JP2020521430A - 人工多能性幹細胞を線維芽細胞から生成するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、人工多能性幹細胞を線維芽細胞から生成するための方法に関する。本発明はまた、開示される方法によって使用される適切な培養培地;多能性幹細胞、上記多能性幹細胞の培養物、開示される方法によって単離される培養した多能性幹細胞に由来する分化した細胞およびそれら細胞の使用、例えば、自家細胞療法手順のような治療的使用に関する。
人工多能性幹細胞(iPSC)は、4つの規定された因子(KLF4、OCT3/4、SOX2およびc−MYC)の異所性発現を通じて種々の体細胞から得られ得る。これは、無限の細胞供給源とともに再生医療のための潜在的使用を提供する。
一局面において、本発明は、:
人工多能性幹細胞(iPSC)を生成するための方法であって、上記方法は、
a)単離された線維芽細胞を提供する工程;
b)線維芽細胞増殖培地(FGM)中で細胞を増殖させ、次いで、上記線維芽細胞を、インターロイキン−6(IL−6)を含む無血清培地(SFM)中で処理する工程;および次いで、そのようにして処理された線維芽細胞を、線維芽細胞増殖培地中で再度、好ましくはコンフルエントになるまで増殖させる工程;
c)上記細胞を凍結/融解させる工程を1〜5サイクル、好ましくは2〜3サイクル行い、次いで、細胞浮遊凝集物が形成するまで、上記細胞を増殖させる工程;
d)上記細胞を人工多能性幹細胞(iPSC)用の増殖培地に移し、上記細胞を、さらにコロニーが形成するまで増殖させ、このようなコロニーをフィーダー細胞上でさらに拡大して、人工多能性幹細胞(iPSC)を生じさせる工程
を包含する方法に関する。
e)上記形成されたiPSCの分子および細胞の特徴を特徴付ける工程。
または上記線維芽細胞は、齧歯類細胞であり、より好ましくはマウスに由来する。
−本発明に従う多能性幹細胞を、本発明に従う方法によって生成し、上記多能性幹細胞を所望の細胞タイプへと分化させる工程、
−このような分化した細胞を必要性のある患者に適用する/投与する工程
を包含する。
一実施形態において、線維芽細胞を処理するために、上記インターロイキン−6は、工程b)において、1ng/ml〜100ng/ml、好ましくは10ng/ml〜50ng/ml、より好ましくは20ng/ml〜40ng/mlの範囲の濃度、さらにより好ましくは約35ng/mlにおいて使用される。
−本発明に従う多能性幹細胞を本発明に従う方法によって生成し、上記多能性幹細胞を所望の細胞タイプへと分化させる工程、
−このような分化した細胞をその必要性のある患者に適用/投与する工程、
を包含する。一実施形態において、分化した専門の細胞は、損傷した細胞または機能していない細胞を置き換えるためにそのiPSCを細胞特異的培地中で増殖させることによって、例えば、処置が意図されるそれぞれの器官へとそれらを注射することによって、得られ得る。
本発明は、人工多能性幹細胞を線維芽細胞(例えば、ヒトおよびマウスの線維芽細胞)から生成するためのベクター不要のIL−6に依存した方法を成功裡に提供する。
本明細書で使用される場合、「幹細胞性(stemness)」とは、幹細胞の特性を表す。
a)単離された線維芽細胞を提供し、このような線維芽細胞を増殖培地中のインターロイキン−6で処理する工程
を包含する。
−本発明に従う方法によって本発明に従う多能性幹細胞を生成し、上記多能性幹細胞を所望の細胞タイプへと分化させる工程、
−このような分化した細胞を、必要性のある患者へと適用/投与する工程
を包含する。例えば、このような分化した細胞は、自家治療置換または美容的介入のために使用され得る。
乳房(NBF−6)および皮膚(HSFN1)由来の線維芽細胞を、無血清培地中で組換えヒトインターロイキン−6(IL−6)で24時間処理した。無血清培地(SFM)、乳房間質線維芽細胞(NBF82)、内腔細胞(LUM16)、筋上皮細胞(MYO)およびSFM処理したNBF−6細胞を、コントロールとして使用した。
1%〜20%(vol/vol)ウシ胎仔血清(FBS)、好ましくは20%(vol/vol)FBS、および0.1%〜2%(vol/vol)の上記で規定されるとおりの抗生物質−抗真菌剤溶液(上記で規定されるとおりの種々の抗生物質および抗真菌剤溶液の100×混合物(Gibcoカタログ番号15240−062から購入))、好ましくは1%の上記抗生物質/抗真菌剤溶液を補充した、M199培地およびF12培地の1:1混合物(vol/vol)。
1%〜10%(vol/vol)ウシ胎仔血清(FBS)(好ましくは2%(vol/vol))、0.1%〜2%(vol/vol)の上記で規定されるとおりの抗生物質−抗真菌剤溶液(上記で規定されるとおりの種々の抗生物質および抗真菌剤溶液の100×混合物(Gibcoカタログ番号15240−062から購入))(好ましくは1%(vol/vol))、HuMEC補充物キット(gipcoカタログ番号12754−016から購入)、およびウシ下垂体抽出物(5μg/ml)を補充した、DMEM培地およびF12培地の1:1混合物(vol/vol)
この培地の組成は、表2に記載されるとおりである:
IL−6は、線維芽細胞において多能性を誘導する
線維芽細胞(NBF−6およびHSFN1)を、IL−6(35ng/mL)を含むかまたは含まないSFM中で増殖させ、凍結/融解を2回行い、次いで、低付着プレートへと移し、iPSC培地中で増殖させた。ピックしたコロニーをフィーダー細胞上で拡大させると、そのコロニーは、代表的なiPSCクローンを形成し、これらを、NBF6−IL6−iPSCおよびHFSN1−IL6−iPSCと称した(図1A)。
全RNAを、TRI試薬(Sigma)を使用して、製造業者の説明書に従って精製し、RT−PCR Kit(Clontech,USA)を使用するcDNA合成の前に、RNase不含有DNaseで処理した。定量RT−PCR(qRT−PCR)のために、RT2 Real−TimeTM SYBR Green qPCRマスターミックス(Roche,Germany)を使用し、増幅を、ライトサイクラー480(Roche,germany)を利用して行った。融解曲線データを集めて、PCR特異性をチェックし、PCR生成物の量を、サイクル閾値(Ct)値によって測定し、次いで、各サンプルに関するGAPDHに対する特異的遺伝子の相対比を計算した。
GeneChip(登録商標) Human Exon 1.0 ST Arrays(HE 1.0 STAs)は、1エキソンあたりおよそ4個のプローブおよび1遺伝子あたりおよそ40個のプローブを使用して、100万個のエキソンクラスターにわたってインターロゲートする(interrogating)、140万個のプローブセットへとグループ分けされた約540万の5μmの特徴(プローブ)を含む。この高密度エキソンアプローチは、遺伝子およびエキソンレベルの発現分析を可能にし、エキソンスキッピング、イントロン保持、選択的スプライシング、および選択的プロモーター使用(alternative promoter usage)に起因する最も複雑なトランスクリプトーム変化の検出を容易にする。遺伝子レベルでの発現変化を試験できるようにするために、本発明者らは、HE 1.0 STAsを本発明者らの研究において使用した。まず、全RNAを、標準プロトコルを使用して抽出した。全RNAの量および質を、それぞれ、Nanodrop ND−1000 UV−分光光度計(NanoDrop Technologies)およびAgilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)を使用することによって決定した。全てのHE 1.0 STA関連手順を、Affymetrixのプロトコルおよびガイドラインに従って、全転写物センス標的標識アッセイを使用して行った。簡潔には、全RNAを、Affymetrixによって提供されるPoly−A RNAコントロールでスパイクインし、rRNA低減を、RiboMinus Human Transcriptome Isolation Kit(Life Sciences Corp.,Grand Island,NY,USA)を使用して行った。第1のサイクル、第1および第2のcDNA合成、ならびにインビトロ転写を、抽出した全RNAに対して行った。次いで、新たに合成したcRNAを精製し、第2のサイクルの第1鎖cDNA合成に使用し、これに続いて、cRNA加水分解およびセンス鎖DNAクリーンアップを行った。フラグメント化、末端標識、および一晩のハイブリダイゼーションを、アッセイマニュアルに記載される標準のAffymetrixプロトコルに従って行った。HE 1.0 STAsを、Affymetrix’s Fluidics Station 450の中で洗浄し、GeneChip scanner 3000(Affymetrix Inc.)でスキャンした。Exon Array Computational Tool(Affymetrix Inc.)を使用して、質評価および初期分析を行った。
網羅的遺伝子発現パターンを、IL−6で生成したiPSC(NBF6−IL6−iPSCおよびHFSN1−IL6−iPSC)とATCC−iPSCとの間で比較した。連続データ間の相関を、ピアソンの相関係数(r)によって予測し、関連p値を、その相関を変換してt検定を与えることによって計算した。全ての統計分析を、MATLABソフトウェアパッケージ(Mathworks,Natick,MA,USA)、PARTEK Genomics Suite(Partek Inc.,St.Lois,MO,USA)、およびSAS 9.4(Statistical Analysis System,SAS Institute Inc.,Cary,NC,USA)で行った。<0.05のp値を、有意と見做した。
全細胞溶解物サンプルを、プロテオーム分析に供した。各サンプルに関して、合計100μgのタンパク質を、以前に記載されるように溶液中トリプシン消化に供した。簡潔には、タンパク質を、0.1% RapiGest SF中、80℃において15分間変性させ、10mM ジチオスレイトール(DTT)中、60℃において30分間還元し、10mM ヨードアセトアミド(IAA)(1.0μL IAA/10μL)中で、遮光して40分間、室温においてアルキル化した。LC/MS分析の前に、サンプルを、一晩37℃においてトリプシン消化し、水性0.1% ギ酸で希釈した。
Synapt G2(Waters,Manchester,UK)での標識不要の定量一次元Nano Acquity液体クロマトグラフィータンデム質量分析法を使用して、サンプル群間の発現タンパク質プロファイルを生成した。その機器の検出器を、2ng/μL ロイシンエンケファリンを使用して設定した。500fmol[Glu]1−フィブリノペプチドBの別個の注入を、Mass Lynx IntelliStart(Waters,Manchester,UK)で質量(m/z)較正のために使用した。全ての分析を、Triazaic Nano source、およびポジティブイオンモビリティーモードnanoESI(Waters,Manchester,UK)でのイオン化で行った。データ非依存性獲得(MSE)/イオンモビリティー分離を行い、Mass Lynxプログラム(version.4.1,SCN833,Waters,Manchester,UK)を使用して、m/z 50〜2000Daの範囲にわたってデータを獲得した。全サンプルを、三連の実行で分析し、自動化データ処理およびデータベース検索を、タンパク質同定プラットフォーム用のProgenesis QI(Waters,UK and Nonlinear Dynamics,Newcastle,UK)上でUniprotヒト特異的タンパク質配列データベースを使用して行った。
次に、テロメラーゼ活性を、TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAアッセイによって評価したところ、NBF6−IL6−iPSCおよびHFSN1−IL6−iPSC細胞は、それらそれぞれのコントロール細胞と比較して、有意に高いテロメラーゼ活性を有することが示された(図2A)。さらに、NBF6−IL6−iPSCは、2ヶ月間にわたって指数関数的増殖を示した(図2B)。
テロメラーゼ活性アッセイを、TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAアッセイ(Roche)を使用して、製造業者によって指示されるとおりに行った。簡潔には、20μgの熱処理または偽処理した細胞抽出物を、PCR(94℃で30秒間、50℃で30秒間、および72℃で90秒間)によって増幅した。このPCR生成物を、抗ジゴキシゲニン−ペルオキシダーゼにハイブリダイズさせ、次いで、ELISA反応を行い、標準のELISAプレートリーダー(x−Mark, BIO−RAD)で450nmにおいてODを測定した。85℃で10分間の加熱は、テロメラーゼ活性を破壊する目的にかない、陰性コントロールとして使用される。
IL−6で生成したiPSCをさらに特徴付けるために、本発明者らは、それらの分化能力をインビトロで調査した。この目的のために、NBF6−IL6−iPSC細胞を、胚様体が形成されるまで懸濁培養し(図3A)、次いで、インビトロ分化のためにゼラチン被覆プレートに移した。図5Aは、異なる形状を有する細胞(例えば、ニューロンおよび上皮)の生成を示す。次に、本発明者らは、これらの細胞を免疫蛍光によって特徴付け、デスミン、α−SMA、ビメンチンに関して陽性(中胚葉);AFPに関して陽性(内胚葉);GFAPおよびβIII−チューブリンに関して陽性(外胚葉)の異なる細胞タイプの存在を示した(図3B)。
IPS細胞を、StemPro Accurase(細胞解離試薬(gipco)で処理することによって採取し、iPSC培地の存在下で5日間、低付着6ウェルプレートに移した。次いで、新たに形成された胚様体を、ゼラチン被覆プレートに移し、同じ培地中で8〜10日間培養した。異なる形状を有するこの生成された細胞を、顕微鏡下でモニターした。
NBF6−IL6−iPSCの多能性をインビボで試験するために、本発明者らは、ヌードマウスの背側腹側部にこれらの細胞を皮下移植した。腫瘍を注射後8週間で形成させ、次いで切除し、組織学的検査に供したところ、腫瘍が種々の組織(例えば、消化管様上皮(内胚葉)、筋肉(中胚葉)および表皮(外胚葉))を含むことが示された(図5)。
まとめると、これらの結果は、2回の凍結/融解サイクルに付随するIL−6処理が、線維芽細胞を多能性幹細胞へと脱分化させ得ることを示す。
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特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
人工多能性幹細胞(iPSC)を生成するための方法であって、該方法は、
a)単離された線維芽細胞を提供する工程;
b)線維芽細胞増殖培地(FGM)中で細胞を増殖させ、次いで、該線維芽細胞を、インターロイキン−6(IL−6)を含む無血清培地(SFM)中で処理し、;次いで、そのようにして処理された線維芽細胞を、線維芽細胞増殖培地中で再度、好ましくは、コンフルエントになるまで増殖させる工程;
c)1〜5サイクル、好ましくは2〜3サイクルの該細胞の凍結/融解を行い、次いで、細胞浮遊凝集物が形成するまで、該細胞を増殖させる工程;
d)該細胞を人工多能性幹細胞(iPSC)用の増殖培地に移し、該細胞を、コロニーが形成するまでさらに増殖させ、このようなコロニーをフィーダー細胞上でさらに拡大して、人工多能性幹細胞(iPSC)を生じさせる工程
を包含する方法。
(項目2)
e)前記形成されたiPSCの分子および細胞の特徴を特徴付ける工程
をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目3)
線維芽細胞をIL−6で処理するための前記無血清培地(SFM)は、0%〜1%(vol/vol)血清、好ましくは≦0.2%(vol/vol)血清、好ましくは約0.2%(vol/vol)血清の最大血清含有量を有し、ここで該血清は、より好ましくは、ウシ胎仔血清(FBS)である、項目1〜2のいずれかに記載の方法。
(項目4)
前記工程b)の処理は、2〜100時間、好ましくは12時間〜72時間の範囲で、より好ましくは12時間〜48時間の範囲で、さらにより好ましくは12時間〜36時間の範囲で、さらにより好ましくは12時間〜30時間の範囲で、さらにより好ましくは20時間〜28時間の範囲で、さらにより好ましくは24時間継続する、項目1〜3のいずれかに記載の方法。
(項目5)
前記工程b)の無血清培地は、0%〜1%(vol/vol)血清、好ましくは≦0.2%(vol/vol)血清、好ましくはウシ胎仔血清(FBS)、好ましくは約0.2%(vol/vol)FBSを補充し、0.1%〜2%(vol/vol)の、10000ユニット/ml ペニシリン、10000μg/ml ストレプトマイシンおよび25μg/ml アンホテリシンBを含む抗生物質−抗真菌剤溶液、好ましくは1%の該抗生物質−抗真菌剤溶液を補充した、M199培地およびF12培地の1:1−混合物(vol/vol)を含み、そしてここで前記工程b)における線維芽細胞増殖培地(FGM)は、1%〜20%(vol/vol)血清、好ましくは10%〜20%(vol/vol)血清、好ましくは20%(vol/vol)血清、より好ましくはウシ胎仔血清(FBS)を補充し、さらに0.1%〜2%(vol/vol)の、10000ユニット/ml ペニシリン、10000μg/ml ストレプトマイシンおよび25μg/ml アンホテリシンBを含む抗生物質−抗真菌剤溶液、好ましくは1%の該抗生物質−抗真菌剤溶液を補充した、M199培地およびF12培地の1:1−混合物(vol/vol)を含む、項目1〜4のいずれかに記載の方法。
(項目6)
前記インターロイキン−6は、ヒトインターロイキン−6であり、ここで好ましくは、該インターロイキンは、組換えヒトインターロイキン−6であり、好ましくは以下の配列:
を有する、項目1〜5のいずれかに記載の方法。
(項目7)
前記インターロイキン−6は、工程b)において、1ng/ml〜100ng/ml,
好ましくは10ng/ml〜50ng/ml、より好ましくは20ng/ml〜40ng/mlの範囲の濃度で、さらにより好ましくは約35ng/mlで、前記無血清培地(SFM)中で使用される、項目1〜6のいずれかに記載の方法。
(項目8)
前記工程d)における前記細胞の増殖は、懸濁細胞培養に都合の良い環境、例えば、低付着プレートにおいて起こる、項目1〜7のいずれかに記載の方法。
(項目9)
前記人工多能性幹細胞は、工程a)〜d)の実行によって生成され、前記処理を受けなかった同じタイプの細胞、すなわち、線維芽細胞と比較して、以下:CD44、ALDH、Oct3/4、Sox2、KLF4、c−Myc、Nanog、BMI−1のうちの1もしくはいくつか、好ましくは全てのより高い発現;そしてCD24、ならびにp16およびp53の発現が低減しているかまたは存在しないことによって特徴付けられる、項目1〜8のいずれかに記載の方法。
(項目10)
前記人工多能性幹細胞を、好ましくはピペッティングデバイス(pipetting device)によって、好ましくは顕微鏡下で単離する工程をさらに包含する、項目1〜9のいずれかに記載の方法。
(項目11)
前記工程a)における線維芽細胞は、哺乳動物細胞であり、好ましくは霊長類に由来し、より好ましくはヒトに由来するか;または該線維芽細胞は、齧歯類細胞であり、より好ましくはマウスに由来する、項目1〜10のいずれかに記載の方法。
(項目12)
項目1〜11のいずれかに記載の方法によって生成される人工多能性幹細胞または人工多能性幹細胞の培養物。
(項目13)
項目12に記載の人工多能性幹細胞もしくはその培養物に由来する分化した細胞、またはこのような分化した細胞の組織もしくは器官。
(項目14)
組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、外科的手順、美容的手順の方法における使用のための、項目13に記載の人工多能性幹細胞またはその培養物であって、ここで該使用は、このような人工多能性幹細胞または該人工多能性幹細胞から分化した細胞の、必要性のある患者への投与を包含する、人工多能性幹細胞またはその培養物。
(項目15)
組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、手術または美容的処置の方法のための医薬の製造のための、項目12に記載の多能性幹細胞の使用。
(項目16)
組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、手術または美容的処置のための方法であって、該方法は、
−項目12に記載の多能性幹細胞を、項目1〜11のいずれかに記載の方法によって生成し、該多能性幹細胞を所望の細胞タイプへと分化させる工程、
−このような分化した細胞を必要性のある患者に適用する/投与する工程
を包含する方法。
(項目17)
美容的方法であるかまたは医療的処置法である、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記方法は、ベクター不要の方法である、項目1〜11のいずれかに記載の方法。
(項目19)
前記方法は、遺伝子の異所性発現、例えば、KLF4、OCT3/4、SOX2および/またはc−MYCの異所性発現を伴わない、項目1〜11または18のいずれかに記載の方法。
(項目20)
前記方法は、インターロイキン−6以外のいかなるインターロイキンでの細胞の処理も、ビタミンCでのいかなる処理も、および前記細胞へのmicroRNAのいかなるトランスフェクションも伴わない、項目1〜11または18〜19のいずれかに記載の方法。
Claims (20)
- 人工多能性幹細胞(iPSC)を生成するための方法であって、該方法は、
a)単離された線維芽細胞を提供する工程;
b)線維芽細胞増殖培地(FGM)中で細胞を増殖させ、次いで、該線維芽細胞を、インターロイキン−6(IL−6)を含む無血清培地(SFM)中で処理し、;次いで、そのようにして処理された線維芽細胞を、線維芽細胞増殖培地中で再度、好ましくは、コンフルエントになるまで増殖させる工程;
c)1〜5サイクル、好ましくは2〜3サイクルの該細胞の凍結/融解を行い、次いで、細胞浮遊凝集物が形成するまで、該細胞を増殖させる工程;
d)該細胞を人工多能性幹細胞(iPSC)用の増殖培地に移し、該細胞を、コロニーが形成するまでさらに増殖させ、このようなコロニーをフィーダー細胞上でさらに拡大して、人工多能性幹細胞(iPSC)を生じさせる工程
を包含する方法。 - e)前記形成されたiPSCの分子および細胞の特徴を特徴付ける工程
をさらに包含する、請求項1に記載の方法。 - 線維芽細胞をIL−6で処理するための前記無血清培地(SFM)は、0%〜1%(vol/vol)血清、好ましくは≦0.2%(vol/vol)血清、好ましくは約0.2%(vol/vol)血清の最大血清含有量を有し、ここで該血清は、より好ましくは、ウシ胎仔血清(FBS)である、請求項1〜2のいずれかに記載の方法。
- 前記工程b)の処理は、2〜100時間、好ましくは12時間〜72時間の範囲で、より好ましくは12時間〜48時間の範囲で、さらにより好ましくは12時間〜36時間の範囲で、さらにより好ましくは12時間〜30時間の範囲で、さらにより好ましくは20時間〜28時間の範囲で、さらにより好ましくは24時間継続する、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記工程b)の無血清培地は、0%〜1%(vol/vol)血清、好ましくは≦0.2%(vol/vol)血清、好ましくはウシ胎仔血清(FBS)、好ましくは約0.2%(vol/vol)FBSを補充し、0.1%〜2%(vol/vol)の、10000ユニット/ml ペニシリン、10000μg/ml ストレプトマイシンおよび25μg/ml アンホテリシンBを含む抗生物質−抗真菌剤溶液、好ましくは1%の該抗生物質−抗真菌剤溶液を補充した、M199培地およびF12培地の1:1−混合物(vol/vol)を含み、そしてここで前記工程b)における線維芽細胞増殖培地(FGM)は、1%〜20%(vol/vol)血清、好ましくは10%〜20%(vol/vol)血清、好ましくは20%(vol/vol)血清、より好ましくはウシ胎仔血清(FBS)を補充し、さらに0.1%〜2%(vol/vol)の、10000ユニット/ml ペニシリン、10000μg/ml ストレプトマイシンおよび25μg/ml アンホテリシンBを含む抗生物質−抗真菌剤溶液、好ましくは1%の該抗生物質−抗真菌剤溶液を補充した、M199培地およびF12培地の1:1−混合物(vol/vol)を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記インターロイキン−6は、ヒトインターロイキン−6であり、ここで好ましくは、該インターロイキンは、組換えヒトインターロイキン−6であり、好ましくは以下の配列:
- 前記インターロイキン−6は、工程b)において、1ng/ml〜100ng/ml, 好ましくは10ng/ml〜50ng/ml、より好ましくは20ng/ml〜40ng/mlの範囲の濃度で、さらにより好ましくは約35ng/mlで、前記無血清培地(SFM)中で使用される、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記工程d)における前記細胞の増殖は、懸濁細胞培養に都合の良い環境、例えば、低付着プレートにおいて起こる、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記人工多能性幹細胞は、工程a)〜d)の実行によって生成され、前記処理を受けなかった同じタイプの細胞、すなわち、線維芽細胞と比較して、以下:CD44、ALDH、Oct3/4、Sox2、KLF4、c−Myc、Nanog、BMI−1のうちの1もしくはいくつか、好ましくは全てのより高い発現;そしてCD24、ならびにp16およびp53の発現が低減しているかまたは存在しないことによって特徴付けられる、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記人工多能性幹細胞を、好ましくはピペッティングデバイス(pipetting device)によって、好ましくは顕微鏡下で単離する工程をさらに包含する、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記工程a)における線維芽細胞は、哺乳動物細胞であり、好ましくは霊長類に由来し、より好ましくはヒトに由来するか;または該線維芽細胞は、齧歯類細胞であり、より好ましくはマウスに由来する、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の方法によって生成される人工多能性幹細胞または人工多能性幹細胞の培養物。
- 請求項12に記載の人工多能性幹細胞もしくはその培養物に由来する分化した細胞、またはこのような分化した細胞の組織もしくは器官。
- 組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、外科的手順、美容的手順の方法における使用のための、請求項13に記載の人工多能性幹細胞またはその培養物であって、ここで該使用は、このような人工多能性幹細胞または該人工多能性幹細胞から分化した細胞の、必要性のある患者への投与を包含する、人工多能性幹細胞またはその培養物。
- 組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、手術または美容的処置の方法のための医薬の製造のための、請求項12に記載の多能性幹細胞の使用。
- 組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、手術または美容的処置のための方法であって、該方法は、
−請求項12に記載の多能性幹細胞を、請求項1〜11のいずれかに記載の方法によって生成し、該多能性幹細胞を所望の細胞タイプへと分化させる工程、
−このような分化した細胞を必要性のある患者に適用する/投与する工程
を包含する方法。 - 美容的方法であるかまたは医療的処置法である、請求項16に記載の方法。
- 前記方法は、ベクター不要の方法である、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記方法は、遺伝子の異所性発現、例えば、KLF4、OCT3/4、SOX2および/またはc−MYCの異所性発現を伴わない、請求項1〜11または18のいずれかに記載の方法。
- 前記方法は、インターロイキン−6以外のいかなるインターロイキンでの細胞の処理も、ビタミンCでのいかなる処理も、および前記細胞へのmicroRNAのいかなるトランスフェクションも伴わない、請求項1〜11または18〜19のいずれかに記載の方法。
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