RU2730034C2 - Способ получения клона стволовых клеток, пригодного для индуцирования дифференцировки в соматические клетки - Google Patents
Способ получения клона стволовых клеток, пригодного для индуцирования дифференцировки в соматические клетки Download PDFInfo
- Publication number
- RU2730034C2 RU2730034C2 RU2017139241A RU2017139241A RU2730034C2 RU 2730034 C2 RU2730034 C2 RU 2730034C2 RU 2017139241 A RU2017139241 A RU 2017139241A RU 2017139241 A RU2017139241 A RU 2017139241A RU 2730034 C2 RU2730034 C2 RU 2730034C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- progenitor cells
- gene
- megakaryocyte progenitor
- genes
- Prior art date
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 132
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 113
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 52
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims description 32
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 title description 96
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 203
- 210000002361 Megakaryocyte Progenitor Cell Anatomy 0.000 claims abstract description 118
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 50
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 26
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 18
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 162
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 57
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 46
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 claims description 46
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 40
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 31
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 28
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 25
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 21
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 20
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 claims description 9
- 102100023075 Protein Niban 2 Human genes 0.000 claims description 9
- 101100022813 Zea mays MEG3 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 108091057508 Myc family Proteins 0.000 claims description 8
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 claims description 6
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 6
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 claims description 5
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000713275 Homo sapiens Solute carrier family 22 member 3 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 claims description 5
- 101100058550 Mus musculus Bmi1 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 claims description 5
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 abstract description 55
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 35
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 21
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 108700042657 p16 Genes Proteins 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 16
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 14
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 101000872170 Homo sapiens Polycomb complex protein BMI-1 Proteins 0.000 description 10
- 102100033566 Polycomb complex protein BMI-1 Human genes 0.000 description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 10
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 10
- 101710113649 Thyroid peroxidase Proteins 0.000 description 9
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 8
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101001070790 Homo sapiens Platelet glycoprotein Ib alpha chain Proteins 0.000 description 8
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 8
- 102100034173 Platelet glycoprotein Ib alpha chain Human genes 0.000 description 8
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 8
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 8
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 8
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 8
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 7
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- 101150061166 tetR gene Proteins 0.000 description 7
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 101001071312 Homo sapiens Platelet glycoprotein IX Proteins 0.000 description 6
- 102100025306 Integrin alpha-IIb Human genes 0.000 description 6
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 description 6
- 102100036851 Platelet glycoprotein IX Human genes 0.000 description 6
- -1 Ring1a / b Proteins 0.000 description 6
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 6
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 6
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 5
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 5
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 5
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 210000003924 normoblast Anatomy 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 229940123169 Caspase inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 4
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 4
- 101001080401 Homo sapiens Proteasome assembly chaperone 1 Proteins 0.000 description 4
- 229960005552 PAC-1 Drugs 0.000 description 4
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 4
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- YQNRVGJCPCNMKT-JLPGSUDCSA-N 2-(4-benzylpiperazin-1-yl)-n-[(2-hydroxy-3-prop-2-enyl-phenyl)methylideneamino]acetamide Chemical compound OC1=C(CC=C)C=CC=C1\C=N/NC(=O)CN1CCN(CC=2C=CC=CC=2)CC1 YQNRVGJCPCNMKT-JLPGSUDCSA-N 0.000 description 3
- BGFHMYJZJZLMHW-UHFFFAOYSA-N 4-[2-[[2-(1-benzothiophen-3-yl)-9-propan-2-ylpurin-6-yl]amino]ethyl]phenol Chemical compound N1=C(C=2C3=CC=CC=C3SC=2)N=C2N(C(C)C)C=NC2=C1NCCC1=CC=C(O)C=C1 BGFHMYJZJZLMHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150062914 BMI1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 3
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 3
- 101001078143 Homo sapiens Integrin alpha-IIb Proteins 0.000 description 3
- 101001139126 Homo sapiens Krueppel-like factor 6 Proteins 0.000 description 3
- 101001133600 Homo sapiens Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor Proteins 0.000 description 3
- 101710149643 Integrin alpha-IIb Proteins 0.000 description 3
- 102100020679 Krueppel-like factor 6 Human genes 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- CXAGHAZMQSCAKJ-WAHHBDPQSA-N (4s,7s)-n-[(2r,3s)-2-ethoxy-5-oxooxolan-3-yl]-7-(isoquinoline-1-carbonylamino)-6,10-dioxo-2,3,4,7,8,9-hexahydro-1h-pyridazino[1,2-a]diazepine-4-carboxamide Chemical compound CCO[C@@H]1OC(=O)C[C@@H]1NC(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H](CCC2=O)NC(=O)C=3C4=CC=CC=C4C=CN=3)N2CCC1 CXAGHAZMQSCAKJ-WAHHBDPQSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 2
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101000716729 Homo sapiens Kit ligand Proteins 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 2
- 101150039798 MYC gene Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 2
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 108010071933 benzoylcarbonyl-aspartyl-glutamyl-valyl-aspartyl-fluoromethyl ketone Proteins 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 2
- NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N di-n-propyl-acetic acid Natural products CCCC(C(O)=O)CCC NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000055151 human KITLG Human genes 0.000 description 2
- 210000000688 human artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 2
- 210000001982 neural crest cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- MSRILKIQRXUYCT-UHFFFAOYSA-M valproate semisodium Chemical compound [Na+].CCCC(C(O)=O)CCC.CCCC(C([O-])=O)CCC MSRILKIQRXUYCT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960000604 valproic acid Drugs 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SCVHJVCATBPIHN-SJCJKPOMSA-N (3s)-3-[[(2s)-2-[[2-(2-tert-butylanilino)-2-oxoacetyl]amino]propanoyl]amino]-4-oxo-5-(2,3,5,6-tetrafluorophenoxy)pentanoic acid Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)COC=1C(=C(F)C=C(F)C=1F)F)C(=O)C(=O)NC1=CC=CC=C1C(C)(C)C SCVHJVCATBPIHN-SJCJKPOMSA-N 0.000 description 1
- FKJMFCOMZYPWCO-HNNXBMFYSA-N (3s)-5-(2,6-dichlorobenzoyl)oxy-4-oxo-3-(phenylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound N([C@@H](CC(=O)O)C(=O)COC(=O)C=1C(=CC=CC=1Cl)Cl)C(=O)OCC1=CC=CC=C1 FKJMFCOMZYPWCO-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- JUNHQBJCWZVSAT-BQYQJAHWSA-N (e)-n-hydroxy-3-[1-methyl-4-(4-methylbenzoyl)pyrrol-2-yl]prop-2-enamide Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C(=O)C1=CN(C)C(\C=C\C(=O)NO)=C1 JUNHQBJCWZVSAT-BQYQJAHWSA-N 0.000 description 1
- CKKOVFGIBXCEIJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-difluorophenol Chemical compound OC1=C(F)C=CC=C1F CKKOVFGIBXCEIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQNRVGJCPCNMKT-LFVJCYFKSA-N 2-[(e)-[[2-(4-benzylpiperazin-1-ium-1-yl)acetyl]hydrazinylidene]methyl]-6-prop-2-enylphenolate Chemical compound [O-]C1=C(CC=C)C=CC=C1\C=N\NC(=O)C[NH+]1CCN(CC=2C=CC=CC=2)CC1 YQNRVGJCPCNMKT-LFVJCYFKSA-N 0.000 description 1
- GONUYDANRODTCF-IBYPIGCZSA-N 3-[[(2s)-2-[(1,3-dimethylindole-2-carbonyl)amino]-3-methylbutanoyl]amino]-5-fluoro-4-oxopentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2N(C)C(C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)CF)=C(C)C2=C1 GONUYDANRODTCF-IBYPIGCZSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 5-Azacytidine Natural products O=C1N=C(N)N=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytidine Natural products O=C1N=C(N)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 102100038511 AT-rich interactive domain-containing protein 3A Human genes 0.000 description 1
- 108010015262 Ac-AAVALLPAVLLALLAPYVAD-CHO Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 101100204304 Arabidopsis thaliana SUB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 101150017888 Bcl2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 1
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 1
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100257372 Caenorhabditis elegans sox-3 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010009540 DNA (Cytosine-5-)-Methyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036279 DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150044325 DRB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102100031690 Erythroid transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 101150099612 Esrrb gene Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000001267 GSK3 Human genes 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010014905 Glycogen Synthase Kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100031547 HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 102000011787 Histone Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010036115 Histone Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102100039996 Histone deacetylase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101100297420 Homarus americanus phc-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000808887 Homo sapiens AT-rich interactive domain-containing protein 3A Proteins 0.000 description 1
- 101000838335 Homo sapiens Dual specificity protein phosphatase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001066268 Homo sapiens Erythroid transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 101000866278 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101001035024 Homo sapiens Histone deacetylase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001056180 Homo sapiens Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000977692 Homo sapiens Iroquois-class homeodomain protein IRX-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 description 1
- 101000595669 Homo sapiens Pituitary homeobox 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000692455 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor beta Proteins 0.000 description 1
- 101000799461 Homo sapiens Thrombopoietin Proteins 0.000 description 1
- 101000694103 Homo sapiens Thyroid peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101001023770 Homo sapiens Transcription factor NF-E2 45 kDa subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000625727 Homo sapiens Tubulin beta chain Proteins 0.000 description 1
- 101000777245 Homo sapiens Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000931374 Homo sapiens Zinc finger protein ZFPM1 Proteins 0.000 description 1
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 101150047694 ID1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100026539 Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100023527 Iroquois-class homeodomain protein IRX-6 Human genes 0.000 description 1
- 101150072501 Klf2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 101710151321 Melanostatin Proteins 0.000 description 1
- 101000804949 Mus musculus Developmental pluripotency-associated protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101100519086 Mus musculus Pcgf2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100310657 Mus musculus Sox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100310648 Mus musculus Sox17 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100257376 Mus musculus Sox3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010050652 N-((1,3-dimethylindole-2-carbonyl)-valinyl)-3-amino-4-oxo-5-fluoropentanoic acid Proteins 0.000 description 1
- 108700026495 N-Myc Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102100030124 N-myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101150072008 NR5A2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 102400000064 Neuropeptide Y Human genes 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 102100036090 Pituitary homeobox 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010035030 Platelet Membrane Glycoprotein IIb Proteins 0.000 description 1
- 102100026547 Platelet-derived growth factor receptor beta Human genes 0.000 description 1
- 102100027583 Proteasome assembly chaperone 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 1
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 1
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150001847 Sox15 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 description 1
- 101150111019 Tbx3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102100035412 Transcription factor NF-E2 45 kDa subunit Human genes 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N Trichostatin A Natural products ONC(=O)C=CC(C)=CC(C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102100024717 Tubulin beta chain Human genes 0.000 description 1
- 102100033254 Tumor suppressor ARF Human genes 0.000 description 1
- 102100031278 Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 1
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 1
- GBJVAVGBSGRRKN-JYEBCORGSA-N Z-DEVD-FMK Chemical compound COC(=O)C[C@@H](C(=O)CF)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(=O)OC)NC(=O)[C@H](CC(=O)OC)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 GBJVAVGBSGRRKN-JYEBCORGSA-N 0.000 description 1
- 102100020993 Zinc finger protein ZFPM1 Human genes 0.000 description 1
- 108010091550 acetyl-AAVALLPAVLLALLAP-DEVD-CHO Proteins 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- BKSBJYSNALKVEA-ZDUSSCGKSA-N benzyl (3s)-5-chloro-3-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-4-oxopentanoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC(=O)OCC1=CC=CC=C1 BKSBJYSNALKVEA-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- ACMIMPKMLMDEEA-WMEOFMBSSA-N chembl196271 Chemical compound N([C@H]1CCC=2C=CC=C3C[C@H](N(C1=O)C3=2)C(=O)NC(CC(=O)O)C(=O)CF)C(=O)OCC1=CC=CC=C1 ACMIMPKMLMDEEA-WMEOFMBSSA-N 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 1
- VFHVQBAGLAREND-UHFFFAOYSA-N diphenylphosphoryl-(2,4,6-trimethylphenyl)methanone Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1C(=O)P(=O)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 VFHVQBAGLAREND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003968 dna methyltransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229950000234 emricasan Drugs 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 102000053400 human TPO Human genes 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 108010028309 kalinin Proteins 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- MXOOUCRHWJYCAL-ZETCQYMHSA-N methyl (3s)-5-fluoro-3-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-4-oxopentanoate Chemical compound COC(=O)C[C@@H](C(=O)CF)NC(=O)OC(C)(C)C MXOOUCRHWJYCAL-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 239000003697 methyltransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108091072810 miR-294 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091076076 miR-295 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091030789 miR-302 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 1
- 239000002829 mitogen activated protein kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- FMURUEPQXKJIPS-UHFFFAOYSA-N n-(1-benzylpiperidin-4-yl)-6,7-dimethoxy-2-(4-methyl-1,4-diazepan-1-yl)quinazolin-4-amine;trihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.C=12C=C(OC)C(OC)=CC2=NC(N2CCN(C)CCC2)=NC=1NC(CC1)CCN1CC1=CC=CC=C1 FMURUEPQXKJIPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLKSOXEVRYIRD-UHFFFAOYSA-N n-phenylquinazolin-2-amine Chemical class N=1C=C2C=CC=CC2=NC=1NC1=CC=CC=C1 AHLKSOXEVRYIRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- URPYMXQQVHTUDU-OFGSCBOVSA-N nucleopeptide y Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 URPYMXQQVHTUDU-OFGSCBOVSA-N 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UQOQENZZLBSFKO-POPPZSFYSA-N prostaglandin J2 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](C\C=C/CCCC(O)=O)C=CC1=O UQOQENZZLBSFKO-POPPZSFYSA-N 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 235000011649 selenium Nutrition 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N trichostatin A Chemical compound ONC(=O)/C=C/C(/C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0644—Platelets; Megakaryocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/602—Sox-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/603—Oct-3/4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/604—Klf-4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/606—Transcription factors c-Myc
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/04—Immortalised cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения клонов вторичных стволовых клеток из клеток-предшественников мегакариоцитов, предусматривающему дедифференцировку клеток-предшественников мегакариоцитов для образования колонии стволовых клеток, а также выделения из нее вторичных стволовых клеток. Также раскрыт способ получения клеток-предшественников мегакариоцитов, предусматривающий индукцию дифференцировки выделенных клонов вторичных стволовых клеток в клетки-предшественники мегакариоцитов. Изобретение также относится к способу получения тромбоцитов, предусматривающему обеспечение созревания индуцированных к дифференцировке клеток-предшественников мегакариоцитов в мегакариоциты и высвобождения тромбоцитов. Изобретение позволяет эффективно получать тромбоциты из клеток-предшественников мегакариоцитов. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл., 3 пр.
Description
Область техники
[0001] Настоящее изобретение относится, например, к способу получения клеточной популяции, произошедшей от единичной клетки, а именно клонированию, стволовых клеток или соматических клеток, состоящих из различных популяций, посредством использования репрограммирования соматических клеток.
Предшествующий уровень техники
[0002] Клонирование является важным этапом в развитии клеточных линий, и это клонирование стандартно проводили с использованием метода серийных разведений.
[0003] Хотя клетки превращают в желаемый тип клеток посредством введения экзогенного гена внутрь клеток (патентный документ 1, непатентные документы 1 и 2), полученные клетки не являются единообразными вследствие таких факторов, как различия в числе копий введенного экзогенного гена или различия во введенном сайте в хромосоме. Таким образом, хотя считается, что клонирование возможно произвести в соответствии с методом предельных разведений, этот метод предельных разведений необязательно может быть применен ко всем клеткам.
[0004] Кроме того, поскольку клетки, полученные посредством введения экзогенного гена, с низкой вероятностью обеспечивают возможность получить желаемые клетки снова, даже если предпринимаются попытки получить клетки тем же способом, в случае, когда клетки, требуют манипуляций с генами, таких как гомологичная рекомбинация, существуют ограничения клеточных типов, позволяющих произвести эту манипуляцию.
[0005] Хотя была предложена заместительная терапия, которая включает индуцированное превращение в T-лимфоциты из iPS клеток посредством репрограммирования T-лимфоцитов, сохраняющих желаемый TCR тип (патентный документ 2 или непатентный документ 3), эту терапию не проводят в целях клонирования или манипуляций с генами.
Список ссылок
Патентные документы
[0006] Патентный документ 1: WO 2014/148646
Патентный документ 2: WO 2011/096482
Непатентные документы
[0007] Непатентный документ 1: Nakamura S, et al, Cell Stem Cell. 14:535-548, 2014
Непатентный документ 2: Tanaka A, et al, PLoS One. 8:e61540, 2013
Непатентный документ 3: Nishimura T, et al., Cell Stem Cell. 12(1):114-126, 2013
Сущность изобретения
Техническая проблема
[0008] Целью настоящего изобретения является получить клеточную популяцию, происходящую из единичной клетки, а именно клонирование, стволовых клеток или соматических клеток, состоящих из различных популяций.
Решение проблемы
[0009] Когда изобретатели настоящего изобретения выделили стволовые клетки, имеющие ген, связанный с индуцированием дифференцировки в соматические клетки, входящий в состав их хромосомы, из колонии стволовых клеток, полученных посредством одного или множества раундов дедифференцировки, было обнаружено, что выделенные стволовые клетки пригодны для индуцирования дифференцировки в соматические клетки, таким образом, приводя к исполнению настоящего изобретения.
[0010] А именно, настоящее изобретение относится к изобретениям, указанным ниже.
[A1] Способ получения клона стволовых клеток, который содержит этапы:
(i) введения в стволовые клетки экзогенного гена, связанного с индукцией дифференцировки в соматические клетки;
(ii) индукция дифференцировки стволовых клеток, в которые введен экзогенный ген, в соматические клетки;
(iii) дедифференцировка индуцированных к дифференцировке соматических клеток; и
(iv) выделение стволовых клеток, несущих экзогенный ген, введенный в их хромосому, из колонии стволовых клеток, образованных на этапе (iii).
[A2] Способ, описанный в [A1], где эффективность индукции дифференцировки изолированных клонов стволовых клеток в соматические клетки выше по сравнению с индукцией стволовых клеток перед клонированиемм.
[A3] Способ, описанный в [A1] или [A2], где соматическими клетками являются гемопоэтические клетки-предшественники, мегакариоцитарные клетки-предшественники, эритробласты, нервные клетки, нейральные стволовые клетки, клетки нервного гребня, миокардиальные клетки, клетки скелетных мышц, хондроциты, гепатоциты или меланоциты.
[A4] Способ, описанный в [A3], где соматические клетки являются клетками-предшественниками мегакариоцитов, и экзогенный ген, связанный с индукцией дифференцировки, является, по меньшей мере, одним экзогенным геном, выбранным из группы, состоящей из онкогенов, включая гены семейства MYC, гены (поликомб гены), ингибирующие экспрессию гена p16 или гена p19, включая Bmi1, и гены, подавляющие апоптоз, включая ген BCL-XL.
[A5] Способ, описанный в любом из пунктов от [A1] до [A4], где выделяют стволовые клетки, экспрессирующие MEG3.
[A6] Способ, описанный в любом из пунктов от [A1] до [A5], где экзогенный ген, связанный с индукцией дифференцировки, функционально связан с отвечающим на препарат промотором.
[A7] Способ, описанный в любом из пунктов от [A1] до [A6], где дедифференцировку на этапе (iii) проводят посредством введения репрограммирующего фактора, выбранного из группы, состоящей из OCT3/4, SOX2 и KLF4.
[A8] Способ получения соматических клеток, который содержит этап:
индукции дифференцировки клонов стволовых клеток, полученных в соответствии со способом, описанным в любом из пунктов от [A1] до [A7], в соматические клетки.
[A9] Способ получения тромбоцитов, который содержит этапы:
индукции дифференцировки клонов стволовых клеток, полученных в соответствии со способом, описанным в любом из пунктов от [A1] до [A6] в клетки-предшественники мегакариоцитов; и
обеспечения созревания индуцированных к дифференцировке клеток-предшественников мегакариоцитов в мегакариоциты и высвобождения тромбоцитов.
[A10] Способ, описанный в [A9], где у полученных тромбоцитов отсутствует HLA.
[0011] [B1] Способ клонирования соматических клеток, который содержит этапы, указанные ниже, где стволовые клетки получают посредством экспрессии экзогенного гена:
(i) образование колонии стволовых клеток посредством введения репрограммирующего фактора в соматические клетки, несущие экзогенный ген, функционально связанный с отвечающим на препарат промотором, встроенным в их хромосому;
(ii) выделение колонии стволовых клеток, полученных на этапе (i); и
(iii) индуцирование стволовых клеток, содержащихся в колонии стволовых клеток, изолированной на этапе (ii), к дифференцировке в соматические клетки посредством контактирования клеток на любой стадии дифференцировки из стволовых клеток в соматические клетки с соответствующим лекарством.
[B2] Способ, описанный в [B1], где соматические клетки являются клетками-предшественниками мегакариоцитов, и экзогенный ген является, по меньшей мере, одним геном, выбранным из группы, состоящей из генов семейства MYC, генов поликомб и генов, подавляющих апоптоз.
[B3] Способ, описанный в [B2], где этап (iii) содержит этапы:
(a) индуцирования стволовых клеток, содержащихся в колонии стволовых клеток, изолированных на этапе (ii), к дифференцировке в гемопоэтические клетки-предшественники; и
(b) контактирования гемопоэтических клеток-предшественников, полученных на этапе (a), с соответствующим препаратом.
[B4] Способ, описанный в любом из пунктов от [B1] до [B3], где репрограммирующий фактор включает OCT3/4, SOX2 и KLF4.
[B5] Способ, описанный в любом из пунктов от [B1] до [B4], где отвечающий на препарат промотор является промотором, имеющим TRE последовательность, и дополнительно экспрессирует обратный tetR слитый белок, по меньшей мере, в клетках этапа (iii).
[B6] Способ, описанный в любом из пунктов от [B2] до [B5], где этап (iii) дополнительно содержит этап отбора стволовых клеток, экспрессирующих MEG3, среди стволовых клеток, содержащихся в колонии стволовых клеток, изолированной на этапе (ii).
[B7] Способ, описанный в любом из пунктов от [B1] до [B6], где этап (iii) дополнительно содержит этап, приводящий к тому, что у стволовых клеток, содержащихся в колонии стволовых клеток, изолированных на этапе (ii), отсутствует HLA.
[B8] Способ, описанный в [B7], где HLA является антигеном класса I.
[B9] Способ, описанный в [B8], где антигеном класса I является β2-микроглобулин.
[B10] Способ получения тромбоцитов, который содержит этапы:
Клонирования клеток-предшественников мегакариоцитов с применением способа, описанного в любом одном из пунктов от [B2] до [B9]; и
Обеспечения созревания клонированных клеток-предшественников мегакариоцитов в мегакариоциты и высвобождения тромбоцитов.
[B11] Способ получения HLA-дефицитных соматических клеток, который содержит этапы:
(i) образования плюрипотентных стволовых клеток посредством введения репрограммирующего фактора в соматические клетки;
(ii) инициирования того, чтобы плюрипотентные стволовые клетки, полученные на этапе (i), были дефицитными по HLA; и
(iii) индуцирование дифференцировки HLA-дефицитных плюрипотентных стволовых клеток, полученных на этапе (ii), в соматические клетки.
[B12] Способ, описанный в [B11], где репрограммирующий фактор включает OCT3/4, SOX2 и KLF4.
[B13] Способ, описанный в [B11] или [B12], где соматические клетки, применяемые на этапе (i), являются клетками-предшественниками мегакариоцитов, а клетки-предшественники мегакариоцитов являются клетками-предшественниками мегакариоцитов, полученными посредством встраивания, по меньшей мере, одного гена, который функционально связан с отвечающим на препарат промотором и выбран из группы, состоящей из генов семейства MYC, генов поликомб, и генов, подавляющих апоптоз, в их хромосоме.
[B14] Способ, описанный в [B13], где этап (iii) содержит этапы:
(A) индуцирования HLA-дефицитных плюрипотентных стволовых клеток, полученных на этапе (ii), к дифференцировке в гемопоэтические клетки-предшественники; и
(B) контактирования гемопоэтических клеток-предшественников, полученных на этапе (A), с соответствующим препаратом.
[B15] Способ, описанный в любом из пунктов от [B11] до [B14], где HLA является антигеном класса I.
[B16] Способ, описанный в [B15], где антигеном класса I является β2-микроглобулин.
[B17] Способ получения HLA-дефицитных тромбоцитов, который содержит этапы:
получения HLA-дефицитных клеток-предшественников мегакариоцитов с применением способа, описанного в любом из пунктов от [B13] до [B16], и
обеспечения созревания HLA-дефицитных клеток-предшественников мегакариоцитов в мегакариоциты и высвобождения тромбоцитов.
[B18] Клетки iPS, содержащие экзогенный онкоген, и экзогенный ген, который подавляет экспрессию гена p16 или гена p19, где соотношение содержания экзогенного гена, который подавляет экспрессию гена p16 или гена p19, и экзогенного онкогена, составляет от 2-кратного до 7-кратного.
[B19] Клетка iPS, описанная в [B18], где онкогеном является c-Myc, и геном, который подавляет экспрессию гена p16 или гена p19, является Bmi1.
[B20] Клетка-предшественник мегакариоцита, содержащая экзогенный онкоген и экзогенный ген, который подавляет экспрессию гена p16 или гена p19, где соотношение содержания экзогенного гена, который подавляет экспрессию гена p16 или гена p19, и экзогенного онкогена составляет от 2-кратного до 7-кратного.
[B21] Клетка-предшественник мегакариоцита, описанная в [B20], где онкогеном является c-Myc, и геном, который подавляет экспрессию гена p16 или гена p19, является Bmi1.
[B22] Способ отбора плюрипотентных стволовых клеток или гемопоэтических клеток-предшественников, пригодных для индукции дифференцировки клеток-предшественников мегакариоцитов, который содержит этап: отбора плюрипотентных стволовых клеток или гемопоэтических клеток-предшественников, которые экспрсессируют MEG3.
Полезные эффекты по изобретению
[0012] По настоящему изобретению, можно получать клон стволовых клеток, который является пригодным для индукции дифференцировки в соматические клетки. Кроме того, стволовые клетки, клонированные по настоящему изобретению, обладают превосходным пролиферативным потенциалом по сравнению со стволовыми клетками, клонированными в соответствии с общепринятым методом предельных разведений. Например, не только вторичные клоны клеток-предшественников мегакариоцитов, полученные в соответствии с настоящим изобретением, обладают превосходным потенциалом к клеточной пролиферации и способностью созревать в мегакариоциты по сравнению с общепринятыми клонами, мегакариоциты, полученные из этих клонов, обладают высокой способностью образовывать тромбоциты.
Краткое описание рисунков
[0013] Фиг. 1 является графиком, на котором показано число образовавшихся тромбоцитов, полученных из 22 кандидатных клонов клеток-предшественников мегакариоцитов, полученных посредством метода предельных разведений наряду с клетками-предшественниками мегакариоцитов (H+), состоящими из различных исходных популяций (фиг. 1A), и интенсивность флуоресценции вместо количества комплекса GPIIb/IIIa, образованного посредством PMA стимуляции тромбоцитов (фиг. 1B).
Фиг. 2 является графиком, на котором показаны результаты повторного измерения числа образовавшихся тромбоцитов, полученных из пяти из 22 кандидатных клонов клеток-предшественников мегакариоцитов на фиг. 1 наряду с клетками-предшественниками мегакариоцитов (H), состоящими из различных исходных популяций (фиг. 2A), и интенсивность флуоресценции вместо количества комплекса GPIIb/IIIa, образованного посредством PMA стимуляции тромбоцитов (фиг. 2B).
Фиг. 3 является графиком, на котором показаны результаты повторного измерения количеств образовавшихся тромбоцитов, полученных из 5 клонов клеток-предшественников мегакариоцитов на фиг. 2, наряду с исходными клетками-предшественниками мегакариоцитов (H) (фиг. 3A), и интенсивность флуоресценции вместо количества комплекса GPIIb/IIIa, образовавшегося посредством PMA стимуляции тромбоцитов (фиг. 3B).
Фиг. 4A является схематической диаграммой получения клеток-предшественников мегакариоцитов, клонирования посредством репрограммирующих факторов, и получения вторичных клеток-предшественников мегакариоцитов из вторичных iPS клеток. Фиг. 4B является графиком, на котором показано число копий на c-MYC или BMI1 клетку, содержащееся в хромосомах вторичных iPS клеточных клонов, полученных посредством репрограммирования клеток-предшественников мегакариоцитов.
На фиг. 5 показаны результаты применения проточного цитометра для измерения распределения клеток, экспрессирующих CD42b и CD41a, и распределения клеток, экспрессирующих CD235 и CD41a, среди клеток-предшественников мегакариоцитов, полученных из каждого вторичного клона iPS клеток.
Фиг. 6A является схематической диаграммой гомологичной рекомбинации для удаления Экзона1 β2-микроглобулина. На фиг. 6B представлены результаты PCR для подтверждения гомологичной рекомбинации во вторичных клонах iPS клеток после введения таргетного вектора.
На фиг. 7A показаны результаты применения проточного цитометра для измерения распределения клеток, экспрессирующих β2-микроглобулин и HLA в клетках-предшественников мегакариоцитов (imMKCL), полученных из вторичных клонов iPS клеток с удаленным Экзоном1 β2-микроглобулина (представлены слева), и тромбоциты, образовавшиеся из клеток-предшественников мегакариоцитов (представлены справа). На фиг. 7B показано соотношение интенсивности флуоресценции PAC1 после PMA стимуляции в тромбоцитах, образовавшихся из мегакариоцитов, полученных из вторичных клонов iPS клеток (HLA(-)) с удаленным Экзоном1 β2-микроглобулина или вторичных клонов iPS клеток (HLA(+)). Интенсивность флуоресценции представлена на основе значения 1 для тромбоцитов, полученных из вторичных клонов iPS клеток (HLA(+)).
На фиг. 8 указаны результаты сравнения уровней экспрессии гена с применением микрочипа, имеющегося в продаже в Illumina (фиг. 8A) или в Affymetrix (фиг. 8B) для вторичных клонов iPS клеток (хорошие iPS), обладающих способностью быть индуцированными к дифференцировке в клетки-предшественники мегакариоцитов, и вторичных клонов iPS клеток (плохие iPS), не обладающих способностью быть индуцированными к дифференцировке в клетки-предшественники мегакариоцитов, или гемопоэтических клеток-предшественников, полученных из вторичных клонов iPS клеток (хорошие HPC), обладающих способностью быть индуцированными к дифференцировке в клетки-предшественники мегакариоцитов, и вторичных клонов iPS клеток (плохие HPC), не способных быть индуцированными к дифференцировке в клетки-предшественники мегакариоцитов.
На фиг. 9A и 9B, соответственно, показаны кривые роста мегакариоцитов (клон 2), полученных из вторичного клона iPS клеток, и клеток-предшественников мегакариоцитов (родительские) перед клонированием, и время удвоения, рассчитанное на основе кривых роста (**: P<0.01).
На фиг. 10A и 10B, соответственно, показаны внешний вид клеток и изменения размера клеток до и после созревания мегакариоцитов (клон 2), полученных из вторичного клона iPS клеток, и клеток-предшественников мегакариоцитов (родительские) перед клонированием.
Фиг. 11 является графиком, сравнивающим количества протромбоцитов, которые являются прогениторами образовавшихся тромбоцитов.
Описание вариантов осуществления
[0014] Способ получения клона стволовых клеток по настоящему изобретению содержит этапы:
(i) введения в стволовые клетки экзогенного гена, связанного с индукцией дифференцировки в соматические клетки;
(ii) индукции дифференцировки стволовых клеток, в которые введен экзогенный ген, в соматические клетки;
(iii) дедифференцировки индуцированных к дифференцировке соматических клеток; и
(iv) выделения стволовых клеток, несущих экзогенный ген, встроенный в их хромосому, из колонии стволовых клеток, образовавшихся на этапе (iii).
[0015] Изолированные клоны стволовых клеток являются более пригодными для того, чтобы быть индуцированными к дифференцировке в соматические клетки по сравнению со стволовыми клетками перед клонированием, и имеют высокую эффективность, чтобы быть индуцированными к дифференцировке в соматические клетки, в пересчете на клетку.
[0016] В одном из вариантов осуществления, способ получения клона стволовых клеток по настоящему изобретению может включать этапы:
(i) образования колонии стволовых клеток посредством введения репрограммирующего фактора в соматические клетки, несущие экзогенный ген, функционально связанный с отвечающим на препарат промотором, встроенным в их хромосому; и
(ii) выделения колонии стволовых клеток, полученных на этапе (i).
[0017] Полученный клон стволовых клеток может быть дополнительно индуцирован к дифференцировке в соматическую клетку. Индукцию дифференцировки может проводить специалист в данной области посредством подходящего отбора способа, пригодного для индукции дифференцировки в желаемую соматическую клетку, и она может не быть ограничена конкретным способом, и может дополнительно включать этап:
(iii) индуцирования стволовых клеток, содержащихся в колонии стволовых клеток, изолированных на этапе (ii), к дифференцировке в соматические клетки посредством контакта клеток на любой стадии дифференцировки из стволовых клеток в соматические клетки с применением соответствующего препарата.
[0018] В настоящем изобретении клонирование относится к клонированию клеточной популяции в смысле выделения клеточной популяции, имеющей однообразную генетическую информацию, из клеточной популяции, имеющей не однообразную генетическую информацию.
[0019] Соматические клетки, представленные для клонирования
В настоящем изобретении нет никаких конкретных ограничений в отношении соматических клеток, представленных для клонирования (обозначаемых как первичные соматические клетки), в случаях, когда клетки получены посредством встраивания гена, функционально связанного с отвечающим на препарат промотором, в их хромосому, и их примеры включают нервные клетки (WO 2014/148646, Wapinski OL et al, Cell. 155:621-635, 2013), нейральные стволовые клетки (Han DW et al, Cell Stem Cell. 10:465-472, 2012), клетки нервного гребня (Kim YJ, et al, Cell Stem Cell. 15:497-506, 2014), миокардиальные клетки (Ieda M et al, Cell. 142:375-386, 2010), клетки скелетных мышц (Tanaka A, et al, PLoS One. 8:e61540, 2013), хондроциты (Outani H, et al, PLoS One. 8:e77365, 2013), гепатоциты (Huang P, et al, Cell Stem Cell. 14:370-384, 2014), меланоциты (Yang R, et al, Nat Commun. 5:5807, 2014), гемопоэтические клетки-предшественники (Batta K, Cell Rep. 9:1871-84, 2014), эритробласты (Hirose S, et al, Stem Cell Reports. 1:499-508, 2013) и клетки-предшественники мегакариоцитов (Nakamura S, et al, Cell Stem Cell. 14:535-548, 2014).
[0020] В настоящем изобретении, клетки-предшественники мегакариоцитов являются пригодными в качестве соматических клеток, клонированных в соответствии со способом по настоящему изобретению, ввиду того, что они не могут быть клонированными посредством метода предельных разведений. Эритробласты также являются пригодными в качестве соматических клеток в настоящем изобретении. Однако, ввиду того, что соматические клетки, отличные от этих клеток, также позволяют получить клоны стволовых клеток, несущие экзогенный ген, связанный с индукцией дифференцировки в желаемые соматические клетки, введенный в их хромосому, соматические клетки не ограничены клетками-предшественниками мегакариоцитов и эритробластами.
[0021] Экзогенный ген, связанный с индукцией дифференцировки в соматические клетки, в настоящем изобретении относится в широком смысле к гену, введенному в клетку, при индукции дифференцировки из стволовой клетки в соматическую клетку. Объясняя это, ген, при использовании в качестве примера случая соматических клеток, являющихся клетками-предшественниками мегакариоцитов, ген, связанный с индукцией дифференцировки, может быть, по меньшей мере, одним геном, выбранным из группы, состоящей из онкогенов, предпочтительно членом семейства генов MYC и более предпочтительно c-Myc, генами, подавляющими экспрессию гена p16 или гена p19 (гены поликомб) и предпочтительно Bmi1, и генами, подавляющими апоптоз, и предпочтительно геном BCL-XL. При использовании в качестве примера случая соматических клеток, являющихся эритробластами, ген, связанный с индукцией дифференцировки, может быть, по меньшей мере, одним геном, выбранным из группы, состоящей из онкогенов, предпочтительно членом семейства генов MYC и более предпочтительно c-Myc, и генами, подавляющими апоптоз, и предпочтительно геном BCL-XL. Экзогенный ген, связанный с индукцией дифференцировки в соматические клетки, может быть функционально связанным с отвечающим на препарат промотором.
[0022] В настоящем изобретении, отвечающий на препарат промотор относится к промотору, который экспрессирует ген в присутствии или отсутствии соответствующего препарата. Примером промотора, который экспрессирует ген в присутствии соответствующего препарата, является TRE промотор (CMV минимальный промотор, несущий Tet отвечающую последовательность, включая семь повторов tet0 последовательности). В случае использования TRE промотора, предпочтительно применяют систему, в которой экспрессия гена индуцирована в присутствии соответствующего препарата (такого как тетрациклин или доксициклин) посредством одновременно экспрессирующегося слитого белка (обратный tetR слитый белок) обратного tetR (rtetR) и VP16AD в тех же клетках. В случае использования обратного tetR слитого белка, необходимо, чтобы слитый белок, по меньшей мере, экспрессировался на "этапе индукции дифференцировки из стволовых клеток во вторичные соматические клетки", которые будут описаны далее. Например, посредством функционально связывающего гена, кодирующего обратный tetR слитый белок к отвечающему на препарат промотору и введения этого гена при получении первичных соматических клеток, обратный tetR слитый белок можно экспрессировать посредством добавления или удаления соответствующего препарата на "этапе индукции дифференцировки из стволовых клеток во вторичные соматические клетки". В случае функционально связанного отвечающего на препарат промотора с двумя или более типами генов, тот же тип отвечающего на препарат промотора можно использовать для всех генов или можно использовать два или более типов отвечающих на препарат промоторов.
[0023] Способ получения первичных клеток-предшественников мегакариоцитов
[0024] В настоящем изобретении, "клетки-предшественники мегакариоцитов" относятся к клеткам, которые становятся мегакариоцитами в результате созревания. Эти клетки не являются многоядерными, и включают клетки, характеризующиеся как CD41a-положительные/CD42a-положительные/CD42b-слабо положительные. Клетки-предшественники мегакариоцитов по настоящему изобретению являются предпочтительно клетками, которые можно выращивать посредством экспансивного культивирования, такими, как клетки, способные претерпевать экспансивное культивирование в течение, по меньшей мере, 60 дней при подходящих условиях. В настоящем изобретении, клетки-предшественники мегакариоцитов могут или могут не быть клонированными, и хотя нет конкретных ограничений относительно этого, те, которые были клонированы, обозначаются как клеточная линия предшественников мегакариоцитов. Клетки-предшественники мегакариоцитов в настоящем изобретении могут быть получены из гемопоэтических клеток-предшественников.
[0025] В настоящем изобретении, "мегакариоциты", которые также обозначают как клетки-предшественники и мегакариоцитарные клетки, являются клетками, которые продуцируют тромбоциты посредством отделения от их цитоплазмы, могут быть мультиядросодержащими клетками, и включают клетки, характеризующиеся как, например, CD41a-положительные/CD42a-положительные/CD42b-положительные. Кроме того, мегакариоциты могут также быть охарактеризованы как клетки, экспрессирующие GATA1, FOG1, NF-E2 и β1-тубулин. Многоядерные мегакариоциты относятся к клеткам или группе клеток, в которых число ядер претерпело относительное увеличение по сравнению с клетками-предшественниками мегакариоцитов. Например, в случае когда ядра клеток-предшественников мегакариоцитов, к которым применяют способ по настоящему изобретению, представляют собой 2N, клетки, в которых ядра представляют собой 4N или более, являются многоядерными мегакариоцитами. Кроме того, в настоящем изобретении, мегакариоциты могут быть иммортализованы в форме мегакариоцитарной клеточной линии или могут быть клонированной группой клеток.
[0026] В настоящем изобретении, гемопоэтические клетки-предшественники (HPC) относятся к клеткам, способным дифференцироваться в клетки крови, такие как лимфоциты, эозинофилы, нейтрофилы, базофилы, эритроциты или мегакариоциты, и в настоящем изобретении, нет разделения между гемопоэтическими клетками-предшественниками и гемопоэтическими стволовыми клетками, и это относится к одним и тем же клеткам, если не указано иначе. Гемопоэтические стволовые клетки/клетки-предшественники могут быть распознаны посредством, например, положительного признака для поверхностных антигенов, CD34 и/или CD43. В настоящем изобретении, гемопоэтические стволовые клетки также могут быть применены к гемопоэтическим клеткам-предшественникам, которые были индуцированы к дифференцировке из плюрипотентных стволовых клеток или гемопоэтических стволовых клеток, а также клеток-предшественников, полученных из плацентарной крови, крови костного мозга или периферической крови. Например, в случае применения плюрипотентных стволовых клеток, гемопоэтические клетки-предшественники можно получать из сетеподобной структуры (ES-мешок или iPS-мешок), полученной посредством культивирования плюрипотентных стволовых клеток на C3H10T1/2 в присутствии VEGF в соответствии со способом, описанным в Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830 (2010). Здесь, "сетеподобная структура" относится к трехмерной мешкоподобной структуре (имеющей пространство внутри), полученной из плюрипотентных стволовых клеток, которая образована посредством популяции эндотелиальных клеток или подобных клеток и содержит гемопоэтические клетки-предшественники в своей внутренней части. Другие примеры способов, применяемых для индукции дифференцировки из плюрипотентных стволовых клеток в гемопоэтические клетки-предшественники, включают способ, в котором применяют образование эмбриоидного тела и добавление цитокина (Chadwick et al. Blood 2003, 102: 906-15, Vijayaragavan et al. Cell Stem Cell 2009, 4: 248-62, Saeki et al. Stem Cells 2009, 27: 59-67), и способ, включающий со-культивирование со стромальными клетками, полученными из различных видов (Niwa et al. J Cell Physiol. 2009 Nov;221(2):367-77.).
[0027] Примеры плюрипотентных стволовых клеток включают оплодотворенные яйцеклетки и такие клетки, как эмбриональные стволовые клетки (ES клетки), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS клетки) или эмбриональные половые клетки (EG клетки). Клетки-предшественники мегакариоцитов, служащие в качестве соматических клеток, по настоящему изобретению являются предпочтительно теми, которые были индуцированы посредством этапа культивирования клеток посредством сверхэкспрессии онкогена, гена, подавляющего экспрессию гена p16 или ген p19 (поликомб ген), и/или гена, подавляющего апоптоз в гемопоэтических клетках-предшественниках.
[0028] В настоящем изобретении, "онкоген" относится к гену, который вызывает злокачественную трансформацию нормальных клеток в результате экспрессии, их структура или функция, являющиеся отличными от структуры и функции нормальных клеток, и их примеры включают гены семейства MYC, гены семейства Src, гены семейства Ras, гены семейства Raf, гены семейства c-Kit и протеинкиназ, такие как PDGFR или Abl. Примеры генов семейства MYC включают c-MYC, N-MYC и L-MYC. Гены c-MYC относятся, например, к генам, состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в NCBI, номер доступа. NM 002467. Кроме того, c-MYC гены включают их гомологи, и гомологи генов c-MYC относятся к генам, для которых, например, их cDNA последовательность состоит из последовательности, которая является по существу идентичной последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в NCBI, номер доступа NM 002467. cDNA, состоящая из последовательности, по существу идентичной последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в NCBI, номер доступа NM 002467, относится к DNA, состоящей из последовательности, имеющей идентификацию приблизительно 60% или более, предпочтительно приблизительно 70% или более, более предпочтительно приблизительно 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 98%, и наиболее предпочтительно приблизительно 99%, с DNA, состоящей из последовательности, представленной в NCBI, номер доступа NM 002467, или DNA, способной гибридизоваться при жестких условиях с DNA, состоящей из последовательности, комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в NCBI, номер доступа NM 002467, с белком, кодируемым этими DNA, способствуя экспансии клеток, таких как гемопоэтические клетки-предшественники, которые находятся на стадии дифференцировки.
[0029] Здесь, жесткие условия относятся к условиям гибридизации, легко определяемым специалистом в данной области, которые, как правило, являются эмпирическими экспериментальными условиями, зависящими от длины зонда, температуры отмывки и концентрации соли. В основном, температура для надлежащего отжига становится выше с увеличением длины зонда, и температура становится ниже с уменьшением длины зонда. Образование гибрида, как правило, зависит от способности комплементарной цепи претерпевать повторный отжиг во внешней среде при температуре немного ниже, чем температура их плавления.
[0030] Например, пример в незначительной степени жестких условий включает отмывку при 0,1 х SSC в 0,1% растворе SDS при температурных условиях от 37°C до 42°C во время стадии отмывки фильтра после гибридизации. Кроме того, пример в высокой степени жестких условий включает отмывку при 5 х SSC в 0,1% растворе SDS при 65°C во время стадии отмывки. Полинуклеотиды более высокой гомологии можно получать посредством использования в более высокой степени жестких условий.
[0031] В настоящем изобретении, поскольку является предпочтительным подавлять уровень экспрессии c-MYC, c-MYC может быть таким, который кодирует белок, слитый с дестабилизирующим доменом. Можно использовать дестабилизирующий домен, приобретенный в ProteoTuner или Clontech Laboratories, Inc.
[0032] В настоящем изобретении, примеры «генов, подавляющих экспрессию гена p16 или ген p19» включают BMI1, Id1, Mel18, Ring1a/b, Phc1/2/3, Cbx2/4/6/7/8, Ezh2, Eed, Suz12, HDAC и Dnmt1/3a/3b. Ген BMI1 относится, например, к гену, состоящему из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в NCBI, номер доступа NM 005180. Кроме того, ген BMI1 включает его гомологи, и гомологи гена BMI1 относятся к генам, для которых их последовательность cDNA состоит из последовательности по существу идентичной последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в NCBI, номер доступа NM 005180. cDNA, состоящая из последовательности, по существу идентичной последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в NCBI, номер доступа NM 005180, относится к DNA, состоящей из последовательности, имеющей идентификацию приблизительно 60% или более, предпочтительно приблизительно 70% или более, более предпочтительно приблизительно 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 98%, и наиболее предпочтительно приблизительно 99%, с DNA, состоящей из последовательности, представленной в NCBI, номер доступа NM 005180, или DNA, способной гибридизоваться при жестких условиях с DNA, состоящей из последовательности, комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в NCBI, номер доступа NM 005180, с белком, кодируемым DNA, стимулирующим экспансию клеток посредством подавления старения клеток, способных к индуцированию онкогенов, присутствующих в клетках, которые экспрессируются онкогенами, такими как гены семейства MYC.
[0033] В настоящем изобретении, "гены, подавляющие апоптоз" относятся к генам, которые подавляют апоптоз, в отношении них нет никаких ограничений, и их примеры включают ген BCL2 ген, ген BCL-XL, сурвивин и MCL1. Ген BCL-XL относится к гену, состоящему из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в NCBI, номер доступа NM 001191 или NM 138578. Кроме того, ген BCL-XL включает их гомологи, и гомологи гена BCL-XL относятся к генам, для которых, например, их cDNA последовательность состоит из последовательности, которая по существу идентична последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в NCBI, номер доступа NM 001191 или NM 138578. cDNA, состоящая из последовательности, по существу идентичной последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в NCBI, номер доступа NM 001191 или NM 138578 относится к DNA, состоящей из последовательности, имеющей идентификацию приблизительно 60% или более, предпочтительно приблизительно 70% или более, более предпочтительно приблизительно 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 98%, и наиболее предпочтительно приблизительно 99%, с DNA, состоящей из последовательности, представленной в NCBI, номер доступа NM 001191 или NM 138578, или DNA, способной гибридизоваться при жестких условиях с DNA, состоящей из последовательности, комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в NCBI, номер доступа NM 001191 или NM 138578, с белком, кодируемым этой DNA, обладающим эффектом подавления апоптоза.
[0034] В настоящем изобретении, способ для сверхэкспрессирующих указанных выше генов в гемопоэтических клетках-предшественниках предпочтительно реализован посредством встраивания гена, функционально связанного с отвечающим на препарат промотором в его хромосоме, и может быть достигнут посредством, например, введения экспрессирующего вектора, содержащего ген, функционально связанный с отвечающим на препарат промотором, в гемопоэтическую клетку-предшественник. Примеры векторов, экспрессирующих эти гены, которые можно использовать, включают ретровирус, лентивирус и другие вирусные векторы, а также экспрессионные плазмиды животных клеток (такие как pA1-11, pXT1, pRc/смV, pRc/RSV или pcDNAI/Neo). Ретровирусные векторы или лентивирусные векторы применяют предпочтительно с точки зрения встраивания в хромосому.
[0035] В дополнение к промотору, экспрессирующий вектор может содержать энхансер, дополнительный сигнал поли(A), селективный маркерный ген или SV40 источник репликации и т.п. Примеры пригодных селективных маркерных генов включают ген дигидрофолат редуктазы, ген устойчивости к неомицину и ген устойчивости к пуромицину.
[0036] В настоящем изобретении, полицистронный вектор, в котором гены соединены в продольном направлении, можно получать, чтобы ввести множество генов одновременно. Чтобы обеспечить полицистронную экспрессию, последовательность 2A саморасщепляющегося пептида вируса ног и рта (ссылка, например, на Science, 322, 949-953, 2008), или IRES (внутренний участок связывания рибосомы), может быть пришит между множеством сверхэкспрессированных генов.
[0037] В настоящем изобретении, в случае вирусного вектора, способ введения экспрессирующего вектора в гемопоэтические клетки-предшественники можно производить посредством введения плазмиды, содержащей нуклеиновую кислоту, в подходящие упаковывающие клетки (такие как Plat-E клетки) или дополняющую клеточную линию (такую как клетки 293) с последующим восстановлением вируса, продуцированного в супернатант клеточной культуры, и инфицированием гемопоэтических клеток-предшественников посредством контакта с вирусом. В случае невирусного вектора, плазмидный вектор может быть введен в клетки посредством использования такого способа, как липофекция, липосомальный способ, электропорация, co-осаждение фосфата кальция, DEAE-декстран способ, микроинъекция или генная пушка.
[0038] В одном из аспектов способа для индуцирования клеток-предшественников мегакариоцитов по настоящему изобретению, ген, подавляющий апоптоз, может быть сверхэкспрессирован после сверхэкспрессирования онкогена или гена, подавляющего экспрессию гена p16 или гена p19 в гемопоэтических клетках-предшественниках. Сверхэкспрессию гена, подавляющего апоптоз, можно проводить таким же образом, как описано выше, посредством введения экспрессионного вектора, белка, кодируемого этими генами, или RNA, кодирующей эти гены, в гемопоэтические клетки-предшественники. В случае последующей экспрессии гена, подавляющего апоптоз, хотя в отношении него нет никаких ограничений, сверхэкспрессию гена, подавляющего апоптоз, предпочтительно производят после сверхэкспрессии онкогена или гена, подавляющего экспрессию гена p16 или гена p19 в течение, по меньшей мере, 14 дней.
[0039] В настоящем изобретении, ингибитор каспазы можно приводить в контакт с гемопоэтическими клетками-предшественниками вместо сверхэкспрессирующего гена, подавляющего апоптоз, в клетках. В настоящем изобретении, ингибитор каспазы может быть любым пептидным соединением, непептидным соединением или биологическим белком. Примеры пептидных соединений включают искусственные химически синтезированные пептидные соединения, указанные в пунктах от (1) до (10) ниже.
(1) Z-Asp-CH2-DCB (молекулярная масса: 454.26)
(2) Boc-Asp(OMe)-FMK (молекулярная масса: 263.3)
(3) Boc-Asp(OBzl)-CMK (молекулярная масса: 355.8)
(4) Ac-AAVALLPAVLLALLAP-YVAD-CHO (молекулярная масса: 1990.5) (SEQ ID NO: 1)
(5) Ac-AAVALLPAVLLALLAP-DEVD-CHO (молекулярная масса: 2000.4) (SEQ ID NO: 2)
(6) Ac-AAVALLPAVLLALLAP-LEVD-CHO (молекулярная масса: 1998.5) (SEQ ID NO: 3)
(7) Ac-AAVALLPAVLLALLAP-IETD-CHO (молекулярная масса: 2000.5) (SEQ ID NO: 4)
(8) Ac-AAVALLPAVLLALLAP-LEHD-CHO (молекулярная масса: 2036.5) (SEQ ID NO: 5)
(9) Z-DEVD-FMK (Z-Asp-Glu-Val-Asp-фторметилкетон) (SEQ ID NO: 6)
(10) Z-VAD FMK
[0040] Примеры ингибиторов каспаз пептидных соединений включают: (1) VX-740 - Vertex Pharmaceuticals (Leung-Toung et al., Curr. Med. Chem. 9, 979-1002 (2002)) и (2) HMR-3480 - Aventis Pharma AG (Randle et al., Expert Opin. Investig. Drugs 10, 1207-1209 (2001)).
[0041] Примеры ингибиторов каспаз непептидных соединений включают: (1) анилинохиназолины (AQZs), AstraZeneca Pharmaceuticals (Scott et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 304, 433-440 (2003)), (2) M826 - Merck Frosst (Han et al., J. Biol. Chem. 277, 30128-30136 (2002)), (3) M867 - Merck Frosst (Methot et al., J. Exp. Med. 199, 199-207 (2004)), и (4) никотинил аспартил кетоны - Merck Frosst (Isabel et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 13, 2137-2140 (2003)).
[0042] Кроме того, примеры ингибиторов каспаз других непептидных соединений включают: (1) IDN-6556 - Idun Pharmaceuticals (Hoglen et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 309, 634-640 (2004)), (2) MF-286 и MF-867 - Merck Frosst (Los et al., Drug Discov. Today 8, 67-77 (2003)), (3) IDN-5370 - Idun Pharmaceuticals (Deckwerth et al., Препарат Dev. Res. 52, 579-586 (2001)), (4) IDN-1965 - Idun Pharmaceuticals (Hoglen et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 811-818 (2001)), и (5) VX-799 - Vertex Pharmaceuticals (Los et al., Drug Discov. Today 8, 67-77 (2003)). Другие примеры ингибиторов каспаз включают M-920 и M-791 - Merck Frosst (Hotchkiss et al., Nat. Immunol. 1, 496-501 (2000)).
[0043] В настоящем изобретении, ингибитором каспазы является предпочтительно Z-VAD FMK. В случае применения Z-VAD FMK для ингибитора каспазы, Z-VAD FMK добавляют к среде, в которой культивируют гемопоэтические клетки-предшественники. Предпочтительная концентрация Z-VAD FMK в среде составляет, например, 10 мкM или более, 20 мкM или более, 30 мкM или более, 40 мкM или более или 50 мкM или более, и составляет предпочтительно 30 мкM или более.
[0044] Хотя в этом отношении нет каких-либо ограничений, среду, применяемую для получения клеток-предшественников мегакариоцитов из гемопоэтических клеток-предшественников, можно получать посредством использования среды, применяемой для культивирования животных клеток, в качестве минимальной среды. Примеры минимальных сред включают среду IMDM, среду 199, минимальную поддерживающую среду Игла (EMEM), среду αMEM, модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM), среду Хэма F12, среду RPMI 1640, среду Фишера, нейроминимальную среду (Life Technologies) и их смешенную среду. Среда может содержать сыворотку или может быть свободной от сыворотки. Среда также может содержать одно или несколько веществ, таких как альбумин, инсулин, трансферрин, селен, жирные кислоты, микроэлементы, 2-меркаптоэтанол, тиол глицерин, липид, аминокислоты, L-глутамин, заменимые аминокислоты, витамины, факторы роста, соединения с низкой молекулярной массой, антибиотики, антиоксиданты, пировиноградную кислоту, буферы, неорганические соли или цитокины при необходимости. Цитокины относятся к белкам, которые стимулируют гемопоэтическую дифференцировку, и их примеры включают VEGF, TPO и SСМ. Предпочтительной средой в настоящем изобретении является среда IMDM, содержащая сыворотку, инсулин, трансферрин, серин, тиол глицерин, аскорбиновую кислоту и TPO. Среда более предпочтительно дополнительно содержит SСМ. Кроме того, в случае применения экспрессионного вектора, содержащего отвечающий на препарат промотор, соответствующий препарат, такой как тетрациклин или доксициклин, предпочтительно содержится в среде на этапе сверхэкспрессии.
[0045] В настоящем изобретении, хотя в данном отношении нет каких-либо ограничений, температурные условия для получения клеток-предшественников мегакариоцитов из гемопоэтических клеток-предшественников являются такими, что стимуляция дифференцировки в клетки-предшественники мегакариоцитов поддерживается посредством культивирования гемопоэтических клеток-предшественников при температуре 37°C или выше. Здесь, поскольку температура, которая не оказывает повреждающего действия на клетки является подходящей, температура 37°C или выше относится, например, к температуре от приблизительно 37°C до приблизительно 42°C и предпочтительно к температуре от приблизительно 37°C до приблизительно 39°C. Продолжительность культивирования при температуре 37°C или выше может быть подходящим образом определена специалистом в данной области во время мониторинга таких факторов как число клеток-предшественников мегакариоцитов. Хотя нет каких-либо конкретных ограничений на эту продолжительность, получают желаемое количество клеток-предшественников мегакариоцитов, ее примеры включают продолжительность, по меньшей мере, 6 дней или более, 12 дней или более, 18 дней или более, 24 дня или более, 30 дней или более, 42 дня или более, 48 дней или более, 54 дня или более или 60 дней или более, и предпочтительно 60 дней или более. Длинный период культивирования не представляет проблемы в отношении индукции клеток-предшественников мегакариоцитов. Кроме того, предпочтительным является подходящим образом производить субкультивирование во время периода культивирования.
[0046] Способ репрограммирования соматических клеток
В настоящем изобретении, введение репрограммирующего фактора в соматические клетки можно проводить для способа, применяемого для репрограммирования соматических клеток. Здесь, примеры репрограммирующих факторов включают гены или продукты генов, такие как Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, бета-катенин, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 или Glis1, и эти репрограммирующие факторы можно использовать в отдельности или в комбинации. Примеры комбинаций репрограммирующих факторов включают комбинации, описанные в WO 2007/069666, WO 2008/118820, WO 2009/007852, WO 2009/032194, WO 2009/058413, WO 2009/057831, WO 2009/075119, WO 2009/079007, WO 2009/091659, WO 2009/101084, WO 2009/101407, WO 2009/102983, WO 2009/114949, WO 2009/117439, WO 2009/126250, WO 2009/126251, WO 2009/126655, WO 2009/157593, WO 2010/009015, WO 2010/033906, WO 2010/033920, WO 2010/042800, WO 2010/050626, WO 2010/056831, WO 2010/068955, WO 2010/098419, WO 2010/102267, WO 2010/111409, WO 2010/111422, WO 2010/115050, WO 2010/124290, WO 2010/147395, WO 2010/147612, Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528, Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474, Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol. 26:1269-1275, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574, Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479, Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135, Feng B, et al. (2009), Nat. Cell Biol. 11:197-203, R. L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461, Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci USA. 106:8912-8917, Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643, Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503, Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74, Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100, Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720 и Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9. Более предпочтительная комбинация репрограммирующих факторов включает Oct3/4, Sox2 и Klf4.
[0047] Указанные выше репрограммирующие факторы содержат факторы, применяемые с целью усилить установление эффективности, такие как ингибиторы гистон деацетилазы (HDAC) (такие как низкомолекулярные ингибиторы наподобие вальпроевой кислоты (VPA), трихостатина A, бутирата натрия, MC 1293 или M344, ингибиторы экспрессии нуклеиновых кислот, такие как siRNA и кшРНК против HDAC (например, HDAC1 siRNA Smartpool® (Millipore), HuSH 29mer кшРНК конструкты против HDAC1 (Ori ген)), ингибиторы MEK (такие как PD184352, PD98059, U0126, SL327 или PD0325901), ингибиторы гликоген синтаза киназы-3 (такие как Bio или CHIR99021), ингибиторы DNA метил трансферазы (такие как 5-азацитидин), ингибиторы гистон метил трансферазы (такие как низкомолекулярные ингибиторы наподобие BIX-01294 или ингибиторы экспрессии нуклеиновых кислот наподобие siRNA и кшРНК против Suv39hl, Suv39h2, SetDBl или G9a), агонисты кальциевых L-каналов (такие как Bayk8644), масляная кислота, ингибиторы TGFβ или ингибиторы ALK5 (такие как LY364947, SB431542, 616453 или A-83-01), ингибиторы p53 (такие как siRNA и кшРНК против p53), ингибиторы ARID3A (такие как siRNA и кшРНК против ARID3A), miRNA, такие как miR-291-3p, miR-294, miR-295 или miR-302), Wnt сигналинг (такой как растворимые Wnt3a), нейропептид Y, простагландины (такие как простагландин E2 или простагландин J2), hTERT, SV40LT, UTF1, IRX6, GLISl, PITX2 или DMRTBl, и в настоящем описании не делают конкретных различий между репрограммирующими факторами, и эти факторы, применяемые с целью улучшить установленную эффективность.
[0048] В случае, когда репрограммирующий фактор представляет собой белок, репрограммирующий фактор может быть введен в соматические клетки посредством такого метода, как липофекция, слияние с проникающим в клетку пептидом (таким как TAT или полиаргинин, полученные из HIV), или микроинъекции.
[0049] С другой стороны, в случае, когда репрограммирующий фактор представляет собой DNA, DNA может быть введено в соматические клетки посредством вектора наподобие вируса, плазмиды или искусственной хромосомы, и посредством таких методов, как липофекция, липосомы или микроинъекция. Примеры вирусные векторы включают ретровирусный вектор, лентивирусный вектор (описан в Cell, 126, pp. 663-676, 2006; Cell, 131, pp. 861-872, 2007; Science, 318, pp. 1917-1920, 2007), аденовирусный вектор (Science, 322, 945-949, 2008), аденоассоциированный вирусный вектор и вирусный вектор Сендай (WO 2010/008054). Кроме того, примеры искусственных хромосомных векторов включают искусственные хромосомы человека (HAC), искусственные дрожжевые хромосомы (YAC) и бактериальные искусственные хромосомы (BAC, PAC). В качестве плазмид можно использовать плазмиды клеток млекопитающих (Science, 322:949-953, 2008). Векторы могут содержать контрольную последовательность, такую как промотор, энхансер, последовательность связывания рибосом, терминатор или сайт полиаденилирования, чтобы обеспечить экспрессию ядерного репрограммирующего вещества, и могут дополнительно содержать ген устойчивости к препарату (такой как ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к ампициллину или ген устойчивости к пуромицину), последовательность селективного маркера, такую как ген тимидин киназы или ген дифтерийного токсина, или ген репортерной последовательности, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), β-глюкуронидаза (GUS) или FLAG при необходимости. Кроме того, указанные выше векторы могут иметь LoxP последовательность до или после вектора, чтобы удалить гены, кодирующие репрограммирующие факторы, или и промотор, и ген, кодирующий репрограммирующий фактор, связанный с ним, после введения в соматические клетки.
[0050] В случае, когда репрограммирующий фактор находится в форме RNA, репрограммирующий фактор может быть введен в соматические клетки посредством метода, такого как липофекция или микроинъекция, и можно использовать RNA с встроенными 5-метилцитидином и псевдоуридином (TriLink Biotechnologies), чтобы ингибировать деградацию (Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630).
[0051] Примеры культуральной жидкости для клеток после репрограммирования включают DMEM, содержащую от 10% до 15% FBS, DMEM/F12 и DME культуральную жидкость (и эти культуральные жидкости могут соответствующим образом дополнительно содержать LIF, пенициллин/стрептомицин, пуромицин, L-глутамин, заменимые аминокислоты или β-меркаптоэтанол и т.п.), а также коммерчески доступные культуральные жидкости (такие как культуральная жидкость для культивирования ES клеток мыши (TX-WES культуральная жидкость, Thrombo-X), культуральная жидкость для культивирования ES клеток приматов (культуральная жидкость ES приматов/iPS клеток, ReproCELL Inc.), или среда, свободная от сыворотки (mTeSR, Stemcell Technology)).
[0052] Пример способа для культивирования клеток после репрограммирования содержит контактирование соматических клеток с репрограммирующим фактором в DMEM, содержащей 10% FBS или DMEM/F12 культуральной жидкости при 37°C в присутствии 5% CO2 и культивирование в течение приблизительно от 4 дней до 7 дней, с последующим пересевом клеток на фидерные клетки (такие как STO клетки или SNL клетки, обработанные митомицином C), и культивирование в культуральной жидкости для культивирования ES клеток приматов, содержащей bFGF, начиная через приблизительно 10 дней после контактирования соматических клеток с репрограммирующим фактором, чтобы обеспечить образование iPS-подобных колоний после от приблизительно 30 дней до приблизительно 45 дней или более от времени контакта.
[0053] Альтернативно, соматические клетки культивируют в DMEM среде, содержащей 10% FBS (которая может также подходящим образом содержать LIF, пенициллин/стрептомицин, пуромицин, L-глутамин, заменимые аминокислоты или β-меркаптоэтанол и т.п.) на фидерных клетках (таких как STO клетки или SNL клетки, обработанные митомицином C) при 37°C в присутствии 5% CO2, чтобы обеспечить образование ES-подобных колоний после от приблизительно 25 дней до приблизительно 30 дней. Репрограммированные соматические клетки предпочтительно применяют как есть вместо фидерных клеток (Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067 или WO 2010/137746), или применяют внеклеточный матрикс (такой как ламинин-5 (WO 2009/123349) или матригель (Becton, Dickinson and Company)).
[0054] Кроме того, примеры способов культивирования включают способы с применением среды, которая не содержит сыворотку (Sun N, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 106:15720-15725, 2009 или Nakagawa M, et al, Sci Rep. 4:3594, 2014). Кроме того, iPS клетки могут содержаться в условиях гипоксии (концентрация кислорода от 0,1% до 15%), чтобы повысить эффективность содержания (Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241 или WO 2010/013845).
[0055] Культуральную жидкость замещают свежей культуральной жидкостью один раз в день, начиная со 2 дня после начала культивирования во время указанного выше культивирования. Кроме того, хотя нет каких-либо конкретных ограничений в данном отношении, пример количества соматических клеток, применяемых при репрограммировании находится в диапазоне от приблизительно 5×103 до приблизительно 5×106 клеток на 10 см2 области культуральной чашки.
[0056] Этап выделения колоний стволовых клеток, полученных посредством репрограммирования соматических клеток
В настоящем изобретении, колонии стволовых клеток можно получать посредством введения репрограммирующего фактора в соматические клетки и культивирования клеток, как описано выше. В настоящем изобретении, стволовые клетки относятся к клеткам, обладающим способностью к саморепликации, которая позволяет клеткам образовывать клетки, идентичные тем клеткам посредством клеточного деления, и способностью дифференцироваться в различные типы клеток, в то же время обладая способностью пролиферировать без ограничения. Хотя нет каких-либо конкретных ограничений для стволовых клеток по настоящему изобретению, они образуют колонии, эти стволовые клетки являются плюрипотентными стволовыми клетками, обладающими способностью дифференцироваться в клетки ткани, исключая плацентарные клетки.
[0057] В настоящем изобретении, колония относится к клеточной массе, полученной из единичной клетки.
[0058] Способ клонирования по настоящему изобретению содержит этап выделения полученной колонии стволовых клеток. Это выделение можно проводить посредством подходящего сбора единичной колонии, а затем переноса в другую культуральную посуду.
[0059] iPS клетки для индуцирования клеток-предшественников мегакариоцитов
В настоящем изобретении, в случае, если соматические клетки являются клетками-предшественниками мегакариоцитов, экзогенный онкоген и экзогенный ген, подавляющий экспрессию гена p16 или ген p19, функционально связанный с отвечающим на препарат промотором, может содержаться в хромосомах клеток-предшественников мегакариоцитов, как описано ранее. В этом случае, вторичные iPS клетки, полученные посредством репрограммирования клеток-предшественников мегакариоцитов в соответствии со способом, описанным выше, сходным образом содержат экзогенный онкоген и экзогенный ген, подавляющий экспрессию гена p16 или гена p19, функционально связанный с отвечающим на препарат промотором в их хромосомах. На данный момент, соотношение содержания экзогенного гена, подавляющего экспрессию гена p16 или гена p19, функционально связанного с отвечающим на препарат промотором, и экзогенного онкогена, функционально связанного с отвечающим на препарат промотором в iPS клетках для индуцирования клеток-предшественников мегакариоцитов, составляет предпочтительно от 2-кратного до 7-кратного и более предпочтительно от 3-кратного до 5-кратного. Сходным образом, соотношение содержания экзогенного гена, подавляющего экспрессию гена p16 или гена p19, функционально связанного с отвечающим на препарат промотором, и экзогенного онкогена, функционально связанного с отвечающим на препарат промотором в клетках-предшественниках мегакариоцитов, составляет предпочтительно от 2-кратного до 7-кратного и более предпочтительно от 3-кратного до 5-кратного. Кроме того, онкоген и ген, который подавляет экспрессию гена p16 или гена p19, подходящим образом выбирают из указанных выше генов.
[0060] Этап индуцирования дифференцировки из стволовых клеток во вторичные соматические клетки
Способ клонирования по настоящему изобретению содержит этап индукции дифференцировки стволовых клеток, полученных в соответствии со способом, описанным выше, во вторичные соматические клетки. В настоящем изобретении, вторичные соматические клетки относятся к соматическим клеткам, полученным посредством репрограммирования первичных соматических клеток в стволовые клетки с последующим индуцированием к дифференцировке во вторичные соматические клетки, и первичные соматические клетки, и вторичные соматические клетки предпочтительно являются одними и теми же клетками. Настоящий этап индуцирования можно проводить посредством реэкспрессии встроенного гена. Реэкспрессию гена можно проводить посредством контактирования клеток на любой стадии дифференцировки из стволовых клеток, полученных посредством репрограммирования первичных соматических клеток, во вторичные соматические клетки с применением соответствующего препарата (в случае промотора, который экспрессирует ген в присутствии соответствующего препарата), или посредством прерывания контакта между клетками на любой стадии дифференцировки из стволовых клеток, полученных посредством репрограммирования первичных соматических клеток, во вторичные соматические клетки и соответствующего препарата (в случае промотора, который экспрессирует ген, когда соответствующий препарат удален). Например, в случае применения гибридного гена (обратный tetR) rtetR и VP16AD, ген может быть повторно экспрессирован посредством введения соответствующего препарата. "Клетки на любой стадии дифференцировки из стволовых клеток, полученные посредством репрограммирования первичных соматических клеток, во вторичные соматические клетки" могут быть любыми клетками, в которых стволовые клетки прошли через дифференцировку во вторичные соматические клетки. Таким образом, в настоящем изобретении, стволовые клетки могут быть индуцированы к дифференцировке в другие клетки перед повторной экспрессией гена, и примеры клеток, подверженных этой индукции дифференцировки, включают фибробласты и гемопоэтические клетки-предшественники. Индукцию дифференцировки в "другие клетки" можно проводить в соответствии с известными способами. В случае применения клеток-предшественников мегакариоцитов в качестве соматических клеток, описанный ранее способ индукции дифференцировки в гемопоэтические клетки-предшественники является примером способа, применяемого для индукции дифференцировки. А именно, посредством введения препарата, соответствующего среде, применяемого для индукции дифференцировки из стволовых клеток в гемопоэтические клетки-предшественники и индукции дифференцировки из ранее описанных гемопоэтических клеток-предшественников в клетки-предшественники мегакариоцитов, онкоген, ген, подавляющий экспрессию гена p16 или гена p19, и/или ген, подавляющий апоптоз, могут быть сверхэкспрессированы.
[0061] Этап отбора стволовых клеток или гемопоэтических клеток-предшественников
В настоящем изобретении, поскольку все стволовые клетки необязательно способны быть индуцированы к дифференцировке в клетки-предшественники мегакариоцитов в случае применения клеток-предшественников мегакариоцитов в качестве соматических клеток, предпочтительно соответствующим образом выбирают стволовые клетки, способные быть индуцированными к дифференцировке в клетки-предшественники мегакариоцитов, и пример способа проведения этой процедуры содержит отбор тех стволовых клеток, которые экспрессируют MEG3. В настоящем изобретении, также могут быть отобраны гемопоэтические клетки-предшественники, полученные из стволовых клеток, экспрессирующих MEG3. В настоящем изобретении, в случае людей, MEG3 относится к некодирующей RNA, состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в NCBI, номер доступа NR 002766, NR 003530, NR 003531, NR 033358, NR 033359, NR 033360, NR 046464, NR 046465, NR 046466, NR 046467, NR 046468, NR 046469, NR 046470, NR 046471, NR 046472 или NR 046473. Хотя нет каких-либо конкретных ограничений в данном отношении, стволовые клетки, к которым применяют способ по настоящему изобретению, могут быть первичными плюрипотентными стволовыми клетками и более предпочтительно являются клонами стволовых клеток, полученными в соответствии со способом описанным выше. Высокий уровень экспрессии может относиться к экспрессии на уровне, который выше, чем среднее значение в множестве одновременно измеренных стволовых клеток или гемопоэтических клеток-предшественников, или может относиться к уровню экспрессии, который выше по сравнению с экспрессией известных стволовых клеток или гемопоэтических клеток-предшественников, которые не могут быть индуцированы к дифференцировке в клетки-предшественники мегакариоцитов.
[0062] В настоящем изобретении, способ известный среди специалистов в данной области можно использовать в качестве способа подтверждения экспрессии MEG3, и его примеры включают PCR анализ с обратной транскрипцией, количественный PCR анализ с обратной транскрипцией, «нозерн»-блоттинг анализ, иммуногистохимический анализ, анализ на микрочипе и их сочетания.
[0063] Способ инициирования соматических клеток быть дефицитными по HLA и способ получения HLA-дефицитных соматических клеток
В одном из вариантов осуществления, настоящее изобретение относится к способу инициирования соматических клеток быть дефицитными по HLA, что включает следующие этапы, или способ получения HLA-дефицитных соматических клеток:
(i) образование плюрипотентных стволовых клеток посредством введения репрограммирующего фактора в соматические клетки;
(ii) инициирование плюрипотентных стволовых клеток, полученных на этапе (i) быть дефицитными по HLA; и
(iii) индуцирование HLA-дефицитных плюрипотентных стволовых клеток, полученных на этапе (ii) к дифференцировке в соматические клетки.
[0064] Соматические клетки, предоставленные для применения в способе для инициирования дефицита HLA по настоящему изобретению, применяемый репрограммирующий фактор, способ образования плюрипотентных стволовых клеток, и способ индукции плюрипотентных стволовых клеток к дифференцировке в соматические клетки являются теми же, что в случае соматических клеток, предоставленных для применения при указанном выше клонировании. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу клонирования соматических клеток и дополнительно инициированию этих клеток быть дефицитными по HLA.
[0065] В настоящем изобретении, HLA относится к человеческому лимфоцитарному антигену, и относится к антигену класса I, состоящему из α цепи и L цепи, антигену класса II, состоящему из β цепи, кодируемой геном DRB1 и α цепи, кодируемой геном DRA, и антигену класса III. Поскольку экспрессируемый HLA отличается в соответствии с соматической клеткой, HLA подлежащий удалению может подходящим образом быть выбран, и в случае применения клеток-предшественников мегакариоцитов в качестве соматических клеток, в качестве HLA предпочтительно выбирают и удаляют антиген класса I. Удаление HLA относится к удалению α цепи, L цепи или β цепи, и в случае удаления антигена класса I, предпочтительно удаляют L цепь, а именно β2-микроглобулин.
[0066] Способ инициирования хромосомы быть дефицитной по HLA в плюрипотентных стволовых клетках по настоящему изобретению можно проводить посредством подходящим образом выбранного известного способа, такого как гомологичная рекомбинация.
[0067] Способ получения тромбоцитов
Способ получения тромбоцитов по настоящему изобретению содержит этап клонирования клеток-предшественников мегакариоцитов с применением способа клонирования по настоящему изобретению, и этап обеспечения созревания клонированных клеток-предшественников мегакариоцитов в мегакариоциты и высвобождения тромбоцитов. Этап обеспечения созревания клонированных клеток-предшественников мегакариоцитов и высвобождения тромбоцитов можно проводить в соответствии с известным способом или способом, соответствующим ему. Например, в случае если клетки-предшественники мегакариоцитов содержат, по меньшей мере, один ген, выбранный из группы, состоящей из генов семейства MYC, поликомб генов и генов, подавляющих апоптоз, созревание мегакариоцитов можно проводить посредством подавления экспрессии генов семейства MYC, поликомб генов и/или генов, подавляющих апоптоз, посредством удаления соответствующего препарата из среды после указанного выше этапа (iii). Созревшие мегакариоциты становятся многоядерными и высвобождают тромбоциты.
[0068] Тромбоциты могут быть в форме препарата тромбоцитов посредством комбинирования с раствором ACD-A, FFP, цитратом натрия, лимонной кислотой или глюкозой и т.п., или могут быть в форме препарата крови посредством комбинирования с эритроцитами.
[0069] В случае получения клонов мегакариоцитов, дефицитных по HLA, в соответствии со способом, описанным выше, тромбоциты, дефицитные по HLA можно получать посредством обеспечения созревания клонов мегакариоцитов и высвобождения тромбоцитов. HLA-дефицитные тромбоциты пригодны, поскольку они могут быть перелиты безотносительно HLA типа реципиента.
[0070] Способ улучшения пролиферативной способности клеток-предшественников мегакариоцитов
Настоящее изобретение относится к способу улучшения пролиферативной способности клеток-предшественников мегакариоцитов посредством получения стволовых клеток посредством репрограммирования клеток-предшественников мегакариоцитов и последующего превращения в клетки-предшественники мегакариоцитов. Таким образом, в одном из его вариантов осуществления, способ улучшения пролиферативной способности клеток-предшественников мегакариоцитов по настоящему изобретению содержит этапы:
(i) образования колонии стволовых клеток посредством введения репрограммирующего фактора в клетки-предшественники мегакариоцитов, несущие экзогенный ген, экспрессирующийся в ответ на препарат;
(ii) выделения колонии стволовых клеток, полученных на этапе (i); и
(iii) индуцирования стволовых клеток, содержащихся в колонии стволовых клеток, изолированных на этапе (ii), к дифференцировке в клетки-предшественники мегакариоцитов, где индукция в соматические клетки содержит этап контактирования с соответствующим препаратом.
[0071] В настоящем изобретении, улучшение пролиферативной способности относится к увеличению длины теломерной последовательности в хромосоме. В настоящем изобретении, теломерная последовательность относится к повторяющейся последовательности, включая TTAGGG, и увеличение длины теломерной последовательности означает, что количество повторов увеличилось.
Примеры
[0072] Хотя далее представлено более подробное объяснение настоящего изобретения на основе примеров и тестовых примеров, настоящее изобретение не ограничено следующими примерами.
[0073] Получение клеток-предшественников мегакариоцитов
Гемопоэтические клетки-предшественники (HPC) получали посредством iPS-мешка из iPS клеток (SeV2: полученные посредством введения c-MYC, OCT3/4, SOX2 и KLF4 в неонатальные фибробласты человека с применением вирусного вектора Сендай в соответствии со способом, описанным в WO 2010/134526) в полуконфлюэнтном состоянии и поддерживали в 6 см чашке, в которой MEF рассевали в концентрации 3×105 клеток/чашку. Более конкретно, iPS клетки разделяли с применением раствора трипсина человека, и приблизительно от 1/30 до 1/50 клеток рассевали на C3H10T1/2 (доступных из Riken, Japan.), обработанных митомицином C (MMC) в форме массы колонии. Кроме того, обработанные MMC C3H10T1/2 получали посредством рассевания в 10 см чашке при концентрации 8×105 клеток/чашку в день накануне рассева iPS клеток. После рассева, культивирование начинали в минимальной среде Игла (EBM), содержащей 20 нг/мл VEGF в атмосфере 5% O2 и 5% CO2 при 37°C (день 0). Среду замещали той же средой на 3 день и 6 день.
[0074] На 7 день, культивирование продолжали в атмосфере 20% O2 и 5% CO2 при 37°C. Среду замещали той же средой на 9 день, 11 день и 13 день. На 14 день, клетки физически снимали с применением скребка для клеток или наконечника пипетки, и клетки однообразного размера вылавливали посредством пропускания через 40 микрометровое клеточное сито. Выловленные клетки подтверждали в качестве гемопоэтических клеток-предшественников (HPC) на основе клеточного размера.
[0075] На 14 день, выловленные HPC рассевали в обработанных MMC C3H10T1/2 в концентрации от 3×104 до 1×105 клеток/лунку. Для среды применяли EBM, содержащую SCF в концентрации 50 нг/мл, TPO в концентрации 50 нг/мл и доксициклин в концентрации 0,5 мкг/мл. Далее, c-MYC и BMI1 вводили в HPC с применением лентивирусного вектора. Применяемым лентивирусным вектором был индуцируемый вектор, контролируемый тетрациклином, и его получали посредством рекомбинирования mOKS кассеты LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G с c-MYC или BMI1 (LV-TRE-c-MYC-xL-Ubc-tTA-I2G или LV-TRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G, соответственно) (Nakamura S, et al, Cell Stem Cell. 14:535-548, 2014). Вирусные частицы, применяемые для инфицирования, получали посредством инфицирования 293T клеток с применением лентивирусного вектора (MOI 300). Протамин добавляли только во время инфицирования. Далее, среду заменяли через сутки, и C3H10T1/2 и среду заменяли один или два раза в неделю.
[0076] BCL-xl вводили при MOI 10 с применением лентивирусного вектора две недели после введения c-MYC и BMI1. Лентивирусным вектором, применяемым для введения BCL-xl, был индуцируемый вектор, контролируемый тетрациклином, и его получали посредством рекомбинации mOKS кассеты, чтобы содержать BCL-xl таки же образом, как описано выше (LV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2G) (Nakamura S, et al, Cell Stem Cell. 14:535-548, 2014). Протамин добавляли только во время инфицирования. Далее, культивирование производили в EBM, содержащей SCF в концентрации 50 нг/мл, TPO в концентрации 50 нг/мл и доксициклин в концентрации 0,5 мкг/мл в 10T1/2 фидерных клетках на 10 см чашке, чтобы получить клетки-предшественники мегакариоцитов (также обозначаемые как imMKCL).
Справочный пример 1
[0077] Метод предельных разведений
Клетки-предшественники мегакариоцитов (imMKCL) рассевали в 96-луночный планшет при плотности 1,5 клетки/300 мкл/лунку с последующим культивированием в течение от 10 дней до 14 дней в среде Дульбекко, модифицированной по методу Исков (IMDM), содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), SCF человека (R&D Systems) в концентрации 50 нг/мл, TPO в концентрации 50 нг/мл, доксициклин (Clontech) в концентрации 5 мг/мл и пуромицин (Sigma-Aldrich) в концентрации 2 мг/мл в атмосфере 5% CO2 при 37°C. Культивирование продолжали тем же образом после переноса содержимого каждой лунки в 24-луночный планшет и 6-луночный планшет с целью увеличить масштаб культивирования. Клетки в каждой лунке были обозначены как клоны клеток-предшественников мегакариоцитов.
[0078] Анализ клонов клеток-предшественников мегакариоцитов (первый раунд)
Каждый из клонов клеток-предшественников мегакариоцитов, полученных в соответствии со способом, описанным выше отмывали дважды с применением PBS, рассевали в 6-луночный планшет в концентрации 4×105 клеток/3 мл, и культивировали в IMDM, содержащей SCF человека в концентрации 50 нг/мл, TPO человека в концентрации 50 нг/мл, SR1 (Calbiochem) в концентрации 750 нМ и 15% FBS. Супернатант собирали 7 дней спустя с последующей оценкой количества образовавшихся тромбоцитов и функции тромбоцитов. Оценку количества образовавшихся тромбоцитов проводили образом, описанным ниже. А именно, антитела, связанные с флуоресцентным красителем, CD41 (BioLegend), CD42a (eBioscience) и CD42b (BioLegend) и йодид пропидия (Sigma-Aldrich) добавляли к культуральному супернатанту и инкубировали в течение 30 минут с последующим анализом с использованием FACSVerseO (BD Biosciences). Анализ, включая исключение клеток-предшественников мегакариоцитов на основе размера, с последующим подсчетом клеток, положительных по CD41, CD42a и CD42b и подсчет количества тромбоцитов на клетку-предшественник мегакариоцита. Оценку функции тромбоцитов проводили образом, описанным ниже. А именно, антитела, связанные с флуоресцентным красителем, CD41, CD42b и активированный гликопротеин (GP) IIb/IIIa (PAC-1; BD Biosciences) и 0,4 мМ форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA) (Sigma-Aldrich) добавляли в культуральный супернатант и инкубировали в течение 30 минут с последующим анализом с применением FACSVerseO. В анализе, уровень экспрессии активированного GP IIb/IIIa применяли для оценки посредством измерения в качестве интенсивности флуоресценции (MFI).
[0079] В результате оценки объема образования тромбоцитов и функции тромбоцитов для 22 клонов клеток-предшественников мегакариоцитов в соответствии со способом, описанным выше, подтверждали, что объем образования тромбоцитов в от 1,6 раз до 1,9 раз выше, чем контрольный (клетки-предшественники мегакариоцитов перед клонированием) для клона 1, клона 4 и клона 13 (фиг. 1A). В отношении функции тромбоцитов, наиболее высокий уровень активности был продемонстрирован клоном, 13 и было показано, что он хорошо реагирует на PMA стимуляцию по сравнению с контролем (фиг. 1B).
[0080] Анализ клонов клеток-предшественников мегакариоцитов (второй раунд)
Пять клонов (1, 2, 4, 11 и 13), которые продемонстрировали высокие объемы образования тромбоцитов и функцию тромбоцитов в результаты для первого раунда анализа были повторно подвергнуты анализу тем же образом. Только для клона 4 было подтверждено, что объем образования тромбоцитов приблизительно в 1,3 раза выше, чем контрольный (фиг. 2A). Кроме того, хотя было подтверждено, что функция тромбоцитов приблизительно в 3,7 раз выше, чем контрольная, для клона 13, результаты по функции тромбоцитов из клонов 1, 2, 4 и 11 отличались от результатов первого раунда анализа, в котором не было изменений по сравнению с контролем (фиг. 2B).
[0081] Анализ клонов клеток-предшественников мегакариоцитов (третий раунд)
Анализы проводили снова тем же образом, что для результатов второго раунда анализа. Не было изменений в объеме образования тромбоцитов в отношении контроля (фиг. 3A). Кроме того, хотя было подтверждено, что функция тромбоцитов в 1,7 раз и 1,6 раз выше, соответственно, чем в контроле для клонов 4 и 13, различия были небольшими (фиг. 3B).
[0082] В соответствии с этими результатами, было подтверждено, что клоны клеток-предшественников мегакариоцитов, полученные посредством метода предельных разведений, не демонстрируют стабильного функционирования в отношении способности образовывать тромбоциты и образованных тромбоцитов. Таким образом, было сделано предположение, что применение метода предельных разведений является непригодным для клонирования клеток-предшественников мегакариоцитов.
Пример 1
[0083] Клонирование клеток-предшественников мегакариоцитов посредством репрограммирования
iPS клетки (вторичные iPS клетки) получали посредством репрограммирования клеток-предшественников мегакариоцитов, полученных с применением описанного ранее способа с последующим произведением клонирования с применением вторичных iPS клеток и снова индуцирования дифференцировки клеток в клетки-предшественники мегакариоцитов для клонирования этих клеток (вторичные клетки-предшественники мегакариоцитов) (фиг. 4A). Далее представлено его подробное описание.
[0084] После введения четырех типов эписомальных плазмидных векторов (pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL и pCXWB-EBNA1; Okita K, et al., Stem Cells. 31:458-66, 2013 и Okita K, et al., Nat Methods. 8:409-12, 2011) в 1×106 клеток первично культивируемой клеточной линии клеток-предшественников мегакариоцитов посредством электропорации с использованием Amaxa Nucleofector, клетки рассевали в концентрации 3×105 клеток/чашку на фидерные клетки в форме MEF в концентрации 1-2×105 клеток/6 см чашку. Полученные колонии извлекали из чашки 14 дней спустя и подвергали экспансивному культивированию, после которого 10 вторичных клонов iPS клеток применяли в анализе.
[0085] Анализ вторичных клонов iPS клеток
Геномную ДНК экстрагировали из 10 вторичных клонов iPS клеток, полученных в соответствии со способом, описанным выше, и количественную PCR проводили на c-MYC и BMI1 внутри экзонов с применением праймеров, совместимых с PCR реакцией. В результате, проверку количества вставок экзогенных c-MYC и BMI1, отличных от двух характерных копий, выявили, что количество вставок экзогенного BMI1 10 типов вторичных клонов iPS клеток составяло приблизительно от 7 копий до 26 копий, в то время как количество вставок экзогенного c-MYC составляло приблизительно от 1 копии до 6 копий, и все были различными (фиг. 4B).
[0086] Геномную ДНК экстрагировали из 10 вторичных клонов iPS клеток (с применением некоторых клонов, которые отличались от описанных ранее) полученных в соответствии со способом, описанным выше с последующим анализом всей геномной последовательности, и когда количество вставок экзогенных c-MYC и BMI1 было проверено, было подтверждено, что они встроились в хромосомы в соотношениях, указанных в следующей Таблице 1. Было подтверждено, что вторичные клоны iPS клеток содержат приблизительно от 3-кратного до 5-кратного количества вставок BMI1 по сравнению с количеством вставок c-MYC.
[Таблица 1]
BMI/MYC | |
2nd-iPS_1 | 3.90 |
2nd-iPS_4 | 2.89 |
2nd-iPS_11 | 4.97 |
2nd-iPS_13 | 3.47 |
2nd-iPS_14 | 3.97 |
2nd-iPS_15 | 2.95 |
2nd-iPS_16 | 4.75 |
2nd-iPS_19 | 2.94 |
2nd-iPS_20 | 4.27 |
2nd-iPS_22 | 4.89 |
[0087] В соответствии с представленными выше результатами, хотя количество вставок экзогенных генов, введенных на этапе получения клеток-предшественников мегакариоцитов, отличалось для каждой клетки-предшественника мегакариоцитов, в случае если они были встроены при постоянном соотношении, предполагали, что образовывались клетки-предшественники мегакариоцитов.
[0088] Индукция вторичных клонов клеток-предшественников мегакариоцитов из вторичных клонов iPS клеток
HPC клоны были соответственно получены посредством iPS-мешка через 14 дней после трех вторичных клонов iPS клеток (#4, #11 и #12) в соответствии с описанным ранее способом. Полученные HPC клоны рассевали в 6-луночные планшеты в концентрации 1×105 клеток/лунку с последующим культивированием в течение 27 дней в EBM, содержащей SCF в концентрации 50 нг/мл, TPO в концентрации 50 нг/мл и доксициклин в концентрации 0,5 мкг/мл для получения вторичных клонов клеток-предшественников мегакариоцитов. Анализ полученных трех клонов клеток-предшественников мегакариоцитов выявил, что клоны были положительны по CD41a и CD41b, отрицательны по CD235, и были получены в форме единообразной клеточной группы (фиг. 5A и 5B).
[0089] Получение HLA-дефицитных (HLA-null) вторичных клонов iPS клеток
Таргетный вектор, показанный на фиг. 6A, был введен во вторичный клон iPS клеток (#11), полученный в соответствии со способом, описанным выше для удаления экзона 1 β2-Микроглобулина (β2m) посредством гомологичной рекомбинации. Была ли проведена гомологичная рекомбинация надлежащим образом или нет, определяли посредством подтверждения PCR продуктов с применением праймеров, сконструированных в сайтах, указанных на фиг. 6A для дикого типа и мутанта (фиг. 6B). В результате, β2m-дефицитные вторичные клоны iPS клеток были установлены для двух клонов (клоны 3 и 4).
[0090] Далее, β2m-дефицитные вторичные клоны клеток-предшественников мегакариоцитов индуцировали в соответствии с описанным ранее способом. Кроме того, тромбоциты получали из супернатанта в соответствии с ранее описанным способом. Когда проточную цитометрию проводили на β2m-дефицитных вторичных клонах клеток-предшественников мегакариоцитов и тромбоцитов с применением антител к β2m (BD Pharmingen) и HLA (BD Pharmingen), было подтверждено, что все являются дефицитными по β2m и HLA (фиг. 7A).
[0091] Подтверждение функции тромбоцитов β2m-дефицитных вторичных клонов клеток-предшественников мегакариоцитов
После стимуляции тромбоцитов, присутствующих в культуре, супернатант вторичного клона iPS клеток дикого типа (#11) и β2m-дефицитные вторичные клоны клеток-предшественников мегакариоцитов с PMA таким же образом, как описано ранее, клоны контактировали с CD42a антителом, CD42b антителом и PAC1, и когда положительные уровни CD42a, CD42b и PAC1 измеряли и оценивали на основе интенсивности флуоресценции (MFI), не было наблюдаемых различий между диким типом и β2m-дефицитным типом (фиг. 7B). На основе сказанного выше, было показано, что тромбоциты, дефицитные по β2m, имеют ту же функцию, что и тромбоциты дикого типа.
Пример 2
[0092] Поиск маркера iPS клеток, пригодного для индукции клеток-предшественников мегакариоцитов
mRNA экстрагировали из двух типов вторичных iPS клеток (обозначаемых как хорошие-iPSC), способных образовывать imMKCL, полученный в соответствии с ранее описанным способом и из двух типов iPS клеток (обозначаемых как плохие-iPSC), не способных образовывать imMKCL, полученные в соответствии с ранее описанным способом с последующим усреднением и анализом уровней экспрессии двух типов хороших-iPSC и плохих-iPSC с применением микрочипа с использованием Illumina HumanHT-12 v4.0 или Affymetrix Gene Chip Human Gene 2.0 ST Array в соответствии с руководствами, предоставленными производителями (фиг. 8A и 8B).
[0093] Кроме того, гемопоэтические клетки-предшественники (HPC) были индуцированы из хороших-iPSC и плохих-iPSC с применением того же способа, как описано ранее (соответственно, обозначаемые как хорошие-HPC и плохие-HPC) с последующим анализом с применением микрочипа с использованием Illumina HumanHT-12 v4.0 или Affymetrix Gene Chip Human Gene 2.0 ST Array (Figs. 8A и 8B).
[0094] В результате анализа с применением указанных выше микрочипов, было подтверждено, что MEG3to высоко экспрессируется и хорошими-iPSC и хорошими-HPC. Таким образом, во вторичных клонах iPS клеток и HPC, индуцированных из них, предполагалось, что подтверждение экспрессии MEG3 обеспечит отбор вторичных клонов iPS клеток, пригодных для индукции клеток-предшественников мегакариоцитов.
Пример 3
[0095] Пролиферативная способность клеток-предшественников мегакариоцитов, полученных из вторичных клонов iPS клеток
Клеточную пролиферативную способность клеток-предшественников мегакариоцитов, полученных из вторичного клона iPS клеток, сравнивали с клеточной пролиферативной способностью линии клеток-предшественников мегакариоцитов перед клонированием, чтобы проверить эффект клонирования по настоящему изобретению. В данном эксперименте, клон, полученный из 2nd-iPS_11, перечисленного в таблицу 1, применяли для вторичного клона iPS клеток. Более конкретно, HPC клон, полученный из 2nd-iPS_11 посредством iPS-мешка через 14 дней в соответствии с ранее описанным способом, рассевали в 6-луночную чашку в концентрации 1×105 клеток/лунку с последующим культивированием в течение 27 дней в EBM, содержащей SCF в концентрации 50 нг/мл, TPO в концентрации 50 нг/мл и доксициклин в концентрации 0,5 мкг/мл, чтобы получить вторичный клон клеток-предшественников мегакариоцитов (клон 2). Клетки-предшественники мегакариоцитов (родительские) перед клонированием, полученные в разделе, озаглавленном "Получение клеток-предшественников мегакариоцитов" применяли в качестве сравнительного примера. Эти клетки рассевали в 6-луночную чашку в концентрации 1×105 клеток/лунку и культивировали в течение 15 дней в EBM, содержащей SCF в концентрации 50 нг/мл, TPO в концентрации 50 нг/мл и доксициклин в концентрации 0,5 мкг/мл.
[0096] В результате периодического подсчета числа клеток во время 15-дневного периода культивирования, клетки-предшественники мегакариоцитов, полученные из вторичных клонов iPS клеток, четко продемонстрировали более быстрый рост, чем клетки-предшественники мегакариоцитов перед клонированием. Результаты показаны на фиг. 9A и 9B.
[0097] Способность к созреванию клеток-предшественников мегакариоцитов, полученных из вторичного клона iPS клеток
Вторичный клон клеток-предшественников мегакариоцитов (клон 2), культивируемый в течение 15 дней, культивировали в условиях содействия созреванию мегакариоцитов (включая добавление SCF в концентрации 50 нг/мл и TPO в концентрации 50 нг/мл к EBM с последующим добавлением SR-1 (StemRegenin1) (Selleckchem) в концентрации 750 нМ и Y27632 (Wako) в концентрации 10 мкМ). Клеткам-предшественникам мегакариоцитов (родительские) также позволяли созревать до мегакариоцитов при тех же условиях культивирования, что и вторичный клон клеток-предшественников мегакариоцитов. Изображения обеих клеток, сфотографированных посредством замедленной фотосъемки, представлены на фиг. 10A, в то время как результаты анализа полученных изображений с применением ImageJ представлены на фиг. 10B. На основе этих результатов, мегакариоциты, клонированные в соответствии с настоящим изобретением, были представлены, чтобы продемонстрировать более высокую способность созревания (клеточная гипертрофия), чем мегакариоциты, полученные из исходных клонов клеток.
[0098] Способность клеток-предшественников мегакариоцитов, полученных из вторичного клона iPS клеток, к образованию тромбоцитов
Число клеток, которые образовывали тромбоциты, измеряли визуально на изображениях, представленных на фиг. 10A, чтобы сравнить способность образования тромбоцитов из полученных мегакариоцитов. В результате, мегакариоциты, полученные из клеток, клонированных в соответствии с настоящим изобретением, четко продемонстрировали более высокую способность к образованию тромбоцитов (число образовавшихся протромбоцитов) (**: p<0.01).
Claims (19)
1. Способ получения клонов вторичных стволовых клеток из клеток-предшественников мегакариоцитов, который содержит этапы:
(i) дедифференцировки клеток-предшественников мегакариоцитов для образования колонии стволовых клеток, где клетки-предшественники мегакариоцитов дифференцируют из стволовых клеток, которые экспрессируют по меньшей мере один экзогенный ген, выбранный из группы, состоящей из онкогенов, генов поликомб и генов, подавляющих апоптоз; и
(ii) выделения вторичных стволовых клеток, несущих по меньшей мере один экзогенный ген, встроенный в их хромосому, из колонии стволовых клеток, образованной на этапе (i).
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий сравнение эффективности индуцирования дифференцировки изолированных клонов вторичных стволовых клеток в клетки-предшественники мегакариоцитов с эффективностью индуцирования дифференцировки стволовых клеток перед клонированием.
3. Способ по п. 1, где онкогенами являются гены семейства MYC, генами поликомб являются Bmi1 и генами, подавляющими апоптоз, являются гены BCL-XL.
4. Способ в соответствии с п.1, где изолируют вторичные стволовые клетки, экспрессирующие MEG3.
5. Способ в соответствии с п.1, где экзогенный ген функционально связан с отвечающим на препарат промотором.
6. Способ в соответствии с п.1, где дедифференцировку на этапе (i) проводят посредством введения репрограммирующего фактора, выбранного из группы, состоящей из OCT3/4, SOX2 и KLF4.
7. Способ получения клеток-предшественников мегакариоцитов, который содержит этап:
(i) дедифференцировки клеток-предшественников мегакариоцитов для образования колонии стволовых клеток, где клетки-предшественники мегакариоцитов дифференцируют из стволовых клеток, которые экспрессируют по меньшей мере один экзогенный ген, выбранный из группы, состоящей из онкогенов, генов поликомб и генов, подавляющих апоптоз; и
(ii) выделения вторичных стволовых клеток, несущих по меньшей мере один экзогенный ген, встроенный в их хромосому, из колонии стволовых клеток, образованной на этапе (i);
(iii) индукции дифференцировки выделенных клонов вторичных стволовых клеток в клетки-предшественники мегакариоцитов.
8. Способ получения тромбоцитов, который содержит этапы:
(i)дедифференцировки клеток-предшественников мегакариоцитов для образования колонии стволовых клеток, где клетки-предшественники мегакариоцитов дифференцируют из стволовых клеток, которые экспрессируют по меньшей мере один экзогенный ген, выбранный из группы, состоящей из онкогенов, генов поликомб и генов, подавляющих апоптоз;
(ii) выделения вторичных стволовых клеток, несущих по меньшей мере один экзогенный ген, встроенный в их хромосому, из колонии стволовых клеток, образованной на этапе (i);
(iii) индукции дифференцировки выделенных клонов вторичных стволовых клеток в клетки-предшественники мегакариоцитов; и
(iv) обеспечение созревания индуцированных к дифференцировке клеток-предшественников мегакариоцитов в мегакариоциты и высвобождения тромбоцитов.
9. Способ по п. 8, дополнительно включающий инициирование клонов стволовых клеток быть дефицитными по HLA.
10. Способ по п. 8, где стволовые клетки, которые экспрессируют по меньшей мере один экзогенный ген, являются гематопоэтическими клетками-предшественниками.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015-082768 | 2015-04-14 | ||
JP2015082768 | 2015-04-14 | ||
PCT/JP2016/062040 WO2016167329A1 (ja) | 2015-04-14 | 2016-04-14 | 体細胞への分化誘導に適した幹細胞クローンを製造する方法 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2017139241A RU2017139241A (ru) | 2019-05-14 |
RU2017139241A3 RU2017139241A3 (ru) | 2019-09-16 |
RU2730034C2 true RU2730034C2 (ru) | 2020-08-14 |
Family
ID=57126279
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017139241A RU2730034C2 (ru) | 2015-04-14 | 2016-04-14 | Способ получения клона стволовых клеток, пригодного для индуцирования дифференцировки в соматические клетки |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20180051260A1 (ru) |
EP (1) | EP3296390B1 (ru) |
JP (1) | JP6873898B2 (ru) |
KR (1) | KR102563564B1 (ru) |
CN (1) | CN107709543B (ru) |
AU (1) | AU2016248858A1 (ru) |
BR (1) | BR112017022219A2 (ru) |
CA (1) | CA2982568A1 (ru) |
IL (1) | IL255031B (ru) |
RU (1) | RU2730034C2 (ru) |
SG (1) | SG11201708395VA (ru) |
WO (1) | WO2016167329A1 (ru) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108866005A (zh) * | 2018-07-20 | 2018-11-23 | 东南大学 | 一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EA014166B1 (ru) * | 2005-12-13 | 2010-10-29 | Киото Юниверсити | Ядерный фактор перепрограммирования |
US20120009158A1 (en) * | 2010-06-18 | 2012-01-12 | The General Hospital Corporation | VENTRICULAR INDUCED PLURIPOTENT STEM (ViPS) CELLS FOR GENERATION OF AUTOLOGOUS VENTRICULAR CARDIOMYOCYTES AND USES THEREOF |
US20120034192A1 (en) * | 2008-09-19 | 2012-02-09 | Young Richard A | Compositions and methods for enhancing cell reprogramming |
WO2014123242A1 (ja) * | 2013-02-08 | 2014-08-14 | 国立大学法人京都大学 | 巨核球及び血小板の製造方法 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3450545B1 (en) * | 2008-10-24 | 2023-08-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Pluripotent stem cells obtained by non-viral reprogramming |
EP2500418B1 (en) * | 2009-09-15 | 2018-01-17 | The University of Tokyo | Novel method for producing differentiated cells |
EP2495320B1 (en) * | 2009-10-28 | 2019-02-27 | Japan Health Sciences Foundation | Method for induction of differentiation of stem cells into hepatocytes |
JPWO2011096482A1 (ja) | 2010-02-03 | 2013-06-13 | 国立大学法人 東京大学 | 多能性幹細胞を用いた免疫機能再建法 |
JP5824760B2 (ja) * | 2011-05-13 | 2015-12-02 | 国立大学法人 東京大学 | 多核化巨核球細胞、及び血小板の製造方法 |
JP6143265B2 (ja) * | 2011-07-25 | 2017-06-07 | 国立大学法人京都大学 | 人工多能性幹細胞の選別方法 |
JP2013240308A (ja) * | 2012-05-23 | 2013-12-05 | Kagoshima Univ | ヒトES/iPS細胞における遺伝子発現方法 |
EP2977449B1 (en) | 2013-03-21 | 2020-02-26 | Kyoto University | Pluripotent stem cell for neuronal differentiation induction |
-
2016
- 2016-04-14 US US15/565,922 patent/US20180051260A1/en not_active Abandoned
- 2016-04-14 RU RU2017139241A patent/RU2730034C2/ru active
- 2016-04-14 CN CN201680034787.0A patent/CN107709543B/zh active Active
- 2016-04-14 AU AU2016248858A patent/AU2016248858A1/en not_active Abandoned
- 2016-04-14 EP EP16780120.8A patent/EP3296390B1/en active Active
- 2016-04-14 JP JP2017512584A patent/JP6873898B2/ja active Active
- 2016-04-14 WO PCT/JP2016/062040 patent/WO2016167329A1/ja active Application Filing
- 2016-04-14 CA CA2982568A patent/CA2982568A1/en not_active Abandoned
- 2016-04-14 BR BR112017022219A patent/BR112017022219A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2016-04-14 KR KR1020177032755A patent/KR102563564B1/ko active IP Right Grant
- 2016-04-14 SG SG11201708395VA patent/SG11201708395VA/en unknown
-
2017
- 2017-10-15 IL IL255031A patent/IL255031B/en unknown
-
2020
- 2020-04-03 US US16/839,906 patent/US20210062158A1/en not_active Abandoned
-
2023
- 2023-09-27 US US18/476,065 patent/US20240026304A1/en active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EA014166B1 (ru) * | 2005-12-13 | 2010-10-29 | Киото Юниверсити | Ядерный фактор перепрограммирования |
US20120034192A1 (en) * | 2008-09-19 | 2012-02-09 | Young Richard A | Compositions and methods for enhancing cell reprogramming |
US20120009158A1 (en) * | 2010-06-18 | 2012-01-12 | The General Hospital Corporation | VENTRICULAR INDUCED PLURIPOTENT STEM (ViPS) CELLS FOR GENERATION OF AUTOLOGOUS VENTRICULAR CARDIOMYOCYTES AND USES THEREOF |
WO2014123242A1 (ja) * | 2013-02-08 | 2014-08-14 | 国立大学法人京都大学 | 巨核球及び血小板の製造方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
NAOYA TAKAYAMA et al., Transient activation of c-MYC expression is critical for efficient platelet generation from human induced pluripotent stem cells, J. Exp. Med., 2010, Vol. 207, No. 13, pp. 2817-2830. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2017139241A (ru) | 2019-05-14 |
CN107709543A (zh) | 2018-02-16 |
BR112017022219A2 (pt) | 2018-07-31 |
AU2016248858A1 (en) | 2017-11-09 |
US20240026304A1 (en) | 2024-01-25 |
KR20180019519A (ko) | 2018-02-26 |
KR102563564B1 (ko) | 2023-08-07 |
EP3296390A4 (en) | 2019-01-09 |
US20180051260A1 (en) | 2018-02-22 |
CN107709543B (zh) | 2021-11-09 |
CA2982568A1 (en) | 2016-10-20 |
EP3296390B1 (en) | 2023-01-04 |
IL255031A0 (en) | 2017-12-31 |
WO2016167329A1 (ja) | 2016-10-20 |
US20210062158A1 (en) | 2021-03-04 |
RU2017139241A3 (ru) | 2019-09-16 |
IL255031B (en) | 2022-04-01 |
JP6873898B2 (ja) | 2021-05-19 |
JPWO2016167329A1 (ja) | 2018-02-15 |
EP3296390A1 (en) | 2018-03-21 |
SG11201708395VA (en) | 2017-11-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220017866A1 (en) | Production methods for megakaryocytes and platelets | |
EP2853592B1 (en) | Highly efficient method for establishing artificial pluripotent stem cell | |
EP2582795B1 (en) | Method for selecting human induced pluripotent stem cells | |
US20230227782A1 (en) | Hematopoietic stem and progenitor cells derived from hemogenic endothelial cells by episomal plasmid gene transfer | |
EP2980207A1 (en) | Cell sorting method | |
JP6883791B2 (ja) | 骨格筋前駆細胞の選択方法 | |
US20240026304A1 (en) | Method for Producing Stem Cell Clones Suitable for Induction of Differentiation into Somatic Cells | |
JP6385340B2 (ja) | 巨核球の成熟化促進物質 | |
JP7097050B2 (ja) | 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 | |
WO2014200114A1 (en) | Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells |