JP2013240308A - ヒトES/iPS細胞における遺伝子発現方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒトES細胞又はヒトiPS細胞の胚様体を形成させるステップにおいて、Mesp1を導入することを特徴とする、ヒトES細胞又はヒトiPS細胞から心筋細胞を誘導する方法、RSVプロモータ又はCMVプロモータの下流に標識遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ;前記ヒト多能性幹細胞を培養し、前記ヒト多能性幹細胞から分化した細胞に特異的に前記標識遺伝子を発現させるステップ;及び、前記標識遺伝子を発現している細胞を分化した細胞として判定することを備える、ヒト多能性幹細胞培養物中の分化細胞の識別方法。
【選択図】なし
Description
我々はマウスES細胞への新しい遺伝子導入・発現技術として、アデノウイルスベクターが有用であることを初めて明らかにし、それを活用した分化した目的細胞の単離技術を発明した(胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法及び単離又は可視化用キット<特許第4624100号>; Takahashi T,et al. : Identification and isolation of embryonic stem cell−derived target cells by adenoviral conditional targeting. Mol Ther. 14, 673−683. 2006)。
しかしながらヒトES細胞、ヒトiPS細胞はマウスとは生物学特性や培養技術において異なるところが大きいところも分かって来ており、このアデノウイルスベクターでの遺伝子導入系は培養技術が違うためそのまま適応できず、また機能するのかは予想困難であり、さらには発現調節の適切なプロモータは何か、全く分からない状態である。例えば「マウスES細胞の未分化維持の決定的因子として未分化維持培養に用いるLIFが、ヒト多能性幹細胞においては未分化維持培養には無効である」、「マウスES細胞は未分化状態での培養ならびに継代時に単細胞の状態にできるのに対し、ヒト多能性幹細胞は基本的に細胞塊のままの状態でしか未分化維持培養や継代はできない(最近、ROCK inhibitorを使用することで孤立単細胞化(Single−cell化)にして継代培養できることが発見されたが、そのメカニズムは不明)」などである。重要なことは、これら、マウスとヒトの多能性幹細胞の違いは現象として分かっているだけで、そのメカニズムは未だほとんど解明されていないこと、またこのような違いとメカニズムが不明という理由のために、一般にヒトの多能性幹細胞の培養技術はマウス多能性幹細胞に比べて煩雑で高度な専門技術を必要とし、比較的簡単なマウス多能性幹細胞の培養技術とは異なる。よって前述のように、ヒト多能性幹細胞に対する決定的な遺伝子導入技術は確立されておらず、アデノウイルスベクターも機能するかも予想できず、また真に有用な発現調節プロモータもわからない状態である。
心筋細胞誘導では、肝細胞誘導のように細胞の発生段階に応じた転写因子を順次ウイルスベクター等でES細胞へ発現させて分化誘導を行う(Inamura et al. 2011)といった報告の例はまだ無い。心筋分化に関与する様々な因子が報告されており、心筋分化に係わる心筋特異的転写因子の存在が明らかにされている。例えば心臓の発生に最初に関与する転写因子Mesp1は、まず原腸陥入期に予定中胚葉域に発現し、上皮間葉移行を引き起こすこと (Lindsley et al. 2008)、また心筋分化を抑制するWntシグナルを抑えているDkk−1の発現を直接誘導し心臓誘導に大きく関与すること(David et al. 2008) などから心血管系制御因子とされる(Boudue et al 2010)。また発生6.5〜7日目のマウス胚中胚葉に、クロマチン・リモデリング因子Baf60c、転写因子Gata4とTbx5を導入すると心筋に特徴的なマーカーの発現し、拍動心筋細胞が誘導されたことなどから、これら三つの因子が心筋分化にかかわる一群の遺伝子発現の司令塔として機能する心筋特異的転写因子の可能性が示唆されている(Takeuchi et al. 2008)。さらにマウス線維芽細胞に転写因子Gata4, Tbx5, MEF2Cを導入すると心筋細胞が誘導されること(Ieda et al 2010)なども報告されている。ただし後述のように、同論文ではMESP1遺伝子は当初スクリーニングで見出した候補の13遺伝子には含まれておらず、また実際MESP1はdirect reprogramingでの心筋細胞分化誘導には必須ではなかった、と記載されている。さらに同様に重要な心筋特異的転写因子のNkx2.5遺伝子を導入した場合は、このdirect reprogramingでの心筋細胞への分化誘導は阻害されている。つまりこのように、過去の論文は単に個々の心筋特異的な転写因子が心筋の発生において重要であることを述べているに過ぎず、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞にMESP1、ならびにどの心筋転写因子を導入したからといって、心筋細胞の分化誘導が促進されることを示唆しているのではない。つまり遺伝子導入した場合に、心筋細胞の分化誘導が促進される、効果がない、むしろ阻害される、といういずれも結果も予測困難である。
また、別の態様において、本発明は、RSVプロモータ(Rous sarcoma virus long terminal repeat)、CMVプロモータ(human cytomegalovirus immediate−early gene enhancer/promoter)による、ヒト多能性幹細胞中の分化細胞のみにおいて特異的に外来遺伝子を発現させる技術、方法に関する。例えば、蛍光蛋白質などの遺伝子をRSV,CMVプロモータに繋いでヒト多能性幹細胞に導入すれば、「未分化と分化の状態の細胞を簡単に判別する」ことが可能となる。例えば、RSV、CMVプロモータにより、ヒト多能性幹細胞の分化状態の細胞のみに(未分化細胞特異的に)外来遺伝子(目的遺伝子)を発現することができる。例えば、細胞死誘導の遺伝子をRSV, CMVプロモータの下流につないでヒト多能性幹細胞に導入すれば、分化細胞を除去して、未分化細胞だけを純化することが可能となる。例えば、RSV, CMVプロモータで目的遺伝子を発現させることで、ヒト多能性幹細胞由来の分化細胞だけに特異的に、その目的遺伝子の影響を与えることができる。
更に別の態様において、本発明は、CAプロモータ(a modified chicken beta−actin promoter with human cytomegalovirus immediate early enhancer)により、ヒト多能性幹細胞において、未分化状態、分化状態いずれでも確実に効率よく外来遺伝子を発現させる物質、方法、技術に関する。例えば、蛍光蛋白質などの遺伝子をRSV,CMVプロモータに繋いでヒト多能性幹細胞に導入すれば、分化状態に関わらず、多能性幹細胞由来の細胞を識別できる。これは例えば、再生医療における移植細胞の同定、追跡などが可能となる。例えば、CAプロモータで目的遺伝子を発現させることで、ヒト多能性幹細胞に分化状態に関わらず(未分化状態から分化状態まで一貫して;分化状態によって作用が不安定や中断されることなく)、目的遺伝子の影響を与えることができる。
(1) ヒトES細胞又はヒトiPS細胞のEBを形成させるステップにおいて、Mesp1を導入することを特徴とする、ヒトES細胞又はヒトiPS細胞から心筋細胞を誘導する方法。
(2) ヒトES細胞又はヒトiPS細胞のEBを形成させるステップにおいて、GATA4及びMEF2Cを導入しないことを特徴とする、(1)に記載の方法。
(3) 更に、G−CSFの存在下で培養するステップを備える、(2)に記載の方法。
(4) ヒトES細胞又はヒトiPS細胞のEBを形成させるステップにおいて、Mesp1と共に、GATA4及びMEF2Cを導入することを特徴とする(1)に記載の方法。
(5) 更に、G−CSFの非存在下で培養するステップを備える、(4)に記載の方法。
(6) Mesp1の導入が、アデノウイルスベクターにより行われることを特徴とする、(1)〜(5)のいずれか1項に記載の方法。
(7) アデノウイルスベクターが、CAプロモータの下流にMesp1遺伝子が結合した発現カセットを含む、(6)に記載の方法。
(8) アデノウイルスベクターによりMesp1を導入することが、MesP1発現アデノウイルスベクターをMOI3で細胞に感染させることを備える、(6)又は(7)に記載の方法。
(9) ヒトES細胞又はヒトiPS細胞のEBを形成させるステップが、96wellプレート中の1×103〜3×103細胞のヒトES細胞又はヒトiPS細胞を使用することを特徴とする、(1)〜(8)のいずれか1項に記載の方法。
(10) 96wellプレートが、低接着96wellプレートである、(9)に記載の方法。
(11) RSVプロモータ又はCMVプロモータを用いることを特徴とする、ヒト多能性幹細胞中の分化細胞のみにおいて特異的に外来遺伝子を発現させる方法。
(12) RSVプロモータ又はCMVプロモータの下流に前記外来遺伝子を結合した発現カセットを使用することを特徴とする、(11)に記載の方法。
(13) RSVプロモータ又はCMVプロモータの下流に前記外来遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ;及び、前記ヒト多能性幹細胞を培養し、前記ヒト多能性幹細胞から分化した細胞に特異的に前記外来遺伝子を発現させるステップを備える(12)に記載の方法。
(14) 前記外来遺伝子が標識遺伝子である、(11)〜(13)のいずれか1項に記載の方法。
(15) 標識遺伝子が、蛍光タンパク質である、(14)に記載の方法。
(16) RSVプロモータ又はCMVプロモータの下流に標識遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ;前記ヒト多能性幹細胞を培養し、前記ヒト多能性幹細胞から分化した細胞に特異的に前記標識遺伝子を発現させるステップ;及び、前記標識遺伝子を発現している細胞を分化した細胞として判定することを備える、ヒト多能性幹細胞培養物中の分化細胞の識別方法。
(17) 前記外来遺伝子が細胞死を誘導する遺伝子である、(11)〜(13)のいずれか1項に記載の方法。
(18) RSVプロモータ又はCMVプロモータの下流に細胞死を誘導する遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ;前記ヒト多能性幹細胞を培養し、前記ヒト多能性幹細胞から分化した細胞に特異的に前記細胞死を誘導する遺伝子を発現させることにより、ヒト多能性幹細胞培養物中の分化細胞を除去する方法。
(19) CAプロモータを用いることを特徴とする、ヒト多能性幹細胞、及び該ヒト多能性幹細胞から分化した細胞の両細胞において外来遺伝子を発現させる方法。
(20) CAプロモータの下流に前記外来遺伝子を結合した発現カセットを使用することを特徴とする、(19)に記載の方法。
(21) CAプロモータの下流に前記外来遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ;及び、前記ヒト多能性幹細胞を培養し、未分化・分化のいずれの状態でも分化状態非依存的に前記ヒト多能性幹細胞に前記外来遺伝子を発現させるステップを備える請求項20に記載の方法。
(22) 外来遺伝子が標識遺伝子である、(19)〜(21)のいずれか1項に記載の方法。
(23) 標識遺伝子が蛍光タンパク質である、(22)に記載の方法。
(24) CAプロモータの下流に標識遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ;前記ヒト多能性幹細胞及び前記ヒト多能性幹細胞から分化した細胞に特異的に前記標識遺伝子を発現させるステップ;及び、前記標識遺伝子を発現している細胞を、前記ヒト多能性幹細胞に由来する細胞として判定することを備える、ヒト多能性幹細胞に由来する細胞の識別方法。
(25) 更に、CAプロモータの下流に標識遺伝子を結合した発現カセットを導入した前記ヒト多能性幹細胞を生体内に移植するステップを備えることを特徴とする、(24)に記載の方法。
(26) (25)に記載の方法を備える、再生医療における移植細胞の同定方法又は追跡方法。
マウスES細胞(D3−feeder free)をトリプシンで分散させた後、1 ×103/wellまたは3×103/wellで低接着96wellプレートに播種し、EB形成を行った。EB形成時にMesP1またはEGFP発現アデノウイルスベクター(AdV−CA−MesP1又はAdV−CA−EGFP)をMOI3で感染させた。播種3日後に24wellまたは48well gelatin coat plateにEBを移し、接着培養を行った。またEB形成6日後に0.75ng/mLのG−CSFを培地に添加した。EB作成10日後に0の出現したwell数をカウントした。
ヒトES細胞(KhES1)またはiPS細胞(201B7)の培養液にRock inhibitor Y−27632を終濃度10μMになるように添加した。CO2インキュベータで1時間培養したのち、CTK処理を行って細胞コロニーを剥がした。細胞塊懸濁液を15mL遠心管に回収し、5分ほど静置し、細胞塊がある程度沈んだのを確認して上清を吸引除去した (MEFの除去)。PBS(−)で細胞塊を懸濁した後、1000rpmで3分遠心を行い、上清を可能な限り吸引除去した。Accutaseをφ6cm dish一枚あたり0.5mL加え、CO2インキュベータに5〜10分静置した。ヒトES/iPS細胞用培地を加え、ピペッティングにより細胞塊をsingle cellに分散させた。1000rpmで3分遠心し、上清を吸引除去した後、10μM Y−27632を含むEB形成培地(10%FCS,0.5μM 2MEを含むαMEM培地)で細胞を懸濁した。
single cellに分散させたヒトES/iPS細胞にアデノウイルスベクターによりMesp1またはEGFPを導入した。細胞を100μLのES/iPS細胞用培地(−bFGF)に懸濁し、MOI1または3のアデノウイルスベクターを加え、CO2インキュベータに1時間静置 (15分おきに軽くVoltexを行い懸濁した)し、ウイルス感染を行った。使用したアデノウイルスベクターはAdV−CA−Mesp1またはAdV−CA−EGFPである。1時間後、PBS(−)1mLを加え3000rpmで5分遠心し、上清を吸引除去し、EB形成培地1mLで細胞を懸濁した。細胞懸濁液を3000rpmで5分遠心し、上清をできる限り吸引除去し、10μM Y−27632を含むEB形成培地で懸濁した後、50μL(2x104)/wellで、低接着96wellプレートに播種し、EB形成を行った。播種4日後にGATA4およびMEF2Cの導入を行った。培地をできるだけ取り除いたのち、1.5x105pfu/mLに調整したウイルス液をwellあたり15μL(1.5x105pfu/well)加えた。CO2インキュベータで1時間静置し、アデノウイルスベクター感染を行った後、ウイルス液を取り除き、EB形成培地50μLを加えた。使用したアデノウイルスベクターはAdV−CMV−GATA4およびAdV−CMV−MEF2Cである。播種6日後2.5ng/mLのG−CSFを添加し、播種10日目にゼラチンコートした24well または48wellにEBを移し、接着培養へと移行した。3〜4日に一度培地交換を行い、拍動細胞の出現したwell数を確認した。
single cellに分散させたヒトES細胞を1×103〜3×104/wellの濃度で低接着96wellプレート(PrimeSurface(登録商標)96Mプレート,住友ベークライト(株))に播種し、EB形成を行った。播種7日目にゼラチンコートした24wellプレートにEBをplatingした。EB作製14,21,35日目(Day14,21,35)に3wellずつ細胞塊を回収し、Sepasol(登録商標)−RNA I Super G (Nacalai Tesque)を用いてプロトコールに従ってRNAを抽出した。PrimeScript(登録商標) II 1st strand cDNA Synthesis Kit (TAKARA)を用いて、RNA 1μgをoligo dTを用いて逆転写反応を行い、1st cDNA鎖を合成した。得られたcDNAを鋳型としてEX−Taqを用いてPCRを行った。
Sepasol(登録商標)−RNA I Super G (Nacalai Tesque)のプロトコールに従って抽出したRNAを用いて、RT−PCRを行った。PrimeScript(登録商標)II 1st strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA)のプロトコールに従って、1μgのRNAをoligo dTを用いて逆転写反応を行い、1st cDNA鎖を合成した。得られたcDNAを鋳型としてEX−Taq(TAKARA)を用いてPCRを行い、心筋関連遺伝子の発現量を確認した(半定量PCR)。使用したPrimerと得られるDNA断片長は表1の通りである。
(ヒトES細胞の心筋分化誘導(1)心筋関連遺伝子およびG−CSFの影響についての検討)
心筋関連遺伝子のMesp1,GATA4およびMEF2Cと心筋誘導に効果的であると報告されているG−CSFの影響についての検討を行った。2×104/wellの細胞からスタートしたEB形成において、EB形成時にMesp1を導入したグループのうち、G−CSFを添加したサブグループ(表2,A)もしくはMesp1に加えGATA4とMEF2Cを導入し、G−CSF添加を行わなかったサブグループ(表2,B)において、拍動細胞出現率が高い結果となった。Mesp1を発現させてG−CSFを添加することでGATA4やMEF2Cなどの心筋分化因子の発現量が高くなり拍動細胞の出現率が高くなるのではないかと考えられる。またMesp1,GATA4およびMEF2Cを細胞に導入し、さらにG−CSFを添加したサブグループでは拍動細胞の出現率が低かったことから、心筋関連遺伝子の過剰発現誘導は、心筋分化にあまり良い影響を与えない可能性が考えられる。
(1回目)
3×103/wellでEB作製を行った。10日後のbeating cellの出現well数を表4に示す。
マウスES細胞で得られた結果から、分化傾向にEB形成時の細胞数が大きな影響を示すことから、まず細胞数と分化傾向について検討を行った。1wellあたり1×103,3×103,1×104,3×104のヒトES細胞を96wellプレートに播種した。EB形成4日目の様子を図2に示す。
アデノウイルスベクターはE1領域欠損の非増殖型ベクターで、RSV,CMV,CAの各プロモータでLacZ遺伝子を発現するAd.RSV−LacZ,Ad.CMV−LacZ,Ad.CA−LacZの3種類を用いた。これらのウイルスの作製法、調整法、一般の癌細胞での特性は、Hepatology 37:155−163 2003に報告しており、それに従っている。各ウイルスベクターを3×108PFU/mL(PFU; plaque forming units,感染力を持つウイルス数/1mLあたり)でヒトとマウスのES細胞に1時間感染後、X−gal染色にてLacZ遺伝子の発現を見た。マウスES細胞の培養は、Mol Ther.14,673−683.2006に報告した方法に従っている。R1のES細胞は、フィーダー細胞としてマイトマイシン処理したマウス胎児線維芽細胞(mEF)との共培養で、D3のES細胞はフィーダー細胞無しで培養している。ヒトES細胞(hES)はmEFと競売している。
結果は、図6の通りである(NCはウイルス感染なし、mEF上のES細胞は矢印頭、で示している)。Ad.CA−LacZは、全ての種類のES細胞、ならびにmEF細胞ともに、強いLacZ遺伝子発現がみられた。Ad.CMV−Lac.ZとAd.RSV−LacZは、マウスES細胞では、mEFとの共培養の有無に関わらず、ES細胞でLacZの強い発現がみられる。これとは対象的に、ヒトES細胞では、共培養のmEF細胞では強いLacZの発現がみられるのとは対称的に、LacZの発現が全くみられない。一方、Ad.CA−LacZは、マウス、ヒトのES細胞とも、強いLacZの発現を認めた。このように、ヒトES細胞では、マウスES細胞とは全く異なりを示し、RSV,CMVの各プロモータは未分化状態では活性が消失するものである。
アデノウイルス受容体のhCRA遺伝子のmRNA発現を、ヒトES細胞(KhES)、代表的な癌細胞株のHeLa細胞(子宮頸癌)、HepG2(肝芽腫)で調べた(図7 a)。GAPDHはコントロールのハウスキーピング遺伝子。いずれの細胞でもhCARの発現がみられ、KhES細胞では、むしろHeLa細胞よりhCAR発現は高かった。次に、ヒトES細胞には1×108PFU/mL、癌細胞には30MOI(Multiplicity of infection;感染ウイルス数/細胞数)でのアデノウイルスを実施例4と同様に感染させてX−gal染色をした(図7b)。癌細胞ではいずれにおいても、いずれのアデノウイルスでもLacZ発現がみられた。一方、Ad.RSV−LacZとAd.CMV−LacZは、mEF細胞で強い発現みられるのに、ヒトES細胞では発現がみられなかった。Ad.CA−LacZはヒトES細胞、mEF細胞とも、LacZの強い発現を認めた。
このように実施例4と同様の傾向が実施例5でも確認できた。つまり、RSV, CMVの各プロモータは、癌細胞株、未分化のマウスES細胞、mES細胞ではプロモータ活性を示す一方、ヒトES細胞では未分化状態では活性を全く示さない。一方、CAプロモータは、癌細胞株、未分化のマウスES細胞、mES細胞だけでなく、未分化のヒトES細胞のいずれでも高いプロモータ活性を示して外来遺伝子の発現誘導ができることが確認できた。
癌や一般の正常細胞へのアデノウイルス遺伝子導入において、hCARが低発現だったり、遺伝子導入効率の低い細胞には、アデノウイルスのファイバーを改変してファイバーノブにRGDペプチドを付加すれば、導入効率が上昇する場合が多いことが報告されている。よって実施例4及び5で確認した、ヒトES細胞の未分化でも機能するCAプロモータで蛍光分子のEGFP遺伝子を発現する、野生型のファイバーのAd.CA−EGFPと、ファイバーをRGDペプチド付加に改変したAd.CA−EGFP/F−RGDの二つで同様の比較実験を行った。感染48時間後に蛍光顕微鏡で観察した。
結果は、Ad.CA−EGFP/F−RGDでむしろ共培養のmEF細胞への遺伝子導入効率が上昇する一方で、マウス、ヒトのどちらのES細胞とも、遺伝子導入効率は上昇しなかった。
よって以降の実験は、Ad.CA−EGFPで行うこととした。
アデノウイルスの量を変えてAd.CA−EGFPにて同様のプロトコールでヒトES細胞に感染、遺伝子導入実験を行った。奇麗なウイルス量依存的な遺伝子導入効率の変化が確認できた。
これまでの実験で、RSV,CMVプロモータはヒトES細胞では未分化ではプロモータ活性が消失し、分化細胞(癌細胞株、正常の分化細胞であるmEF細胞)ではプロモータ活性がみられることがわかった。一方、CAプロモータを使えば、アデノウルスベクターで遺伝子導入された後にも、未分化状態のヒトES細胞でもプロモータ活性が高く維持されることが分かった。
一方で、アデノウイルスベクターで簡単に高効率でヒトES細胞に遺伝子導入し、CAプロモータで高発現できる一方で、共培養のmEF細胞にも同等かそれ以上にアデノウイルスが感染して遺伝子導入・発現することも分かった。フィーダー細胞なしでも培養可能にできるマウスES細胞とは異なり、ヒトES細胞においては、未分化維持にはmEF細胞のようなフィーダー細胞との共培養が一般には必要である。よってアデノウイルスベクターではヒトES細胞だけでなくフィーダー細胞にも遺伝子が導入されてしまうため、ヒトES細胞特異的に遺伝子を導入し発現させることが不可能である。
これを解決する方法を以下のように開発した。
図10のプロトコール1は、前述した一般的なアデノウイルスの感染・遺伝子導入の方法である。つまり、フィーダー細胞と共培養のヒトES細胞の培地を抜いて、最小量のアデノウイルス液を加えて1時間培養した後、新鮮な培地と交換するという方法であり、詳しくは以下である。
1)2、3日前に、24 well plateへヒトES細胞を蒔き込む。
2)感染に必要な1.0×105−3.0×108 pfu/mlとなるアデノウイルスベクター量を計算する。
3)ヒトES細胞用培地へアデノウイルスベクター溶液を必要量添加して、アデノウイルスベクター−ヒトES細胞用培地(希釈系列など)を調整する。
4)ヒトES細胞用培地を吸引除去後、アデノウイルスベクター溶液を200μl(細胞表面が乾かないよう浸る液量が必要)添加し、well全体に行き渡るように広げる。
5)37℃、5.0%CO2インキュベータへ移し、15分毎に培養皿を振盪・混和して、アデノウイルスベクター溶液をwell全体に行き渡らせる。
6)アデノウイルスベクター感染開始から60分後、アデノウイルスベクター−ヒトES細胞用培地を吸引除去する。500μlの新しいヒトES細胞用培地を添加して、培養を続ける。
7)少なくとも感染後、24時間で導入遺伝子の発現を確認することができる。
(1)ヒトES細胞を24ウェル培養皿に培養する。
(2)細胞解離液0.25ml(24ウェル培養皿の1ウェルあたり)をdishに加え、細胞表面全体に液が行き渡るようにした後、37℃、3.0% CO2インキュベータで5分間加温する。
(3)細胞の状態を顕微鏡で観察する(コロニーの周辺が捲れ上がってくる)。
(4)ヒトES細胞培地を1.0ml添加し、pipetting(ピペットで吸ったり戻したりする)によって細胞を剥がす。更に数回のpipettingによってコロニーを適当なサイズに砕く。
(5)細胞懸濁液からFeeder細胞を取り除くために、(4)の細胞懸濁液をゼラチンでコートした12ウェル培養皿上でインキュベーションする。37℃、5.0% CO2インキュベータで30−60分間静置する。
(6)フィーダー細胞を除いた細胞浮遊液を1.5mlエッペンドルフチューブ(一般的な実験用の小型の1.5mL蓋付きのチュープであればよい)中に集める。
(7)約170×g(1000rpm)、5分間遠心する。
(8)上澄み(sup)をできるだけ除く。 ヒトES細胞が濃縮されたペレット(ppt)が残る。
(9)別のチューブで、目的のウイルス感染濃度となるようにアデノウイルスベクターを添加したヒトES細胞用培地、50−100μLを調整する。
(10)(8)で得られたヒトES細胞ペレット(ppt)に、9)のアデノウイルスベクター−ヒトES細胞用培地を50−100μL(凝集塊が十分に浸るようウイルス溶液は最低50 μl必要)添加して、細胞を懸濁する。(エッペンドルフチューブ中でウイルス感染)。
(11)37℃、5.0% CO2インキュベータで1時間のインキュベーション(細胞塊が沈むので、15分毎に混和する)
(12)ヒトES用培地を1.0mL添加し、約170×g(1000rpm)、3分間遠心する。
(13)ウイルス粒子を含んだ上澄み(sup)をできるだけ除く。(W0)
(14)ヒトES用培地1.0mLを添加し、約170×g(1000rpm)、3分間遠心する。
(15)上澄み(sup)をできるだけ除く。(W1)
(16)必要に応じて、Advを除くために、14)−15)を3〜5回繰り返す。(W3−5)
(17)アデノウイルスベクター感染後のヒトES細胞ペレットへ培地を加え、軽く懸濁する。
(18)新たに用意したフィーダー細胞へアデノウイルス感染後のES細胞懸濁液を加え、37℃、5.0% CO2インキュベータでインキュベーション。(最終濃度5.0ng/mlの濃度でbFGFを添加する。)
(19)通常培養を行ない鏡検する。
まずプロトコール1(図11b)では、これまでの実験と同様に、ヒトES細胞だけでなく、共培養のフィーダーのmEF細胞にも高率に遺伝子導入されていた。2回の洗浄にて若干のフィーダー細胞への遺伝子導入は減った。一方、プロトコール2の無フィーダー感染法では、フィーダー細胞への遺伝子導入が劇的に減少していた(図11 a, c)。さらに洗浄を重ねるに従いフィーダー細胞への感染・遺伝子導入がさらに劇的に減少して行き、5回の洗浄では僅か2〜3%のmEF細胞が遺伝子導入されただけとなった。
免疫細胞染色により、ヒトES細胞の未分化マーカーの発現を調べた。図12に示したように、TRA−1−60,STAT3、Oct3/4などの未分化マーカーを、アデノウイルスでEGFP遺伝子が導入されたヒトES細胞は、依然高発現していること、つまりアデノウイウルスによる遺伝子導入でヒトES細胞の未分化性維持に影響がなかったことが確認された。
まず「接着感染法」のプロトコールの詳細は以下であり、これに従い感染をさせ実験を行った。
第一日目:細胞準備
培地は3)〜8)まではRock inhibitor添加ES細胞培地(bFGF含有)を使用する。またマトリゲルでコートした12wellを用意する。
前日からRock inhibitorで処理しておいたヒトES細胞、ヒトiPS細胞より培地を取り除き、CTK液(2.5% Trypsin 10ml、collagenase IV(10mg/ml)10ml、Knockout SR Serum Replacement(Invitrogen社)20ml、100mM CaCl2 1ml、PBS 59ml)を加え、37℃ 5−7分静置する。
細胞を観察し、コロニーの縁が剥がれ掛けていたらCTKを取り除く。剥がれ方が不十分な場合はさらに3分 37℃静置する。
2mLの培地を加え、コロニーをなるべく壊さないように2mLピペットで剥がす。剥がした細胞は15mL tubeに移す。もう一度2mLの培地を培養皿に加え、残っている細胞をチューブに移す。
3−5分ほど静置し、細胞塊がある程度チューブの下に沈んだら上清を取り除く。このときmEF細胞もほとんど取り除かれる。4mL PBS(−)を加え、遠心1000rpm×3分。
PBS(−)を取り除き、Accutase 0.5mLを加え、37℃で5分静置。
1mLの培地を加え、P1000でピペッティングし、single cellにする。
細胞浮遊液を15mL tubeに回収し、細胞数をカウントする。
8×104/wellでマトリゲル12well plateに播種。培地はRock inhibitorを添加したmEFコンディション培地(CM)を使用する。
前日に播種したES細胞およびiPS細胞をカウントする。今回は、5×105/wellであった。
Ad.CA−EGFP(2.5×107PFU/μL)を使用し、bFGFを含まないES培地に交換し、ウイルス液を各MOI(1,3,10)になるように希釈調整して加え、37℃で感染1時間後、ウイルス液を取り除き、1wellあたり1mLの新しいCMを加える。
以下に述べる解析を行った。
第一日目:細胞準備
細胞の調整方法は、「接着感染法」 の1)〜7)までは同一である。
細胞数をカウント後、3.2×105ずつ1.5mLチューブに移す。
3000rpm×5min遠心後、bFGFを含まないES培地に懸濁する。
前述のAd.CA−EGFの希釈ウイルス液を、各MOI(1,3,10)で加え、37℃ 1時間静置する。感染1時間後、3000rpm×5min遠心し、ウイルス粒子を含む上清を取り除く。Rock inhibitor添加ES細胞培地(bFGF含有)1mLを添加し、3000rpm×5min遠心後、ウイルス粒子を含む上清を取り除く。Rock inhibitor添加CM(bFGF+)を添加し、Rock inhibitor添加CM(bFGF+)を加えた12 well plate(マトリゲル処理)に250mLずつ播種する。
以下に述べる解析を行った。
以下に、解析の結果を示す。
(1)蛍光顕微鏡での観察
「接着感染法」の方はほぼコンフルエントな状態まで細胞が増殖し、MOI10では90%以上でEGFPの発現が観察された(図13)。
一方、「無フィーダー感染法」では、生存細胞数が極めて少ないが、生存細胞はMOI1でもほとんどの細胞でEGFPが発現しているように観察された。(図14)。
KhES1: ヒトES細胞
201B7: ヒトiPS細胞
253G1: ヒトiPS細胞
(2)フローサイトメーター(FACS)解析
EGFP陽性細胞をFACSにて解析した。FACSの細胞の調整法は以下の通りである。
細胞を0.5mLのPBSで洗浄後、150μLの0.25%TEを加え、37℃5分静置する。0.5mLの10%胎胎仔血清−DMEM(mEF用培地)を加え、ピペッティングする。5000rpm×3min遠心して細胞を集める。生細胞と死細胞を区別するために核染色のPIストック(0.05mg/ml)をES培地で50倍に希釈し、この培地でES細胞を懸濁する(0.5mL/サンプル)。FACS解析を行う。結果は図15、図16の通りである。
「接着感染法」の結果が図中のadhesionで、「無フィーダー感染法」の結果が図中のsuspensionで表されている。
同じMOI数で比較すると、「接着感染法」(adhesion)に比べ、「無フィーダー感染法」(suspend)が遙かに高い導入効率を示した。MOI3で感染させた場合でも約97%の細胞がEGFPを発現しており、MOI1でも約86%の細胞がEGFP陽性だった。
さらに低いMOI(0.1,1)も交えて、幅広くMOIの違いでの遺伝子導入効率を調べたが、いずれのMOIでも「接着感染法」より「無フィーダー感染法」の方が遺伝子導入効率が高く、特に低いMOIではその差は顕著にみられた(図17)。
次に、ヒトES細胞だけでなく、ヒトiPS細胞での遺伝子導入効率を調べた(図18, 図19)。
まず、「接着感染法」の結果は、いずれの細胞も、感染無しのコントロール(NC)ではEGFP陽性細胞みられておらず、疑陽性(EGFPの自家発光など)なく、うまく実験と解析が行われていることが示されている(図18)。
細胞間で多少の効率の差はあるものの、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞(2種類)の合計3種類のいずれの細胞とも、高い導入効率を示した(図19)。
前述までの詳細な検討で、「無フィーダー感染法」は「接着感染法」より高い遺伝子導入効率を示すことが明らかなので、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞の「無フィーダー感染法」での遺伝子導入効率は、低いMOI(0.1,0.3,1)で同様にFACSで調べた(図20)。このような極めて低いMOIでも、極めて高い遺伝子導入効率を得ることができた。MOIは、アデノウイルス産生細胞である293細胞での力価測定から換算した感染力価のウイルスが一個の細胞あたりどれだけの遺伝子導入を示したかである。つまりその値がMOI1で70%だとしたら、最も感染効率のいい293細胞が10個中10個に感染する感染ウイルス量で、10個中7個に感染するということであり、これは極めて高い遺伝子導入効率を達成できたといえる。例えば、我々が以前調べた代表的な7種類の癌細胞株でのアデノウイルス遺伝子導入効率では、最高野結果だった肝芽種のHepG2細胞(肝細胞系の癌細胞は最も高いアデノウイルス遺伝子導入効率を示すことは他の多くの論文で示されている)でさえMOI1での遺伝子導入効率は約30%であることからも(INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 27: 77−85, 2005)、本願の発明でヒトES細胞、ヒトiPS細胞に極めて高い遺伝子導入効率を達成できたことは客観的に実証できた。
CAプロモータ 646bp
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Claims (26)
- ヒトES細胞又はヒトiPS細胞のEBを形成させるステップにおいて、Mesp1を導入することを特徴とする、ヒトES細胞又はヒトiPS細胞から心筋細胞を誘導する方法。
- ヒトES細胞又はヒトiPS細胞のEBを形成させるステップにおいて、GATA4及びMEF2Cを導入しないことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 更に、G−CSFの存在下で培養するステップを備える、請求項2に記載の方法。
- ヒトES細胞又はヒトiPS細胞のEBを形成させるステップにおいて、Mesp1と共に、GATA4及びMEF2Cを導入することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 更に、G−CSFの非存在下で培養するステップを備える、請求項4に記載の方法。
- Mesp1の導入が、アデノウイルスベクターにより行われることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- アデノウイルスベクターが、CAプロモータの下流にMesp1遺伝子が結合した発現カセットを含む、請求項6に記載の方法。
- アデノウイルスベクターによりMesp1を導入することが、MesP1発現アデノウイルスベクターをMOI3で細胞に感染させることを備える、請求項6又は7に記載の方法。
- ヒトES細胞又はヒトiPS細胞のEBを形成させるステップが、96wellプレート中の1×103〜3×103細胞のヒトES細胞又はヒトiPS細胞を使用することを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 96wellプレートが、低接着96wellプレートである、請求項9に記載の方法。
- RSVプロモータ又はCMVプロモータを用いることを特徴とする、ヒト多能性幹細胞中の分化細胞のみにおいて特異的に外来遺伝子を発現させる方法。
- RSVプロモータ又はCMVプロモータの下流に前記外来遺伝子を結合した発現カセットを使用することを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- RSVプロモータ又はCMVプロモータの下流に前記外来遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ;及び、前記ヒト多能性幹細胞を培養し、前記ヒト多能性幹細胞から分化した細胞に特異的に前記外来遺伝子を発現させるステップを備える請求項12に記載の方法。
- 前記外来遺伝子が標識遺伝子である、請求項11〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 標識遺伝子が、蛍光タンパク質である、請求項14に記載の方法。
- RSVプロモータ又はCMVプロモータの下流に標識遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ;前記ヒト多能性幹細胞を培養し、前記ヒト多能性幹細胞から分化した細胞に特異的に前記標識遺伝子を発現させるステップ;及び、前記標識遺伝子を発現している細胞を分化した細胞として判定することを備える、ヒト多能性幹細胞培養物中の分化細胞の識別方法。
- 前記外来遺伝子が細胞死を誘導する遺伝子である、請求項11〜13のいずれか1項に記載の方法。
- RSVプロモータ又はCMVプロモータの下流に細胞死を誘導する遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ;前記ヒト多能性幹細胞を培養し、前記ヒト多能性幹細胞から分化した細胞に特異的に前記細胞死を誘導する遺伝子を発現させることにより、ヒト多能性幹細胞培養物中の分化細胞を除去する方法。
- CAプロモータを用いることを特徴とする、ヒト多能性幹細胞、及び該ヒト多能性幹細胞から分化した細胞の両細胞において外来遺伝子を発現させる方法。
- CAプロモータの下流に前記外来遺伝子を結合した発現カセットを使用することを特徴とする、請求項19に記載の方法。
- CAプロモータの下流に前記外来遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ;及び、前記ヒト多能性幹細胞を培養し、未分化・分化のいずれの状態でも分化状態非依存的に前記ヒト多能性幹細胞に前記外来遺伝子を発現させるステップを備える請求項20に記載の方法。
- 外来遺伝子が標識遺伝子である、請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 標識遺伝子が蛍光タンパク質である、請求項22に記載の方法。
- CAプロモータの下流に標識遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ;前記ヒト多能性幹細胞及び前記ヒト多能性幹細胞から分化した細胞に特異的に前記標識遺伝子を発現させるステップ;及び、前記標識遺伝子を発現している細胞を、前記ヒト多能性幹細胞に由来する細胞として判定することを備える、ヒト多能性幹細胞に由来する細胞の識別方法。
- 更に、CAプロモータの下流に標識遺伝子を結合した発現カセットを導入した前記ヒト多能性幹細胞を生体内に移植するステップを備えることを特徴とする、請求項24に記載の方法。
- 請求項25に記載の方法を備える、再生医療における移植細胞の同定方法又は追跡方法。
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