KR101548534B1

KR101548534B1 - 전자기장을 이용한 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법

Info

Publication number: KR101548534B1
Application number: KR1020130124784A
Authority: KR
Inventors: 김종필; 백순봉; 박정극
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2013-10-18
Publication date: 2015-09-02
Also published as: KR20150045557A; WO2015057015A1

Abstract

본 발명은 전자기장을 이용한 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 전자기장을 이용한 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법은 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 효율이 우수하고, 유도만능 줄기세포를 용이하게 수득할 수 있다. 또한, 상기 방법으로 제조된 유도만능 줄기세포는 역분화 인자의 발현양이 높고, 마우스에 이식하는 경우, 전분화능이 나타난다. 따라서, 상기 역분화된 유도만능 줄기세포를 세포치료제 개발 및 재생의학 분야의 연구 등에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

전자기장을 이용한 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법{method for dedifferentiating adult cell to induced pluripotent stem cell using electromagnetic field}

본 발명은 전자기장을 이용한 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법에 관한 것이다.

줄기세포 (stem cells)는 무한히 자가 재생할 수 있으면서 신체 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 미분화 세포이다. 줄기세포 연구는 재생의학, 신약 개발과 같은 세포치료제의 개발, 인체 질환의 발병 원인 및 치료, 그리고 인체의 발생 과정을 연구하는 중요한 대상으로 각광받고 있는 연구 분야이다. 만능 줄기세포 (totipotent stem cells)는 난자와 정자의 수정 이후 8 세포기까지의 세포를 말하며, 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생 가능하다. 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cells)는 수정 4-5일 후 나타나는 배반포 (blastocyte)의 안쪽에 위치한 내세포피 (inner cell mass)에서 유래하며, 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있지만, 새로운 생명체를 형성하지는 못한다. 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)는 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포이다. 줄기세포 중 배아 줄기세포는 착상 전 배아의 내세포피 (inner cell mass)로부터 만들어지며, 적절한 환경 하에서 200가지 이상의 세포로 분화할 수 있고, 기관 전체를 만들 수도 있다 (Nagy et al., Development, 110:815-821, 1990). 그러나 세포치료제로서 배아 줄기세포는 난자를 사용해서 만들어야 하고, 배아를 파괴해야 얻을 수 있다는 윤리적인 문제를 가지며, 또한 면역거부반응이 있어서 임상에 사용하기 어렵다는 것 등과 같은 여러 문제점을 가진다.

최근, 이에 대한 보완책으로 유도 만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells)가 보고되고 있다. 유도 만능 줄기세포는 분화가 끝난 세포를 역분화시켜 전분화능 (pluripotency)을 갖는 세포를 지칭하며, 배아 줄기세포와 유사하게 자가재생할 수 있는 능력을 가지고 신체의 모든 타입의 세포로 분화할 수 있는 특징을 가진다. 현재까지 유도 만능 줄기세포는 유전자 발현과 분화능에서 만능 줄기세포인 배아 줄기세포와 유전적, 후생학적 특성 및 분화능 등에서 매우 유사한 특성을 갖는 것으로 보고되고 있다 (Takahashi and Yamanaka, Cell, 126:663-676, 2006). 현재까지 역분화 인자의 세포내 도입은 바이러스 벡터를 이용하여 세포 내 전달하는 방법이 현재까지 가장 효과적이다. 하지만 치료 목적을 위한 유도 만능 줄기세포 제작에 바이러스 유전체의 이용은 잠재적 위험성을 지니고 있다. 또한 세포내 유전체에 무작위로 매우 안정적으로 삽입되기 때문에 유전자의 변이와 같은 다양한 문제들을 항상 내재하고 있다. 또한, 역분화 줄기세포의 생성효율이 1 % 미만으로 아주 낮고, 종양생성의 위험을 갖고 있다. 많은 연구팀에서, 이 같은 문제를 해결하기 위하여 보고된 논문에서는 발암유전자를 대체 또는, 리프로그래밍에 보다 유리한 세포 형태를 이용하여 리프로그래밍 인자를 줄이는 연구가 진행되고 있다. 그러나 이 역시 다양한 인자를 주입하거나, 특정 세포 종류를 분리 (isolation) 해야하는 단점을 가지고 있다.

역분화 줄기세포의 연구가 현재 세계적인 화두임에도 불구하고, 아직 국내에서는 리프로그래밍 방법에 대한 새로운 견해를 제시하거나 그 기전을 확인한 논문이 거의 보고 되어 있지 않고, 특히 일본이 역분화줄기세포 분야에 세계적 선구적 역할을 하고 있음은 물론이고, 최근 중국에서도 이와 관련하여 의미있는 연구사례가 다수 보고되고 있으나 우리나라에선 그 연구가 미흡하여 세계적으로 뒤처지고 있는 실정이다.

한편, 파동에너지를 생물학에 접목하는 기술에 대한 연구가 진행되고 있다. 기존에 알려진 파동을 생물학에 접목한 기술로는 뇌조직에 약 10 Hz 이하의 저주파 에너지를 적용시키기 위한 장치로 환자의 뇌 안에 전극을 이식후 직접 전기자극을 부여하여 전기 흐름에 의한 자기장을 야기하는 장치 (공개특허: US20060205993)가 있다. Zheng은 중추신경계에 자기자극을 주는 방법으로 고주파 또는 복수의 주파수 성분을 조합하여 뇌기능 개선에 사용하려는 기술 (JP 2008-543388)을 개발하였으며 Riken은 배아줄기세포에 전기펄스 처리하여 신경세포를 제조하는 기술 (US200740065941)을 개발하였다. Gliner 등은 세포에 전기펄스를 처리하여 신경세포를 제조하는 기술을 개발하였다 (US20050075679). 그러나, 파동에너지를 이용하여 성체세포를 역분화시키는 기술에 대한 연구는 전무한 실정이다.

이에 본 발명자들은 세포를 효율적으로 리프로그래밍하여 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 기술에 대한 연구를 계속하던 중, 특정한 주파수를 갖는 전자기장내에서 성체세포를 배양하는 경우, 역분화 효율이 유의적으로 높음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 전자기장 하에서 성체세포를 배양하는 단계;를 포함하는 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법을 제공함에 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 역분화된 유도만능 줄기세포를 제공함에 있다.

본 발명은 전자기장 하에서 성체세포를 배양하는 단계;를 포함하는 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 역분화된 유도만능 줄기세포를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 "전자기장"은 주기적으로 세기가 변화하는 전자기장이 공간 속으로 전파해 나가는 현상으로 전자파와 같은 의미이며, 본 발명에서 사용된 전자기장은 펄스파 형태 또는 연속파 (사인파)형태를 모두 포함할 수 있다.

본 발명에서 전자기장의 주파수는 1 내지 200 Hz, 바람직하게는 50 Hz 일 수 있고, 전자기장의 강도는 0.1 내지 15 mT, 바람직하게는, 0.5 내지 2 mT 일 수 있다.

본 발명에서 "줄기세포"는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포, 즉 미분화세포이며 배아 줄기세포와 성체 줄기세포로 분류할 수 있다. "배아 줄기세포"는 분화능력을 가지고 있으나 아직 분화가 일어나지 않은 미분화 세포로, 이러한 미분화 상태에서 적절한 조건을 맞춰주면 다양한 조직세포로 분화가 가능한 만능 줄기세포성(pluripotency)을 가지는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아 줄기세포로부터 유래한 배아체 (embryoid bodies)도 포함한다. "성체 줄기세포"는 모든 조직으로 분화할 수는 없으나 각 표적기관으로는 분화할 수 있는, 제한된 분화능을 가지는 세포를 의미한다. 더불어 "분화능"이란 생물의 초기 발생에서 배의 일부가 주어진 발생조건에 따라 각종 기관이나 조직으로 분화될 수 있는 능력을 말한다. 본 발명에서 "유도 만능 줄기세포"란 분화가 끝난 세포를 역분화시켜 전분화능(pluripotency)을 갖는 세포를 지칭하며, 배아 줄기세포와 유사하게 자가재생할 수 있는 능력을 가지고 신체의 모든 타입의 세포로 분화할 수 있는 특징을 가진 것으로, "역분화 줄기세포"라고도 한다. 유도 만능 줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지며, 구체적으로는 비슷한 세포 모양을 보여주며, 유전자, 단백질 발현 패턴이 유사하며, in vitro 및 in vivo에서 전분화능을 가지며, 테라토마 (teratoma)를 형성하고, 생쥐의 배반포 (blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라 (chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이(germline transmission)가 가능하다.

또한, 본 발명에서 "성체세포"는 배아세포와 반대되는 용어로, 태어나서 생존하는 성체로부터 유래한 세포를 지칭한다. 본 발명에서 사용되는 성체세포의 유전적 배경에는 제한이 없으나, 개과 동물, 고양이과 동물, 멧돼지과 동물, 소과 동물, 사슴과 동물, 기린과 동물, 페커리과 동물, 낙타과 동물, 하마과 동물, 말과 동물, 맥과 동물, 코뿔소과 동물, 족제비과 동물, 토끼과 동물, 설치류 및 영장류로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상으로부터 유래일 수 있고, 바람직하게는 마우스 또는 인간의 섬유아세포일 수 있다.

본 발명에서 "역분화 (dedifferentiation)"는 부분 또는 최종 분화된 세포를 만능 또는 다능과 같은 미분화 상태로 되돌려서, 새로운 분화 조직의 형성이 가능하도록 하는 후성학적인 역행 과정을 의미한다. 이러한 역분화 현상은 세포 유전체의 후성학적인 변형(epigenetic changes)들이 고정되어 있는 것이 아니라 지워지고 다시 형성될 수 있는 가역적인 과정이기 때문에 가능하다. 역분화는 "재프로그램화 (reprogramming)"라고도 불리우며, 부분 또는 최종 분화된 세포의 유전적 및 표현적 프로필을 배아줄기세포의 그것과 비슷하도록 변화시키는 과정에 관한 것이다. 예를 들면, 상기 변화는 메틸화 패턴의 변화, 줄기세포성 유전자의 발현율 변화 등을 포함한다.

인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함하나, 본 발명에서는 렌티바이러스를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 역분화 인자는 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog 및 Lin28이고, 바람직하게는 Oct4, Sox2, Klf4 및 C-Myc이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 재프로그램화를 위한 유도 만능 줄기세포의 형성을 위해서는, 역분화 유도인자를 체세포 내에 전달하는 단계를 필수적으로 거치게 되며, 구체적으로는, 레트로바이러스를 수송체로 사용하여 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 역분화 유도인자를 코딩하는 유전자들을 체세포에 전달하거나 (Takahashi. K. et al, Cell,131:861-872, 2007), 또는 렌티바이러스들을 수송체로 사용하여 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 역분화 유도인자를 코딩하는 유전자를 체세포에 전달할 수 있다.

Sox 패밀리 유전자들은 Oct4와 유사하게 만능성 유지에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 그러나 Oct4 유전자가 만능성 줄기세포에만 관여하고 있는 반면 Sox 패밀리 유전자들은 다능성 줄기세포나 단능성 줄기세포와도 관련되어 있다. Sox2 (SRY-type high mobility group box 2) 전사인자는 Sox 패밀리 단백질 중 유일하게 배아줄기세포의 만능성 유지에 중요한 역할을 한다 (Avilion et al., Genes Dev, 17:126-140, 2003). Oct4와 마찬가지로 생쥐의 배아줄기세포에서 Sox-2의 발현을 저해하면 분화가 유도된다 (Ivanova et al., Nature, 442:533-538, 2006). 또한 여러 Sox2 하위 유전자의 프로모터 영역에서 발견되는 Sox-2 결합부위는 종종Oct4와 Nanog 결합부위와 인접하게 존재한다 (Boyer et al., Cell, 122:947-956, 2005). 그러므로 Sox2 전사인자와 Oct4 전사인자 사이의 상호작용이 유도 만능 줄기세포가 미분화 상태를 유지하고 배아줄기세포의 특성을 나타나게 하는데 기본적인 틀을 제공할 것으로 예상된다 (Lewitzky and Yamanaka, Current Opinion in Biotechnology, 18:467-473, 2007).

c-Myc는 세포 성장, 분화, 증식, 세포 예정사 및 암세포로의 형질 전환 등의 다양한 세포 내 기능을 수행하는 발암 유전자이다. 또한 만능성을 유지하는 주요 기작인 LIF (Leukemia Inhibitory Factor)/STAT3와 Wnt 신호전달 메커니즘의 하위 유전자로 밝혀졌다 (Sears et al., Genes Dev, 14:2501-2514, 2000). c-Myc 전사인자는 유도 만능 줄기세포 내에서 세포의 증식을 저해하는 것을 막아주는 역할을 하는 것으로 예상되고 있다. 또한 c-Myc은 게놈 상에 존재하는 Myc 인식부위에 결합하는 것 뿐만 아니라 염색질 구조를 변화시켜 Oct4와 Sox2 가 표적 유전자에 잘 결합할 수 있도록 도와주는 기능을 수행한다 (Lewitzky and Yamanaka, Current Opinion in Biotechnology, 18:467-473, 2007).

Klf4는 성장 억제에 관여하여 세포주기를 조절하는 역할을 한다. 최근 연구에 따르면 c-Myc과 유사하게 배아줄기세포에서 STAT3의 하위 유전자로 작용하며, 과발현시 Oct4 발현을 유지시켜 생쥐 배아줄기세포의 분화를 억제한다고 밝혀졌다 (Li et al., Blood, 105:635-637, 2005).

Nanog는 배아 특이적인 유전인자로 Oct4나 Sox2와 마찬가지로 배아줄기세포의 만능성을 유지하는데 필요한 유전자이다. 또한 LIN28은 mRNA 결합 단백질로 배아줄기세포와 배아종양세포에서 발현되며 분화와 증식에 관여하고 있다고 알려져 있다 (Yu et al., Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cell, Science New York, NY, 2007).

상기와 같이 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog 및 Lin28 유전자를 "역분화 유도인자 (reprogramming-inducing gene)"라고 하며, 역분화 유도인자는 분화가 끝난 세포를 재프로그램화시킬 수 있는 유전자들을 의미한다. 특히 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 Yamanaka 인자라고 부른다.

본 발명에서 성체세포의 배양은 FBS (Fetal Bovine serum) 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 배지에서 성체세포를 배양할 수 있다.

상기 배지는 DMEM (Dulbecco`s Modified Eagle Medium)일 수 있으나, 이에 제한 되지 않는다. 5 내지 15% (v/v)의 FBS (Fetal Bovine serum), 바람직하게는 10 %의 FBS, 0.1 내지 5 % (v/v)의 페니실린/스트렙토마이신, 바람직하게는 1 %의 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 배지에서 성체세포를 배양할 수 있고, 상기 배양은 1 내지 10일, 바람직하게는 5일 동안 배양할 수 있다.

상기 성체세포가 마우스 유래의 성체세포인 경우, FBS (Fetal Bovine serum), 비필수 아미노산, 페니실린/스트렙토마이신, 글루타민, β-머캅토에탄올 및 백혈병억제인자 (LIF; Leukemia Inhibitory factor)가 포함된 배지에서 성체세포를 추가적으로 배양할 수 있다.

상기 추가배양을 위한 배지로는 DMEM (Dulbecco`s Modified Eagle Medium)일 수 있고, 5 내지 20% (v/v)의 FBS (Fetal Bovine serum), 바람직하게는 15 %의 FBS, 0.1 내지 5 % (v/v)의 비필수 아미노산, 바람직하게는 1 %의 비필수 아미노산, 0.1 내지 5 % (v/v)의 페니실린/스트렙토마이신, 바람직하게는 1 %의 페니실린/스트렙토마이신, 0.1 내지 5 % (v/v), 바람직하게는 1 % (v/v)의 글루타민 (100 mM 내지 500 mM, 바람직하게는 200 mM), 0.1 내지 5 % (v/v), 바람직하게는 1 % (v/v)의 β-머캅토에탄올 및 10^-6 내지 10^-5 % (v/v), 바람직하게는 4 × 10^-6 % (v/v)의 백혈병억제인자 (LIF; Leukemia Inhibitory factor)가 포함된 배지에서 성체세포를 추가적으로 배양할 수 있으며, 상기 배양은 10 내지 20일, 바람직하게는 15일 동안 배양할 수 있다.

상기 성체세포가 인간 유래의 성체세포인 경우, 추가배양을 위한 배지로 DF12 배양 배지를 이용할 수 있고, 10 내지 30 % (v/v), 바람직하게는 20 % (v/v)의 혈청 대체물 (serum replacer), 0.1 % 내지 5 % (v/v), 바람직하게는 1 % (v/v)의 비필수 아미노산, 0.1 % 내지 5 % (v/v), 바람직하게는 1 %의 페니실린/스트렙토마이신, 0.1 내지 5 % (v/v), 바람직하게는 1 % (v/v)의 글루타민 및 β-머캅토에탄올의 혼합물 및 10^-5 내지 10^-4 % (v/v), 바람직하게는 1.4 × 10^-5 (v/v) %의 bFGF (bovine fibroblast growth factor)가 포함된 배지에서 성체세포를 추가적으로 배양할 수 있으며, 상기 배양은 20 내지 40일, 바람직하게는 30일 동안 수행할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 역분화된 유도만능 줄기세포는 역분화 인자의 발현양이 높고, 역분화 인자의 프로모터 부위가 탈 메틸화가 된다. 또한, 상기 역분화된 유도만능 줄기세포를 마우스에 이식하는 경우, 전분화능이 나타난다. 따라서, 상기 역분화된 유도만능 줄기세포를 세포치료제 개발 및 재생의학 분야의 연구 등에 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 전자기장을 이용한 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법은 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 효율이 우수하고, 유도만능 줄기세포를 용이하게 수득할 수 있다. 또한, 상기 방법으로 제조된 유도만능 줄기세포는 역분화 인자의 발현양이 높고, 마우스에 이식하는 경우, 전분화능이 나타난다. 따라서, 상기 역분화된 유도만능 줄기세포를 세포치료제 개발 및 재생의학 분야의 연구 등에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 Oct4-GFP Knock-in 마우스의 섬유아세포에 역분화인자 (Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4)를 도입한 후, 50Hz 전자기파를 처리하는 경우, GFP-양성 유도만능 줄기세포 콜로니를 확인한 도이다.
도 2는 Oct4-GFP Knock-in 마우스의 섬유아세포에 역분화인자 (Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4)를 도입한 후, 50Hz 전자기파를 처리하는 경우, FACS를 이용하여 GFP-양성 세포 집단을 분석한 도이다.
도 3은 Oct4-GFP Knock-in 마우스의 섬유아세포에 역분화인자 (Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4)를 도입한 후, 50Hz 전자기파를 처리하는 경우, 시간에 따른 전분화능 마커 유전자 (Oct4, Sox2 및 Nanog)의 mRNA 발현변화를 시간에 따라 나타낸 도이다.
도 4는 Oct4-GFP Knock-in 마우스의 섬유아세포에 역분화인자 (Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4)를 도입한 후, 50 Hz 전자기파를 처리하는 경우, 면역염색법을 통하여 전분화능 마커 유전자 (Oct4, Sox2, Nanog)의 단백질 수준에서 발현을 확인한 도이다.
도 5는 Oct4-GFP Knock-in 마우스의 섬유아세포에 역분화인자 (Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4)를 도입한 후, 50Hz 전자기파를 처리하는 경우, Oct4와 Nanog의 프로모터의 메틸화 경향을 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 전자기장을 통해 제조된 마우스 유도만능 줄기세포를 면역결핍마우스에 주사한 경우, 키메라 마우스의 생성여부를 통해 유도만능 줄기세포의 전분화능을 확인한 도이다.
도 7은 전자기장을 인간 섬유아세포에 처리한 경우, 인간 유도만능 줄기세포의 생성을 확인한 도이다.
도 8은 전자기장을 인간 섬유아세포에 처리한 경우, 시간에 따른 전분화능 마커 유전자의 mRNA 발현변화를 나타낸 도이다.
도 9는 전자기장을 인간 섬유아세포에 처리한 경우, 면역염색법을 통하여 전분화능 마커 유전자의 단백질 수준에서 발현을 확인한 도이다.
도 10은 본 발명의 전자기장을 통해 제조된 인간 유도만능 줄기세포를 면역결핍마우스에 주사한 경우, 테라토마 (Teratoma) 능을 분석함으로써 전분화능을 확인한 도이다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[ 실시예 1] 전자기장을 이용한 마우스 성체세포 리프로그래밍 .

1. 전자기장을 조사한 경우, 역분화 효율 확인

OCT4-GFP Knock-in 성체마우스의 꼬리를 잘라 일차 (primary) 세포배양을 한 후, 상기 세포에 4가지 역분화 인자 (Oct4/Sox2/c-Myc/Klf4)가 도입된 렌티바이러스(lentivirus)를 처리하였다. 이 후, 전자기장 (50 Hz, 0.5 내지 2 mT)을 발생시키는 전자기파 장치를 배양기 내에 장착하고 전자기장 안에 배양 접시를 놓고10 %(v/v)의 DMEM, 1 % (v/v)의 FBS, 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 배양 배지에서 5일간 배양한 후(2일에 한번 배양 배지 교환), 15 % (v/v)의 DMEM에 1 % (v/v)의 FBS, 1 % (v/v)의 비-필수아미노산, 1 % (v/v)의 페니실린/스트렙토마이신, 200 mM의 글루타민, 0.7 ul의 β-머캅토에탄올, 5 μl의 백혈병억제인자 (LIF; Leukemia Inhibitory factor)가 함유된 배양 배지에서 15일 동안 배양하였다(2일에 한번 배양 배지 교환). 이 후, 형광 현미경을 통하여 GFP 양성 유도 만능 줄기세포 콜로니를 관찰하였고, FACS를 이용하여 콜로니를 정량적으로 분석하였다. 이의 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 50Hz의 전자기장을 처리한 군에서, 전기장을 처리하지 않은 군과 비교하여, GFP 양성 유도만능 줄기세포 콜로니들이 약 30배 이상 증가함을 확인하였다.

2. 전자기장을 조사한 경우, 분자 수준에서 역분화 인자 발현 확인

상기 실시예 1-1에서 제조된 유도만능 줄기세포를 계대 배양하였다. 보다 구체적으로 계대 하루 전, 0.2 %의 젤라틴을 코팅한 6-웰 플레이트에 미토마이신 C (Mitomycin C; 10 ug/ml)를 37 ℃로 유지되는 CO₂ 배양기에서 2시간 처리한 마우스 배아 섬유아세포 (배아 단계 13일 후의 mouse embryonic fibroblast(feeder))를 배양한 후, 다음날 5000~1000개의 유도만능줄기세포를 트립신아제를 처리한 다음, 상기 섬유아세포 상에서 배양하였다.

이 후, 통상적인 방법으로 mRNA를 수득하고, cDNA를 합성 후, 전분화능 마커 유전자 (Oct4, Sox2, Nanog)들을 정량적 PCR (quantitative PCR)로 분석하였고, 이의 결과를 도 3에 나타내었다. 또한, 면역염색법을 통하여 전분화능 마커 유전자들 (Oct4, Sox2, Nanog)의 단백질 수준에서의 발현을 확인한 결과를 도 4에 나타내었다. 또한, 본 발명의 유도만능 줄기세포의 Oct4, Nanog의 프로모터 부위의 탈메틸화 경향을 도 5에 나타내었다. 또한, 본 발명의 유도만능 줄기세포의 전분화능을 확인한 결과를 도 6에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 전자기장을 통해 역분화한 세포들에서 전분화능 마커 유전자 (Oct4, Sox2, Nanog)들의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인하였다.

또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 전자기장을 조사한 경우, 본 발명의 유도만능 줄기세포에서 전분화능 마커 (Oct4, Sox2, Nanog)가 단백질 수준에서 발현함을 확인하였다.

또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 전자기장을 조사한 경우, 본 발명의 역분화로 유도된 유도만능 줄기세포의 OCt4, Nanog의 프로모터 지역이 탈메틸화가 되었음을 확인하였다.

또한, 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 유도 만능 줄기세포가 키메릭 마우스를 생성함을 확인함으로써, 본 발명의 유도만능 줄기세포가 전분화능이 있음을 확인하였다.

[ 실시예 2] 전자기장을 이용한 인간 성체세포 리프로그래밍

1. 전자기장을 조사한 경우, 역분화 효율 확인

인간 섬유아세포를 배양하여 역분화 인자 (Oct4/Sox2/c-Myc/Klf4)가 도입된 렌티바이러스를 처리하고, 전자기파 장치를 배양기 내에 장착하고 전자기장 안에 배양접시를 넣고, 10 %(v/v)의 DMEM, 1 % (v/v)의 FBS, 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 배양배지에서 5일간 배양한 후(2일에 한번 배양배지 교환), 200 ml의 DF12 배지에 50 ml(v/v) 혈청 대체물 (serum replacer), 2.5 ml의 1% 비-필수 아미노산, 1 % (v/v)의 페니실린/스트렙토마이신, 1.25 ml의 [200 mM 글루타민 및 β-머캅토에탄올] 및 10 μl의 bFGF가 함유된 배양배지에서 30일 동안 배양(매일 한번 배양배지 교환)하였다. 전자기장을 처리한 경우와 비 처리한 경우의 세포 생성 속도를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 전자기장을 처리한 경우, 전자기장을 처리하지 않은 세포와 비교하여 유도 만능줄기세포 콜로니들이 빠르게 생성되는 것을 확인하였다.

2. 전자기장을 조사한 경우, 분자 수준에서 역분화 인자 발현 확인

실시예 2-1에서 제조된 유도만능줄기세포의 계대 배양을 위하여, 계대 하루 전 0.2% 젤라틴을 코팅한 6-웰 접시에 영양세포 (Feeder cell)를 배양 후, 다음날 유도만능줄기세포를 영양세포 상에 배양하였다.

이 후, 통상적인 방법으로 mRNA를 얻은 다음 cDNA 합성후 전분화능 마커 유전자들을 정량적 PCR을 수행하였으며, 이의 결과를 도 8에 나타내었다. 또한, 면역염색법을 통하여, 단백질 수준에서 전분화능 마커의 발현을 확인한 결과를 도 9에 나타내었다. 또한, 본 발명의 인간 유도만능 줄기세포를 면역결핍마우스에 주사한 경우의 테라토마능의 분석을 통해 전분화능의 확인한 결과를 도 10에 나타내었다.

도 8 내지 도 10에 나타난 바와 같이, 전자기장을 세포에 조사한 경우, 전분화능 마커의 발현이 증가함을 확인하였고, 또한, 제조된 유도만능 줄기세포를 면역결핍 마우스에 조사한 경우, 테라토마 (Teratoma)가 생성되고, 삼배엽 (three-germ layer)이 생성됨을 확인함으로써, 본 발명의 유도만능 줄기세포가 전분화능을 가지고 있음을 확인하였다.

Claims

1) Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 역분화인자가 형질도입된 마우스 또는 인간 유래의 성체세포를 얻는 단계; 및
2)상기 1)단계에서 얻은 성체세포를 10 내지 100Hz 주파수, 0.5 내지 2.0mT 강도의 전자기장 하에서 배양하는 단계; 를 포함하는 마우스 또는 인간 유래의 성체세포를 유도만능 줄기세포로 역분화시키는 방법.

제1항에 있어서, 상기 주파수는 50Hz인 것을 특징으로 하는, 방법.

제1항에 있어서, 상기 강도는 1mT인 것을 특징으로 하는, 방법.

제1항에 있어서, 상기 주파수는 50Hz이며, 상기 강도는 1mT인 것을 특징으로 하는, 방법.

삭제

제 1항에 있어서, 상기 2) 단계의 배양은 FBS (Fetal Bovine serum) 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 방법.

제1항에 있어서, 상기 2) 단계의 배양은 1 내지 10일 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는, 방법.

제 7항에 있어서, 상기 성체세포는 마우스 유래의 성체세포이며,
상기 2) 단계의 배양 이후,
3) FBS (Fetal Bovine serum), 비필수 아미노산, 페니실린/스트렙토마이신, 글루타민, β-머캅토에탄올 및 백혈병억제인자 (LIF; Leukemia Inhibitory factor)가 포함된 배지에서 성체세포를 추가적으로 배양하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.

제 9항에 있어서, 상기 3) 단계의 배양은 10 내지 20일 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는, 방법.

제 7항에 있어서, 상기 성체세포는 인간 유래의 성체세포이며,
상기 2) 단계의 배양 이후,
3) 혈청 대체물 (serum replacer), 비필수 아미노산, 페니실린/스트렙토마이신, 글루타민 및 β-머캅토에탄올의 혼합물 및 bFGF (bovine fibroblast growth factor)가 포함된 배지에서 성체세포를 추가적으로 배양하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.

제 11항에 있어서, 상기 3) 단계의 배양은 20 내지 40일 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는, 방법.

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