JP6873898B2 - 体細胞への分化誘導に適した幹細胞クローンを製造する方法 - Google Patents
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Description
[A1]幹細胞クローンを製造する方法であって、
(i) 体細胞への分化誘導に関連する外来性遺伝子を幹細胞に導入する工程、
(ii) 前記外来性遺伝子が導入された幹細胞を前記体細胞へと分化誘導する工程、
(iii) 分化誘導された体細胞を脱分化する工程、および
(iv) 工程(iii)で形成された幹細胞コロニーから、染色体に前記外来性遺伝子が組み込まれた幹細胞を単離する工程、
を含む、方法。
[A2]単離された幹細胞クローンの体細胞への分化誘導効率が、クローン化前の幹細胞と比較して高い、[A1]に記載の方法。
[A3]前記体細胞が造血前駆細胞、巨核前駆細胞、赤芽球、神経細胞、神経幹細胞、神経冠細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、肝細胞又はメラニン細胞である、[A1]又は[A2]に記載の方法。
[A4]前記体細胞が巨核球前駆細胞であり、前記分化誘導に関連する外来性遺伝子が、MYCファミリー遺伝子を含む癌遺伝子、Bmi1を含むp16遺伝子又はp19遺伝子の発現を抑制する遺伝子(ポリコーム遺伝子)およびBCL−XL遺伝子を含むアポトーシス抑制遺伝子から成る群より選択される少なくとも一つの外来性遺伝子である、[A3]に記載の方法。
[A5]MEG3を発現する幹細胞が単離される、[A1]〜[A4]のいずれかに記載の方法。
[A6]前記分化誘導に関連する外来性遺伝子が薬剤応答性プロモーターと機能的に連結されている、[A1]〜[A5]のいずれかに記載の方法。
[A7]工程(iii)の脱分化がOCT3/4、SOX2およびKLF4から成る群から選択される初期化因子の導入により実施される、[A1]〜[A6]のいずれかに記載の方法。
[A8]体細胞を製造する方法であって、
[A1]〜[A7]に記載の方法に従い製造された幹細胞クローンを体細胞へ分化誘導する工程、を含む、方法。
[A9]血小板を製造する方法であって、
[A1]〜[A6]に記載の方法に従い製造された幹細胞クローンを巨核前駆細胞へ分化誘導する工程、および
分化誘導された巨核球前駆細胞を巨核球細胞に成熟させ、血小板を放出させる工程、
を含む、方法。
[A10]
製造される血小板がHLAを欠損している、[A9]に記載の方法。
(i)薬剤応答性プロモーターと機能的に連結された外来性遺伝子が染色体へ組み込まれた体細胞へ初期化因子を導入し、幹細胞コロニーを形成させる工程、
(ii)前記工程(i)で得られた幹細胞コロニーを単離する工程、および
(iii)前記工程(ii)で単離された幹細胞コロニーに含まれる幹細胞を体細胞へ誘導する工程であって、当該幹細胞から当該体細胞へのいずれかの分化段階の細胞を対応する薬剤と接触する工程を含む、工程;
[B2]前記体細胞が、巨核球前駆細胞であって、前記外来性遺伝子が、MYCファミリー遺伝子、ポリコーム遺伝子およびアポトーシス抑制遺伝子から成る群より選択される少なくとも一つの遺伝子である、[B1]に記載の方法;
[B3]前記工程(iii)が、次の工程を含む、[B2]に記載の方法;
(a)前記工程(ii)で単離された幹細胞コロニーに含まれる幹細胞を造血前駆細胞へ誘導する工程、および
(b)前記工程(a)で得られた造血前駆細胞を対応する薬剤と接触する工程;
[B4]前記初期化因子が、OCT3/4、SOX2およびKLF4を含む因子である、[B1]から[B3]のいずれかに記載の方法;
[B5]前記薬剤応答性プロモーターが、TRE配列を有するプロモーターであり、少なくとも前記工程(iii)の細胞において、さらにreverse tetR融合タンパク質を発現させる、[B1]から[B4]のいずれかに記載の方法;
[B6]前記工程(iii)において、前記工程(ii)で単離された幹細胞コロニーに含まれる幹細胞において、MEG3を発現する幹細胞を選択する工程をさらに含む、[B2]から[B5]のいずれかに記載の方法;
[B7]前記工程(iii)において、前記工程(ii)で単離された幹細胞コロニーに含まれる幹細胞において、HLAを欠損させる工程をさらに含む、[B1]から[B6]のいずれかに記載の方法;
[B8]前記HLAが、クラスI抗原である、[B7]に記載の方法;
[B9]前記クラスI抗原が、β2-ミクログロブリンである、[B8]に記載の方法;
[B10]次の工程を含む、血小板の製造方法:
[B2]から[B9]のいずれか1項に記載の方法で巨核球前駆細胞をクローン化する工程、および
クローン化された巨核球前駆細胞を巨核球細胞に成熟させ、血小板を放出させる工程;
[B11]次の工程を含む、HLAを欠損させた体細胞を製造する方法;
(i) 体細胞へ初期化因子を導入し、多能性幹細胞を形成させる工程、
(ii)前記工程(i)で得られた多能性幹細胞においてHLAを欠損させる工程、および
(iii)前記工程(ii)で得られたHLAを欠損させた多能性幹細胞を体細胞へ誘導する工程;[B12]前記初期化因子が、OCT3/4、SOX2およびKLF4を含む因子である、[B11]に記載の方法;
[B13]前記工程(i)で用いられる体細胞が、巨核球前駆細胞であって、当該巨核球前駆細胞が、薬剤応答性プロモーターと機能的に連結されたMYCファミリー遺伝子、ポリコーム遺伝子およびアポトーシス抑制遺伝子から成る群より選択される少なくとも一つの遺伝子を染色体へ組み込むことによって製造された巨核球前駆細胞である、[B11]または[B12]に記載の方法;
[B14]前記工程(iii)が、次の工程を含む、[B13]に記載の方法;
(A)前記工程(ii)で得られたHLAを欠損させた多能性幹細胞を造血前駆細胞へ誘導する工程、および
(B)前記工程(A)で得られた造血前駆細胞を対応する薬剤と接触する工程;
[B15]前記HLAが、クラスI抗原である、[B11]から[B14]のいずれかに記載の方法;
[B16]前記クラスI抗原が、β2-ミクログロブリンである、[B15]に記載の方法;
[B17]次の工程を含む、HLAを欠損させた血小板の製造方法:
[B13]から[B16]のいずれかに記載の方法で、HLAを欠損させた巨核球前駆細胞を製造する工程、および
HLAを欠損させた巨核球前駆細胞を巨核球細胞に成熟させ、血小板を放出させる工程;
[B18]外来性の癌遺伝子および外来性のp16遺伝子又はp19遺伝子の発現を抑制する遺伝子を含む、iPS細胞であって、当該外来性の癌遺伝子に対する外来性のp16遺伝子又はp19遺伝子の発現を抑制する遺伝子の含有率が2倍から7倍である、iPS細胞;
[B19]前記癌遺伝子が、c-Mycであり、および前記p16遺伝子又はp19遺伝子の発現を抑制する遺伝子がBmi1である、[B18]に記載のiPS細胞;
[B20]外来性の癌遺伝子および外来性のp16遺伝子又はp19遺伝子の発現を抑制する遺伝子を含む、巨核球前駆細胞であって、当該外来性の癌遺伝子に対する外来性のp16遺伝子又はp19遺伝子の発現を抑制する遺伝子の含有率が2倍から7倍である、巨核球前駆細胞;
[B21]前記癌遺伝子が、c-Mycであり、および前記p16遺伝子又はp19遺伝子の発現を抑制する遺伝子がBmi1である、[B20]に記載の巨核球前駆細胞;及び
[B22]巨核球前駆細胞の誘導に適した多能性幹細胞または造血前駆細胞を選択する方法であって、MEG3を発現する多能性幹細胞または造血前駆細胞を選択する工程を含む、方法。
(i) 体細胞への分化誘導に関連する外来性遺伝子を幹細胞に導入する工程、
(ii) 前記外来性遺伝子が導入された幹細胞を前記体細胞へと分化誘導する工程、
(iii) 分化誘導された体細胞を脱分化する工程、および
(iv) 工程(iii)で形成された幹細胞コロニーから、染色体に前記外来性遺伝子が組み込まれた幹細胞を単離する工程。
(i)薬剤応答性プロモーターと機能的に連結された外来性遺伝子が染色体へ組み込まれた体細胞へ初期化因子を導入し、幹細胞コロニーを形成させる工程、および
(ii)前記工程(i)で得られた幹細胞コロニーを単離する工程。
(iii)工程(ii)で単離された幹細胞コロニーに含まれる幹細胞を体細胞へ誘導する工程であって、当該幹細胞から当該体細胞へのいずれかの分化段階の細胞を対応する薬剤と接触する工程を含む、工程。
本発明において、クローン化に供される体細胞(1次体細胞という。)は、薬剤応答性プロモーターと機能的に連結された遺伝子を染色体へ組み込むことによって製造された細胞であれば、特に限定されないが、例えば、神経細胞(WO2014/148646、Wapinski OL et al, Cell. 155:621-635, 2013)、神経幹細胞(Han DW et al, Cell Stem Cell. 10:465-472, 2012)、神経冠細胞(Kim YJ, et al, Cell Stem Cell. 15:497-506, 2014)、心筋細胞(Ieda M et al, Cell. 142:375-386, 2010)、骨格筋細胞(Tanaka A, et al, PLoS One. 8:e61540, 2013)、軟骨細胞(Outani H, et al, PLoS One. 8:e77365, 2013)、肝細胞(Huang P, et al, Cell Stem Cell. 14:370-384, 2014)、メラニン細胞(Yang R, et al, Nat Commun. 5:5807, 2014)、造血前駆細胞(Batta K, Cell Rep. 9:1871-84, 2014)、赤芽球(Hirose S, et al, Stem Cell Reports. 1:499-508, 2013)および巨核球前駆細胞(Nakamura S, et al, Cell Stem Cell. 14:535-548, 2014)が挙げられる。
(1)Z-Asp-CH2-DCB(分子量454.26)
(2)Boc-Asp(OMe)-FMK(分子量263.3)
(3)Boc-Asp(OBzl)-CMK(分子量355.8)
(4)Ac-AAVALLPAVLLALLAP-YVAD-CHO(分子量1990.5)(配列番号1)
(5)Ac-AAVALLPAVLLALLAP-DEVD-CHO(分子量2000.4)(配列番号2)
(6)Ac-AAVALLPAVLLALLAP-LEVD-CHO(分子量1998.5)(配列番号3)
(7)Ac-AAVALLPAVLLALLAP-IETD-CHO(分子量2000.5)(配列番号4)
(8)Ac-AAVALLPAVLLALLAP-LEHD-CHO(分子量2036.5)(配列番号5)
(9)Z-DEVD-FMK (Z-Asp-Glu-Val-Asp-fluoromethylketone)(配列番号6)
(10)Z-VAD FMK
本発明において、体細胞を初期化する方法として、体細胞へ初期化因子を導入することによって行い得る。ここで、初期化因子とは、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等の遺伝子または遺伝子産物が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat. Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。より好ましい初期化因子は、Oct3/4、Sox2およびKlf4を含む組み合わせである。
本発明では、上述のとおり体細胞へ初期化因子を導入し、培養することで、幹細胞コロニーを得ることができる。本発明において、幹細胞とは、分裂して自分と同じ細胞を作る自己複製能と、別の種類の細胞に分化する能力を持ち、際限なく増殖できる細胞を意味する。本発明の幹細胞は、コロニーを形成する限り特に限定されないが、幹細胞のうち胎盤を除く組織細胞へ分化する能力を有する多能性幹細胞である。
本発明において、体細胞が巨核球前駆細胞である場合、上述の通り、薬剤応答性プロモーターと機能的に連結された外来性の癌遺伝子および外来性のp16遺伝子又はp19遺伝子の発現を抑制する遺伝子を巨核球前駆細胞の染色体内に含んでいてもよい。その場合、当該巨核球前駆細胞を上述の方法により初期化することによって得られる2次iPS細胞は、同様に薬剤応答性プロモーターと機能的に連結された外来性の癌遺伝子および外来性のp16遺伝子又はp19遺伝子の発現を抑制する遺伝子をその染色体内に含む。このとき、巨核球前駆細胞誘導用iPS細胞における外来性の癌遺伝子に対する薬剤応答性プロモーターと機能的に連結された外来性の癌遺伝子に対する薬剤応答性プロモーターと機能的に連結された外来性のp16遺伝子又はp19遺伝子の発現を抑制する遺伝子の含有率が、2倍から7倍であることが好ましく、より好ましくは、3倍から5倍である。同様に、巨核球前駆細胞における外来性の癌遺伝子に対する薬剤応答性プロモーターと機能的に連結された外来性の癌遺伝子に対する薬剤応答性プロモーターと機能的に連結された外来性のp16遺伝子又はp19遺伝子の発現を抑制する遺伝子の含有率が、2倍から7倍であることが好ましく、より好ましくは、3倍から5倍である。なお、癌遺伝子およびp16遺伝子又はp19遺伝子の発現を抑制する遺伝子は、上述の遺伝子として適宜選択される。
本発明のクローン化方法において、上記の方法で得られた幹細胞を2次体細胞へと誘導する工程を含む。本発明において、2次体細胞とは、1次体細胞から幹細胞へ初期化された後、誘導されて得られる体細胞を意味し、好ましくは、1次体細胞と2次体細胞は、同一の体細胞である。本誘導工程では、組み込まれた遺伝子を再度発現させることによって行い得る。遺伝子の再発現は、1次体細胞の初期化により得られた幹細胞から2次体細胞までのいずれかの分化段階の細胞を対応する薬剤と接触させること(対応する薬剤の存在下で遺伝子を発現するプロモーターの場合)、または、1次体細胞の初期化により得られた幹細胞から2次体細胞までのいずれかの分化段階の細胞と対応する薬剤との接触を中止すること(対応する薬剤を除去すると遺伝子を発現するプロモーターの場合)によって行い得る。例えば、rtetRおよびVP16ADの融合遺伝子(reverse tetR)を用いる場合、対応する薬剤を投与することによって遺伝子を再度発現させることができる。「1次体細胞の初期化により得られた幹細胞から2次体細胞までのいずれかの分化段階の細胞」とは、当該幹細胞が2次体細胞に分化するまでに経るあらゆる細胞とすることができる。したがって、本発明において、遺伝子を再発現する前に、当該幹細胞を他の細胞へと誘導してよく、当該誘導後の細胞として、線維芽細胞、造血前駆細胞などが挙げられる。「他の細胞」への誘導は公知の方法にしたがって行うことができる。体細胞として巨核球前駆細胞を用いる場合、上述した造血前駆細胞への誘導方法が例示される。すなわち、幹細胞から造血前駆細胞を誘導し、上述した造血前駆細胞から巨核球前駆細胞を誘導するために用いる培地へ対応する薬剤を投与することで、癌遺伝子、p16遺伝子又はp19遺伝子の発現を抑制する遺伝子、並びに/あるいはアポトーシス抑制遺伝子を強制発現することができる。
本発明において、体細胞として巨核球前駆細胞を用いる場合、必ずしも全ての幹細胞が、巨核球前駆細胞へ誘導可能であるとは限らないことから、巨核球前駆細胞へ誘導可能な幹細胞を適宜選択することが好ましく、当該方法として、幹細胞において、MEG3を発現する幹細胞を選択する方法が例示される。本発明において、MEG3を発現する幹細胞由来の造血前駆細胞を選択しても良い。本発明において、MEG3とは、ヒトの場合、例えば、NCBIのアクセッション番号NR_002766、NR_003530、NR_003531、NR_033358、NR_033359、NR_033360、NR_046464、NR_046465、NR_046466、NR_046467、NR_046468、NR_046469、NR_046470、NR_046471、NR_046472またはNR_046473で示される核酸配列からなるノンコーディングRNAである。本発明の方法を適用する幹細胞は、特に限定されないが、1次多能性幹細胞であっても良く、より好ましくは、上記の方法で得られた幹細胞クローンである。発現が高いとは、同時に測定した複数の幹細胞または造血前駆細胞において、平均値より発現が高いことを意味しても良く、または、巨核球前駆細胞へ誘導できない既知の幹細胞または造血前駆細胞での発現と比較して高いことを意味しても良い。
一実施態様において、本発明は、次の工程を含む、体細胞のHLAを欠損させる方法、又はHLAを欠損させた体細胞を製造する方法を提供する;
(i)体細胞へ初期化因子を導入し、多能性幹細胞を形成させる工程、
(ii)前記工程(i)で得られた多能性幹細胞においてHLAを欠損させる工程、および
(iii)前記工程(ii)で得られたHLAを欠損させた多能性幹細胞を体細胞へ誘導する工程。
本発明の血小板の製造方法は、本発明のクローン化方法で巨核球前駆細胞をクローン化する工程と、クローン化された巨核球前駆細胞を巨核球細胞に成熟させ、血小板を放出させる工程を含む。巨核球前駆細胞を成熟させ、血小板を放出させる工程は、公知の方法又はそれに準ずる方法に従って行うことができる。例えば、巨核球前駆細胞が、MYCファミリー遺伝子、ポリコーム遺伝子およびアポトーシス抑制遺伝子から成る群より選択される少なくとも一つの遺伝子を含む場合、巨核球細胞の成熟は、上記工程(iii)の後、対応する薬剤を培地から除去することにより、MYCファミリー遺伝子、ポリコーム遺伝子および/又はアポトーシス抑制遺伝子の発現を抑制することで行うことができる。成熟した巨核球細胞は、多核化し、血小板を放出する。
本発明は、上述の通り、巨核球前駆細胞を初期化により幹細胞を作製し、さらに、巨核球前駆細胞へと変換することによって、当該巨核球前駆細胞の増殖能力を改善する方法を提供する。従って、一実施態様において、本発明の巨核球前駆細胞の増殖能力を改善する方法は、以下の工程を含む;
(i)薬剤応答性に発現する外来性の遺伝子を有する巨核球前駆細胞へ初期化因子を導入し、幹細胞コロニーを形成させる工程、
(ii)前記工程(i)で得られた幹細胞コロニーを単離する工程、および
(iii)前記工程(ii)で単離された幹細胞コロニーに含まれる幹細胞を巨核球前駆細胞へ誘導する工程であって、当該体細胞への誘導が、対応する薬剤と接触する工程を含む方法である、工程。
3x105cells/dishでMEFを播種した6cm dishで維持されているセミコンフルエント状態のiPS細胞(SeV2: neonate human fibroblastへWO2010/134526の方法に従って、センダイウィルスベクターによりc-MYC, OCT3/4, SOX2およびKLF4を導入することによって作製)より、iPS-sacを介して造血前駆細胞(HPC)の誘導を行った。詳細には、iPS細胞をヒトトリプシン溶液を用いて遊離させ、1/50から1/30程度の細胞を、コロニーの塊として、マイトマイシンC(MMC)処理したC3H10T1/2(理研から入手可能)上へ播種した。なお、MMC処理したC3H10T1/2は、iPS細胞を播種する前日に8x105 cells / dishで10cm dishへ播種して用意した。播種後、20 ng / ml VEGFを添加したEagel’s Basal Medium (EBM)中で5% O2、5% CO2、37℃雰囲気下で培養を開始した(day0)。Day3およびday6において、同じ培地で培地交換を行った。
巨核球前駆細胞(imMKCL)を96-well plate上に1.5 cells/300uL/wellの密度で播種し、15% fetal bovine serum (FBS)、50 ng/mL human SCF (R&D systems)、50ng/mL TPO、5 mg/mL doxycycline (Clontech)、2 mg/mL puromycin (Sigma-Aldrich)を含有するIscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)中、37°C、5%CO2雰囲気下で 、10から14日間培養した。スケールアップのため、各wellを、それぞれ、24-well plateおよび6-well plateへ移し、同様に培養を継続した。各well中の細胞を巨核球前駆細胞クローンと称する。
上記の方法で得られた各巨核球前駆細胞クローンをPBSを用いて2度洗浄し、4 x 105/3mLで6-well plateへ播種し、50 ng/mL human SCF、50 ng/mL human TPO、750 nM SR1(Calbiochem)、15% FBSを含有するIMDM中で培養した。7日後、培養上清を回収し、血小板産生数および血小板機能を評価した。血小板産生数の評価は次のように行った。すなわち、CD41(BioLegend)、CD42a(eBioscience)およびCD42b(BioLegend)に対する蛍光色素結合抗体およびpropidium iodide(Sigma-Aldrich)を培養上清に添加し、30分間インキュベート後にFACSVerseO(BD Biosciences)を用いて分析した。分析は、大きさで巨核球前駆細胞を排除した後、CD41、CD42aおよびCD42bが陽性であることを指標として計数し、巨核球前駆細胞あたりの血小板数として算出した。血小板機能の評価は次のように行った。すなわち、CD41、CD42b、activated glycoprotein (GP) IIb/IIIa(PAC-1; BD Biosciences)に対する蛍光色素結合抗体および0.4 mM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich )を培養上清に添加し、30分間インキュベート後にFACSVerseO を用いて分析した。分析は、activated GP IIb/IIIaの発現レベルを蛍光強度(MFI)で計測し、評価に用いた。
1回目の解析結果において血小板産生量が多く、血小板機能が高かった5つのクローン(1、2、4、11および13)について、再度同様に解析を行った。血小板産生量は、クローン4のみが、対照に対して1.3倍程度多いことが確認された(図2A)。また、血小板機能としては、クローン13が、対照に対して3.7倍程度多いことが確認されたが、クローン1、2、4および11では、1回目の解析結果とは異なり、対照に対して変化がなかった(図2B)。
2回目の解析結果について、再度同様に解析を行った。血小板産生量は、対照に対して変化がなかった(図3A)。また、血小板機能としては、クローン4および13が、対照に対してそれぞれ1.7倍および1.6倍程度多いことが確認されたが、差異は小さくなった(図3B)。
上述の方法で得られた巨核球前駆細胞を初期化によりiPS細胞を作製し(2次iPS細胞)、2次iPS細胞にてクローン化を行い、再度巨核球前駆細胞へと誘導しクローン化した(2次巨核球前駆細胞)(図4A)。詳細には、以下の通りである。
上述の方法で得られた10個の2次iPS細胞クローンからゲノムDNAを抽出し、c-MYCおよびBMI1に対してexon内でPCR反応可能なprimerを用いて、定量PCRを行った。その結果、内在性の2コピー以外の外来性のc-MYCおよびBMI1の挿入数を検討したところ、10種の2次iPS細胞クローンの外来性のBMI1の挿入数は約7コピーから26コピーであり、外来性のc-MYCの挿入数は約1コピーから6コピーと全て異なっていた(図4B)。
3個の2次iPS細胞クローン(#4、#11および#12)から上述した方法にてiPS-sacを介して14日後にHPCクローンをそれぞれ得た。得られたHPCクローンを1x105 cells / wellで6-wellへ播種し、SCF 50 ng / ml, TPO 50 ng / ml, ドキシサイクリン0.5 μg / mlを添加したEBM中で27日間培養し、2次巨核球前駆細胞クローンを得た。得られた3つの巨核球前駆細胞クローンを解析したところ、CD41aおよびCD41b陽性であり、CD235陰性である均一な細胞群が得られた(図5AおよびB)
上述の方法で得られた2次iPS細胞クローン(#11)へ、図6Aに示したTarget vectorを導入し、相同組換えによりβ2-Microglobulin (β2m)のExon1を欠失させた。相同組換えが適切に行われているかについては、野生型と組換え型において図6Aに示された位置に設計されたプライマーを用いてPCR産物を確認することによって行われた(図6B)。その結果、2つのクローン(Clone 3及び4)においてβ2mの欠損型2次iPS細胞クローンが樹立された。
野生型2次iPS細胞クローン(#11)およびβ2mの欠損型2次巨核球前駆細胞クローンの培養上清中の血小板を上述と同様にPMAで刺激した後、CD42a抗体、CD42b抗体およびPAC1と接触させ、CD42a、CD42bおよびPAC1の陽性レベルを蛍光強度(MFI)で計測し、評価したところ、野生型とβ2mの欠損型において、その違いは見られなかった(図7B)。以上より、β2mを欠損した血小板は、野生型の血小板と機能は変わらないことが示された。
上述の方法で得られたimMKCLを樹立することができた2種の2次iPS細胞(以下、Good-iPSCと言う)および、上述の方法では、imMKCLを樹立することができなかった2種のiPS細胞(以下、Bad-iPSCと言う)より、mRNAを抽出し、製造者マニュアルに従って、Illumina HumanHT-12 v4.0またはAffymetrix GeneChip Human Gene 2.0 ST Arrayを用いてマイクロアレイを行い、各2種のGood-iPSCおよびBad-iPSCの発現量を平均化し、解析を行った(図8AおよびB)。
高発現していることが確認された。従って、2次iPS細胞クローンまたはそれから誘導されたHPCにおいて、MEG3の発現を確認することで、巨核球前駆細胞の誘導に適した2次iPS細胞クローンを選択することができることが示唆された。
本発明によるクローン化の効果を検討するべく、2次iPS細胞クローン由来巨核球前駆細胞の細胞増殖能をクローン化前の巨核前駆細胞株と比較した。本実験においては、2次iPS細胞クローンとして、表1の2nd-iPS_11由来のものを用いた。具体的には、2nd-iPS_11から上述した方法にてiPS-sacを介して14日後に得られたHPCクローンを1x105cells / wellで6-wellへ播種し、SCF 50 ng / ml, TPO 50 ng / ml, ドキシサイクリン0.5 μg / mlを添加したEBM中で27日間培養することにより、2次巨核球前駆細胞クローンを得た(Clone 2)。比較例として、「巨核前駆細胞の製造」の項で調製したクローン化前の巨核前駆細胞(Parental)を使用した。これらの細胞を1x105 cells / wellで6-wellへ播種し、SCF 50 ng / ml, TPO 50 ng / ml, ドキシサイクリン0.5 μg / mlを添加したEBM中で15日間培養した。
15日間培養した2次巨核球前駆細胞クローン(Clone 2)を更に巨核球成熟条件(EBM中に SCF 50 ng / ml, TPO 50 ng / ml を添加し、さらにSR-1 (StemRegenin1)(Selleckchem社製)750 nMとY27632(wako社製) 10 microMを添加した培養条件)で培養した。巨核前駆細胞(Parental)も2次巨核球前駆細胞クローンと同様の培養条件で巨核球に成熟させた。両細胞についてタイムラプスイメージングを行い撮影した画像を図10Aに、そして得られた画像をImageJで解析した結果を図10Bに示す。これらの結果から、本発明に従いクローン化された巨核球の方がクローン元の細胞から誘導された巨核球より優れた成熟能(細胞肥大化)を示した。
続いて、得られた巨核球の血小板産生能を比較するために、図10Aの画像中で血小板を形成した細胞の数を目視で計測した。その結果、本発明に従いクローン化された細胞に由来する巨核球の方が優れた血小板産生能(proplatelet形成数)を示すことが明らかになった(** p<0.01)。
Claims (8)
- 幹細胞から分化誘導された巨核球前駆細胞から2次幹細胞クローンを製造する方法であって、
(i) MYCファミリー遺伝子、BMI1遺伝子及びBCL−XL遺伝子から成る群から選択される少なくとも1つの外来性遺伝子を発現する幹細胞、又は当該幹細胞から誘導された造血前駆細胞、から分化誘導された巨核球前駆細胞を脱分化して幹細胞コロニーを形成する工程、および
(ii) 工程(i)で形成された幹細胞コロニーから、染色体に前記外来性遺伝子が組み込まれた2次幹細胞クローンを単離する工程、
を含み、
前記幹細胞が発現する外来性遺伝子が少なくともMYCファミリー遺伝子及びBMI1遺伝子を含む、方法。 - 単離された2次幹細胞クローンの体細胞への分化誘導効率を、クローン化前の幹細胞の分化誘導効率と比較する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
- MEG3を発現する2次幹細胞クローンが単離される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記外来性遺伝子が薬剤応答性プロモーターと機能的に連結されている、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(i)の脱分化がOCT3/4、SOX2およびKLF4から成る群から選択される初期化因子の導入により実施される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 巨核球前駆細胞を製造する方法であって、
請求項1〜5に記載の方法に従い製造された2次幹細胞クローンを体細胞へ分化誘導する工程、を含む、方法。 - 血小板を製造する方法であって、
請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法に従い製造された2次幹細胞クローンを巨核前駆細胞へ分化誘導する工程、および
分化誘導された巨核球前駆細胞を巨核球細胞に成熟させ、血小板を放出させる工程、
を含む、方法。 - 前記2次幹細胞において、HLAを欠損させる工程をさらに含む、請求項7に記載の方法。
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