JP7267601B2 - 多能性幹細胞を用いた免疫機能再建法 - Google Patents
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Description
(1)ヒトT細胞を製造する方法であって、ヒトT細胞からiPS細胞を誘導する工程と、該iPS細胞をT細胞に分化させる工程とを含む、方法。
(2)前記ヒトT細胞は、CD4及びCD8からなる群から選択される少なくとも一の分子が発現しているT細胞である、(1)に記載の方法。
(3)iPS細胞へ誘導されるT細胞が抗原特異性を有する、(1)又は(2)に記載の方法。
(4)iPS細胞へ誘導されるT細胞とiPS細胞から分化させるT細胞の抗原特異性が同一である、(3)に記載の方法。
(5)(1)から(4)のいずれかに記載の方法により製造されたヒトT細胞。
(6)(5)に記載のヒトT細胞を含有する、医薬組成物。
(7)ヒトより所望の抗原特異性を有するT細胞を単離する工程と、
該所望の抗原特異性を有するT細胞からiPS細胞を誘導する工程と、
該iPS細胞をT細胞に分化させる工程と、
得られたiPS細胞由来T細胞をヒトの体内に投与する工程と
を含む、免疫細胞治療の方法。
現することが初めて明らかになった。特にTCRα鎖β鎖とも一つのインフレーム(in
frame)再構成しか持たないiPSC(iPS細胞)からのT系譜細胞への誘導においては、出現したTCRはiPS細胞に保存された塩基配列と同一(identical)であり、完全にモノクローナル(monoclonal)であった。このことは、常に内在性TCRα鎖β鎖(特に対立形質排除(allelic exclusion)による制御が不完全なα鎖)の発現による阻害効果(interfere)を考慮しなければならないES細胞、CD34陽性造血幹細胞、あるいはナイーブT細胞へのTCR遺伝子導入法とは比較にならないほど効率よく、目的の抗原に対するモノクローナルTCRαβを持つT細胞を誘導できる事が示された。
本発明は、ヒトT細胞からiPS細胞を誘導する工程と、該iPS細胞をT細胞に分化させる工程とを含む、ヒトT細胞を製造する方法を提供する。
本発明においてT細胞を単離される「ヒト」としては、特に制限はない。健常人であっても、免疫機能が低下している人や、悪性腫瘍、感染症、自己免疫疾患などを患っている人であってもよい。本発明によって得られたT細胞を免疫細胞治療に用いる場合は、拒絶反応が起こらないという観点から、T細胞を単離されるヒトは、本発明によって得られたT細胞が投与されるヒトとHLAの型が一致していることが好ましく、本発明によって得られたT細胞が投与されるヒトと同一人であることがより好ましい。
本発明において「iPS細胞へ誘導されるヒトT細胞」及び「iPS細胞から分化させるヒトT細胞」としては特に制限はないが、好ましくはCD3を発現しており、且つCD4及びCD8からなる群から選択される少なくとも一の分子が発現しているT細胞である。このようなヒトT細胞としては、例えば、CD4陽性細胞であるヘルパー/制御性T細胞、CD8陽性細胞である細胞傷害性T細胞、ナイーブT細胞(CD45RA+CD62
L+細胞)、セントラルメモリーT細胞(CD45RA-CD62L+細胞)、エフェクタ
ーメモリーT細胞(CD45RA-CD62L-細胞)、及びターミナルエフェクターT細胞(CD45RA+CD62L-細胞)が挙げられる。後述する免疫療法を実施する場合、iPS細胞から分化させるヒトT細胞は、iPS細胞へ誘導されるヒトT細胞と抗原特異性が同一であることが好ましい。なお、T細胞における抗原特異性は、抗原特異的な、再構成されたTCR遺伝子によりもたらされる。
トロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法にて細胞に導入することができる。
形成を観察する方法により行うことができる。
前記のようにして得られたTiPS細胞をT細胞に分化させるためには、中胚葉系への分化を誘導し易くするという観点から、先ずはTiPS細胞をストローマ細胞上にて、サイトカインを含有せず、FCS等を含有するα-MEM培地中にて培養することが好ましい。用いるストローマ細胞としては、造血系への分化を誘導し易くするという観点から、放射線照射等の処理を施したOP9細胞、10T1/2細胞であることが好ましい。但し、TiPS細胞を効率良くCD34陽性造血幹細胞に誘導させる場合には、VEGF、SCF、TPO、SCF、及びFLT3L群から選択される少なくとも1のサイトカインを含有する培地中にて培養することが好ましく、VEGF、SCF、及びTPOを含有する培地中、又はVEGF、SCF、及びFLT3Lを含有する培地中にて培養することがより好ましい。培養期間としては、血球細胞等を含有する袋状の構造物(ES-sac(サック)とも称する)を形成するまでの期間であることが好ましく、TiPS細胞の培養を開始してから10~14日間であることが好ましい。
精製する方法を採用することもできる。
本発明の方法によって製造したヒトT細胞は、抗原特異的な免疫機能を有するため、例えば、腫瘍、感染症、自己免疫不全等の疾患の治療または予防のために用いることができる。
フローサイトリー分析は、MoFlo(Dako Cytomation社製)、FACSAria(登録商標、BD Bioscience社製)、又はFACSCantoII(登録商標、BD Bioscience社製)を用いて行った。得られたデータの分
析はFlowJoソフトウェア(Treestar社製)を用いて行った。また、フローサイトリー分析に用いた抗体は下記の通りである。
抗ヒトCD3-APC抗体(BD Bioscience社製)、抗ヒトCD4-FITC抗体(BD Bioscience社製)、抗ヒトCD8-PerCP/Cy5.5抗体(BD Bioscience社製)、抗ヒトCD56-PE抗体(BD Bioscience社製)、抗ヒトCD45RA-Pacific Blue抗体(Caltag
Laboratories社製)、抗ヒトCD62L-PE-Cy7抗体(Biolegend社製)、抗ヒトCD45-Alexa 405抗体(Molecular Probes-Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、抗ヒトCD34-PE抗体(BD Bioscience社製)、抗ヒトCD38-PerCP/Cy5.5抗体(Biolegend社製)、抗ヒトCD1a-APC抗体(Biolegend社製)、抗ヒトCD5-PE/Cy7, -CD7-FITC抗体(Biolegend社製)、抗ヒトCD5-PE/Cy7抗体(Biolegend社製)、抗ヒトCD7-FITC抗体(Biolegend社製)、抗ヒトTCRαβ-FITC抗体(Biolegend社製)。さらに、フローサイトリー分析において、細胞は適切な濃度に調整した抗体カクテルと共に4℃にて30分間インキュベーションした後、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄した。また、死細胞を排除するため、ヨウ化プロピジウムを添加した。
ヒトOCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、及びNANOG(山中因子、YFs)をコードするpMXsレトロウィルスベクターは、山中伸弥教授(京都大学iPS細胞研究所 所属)より供与された。Gag-Pol遺伝子、及びTet-OFF制御のVSV-G偽型エンベロープ遺伝子を有する293GPGパッケージング細胞に、これらYFsを導入した。テトラサイクリンを除いた培地にてウィルスを誘導してから3日後に、これら細胞の培養上清を毎日、全4回回収した。回収した培養上清は、0.45μm酢酸セルロースフィルターに通し、6000gにて16時間かけ遠心分離を行った。そして、得られた上清の濃度が0.5%になるようにα-MEM(α-最小必須培地)に懸濁し、使用するまで-80℃にて保存した。
実験プロトコールは、東京大学医科学研究所 ヒト倫理審査委員会の承認を受けたものである(承認番号:20-6-0826)。また、全ての研究はヘルシンキ宣言に従って行った。
L+)、セントラルメモリー(CD45RA-CD62L+)、エフェクターメモリー(C
D45RA-CD62L-)、またはターミナルエフェクター(CD45RA+CD62L-)に分類した。
ウェルパーク記念研究所培地(Roswell Park Memorial Institute、RPMI)1640培地(GIBCO-Invitrogen社製)にて最初培養した。そして、かかるT細胞の3倍量の抗CD3/CD28結合磁性ビーズ(Dynabeads(登録商標)、ClinExVivo(登録商標)CD3/CD28、Invitrogen社製)を添加することによって、これら細胞を活性化させた。なお、T細胞から誘導したiPS細胞(T-iPS細胞)の作製において、この活性化した日をday0と規定する(以下、図1 参照)。いくつかの実験において、抗CD3/CD28結合磁性ビーズによって、PBMCsから磁気的に捕捉したCD3+細胞を単離すると
同時に刺激した。day2及びday3において、10μg/ml硫酸プロタミン(Sigma-Aldrich社製)を添加した、レトロネクチン(登録商標)コ―ティングプレート(Takara社製)上にて、スピノキュレーション(spinoculation)によってレトロウィルスを細胞に感染させた(Kaneko,S.ら、Blood、2009年、113巻、1006~1015ページ 参照)。T細胞培養用の完全合成培地は毎日交換した。day6において、感染細胞を回収し、6cmディッシュ上の3×105個の照射MEF細胞層上に移した。その後4日間(day6~day10)、培地の
半分量を毎日ヒトiPS細胞培地に交換した。なお、ヒトiPS細胞培地の組成は下記の通りである(Takayama,N.ら、Blood、2008年、111巻、5298~5306ページ 参照)。
20% ノックアウト血清代替物添加リン酸緩衝生理食塩水)を用いて、新鮮なMEF細胞層上に3~4日毎に移した。
染色体Gバンド分析は、日本遺伝子研究所に外注し、所定の方法に従って行った。
ALP染色のため、ヒトES/iPS細胞様コロニーを氷冷固定液(90%メタノール、10%ホルムアルデヒド)にて固定し、ALP染色キット(Vector Laboratories社製)を用い、その製造会社の説明書に従って染色した。また、免疫細胞化学的染色のため、ヒトES/iPS細胞様コロニーを5%パラホルムアルデヒドにて固定し、0.1% TritonX-100にて透過処理を行った。
PE-conjugated anti-SSEA-4(FAB1435P、R&D Systems社製、希釈率:1/50)、anti-Tra-1-60(MAB4360、Millipore社製、希釈率:1/100)、anti-Tra-1-81(MA
B4381、Millipore社製、希釈率:1/100)。また、Tra-1-60及びTra-1-81の検出には、二次抗体としてAlexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody (希釈率:1/500、A11029、Molecular Probes-Invitrogen社製)を用いた。さらに、核の対比染色は4’,6-diamidino-2-phenylindol(希釈率:1/1000、Roche Diagnostics社製)を用いて行った。また、顕微鏡写真は、蛍光顕微鏡Axio Observer.Z1(Carl Zeiss Japan社製)を用いて撮影した。
ヒトES/iPS細胞様コロニーを凝集させ、NOD-Scidマウスの左側の精巣の髄質にMasaki,H.ら、Stem Cell Res、2007年、1巻、105~115ページの記載に従って注入した。なお、注入細胞数はマウス1匹あたり、1.0×106個である。注入してから8週間後、精巣内に形成された腫瘍を切除し、5%パラ
ホルムアルデヒドにて固定し、パラフィンに包埋した後、切片にした。そして、得られた切片をヘマトキシリン/エオシン法にて染色し、光学顕微鏡にて、前記iPS細胞が三胚葉への分化能を有しているかどうかを調べた。
ES細胞、iPS細胞(クローニングしてから約50日目の細胞)、これらの子孫細胞、及び新鮮分離した末梢血CD3+T細胞から、RNeasy micro キット(Q
iagen社製)を用いて、トータルRNAを抽出した。そして、得られたトータルRNAを鋳型とし、PrimeScriptII 1st Strand Synthesis キット(Takara社製)を用いて、逆転写反応を行った。
また、ハウスキーピング遺伝子(GAPDH又はACTB)については30サイクル、全ての多能性遺伝子又はT細胞関連遺伝子については35サイクルにて、ExTaq HS (Takara社製)を用いてPCR反応を行った。
なお、標的遺伝子、及び分析に用いたPCRプライマーの配列は表1及び表2に示す。
ヒトES細胞(KhES3)、T細胞由来iPS細胞(TkT3V1-7)、及びCD3/CD28刺激CD3+CD4+CD8-細胞について、全ゲノム遺伝子の発現解析を行
った。先ず、各細胞からトータルRNA(2μg)を抽出し、プローブ調製に供した。そして、蛍光標識した相補的RNAとWhole Human Genome Microarray 4x44K(G4112F、Agilent Technologies社製)とを、一色法にてハイブリダイズした(委託先:Takara Bio Inc)。次いで、アレイをスキャンし、スポットイメージをAgilent Feature Extraction 装置(Agilent Technologies社製)にて検出した。そして、得られたシグナルデータは、GeneSpringソフトウェア(Agi
lent Technologies社製)を用いて分析した。また得られたデータの正規化には、Two normalization proceduresを適用した。すなわち、シグナル強度 0.01未満は0.01とした。また、チップから得られた測定値の50thpercentileに各チップを正規化した。そして、全3サンプルにおいて、presentのフラグが付いた遺伝子(36275遺伝子)について分析を行った。
約5×106個のT-iPS細胞から、QIAamp DNAキット(Qiagen社
製)を用いて、ゲノムDNAを抽出した。抽出したDNA(40ng)は、TCRG、TCRB、及びTCRA遺伝子再構成の各々PCRにて検出するために用いた。
Mol Pathol、1995年、4巻、108~112ページ 参照)はExTaq HS (Takara社製)を用いて行った。PCRの反応条件は、95℃にて5分間、次いでアニーリング温度の比較的高い反応、すなわち95℃にて45秒間、65℃にて45秒間、72℃にて45秒間という反応を5サイクル、そしてアニーリング温度の比較的低い反応、すなわち95℃にて45秒間、55℃にて45秒間、72℃にて30秒間の反応を30サイクルとした。
TCRBの再構成を検出するため、PCR及びヘテロ二本鎖分析は、若干の改変を加えたBIOMED-2プロトコール(van Dongen,J.Leukemia、2003年、17巻、2257~2317ページ 参照)に沿って行った。
T-iPS細胞又はその他の多能性幹細胞を、胚性幹細胞由来サック(ES-sac)様の構造をとるように、若干の変更を施したTakayama,N.ら、Blood、2008年、111巻、5298~5306ページの記載に沿って、誘導した。
びTCRαβを発現しているT系譜細胞は、毎週フローサイトメトリーにてソーティングし、遺伝子発現解析を行った。なお、OP9細胞及びOP9-DL1細胞は、ナショナルバイオリソースプロジェクト(日本)を通して、理研バイオリソースセンターから入手した。
T細胞への誘導の終わり(OP9-DL1細胞層上にて約4週間培養した後、Day40)に、浮遊細胞を回収し、30ng/ml OKT-3(Janssen Pharmaceutica社製)及び600IU/ml hIL-2(Novartis Vaccines & Diagnostics社製)にて刺激した。その5日後に細胞数を数え、CD3の発現を評価した。そして、顕微鏡写真を撮り、形態学的画像を得た。
の浮遊細胞を、10ng/ml ホルボール 12-ミリスタート 13-アセテ―ト(PMA、Sigma-Aldrich社製)、0.4μM A23187 カルシウムイオノホア(イオノマイシン、Sigma-Aldrich社製)、及び20IU/ml hIL-1α(Peprotech社製)によって、12時間刺激した。さらに最後の3時間においては、タンパク質分泌阻害剤 ブレフェルジンA(1mM、Sigma-Aldrich社製)を添加して培養した。
OP9-DL1細胞層上での培養を開始してから、14日目(day26)、21日目(day33)、及び28日目(day40)に、T-iPS細胞から誘導したCD3+
TCRαβ+T系譜細胞から、トータルRNAを抽出した。
そして、逆転写産物5’末端における乗り換え機構(switch mechanism at the 5’-end of the reverse transcript)に基づく方法(SMART法、Du,G.ら、J Immunol Methods、2006年、308巻、19~35ページ 参照)にて、Super SMART(登録商標)cDNA synthesis kit(Clontech Laboratories社製)を用いて、製造会社の説明書に従って、cDNAを合成した。すなわち、3’SMART(登録商標)CDS primer及びSMART II A oligo(Super SMART(登録商標) cDNA synthesis kit)、並びにPrimeScript Reverse Transcriptase (Takara社製)を用いて、42℃にて90分間、逆転写反応を行った。また、二本鎖cDNAの合成及び増幅は、5’PCR Primer II A(Super SMART(登録商標) cDNA synthesis kit)及びAdvantage2 PCR Kit(BD Clontech社製)に含まれている試薬類を用いて行った。なお、PCRの反応条件は、95℃にて5秒間、65℃にて5秒間、68℃にて3分間を20サイクルとした。
本実施例における全ての統計解析は、エクセル(Microsoft社製)、Prism(Graphpad Software社製)、及びStatcel2(OMS Publishing社製)を用い、ANOVA又はスチューデントt検定にて行った。そして、P<0.05を有意とした。
<ヒト末梢血T細胞からのiPS細胞の樹立>
先ず、ヒト末梢血中のT細胞を用いて、図1に示すようにiPS細胞の樹立を行った。すなわち、健常人(年齢(24~56歳)及び性別の異なる複数の健常人)の末梢血より、末梢血単核球(PBMC)又はCD3陽性細胞を単離し、CD3/CD28 ClinExVivo ビーズにて刺激した。そして、hIL-2 20ng/mlを含有するRPMI1640+10%FBS+PSG(ペニシリン、ストレプトマイシン、及びL-グルタミン)で2日間培養し、VSV-Gシュードタイプのレトロウイルスウイルスベクター pMX OCT4、pMX SOX2、pMX KLF4、及びpMX c-MYCm、又はpMX OCT4、pMX SOX2、pMX KLF4を用いて遺伝子導入した。連続2日間の遺伝子導入操作後、分離日から6日目に6cmdishの照射MEF(マウス胎児繊維芽細胞)上に1×105個を撒き、連日半量ずつiPSメディウム(ヒト
iPS細胞培地)に置換していき、播種後4日間にT細胞メディウムから完全にiPSメディウムに置換した。分離11日後(播種5日後)ころより敷石様の細胞集ゾクを認め、数日の後(培養開始してから18~24日後)にヒトES細胞様の外観を呈するようになった(図2:コロニー(ヒトES細胞様コロニー)の写真 参照、)。それらの細胞はALP染色陽性、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81などの未分化マーカー陽性(図3:コロニーの染色写真 参照)であり、外来遺伝子のサイレンシングとES細胞様遺伝子発現パターンを認めた(図4:電気泳動の写真 参照)。なお、c-MYCを導入した、及び導入しなかった3×105個の細胞から、各々アルカリフォスファター
ゼ(ALP)陽性ヒトES細胞様コロニーを、77±25(0.03%)及び5.1±2.4(0.001%)の割合にて得た(図5 参照)。
従って、ヒト末梢血T細胞から樹立したiPS細胞は多能性を有していることが明らかになった。
樹立されたiPS細胞がT細胞由来であることを確認するために、TCR遺伝子の再構
成を確認した。TCR遺伝子はTCRδ、TCRγ、TCRβの3群が(ほぼこの順番で)早期から再構成を始める。4因子由来の4クローン中2クローン、3因子由来の9クローン中6クローンでTCRγ遺伝子の再構成を認めた(図9:電気泳動 参照)。それらのクローンのTCRβ遺伝子とTCRα遺伝子の再構成を解析したところ、全てのクローンでインフレーム(in frame)のTCRβ遺伝子とTCRα遺伝子の再構成を認めた(表5:TCRα鎖領域のインフレーム(in frame)遺伝子再構成、表6:TCRβ鎖領域のインフレーム(in frame)遺伝子再構成 参照)。それらの全ての再構成でTRAV24とTRBV11が特異的に用いられるNKT細胞タイプの組合わせは無く、末梢血T細胞由来のiPS細胞であることが確認された。なお、表5及び6において、「iPS Clone」は樹立したT細胞由来のiPS細胞株を示し、「Rearrangement」は再構成に用いられるセグメントの組み合わせを示し、「Sequence of junctional region」は結合領域の塩基配列を示す。
また、実施例2同様に、樹立されたiPS細胞がT細胞由来であることを確認するために、TCR遺伝子の再構成を確認した。すなわち、ヒトは4つのTCR遺伝子(TCRA、TCRB、TCRG、及びTCRD)を有しており、これらのDNA再構成は、胸腺における正常なTリンパ球の発達に関与していることが知られている。また、TCR遺伝子の再構成は、T系譜細胞に特異的な、不可逆的な遺伝的現象であり、この遺伝的現象によってT細胞は遺伝的な痕跡を与えられ、特徴付けられる。従って、これらの痕跡を調べる
ことにより、実施例1において得られたiPS細胞は、健常人ドナーの成熟末梢Tリンパ球由来であるかどうか遡及的に確認することができる。
また、TCRβ鎖はTCRα鎖と共にヘテロ二量体を形成しており、殆どの末梢血T細胞はTCRαβを発現している(Davis,M.M.ら、Nature、1998年、334巻、395~402ページ 参照)。TCRG及びTCRBに対して、TCRA遺伝子座は複雑である。TCRA遺伝子座はTCRD遺伝子座を含んでいるだけでなく、103のVαセグメント、61のJαセグメント、及びCαセグメントを含む、1000kb以上にわたる領域である。そこで、ゲノムDNAにおけるTCRA遺伝子再構成を検出するために、Vαセグメントに対する34のフォワードプライマーと、Jαセグメントに対する12のリバースプライマーとのセットを設計した。なお、多重構造の解析にこれらを用いる際に、膨大なプライマーの組み合わせを実用できる程度にその数を絞った。そして、全てのJαプライマーは一つのチューブにて混合し、このJαプライマーミックスと、各Vαプライマーとを用いて、1つのサンプルに対して34のPCR反応を行った。その結果、この方法によって、TCRB再構成iPS細胞において、TCRA再構成を同定することができた(図12 参照)。
<CD4+リンパ球又はCD8+リンパ球からiPS細胞への再プログラミング>
末梢Tリンパ球は主に2つの機能的なサブセット、すなわちCD4+ヘルパー/制御性
細胞、及びCD8+細胞傷害性細胞に由来する。また、ウィルスによる遺伝子導入効率に
おいて、CD4+リンパ球とCD8+リンパ球との間に有意な差はないことが知られている(Berger,C.ら、Blood、2003年、101巻、476~484ページ、Kaneko,S.ら、Blood、2009年、113巻、1006~1015ページ
参照)。そこで、末梢Tリンパ球をCD4+T細胞とCD8+T細胞とに分け、iPS細
胞への再プログラミングを行い、由来するT細胞の違いによって、iPS細胞への再プログラミングの効率に差異があるのかどうかを調べた。なお、各細胞における誘導条件を下記に示す。
採血により得た末梢血単核球のCD3陽性CD56陰性CD4陽性T細胞分画(以下、CD4陽性T細胞)をフローサイトで分取し、抗CD3抗体、抗CD28抗体(ビーズ結合、固層化、培地への添加の別を問わない)で活性化させた。培地にはヒトIL-2を20ng/ml程度添加し、刺激から48~96時間後にかけてレトロネクチンをコートした24穴プレート上で複数回の山中因子遺伝子導入を行った。その際に用いた山中因子はOCT4、SOX2、KLF4、及びC-MYC、又はOCT4、SOX2、及びKLF4である。最後の遺伝子導入から2日後以降を目安に、6cmディッシュ上の照射MEF上に1~5x105の遺伝子導入T細胞を乗せた。なお、初日にフローサイトでCD4陽
性T細胞を分取して用いなかった場合は、このタイミングでフローサイトによりCD4陽性T細胞を分取してMEFに乗せた。乗せ換え翌日より4日間、半量ずつの培地を0.5μMバルプロ酸入りES細胞用培地に置換し、その後は連日又は一日おきに0.5μMバルプロ酸入りES細胞用培地を交換して培養を続けた。乗せ換え後10日前後より敷石様の細胞集簇を認め、数日のうちに完成したiPS細胞コロニーが観察された。
採血により得た末梢血単核球のCD3陽性CD56陰性CD8陽性T細胞分画(以下、CD8陽性T細胞)をフローサイトで分取し、抗CD3抗体、抗CD28抗体(ビーズ結合、固層化、培地への添加の別を問わない)で活性化させた。培地にはヒトIL-2を20ng/ml、IL-7を10ng/ml、IL-15を10ng/ml程度添加し、刺激から48~96時間後にかけてレトロネクチンをコートした24穴プレート上で複数回の山中因子遺伝子導入を行う。その際に用いた山中因子はOCT4、SOX2、KLF4、C-MYC、NANOG、及びLIN28、又はOCT4、SOX2、KLF4、C-MYC、及びNANOGである。最後の遺伝子導入から2日後以降を目安に、6cmディッシュ上の照射MEF上に1~5x105の遺伝子導入T細胞を乗せた。なお、初日にフ
ローサイトでCD8陽性T細胞を分取して用いなかった場合は、このタイミングでフローサイトによりCD8陽性T細胞を分取してMEFに乗せた。乗せ換え翌日より4日間、半量ずつの培地を0.5μMバルプロ酸入りES細胞用培地に置換し、その後は連日又は一日おきに0.5μMバルプロ酸入りES細胞用培地を交換して培養を続けた。乗せ換え後2週前後より敷石様の細胞集簇を認め、1~2週のうちに完成したiPS細胞コロニーが観察された。
子 NANOGを更に導入する条件下におけるCD8+Tリンパ球からT-iPS細胞へ
の誘導の成功率の2倍であった。なお、本実施例において、CD4+Tリンパ球からはN
ANOGを導入せずに、7、8回の試行によってT-iPS細胞が得られる。
EF上への乗せ換え後に10μMのROCK inhibitor存在下に5%O2下の
低酸素培養、又は1μM MEK inhibitor(PD0325901)及び3μM GSK3 inhibitor (CHIR99021)をコロニー形成まで培地に添加することによって、T-iPS細胞への誘導効率が若干上昇する傾向にあることが確認された。
CCR7の発現に基づき、ナイーブ(CD45RA+CD62L+)、セントラルメモリー(CD45RA-CD62L+)、エフェクターメモリー(CD45RA-CD62L-)、及びターミナルエフェクターT細胞(CD45RA+CD62L-)のサブセットに分け、iPS細胞への誘導(再プログラミング)を行った(Sallusto,F.ら、Nature、1999年、401巻、708~712ページ 参照、図14 参照)。その結果、健常人ドナー3人における平均 再プログラミングの効率は、ナイーブT細胞においては0.0041%、セントラルメモリーT細胞においては0.017%、エフェクターメモリーT細胞においては0.0036%、ターミナルエフェクターT細胞においては0.0008%であり、特にセントラルメモリーT細胞より比較的良好にT-iPS細胞は樹立されることが明らかになった(図15 参照)。なお、CD4+セントラル
メモリーT細胞の再プログラミング効率の高さは、抗CD3/CD28刺激に対する感受性を反映しているのかもしれない。
<TiPS細胞から分化したT系譜細胞の機能解析>
ヒトES細胞から得たCD34陽性細胞をSCID-huマウスに移植することで移植されたヒト胎児胸腺内にT細胞系譜が分化誘導される(Galic,Zら、PNAS、2006年、103巻、31号、11742~7ページ 参照)。またin vivoではES細胞はOP9-DL1細胞によって、CD4/CD8 double positiveを主としたCD3陽性、TCR陽性細胞へと誘導される(Timmermansら、JI、2009年、182巻、6879~6888ページ 参照)。
の発現は亢進しており、いくらかの細胞において、CD3-TCRαβ複合体も発現し始めていた。第3週までに、CD34細胞は完全に消失しており、CD3-TCRαβ強陽性細胞は浮遊細胞の最も多い細胞群となっていた。なお、CD3+細胞においてTCRαβ-細胞はなかった(図17の(b) 参照)。また、第3週の後でさえ、大抵の再分化
CD3+TCRαβ+細胞は、共陰性(DN)ステージのものであったが、いくつかの細胞群においては、CD4のみ陽性な細胞(8.5±8.2%)及びCD8のみ陽性な細胞(15.5±15.9%)も検出された(図18及び図19 参照)。
よってCD3発現細胞は活性化しているように見受けられた(図20 参照)。しかし、実際のCD3+細胞は変わっていないことが確認された。
。しかし、機能的又は非機能的再構成由来の配列とは異なる転写産物は確認されなかった(表9 参照)。なお、表8において、「iPS Clone」は樹立したT細胞由来のiPS細胞株を示し、「Productivity」は、再構成したT細胞受容体が機能を有するか否か、すなわちβ受容体と複合体を作り抗原を認識するか(機能的:Productive)、否か(非機能的:Unproductive)を示し、「Sequence of junctional region」は結合領域の塩基配列を示す。また、表9において、「Productivity」は、再構成したT細胞受容体が機能を有するか否か、すなわちβ受容体と複合体を作り抗原を認識するか(機能的:Productive)、否か(非機能的:Unproductive)を示し、「No.of Sequenced Samples」は各TCR遺伝子において解析したサンプル数を示し、「Sequence allignment with T-iPSC‘s genome」は、解析したサンプルにおいて、再分化前のT-iPS細胞のゲノムと一致した数及び割合(Identical)、又は該ゲノムと異なった数及び割合(Different)を示す。
PSC)のいずれにおいてもCD3陽性細胞が誘導されたが、T-iPS細胞は、皮膚細胞やCD34陽性細胞に由来するiPS、およびES細胞に比して明らかにT細胞へと誘導されやすいことが判明した(図16、17、26、及び27 参照)。
<ヒトT細胞より樹立したiPS細胞から機能的T細胞への誘導2>
複数ドナーのCD4T細胞又はCD8T細胞に由来するT-iPSCクローン(6クローン)を用いて、モノクローナルTCRを持つT細胞集団の誘導を試みた。すなわち、誘導開始日に3×105個のT-iPS細胞を10cmディッシュに敷き詰めた照射OP9
細胞又は10T1/2細胞に撒き、分化培地を用いて14日間程度共培養した。12~14日目にかけて共培養中に袋状の構造物に入った血球細胞が出現した。なお、その際にサイトカインを併用しなくても血球細胞は出現したが、VEGFを添加するとCD34陽性造血幹細胞(以下CD34細胞)の回収が改善することが明らかになった。またVEGF、SCF、及びTPO、又はVEGF、SCF、及びFLT3Lを加えると、さらにCD34細胞の回収が改善するも明らかになった。なお、後述の通り、これらの傾向は最終産物であるT系譜細胞の回収にも反映された。
含有α-MEM培地にて共培養した。なお、SCFはNK細胞への分化を強く促すため、使用しなかった。前述の通り、共培養2週目には一部、3週目には大部分の浮遊細胞がCD3陽性TCRαβ陽性のT系譜細胞になるが、それらの細胞はCD4とCD8の発現においてダブルネガティブ(DN)、ダブルポジティブ(DP)、シングルポジティブ(SP)を含み、一様の集団ではなかった(図17 参照)。そこで、さらに詳細に検討した結果、DN、DP、CD4SP、CD8SPの構成はIL-7の濃度に依存することを見出した。具体的には、図には示さないが、IL-7非添加ではCD3陽性CD56陰性T細胞そのものが少なくて大部分はDNであった。IL-7 5~10ng/mlではCD3陽性CD56陽性NKT様の細胞集団が出現し、やはり大部分はDNであった。一方、IL-7 1ng/mlではCD3陽性CD56陰性のT系譜細胞が大部分を占め、DNからDP、そしてCD4SP、CD8SPへの分化が確認された。また、これらのSP細胞を末梢血T細胞の分化マーカーで解析すると、CD8SPの80%程度はCD45RA+CD62L+ナイーブT細胞であり、CD4SPの大部分はCD45RA-CD62L+セントラルメモリーT細胞であったすなわち、エフェクターメモリー段階に進んでいたT細胞が、T-iPS細胞を介してナイーブT細胞(CD8SPの場合)やセントラルメモリーT細胞(CD4の場合)に若返りし得ることが示唆された。
<223> 人工的に合成されたプライマーの塩基配列
Claims (12)
- ヒトCD8シングルポジティブT細胞の集団を製造する方法であって、
(A)所望の抗原特異性を有し、かつCD8陽性のヒトT細胞からiPS細胞を誘導する工程{但し、p53の阻害剤を用いてp53を不活性化することによりiPS細胞の樹立効率を高めることを含む工程を除く}と、
(B)該iPS細胞をCD8シングルポジティブT細胞に分化させ、分化および上記所望の抗原特異性の保持を確認し、かつ当該分化した上記所望の抗原特異性を有するヒトCD8シングルポジティブT細胞の集団を得る工程と
を含む、方法。 - 分化したCD8シングルポジティブT細胞が、CD45RA + CD62L + ナイーブT細胞、CD45RA - CD62L + セントラルメモリーT細胞、CD45RA - CD62L - エフェクターメモリーT細胞、およびCD45RA + CD62L - のターミナルエフェクターT細胞からなる群から選択される1以上である、請求項1に記載の方法。
- 分化したCD8シングルポジティブT細胞が、CD45RA + CD62L + ナイーブT細胞である、請求項1または2に記載の方法。
- 分化したCD8シングルポジティブT細胞が、CD45RA - CD62L + セントラルメモリーT細胞である、請求項1または2に記載の方法。
- iPS細胞に誘導されるヒトT細胞が、CD45RA - CD62L + セントラルメモリーT細胞、CD45RA + CD62L + ナイーブT細胞またはCD45RA - CD62L - エフェクターメモリーT細胞である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- iPS細胞に誘導されるヒトT細胞が、CD45RA - CD62L + セントラルメモリーT細胞である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(A)が、ヒトT細胞をインターロイキン-2(IL-2)存在下にて抗CD3抗体および抗CD28抗体により刺激することにより活性化する工程をさらに含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(B)が、該iPS細胞をストローマ細胞上で培養して、血球細胞を含有する袋状の構造物(サック)を形成することを含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(B)が、VEGF、TPO、SCF、及びFLT3L群から選択される少なくとも1のサイトカインを含有する培地中にて該iPS細胞を培養することを含む、請求項8に記載の方法。
- 工程(B)が、袋状の構造物から得られた血球細胞をストローマ細胞上で培養することを含む、請求項8または9に記載の方法。
- ストローマ細胞が、OP9-DL1細胞、OP9-DL4細胞、および10T1/2/DL4細胞からなる群から選択される1以上の細胞である、請求項10に記載の方法。
- 袋状の構造物から得られた血球細胞をストローマ細胞上で培養することが、IL-7、FLT3L、VEGF、SCF、TPO、IL-2、およびIL-15からなる群から選択される1以上のサイトカインを含む培地中で行われる、請求項10または11に記載の方法。
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