JP2024074958A - 合成メッセンジャーrnaを用いて尿細胞を神経幹細胞へ直接逆分化する方法 - Google Patents
合成メッセンジャーrnaを用いて尿細胞を神経幹細胞へ直接逆分化する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024074958A JP2024074958A JP2024062662A JP2024062662A JP2024074958A JP 2024074958 A JP2024074958 A JP 2024074958A JP 2024062662 A JP2024062662 A JP 2024062662A JP 2024062662 A JP2024062662 A JP 2024062662A JP 2024074958 A JP2024074958 A JP 2024074958A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- neural stem
- stem cells
- medium
- urine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 133
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 107
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 33
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 15
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 62
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 50
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 49
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 claims description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 27
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 16
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims description 9
- MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N L-ascorbic acid 2-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(OP(O)(O)=O)=C1O MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N 0.000 claims description 9
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 8
- 101000942967 Homo sapiens Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 claims description 7
- 102000046645 human LIF Human genes 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 claims description 4
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FHYUGAJXYORMHI-UHFFFAOYSA-N SB 431542 Chemical compound C1=CC(C(=O)N)=CC=C1C1=NC(C=2C=C3OCOC3=CC=2)=C(C=2N=CC=CC=2)N1 FHYUGAJXYORMHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 2
- FYBHCRQFSFYWPY-UHFFFAOYSA-N purmorphamine Chemical compound C1CCCCC1N1C2=NC(OC=3C4=CC=CC=C4C=CC=3)=NC(NC=3C=CC(=CC=3)N3CCOCC3)=C2N=C1 FYBHCRQFSFYWPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 7
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 abstract description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 abstract description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 30
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 18
- 108091046869 Telomeric non-coding RNA Proteins 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 13
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 13
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 12
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 10
- 101000652332 Homo sapiens Transcription factor SOX-1 Proteins 0.000 description 9
- 101100377226 Homo sapiens ZBTB16 gene Proteins 0.000 description 9
- 108010032788 PAX6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 9
- 102100037506 Paired box protein Pax-6 Human genes 0.000 description 9
- 108700003766 Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Proteins 0.000 description 9
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 9
- 102100040314 Zinc finger and BTB domain-containing protein 16 Human genes 0.000 description 9
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 9
- 102100030248 Transcription factor SOX-1 Human genes 0.000 description 8
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 8
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 8
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 8
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 229940121372 histone deacetylase inhibitor Drugs 0.000 description 7
- 239000003276 histone deacetylase inhibitor Substances 0.000 description 7
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 6
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 6
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 229940126513 cyclase activator Drugs 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 5
- 101000857270 Homo sapiens Zinc finger protein GLIS1 Proteins 0.000 description 5
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 5
- -1 Nanog Proteins 0.000 description 5
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 5
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 101150023320 B16R gene Proteins 0.000 description 3
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 3
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 3
- 101000979001 Homo sapiens Methionine aminopeptidase 2 Proteins 0.000 description 3
- 101000969087 Homo sapiens Microtubule-associated protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 101000692455 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor beta Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 102100023174 Methionine aminopeptidase 2 Human genes 0.000 description 3
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 3
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 3
- 102100026547 Platelet-derived growth factor receptor beta Human genes 0.000 description 3
- 102100021487 Protein S100-B Human genes 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 108010023918 S100 Calcium Binding Protein beta Subunit Proteins 0.000 description 3
- 101100316831 Vaccinia virus (strain Copenhagen) B18R gene Proteins 0.000 description 3
- 101100004099 Vaccinia virus (strain Western Reserve) VACWR200 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000001222 gaba-ergic neuron Anatomy 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940123320 Cyclase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 239000006147 Glasgow's Minimal Essential Medium Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 101000976622 Homo sapiens Zinc finger protein 42 homolog Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 2
- 102100023550 Zinc finger protein 42 homolog Human genes 0.000 description 2
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 2
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 2
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 2
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 2
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 210000004129 prosencephalon Anatomy 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000001202 rhombencephalon Anatomy 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 241000282817 Bovidae Species 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 101150026630 FOXG1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100020871 Forkhead box protein G1 Human genes 0.000 description 1
- 201000011240 Frontotemporal dementia Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102100023823 Homeobox protein EMX1 Human genes 0.000 description 1
- 102100027849 Homeobox protein GBX-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100034862 Homeobox protein Hox-B2 Human genes 0.000 description 1
- 102100028404 Homeobox protein Hox-B4 Human genes 0.000 description 1
- 102100030636 Homeobox protein OTX1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030634 Homeobox protein OTX2 Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000762379 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001048956 Homo sapiens Homeobox protein EMX1 Proteins 0.000 description 1
- 101000859754 Homo sapiens Homeobox protein GBX-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001019752 Homo sapiens Homeobox protein Hox-B2 Proteins 0.000 description 1
- 101000839788 Homo sapiens Homeobox protein Hox-B4 Proteins 0.000 description 1
- 101000584392 Homo sapiens Homeobox protein OTX1 Proteins 0.000 description 1
- 101000584400 Homo sapiens Homeobox protein OTX2 Proteins 0.000 description 1
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 208000000609 Pick Disease of the Brain Diseases 0.000 description 1
- 101150088324 REX4 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 102100025883 Zinc finger protein GLIS1 Human genes 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000003291 dopaminomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003371 gabaergic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 102000052983 human POU5F1 Human genes 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 108010017843 platelet-derived growth factor A Proteins 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000007651 self-proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
Abstract
【課題】本発明の目的は、尿細胞から神経幹細胞への逆分化を誘導する組成物を提供することである。本発明の他の目的は、尿細胞から神経幹細胞への逆分化を誘導する方法を提供することである。本発明さらに他の目的は、尿細胞から逆分化した神経幹細胞を有効成分として、神経損傷疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
【解決手段】本発明は、逆分化因子Oct4、Sox2、Klf4及びGlis1のmRNAを導入して、尿細胞から神経幹細胞の逆分化誘導方法及び前記方法により誘導された神経幹細胞を有効成分とする神経損傷疾患の予防または治療用組成物に関する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、逆分化因子Oct4、Sox2、Klf4及びGlis1のmRNAを導入して、尿細胞から神経幹細胞の逆分化誘導方法及び前記方法により誘導された神経幹細胞を有効成分とする神経損傷疾患の予防または治療用組成物に関する。
【選択図】なし
Description
本発明は、尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化方法、及び前記方法により製造された直接逆分化した神経幹細胞を含む神経損傷疾患の治療のための薬学的組成物に関する。
幹細胞(stem cell)とは、無限の自己増殖能力及び身体内で必要とされる特定の細胞及び組織への分化能を持つ細胞を意味する。幹細胞は、その種類を3つに分類しており、その種類としては、初期胚から分離した胚性幹細胞(embryonic stem cell、ES細胞)、胚期の原始生殖細胞から分離した胚性生殖細胞(embryonic germ cell、EG細胞)、及び多能性成体幹細胞(multipotent adult progenitor cell、MAPC細胞)がある。
幹細胞は、特化した機能を持つ細胞に分化する潜在力を有しているので、様々な臓器の機能回復のための細胞治療剤としての研究対象となっており、最近では整形と美容に至るまで、その活用範囲が拡大している傾向にある。
成体幹細胞の体内における役割は、大きく2つに要約できるが、第一は、幹細胞そのものが私たちの体で損傷した組織や細胞に分化し、再び再生させる役割であり、第二は、一生の間に持続的に成長因子及びサイトカインなどのタンパク質を分泌して近くの細胞の成長及び再生を助ける役割を果たす。
直接逆分化(direct reprogramming)方式は、体細胞を望む他のタイプの細胞に転換できる技術である。日本の山中教授の逆分化(reprogramming)とは異なり、万能性幹細胞の状態を経ないので、少ない時間と高効率を示すとともに、万能性幹細胞の腫瘍発生のリスクや追加分化費用などを解決できる。しかし、現在行われている直接逆分化方式は、細胞源としてマウス細胞を主に用いてヒト体細胞で同一に再現される確率が高くない。また、ヒト体細胞の中ではよく皮膚細胞(線維芽細胞)を用いるが、この場合、侵襲的な方式の細胞源採取方法が必要となり、供与者の苦痛、安全性のリスクをもたらして利便性が低下する。また、直接逆分化時に要求される逆分化因子(遺伝子)導入方式において主にウイルスを用いているため、臨床的利用が困難であり、ウイルスを用いた遺伝子挿入システム(integration-system)の場合、誘電体に無分別な挿入による変異を誘発するため、治療用として適していない。
そこで、本発明者らは、細胞源として採取が容易なヒト尿由来細胞を用いており、逆分化因子の細胞導入に合成mRNAのトランスフェクション(transfection)を用いることにより前記問題を解決し、尿細胞から神経幹細胞への高効率の直接逆分化に要求される最適の培養条件を確認して、本発明を完成した。
本発明の目的は、尿細胞から神経幹細胞への逆分化を誘導する組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、尿細胞から神経幹細胞への逆分化を誘導する方法を提供することである。
本発明さらに他の目的は、尿細胞から逆分化した神経幹細胞を有効成分として、神経損傷疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
本発明は、
(i)Oct4タンパク質またはOct4タンパク質をコードする核酸と、
(ii)Sox2タンパク質またはSox2タンパク質をコードする核酸と、
(iii)Klf4タンパク質またはKlf4タンパク質をコードする核酸と、
(iv)Glis1タンパク質またはGlis1タンパク質をコードする核酸と、を含む尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する組成物を提供する。
(i)Oct4タンパク質またはOct4タンパク質をコードする核酸と、
(ii)Sox2タンパク質またはSox2タンパク質をコードする核酸と、
(iii)Klf4タンパク質またはKlf4タンパク質をコードする核酸と、
(iv)Glis1タンパク質またはGlis1タンパク質をコードする核酸と、を含む尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する組成物を提供する。
本発明において、用語の「逆分化神経幹細胞」とは、分化した細胞に逆分化技術を用いて神経幹細胞と類似または同一の多分化能(multi-potent)を持つ未分化状態の幹細胞を確立する方式で作製された細胞を含む。誘導神経幹細胞は、神経幹細胞と同一または類似した特性を有しているが、具体的には、似たような細胞の形態を示し、遺伝子及びタンパク質の発現パターンが類似し、生体内外で多分化能を持つことができる。したがって、本発明の逆分化神経幹細胞は、神経細胞(ニューロン)、アストロサイト、希突起膠細胞、GABA性神経細胞またはドーパミン性神経細胞などに分化可能なものであってもよい。
本発明において、用語の「尿細胞(Urine cells;UCs)」とは、尿から何の不便も苦痛もなく、いつでも容易に反復的に得られる体細胞として知られている。
本発明者は、尿細胞において逆分化因子であるOct4、Sox2、Klf4及びGlis1を発現させる場合、既に分化した細胞タイプの尿細胞が分化能を持つ神経幹細胞に逆分化(de-differentiation)されることを発見した。
前記用語の「逆分化因子」は、2006年Yamanaka教授チームによって導入された概念である逆分化(Reprogramming)から始まった。成体のすべての細胞は、正常発達過程を経て分化していない状態から次第に分化し、各機能が専門化された細胞に変化する。その中で受精卵の細胞は、全能性(Totipotent)を有しており、その後に発達段階が進むにつれて胚盤胞になると、内部細胞塊(inner cell mass)と外側細胞に区分が可能であるが、このときの内部細胞塊細胞が胚細胞と生殖細胞として発生することがあり、これを万能性(pluripotent)という。この胚性幹細胞は、万能性特有の遺伝子発現の様相を示すが、その代表的な例がOct4、Sox2、Nanog、Lin28などである。逆分化は、体細胞にこのような特異的な遺伝子発現を誘導し、胚性幹細胞及び成体幹細胞などの未分化細胞と類似した性質に戻す技術と言える。Oct4、Sox2、Klf4及びGlis1は、逆分化関連の一連の研究において使用されてきた様々な因子のうちの一部として尿細胞から神経幹細胞へ逆分化させるのに本発明者らが用いた。
本発明の組成物に用いられるOct4、Sox2、Klf4及びGlis1は、ヒトとウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、レイヨウ、イヌなどの動物由来のすべてのOct4、Sox2、Klf4及びGlis1を含み、好ましくは、ヒトOct4、Sox2、Klf4及びGlis1である。また、神経幹細胞への逆分化に用いられる本発明のOct4、Sox2、Klf4及びGlis1タンパク質は、これらの野生型(wild type)のアミノ酸配列を有するタンパク質だけでなく、Oct4、Sox2、Klf4及びGlis1タンパク質の変異体を含んでもよい。
具体的な一実施例において、前記逆分化に初めて使用されたOct4、Sox2、Klf4及びGlis1の遺伝子配列は、Nature.2011 Jun 8;474(7350):225-9に開示されたものを使用した。
Oct4、Sox2、Klf4及びGlis1タンパク質の変異体とは、Oct4、Sox2、Klf4及びGlis1の天然アミノ酸配列と1つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保全的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有するタンパク質をを意味する。前記変異体は、天然タンパク質と同一の生物学的活性を示す機能的等価物であるか、必要によってタンパク質の物理化学的性質が変形した変異体であってもよい。物理、化学的環境に対する構造的安定性が増大し、または生理学的活性が増大した変異体である。
前記Oct4、Sox2、Klf4及びGlis1タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸は、野生型または前記のような変異体形態のOct4、Sox2、Klf4及びGlis1タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸であって、一つ以上の塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせによって変異されてもよく、天然から分離されるか、化学的合成法を用いて製造してもよい。
前記Oct4、Sox2、Klf4及びGlis1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、単鎖または二重鎖であってもよく、DNA分子(ゲノム、cDNA)またはRNA分子であってもよい。本発明の具体的な実施例において、Oct4、Sox2、Klf4及びGlis1タンパク質をコードする核酸は、合成メッセンジャーRNA(mRNA)を用いており、前記合成メッセンジャーRNAは、Oct4、Sox2、Klf4及びGlis1を発現するDNAを導入した合成mRNA発現ベクターを用いて製造されてもよい。
本発明は、尿細胞にOct4、Sox2、Klf4及びGlis1タンパク質または前記タンパク質をコードする核酸を導入する段階を含む尿細胞を神経幹細胞へ直接逆分化を誘導する方法を提供する。
より具体的には、
(a)尿から尿細胞を分離培養する段階と、
(b)前記培養した尿細胞にOct4、Sox2、Klf4及びGlis1タンパク質または前記タンパク質をコードする核酸を導入する段階と、
(c)前記組成物が導入された尿細胞を神経幹細胞誘導培地で培養し、神経幹細胞へ直接逆分化を誘導する段階と、
(d)前記神経幹細胞へ直接逆分化を誘導した細胞から神経幹細胞の特性を持つ神経幹細胞株を選別する段階と、を含んでもよい。
(a)尿から尿細胞を分離培養する段階と、
(b)前記培養した尿細胞にOct4、Sox2、Klf4及びGlis1タンパク質または前記タンパク質をコードする核酸を導入する段階と、
(c)前記組成物が導入された尿細胞を神経幹細胞誘導培地で培養し、神経幹細胞へ直接逆分化を誘導する段階と、
(d)前記神経幹細胞へ直接逆分化を誘導した細胞から神経幹細胞の特性を持つ神経幹細胞株を選別する段階と、を含んでもよい。
前記段階(a)において、尿細胞の培養は、FBS(fetal bovine serum)及びbFGF(basic fibroblast growth factor)、EGF(epithelial growth factor)含有培地において行われてもよい。
本発明において用いられる用語の「培地(culture medium)」とは、in vitro上で細胞の成長及び生存を支持できるようにする培地を意味し、尿細胞及び逆分化神経幹細胞誘導及び培養に適切な当分野において用いられる通常の培地をすべて含む。細胞の種類に応じて培地及び培養条件を選ぶことができる。培養に用いられる培地は、好ましくは、細胞培養最小培地(cell culture minimum medium;CCMM)で、一般的に炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。このような細胞培養最小培地には例えば、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)、MEM(Minimal essential Medium)、BME(Basal Medium Eagle)、RPMI1640、F-10、F-12、αMEM(α Minimal essential Medium)、GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium)、及びIMEM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)などがあるが、これに制限されない。また、前記培地は、ペニシリン(penicillin)、ストレプトマイシン(streptomycin)またはゲンタマイシン(gentamicin)などの抗生剤を含んでもよい。
本発明の具体的な実施例において、尿から分離した細胞をFBS、bFGF及びEGFを含有する基本培地で培養することにより得ることができ、具体的にFBSが含まれたハイグルコースDMEM及びREGM(Renal Epithelial Cell Growth Medium)培地にbFGF及びEGFを添加して培養することにより、得ることができる。本発明のより具体的には、前記ハイグルコースDMEM及びREGM培地は、L-グルタミン及びペニシリン-ストレプトマイシンをさらに含んでもよい。
前記(b)段階において、逆分化因子を尿細胞に導入する方法は、当業界で通常用いられる細胞に核酸分子またはタンパク質を提供する方法を制限なく使用でき、好ましくは、逆分化因子を分化した細胞の培養液に投与する方法または逆分化因子を分化した細胞に直接注入する方法を用いることができ、このときに用いられる逆分化因子は、該因子の遺伝子を挿入したウイルスベクターに形質感染させたパッケージング細胞から得られたウイルス、試験管内転写(in vitro transcription)により生産したメッセンジャーRNA、または様々な細胞株内で生産されたタンパク質などの形態で用いることができる。本発明の具体的な実施例において、尿細胞への前記逆分化因子の導入は、Oct4、Sox2、Klf4及びGlis1をコードするDNAの転写によって生成されたメッセンジャーRNAを使用した。
前記転写合成されたメッセンジャーRNAを分化した細胞に直接注入する方法は、当業界に公知の任意の方法を選んで使用でき、これに制限されるものではないが、微細注入法(microijection)、電気穿孔法(electroporation)、粒子噴射法(particle bombardment)、直接筋肉注入法、インシュレータ(insulator)及びトランスポゾンを用いた方法の中から適宜選んで適用してもよい。具体的に本発明の実施例において、逆分化因子のメッセンジャーRNAは、電気穿孔法を用いて尿細胞に導入された。
前記段階(c)において、Oct4、Sox2、Klf4及びGlis1タンパク質をコードする核酸が導入された尿細胞を神経幹細胞に誘導する培地(神経幹細胞誘導培地)は、DMEM/F12培地とNeurobasal培地を1:1体積比で混合し、前記培地の混合物に1xN2、1xB27、human LIF、TGF-beta inhibitor及びGSK3-beta inhibitorを添加した培地であってもよい。より具体的には、前記培地は、Shh agonist、adenylyl cyclase activator、histone deacetylase inhibitor及びascorbic acid 2-phosphateのうちの一つ以上をさらに含んでもよい。本発明の具体的な実施例において、Shh agonist、adenylyl cyclase activator、histone deacetylase inhibitor及びascorbic acid 2-phosphateをすべて添加した培地における神経幹細胞転換率が最も優れていることを確認した。
また、前記培地における尿細胞の培養は、低酸素(O2hypoxia)条件で行う場合、誘導効率が増加し得る。
前記段階(d)で誘導された神経幹細胞の選別は、前記段階(C)を行った後、生成された神経幹細胞コロニーを採取することであり、前記選別された神経幹細胞は、神経幹細胞培地で培養できる。前記神経幹細胞培地は、DMEM/F12培地とNeurobasal培地を1:1の体積比で混合した培地に1xN2、1xB27、human LIF、TGF-beta inhibitor及びGSK3-beta inhibitorを添加した培地であってもよい。さらに、前記誘導された神経幹細胞は、0.5mM EDTA溶液もしくはAccutase溶液を用いて継代培養できる。
また、本発明は、前記方法により誘導された神経幹細胞を有効成分として含む神経損傷疾患予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
神経幹細胞は、神経細胞(ニューロン)、アストロサイト、希突起膠細胞、GABA性神経細胞またはドーパミン性神経細胞などに分化可能な多分化能を持つ細胞であって、前記損傷又は消失した神経細胞を修復でき、前記神経細胞の損傷または消失により発生する疾患を制限なく治療が可能である。
具体的には、前記神経細胞の損傷により発生する疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー、ピック病(Pick's disease)、ハンチントン病(Huntington's disease)、筋萎縮性側面硬化症(amyotriophic lateral sclerosis)、虚血性脳疾患(stroke)、脱髄疾患(demyelinating disease)、多発性硬化症、てんかん、退行性神経疾患及び脊髄損傷(spinal cord injury)からなる群から選ばれてもよい。
本発明は、ヒト尿由来細胞を細胞源として活用し、細胞源の確保の利便性を最大化し、合成mRNAを用いたnon-integration方式の直接的逆分化方法により臨床的利用の可能性を高めた技術である。
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。しかし、下記実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
実施例1:尿から尿細胞(Urine cell)の分離
1972年イギリスのSutherlandとBainが開発した技術を基本とし、具体的には、次の通りである。まず、供与者から提供された尿を1000gに10分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、下層に残ったペレットを1%Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B抗生剤が含まれたPBS溶液20mlに希釈させた。次に希釈されたPBS+ペレット溶液を1000gに10分間遠心分離した。再び上澄み液を除去した後、下層に残ったペレットをgelatinがコーティングされた12 well cell culture dishに基本培地(DMEM/F12を基本として1%Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B抗生剤、1%L-glutamine、10%FBSが含まれた培地)1mlで希釈してシーディングした。その後、3日間基本培地を1mlずつ添加して培養した後、成長培地(DMEMとREGMを1:1で混合した培地を基本とし、1%Penicillin/Streptomycin抗生剤、1%L-glutamine、5%FBS、10ng/mlのbFGF、10g/mlのEGFを含む培地)に変更して培養した。
1972年イギリスのSutherlandとBainが開発した技術を基本とし、具体的には、次の通りである。まず、供与者から提供された尿を1000gに10分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、下層に残ったペレットを1%Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B抗生剤が含まれたPBS溶液20mlに希釈させた。次に希釈されたPBS+ペレット溶液を1000gに10分間遠心分離した。再び上澄み液を除去した後、下層に残ったペレットをgelatinがコーティングされた12 well cell culture dishに基本培地(DMEM/F12を基本として1%Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B抗生剤、1%L-glutamine、10%FBSが含まれた培地)1mlで希釈してシーディングした。その後、3日間基本培地を1mlずつ添加して培養した後、成長培地(DMEMとREGMを1:1で混合した培地を基本とし、1%Penicillin/Streptomycin抗生剤、1%L-glutamine、5%FBS、10ng/mlのbFGF、10g/mlのEGFを含む培地)に変更して培養した。
実施例2:電気穿孔法を用いた尿細胞への逆分化因子導入
実施例1で培養された尿由来細胞を電気穿孔法(electroporation)によって合成mRNAを導入させる方法で、具体的には、次の通りである。合成mRNAの場合、通常の試験管転写(in vitro transcription)kit(RiboMAX製、Large Scale RNA Production Systems、Promega)を通じて合成され、合成されるmRNAのバックボーン(backbone)となるDNAは、T7-VEE-OKS-iG(Steven Dowdy、Addgene)で、OCT4、KLF4、SOX2及びGLIS1の遺伝子を含んでいる(図1)。前記OCT4、KLF4、SOX2及びGLIS1遺伝子の配列は、Nature.2011 Jun 8;474(7350):225-9.に開示されたものを使用し、該遺伝子配列とmRNA適用法は、Cell Stem cell.2013 Aug 1;13(2):246-54及び米国特許US 9,862,930 B2を参考にした。
実施例1で培養された尿由来細胞を電気穿孔法(electroporation)によって合成mRNAを導入させる方法で、具体的には、次の通りである。合成mRNAの場合、通常の試験管転写(in vitro transcription)kit(RiboMAX製、Large Scale RNA Production Systems、Promega)を通じて合成され、合成されるmRNAのバックボーン(backbone)となるDNAは、T7-VEE-OKS-iG(Steven Dowdy、Addgene)で、OCT4、KLF4、SOX2及びGLIS1の遺伝子を含んでいる(図1)。前記OCT4、KLF4、SOX2及びGLIS1遺伝子の配列は、Nature.2011 Jun 8;474(7350):225-9.に開示されたものを使用し、該遺伝子配列とmRNA適用法は、Cell Stem cell.2013 Aug 1;13(2):246-54及び米国特許US 9,862,930 B2を参考にした。
合成されたmRNAは、0.5μgを1時間の間0.2ug/mlのB18Rタンパク質で前処理された1×10^6個の尿由来細胞に1600V、10ms、3回の電気穿孔法で処理することにより導入した。導入された尿由来細胞は、0.2ug/mlのB18R proteinが含まれた成長培地で2日間培養した。
本発明者らは、電気穿孔法による導入の効率を可視化して判断、検証するため、GFP蛍光遺伝子を含む合成mRNAの導入を同時に進行してGFP蛍光タンパク質を発現するヒト尿由来細胞の効率をFACS分析を通じて検証した。前記検証を通じて電気穿孔法による合成mRNAのヒト尿由来細胞導入効率が処理後、48時間頃に72.2%に至ることを確認し、次の段階である神経幹細胞誘導実験を進めるのに十分であると判断した(図2)。
実施例3:尿由来逆分化神経幹細胞誘導
マトリゲル(MatrigelTM)がコーティングされた細胞培養皿にmRNAが導入された尿由来細胞をシーディングした後、神経幹細胞培地(DMEM/F12培地とNeurobasal(Gibco)培地を1:1で混合し、1xN2(Gibco)、1xB27(Gibco)、10ng/mlのヒトLIF、2uMのSB431542(TGF-beta inhibitor)と3uMのCHIR99021(GSK3-beta inhibitor)を添加した培地)を基本として0.5uMのpurmorphamine(Shh agonist)、10uMのfolskolin(adenylyl cyclase activator)、100uMのsodium butyrate(histone deacetylase inhibitor)と64ug/mlのascorbic acid 2-phosphateを添加した神経幹細胞誘導培地で7-10日間培養した。誘導完了時に神経幹細胞コロニーの発生を確認できた(図3)。
マトリゲル(MatrigelTM)がコーティングされた細胞培養皿にmRNAが導入された尿由来細胞をシーディングした後、神経幹細胞培地(DMEM/F12培地とNeurobasal(Gibco)培地を1:1で混合し、1xN2(Gibco)、1xB27(Gibco)、10ng/mlのヒトLIF、2uMのSB431542(TGF-beta inhibitor)と3uMのCHIR99021(GSK3-beta inhibitor)を添加した培地)を基本として0.5uMのpurmorphamine(Shh agonist)、10uMのfolskolin(adenylyl cyclase activator)、100uMのsodium butyrate(histone deacetylase inhibitor)と64ug/mlのascorbic acid 2-phosphateを添加した神経幹細胞誘導培地で7-10日間培養した。誘導完了時に神経幹細胞コロニーの発生を確認できた(図3)。
また、さらに1xN2、1xB27、human LIF、TGF-beta inhibitor及びGSK3-beta inhibitorを添加した培地でShh agonist、adenylyl cyclase activator、histone deacetylase inhibitor及びascorbic acid 2-phosphateのうち1つ以上をさらに含むとき、神経幹細胞の誘導効率に及ぼす影響を確認した。Shh agonist、adenylyl cyclase activator、histone deacetylase inhibitor及びascorbic acid 2-phosphateをすべて添加した培地における神経幹細胞転換率が最も優れていることを確認した(図21)。
前記誘導された神経幹細胞コロニーを採取してMatrigelがコーティングされた細胞培養皿に神経幹細胞培地を入れて培養する。誘導された神経幹細胞は、以後、0.5mM EDTA溶液あるいはAccutase溶液を用いて継代培養でき、以後、次の実施例において前記誘導された神経幹細胞の様々な特性を検証する実験を行った。
実施例4:誘導された神経幹細胞の分子生物学的特性分析
本発明から誘導された神経幹細胞の分子生物学的特性を検証するための実験を行った。
本発明から誘導された神経幹細胞の分子生物学的特性を検証するための実験を行った。
<4-1>
H9胚性幹細胞から由来する神経幹細胞をpositive controlとしたRT-PCRによるmRNA水準分析を通じて誘導された神経幹細胞がSOX1、SOX2、PAX6、PLZFのような神経幹細胞マーカー遺伝子を発現していることを確認した(図4)。本実験に使用されたプライマー配列は、次の通りである:
SOX1(forward-ACACTTGAAGCCCAGATGG;配列番号1、
reverse-ATAGGCTCACTTTTGGACGG);配列番号2、
SOX2(forward-TCAGGAGTTGTCAAGGCAGAGA;配列番号3、
reverse-CCGCCGCCGATGATTGTTATTA;配列番号4)、PAX6(forward-GGCTCAAATGCGACTTCAG;配列番号5、
reverse-CCCTTCGATTAGAAAACCATACC;配列番号6)、PLZF(forward-TATACAGCCACGCTGCAAGCCA;配列番号7、reverse-TGGTCTCCAGCATCTTCAGGCA;配列番号8)。
H9胚性幹細胞から由来する神経幹細胞をpositive controlとしたRT-PCRによるmRNA水準分析を通じて誘導された神経幹細胞がSOX1、SOX2、PAX6、PLZFのような神経幹細胞マーカー遺伝子を発現していることを確認した(図4)。本実験に使用されたプライマー配列は、次の通りである:
SOX1(forward-ACACTTGAAGCCCAGATGG;配列番号1、
reverse-ATAGGCTCACTTTTGGACGG);配列番号2、
SOX2(forward-TCAGGAGTTGTCAAGGCAGAGA;配列番号3、
reverse-CCGCCGCCGATGATTGTTATTA;配列番号4)、PAX6(forward-GGCTCAAATGCGACTTCAG;配列番号5、
reverse-CCCTTCGATTAGAAAACCATACC;配列番号6)、PLZF(forward-TATACAGCCACGCTGCAAGCCA;配列番号7、reverse-TGGTCTCCAGCATCTTCAGGCA;配列番号8)。
<4-2>
免疫染色法を用いたタンパク質水準分析を通じて誘導された神経幹細胞がSOX1、NESTIN、SSEA1、SOX2、PAX6及びPLZFのような神経幹細胞マーカー遺伝子を発現していることを確認した(図5)。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである:SOX1(AF3369、R&D Systems)、NESTIN(MAB5326、Millipore)、SSEA1(MAB4301、Millipore)、SOX2(SC-20088、Santacruz)、PAX6(PAX6、DSHB)、PLZF(AF2944、R&D Systems)。
免疫染色法を用いたタンパク質水準分析を通じて誘導された神経幹細胞がSOX1、NESTIN、SSEA1、SOX2、PAX6及びPLZFのような神経幹細胞マーカー遺伝子を発現していることを確認した(図5)。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである:SOX1(AF3369、R&D Systems)、NESTIN(MAB5326、Millipore)、SSEA1(MAB4301、Millipore)、SOX2(SC-20088、Santacruz)、PAX6(PAX6、DSHB)、PLZF(AF2944、R&D Systems)。
<4-3>
Ki67の免疫染色を通じて誘導された神経幹細胞が分裂能力を持っていることを確認した(図6)。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである。Ki67(Ab9260、Millipore)
Ki67の免疫染色を通じて誘導された神経幹細胞が分裂能力を持っていることを確認した(図6)。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである。Ki67(Ab9260、Millipore)
<4-4>
qRT-PCRによるmRNAの量的分析を通じてH9胚性幹細胞から由来する神経幹細胞に対して誘導された神経幹細胞がSOX1、SOX2、PLZF、PAX6のような神経幹細胞マーカー遺伝子を発現していることを確認した(図7)。
qRT-PCRによるmRNAの量的分析を通じてH9胚性幹細胞から由来する神経幹細胞に対して誘導された神経幹細胞がSOX1、SOX2、PLZF、PAX6のような神経幹細胞マーカー遺伝子を発現していることを確認した(図7)。
<4-5>
RT-PCRによるmRNA水準分析を通じて誘導された神経幹細胞が発達学上、forebrain、midbrain、hindbrain、spinal cord特異的なマーカー遺伝子を発現していることを確認した(図8)。本実験に使用されたプライマー配列は、次の通りである:
EMX1(forward-CAGGCCCAGGTAGTTCAATGGG;配列番号9、
reverse-GCTCAGCCTTAAGCCCTGTCTC;配列番号10)、FOXG1(forward-ACCCGTCAATGACTTCGCAGAG;配列番号11、
reverse-AGGGTTGGAAGAAGACCCCTGA;配列番号12)、 OTX1(forward-CTCAAACAACCCCCATACGGCA;配列番号13、
reverse-GGTAGCGAGTCTTGGCGAAGAG;配列番号14)、OTX2(forward-TTCAGGGCTGTGTGAATTGTGTGA;配列番号15、
reverse-CAGAGGTGGAGTTCAAGGTTGCAT;配列番号16)、EN1(forward-GAGTTCCAGGCAAACCGCTACA;配列番号17、
reverse-GTTGTACAGTCCCTGGGCCATG;配列番号18)、GBX2(forward-CGGTTAGCAGCCACCTTTCCAT;配列番号19、
reverse-GACGTGCTTCACATGGCTCAGA;配列番号20)、HOXB2(forward-GAGACCCAGGAGCCAAAAGC;配列番号21、
reverse-GAAGGAGACGTGGCGGATTG;配列番号22)、HOXB4(forward-CTGAGGGCCAGAATGACTGCTC;配列番号23、
reverse-CAGAACTCAACTGGCCCCTCAC;配列番号24)。
RT-PCRによるmRNA水準分析を通じて誘導された神経幹細胞が発達学上、forebrain、midbrain、hindbrain、spinal cord特異的なマーカー遺伝子を発現していることを確認した(図8)。本実験に使用されたプライマー配列は、次の通りである:
EMX1(forward-CAGGCCCAGGTAGTTCAATGGG;配列番号9、
reverse-GCTCAGCCTTAAGCCCTGTCTC;配列番号10)、FOXG1(forward-ACCCGTCAATGACTTCGCAGAG;配列番号11、
reverse-AGGGTTGGAAGAAGACCCCTGA;配列番号12)、 OTX1(forward-CTCAAACAACCCCCATACGGCA;配列番号13、
reverse-GGTAGCGAGTCTTGGCGAAGAG;配列番号14)、OTX2(forward-TTCAGGGCTGTGTGAATTGTGTGA;配列番号15、
reverse-CAGAGGTGGAGTTCAAGGTTGCAT;配列番号16)、EN1(forward-GAGTTCCAGGCAAACCGCTACA;配列番号17、
reverse-GTTGTACAGTCCCTGGGCCATG;配列番号18)、GBX2(forward-CGGTTAGCAGCCACCTTTCCAT;配列番号19、
reverse-GACGTGCTTCACATGGCTCAGA;配列番号20)、HOXB2(forward-GAGACCCAGGAGCCAAAAGC;配列番号21、
reverse-GAAGGAGACGTGGCGGATTG;配列番号22)、HOXB4(forward-CTGAGGGCCAGAATGACTGCTC;配列番号23、
reverse-CAGAACTCAACTGGCCCCTCAC;配列番号24)。
<4-6>
total RNA sequencingを通してglobal gene expression levelにおいて誘導された神経幹細胞が本来の尿由来細胞よりH9胚性幹細胞から由来する神経幹細胞と類似したmRNA及びlnc-RNAの発現パターンを示すことを確認した(図9、10)。
total RNA sequencingを通してglobal gene expression levelにおいて誘導された神経幹細胞が本来の尿由来細胞よりH9胚性幹細胞から由来する神経幹細胞と類似したmRNA及びlnc-RNAの発現パターンを示すことを確認した(図9、10)。
<4-7>
VEE遺伝子のRT-PCR及びgenomic DNA PCR分析を通じて誘導された神経幹細胞内に導入させた合成mRNAがもはや残存せず、host誘電体にintegrationされていないことを確認した(図11)。本実験に使用されたプライマー配列は、次の通りである:VEE(forward-ACGAAGGGCAAGTCGCTGTT;配列番号25、reverse-TTTCGTCGGCCCAGTTGGTA;配列番号26)。
VEE遺伝子のRT-PCR及びgenomic DNA PCR分析を通じて誘導された神経幹細胞内に導入させた合成mRNAがもはや残存せず、host誘電体にintegrationされていないことを確認した(図11)。本実験に使用されたプライマー配列は、次の通りである:VEE(forward-ACGAAGGGCAAGTCGCTGTT;配列番号25、reverse-TTTCGTCGGCCCAGTTGGTA;配列番号26)。
<4-8>
STR analysisを通じてヒト尿由来細胞と誘導された神経幹細胞が同一の個体から由来したことを確認した(図12)。
STR analysisを通じてヒト尿由来細胞と誘導された神経幹細胞が同一の個体から由来したことを確認した(図12)。
<4-9>
核型分析を通じて誘導された神経幹細胞が正常な染色体を保存していることを確認した(図13)。
核型分析を通じて誘導された神経幹細胞が正常な染色体を保存していることを確認した(図13)。
実施例5:誘導された神経幹細胞の分化能力分析
<5-1>神経細胞への分化能力分析
誘導された神経幹細胞を神経細胞へ分化させるときに、神経細胞マーカー遺伝子であるTUJ1、MAP2を発現していることを免疫染色法により確認した(図14)。神経細胞分化法は、次の通りである。神経幹細胞をDMEM/F12培地に1xN2、1xB27、300ng/mlのcAMP、0.2mMのvitamin C、10ng/mlのBDNFと10ng/mlのGDNFを添加した神経細胞分化培地に14日間培養した後、分析する。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである。Tuj1(801202、BioLegend)、MAP2(AB5622、Millipore)。
<5-1>神経細胞への分化能力分析
誘導された神経幹細胞を神経細胞へ分化させるときに、神経細胞マーカー遺伝子であるTUJ1、MAP2を発現していることを免疫染色法により確認した(図14)。神経細胞分化法は、次の通りである。神経幹細胞をDMEM/F12培地に1xN2、1xB27、300ng/mlのcAMP、0.2mMのvitamin C、10ng/mlのBDNFと10ng/mlのGDNFを添加した神経細胞分化培地に14日間培養した後、分析する。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである。Tuj1(801202、BioLegend)、MAP2(AB5622、Millipore)。
また、誘導された神経幹細胞は、GABA神経細胞、運動神経細胞、ドーパミン神経細胞へ分化できることを免疫染色法により、それぞれGABA、HB9、THを染色して確認できた(図15)。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである:GABA(A2052、Sigma)、HB9(81.5C10、DSHB)、TH(AB152、Millipore)。
<5-2>神経膠細胞への分化能力分析
免疫染色法によるS100beta、GFAP染色を通じて誘導された神経幹細胞が神経膠細胞のいずれかである星状細胞へ分化できることを確認した(図16)。星状細胞の分化法は、次の通りである。DMEM/F12培地に1xN2と1xB27が含まれた培地に2.5%FBSまたは20ng/mlのCNTFと10ng/mlのBMP4を添加した星状細胞分化培地に14日以上培養した後に分析する。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである:S100beta(S2535、Sigma)、GFAP(SAB4501162、Sigma)。
免疫染色法によるS100beta、GFAP染色を通じて誘導された神経幹細胞が神経膠細胞のいずれかである星状細胞へ分化できることを確認した(図16)。星状細胞の分化法は、次の通りである。DMEM/F12培地に1xN2と1xB27が含まれた培地に2.5%FBSまたは20ng/mlのCNTFと10ng/mlのBMP4を添加した星状細胞分化培地に14日以上培養した後に分析する。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである:S100beta(S2535、Sigma)、GFAP(SAB4501162、Sigma)。
免疫染色法によるPDGFR、OLIG2、O4染色を通じて誘導された神経幹細胞が神経膠細胞のいずれかである希突起膠細胞に分化できることを確認した(図17)。希突起膠細胞の分化法は、次の通りである。DMEM/F12培地に1xN2、1xB27、25ug/mlのinsulin、1uMのShh agonistと100nMのretinoic acidが添加された培地に5日以上培養した後、DMEM/F12培地に1xN2、1xB27、25ug/mlのinsulin、100ng/mlのbiotin、60ng/mlのT3、10ng/mlのPDGF-AA、10ng/mlのIGF-1、5ng/mlのHGF、10ng/mlのNT-3と1uMのcAMPが添加された培地に7日以上培養した後に分析する。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである:PDGFR(SC338、Santacruz)、OLIG2(AB9610、Millipore)、O4(MAB345、Millipore)。
実施例6:万能性段階を経ない神経幹細胞誘導方法の検証及び分析
本発明に使用された逆分化因子であるOCT4、SOX2、KLF4、GLIS1遺伝子の組み合わせは、特定の条件下で誘導万能幹細胞を確立できることが知られている(米国特許第09862930号)。
本発明に使用された逆分化因子であるOCT4、SOX2、KLF4、GLIS1遺伝子の組み合わせは、特定の条件下で誘導万能幹細胞を確立できることが知られている(米国特許第09862930号)。
しかし、本発明において誘導された神経幹細胞が万能性段階を経ないことを、次のような理由により検証した。
第一に、本発明では、ヒト誘導万能幹細胞を確立するのに必須的に知られているbFGF及び内在遺伝子のmRNAの発現に必要なB18Rタンパク質を排除した神経幹細胞誘導培地を用いたため、現在までに報告された研究結果に従う場合、ヒト誘導万能幹細胞を確立するのは不可能である。
第二に、本発明において誘導された神経幹細胞が形成される時期は、プロトコル上の誘導過程後8日前後で(図3)、知られているヒト誘導万能幹細胞が形成される時期は、誘導過程後、3週間以上が必要となるため、万能性段階を経たとするには時間的に短い。
第三に、日付別qRT-PCR分析を通じて察し見たときの万能性段階マーカー遺伝子であるOCT4、REX1及びNANOGの発現が0日目から12日目にかけて低い発現を維持していた(図18)。本実験に使用されたプライマー配列は、次の通りである。OCT4(forward-GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG;配列番号27、reverse-CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC;配列番号28)、REX1(forward-CTGAAGAAACGGGCAAAGAC;配列番号29、reverse-GAACATTCAAGGGAGCTTGC;配列番号30)、NANOG(forward-CAGCCCTGATTCTTCCACCAGTCCC;配列番号31、reverse-GGAAGGTTCCCAGTCGGGTTCACC;配列番号32)。
第四に、誘導された神経幹細胞を免疫染色法により検証したとき、H9胚性幹細胞とは異なり、OCT4及びNANOGの発現が感知されなかったことを確認した(図19)。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである:OCT4(SC5279、Santacruz)、NANOG(AF1997、R&D systems)。
前記のような根拠に基づいて、本発明の方法は、尿細胞が万能性幹細胞の段階を経ずにすぐに神経幹細胞に誘導できることを確認できた。
実施例7:神経幹細胞への誘導効率増加実験
尿細胞から神経幹細胞への転換効率を向上させることができる培養条件などをさらに確認した。
尿細胞から神経幹細胞への転換効率を向上させることができる培養条件などをさらに確認した。
一般的な酸素条件(21%O2)を対照群とし、酸素の濃度を調節して誘導を行った。具体的に、1×10^5個の尿由来細胞をそれぞれの基本条件(21%O2)と低酸素条件(5%hypoxia)で神経幹細胞誘導方法を行った後、免疫染色法を用いて神経幹細胞マーカー遺伝子SOX1、PLZFにpositiveコロニーの数を数えることにより、低酸素条件で約2倍の転換効率の増加を示すことを確認した(図20)。
Claims (6)
- (i)Oct4タンパク質をコードする核酸と、
(ii)Sox2タンパク質をコードする核酸と、
(iii)Klf4タンパク質をコードする核酸と、
(iv)Glis1タンパク質をコードする核酸と、
(v)DMEM/F12培地及びNeurobasal培地を1:1の体積比で混合することによって得られる神経幹細胞誘導培地であって、前記神経幹細胞誘導培地は、N2、B27、human LIF、SB431542、CHIR99021、purmorphamine、folskolin、sodium butyrate及びアスコルビン酸2-リン酸塩(ascorbic acid 2-phosphate)を含む、神経幹細胞誘導培地と
を含む、尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する組成物。 - 前記尿細胞は、尿中に含まれる脱落した体細胞である、請求項1に記載の尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する組成物。
- 前記Oct4、Sox2、Klf4及びGlis1タンパク質をコードする核酸は、合成mRNAである、請求項1に記載の尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する組成物。
- (a)尿から尿細胞を分離培養する段階と、
(b)前記培養した尿細胞に請求項1または3に記載の組成物を導入する段階と、
(c)前記組成物が導入された尿細胞を神経幹細胞誘導培地で7-10日間培養して神経幹細胞へ直接逆分化を誘導する段階と、
(d)前記神経幹細胞誘導培地によって直接逆分化を誘導した細胞から神経幹細胞様の特性を持つ神経幹細胞株を選別する段階と、
を含み、
前記(c)段階において、前記神経幹細胞誘導培地は、DMEM/F12培地及びNeurobasal培地を1:1の体積比で混合し、前記培地混合物に、N2、B27、human LIF、SB431542、CHIR99021、purmorphamine、folskolin、sodium butyrate及びアスコルビン酸2-リン酸塩(ascorbic acid 2-phosphate)を添加することによって得られる、
尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する方法。 - 前記(b)段階において、前記Oct4、Sox2、Klf4及びGlis1タンパク質をコードする合成mRNAの導入は、電気穿孔法(electroporation)を用いて前記合成mRNAを導入させるものである、請求項4に記載の尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する方法。
- 前記神経幹細胞誘導培地における培養は、低酸素(O2hypoxia)の条件で行われるものである、請求項4に記載の尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する方法。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2018-0101208 | 2018-08-28 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023003968A Division JP2023037004A (ja) | 2018-08-28 | 2023-01-13 | 合成メッセンジャーrnaを用いて尿細胞を神経幹細胞へ直接逆分化する方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2024074958A true JP2024074958A (ja) | 2024-05-31 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10557123B2 (en) | Methods for reprogramming cells and uses thereof | |
Shahbazi et al. | Conversion of human fibroblasts to stably self-renewing neural stem cells with a single zinc-finger transcription factor | |
Cassady et al. | Direct lineage conversion of adult mouse liver cells and B lymphocytes to neural stem cells | |
EP2982747B1 (en) | Method for producing reprogrammed derivative neuronal stem cell from non-neuronal cell by using hmga2 | |
US20190024056A1 (en) | Methods for reprogramming cells and uses thereof | |
Su et al. | Direct conversion of fibroblasts into neural progenitor-like cells by forced growth into 3D spheres on low attachment surfaces | |
JP2023037004A (ja) | 合成メッセンジャーrnaを用いて尿細胞を神経幹細胞へ直接逆分化する方法 | |
US20190322981A1 (en) | Means and methods for the generation of oligodendrocytes | |
Isoda et al. | Robust production of human neural cells by establishing neuroepithelial-like stem cells from peripheral blood mononuclear cell-derived feeder-free iPSCs under xeno-free conditions | |
WO2013011093A1 (en) | Novel method for generation of neural progenitor cells | |
WO2013124309A1 (en) | Direct reprogramming of somatic cells into neural stem cells | |
JP2024074958A (ja) | 合成メッセンジャーrnaを用いて尿細胞を神経幹細胞へ直接逆分化する方法 | |
WO2023010209A1 (en) | Neural progenitor cells and therapeutic uses of same | |
EP4381051A1 (en) | Neural progenitor cells and therapeutic uses of same | |
WO2023164499A2 (en) | Methods of making induced pluripotent stem cells | |
Shahbazi et al. | Narges Zare Mehrjardi, 3 Patrick Günther, 4 Angelika Lampert, 5, 6 Kristian Händler, 4 Firuze Fulya Hatay, 3 Diana Schmidt, 5, 7 Marek Molcanyi, 3 Jürgen Hescheler, 3 Joachim L. Schultze, 4 Tomo Saric, 3,* and Hossein Baharvand | |
Liu | Direct generation of region-specific induced neural Precursors from adult human fibroblasts using non-viral and viral methods | |
Adeeb et al. | Locomotor Recovery After Spinal Cord Transection: Transplantation of Oligodendrocytes and Motoneuron Progenitors from Human Embryonic Stem Cells |