 1).

실시예 4. 활성화한 단핵구 세포의 면역 결핍 마우스에 이식

6-9주령의, 무게가 18 내지 22 g인 수컷 NOD/Severe Combined Immuno-Deficiency (SCID) (NOD.CB17-Prkdc^SCID/Jstrain, The Jackson Laboratory, BarHarbor, ME, USA) 마우스를 이용하였다. 마우스를 마취시킨 후 마우스의 머리쪽 털을 제거하였다. 그 후 PBS 중의 1 X 10⁶ 개수의 P-0.5를 CM-DiI를 라벨하였고, 이 라벨된 단핵구 세포를 마우스의 머리의 진피조직에 주사하였다 (각 그룹당 n=5). 그 결과, 세포이식 후 35일 동안 활성화한 단핵구 세포(P-0.5) 이식에 따른 마우스 두피에서 어떠한 부작용도 관찰되지 않았다 (도2). 그리고 이식한 P-0.5 단핵구 세포가 마우스 진피조직 내에 잘 생착되어 있는지 확인하기 위하여 피부 안쪽을 확인한 결과 분홍색의 CM-Dil(분홍색)로 라벨한 세포가 존재하는 것을 육안으로 잘 확인할 수 있었다 (도3).

실시예 5. 조직학적 분석

이식한 세포가 진피 조직에 1달 후에도 생착되어 있는지를 확인하기 위하여 조직학적 분석을 실시하였다. 피부 조직을 파라포름알데히드에서 4시간 동안 고정시키고 15% 수크로스 용액에서 밤새 항온처리하였다. 조직을 OCT 배합물(Sakura Finetek USA, Torrance, CA)에서 매립하고, 액체 질소에서 순간 동결시키고 10 내지 20μm의 두께 증분으로 절편화하였다. 그리고 일차항체로 각질세포 마커인 사이토케라틴(cytokeratin) (1:250, Abcam, Cambridge, MA.)과 Cy2 (1:400, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) 이차 항체로 염색하였다. 세포의 핵은 DAPI를 이용하여 염색하였다. 공초점 현미경을 이용하여 사진을 찍었고, 이식한 세포의 생착 여부를 확인하였다. 그 결과, 세포 이식 후 35일 후에도 이식한 세포가 마우스의 진피 조직에 잘 생착되어 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (19)

1. 단핵구 세포의 기본 세척 배지에 더하여 EGF(상피세포 성장 인자(Epidermal growth factor)), TPO(트롬보포이에틴(Thrombopoietin)), Flt-3L, IGF(인슐린-유사 성장 인자(Insulin-like growth factor))-1, GCP(과립구 주화성 단백질(granulocyte chemotactic protein))-2 및 안지오포이에틴(Angiopoietin)-1의 6가지 성장 인자를 각각 100 - 1000 ng/ml의 농도로 포함하는 단핵구 세포 활성화 배지.
2. 제1항에 있어서, 상기 6가지 성장 인자는 각각 400 ng/ml의 농도로 포함되는 단핵구 세포 활성화 배지.
3. 제1항에 있어서, 단핵구 세포의 기본 세척 배지는 포스페이트-완충 염수(phosphate-buffered saline)(PBS), pH7.2, + 0.5% BSA + 2 mM EDTA로 이루어지는 것인 단핵구 세포 활성화 배지.
4. 제1항에 있어서, 단핵구 세포는 인간 제대혈 유래 단핵구 세포, 인간 말초혈액 단핵구 세포, 또는 인간 골수 유래 단핵구 세포인 단핵구 세포 활성화 배지.
5. 제1항의 활성화 배지로 활성화되어 활성화되지 않은 단핵구 세포에 비하여 항어팝토시스 능력과 신생혈관형성 능력이 향상된 단핵구 세포.
6. 제3항의 활성화 배지로 활성화되어 활성화되지 않은 단핵구 세포에 비하여 항어팝토시스 능력과 신생혈관형성 능력이 향상된 단핵구 세포.
7. 제5항에 있어서, 활성화 배지로 30분 동안 활성화된 단핵구 세포.
8. 제6항에 있어서, 활성화 배지로 30분 동안 활성화된 단핵구 세포.
9. 제5항에 있어서, VEGF-A, HGF, IGF-1, FGF-2, CTGF, PDGF-B, PIGF, 및 TGF-b 중 하나 이상을 발현하는 단핵구 세포.
10. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF-A, HGF, IGF-1, FGF-2, CTGF, PDGF-B, PIGF, 및 TGF-b 중 하나 이상을 발현하는 단핵구 세포.
11. 제5항에 있어서, 인간 제대혈 유래 단핵구 세포, 인간 말초혈액 단핵구 세포, 및 인간 골수 유래 단핵구 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 단핵구 세포.
12. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 제대혈 유래 단핵구 세포, 인간 말초혈액 단핵구 세포, 및 인간 골수 유래 단핵구 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 단핵구 세포.
13. 제10항에 있어서, 인간 제대혈 유래 단핵구 세포, 인간 말초혈액 단핵구 세포, 및 인간 골수 유래 단핵구 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 단핵구 세포.
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