KR102128032B1 - 전자기파 반응성 프로모터를 이용하여 타겟 유전자를 과발현시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 프로모터와 타겟 유전자가 삽입된 벡터를 도입하여 형질전환된 세포를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 형질전환된 세포에 전자기파를 인가하는 단계; 를 포함하는, 타겟 유전자를 과발현시키는 방법 및/또는 세포 리프로그래밍 방법과 상기 방법을 이용한 질환 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 전자기파 반응성 프로모터를 이용하여 목표 유전자를 과발현시키는 방법을 이용하면, 세포 내외에서 간편하게 인위적으로 원하는 타겟 유전자의 발현 양을 조절하고 원하는 특정 시간까지 타겟 유전자의 발현을 조절할 수 있다.

Description

전자기파 반응성 프로모터를 이용하여 타겟 유전자를 과발현시키는 방법{A method for overexpressing target gene using electromagnetic inducible promoter}

본 발명은 (a) 프로모터와 타겟 유전자가 삽입된 벡터를 세포에 도입하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 세포에 전자기파를 인가하는 단계; 를 포함하는, 타겟 유전자를 과발현시키는 방법 및/또는 세포 리프로그래밍 방법과 상기 방법을 이용한 신경 질환 또는 골질환 치료 및 기타 유전자 세포 치료에 관한 것이다.

유전자를 과발현(overexpression)시키는 방법으로 가장 흔히 사용되는 방법은 프로모터(promoter)라 불리는 유전자 서열을 이용하여 타겟 유전자를 발현하는 방법이다. 프로모터는 전사조절인자들이 결합하는 모든 DNA 염기서열부위를 말하여, 일반적으로 전사를 조절할 대상이 되는 유전자의 유전정보를 지니고 있는 DNA 염기서열 앞부분에 위치한다.

이러한 프로모터 서열을 이용하여 타겟 유전자를 과발현시키는 방법으로는 프로모터 서열에 변이를 일으키거나 발현이 잘 되는 프로모터 서열을 선발하여 해당 서열을 타겟 유전자 앞에 도입하는 방법 등이 사용되어 왔다. 발현이 잘 되는 프로모터 서열로는 CMV 프로모터, EF1a 프로모터, PGK 프로모터 및 U6 프로모터 서열 등이 가장 흔히 사용되어 왔다(Khan KH. "Gene Expression in Mammalian Cells and its Applications". Advanced Pharmaceutical Bulletin. 2013;3(2):257-263; Norrman K, Fischer Y, Bonnamy B, Wolfhagen Sand F, Ravassard P, et al. (2010) Quantitative Comparison of Constitutive Promoters in Human ES cells. PLoS ONE 5(8): e12413 외)

그러나 과발현 프로모터를 도입하는 유전자 과발현 방법은 유전자 발현의 지속 및 중지(on and off) 조절이 어려울 뿐만 아니라 생체 내에서 유전자 발현조절이 더욱 불가능하며, 이러한 문제점들은 상기 유전자 과발현 시스템을 활용한 세포 분화, 세포 전환 기술 및 세포치료 활용에 있어서 가장 큰 문제점으로 여겨지고 있다. 이러한 문제점을 해결하고자 화학물질에 의해 활성화되는 프로모터 서열을 활용하는 방법이 개발되었으나, 이마저도 화학물질 전달의 어려움이 있고 생체 내에서 해당 물질에 반응하지 않는 조건이 다수 존재하여 극히 제한적으로만 이용되는 실정이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 상기의 문제점을 해결하기 위한 방안을 연구한 끝에, 이전 발견되어진 바가 없는 특정 전자기파 조사에 의해서 조절 될 수 있는 프로모터 유전자 서열을 발견하였으며, 이 프로모터 유전자 서열의 활성을 조절함으로써 유전자 발현 수준을 조절할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 (a) 프로모터와 타겟 유전자가 삽입된 벡터를 세포에 도입하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 세포에 전자기파를 인가하는 단계; 를 포함하는, 타겟 유전자를 과발현시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 프로모터와 타겟 유전자가 삽입된 벡터를 세포에 도입하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 세포에 전자기파를 인가하는 단계; 를 포함하는, 세포 리프로그래밍 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 방법을 이용하여 제조된, 분화된 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 방법을 이용하여 제조된 세포를 유효성분으로 포함하는, 신경 질환 또는 골질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 프로모터와 타겟 유전자가 삽입된 벡터를 세포에 도입하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 세포에 전자기파를 인가하여 리프로그래밍 단계를 거쳐 분화된 세포를 수득하는 단계; 를 포함하는, 신경 질환 또는 골질환 치료 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 (a) 프로모터와 타겟 유전자가 삽입된 벡터를 세포에 도입하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 세포에 전자기파를 인가하는 단계; 를 포함하는, 타겟 유전자를 과발현시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 용어, "프로모터"는 뒤에 연결시키는 목적 유전자의 발현을 위해 RNA 중합효소 또는 인핸서 등이 결합하는 부위를 포함하는 목적 유전자의 전사시키는 부위 근처에 존재하는 DNA 영역을 의미한다.

상기 프로모터는 EGR1 프로모터 또는 IFI44 프로모터일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 1 또는 2를 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 1 또는 2를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 전자기파 반응성 프로모터의 기능을 갖는 서열이라면 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 경우 또한 본 발명의 범위에 포함되는 것이 자명하다.

본 발명의 용어, "타겟 유전자"는 "목표 유전자", "목적 유전자"와 상호교환적으로 사용되며, 프로모터 서열 뒤에 작동가능하게 연결되어 프로모터에 의해 발현이 조절되는 유전자를 의미한다. 구체적으로는 상기 전자기파 반응성 프로모터에 의해 발현이 조절되는 유전자를 의미하며 특별히 한정되는 바 없다.

본 발명의 용어, "작동 가능하게 연결된(operably linked)"이란 일반적으로 기능을 수행하도록 염기 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 염기 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있다.

본 발명의 용어, "벡터"는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 상기 벡터는 바이러스 벡터, 에피솜 벡터, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 (Lentivirus), 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murineleukemia virus), ASLV(Avian sarcoma/Leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함할 수 있다. 또한, 더욱 구체적으로 RNA 기반 바이러스 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 에피솜 벡터(Episomal vector)는 비바이러스성 비삽입성 벡터로서, 염색체 내에 삽입되지 않고 벡터에 포함된 유전자를 발현시킬 수 있는 특성을 가지는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 목적상 에피솜 벡터를 포함하는 세포는, 에피솜 벡터가 유전체 내에 삽입되거나, 또는 유전체 내에 삽입되지 않은 상태로 세포 내 존재하는 경우를 모두 포함한다.

본 발명의 용어, (a) 프로모터와 타겟 유전자가 삽입된 벡터를 세포에 도입하는 단계는, 목표 유전자를 포함하는 벡터를 세포 내에 도입하여 세포 내에서 상기 목표 유전자가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다.

상기 유전자는 DNA 또는 RNA의 형태일 수 있으며 세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한 상기 목표 유전자는 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 목표 유전자는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 목표 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 본 발명의 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 목표 유전자는 그 자체의 형태로 세포에 도입되어 세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 세포는 과발현시키고자 하는 목표 유전자의 종류에 따라 통상의 지식을 가진 당업자가 적절하게 선택할 수 있다.

본 발명의 "전자기장"은 주기적으로 세기가 변화하는 전자기장이 공간 속으로 전파해 나가는 현상으로 전자파와 같은 의미이며, 본 발명에서 사용된 전자기장은 펄스파 형태 또는 연속파 (사인파)형태를 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 목적상, "전자기장 처리"와 "전자기파 인가"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 전자기장의 주파수는 30 내지 500Hz일 수 있고, 구체적으로는 50Hz 내지 300Hz일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 전자기장의 강도는 5 내지 50 Gauss(G)일 수 있고, 구체적으로는 10G 내지 30G일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서는 전자기파의 강도를 10G, 20G, 30G로 변화시키면서 50Hz 이상 300Hz 이하의 주파수를 갖는 전자기파를 인가하여, 세포 분화에 관여하는 타겟 유전자의 발현을 조사한 결과 10G 내지 20G, 50Hz 이상 250Hz이하에서 세포 분화가 가장 많이 일어난 것을 확인하였다(도 5).

본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) 프로모터와 타겟 유전자가 삽입된 벡터를 세포에 도입하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 세포에 전자기파를 인가하는 단계; 를 포함하는, 세포 리프로그래밍 방법을 제공한다. 프로모터 및 타겟 유전자, 벡터에 관해서는 전술한 바와 같다.

상기 "벡터를 도입하여 세포를 수득하는 단계"는 분리된 세포에 상기 벡터를 도입하는 것일 수 있다.

본 발명의 용어, "분리된 세포"는 특별한 제한은 없으나, 구체적으로는 생식세포, 체세포(Somatic cell) 또는 전구세포(Progenitor cell) 등 이미 계통(Lineage)이 특정된 세포일 수 있다. 그 예로 인간에게서 유래한 세포일 수 있으나, 다양한 개체에서 유래된 세포 역시 본 발명의 범위 내에 속한다.

또한, 본 발명의 분리된 세포에는 생체내 또는 생체외의 세포가 모두 포함될 수 있으며, 구체적으로, 생체에서 분리된 세포일 수 있다.

상기 "체세포"는 생식세포를 제외한 동·식물을 구성하는 분화가 완결된 모든 세포를 뜻하며, 상기 "전구세포"는 자손에 해당하는 세포가 특정 분화 형질을 발현하는 것으로 밝혀진 경우, 분화 형질을 발현하지 않으나, 그 분화 운명(Fate)을 가지고 있는 모세포를 말한다. 예를 들면, 신경세포(뉴런)에 대해서는 신경아세포(뉴런간세포)가 전구세포에 해당하고, 근관세포에 대해서는 근아세포가 전구세포에 해당한다.

상기 타겟 유전자는 세포 리프로그래밍에 이용되는 유전자일 수 있으며, 구체적으로 상기 타겟 유전자는 세포의 직접교차분화에 관여하는 유전자일 수 있고, 보다 구체적으로는 신경세포 또는 골세포로의 직접교차분화를 일으킬 수 있는 인자일 수 있으며, 보다 구체적으로는 Ascl1, Nurr1, Pitx3, Lmx1, Runx2 및 Osterix로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "리프로그래밍(Reprogramming)"은 "세포 운명(fate) 전환"과 상호 교환적으로 사용되며, 특정 세포가 가지는 전체 유전자 발현 패턴 (Global gene expression pattern) 등을 조절하여, 목적하는 세포로 전환시키는 방법을 의미한다. 다시 말해서, 본 발명에서 리프로그래밍은 세포의 운명을 인위적으로 조작하여 전혀 다른 특성을 가지는 세포로 전환시키는 방법을 의미하며, 본 발명의 목적상 상기 리프로그래밍은 외래 유전자 혹은 기타 유전자를 포함하는 벡터를 세포에 도입함으로써 수행되는 것일 수 있다. 상기 리프로그래밍은 세포의 분화, 역분화(Dedifferentiation), 직접 리프로그래밍 (Direct reprogramming 또는 Direct conversion), 또는 직접 교차분화(Trans-differentiation)을 의미할 수 있다.

본 발명에서 용어, "직접 리프로그래밍(Direct reprogramming)"은 리프로그래밍 과정을 통해 전분화능을 가진 유도 만능 줄기세포를 제작하는 기술과는 차별화되며, 리프로그래밍 배양을 통해 직접적으로 원하는 목적 세포로의 직접 전환을 유도하는 기술이다. 기존 유도 만능 줄기세포 리프로그래밍 기술을 이용하여 목적 세포를 생산하기 위해서는 우선적으로 분리된 체세포로부터 유도 만능 줄기세포를 제작하고, 목적 세포에 따라서는 중간 세포를 제작해야 한다. 이와 같이 복잡한 생산 배양 과정을 순차적으로 거쳐야 하기 때문에 생산 효율이 낮고 시간적, 비용적 소모가 크다는 단점이 있다. 또한 태생적으로 전분화능 줄기세포를 경유하여 생산되기 때문에 미분화 세포의 잔류 여부, 안전성 확보 여부가 검증되어야 한다는 문제가 있다. 하지만, 본 발명은 직접 리프로그래밍 기술을 통해 목적 세포를 초기세포로부터 직접 생산함으로써 생산시간, 비용, 효율, 안전성 등 상기 기술의 문제점을 극복할 수 있는 대안을 제공할 수 있다. 본 발명의 "직접 리프로그래밍"은 직접 역분화, 직접 분화, 직접 전환, 직접교차분화, 교차분화 등과 혼용될 수 있다. 상기 직접 리프로그래밍은 특히 신경세포 또는 골세포로의 전환을 의미할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서는 Ascl1, Nurr1, Pitx3, Lmx1를 목표 유전자로 하여 본 발명의 프로모터를 포함하는 벡터를 제작하였으며, 해당 벡터를 체세포에 도입한 후 전자기파를 조사함으로써 신경세포로의 분화를 확인하였다(실시예 3). 본 발명의 다른 구현예에서는 Runx2 및 Osterix를 목표 유전자로 하여 본 발명의 프로모터를 포함하는 벡터를 제작하였으며, 해당 벡터를 체세포에 도입한 후 전자기파를 조사함으로써 골세포로의 분화를 확인하였다(실시예 4).

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 방법을 이용하여 제조된, 분화된 세포를 제공한다. 상기 분화된 세포는 골세포 또는 신경세포일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 방법을 이용하여 제조된 세포를 유효성분으로 포함하는, 신경 질환 또는 골질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) 프로모터와 타겟 유전자가 삽입된 벡터를 세포에 도입하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 세포에 전자기파를 인가하여 리프로그래밍 단계를 거쳐 분화된 세포를 수득하는 단계; 를 포함하는, 신경질환 또는 골질환 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 용어, "신경 질환"은 신경세포 또는 신경조직의 변형, 손실 등이 원인이 되어 발생하는 질환을 포함하는 것으로, 파킨슨씨병, 알츠하이머, 피크병(Pick's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증(amyotriophiclateral sclerosis), 허혈성 뇌질환(stroke), 탈수초질환(demyelinating disease), 다발성 경화증, 간질, 퇴행성 신경질환, 척수 손상(spinal cord injury)등을 포함할 수 있으나, 상기 예에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서는 본 발명의 프로모터를 포함하는 벡터를 이용하여 신경세포 분화에 관여하는 인자를 과발현시킴으로써 신경세포로의 전환을 확인하였는바, 상기 신경 질환을 갖는 개체에서 신경조직을 형성할 수 있음을 확인하였다(실시예 4).

본 발명의 용어, "골질환"은 골밀도가 감소되어 일어날 수 있는 모든 질환을 포함하는 것으로, 골세포 또는 골조직 변형, 손실 등이 원인이 되어 발생하는 질환일 수 있으며, 구체적으로는 골다공증(osteoporosis), 류마티스 관절염, 치주질환, 골연화증(osteomalacia), 골형성 부전증(osteogenesis imperfecta), 골화석증(osteopetrosis), 골경화증(osteosclerosis), 파제트병(Paget's disease), 무형성 골질환(adynamic bone disease), 대사성 골질환(metabolic bone disease), 구루병(rickets) 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에서는 본 발명의 프로모터를 포함하는 벡터를 이용하여 골세포 분화에 관여하는 인자를 과발현시킴으로써 골세포로의 분화를 확인하였는바, 상기 골질환을 갖는 개체에서 골조직을 형성할 수 있음을 확인하였다(실시예 4).

상기와 같은 결과는 본 발명의 프로모터와 전자기장을 인가하는 방법을 이용하여 목표 유전자를 과발현시킴으로써 체세포를 다른 세포로 전환시킬 수 있음을 시사하는 것으로, 특정 조직을 구성하는 세포의 손실 및 이로 인한 조직 손상이 원인이 되어 발생하는 질환이라면 본 발명의 치료 방법을 적용할 수 있음은 자명하다.

본 발명의 용어, "치료"는 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 포함한다.

본 발명의 용어, "예방"은 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 포함한다.

상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

상세하게는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 전자기파 조사에 반응하는 특정 유전자의 프로모터를 이용하면 인위적으로 원하는 타겟 유전자의 발현 양을 조절하고 원하는 특정 시간까지 타겟 유전자의 발현을 조절할 수 있다.

또한, 생체 내외에서 특정 타겟 유전자의 발현을 조절할 수 있으며, 이러한발현 조절을 통해 원하는 세포로 분화 및 리프로그래밍을 가현할 수 있으며 이를 세포 치료기술 및 세포치료제에 응용할 수 있다.

상기와 같은 발현 조절을 세포 치료기술에 적용하는 경우, 물리적인 전자기장을 이용하여 비침습적으로 유전자 과발현을 유도하므로, 안전하고 부작용이 적으면서도 효율적인 치료를 유도할 수 있다. 아울러, 원하는 세포배양 단계까지 세포의 변화을 인위적으로 조절 할 수 있으므로, 치료가 완료되었을 때에도, 단순히 전자기장 처리를 제거함으로써 신경 재생 효과를 치료 정도에 따라 조절할 수 있다.

도 1은 EGR1 또는 IFI44 프로모터를 포함한 벡터의 구조 및 전자기 조사에 의한 작동을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 EGR1 또는 IFI44 프로모터와 GFP 유전자가 포함된 벡터를 도입한 세포에 면역염색을 수행한 결과이다.
도 3은 EGR1 또는 IFI44 프로모터와 Ascl1 유전자가 포함된 벡터를 도입한 세포에서, EMF(전자기장)유무에 따른 신경 지표 유전자인 Tuj1, TH, DAT, Syn(Synapsin) 발현 정도를 RT-PCR로 측정한 결과이다.
도 4는 전자기장 세기에 따른 TH 및 Tuj1 발현 정도의 변화를 면역염색을 통해 관찰한 것이다.
도 5는 전자기장 세기 및 주파수를 다양하게 변화하여 인가함으로써 신경세포로 분화된 세포수를 측정한 것이다.
도 6은 20G 세기 100Hz 주파수의 전자기장을 처리한 결과를 면역염색으로 확인한 것이다.
도 7은 프로모터에 전자기장을 조사하여 마우스 모델에서 신경세포를 제작한 결과를 면역염색을 통해 확인한 것이다.
도 8은 프로모터에 전자기장을 조사하여 파킨슨병 마우스 모델 내에서 신경세포를 제작한 후 5주 동안 마우스 회전 실험을 수행한 결과이다.
도 9는 EGR1 또는 IFI44 프로모터와 osteocalcinin 유전자가 포함된 벡터를 도입한 세포에서, EMF(전자기장)유무에 따른 골 지표 유전자인 골세포 표지유전자인 Osteopontin 및 Osteocalcin을 면역염색으로 확인한 것이다.
도 10은 웨스턴 블랏팅 실험 결과이다. RX는 뼈세포 직접교차분화에 필요한 인자인 Runx2를 의미하며, RXO는 Runx2와 Oct4를 의미한다.
도 11은 골세포 표지유전자 Runx2, Osterix 및 Osteoponin, BSP 발현 정도를 RT-PCR 분석 결과이다.
도 12는 골세포 표지유전자인 Runx2, Osterix 및 Osteoponin, BSP 발현정도를 RT-PCR 분석한 결과이다.
도 13은 프로모터에 전자기장을 조사하여 마우스 모델에서 골세포 분화를 일으켜 주별 행동 테스트를 수행한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 벡터 제작

이하 실시예에서 사용하기 위하여 EGR1 프로모터와 IFI44 프로모터를 각각 벡터 구조체에 삽입하였다.

상기 벡터 구조체에 각각의 실시예에서 사용한 목표 유전자를 도입하여 각 프로모터의 영향을 받도록 제작하였다. 제작한 벡터의 형태를 도 1에 표시하였다.

실시예 2: 전자기파 반응성 프로모터를 이용한 GFP 유전자 발현 조절 확인

각 프로모터가 전자기 인가에 의해 발현 조절되는지 확인하기 위하여, GFP 유전자 발현 여부를 조사하였다.

구체적으로 실시예 1과 동일한 방법으로 GFP 유전자를 목표 유전자로 하여 벡터를 제작하였다. 제작한 벡터를 렌티바이러스에 도입한 후 이를 피부세포에 도입하였다. counterstaining으로 DAPI염색을 수행하였으며 대조군으로는 pGL3-Basic Vector(Promega, plasmid E1751)를 사용하였다. 각각의 세포에 전자기장을 20G, 100Hz로 24시간 동안 인가하였다. 이후 면역염색을 수행하여 실험 결과를 도 2에 나타내었다.

실험 결과, 대조군에서는 GFP 발현이 거의 나타나지 않는 반면 EGR1 프로모터 또는 IFI44 프로모터를 사용한 실험군에서는 GFP가 발현되는 것을 확인하였다.

이를 통해, 전자기 인가에 의해 EGR1 또는 IFI44 프로모터가 활성화될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3: 전자기파 반응성 프로모터를 이용한 신경세포로의 직접교차분화

실시예 3-1: 신경세포 제작 확인

체세포를 신경세포로 리프로그래밍하기 위해 과발현시켜야 하는 유전자인 Ascl1, Nurr1, Pitx3 및 Lmx1a를 목표유전자로 하여, 실시예 1과 같은 방법으로 벡터를 제작한 후 피부에서 유래된 fibroblast에 도입하였다. 전자기장을 20G 100Hz의 세기로 인가한 후, RT-PCR을 통해 신경세포 표지인자의 발현을 측정하였다. RT-PCR 결과를 도 3에 나타내었다.

실험 결과, 전자기파를 인가한 경우 신경세포 표지인자인 Tuj1, TH, DAT 및 Synapsin의 발현 정도가 크게 증가하는 것을 확인하였다.

이를 통해 전자기 인가로 프로모터 활성을 조절함으로써 리프로그래밍을 일으켜 신경세포를 제작할 수 있음을 확인하였다.

실시예 3-2: 최적 전자기파 강도 측정

EGR1 및 IFI44 프로모터의 각 유전자에 대한 최적 전자기파 세기를 파악하기 위하여 전자기파를 다양한 강도 및 주파수로 인가한 후 목표 유전자의 발현 정도를 조사하였다.

구체적으로. 실시예 3-1과 동일한 방법으로 벡터 및 체세포를 제작하였으며, 이후 전자기파의 강도를 10G, 20G, 30G로 변화시키면서 전자기파 세기 변화에 따른 유전자 발현 변화를 면역염색을 이용하여 관찰하였다. 면역염색 결과를 도 4에 나타내었다.

면역 염색 결과 전자기장을 인가하지 않은 경우 TH 및 Tuj1이 전혀 발현되지 않았으나, 노출된 전자기장의 강도가 10G, 20G, 30G로 증가할수록 신경세포 표지인자가 강하게 나타나고 있음을 확인할 수 있었다. 그러나 30G로 전자기파를 조사한 경우는 세포의 형태가 다소 달라지는 것을 확인할 수 있었다.

이를 통해, EGR1 프로모터 및 IFI44 프로모터에 인가하는 전자기장의 최적 강도는 30G 이하임을 확인하였다.

실시예 3-3: in vivo에서 신경세포로의 직접교차분화 확인

EGR1 및 IFI44 프로모터에 전자기파를 조사하여 in vivo에서도 체세포를 신경세포로 리프로그래밍할 수 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 3-1과 같은 방법을 사용하여 파킨슨 마우스 모델에 벡터를 도입하였고 20G 100Hz 세기로 전자기장을 인가하였다. 마우스 모델의 선조체(striatum)조직에 면역염색을 수행하여 결과를 도 7에 나타내었다.

실험 결과, 마우스 모델에서 신경세포가 성공적으로 제작되는 것을 확인하였다.

이를 통해 본 발명의 프로모터에 전자기장을 조사하여 생체내에서도 체세포를 신경세포로 분화시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 3-4: in vivo에서 신경세포로의 리프로그래밍 촉진을 이용한 신경세포 손상 완화 효과 확인

상기 실시예 3-1 내지 3-3에서 확인한 결과를 이용하여 마우스 모델에서 신경세포 손상 치료효과를 확인하고자 실험을 수행하였다.

구체적으로 파킨슨병 유발 약물인 60HDA를 주입한 동물모델에서, 실시예 3-1에서 제조한 벡터를 도입하여 전자기장을 20G 100Hz로 인가한 후 이에 따른 마우스의 행동 변화를 마우스 회전 테스트(mouse rotatory test)를 이용하여 분석하고 그 결과를 도 8에 도시하였다.

그 결과, EMF를 인가한 경우 마우스가 제자리를 도는 행위가 시간이 지날수록 감소되는 비율이 커짐을 확인할 수 있었다.

이를 통해, 신경세포 손상으로 인해 발생하는 질환 치료 및 완화에 본 발명의 프로모터에 전자기파를 인가하는 방법을 사용할 수 있음을 확인하였다.

실시예 4: 전자기파 반응성 프로모터를 이용한 골세포로의 리프로그래밍

실시예 4-1: 골세포로의 리프로그래밍 확인

EGR1 및 IFI44 프로모터에 전자기파를 조사하여 체세포를 골세포로 리프로그래밍 할 수 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

구체적으로 체세포를 골세포로 리프로그래밍하기 위해 과발현시켜야 하는 유전자인 Runx2 및 Osterix를 목표유전자로 하여, 실시예 1과 같은 방법으로 벡터 및 렌티바이러스를 제조하였다. 제조한 바이러스를 이용하여 벡터를 체세포에 주입한 후 전자기장을 인가하였다. 전자기장을 인가한 후 각 세포에 골세포 표지인자인 Osteopontin, Osteocalcin에 대해 면역염색 및 RT-PCR 분석을 수행하여 결과를 도 9내지 도 12에 나타내었다.

실험 결과, 전자기파를 인가한 경우 골세포 표지인자의 발현 정도가 크게 증가하는 것을 확인하였다.

이를 통해, 전자기 인가로 프로모터 활성을 조절함으로써 리프로그래밍을 일으켜 골세포를 제작할 수 있음을 확인하였다.

실시예 4-2: in vivo에서 골세포로의 직접교차분화 촉진을 이용한 골질환 증상 완화 효과 확인

상기 실시예 4-1에서 확인한 결과를 이용하여 마우스 모델에서 골세포 손상 치료효과를 확인하고자 실험을 수행하였다.

구체적으로 실시예 4-1 과 같이 벡터 제작, 도입한 후 전자기장을 인가하여 골세포 유전자인 Runx2의 발현을 RT-qPCR을 이용하여 정량적으로 분석하였다. 그 결과, 전자기장 인가로 인해 골 표지유전자인 Runx2 가 시간이 지날수록 발현량이 증가한 것을 확인하였다(도 13).

이를 통해, 전자기 인가로 프로모터 활성을 조절함으로써 직접교차분화를 일으켜 골세포 제작에 이용할 수 있음을 확인하였는바, 본 발명의 프로모터에 전자기파를 인가하는 방법을 골질환 치료에 사용할 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> {A method for overexpressing target gene using electromagnetic inducible promoter <130> KPA181000-KR <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 820 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGR1 <400> 1 agccgccgcg cgcccagctc tacgcgcctg gcgccctccc cacgcgggcg tccccgactc 60 ccgcgcgcgc tcaggctccc agttgggaac caaggagggg gaggatgggg ggggggggtg 120 tgcgccgacc cggaaacgcc atataaggag caggaaggat cccccgccgg aacagacctt 180 atttgggcag cgccttatat ggagtggccc aatatggccc tgccgcttcc ggctctggga 240 ggaggggcga gcgggggttg gggcgggggc aagctgggaa ctccaggcgc ctggcccggg 300 aggccactgc tgctgttcca atactaggct ttccaggagc ctgagcgctc gcgatgccgg 360 agcgggtcgc agggtggagg tgcccaccac tcttggatgg gagggcttca cgtcactccg 420 ggtcctcccg gccggtcctt ccatattagg gcttcctgct tcccatatat ggccatgtac 480 gtcacggcgg aggcgggccc gtgctgttcc agacccttga aatagaggcc gattcgggga 540 gtcgcgagag atcccagcgc gcagaacttg gggagccgcc gccgcgattc gccgccgccg 600 ccagcttccg ccgccgcaag atcggcccct gccccagcct ccgcggcagc cctgcgtcca 660 ccacgggccg cggctaccgc cagcctgggg gcccacctac actccccgca gtgtgcccct 720 gcaccccgca tgtaacccgg ccaacccccg gcgagtgtgc cctcagtagc ttcggccccg 780 ggctgcgccc accacccaac atcagttctc cagctcgctg 820 <210> 2 <211> 1014 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFI44 <400> 2 ctctcactcc attcaggaca cttctccaat gacatctcat tagatagacc tttcctgatt 60 atgctgtcta aagtaggaga tttcttccca catcactcct attcctcctc tttttctcac 120 ttaatactcc aaaactctgt ttatttactt gaaaagtggc aataatattg gtgtcctcat 180 cataaagtta ttaaaataaa cacacgagat acatgtaaat tgtcttgcaa ataatgtcta 240 taataatata atttttaaag ccaagtatat aatacctcat aagctgctta aaatattttt 300 atttgatgat gctattgttt ttaatagggc cagcaaatta aaaaaacctt tttagggcag 360 gcaggtaatt taaatttttt agaaccagtc aggtataaag caagagggga caaaggagga 420 ctggagagtg gatgcccaat gatataaaag cattcacgtt caacaattaa aaactataaa 480 gacattacat tggccctaca gaacaaatgt gcggattgaa ttctgcctat aggacacgaa 540 tttatgatcc ttagcaatgt gaagttagag aaggggtttt attgtgaaat tgacacaggt 600 tgttttatat cttataaatg aagtctcctc attttcctgt ggtcagaaga gagggggcaa 660 gcagaaaagc agaggaacaa atttggaggc taaaataaca ttctacataa ggaactatac 720 tacagtagaa ttaattgata gcagggatta agagatgtaa atgaatttga gatacatatt 780 ctagaggtag aatgtgcaat actttttgta tgtccatata cagaaattgg ttgcattttc 840 cttaaataaa aagatttttt aaaagttagt gagctgttat gttttcttcc ctctgacttc 900 aattccttga ttctttcaat ttttttaata taaatttact gtctaaaagc tggatcagct 960 tatgctcctt tgttgagaga agttggcatg ctgtcaagtg ggctgggcac actg 1014

Claims (15)

1. (a) 서열번호 1 또는 2의 프로모터와 타겟 유전자가 삽입된 벡터를 세포에 도입하는 단계;
   (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 세포에 50Hz 이상 300Hz 이하의 주파수의 전자기파를 인가하는 단계;
   를 포함하는, 타겟 유전자를 과발현시키는 방법.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 전자기파는 10G 이상 30G 이하의 세기로 인가되는 것인, 방법.
   
5. 삭제
6. (a) 서열번호 1 또는 2의 프로모터와 타겟 유전자가 삽입된 벡터를 세포에 도입하는 단계;
   (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 세포에 50Hz 이상 300Hz 이하의 주파수의 전자기파를 인가하는 단계;
   를 포함하는, 세포 리프로그래밍 방법.
   
7. 삭제
8. 제6항에 있어서, 상기 타겟 유전자는 Ascl1, Nurr1, Pitx3, Lmx1, Runx2 및 Osterix로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 세포 리프로그래밍 방법.
   
9. 제6항 또는 제8항의 방법으로 제조된, 분화된 세포.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 분화된 세포는 골세포 또는 신경세포인 것인, 세포.
    
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제

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