JPWO2015166845A1 - 細胞の分化状態の評価方法 - Google Patents
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Abstract
Description
前記所定物質が、プトレシン、キヌレニン、シスタチオニン、アスコルビン酸、リボフラビン、ピルビン酸、セリン、システイン、トレオン酸、クエン酸、及びオロト酸から成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物であることを特徴としている。
バイオコートマトリゲル(登録商標、コーニングインターナショナル株式会社)がコートされた4枚の培養皿(直径60 mm)に前記KhES−1株を植え継いで培養を行った(図1では簡略化のため培養皿1枚のみを示している)。培地としてはmTeSR1(modified Tenneille Serum Replacer 1)を使用し、毎日培地の交換を行った。mTeSR1の構成成分を図5及び図6に示す。同様にKhES−3株についても4枚の培養皿に植え継いで培養を行った。細胞の植え継ぎ(継代)を行った日を0日目としてコンフルエント(confluent)に達するまで培養を継続し、各日の培地交換時に培養皿から回収した培養上清を質量分析用のサンプルとした。なお、培養0日目については、mTeSR1そのものを質量分析用サンプルとした。
マトリゲルがコートされた4枚の培養皿(直径60 mm)に前記KhES−1株を植え継いで培養を行った(図1では簡略化のため培養皿1枚のみを示している)。培地としてはmTeSR1を使用し、毎日培地の交換を行ってコンフルエントに達するまで培養を継続した。同様にKhES−3株についても4枚の培養皿に植え継いで培養を行った。継代を行った日を0日目とし、2日目からは前記培地交換の際に、レチノイン酸を終濃度0.1 μMとなるよう添加したmTeSR1に交換することにより、分化誘導刺激を行った。各日の培地交換時に培養皿から回収した培養上清を質量分析用のサンプルとし、培養0日目については、mTeSR1そのものを質量分析用サンプルとした。
前記サンプルにそれぞれ内部標準物質としてイソプロピルリンゴ酸を添加し、抽出溶液(メタノール:クロロホルム:水=2.5:1:1)で処理して除蛋白を行った。抽出後の上清を回収し、乾燥させた。
上述の前処理を行った各サンプルをメトキシアミン塩酸塩を含むピリジン溶液中でインキュベートすることにより、サンプル中の化合物のメトオキシム化を行った。更に、各サンプルにMSTFA(N−メチル−N−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド)を添加することでサンプル中の化合物をトリメチルシリル化した。そして、これらの誘導体化処理を施したサンプルをGC−MSによる分析に供した。分析結果の解析には、島津製作所製の「GCMS代謝成分データベースVer. 2」を使用した。該データベースは前記と同様の誘導体化処理を施した種々の化合物標準品をGC−MSで分析したデータが集約されたものである。化合物の同定は、前記データベースで設定された保持指標(保持時間を相対化した数値)とサンプル中の誘導体化化合物の保持指標との差が±5以内であるか否か、及び前記データベースで設定された定量イオン及び確認イオンの両者がサンプル中の誘導体化化合物について検出されているか否かを指標に行った。一方、化合物の定量は、前記データベースで設定された条件に従い、サンプル中の各誘導体化化合物に特徴的なイオンに関するマスクロマトグラムの面積を算出する方法により実施した。
上述の前処理を行った各サンプルに適当量の超純水(Milli-Q(登録商標)水、メルク株式会社)を加えて溶解させ、LC−MSによる分析に供した。LC−MS分析では、各サンプル中の化合物を逆相分離カラムを用いた勾配溶出によって時間的に分離した後、多重反応モニタリング(MRM、Multiple Reaction Monitoring)モードによる質量分析を行った。MRMモードにおける分析条件の設定は、化合物標準品を用いて実施した。化合物の同定は、標準品の保持時間とサンプル中の化合物の保持時間との差が±0.1分以内であるか否かを基準に行った。また、化合物の定量は、サンプル中の各化合物に特徴的なイオンについてマスクロマトグラムの面積を算出する方法により実施した。
Claims (8)
- 分化状態が未知の幹細胞あるいは幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞とし、該被検細胞の培養上清における所定物質の存在量に基づいて該被検細胞の分化状態を評価する方法であって、
前記所定物質が、プトレシン、キヌレニン、シスタチオニン、アスコルビン酸、リボフラビン、ピルビン酸、セリン、システイン、トレオン酸、クエン酸、及びオロト酸から成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物であることを特徴とする細胞分化状態の評価方法。 - 前記被検細胞の培養上清における前記所定物質の存在量と、分化状態が既知である対照細胞の培養上清における前記所定物質の存在量とを比較することにより、前記被検細胞の分化状態を評価することを特徴とする請求項1に記載の細胞分化状態の評価方法。
- 前記対照細胞として分化していることが明らかな細胞を使用し、プトレシン、キヌレニン、シスタチオニン、アスコルビン酸、及びリボフラビンから成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物の、前記対照細胞の培養上清における存在量に対する前記被検細胞の培養上清における存在量の比が予め定めた閾値以上である場合に、前記分化状態が未知の幹細胞は未分化状態である、又は前記幹細胞より分化誘導を行った細胞には未分化状態の細胞が混在していると判定することを特徴とする請求項2に記載の細胞分化状態の評価方法。
- 前記対照細胞として分化していることが明らかな細胞を使用し、ピルビン酸、セリン、システイン、トレオン酸、クエン酸、及びオロト酸から成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物の、前記被検細胞の培養上清における存在量に対する前記対照細胞の培養上清における存在量の比が予め定めた閾値以上である場合に、前記分化状態が未知の幹細胞は未分化状態である、又は前記幹細胞より分化誘導を行った細胞には未分化状態の細胞が混在していると判定することを特徴とする請求項2に記載の細胞分化状態の評価方法。
- 前記対照細胞として未分化であることが明らかな細胞を使用し、プトレシン、キヌレニン、シスタチオニン、アスコルビン酸、及びリボフラビンから成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物の、前記対照細胞の培養上清における存在量に対する前記被検細胞の培養上清における存在量の比が予め定めた閾値以上である場合に、前記分化状態が未知の幹細胞は未分化状態である、又は前記幹細胞より分化誘導を行った細胞には未分化状態の細胞が混在していると判定することを特徴とする請求項2に記載の細胞分化状態の評価方法。
- 前記対照細胞として未分化であることが明らかな細胞を使用し、ピルビン酸、セリン、システイン、トレオン酸、クエン酸、及びオロト酸から成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物の、前記被検細胞の培養上清における存在量に対する前記対照細胞の培養上清における存在量の比が予め定めた閾値以上である場合に、前記分化状態が未知の幹細胞は未分化状態である、又は前記幹細胞より分化誘導を行った細胞には未分化状態の細胞が混在していると判定することを特徴とする請求項2に記載の細胞分化状態の評価方法。
- 前記幹細胞が多能性幹細胞であることを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の細胞分化状態の評価方法。
- 前記培養上清中の前記所定物質の存在量を質量分析法により定量することを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の細胞分化状態の評価方法。
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