JP2023037004A - 合成メッセンジャーｒｎａを用いて尿細胞を神経幹細胞へ直接逆分化する方法 - Google Patents
合成メッセンジャーｒｎａを用いて尿細胞を神経幹細胞へ直接逆分化する方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】本発明の目的は、尿細胞から神経幹細胞への逆分化を誘導する組成物を提供することである。本発明の他の目的は、尿細胞から神経幹細胞への逆分化を誘導する方法を提供することである。本発明さらに他の目的は、尿細胞から逆分化した神経幹細胞を有効成分として、神経損傷疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。【解決手段】本発明は、逆分化因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１のｍＲＮＡを導入して、尿細胞から神経幹細胞の逆分化誘導方法及び前記方法により誘導された神経幹細胞を有効成分とする神経損傷疾患の予防または治療用組成物に関する。【選択図】なし
Description
本発明は、尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化方法、及び前記方法により製造された直接逆分化した神経幹細胞を含む神経損傷疾患の治療のための薬学的組成物に関する。
幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）とは、無限の自己増殖能力及び身体内で必要とされる特定の細胞及び組織への分化能を持つ細胞を意味する。幹細胞は、その種類を３つに分類しており、その種類としては、初期胚から分離した胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＥＳ細胞）、胚期の原始生殖細胞から分離した胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ、ＥＧ細胞）、及び多能性成体幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ａｄｕｌｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ、ＭＡＰＣ細胞）がある。
幹細胞は、特化した機能を持つ細胞に分化する潜在力を有しているので、様々な臓器の機能回復のための細胞治療剤としての研究対象となっており、最近では整形と美容に至るまで、その活用範囲が拡大している傾向にある。
成体幹細胞の体内における役割は、大きく２つに要約できるが、第一は、幹細胞そのものが私たちの体で損傷した組織や細胞に分化し、再び再生させる役割であり、第二は、一生の間に持続的に成長因子及びサイトカインなどのタンパク質を分泌して近くの細胞の成長及び再生を助ける役割を果たす。
直接逆分化（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）方式は、体細胞を望む他のタイプの細胞に転換できる技術である。日本の山中教授の逆分化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）とは異なり、万能性幹細胞の状態を経ないので、少ない時間と高効率を示すとともに、万能性幹細胞の腫瘍発生のリスクや追加分化費用などを解決できる。しかし、現在行われている直接逆分化方式は、細胞源としてマウス細胞を主に用いてヒト体細胞で同一に再現される確率が高くない。また、ヒト体細胞の中ではよく皮膚細胞（線維芽細胞）を用いるが、この場合、侵襲的な方式の細胞源採取方法が必要となり、供与者の苦痛、安全性のリスクをもたらして利便性が低下する。また、直接逆分化時に要求される逆分化因子（遺伝子）導入方式において主にウイルスを用いているため、臨床的利用が困難であり、ウイルスを用いた遺伝子挿入システム（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ－ｓｙｓｔｅｍ）の場合、誘電体に無分別な挿入による変異を誘発するため、治療用として適していない。
そこで、本発明者らは、細胞源として採取が容易なヒト尿由来細胞を用いており、逆分化因子の細胞導入に合成ｍＲＮＡのトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用いることにより前記問題を解決し、尿細胞から神経幹細胞への高効率の直接逆分化に要求される最適の培養条件を確認して、本発明を完成した。
本発明の目的は、尿細胞から神経幹細胞への逆分化を誘導する組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、尿細胞から神経幹細胞への逆分化を誘導する方法を提供することである。
本発明さらに他の目的は、尿細胞から逆分化した神経幹細胞を有効成分として、神経損傷疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
本発明は、
（ｉ）Ｏｃｔ４タンパク質またはＯｃｔ４タンパク質をコードする核酸と、
（ｉｉ）Ｓｏｘ２タンパク質またはＳｏｘ２タンパク質をコードする核酸と、
（ｉｉｉ）Ｋｌｆ４タンパク質またはＫｌｆ４タンパク質をコードする核酸と、
（ｉｖ）Ｇｌｉｓ１タンパク質またはＧｌｉｓ１タンパク質をコードする核酸と、を含む尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する組成物を提供する。
（ｉ）Ｏｃｔ４タンパク質またはＯｃｔ４タンパク質をコードする核酸と、
（ｉｉ）Ｓｏｘ２タンパク質またはＳｏｘ２タンパク質をコードする核酸と、
（ｉｉｉ）Ｋｌｆ４タンパク質またはＫｌｆ４タンパク質をコードする核酸と、
（ｉｖ）Ｇｌｉｓ１タンパク質またはＧｌｉｓ１タンパク質をコードする核酸と、を含む尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する組成物を提供する。
本発明において、用語の「逆分化神経幹細胞」とは、分化した細胞に逆分化技術を用いて神経幹細胞と類似または同一の多分化能（ｍｕｌｔｉ－ｐｏｔｅｎｔ）を持つ未分化状態の幹細胞を確立する方式で作製された細胞を含む。誘導神経幹細胞は、神経幹細胞と同一または類似した特性を有しているが、具体的には、似たような細胞の形態を示し、遺伝子及びタンパク質の発現パターンが類似し、生体内外で多分化能を持つことができる。したがって、本発明の逆分化神経幹細胞は、神経細胞（ニューロン）、アストロサイト、希突起膠細胞、ＧＡＢＡ性神経細胞またはドーパミン性神経細胞などに分化可能なものであってもよい。
本発明において、用語の「尿細胞（Ｕｒｉｎｅ ｃｅｌｌｓ；ＵＣｓ）」とは、尿から何の不便も苦痛もなく、いつでも容易に反復的に得られる体細胞として知られている。
本発明者は、尿細胞において逆分化因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１を発現させる場合、既に分化した細胞タイプの尿細胞が分化能を持つ神経幹細胞に逆分化（ｄｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）されることを発見した。
前記用語の「逆分化因子」は、２００６年Ｙａｍａｎａｋａ教授チームによって導入された概念である逆分化（Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）から始まった。成体のすべての細胞は、正常発達過程を経て分化していない状態から次第に分化し、各機能が専門化された細胞に変化する。その中で受精卵の細胞は、全能性（Ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）を有しており、その後に発達段階が進むにつれて胚盤胞になると、内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）と外側細胞に区分が可能であるが、このときの内部細胞塊細胞が胚細胞と生殖細胞として発生することがあり、これを万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）という。この胚性幹細胞は、万能性特有の遺伝子発現の様相を示すが、その代表的な例がＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８などである。逆分化は、体細胞にこのような特異的な遺伝子発現を誘導し、胚性幹細胞及び成体幹細胞などの未分化細胞と類似した性質に戻す技術と言える。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１は、逆分化関連の一連の研究において使用されてきた様々な因子のうちの一部として尿細胞から神経幹細胞へ逆分化させるのに本発明者らが用いた。
本発明の組成物に用いられるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１は、ヒトとウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、レイヨウ、イヌなどの動物由来のすべてのＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１を含み、好ましくは、ヒトＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１である。また、神経幹細胞への逆分化に用いられる本発明のＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１タンパク質は、これらの野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）のアミノ酸配列を有するタンパク質だけでなく、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１タンパク質の変異体を含んでもよい。
具体的な一実施例において、前記逆分化に初めて使用されたＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１の遺伝子配列は、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１ Ｊｕｎ ８；４７４（７３５０）：２２５－９に開示されたものを使用した。
Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１タンパク質の変異体とは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１の天然アミノ酸配列と１つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保全的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有するタンパク質をを意味する。前記変異体は、天然タンパク質と同一の生物学的活性を示す機能的等価物であるか、必要によってタンパク質の物理化学的性質が変形した変異体であってもよい。物理、化学的環境に対する構造的安定性が増大し、または生理学的活性が増大した変異体である。
前記Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸は、野生型または前記のような変異体形態のＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸であって、一つ以上の塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせによって変異されてもよく、天然から分離されるか、化学的合成法を用いて製造してもよい。
前記Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、単鎖または二重鎖であってもよく、ＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡ分子であってもよい。本発明の具体的な実施例において、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１タンパク質をコードする核酸は、合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を用いており、前記合成メッセンジャーＲＮＡは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１を発現するＤＮＡを導入した合成ｍＲＮＡ発現ベクターを用いて製造されてもよい。
本発明は、尿細胞にＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１タンパク質または前記タンパク質をコードする核酸を導入する段階を含む尿細胞を神経幹細胞へ直接逆分化を誘導する方法を提供する。
より具体的には、
（ａ）尿から尿細胞を分離培養する段階と、
（ｂ）前記培養した尿細胞にＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１タンパク質または前記タンパク質をコードする核酸を導入する段階と、
（c）前記組成物が導入された尿細胞を神経幹細胞誘導培地で培養し、神経幹細胞へ直接逆分化を誘導する段階と、
（ｄ）前記神経幹細胞へ直接逆分化を誘導した細胞から神経幹細胞の特性を持つ神経幹細胞株を選別する段階と、を含んでもよい。
（ａ）尿から尿細胞を分離培養する段階と、
（ｂ）前記培養した尿細胞にＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１タンパク質または前記タンパク質をコードする核酸を導入する段階と、
（c）前記組成物が導入された尿細胞を神経幹細胞誘導培地で培養し、神経幹細胞へ直接逆分化を誘導する段階と、
（ｄ）前記神経幹細胞へ直接逆分化を誘導した細胞から神経幹細胞の特性を持つ神経幹細胞株を選別する段階と、を含んでもよい。
前記段階（a）において、尿細胞の培養は、ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）及びｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）含有培地において行われてもよい。
本発明において用いられる用語の「培地（ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ上で細胞の成長及び生存を支持できるようにする培地を意味し、尿細胞及び逆分化神経幹細胞誘導及び培養に適切な当分野において用いられる通常の培地をすべて含む。細胞の種類に応じて培地及び培養条件を選ぶことができる。培養に用いられる培地は、好ましくは、細胞培養最小培地（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｉｎｉｍｕｍ ｍｅｄｉｕｍ；ＣＣＭＭ）で、一般的に炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。このような細胞培養最小培地には例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、αＭＥＭ（α Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ'ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、及びＩＭＥＭ（Ｉｓｃｏｖｅ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）などがあるが、これに制限されない。また、前記培地は、ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）またはゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）などの抗生剤を含んでもよい。
本発明の具体的な実施例において、尿から分離した細胞をＦＢＳ、ｂＦＧＦ及びＥＧＦを含有する基本培地で培養することにより得ることができ、具体的にＦＢＳが含まれたハイグルコースＤＭＥＭ及びＲＥＧＭ（Ｒｅｎａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ）培地にｂＦＧＦ及びＥＧＦを添加して培養することにより、得ることができる。本発明のより具体的には、前記ハイグルコースＤＭＥＭ及びＲＥＧＭ培地は、Ｌ－グルタミン及びペニシリン－ストレプトマイシンをさらに含んでもよい。
前記（ｂ）段階において、逆分化因子を尿細胞に導入する方法は、当業界で通常用いられる細胞に核酸分子またはタンパク質を提供する方法を制限なく使用でき、好ましくは、逆分化因子を分化した細胞の培養液に投与する方法または逆分化因子を分化した細胞に直接注入する方法を用いることができ、このときに用いられる逆分化因子は、該因子の遺伝子を挿入したウイルスベクターに形質感染させたパッケージング細胞から得られたウイルス、試験管内転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）により生産したメッセンジャーＲＮＡ、または様々な細胞株内で生産されたタンパク質などの形態で用いることができる。本発明の具体的な実施例において、尿細胞への前記逆分化因子の導入は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１をコードするＤＮＡの転写によって生成されたメッセンジャーＲＮＡを使用した。
前記転写合成されたメッセンジャーＲＮＡを分化した細胞に直接注入する方法は、当業界に公知の任意の方法を選んで使用でき、これに制限されるものではないが、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｊｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、粒子噴射法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、直接筋肉注入法、インシュレータ（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）及びトランスポゾンを用いた方法の中から適宜選んで適用してもよい。具体的に本発明の実施例において、逆分化因子のメッセンジャーＲＮＡは、電気穿孔法を用いて尿細胞に導入された。
前記段階（ｃ）において、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１タンパク質をコードする核酸が導入された尿細胞を神経幹細胞に誘導する培地（神経幹細胞誘導培地）は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を１：１体積比で混合し、前記培地の混合物に１ｘＮ２、１ｘＢ２７、ｈｕｍａｎ ＬＩＦ、ＴＧＦ－ｂｅｔａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及びＧＳＫ３－ｂｅｔａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加した培地であってもよい。より具体的には、前記培地は、Ｓｈｈ ａｇｏｎｉｓｔ、ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ、ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及びａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅのうちの一つ以上をさらに含んでもよい。本発明の具体的な実施例において、Ｓｈｈ ａｇｏｎｉｓｔ、ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ、ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及びａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅをすべて添加した培地における神経幹細胞転換率が最も優れていることを確認した。
また、前記培地における尿細胞の培養は、低酸素（Ｏ２ｈｙｐｏｘｉａ）条件で行う場合、誘導効率が増加し得る。
前記段階（ｄ）で誘導された神経幹細胞の選別は、前記段階（Ｃ）を行った後、生成された神経幹細胞コロニーを採取することであり、前記選別された神経幹細胞は、神経幹細胞培地で培養できる。前記神経幹細胞培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を１：１の体積比で混合した培地に１ｘＮ２、１ｘＢ２７、ｈｕｍａｎ ＬＩＦ、ＴＧＦ－ｂｅｔａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及びＧＳＫ３－ｂｅｔａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加した培地であってもよい。さらに、前記誘導された神経幹細胞は、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液もしくはＡｃｃｕｔａｓｅ溶液を用いて継代培養できる。
また、本発明は、前記方法により誘導された神経幹細胞を有効成分として含む神経損傷疾患予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
神経幹細胞は、神経細胞（ニューロン）、アストロサイト、希突起膠細胞、ＧＡＢＡ性神経細胞またはドーパミン性神経細胞などに分化可能な多分化能を持つ細胞であって、前記損傷又は消失した神経細胞を修復でき、前記神経細胞の損傷または消失により発生する疾患を制限なく治療が可能である。
具体的には、前記神経細胞の損傷により発生する疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー、ピック病（Ｐｉｃｋ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、筋萎縮性側面硬化症（ａｍｙｏｔｒｉｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、虚血性脳疾患（ｓｔｒｏｋｅ）、脱髄疾患（ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症、てんかん、退行性神経疾患及び脊髄損傷（ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ）からなる群から選ばれてもよい。
本発明は、ヒト尿由来細胞を細胞源として活用し、細胞源の確保の利便性を最大化し、合成ｍＲＮＡを用いたｎｏｎ－ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ方式の直接的逆分化方法により臨床的利用の可能性を高めた技術である。
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。しかし、下記実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
実施例１：尿から尿細胞（Ｕｒｉｎｅ ｃｅｌｌ）の分離
１９７２年イギリスのＳｕｔｈｅｒｌａｎｄとＢａｉｎが開発した技術を基本とし、具体的には、次の通りである。まず、供与者から提供された尿を１０００ｇに１０分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、下層に残ったペレットを１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ抗生剤が含まれたＰＢＳ溶液２０ｍｌに希釈させた。次に希釈されたＰＢＳ＋ペレット溶液を１０００ｇに１０分間遠心分離した。再び上澄み液を除去した後、下層に残ったペレットをｇｅｌａｔｉｎがコーティングされた１２ ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２を基本として１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ抗生剤、１％Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１０％ＦＢＳが含まれた培地）１ｍｌで希釈してシーディングした。その後、３日間基本培地を１ｍｌずつ添加して培養した後、成長培地（ＤＭＥＭとＲＥＧＭを１：１で混合した培地を基本とし、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ抗生剤、１％Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０g／ｍｌのＥＧＦを含む培地）に変更して培養した。
１９７２年イギリスのＳｕｔｈｅｒｌａｎｄとＢａｉｎが開発した技術を基本とし、具体的には、次の通りである。まず、供与者から提供された尿を１０００ｇに１０分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、下層に残ったペレットを１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ抗生剤が含まれたＰＢＳ溶液２０ｍｌに希釈させた。次に希釈されたＰＢＳ＋ペレット溶液を１０００ｇに１０分間遠心分離した。再び上澄み液を除去した後、下層に残ったペレットをｇｅｌａｔｉｎがコーティングされた１２ ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２を基本として１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ抗生剤、１％Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１０％ＦＢＳが含まれた培地）１ｍｌで希釈してシーディングした。その後、３日間基本培地を１ｍｌずつ添加して培養した後、成長培地（ＤＭＥＭとＲＥＧＭを１：１で混合した培地を基本とし、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ抗生剤、１％Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０g／ｍｌのＥＧＦを含む培地）に変更して培養した。
実施例２：電気穿孔法を用いた尿細胞への逆分化因子導入
実施例１で培養された尿由来細胞を電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によって合成ｍＲＮＡを導入させる方法で、具体的には、次の通りである。合成ｍＲＮＡの場合、通常の試験管転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）ｋｉｔ（ＲｉｂｏＭＡＸ製、Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を通じて合成され、合成されるｍＲＮＡのバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）となるＤＮＡは、Ｔ７－ＶＥＥ－ＯＫＳ－ｉＧ（Ｓｔｅｖｅｎ Ｄｏｗｄｙ、Ａｄｄｇｅｎｅ）で、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びＧＬＩＳ１の遺伝子を含んでいる（図１）。前記ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びＧＬＩＳ１遺伝子の配列は、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１ Ｊｕｎ ８；４７４（７３５０）：２２５－９．に開示されたものを使用し、該遺伝子配列とｍＲＮＡ適用法は、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ．２０１３ Ａｕｇ １；１３（２）：２４６－５４及び米国特許ＵＳ ９,８６２,９３０ Ｂ２を参考にした。
実施例１で培養された尿由来細胞を電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によって合成ｍＲＮＡを導入させる方法で、具体的には、次の通りである。合成ｍＲＮＡの場合、通常の試験管転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）ｋｉｔ（ＲｉｂｏＭＡＸ製、Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を通じて合成され、合成されるｍＲＮＡのバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）となるＤＮＡは、Ｔ７－ＶＥＥ－ＯＫＳ－ｉＧ（Ｓｔｅｖｅｎ Ｄｏｗｄｙ、Ａｄｄｇｅｎｅ）で、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びＧＬＩＳ１の遺伝子を含んでいる（図１）。前記ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びＧＬＩＳ１遺伝子の配列は、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１ Ｊｕｎ ８；４７４（７３５０）：２２５－９．に開示されたものを使用し、該遺伝子配列とｍＲＮＡ適用法は、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ．２０１３ Ａｕｇ １；１３（２）：２４６－５４及び米国特許ＵＳ ９,８６２,９３０ Ｂ２を参考にした。
合成されたｍＲＮＡは、０.５μｇを１時間の間０.２ｕｇ／ｍｌのＢ１８Ｒタンパク質で前処理された１×１０^６個の尿由来細胞に１６００Ｖ、１０ｍｓ、３回の電気穿孔法で処理することにより導入した。導入された尿由来細胞は、０.２ｕｇ／ｍｌのＢ１８Ｒ ｐｒｏｔｅｉｎが含まれた成長培地で２日間培養した。
本発明者らは、電気穿孔法による導入の効率を可視化して判断、検証するため、ＧＦＰ蛍光遺伝子を含む合成ｍＲＮＡの導入を同時に進行してＧＦＰ蛍光タンパク質を発現するヒト尿由来細胞の効率をＦＡＣＳ分析を通じて検証した。前記検証を通じて電気穿孔法による合成ｍＲＮＡのヒト尿由来細胞導入効率が処理後、４８時間頃に７２.２％に至ることを確認し、次の段階である神経幹細胞誘導実験を進めるのに十分であると判断した（図２）。
実施例３：尿由来逆分化神経幹細胞誘導
マトリゲル（ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ）がコーティングされた細胞培養皿にｍＲＮＡが導入された尿由来細胞をシーディングした後、神経幹細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ）培地を１：１で混合し、１ｘＮ２（Ｇｉｂｃｏ）、１ｘＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＬＩＦ、２ｕＭのＳＢ４３１５４２（ＴＧＦ－ｂｅｔａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）と３ｕＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３－ｂｅｔａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を添加した培地）を基本として０.５ｕＭのｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ（Ｓｈｈ ａｇｏｎｉｓｔ）、１０ｕＭのｆｏｌｓｋｏｌｉｎ（ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、１００ｕＭのｓｏｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒａｔｅ（ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）と６４ｕｇ／ｍｌのａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅを添加した神経幹細胞誘導培地で７－１０日間培養した。誘導完了時に神経幹細胞コロニーの発生を確認できた（図３）。
マトリゲル（ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ）がコーティングされた細胞培養皿にｍＲＮＡが導入された尿由来細胞をシーディングした後、神経幹細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ）培地を１：１で混合し、１ｘＮ２（Ｇｉｂｃｏ）、１ｘＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＬＩＦ、２ｕＭのＳＢ４３１５４２（ＴＧＦ－ｂｅｔａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）と３ｕＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３－ｂｅｔａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を添加した培地）を基本として０.５ｕＭのｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ（Ｓｈｈ ａｇｏｎｉｓｔ）、１０ｕＭのｆｏｌｓｋｏｌｉｎ（ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、１００ｕＭのｓｏｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒａｔｅ（ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）と６４ｕｇ／ｍｌのａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅを添加した神経幹細胞誘導培地で７－１０日間培養した。誘導完了時に神経幹細胞コロニーの発生を確認できた（図３）。
また、さらに１ｘＮ２、１ｘＢ２７、ｈｕｍａｎ ＬＩＦ、ＴＧＦ－ｂｅｔａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及びＧＳＫ３－ｂｅｔａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加した培地でＳｈｈ ａｇｏｎｉｓｔ、ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ、ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及びａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅのうち１つ以上をさらに含むとき、神経幹細胞の誘導効率に及ぼす影響を確認した。Ｓｈｈ ａｇｏｎｉｓｔ、ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ、ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及びａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅをすべて添加した培地における神経幹細胞転換率が最も優れていることを確認した（図２１）。
前記誘導された神経幹細胞コロニーを採取してＭａｔｒｉｇｅｌがコーティングされた細胞培養皿に神経幹細胞培地を入れて培養する。誘導された神経幹細胞は、以後、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液あるいはＡｃｃｕｔａｓｅ溶液を用いて継代培養でき、以後、次の実施例において前記誘導された神経幹細胞の様々な特性を検証する実験を行った。
実施例４：誘導された神経幹細胞の分子生物学的特性分析
本発明から誘導された神経幹細胞の分子生物学的特性を検証するための実験を行った。
本発明から誘導された神経幹細胞の分子生物学的特性を検証するための実験を行った。
＜４－１＞
Ｈ９胚性幹細胞から由来する神経幹細胞をｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとしたＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡ水準分析を通じて誘導された神経幹細胞がＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＰＡＸ６、ＰＬＺＦのような神経幹細胞マーカー遺伝子を発現していることを確認した（図４）。本実験に使用されたプライマー配列は、次の通りである：
ＳＯＸ１（ｆｏｒｗａｒｄ－ＡＣＡＣＴＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＡＴＧＧ；配列番号１、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＡＴＡＧＧＣＴＣＡＣＴＴＴＴＧＧＡＣＧＧ）；配列番号２、
ＳＯＸ２（ｆｏｒｗａｒｄ－ＴＣＡＧＧＡＧＴＴＧＴＣＡＡＧＧＣＡＧＡＧＡ；配列番号３、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＣＣＧＣＣＧＣＣＧＡＴＧＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡ；配列番号４）、ＰＡＸ６（ｆｏｒｗａｒｄ－ＧＧＣＴＣＡＡＡＴＧＣＧＡＣＴＴＣＡＧ；配列番号５、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＣＣＣＴＴＣＧＡＴＴＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＡＣＣ；配列番号６）、ＰＬＺＦ（ｆｏｒｗａｒｄ－ＴＡＴＡＣＡＧＣＣＡＣＧＣＴＧＣＡＡＧＣＣＡ；配列番号７、ｒｅｖｅｒｓｅ－ＴＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＡＧＧＣＡ；配列番号８）。
Ｈ９胚性幹細胞から由来する神経幹細胞をｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとしたＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡ水準分析を通じて誘導された神経幹細胞がＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＰＡＸ６、ＰＬＺＦのような神経幹細胞マーカー遺伝子を発現していることを確認した（図４）。本実験に使用されたプライマー配列は、次の通りである：
ＳＯＸ１（ｆｏｒｗａｒｄ－ＡＣＡＣＴＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＡＴＧＧ；配列番号１、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＡＴＡＧＧＣＴＣＡＣＴＴＴＴＧＧＡＣＧＧ）；配列番号２、
ＳＯＸ２（ｆｏｒｗａｒｄ－ＴＣＡＧＧＡＧＴＴＧＴＣＡＡＧＧＣＡＧＡＧＡ；配列番号３、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＣＣＧＣＣＧＣＣＧＡＴＧＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡ；配列番号４）、ＰＡＸ６（ｆｏｒｗａｒｄ－ＧＧＣＴＣＡＡＡＴＧＣＧＡＣＴＴＣＡＧ；配列番号５、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＣＣＣＴＴＣＧＡＴＴＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＡＣＣ；配列番号６）、ＰＬＺＦ（ｆｏｒｗａｒｄ－ＴＡＴＡＣＡＧＣＣＡＣＧＣＴＧＣＡＡＧＣＣＡ；配列番号７、ｒｅｖｅｒｓｅ－ＴＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＡＧＧＣＡ；配列番号８）。
＜４－２＞
免疫染色法を用いたタンパク質水準分析を通じて誘導された神経幹細胞がＳＯＸ１、ＮＥＳＴＩＮ、ＳＳＥＡ１、ＳＯＸ２、ＰＡＸ６及びＰＬＺＦのような神経幹細胞マーカー遺伝子を発現していることを確認した（図５）。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである：ＳＯＸ１（ＡＦ３３６９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＮＥＳＴＩＮ（ＭＡＢ５３２６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＳＳＥＡ１（ＭＡＢ４３０１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＳＯＸ２（ＳＣ－２００８８、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）、ＰＡＸ６（ＰＡＸ６、ＤＳＨＢ）、ＰＬＺＦ（ＡＦ２９４４、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
免疫染色法を用いたタンパク質水準分析を通じて誘導された神経幹細胞がＳＯＸ１、ＮＥＳＴＩＮ、ＳＳＥＡ１、ＳＯＸ２、ＰＡＸ６及びＰＬＺＦのような神経幹細胞マーカー遺伝子を発現していることを確認した（図５）。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである：ＳＯＸ１（ＡＦ３３６９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＮＥＳＴＩＮ（ＭＡＢ５３２６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＳＳＥＡ１（ＭＡＢ４３０１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＳＯＸ２（ＳＣ－２００８８、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）、ＰＡＸ６（ＰＡＸ６、ＤＳＨＢ）、ＰＬＺＦ（ＡＦ２９４４、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
＜４－３＞
Ｋｉ６７の免疫染色を通じて誘導された神経幹細胞が分裂能力を持っていることを確認した（図６）。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである。Ｋｉ６７（Ａｂ９２６０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
Ｋｉ６７の免疫染色を通じて誘導された神経幹細胞が分裂能力を持っていることを確認した（図６）。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである。Ｋｉ６７（Ａｂ９２６０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
＜４－４＞
ｑＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡの量的分析を通じてＨ９胚性幹細胞から由来する神経幹細胞に対して誘導された神経幹細胞がＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＰＬＺＦ、ＰＡＸ６のような神経幹細胞マーカー遺伝子を発現していることを確認した（図７）。
ｑＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡの量的分析を通じてＨ９胚性幹細胞から由来する神経幹細胞に対して誘導された神経幹細胞がＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＰＬＺＦ、ＰＡＸ６のような神経幹細胞マーカー遺伝子を発現していることを確認した（図７）。
＜４－５＞
ＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡ水準分析を通じて誘導された神経幹細胞が発達学上、ｆｏｒｅｂｒａｉｎ、ｍｉｄｂｒａｉｎ、ｈｉｎｄｂｒａｉｎ、ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ特異的なマーカー遺伝子を発現していることを確認した（図８）。本実験に使用されたプライマー配列は、次の通りである：
ＥＭＸ１（ｆｏｒｗａｒｄ－ＣＡＧＧＣＣＣＡＧＧＴＡＧＴＴＣＡＡＴＧＧＧ；配列番号９、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＧＣＴＣＡＧＣＣＴＴＡＡＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣ；配列番号１０）、ＦＯＸＧ１（ｆｏｒｗａｒｄ－ＡＣＣＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＡＧ；配列番号１１、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＡＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＣＴＧＡ；配列番号１２）、 ＯＴＸ１（ｆｏｒｗａｒｄ－ＣＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＣＣＣＡＴＡＣＧＧＣＡ；配列番号１３、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＧＧＴＡＧＣＧＡＧＴＣＴＴＧＧＣＧＡＡＧＡＧ；配列番号１４）、ＯＴＸ２（ｆｏｒｗａｒｄ－ＴＴＣＡＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＧＴＧＡ；配列番号１５、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＣＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＴＧＣＡＴ；配列番号１６）、ＥＮ１（ｆｏｒｗａｒｄ－ＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＣＡＡＡＣＣＧＣＴＡＣＡ；配列番号１７、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＧＴＴＧＴＡＣＡＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＣＡＴＧ；配列番号１８）、ＧＢＸ２（ｆｏｒｗａｒｄ－ＣＧＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＴＣＣＡＴ；配列番号１９、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＧＡＣＧＴＧＣＴＴＣＡＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧＡ；配列番号２０）、ＨＯＸＢ２（ｆｏｒｗａｒｄ－ＧＡＧＡＣＣＣＡＧＧＡＧＣＣＡＡＡＡＧＣ；配列番号２１、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＧＡＡＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＧＧＡＴＴＧ；配列番号２２）、ＨＯＸＢ４（ｆｏｒｗａｒｄ－ＣＴＧＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＴＧＡＣＴＧＣＴＣ；配列番号２３、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＣＡＧＡＡＣＴＣＡＡＣＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＣ；配列番号２４）。
ＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡ水準分析を通じて誘導された神経幹細胞が発達学上、ｆｏｒｅｂｒａｉｎ、ｍｉｄｂｒａｉｎ、ｈｉｎｄｂｒａｉｎ、ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ特異的なマーカー遺伝子を発現していることを確認した（図８）。本実験に使用されたプライマー配列は、次の通りである：
ＥＭＸ１（ｆｏｒｗａｒｄ－ＣＡＧＧＣＣＣＡＧＧＴＡＧＴＴＣＡＡＴＧＧＧ；配列番号９、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＧＣＴＣＡＧＣＣＴＴＡＡＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣ；配列番号１０）、ＦＯＸＧ１（ｆｏｒｗａｒｄ－ＡＣＣＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＡＧ；配列番号１１、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＡＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＣＴＧＡ；配列番号１２）、 ＯＴＸ１（ｆｏｒｗａｒｄ－ＣＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＣＣＣＡＴＡＣＧＧＣＡ；配列番号１３、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＧＧＴＡＧＣＧＡＧＴＣＴＴＧＧＣＧＡＡＧＡＧ；配列番号１４）、ＯＴＸ２（ｆｏｒｗａｒｄ－ＴＴＣＡＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＧＴＧＡ；配列番号１５、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＣＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＴＧＣＡＴ；配列番号１６）、ＥＮ１（ｆｏｒｗａｒｄ－ＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＣＡＡＡＣＣＧＣＴＡＣＡ；配列番号１７、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＧＴＴＧＴＡＣＡＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＣＡＴＧ；配列番号１８）、ＧＢＸ２（ｆｏｒｗａｒｄ－ＣＧＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＴＣＣＡＴ；配列番号１９、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＧＡＣＧＴＧＣＴＴＣＡＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧＡ；配列番号２０）、ＨＯＸＢ２（ｆｏｒｗａｒｄ－ＧＡＧＡＣＣＣＡＧＧＡＧＣＣＡＡＡＡＧＣ；配列番号２１、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＧＡＡＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＧＧＡＴＴＧ；配列番号２２）、ＨＯＸＢ４（ｆｏｒｗａｒｄ－ＣＴＧＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＴＧＡＣＴＧＣＴＣ；配列番号２３、
ｒｅｖｅｒｓｅ－ＣＡＧＡＡＣＴＣＡＡＣＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＣ；配列番号２４）。
＜４－６＞
ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを通してｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌにおいて誘導された神経幹細胞が本来の尿由来細胞よりＨ９胚性幹細胞から由来する神経幹細胞と類似したｍＲＮＡ及びｌｎｃ－ＲＮＡの発現パターンを示すことを確認した（図９、１０）。
ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを通してｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌにおいて誘導された神経幹細胞が本来の尿由来細胞よりＨ９胚性幹細胞から由来する神経幹細胞と類似したｍＲＮＡ及びｌｎｃ－ＲＮＡの発現パターンを示すことを確認した（図９、１０）。
＜４－７＞
ＶＥＥ遺伝子のＲＴ－ＰＣＲ及びｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ＰＣＲ分析を通じて誘導された神経幹細胞内に導入させた合成ｍＲＮＡがもはや残存せず、ｈｏｓｔ誘電体にｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎされていないことを確認した（図１１）。本実験に使用されたプライマー配列は、次の通りである：ＶＥＥ（ｆｏｒｗａｒｄ－ＡＣＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＧＣＴＧＴＴ；配列番号２５、ｒｅｖｅｒｓｅ－ＴＴＴＣＧＴＣＧＧＣＣＣＡＧＴＴＧＧＴＡ；配列番号２６）。
ＶＥＥ遺伝子のＲＴ－ＰＣＲ及びｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ＰＣＲ分析を通じて誘導された神経幹細胞内に導入させた合成ｍＲＮＡがもはや残存せず、ｈｏｓｔ誘電体にｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎされていないことを確認した（図１１）。本実験に使用されたプライマー配列は、次の通りである：ＶＥＥ（ｆｏｒｗａｒｄ－ＡＣＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＧＣＴＧＴＴ；配列番号２５、ｒｅｖｅｒｓｅ－ＴＴＴＣＧＴＣＧＧＣＣＣＡＧＴＴＧＧＴＡ；配列番号２６）。
＜４－８＞
ＳＴＲ ａｎａｌｙｓｉｓを通じてヒト尿由来細胞と誘導された神経幹細胞が同一の個体から由来したことを確認した（図１２）。
ＳＴＲ ａｎａｌｙｓｉｓを通じてヒト尿由来細胞と誘導された神経幹細胞が同一の個体から由来したことを確認した（図１２）。
＜４－９＞
核型分析を通じて誘導された神経幹細胞が正常な染色体を保存していることを確認した（図１３）。
核型分析を通じて誘導された神経幹細胞が正常な染色体を保存していることを確認した（図１３）。
実施例５：誘導された神経幹細胞の分化能力分析
＜５－１＞神経細胞への分化能力分析
誘導された神経幹細胞を神経細胞へ分化させるときに、神経細胞マーカー遺伝子であるＴＵＪ１、ＭＡＰ２を発現していることを免疫染色法により確認した（図１４）。神経細胞分化法は、次の通りである。神経幹細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１ｘＮ２、１ｘＢ２７、３００ｎｇ／ｍｌのｃＡＭＰ、０.２ｍＭのｖｉｔａｍｉｎ Ｃ、１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦと１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦを添加した神経細胞分化培地に１４日間培養した後、分析する。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである。Ｔｕｊ１（８０１２０２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＭＡＰ２（ＡＢ５６２２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。
＜５－１＞神経細胞への分化能力分析
誘導された神経幹細胞を神経細胞へ分化させるときに、神経細胞マーカー遺伝子であるＴＵＪ１、ＭＡＰ２を発現していることを免疫染色法により確認した（図１４）。神経細胞分化法は、次の通りである。神経幹細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１ｘＮ２、１ｘＢ２７、３００ｎｇ／ｍｌのｃＡＭＰ、０.２ｍＭのｖｉｔａｍｉｎ Ｃ、１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦと１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦを添加した神経細胞分化培地に１４日間培養した後、分析する。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである。Ｔｕｊ１（８０１２０２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＭＡＰ２（ＡＢ５６２２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。
また、誘導された神経幹細胞は、ＧＡＢＡ神経細胞、運動神経細胞、ドーパミン神経細胞へ分化できることを免疫染色法により、それぞれＧＡＢＡ、ＨＢ９、ＴＨを染色して確認できた（図１５）。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである：ＧＡＢＡ（Ａ２０５２、Ｓｉｇｍａ）、ＨＢ９（８１.５Ｃ１０、ＤＳＨＢ）、ＴＨ（ＡＢ１５２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。
＜５－２＞神経膠細胞への分化能力分析
免疫染色法によるＳ１００ｂｅｔａ、ＧＦＡＰ染色を通じて誘導された神経幹細胞が神経膠細胞のいずれかである星状細胞へ分化できることを確認した（図１６）。星状細胞の分化法は、次の通りである。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１ｘＮ２と１ｘＢ２７が含まれた培地に２.５％ＦＢＳまたは２０ｎｇ／ｍｌのＣＮＴＦと１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を添加した星状細胞分化培地に１４日以上培養した後に分析する。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである：Ｓ１００ｂｅｔａ（Ｓ２５３５、Ｓｉｇｍａ）、ＧＦＡＰ（ＳＡＢ４５０１１６２、Ｓｉｇｍａ）。
免疫染色法によるＳ１００ｂｅｔａ、ＧＦＡＰ染色を通じて誘導された神経幹細胞が神経膠細胞のいずれかである星状細胞へ分化できることを確認した（図１６）。星状細胞の分化法は、次の通りである。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１ｘＮ２と１ｘＢ２７が含まれた培地に２.５％ＦＢＳまたは２０ｎｇ／ｍｌのＣＮＴＦと１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を添加した星状細胞分化培地に１４日以上培養した後に分析する。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである：Ｓ１００ｂｅｔａ（Ｓ２５３５、Ｓｉｇｍａ）、ＧＦＡＰ（ＳＡＢ４５０１１６２、Ｓｉｇｍａ）。
免疫染色法によるＰＤＧＦＲ、ＯＬＩＧ２、Ｏ４染色を通じて誘導された神経幹細胞が神経膠細胞のいずれかである希突起膠細胞に分化できることを確認した（図１７）。希突起膠細胞の分化法は、次の通りである。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１ｘＮ２、１ｘＢ２７、２５ｕｇ／ｍｌのｉｎｓｕｌｉｎ、１ｕＭのＳｈｈ ａｇｏｎｉｓｔと１００ｎＭのｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄが添加された培地に５日以上培養した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１ｘＮ２、１ｘＢ２７、２５ｕｇ／ｍｌのｉｎｓｕｌｉｎ、１００ｎｇ／ｍｌのｂｉｏｔｉｎ、６０ｎｇ／ｍｌのＴ３、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＮＴ－３と１ｕＭのｃＡＭＰが添加された培地に７日以上培養した後に分析する。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである：ＰＤＧＦＲ（ＳＣ３３８、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）、ＯＬＩＧ２（ＡＢ９６１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｏ４（ＭＡＢ３４５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。
実施例６：万能性段階を経ない神経幹細胞誘導方法の検証及び分析
本発明に使用された逆分化因子であるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＧＬＩＳ１遺伝子の組み合わせは、特定の条件下で誘導万能幹細胞を確立できることが知られている（米国特許第０９８６２９３０号）。
本発明に使用された逆分化因子であるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＧＬＩＳ１遺伝子の組み合わせは、特定の条件下で誘導万能幹細胞を確立できることが知られている（米国特許第０９８６２９３０号）。
しかし、本発明において誘導された神経幹細胞が万能性段階を経ないことを、次のような理由により検証した。
第一に、本発明では、ヒト誘導万能幹細胞を確立するのに必須的に知られているｂＦＧＦ及び内在遺伝子のｍＲＮＡの発現に必要なＢ１８Ｒタンパク質を排除した神経幹細胞誘導培地を用いたため、現在までに報告された研究結果に従う場合、ヒト誘導万能幹細胞を確立するのは不可能である。
第二に、本発明において誘導された神経幹細胞が形成される時期は、プロトコル上の誘導過程後８日前後で（図３）、知られているヒト誘導万能幹細胞が形成される時期は、誘導過程後、３週間以上が必要となるため、万能性段階を経たとするには時間的に短い。
第三に、日付別ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を通じて察し見たときの万能性段階マーカー遺伝子であるＯＣＴ４、ＲＥＸ１及びＮＡＮＯＧの発現が０日目から１２日目にかけて低い発現を維持していた（図１８）。本実験に使用されたプライマー配列は、次の通りである。ＯＣＴ４（ｆｏｒｗａｒｄ－ＧＡＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＡＧＣＴＡＧＧ；配列番号２７、ｒｅｖｅｒｓｅ－ＣＴＴＣＣＣＴＣＣＡＡＣＣＡＧＴＴＧＣＣＣＣＡＡＡＣ；配列番号２８）、ＲＥＸ１（ｆｏｒｗａｒｄ－ＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＧＧＧＣＡＡＡＧＡＣ；配列番号２９、ｒｅｖｅｒｓｅ－ＧＡＡＣＡＴＴＣＡＡＧＧＧＡＧＣＴＴＧＣ；配列番号３０）、ＮＡＮＯＧ（ｆｏｒｗａｒｄ－ＣＡＧＣＣＣＴＧＡＴＴＣＴＴＣＣＡＣＣＡＧＴＣＣＣ；配列番号３１、ｒｅｖｅｒｓｅ－ＧＧＡＡＧＧＴＴＣＣＣＡＧＴＣＧＧＧＴＴＣＡＣＣ；配列番号３２）。
第四に、誘導された神経幹細胞を免疫染色法により検証したとき、Ｈ９胚性幹細胞とは異なり、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの発現が感知されなかったことを確認した（図１９）。本実験に使用された抗体の場合、次の通りである：ＯＣＴ４（ＳＣ５２７９、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）、ＮＡＮＯＧ（ＡＦ１９９７、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）。
前記のような根拠に基づいて、本発明の方法は、尿細胞が万能性幹細胞の段階を経ずにすぐに神経幹細胞に誘導できることを確認できた。
実施例７：神経幹細胞への誘導効率増加実験
尿細胞から神経幹細胞への転換効率を向上させることができる培養条件などをさらに確認した。
尿細胞から神経幹細胞への転換効率を向上させることができる培養条件などをさらに確認した。
一般的な酸素条件（２１％Ｏ２）を対照群とし、酸素の濃度を調節して誘導を行った。具体的に、１×１０^５個の尿由来細胞をそれぞれの基本条件（２１％Ｏ２）と低酸素条件（５％ｈｙｐｏｘｉａ）で神経幹細胞誘導方法を行った後、免疫染色法を用いて神経幹細胞マーカー遺伝子ＳＯＸ１、ＰＬＺＦにｐｏｓｉｔｉｖｅコロニーの数を数えることにより、低酸素条件で約２倍の転換効率の増加を示すことを確認した（図２０）。
Claims (7)
- （ｉ）Ｏｃｔ４タンパク質をコードする核酸と、
（ｉｉ）Ｓｏｘ２タンパク質をコードする核酸と、
（ｉｉｉ）Ｋｌｆ４タンパク質をコードする核酸と、
（ｉｖ）Ｇｌｉｓ１タンパク質をコードする核酸と、
（ｖ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地及びＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を１：１の体積比で混合することによって得られる神経幹細胞誘導培地であって、前記神経幹細胞誘導培地は、Ｎ２、Ｂ２７、ｈｕｍａｎ ＬＩＦ、ＴＧＦ－ｂｅｔａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＧＳＫ３－ｂｅｔａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｓｈｈアゴニスト（Ｓｈｈ ａｇｏｎｉｓｔ）、アデニル環化活性剤（ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、ヒストン脱アセチル化抑制剤（ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）及びアスコルビン酸２－リン酸塩（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含む、神経幹細胞誘導培地と
を含む、尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する組成物。 - 前記尿細胞は、尿中に含まれる脱落した体細胞である、請求項１に記載の尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する組成物。
- 前記Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１タンパク質をコードする核酸は、合成ｍＲＮＡである、請求項１に記載の尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する組成物。
- （ａ）尿から尿細胞を分離培養する段階と、
（ｂ）前記培養した尿細胞に請求項１または３に記載の組成物を導入する段階と、
（ｃ）前記組成物が導入された尿細胞を神経幹細胞誘導培地で７－１０日間培養して神経幹細胞へ直接逆分化を誘導する段階と、
（ｄ）前記神経幹細胞誘導培地によって直接逆分化を誘導した細胞から神経幹細胞様の特性を持つ神経幹細胞株を選別する段階と、
を含み、
前記（ｃ）段階において、前記神経幹細胞誘導培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地及びＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を１：１の体積比で混合し、前記培地混合物に、Ｎ２、Ｂ２７、ｈｕｍａｎ ＬＩＦ、ＴＧＦ－ｂｅｔａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＧＳＫ３－ｂｅｔａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｓｈｈアゴニスト（Ｓｈｈ ａｇｏｎｉｓｔ）、アデニル環化活性剤（ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、ヒストン脱アセチル化抑制剤（ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）及びアスコルビン酸２－リン酸塩（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を添加することによって得られる、
尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する方法。 - 前記（ｂ）段階において、前記Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１タンパク質をコードする合成ｍＲＮＡの導入は、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて前記合成ｍＲＮＡを導入させるものである、請求項４に記載の尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する方法。
- 前記神経幹細胞誘導培地における培養は、低酸素（Ｏ２ｈｙｐｏｘｉａ）の条件で行われるものである、請求項４に記載の尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する方法。
- 請求項４～６のいずれか一項に記載の方法によって製造された直接逆分化した神経幹細胞を有効成分として含み、前記直接逆分化した神経幹細胞は、ＥＮ１及びＯＴＸ２タンパク質をコードする遺伝子を発現する、神経細胞損傷疾患の予防または治療用薬学的組成物。
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