WO2019244853A1 - 細胞のゲノム異常の評価方法 - Google Patents

細胞のゲノム異常の評価方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2019244853A1
WO2019244853A1 PCT/JP2019/023962 JP2019023962W WO2019244853A1 WO 2019244853 A1 WO2019244853 A1 WO 2019244853A1 JP 2019023962 W JP2019023962 W JP 2019023962W WO 2019244853 A1 WO2019244853 A1 WO 2019244853A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
indicator substance
sample
culture supernatant
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/023962
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
鈴木　崇
健一 豊田
雅俊 高橋
原　圭祐
智久 永田
大島　康弘
Original Assignee
株式会社 島津製作所
東京エレクトロン株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社 島津製作所, 東京エレクトロン株式会社 filed Critical 株式会社 島津製作所
Priority to US17/253,118 priority Critical patent/US20210278413A1/en
Priority to CN201980047166.XA priority patent/CN112673110A/zh
Priority to EP19821933.9A priority patent/EP3808855A4/en
Priority to JP2020525728A priority patent/JPWO2019244853A1/ja
Publication of WO2019244853A1 publication Critical patent/WO2019244853A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • G01N33/6812—Assays for specific amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5073—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating genomic abnormalities in cells, and more particularly, to a method for evaluating genomic abnormalities in cells that is simple, quick, and non-invasive without requiring specialty in evaluation.
  • Pluripotent stem cells such as iPS cells and ES cells can be differentiated into all kinds of cells constituting the body, and have been receiving great attention as cell sources for regenerative medicine.
  • iPS cells and ES cells need to be cultured in large quantities.
  • these cells become abnormal in their genomes after repeated divisions [numerical abnormalities of chromosomes, abnormalities in chromosome shapes (abnormalities in which part of a chromosome is transferred to another chromosome, abnormalities in which the direction of one part of a chromosome is reversed)] ]
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Since cells with a genomic abnormality also increase the possibility of causing cancer, it is necessary to confirm whether or not these genomic abnormalities have occurred before transplanting the cells.
  • Non-Patent Document 3 Japanese Chromosome Genetic Test Vol.32 No.1 2014, pp60-89.
  • Japanese Patent Application Publication No. 2010-508815 discloses a method for diagnosing chromosomal abnormality by analyzing components in a medium for culturing oocytes for fertilization and implantation. I have. In the publication, the cells of interest are oocytes, and there is no disclosure of pluripotent stem cells.
  • Non-Patent Document 3 The chromosome analysis method disclosed in Non-Patent Document 3 requires complicated technical procedures including pre-processing operations, and requires visualization with a microscope. For this reason, analysis evaluation by outsourcing is common. In this case, it takes several weeks to several months to obtain an analysis result.
  • the cells used for the evaluation are used for another purpose, for example, regenerative medicine.
  • regenerative medicine could not be used as a cell source.
  • An object of the present invention is to provide a simple and rapid method for evaluating non-invasive cell genomic abnormalities without requiring specialty for evaluation.
  • the present inventors have found that it is possible to evaluate cell genomic abnormalities based on the abundance of a specific indicator substance in a culture supernatant, leading to the present invention.
  • the present invention includes the following inventions. (1) A method for evaluating whether a pluripotent stem cell cultured in a culture medium or a cell that has been induced to differentiate from the pluripotent stem cell as a test cell, whether the test cell has a genomic abnormality.
  • the indicator substance is at least one selected from the group consisting of deoxycytidine, kynurenine, putrescine, alanine, cysteine, cystathionine, and threonic acid,
  • a method for evaluating a genomic abnormality comprising: evaluating whether or not the test cell has a genomic abnormality based on the abundance of the at least one indicator substance.
  • the method further comprises the step of measuring the abundance of the indicator substance in the culture supernatant of control cells known to have normal chromosomes, By comparing the abundance of the indicator substance in the culture supernatant of the test cell and the abundance of the indicator substance in the culture supernatant of the control cell, the test cell The method for evaluating a genomic abnormality according to the above (1), wherein whether the genomic has a genomic abnormality is evaluated.
  • the ratio of the indicator substance in the culture supernatant of the test cells to the abundance of the indicator substance in the culture supernatant of the control cell is a predetermined threshold value for the at least one indicator substance.
  • the test cell detects a genomic abnormality based on whether or not the ratio is below a predetermined threshold.
  • a method for culturing cells comprising a step of selecting the test cells based on a result of the genomic abnormality evaluation by the method according to any one of (1) to (9) above.
  • the method for evaluating a genomic abnormality according to the present invention is applied to a pluripotent stem cell cultured in a medium or a cell that has been induced to differentiate from a pluripotent stem cell as a test cell.
  • the present invention can be applied not only to pluripotent stem cells but also to general cells cultured in a medium.
  • Pluripotent stem cells include ES cells (Embryonic Stem cells, embryonic stem cells) and iPS cells (Induced Pluripotent Stem cells, induced pluripotent stem cells).
  • the measurement of the amount of the indicator substance in the culture supernatant may be performed by any method.
  • Representative methods include gas chromatography (GC), liquid chromatography (LC), mass spectrometry (MS), liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), and gas chromatography mass spectrometry (GC-MS). MS).
  • test cells can be used as a cell source or the like for regenerative medicine after chromosome analysis.
  • the present invention unlike the related art, visual observation of chromosomes using a microscope is unnecessary, and specialty for visual observation of chromosomes is not required.
  • the evaluation procedure is simple, and genomic abnormalities can be quickly evaluated.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a method for evaluating a genomic abnormality of a cell in one example of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the change over time in the abundance of the indicator substance threonate determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of control cells (sample C) and test cells (sample D) in Examples. It is.
  • the horizontal axis is the number of days of culture, and the vertical axis is the area ratio.
  • Area ratio area value of indicator substance / area value of internal standard substance. 3 to 8, the horizontal axis and the vertical axis represent the same.
  • FIG. 3 is a graph showing time-dependent changes in the abundance of the indicator substance cystathionine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of control cells (sample C) and test cells (sample D) in the examples. is there.
  • FIG. 4 is a graph showing the change over time in the abundance of the indicator substance kynurenine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (sample C) and the test cells (sample D) in the examples. is there.
  • FIG. 5 is a graph showing the change over time in the abundance of the indicator substance cysteine obtained by LC-MS analysis of the culture supernatant of control cells (sample C) and test cells (sample D) in Examples. is there.
  • FIG. 4 is a graph showing the change over time in the abundance of the indicator substance kynurenine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (sample C) and the test cells (sample D)
  • FIG. 6 is a graph showing the change over time in the abundance of the indicator substance alanine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (sample C) and the test cells (sample D) in Examples. is there.
  • FIG. 7 is a graph showing the change over time in the abundance of the indicator substance putrescine obtained by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (sample C) and the test cells (sample D) in Examples. is there.
  • FIG. 8 is a graph showing the change over time in the abundance of the indicator substance deoxycytidine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (sample C) and the test cells (sample D) in Examples. It is.
  • FIG. 7 is a graph showing the change over time in the abundance of the indicator substance putrescine obtained by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (sample C) and the test cells (sample D)
  • FIG. 9 shows the time course of the abundance of the indicator substance threonate determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D) in Examples. It is a graph which shows a change.
  • the horizontal axis is the number of days of culture, and the vertical axis is the area ratio.
  • Area ratio area value of indicator substance / area value of internal standard substance. 10 to 15, the horizontal axis and the vertical axis indicate the same.
  • FIG. 10 shows the time course of the abundance of the indicator substance kynurenine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D) in Examples.
  • FIG. FIG. 11 shows the time-dependent changes in the amount of the indicator substance cysteine obtained by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D) in Examples.
  • FIG. FIG. 12 shows the time-dependent changes in the amount of the indicator substance alanine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D) in Examples.
  • FIG. 13 shows changes over time in the abundance of the indicator substance putrescine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of control cells (samples A, B, and C) and test cells (sample D) in the examples.
  • FIG. FIG. 14 shows the time course of the abundance of the indicator substance deoxycytidine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B and C) and the test cells (sample D) in the examples. It is a graph which shows a change.
  • FIG. 15 is a graph showing time-dependent changes in the cell coverage obtained by imaging wells for control cells (sample C) and test cells (sample D) in the examples.
  • the horizontal axis is the number of days of culture, and the vertical axis is the cell coverage.
  • FIG. 16 shows the time course of the abundance of the indicator substance threonic acid obtained by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D). It is a graph which shows a change.
  • FIG. 16 shows the time course of the abundance of the indicator substance threonic acid obtained by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D). It is a graph which shows a change.
  • the horizontal axis is the number of culture days, and the vertical axis is the
  • FIG. 17 shows the time-dependent changes in the abundance of the indicator substance Kynurenine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D). It is a graph shown.
  • FIG. 18 shows the change over time in the abundance of the indicator substance cysteine (Cysteine) obtained by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D). It is a graph shown.
  • FIG. 18 shows the change over time in the abundance of the indicator substance cysteine (Cysteine) obtained by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D). It is a graph shown.
  • FIG. 19 shows the change over time in the abundance of the indicator substance alanine (Alanine) determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D). It is a graph shown.
  • FIG. 20 shows the change over time in the abundance of the indicator substance Putrecine (Putrecine) determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D). It is a graph shown.
  • FIG. 1 shows the change over time in the abundance of the indicator substance alanine
  • FIG. 21 shows the time course of the abundance of the indicator substance deoxycytidine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B and C) and the test cells (sample D).
  • FIG. FIG. 22 shows the indicator substance threonate determined by LC-MS analysis of the culture supernatant on the third day of culture for control cells (samples A, B, and C) and test cells (sample D) in Examples.
  • 5 is a graph showing ⁇ Conc / ⁇ Confluency in the culture supernatant of Example 1.
  • the vertical axis is ⁇ Conc / ⁇ Confluency. 23 to 27, the vertical axis represents the same.
  • FIG. 23 shows, in Examples, the indicator substance kynurenine of control cells (samples A, B, and C) and test cells (sample D) determined by LC-MS analysis of the culture supernatant on the third day of culture. It is a graph which shows (DELTA) Conc / (DELTA) Confluency in a culture supernatant.
  • FIG. 24 shows an example of the indicator substance cysteine obtained by LC-MS analysis of the culture supernatant on the third day of culture for control cells (samples A, B, and C) and test cells (sample D) in Examples. It is a graph which shows (DELTA) Conc / (DELTA) Confluency in a culture supernatant.
  • FIG. 24 shows an example of the indicator substance cysteine obtained by LC-MS analysis of the culture supernatant on the third day of culture for control cells (samples A, B, and C) and test cells (sample D) in Examples. It is
  • FIG. 25 shows, in the examples, the indicator substance alanine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant on the third day of culture for the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D). It is a graph which shows (DELTA) Conc / (DELTA) Confluency in a culture supernatant.
  • FIG. 26 shows, in the examples, the indicator substance putrescine of control cells (samples A, B, and C) and test cells (sample D) determined by LC-MS analysis of the culture supernatant on the third day of culture. It is a graph which shows (DELTA) Conc / (DELTA) Confluency in a culture supernatant.
  • FIG. 27 shows the indicator substance deoxycytidine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant on the third day of culture for the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D) in the examples.
  • 5 is a graph showing ⁇ Conc / ⁇ Confluency in the culture supernatant of Example 1.
  • the method for evaluating a genomic abnormality of the present invention uses a pluripotent stem cell cultured in a medium or a cell that has been induced to differentiate from a pluripotent stem cell as a test cell, and determines whether the test cell has a genomic abnormality.
  • the indicator substance that is, the biomarker is at least one selected from the group consisting of deoxycytidine, kynurenine, putrescine, alanine, cysteine, cystathionine, and threonic acid, In the evaluating step, whether the test cell has a genomic abnormality is evaluated based on the abundance of the at least one indicator substance.
  • the test cell is a pluripotent stem cell cultured in a medium or a cell that has been induced to differentiate from a pluripotent stem cell.
  • Pluripotent stem cells include ES cells (Embryonic Stem cells, embryonic stem cells) and iPS cells (Induced Pluripotent Stem cells, induced pluripotent stem cells).
  • ES cells Embryonic Stem cells, embryonic stem cells
  • iPS cells Induced Pluripotent Stem cells, induced pluripotent stem cells.
  • pluripotent stem cells repeatedly divide during culture in a culture medium, resulting in abnormalities in the genome [numerous chromosomal abnormalities, abnormal chromosomal shapes (abnormalities in which part of a chromosome is transferred to another chromosome, Anomalies in which the direction of certain parts of the chromosome are reversed)]. Therefore, it is necessary to confirm whether a genomic abnormality has occurred in the cell.
  • the method for evaluating a genomic abnormality further includes a step of measuring the abundance of an indicator substance in a culture supernatant of a control cell known to have a normal chromosome.
  • the evaluating step for the at least one indicator substance, the abundance of the indicator substance in the culture supernatant of the test cell and the presence of the corresponding indicator substance in the culture supernatant of the control cell By comparing with the amount, whether or not the test cell has a genomic abnormality is evaluated.
  • the method for evaluating a genomic abnormality comprises, instead of the step of measuring the abundance of the indicator substance in the culture supernatant of control cells known to have normal chromosomes, The abundance of the indicator substance in the culture supernatant of the control cells known to have been registered in advance in the library, and the abundance of the indicator substance in the culture supernatant of the control cells based on the library prepared in advance is used. You may. In this case, the culture conditions for the test cells need to be the same as or similar to the culture conditions used for the library preparation.
  • a medium used for culturing test cells and control cells a medium generally used for culturing stem cells, for example, DMEM / F12, or a medium containing DMEM / F12 as a main component (for example, mTeSR1, TeSR -E8, Essential-8) can be used.
  • Table 1 shows the components of DMEM / F12.
  • the indicator substance is at least one selected from the group consisting of deoxycytidine, kynurenine, putrescine, alanine, cysteine, cystathionine, and threonic acid.
  • deoxycytidine, kynurenine, putrescine, cystathionine, or threonate when the test cells have a genomic abnormality, tend to decrease as compared to normal cells without genomic abnormalities. Can be seen.
  • alanine or cysteine tends to increase when the test cell has a genomic abnormality, as compared with normal cells having no genomic abnormality.
  • the method for evaluating a genomic abnormality comprises, for the at least one indicator substance, the presence of the indicator substance in the culture supernatant of the test cell with respect to the abundance of the indicator substance in the culture supernatant of the control cell.
  • Ratio with quantity: Ratio (abundance of the indicator in the culture supernatant of the test cells) / (abundance of the indicator in the culture supernatant of the control cells) Is evaluated whether or not the test cell has a genomic abnormality based on whether or not is greater than or equal to a predetermined threshold.
  • the indicator substance is deoxycytidine, kynurenine, putrescine, cystathionine, or threonate
  • the indicator substance is deoxycytidine, kynurenine, putrescine, cystathionine, or threonate
  • the test cell has a genomic abnormality, as compared with a normal cell having no genomic abnormality
  • the indicator There is a tendency for substances to decrease. Therefore, it can be evaluated whether or not the test cell has a genomic abnormality based on whether or not the ratio is equal to or less than a predetermined threshold.
  • the indicator substance is alanine or cysteine
  • the indicator substance tends to increase in comparison with a normal cell having no genomic abnormality. . Therefore, it can be evaluated whether or not the test cell has a genomic abnormality based on whether or not the ratio is equal to or greater than a predetermined threshold.
  • the threshold value can be determined in advance by those skilled in the art.
  • the threshold may vary depending on the strain of test cell being cultured.
  • the indicator substances putrescine, deoxycytidine, and kynurenine are used. It is also recommended to select at least one selected from the group consisting of:
  • two or more of the indicator substances are selected as the indicator substances.
  • a cell known to have a specific abnormal chromosome may be used as a control cell instead of a cell known to have a normal chromosome.
  • the method for evaluating a genome abnormality may further include a step of measuring the abundance of the indicator substance in the culture supernatant of a control cell known to have a chromosome of a specific abnormal type.
  • the abundance of the indicator substance in the culture supernatant of control cells known to have a specific abnormal chromosome is registered in advance in a library, and the control cells are cultured based on the library prepared in advance. The amount of the indicator substance present in the supernatant may be used.
  • the culture conditions for the test cells need to be the same as or similar to the culture conditions used for the library preparation.
  • the at least one indicator substance is used as the indicator in the culture supernatant of the test cell.
  • the test cell By comparing the abundance of the substance with the abundance of the corresponding indicator substance in the culture supernatant of the control cell, it is evaluated whether or not the test cell has a genomic abnormality. That is, if the abundance of the indicator substance in the test cell, the same behavior as the abundance of the corresponding indicator substance in the control cells is observed, the test cell is an abnormal chromosome of the control cell. It can be determined that they have the same specific abnormal chromosome.
  • the test cell has an abnormal chromosome of the control cell. It can be determined that there is no. In this case, it can be determined that the test cell may have a normal chromosome or may have an abnormal chromosome different from the abnormal chromosome of the control cell.
  • a method for measuring the abundance of the indicator substance in the culture supernatant quantitative analysis using a gas chromatography analyzer (GC), a liquid chromatography analyzer (LC) or a mass spectrometer can be used.
  • Quantitative analysis using a chromatograph mass spectrometer (LC-MS) or a gas chromatograph mass spectrometer (GC-MS) can be preferably used, but is not limited thereto.
  • a sample obtained by subjecting a culture supernatant to a predetermined pretreatment is passed together with an eluent to a column of a liquid chromatography (LC) device, and components separated and eluted by the column are detected by an ultraviolet-visible spectrometer or an infrared spectrometer.
  • the abundance of the indicator substance contained in the sample may be determined from the result detected by a detector such as a detector. Further, a reagent or the like for causing each indicator substance to specifically develop or emit light may be added to the culture supernatant, and the abundance of the indicator substance may be determined based on the intensity of the color or emission.
  • the amount of the indicator substance is determined by gas chromatography (GC), liquid chromatography (LC), gas chromatography / mass spectrometry (GC-MS), or liquid chromatography / mass spectrometry (LC-MS).
  • the peak area value (Area) of the indicator substance or the concentration (Concentration) of the indicator substance in the culture supernatant calculated from the peak area value (Area) of the indicator substance can be used.
  • “Area / Cell Number” corrected by the number of cells (Cell Number, or Cell Count), " Concentration / Cell @ Number may be used.
  • the difference in the proliferation rate between the control cells and the test cells is reduced.
  • the peak area value of the indicator substance per cell number (Area / Confluency) or the concentration of the indicator substance (Concentration / Confluency) can be compared. Therefore, it is possible to perform highly accurate comparison in which the metabolism of the control cell and the test cell is reflected more, and it is possible to more accurately evaluate whether the test cell has a genomic abnormality.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a method for evaluating a genomic abnormality of a cell in one example of the present invention.
  • control cells were subcultured and cultured in 5 wells of 6 well plate (well diameter 35 mm) coated with vitronectin-N (Vitronectin-N, Life Technologies) (FIG. 1 shows only one well for simplicity). There).
  • vitronectin-N vitronectin-N, Life Technologies
  • FIG. 1 shows only one well for simplicity).
  • 1 well was prepared in which only the medium was added without passing cells.
  • Essential-8 was used as a medium, and the medium was changed every day.
  • Table 2 shows the constituent components of Essential-8. Culture was continued until the fourth day was reached, with the day when the cells were subcultured (passaged) as the first day.
  • the cells were transferred to a new 6-well plate (well diameter 35 mm) in 5 wells, and the culture was similarly continued until day 4 was reached.
  • Subculture was performed three times in total, and the culture supernatant collected from the culture well at the time of medium exchange on each day was used as sample A for analysis.
  • One set consists of the passage of the control cells and the completion of three subcultures.
  • the culture is performed under the same conditions in total of three sets, and the culture supernatant collected from the culture well at the time of medium exchange on each day is analyzed. (The culture supernatant sample collected in the second set was sample B for analysis, and the culture supernatant sample collected in the third set was sample C for analysis.)
  • test cells were subcultured and cultured in 5 wells of 6 well plate (well diameter 35 mm) coated with vitronectin-N (Vitronectin-N, Life Technologies) (FIG. 1 shows only one well for simplicity). ing).
  • 1 well was prepared in which only the medium was added without passing cells.
  • Essential-8 was used as a medium, and the medium was changed every day.
  • Culture was continued until the fourth day was reached, with the day when the cells were subcultured (passaged) as the first day. After 4 days of culture, the cells were transferred to a new 6-well plate (well diameter 35 mm) in 5 wells, and the culture was similarly continued until day 4 was reached.
  • the passage was performed three times in total, and the culture supernatant collected from the culture well at the time of medium exchange on each day was used as a sample D for mass spectrometry.
  • sample pre-processing To 50 ⁇ L of each sample, 20 ⁇ L of a 0.5 mM isopropylmalic acid aqueous solution was added as an internal standard substance, and 260 ⁇ L of methanol was further added to denature the protein contained in the sample. The protein was removed by a filtration filter, and the filtrate was collected.
  • the compound is identified by determining whether the difference between the retention index set in the database (a numerical value obtained by making the retention time relative) and the retention index of the derivatized compound in the sample is within ⁇ 5, and setting in the database. An index was used to determine whether both the determined quantitative ion and the confirming ion were detected for the derivatized compound in the sample. On the other hand, the quantification of the compound was carried out by a method of calculating the area of a mass chromatogram relating to ions characteristic of each derivatized compound in the sample according to the conditions set in the database.
  • LC-MS / MS conditions HPLC: Applicable equipment: Ultra high-performance liquid chromatograph Nexera X2 series (Shimadzu) Column: Discovery HS F5-3 * (2.1 mm ID ⁇ 150 mmL, particle size: 3 ⁇ m, Sigma-Aldrich) LC / MS: Equipment used: LCMS-8060, ultra-high-speed triple quadrupole mass spectrometer (Shimadzu Corporation)
  • analysis can also be performed by LC, and the results can be used to perform data analysis and evaluate genomic abnormalities in the same procedure as described below.
  • the value obtained by subtracting the area ratio of the control sample from the area ratio obtained for the control cells is [a]
  • the value obtained by subtracting the area ratio of the control sample from the area ratio obtained for the test cells is [b].
  • [A] / [a] where the increase rate of the cell coverage of the target cell every 24 hours of culture is [c] and the increase rate of the cell coverage of the test cells every 24 hours of culture is [d].
  • the confidence intervals of [c] and [b] / [d] do not overlap, the amount of substance produced or consumed by one cell during 24 hours of culturing includes the culture supernatant of the control cell and the culture supernatant of the test cell. It was determined that there was a significant difference between the two.
  • FIG. 2 is a graph showing the time-dependent changes in the abundance of the indicator substance Threonic acid (Threonic acid) determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of control cells (sample C) and test cells (sample D). It is.
  • the horizontal axis is the number of days of culture, and the vertical axis is the area ratio.
  • Area ratio area value of indicator substance / area value of internal standard substance. 3 to 8, the horizontal axis and the vertical axis represent the same.
  • FIG. 3 is a graph showing the change over time in the abundance of the indicator substance cystathionine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of control cells (sample C) and test cells (sample D). .
  • FIG. 3 is a graph showing the change over time in the abundance of the indicator substance cystathionine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of control cells (sample C) and test cells (sample D). .
  • FIG. 4 is a graph showing the change over time in the abundance of the indicator substance Kynurenine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (sample C) and the test cells (sample D).
  • FIG. 5 is a graph showing the change over time in the abundance of the indicator substance cysteine (Cysteine) determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (sample C) and the test cells (sample D).
  • FIG. 6 is a graph showing the time-dependent changes in the amount of the indicator substance alanine (Alanine) determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (sample C) and the test cells (sample D). .
  • FIG. 5 is a graph showing the change over time in the abundance of the indicator substance cysteine (Cysteine) determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (sample C) and the test cells (sample D).
  • FIG. 7 is a graph showing the change over time in the abundance of the indicator substance Putrecine (Putrecine) determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (sample C) and the test cells (sample D).
  • FIG. 8 is a graph showing the change over time of the abundance of the indicator substance deoxycytidine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (sample C) and the test cells (sample D). is there.
  • control cells (sample C) and the test cells (sample D) have substantially the same cell growth rate by culturing, that is, have the same number of cells over time.
  • FIG. 15 is a graph showing the change over time in the cell coverage obtained by imaging a well for control cells (sample C) and test cells (sample D). The horizontal axis is the number of days of culture, and the vertical axis is the cell coverage (Confluency). From FIG. 15, it can be seen that the cell growth curves of the control cells (sample C) and the test cells (sample D) by culturing are substantially the same. It is preferable that the sample of the control cell has a cell growth curve substantially identical to that of the sample of the test cell.
  • the cell growth curves are substantially the same, the number of cells is almost the same, so that the peak area value (Area) of the indicator substance per cell number or the concentration (Concentration) of the indicator substance can be compared. Therefore, it is possible to perform highly accurate comparison in which the metabolism of the control cell and the test cell is reflected more, and it is possible to more accurately evaluate whether the test cell has a genomic abnormality.
  • threonate, cystathionine, kynurenine, putrescine, and deoxycytidine as indicator substances show that the chromosome at the 18th chromosome is higher than that of control cells having normal chromosomes (sample C). In the test cells having abnormalities (sample D), a significant decrease was observed with the passage of time.
  • cysteine and alanine as indicator substances show that test cells (sample D) having an abnormality on the chromosome 18 in the test cells (sample D) have a higher level than control cells having normal chromosomes (sample C). There was a significant increase over time.
  • FIGS. 9 to 14 show control cells (sample A) and control cells (sample A) in addition to the control cells (sample C) and test cells (sample D) in comparison to FIGS. 2 and 4 to 8 described above.
  • the result of (Sample B) is added.
  • the control cells (sample A) and the control cells (sample B) differ from the control cells (sample C) and the test cells (sample D) in the cell growth rate by culture, that is, the number of cells over time is Although different, significant differences are found in the amount of each indicator substance between the control cells (samples AC) and the test cells (sample D). Therefore, even when the cell growth rate by culture is different, it is possible to evaluate whether or not the test cell has a genomic abnormality by comparing the abundance of each indicator substance in the control cell and the test cell. It is possible.
  • FIG. 16 shows the time course of the abundance of the indicator substance threonic acid determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D). It is a graph which shows a change.
  • FIG. 16 shows the time course of the abundance of the indicator substance threonic acid determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D). It is a graph which shows a change.
  • the horizontal axis is the number of culture days, and the vertical axis is the area ratio / cell coverage.
  • Area ratio area value of indicator substance / area value of internal standard substance. 17
  • FIG. 17 shows the time-dependent changes in the abundance of the indicator substance Kynurenine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D). It is a graph shown.
  • FIG. 18 shows the change over time in the abundance of the indicator substance cysteine (Cysteine) obtained by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D). It is a graph shown.
  • FIG. 18 shows the change over time in the abundance of the indicator substance cysteine (Cysteine) obtained by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D). It is a graph shown.
  • FIG. 19 shows the change over time in the abundance of the indicator substance alanine (Alanine) determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D). It is a graph shown.
  • FIG. 20 shows the change over time in the abundance of the indicator substance Putrecine (Putrecine) determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D). It is a graph shown.
  • FIG. 21 shows the time course of the abundance of the indicator substance deoxycytidine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B and C) and the test cells (sample D).
  • control cells (sample C) and the test cells (sample D) have substantially the same cell growth rate by culturing, that is, have substantially the same number of cells over time. Things.
  • threonate, kynurenine, putrescine, and deoxycytidine as indicator substances show abnormalities on the 18th chromosome as compared to control cells having normal chromosomes (sample C).
  • cysteine and alanine as indicator substances show that the test cells (sample D) having an abnormality on the 18th chromosome showed higher levels than the control cells having normal chromosomes (sample C). There was a significant increase over time.
  • Table 3 shows the 95% confidence intervals for each indicator substance
  • Table 4 shows the 90% confidence intervals for each indicator substance.
  • the value obtained by subtracting the area ratio of the control sample from the area ratio obtained for the control cell samples A, B, and C was [a]
  • the area of the control sample was obtained from the area ratio obtained for the test cells.
  • the value obtained by subtracting the ratio was [b]
  • the rate of increase of the cell coverage of the target cells every 24 hours of culture was [c]
  • the rate of increase of the cell coverage of the test cells every 24 hours of culture was [d].
  • the confidence intervals of [a] / [c] and [b] / [d] do not overlap, the amount of substance produced or consumed by one cell during 24 hours of cultivation differs from the culture supernatant of control cells. It was determined that there was a significant difference between the culture supernatants of the test cells. By making such a determination, a more accurate determination can be made.
  • FIG. 22 shows the indicator substance Threonic acid (Threonic acid) determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D) on day 3 of the culture.
  • 5 is a graph showing ⁇ Conc / ⁇ Confluency in the culture supernatant of Example 1.
  • the vertical axis is ⁇ Conc / ⁇ Confluency. 23 to 27, the vertical axis represents the same.
  • FIG. 23 shows the culture of the indicator substance kynurenine (Kynurenine) determined by LC-MS analysis of the culture supernatant on the third day of culture for the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D).
  • FIG. 24 shows the cultivation of the indicator substance cysteine (Cysteine) determined by LC-MS analysis of the culture supernatant on the third day of culturing for the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D). It is a graph which shows (DELTA) Conc / (DELTA) Confluency in a supernatant.
  • FIG. 25 shows the cultivation of the indicator substance Alanine (Alanine) determined by LC-MS analysis of the culture supernatant on the third day of culturing for the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D) It is a graph which shows (DELTA) Conc / (DELTA) Confluency in a supernatant.
  • FIG. 26 shows the culture of the indicator substance Putrecine (Putrecine) determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D) on day 3 of the culture.
  • Putrecine Putrecine
  • FIG. 27 shows the indicator substance Deoxycytidine determined by LC-MS analysis of the culture supernatant of the control cells (samples A, B, and C) and the test cells (sample D) on day 3 of the culture. It is a graph which shows (DELTA) Conc / (DELTA) Confluency in a culture supernatant.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

評価についての専門性を必要とすることなく、簡便且つ迅速であり、非侵襲的な細胞のゲノム異常の評価方法を提供する。培地中で培養された多能性幹細胞あるいは多能性幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞として、該被検細胞がゲノム異常を有するか否かを評価する方法であって、被検細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップと、前記指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かを評価するステップとを含み、前記指標物質が、デオキシシチジン、キヌレニン、プトレシン、アラニン、システイン、シスタチオニン、及びトレオン酸からなる群から選ばれる少なくとも１つであり、前記少なくとも１つの指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、ゲノム異常評価方法。

Description

細胞のゲノム異常の評価方法
　本発明は、細胞のゲノム異常の評価方法に関し、より詳しくは、評価についての専門性を必要とすることなく、簡便且つ迅速であり、非侵襲的な細胞のゲノム異常の評価方法に関する。
　ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞は、体を構成するあらゆる細胞に分化することが可能であり、再生医療用の細胞供給源として大きな注目を集めている。再生医療用途にこれら細胞を用いるためには、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞を大量に培養する必要がある。一方で、これらの細胞は分裂を繰り返すとゲノムに異常［染色体の数的異常、染色体の形状異常（染色体の一部が他の染色体に移る異常、染色体のある部分の向きが逆となる異常）］が生じる危険が高まることが知られている（非特許文献１、２）。ゲノムに異常が生じた細胞は癌化を引き起こす可能性も高まるため、細胞を移植する前にこれらゲノム異常が生じていないかどうかを確認する必要がある。
　染色体の解析法としては、細胞を一定数培養した後、コルセミド溶液で分裂を停止させ、低張液で処理した後、メタノール／酢酸などで固定する。その後、スライドグラス上で標本を作製し、ギムザ染色またはＧバンド／Ｑバンド処理などを行った後に顕微鏡観察する手法が一般的である。非特許文献３（日本染色体遺伝子検査 Vol.32 No.1 2014, pp60-89）参照。
　特表２０１０－５０８８１５号公報（ＷＯ２００８／０６６６５５号公報）には、受精および着床についての卵母細胞を培養する際の培地中の成分を分析して、染色体異常を診断する方法が開示されている。同号公報において、対象となる細胞は卵母細胞であり、多能性幹細胞についての開示はない。
特表２０１０－５０８８１５号公報 ＷＯ２００８／０６６６５５号公報
Louise C. Laurent, et. al., "Dynamic Changes in the Copy Number of Pluripotency and Cell Proliferation Genes in Human ES and iPS Cells during Reprogramming and Time in Culture", Cell Stem Cell 8, 106-118, January 7, 2011 "Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage", Nature Biotechnology volume 29, 1132-1144 (2011) 日本染色体遺伝子検査学会，「染色体遺伝子検査の品質保証のための指針　第２編」（Guidelines for Quality Assurance of Chromosomal and Genetic Testing Second Edition），日本染色体遺伝子検査 Vol.32 No.1 2014, pp60-89
　上記非特許文献３に開示の染色体の解析法は、前処理操作を含めてその手順が煩雑であることに加え、顕微鏡での目視観察となるため、評価には専門性を必要とする。そのため、外部委託による解析評価が一般的となっている。この場合、解析結果が得られるまでに数週間から数カ月を要する。
　また、上記解析法では、いずれも細胞に対して侵襲的な処理を行う必要があるため、染色体の解析を行った後に、該評価に供した細胞を別の目的に利用すること、例えば再生医療用の細胞源とすることができなかった。
　本発明の目的は、評価についての専門性を必要とすることなく、簡便且つ迅速であり、非侵襲的な細胞のゲノム異常の評価方法を提供することにある。
　本発明者らは鋭意検討した結果、培養上清中の特定の指標物質の存在量に基づいて、細胞のゲノム異常を評価できることを見出し、本発明に至った。
　本発明は、以下の発明を含む。
（１）　培地中で培養された多能性幹細胞あるいは多能性幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞として、該被検細胞がゲノム異常を有するか否かを評価する方法であって、
　被検細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップと、
　前記指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かを評価するステップとを含み、
　前記指標物質が、デオキシシチジン、キヌレニン、プトレシン、アラニン、システイン、シスタチオニン、及びトレオン酸からなる群から選ばれる少なくとも１つであり、
　前記少なくとも１つの指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、ゲノム異常評価方法。
（２）　正常型の染色体を有することが判っている対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップをさらに含み、
　前記少なくとも１つの指標物質について、前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量とを比較することにより、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、上記（１）に記載のゲノム異常評価方法。
（３）　前記少なくとも１つの指標物質について、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量に対する前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量との比が、予め定めた閾値以上であるか否か又は閾値以下であるか否かに基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、上記（２）に記載のゲノム異常評価方法。
（４）　前記指標物質が、デオキシシチジン、キヌレニン、プトレシン、シスタチオニン、又はトレオン酸の場合に、前記比が、予め定めた閾値以下であるか否かに基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、上記（３）に記載のゲノム異常評価方法。
（５）　前記指標物質が、アラニン、又はシステインの場合に、前記比が、予め定めた閾値以上であるか否かに基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、請求項３に記載のゲノム異常評価方法。
（６）　前記指標物質のうち、プトレシン、デオキシシチジン、及びキヌレニンからなる群から選ばれる少なくとも１つを指標物質として選択する、上記（１）～（４）のうちのいずれかに記載のゲノム異常評価方法。
（７）　前記指標物質のうち、２種以上を指標物質として選択する、上記（１）～（６）のうちのいずれかに記載のゲノム異常評価方法。
（８）　１８番目の染色体に異常を有するか否かを評価する、上記（１）～（７）のうちのいずれかに記載のゲノム異常評価方法。
（９）　前記培養上清中の前記指標物質の存在量を、ＬＣ－ＭＳ（液体クロマトクラフ質量分析計）を用いて行う、上記（１）～（８）のうちのいずれかに記載のゲノム異常評価方法。
　上記（１）～（９）のうちのいずれかに記載の方法によるゲノム異常評価結果に基づいて、前記被検細胞を選別する工程を含む、細胞の培養方法。
　本発明のゲノム異常評価方法は、培地中で培養された多能性幹細胞あるいは多能性幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞として適用される。しかしながら、多能性幹細胞に限らず、培地中で培養された一般の細胞にも適用され得る。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞（Embryonic Stem cells、胚性幹細胞）やｉＰＳ細胞（Induced Pluripotent Stem cells、人工多能性幹細胞）等である。
　本発明において、前記培養上清中の前記指標物質の存在量に測定は、どのような方法を用いて行ってもよい。代表的な方法としてガスクロマトグラフィー分析法（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー分析法（ＬＣ）、質量分析法（ＭＳ）、液体クロマトクラフ質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）、ガスクロマトグラフ質量分析法（ＧＣ－ＭＳ）を挙げることができる。
　本発明によれば、細胞の染色体を解析するのに培養上清を採取すればよいだけであるため、従来のような煩雑な前処理が必要なく、短時間で解析結果を得ることが可能となる。また、従来のように細胞に対して侵襲的な処理を行う必要がないため、染色体の解析後に、被検細胞を再生医療用の細胞源等として利用することが可能となる。
　すなわち、本発明によれば、従来のように、顕微鏡を用いた染色体の目視観察は不要であり、染色体の目視観察についての専門性を必要としない。また、評価手順は簡便であり、迅速にゲノム異常の評価を行うことができる。
図１は、本発明の一実施例における細胞のゲノム異常の評価方法を説明する模式図である。 図２は、実施例において、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質トレオン酸の存在量の経時変化を示すグラフである。横軸は培養日数であり、縦軸は面積比である。面積比＝指標物質の面積値／内部標準物質の面積値。図３～図８において、横軸、及び縦軸は同じことを表す。 図３は、実施例において、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質シスタチオニンの存在量の経時変化を示すグラフである。 図４は、実施例において、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質キヌレニンの存在量の経時変化を示すグラフである。 図５は、実施例において、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質システインの存在量の経時変化を示すグラフである。 図６は、実施例において、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質アラニンの存在量の経時変化を示すグラフである。 図７は、実施例において、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質プトレシンの存在量の経時変化を示すグラフである。 図８は、実施例において、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質デオキシシチジンの存在量の経時変化を示すグラフである。 図９は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質トレオン酸の存在量の経時変化を示すグラフである。横軸は培養日数であり、縦軸は面積比である。面積比＝指標物質の面積値／内部標準物質の面積値。図１０～図１５において、横軸、及び縦軸は同じことを表す。 図１０は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質キヌレニンの存在量の経時変化を示すグラフである。 図１１は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質システインの存在量の経時変化を示すグラフである。 図１２は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質アラニンの存在量の経時変化を示すグラフである。 図１３は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質プトレシンの存在量の経時変化を示すグラフである。 図１４は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質デオキシシチジンの存在量の経時変化を示すグラフである。 図１５は、実施例において、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、ｗｅｌｌの撮像により求められた細胞被覆率の経時変化を示すグラフである。横軸は培養日数であり、縦軸は細胞被覆率である。 図１６は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質トレオン酸(Threonic acid)の存在量の経時変化を示すグラフである。横軸は培養日数であり、縦軸は面積比／細胞被覆率である。面積比＝指標物質の面積値／内部標準物質の面積値。図１７～図２１において、横軸、及び縦軸は同じことを表す。 図１７は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質キヌレニン(Kynurenine)の存在量の経時変化を示すグラフである。 図１８は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質システイン(Cysteine)の存在量の経時変化を示すグラフである。 図１９は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質アラニン(Alanine)の存在量の経時変化を示すグラフである。 図２０は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質プトレシン(Putrecine)の存在量の経時変化を示すグラフである。 図２１は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質デオキシシチジン(Deoxycytidine)の存在量の経時変化を示すグラフである。 図２２は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質トレオン酸の培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。縦軸はΔConc／ΔConfluencyである。図２３～図２７において、縦軸は同じことを表す。 図２３は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質キヌレニンの培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。 図２４は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質システインの培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。 図２５は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質アラニンの培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。 図２６は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質プトレシンの培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。 図２７は、実施例において、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質デオキシシチジンの培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。
　本発明のゲノム異常評価方法は、培地中で培養された多能性幹細胞あるいは多能性幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞として、該被検細胞がゲノム異常を有するか否かを評価する方法であって、
　被検細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップと、
　前記指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かを評価するステップとを含む。
　前記指標物質、すなわちバイオマーカーが、デオキシシチジン、キヌレニン、プトレシン、アラニン、システイン、シスタチオニン、及びトレオン酸からなる群から選ばれる少なくとも１つであり、
　前記評価ステップにおいて、前記少なくとも１つの指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる。
　本発明において、被検細胞は、培地中で培養された多能性幹細胞あるいは多能性幹細胞より分化誘導を行った細胞である。多能性幹細胞は、ＥＳ細胞（Embryonic Stem cells、胚性幹細胞）やｉＰＳ細胞（Induced Pluripotent Stem cells、人工多能性幹細胞）等である。このような多能性幹細胞は、培地中で培養している間に分裂を繰り返して、ゲノムに異常［染色体の数的異常、染色体の形状異常（染色体の一部が他の染色体に移る異常、染色体のある部分の向きが逆となる異常）］が生じる危険が高まる。そのため、細胞にゲノム異常が生じていないかどうかを確認する必要がある。
　本発明の好ましい形態において、ゲノム異常評価方法は、正常型の染色体を有することが判っている対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップをさらに含む。この形態の場合、前記評価ステップにおいて、前記少なくとも１つの指標物質について、前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記対応する指標物質の存在量とを比較することにより、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる。
　本発明の別の形態において、ゲノム異常評価方法は、正常型の染色体を有することが判っている対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップの代わりに、正常型の染色体を有することが判っている対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を予めライブラリの登録しておき、前記予め作製されたライブラリに基づいた対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を用いてもよい。この場合、前記被検細胞の培養条件は、ライブラリ作製に用いた培養条件と同じか又は近似したものとする必要がある。
　被検細胞の培養、及び対照細胞の培養に用いる培地としては、幹細胞の培養に一般的に使用される培地、例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２や、該ＤＭＥＭ／Ｆ１２を主成分とする培地（例えばｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ－Ｅ８、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ－８等）を用いることができる。表１にＤＭＥＭ／Ｆ１２の構成成分を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明において、前記指標物質は、デオキシシチジン、キヌレニン、プトレシン、アラニン、システイン、シスタチオニン、及びトレオン酸からなる群から選ばれる少なくとも１つである。
　前記指標物質のうち、デオキシシチジン、キヌレニン、プトレシン、シスタチオニン、又はトレオン酸は、前記被検細胞がゲノム異常を有する場合に、ゲノム異常の存在しない正常型の細胞の場合に比べ、減少する傾向が見られる。一方、前記指標物質のうち、アラニン、又はシステインは、前記被検細胞がゲノム異常を有する場合に、ゲノム異常の存在しない正常型の細胞の場合に比べ、増加する傾向が見られる。
　本発明の好ましい形態において、ゲノム異常評価方法は、前記少なくとも１つの指標物質について、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量に対する前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量との比：
比＝（前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量）／（前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量）
が、予め定めた閾値以上であるか否か又は閾値以下であるか否かに基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる。
　前記指標物質が、デオキシシチジン、キヌレニン、プトレシン、シスタチオニン、又はトレオン酸の場合には、前記被検細胞がゲノム異常を有する場合に、ゲノム異常の存在しない正常型の細胞の場合に比べ、前記指標物質が減少する傾向が見られる。そのため、前記比が、予め定めた閾値以下であるか否かに基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価を行うことができる。
　前記指標物質が、アラニン、又はシステインの場合には、前記被検細胞がゲノム異常を有する場合に、ゲノム異常の存在しない正常型の細胞の場合に比べ、前記指標物質が増加する傾向が見られる。そのため、前記比が、予め定めた閾値以上であるか否かに基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価を行うことができる。
　これらの形態の場合において、閾値は当業者が予め定めることができる。閾値は、培養される被検細胞の株にもよって異なり得る。
　本発明において、ゲノム異常の存在しない正常型の細胞とゲノム異常を有する細胞との間で有意な存在量の差異が認められるという観点から、前記指標物質のうち、プトレシン、デオキシシチジン、及びキヌレニンからなる群から選ばれる少なくとも１つを指標物質として選択することも推奨される。
　また、本発明において、前記指標物質のうち、２種以上を指標物質として選択することも好ましい。２種以上の指標物質の存在量に基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価を行うことにより、より確度の高い評価を行い得る。
　本発明において、特に１８番目の染色体に異常を有するか否かを評価することができる。
　また、本発明の別の形態において、正常型の染色体を有することが判っている細胞に代えて、ある特定の異常型の染色体を有することが判っている細胞を対照細胞とする場合もある。この形態の場合、本ゲノム異常評価方法は、ある特定の異常型の染色体を有することが判っている対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップをさらに含むとよい。あるいは、ある特定の異常型の染色体を有することが判っている対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を予めライブラリの登録しておき、前記予め作製されたライブラリに基づいた対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を用いてもよい。この場合、前記被検細胞の培養条件は、ライブラリ作製に用いた培養条件と同じか又は近似したものとする必要がある。
　そして、ある特定の異常型の染色体を有することが判っている細胞を対照細胞とする形態の場合、前記評価ステップにおいて、前記少なくとも１つの指標物質について、前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記対応する指標物質の存在量とを比較することにより、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる。すなわち、前記被検細胞における前記指標物質の存在量が、前記対照細胞における前記対応する指標物質の存在量と同様の挙動が認められれば、該被検細胞は、前記対照細胞の異常型染色体と同じ特定の異常型染色体を有すると判断できる。前記被検細胞における前記指標物質の存在量が、前記対照細胞における前記対応する指標物質の存在量と異なる挙動が認められれば、該被検細胞は、前記対照細胞の異常型染色体を有していないと判断できる。この場合、該被検細胞は、正常型染色体を有しているか、あるいは、前記対照細胞の異常型染色体とは別の異常型染色体を有している可能性があると判断できる。
　培養上清における前記指標物質の存在量を測定する方法としては、ガスクロマトグラフィー分析装置（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー分析装置（ＬＣ）や質量分析装置による定量分析を用いることができ、特に、液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ）や、ガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ－ＭＳ）を用いた定量分析を好適に利用することができるが、これに限定されるものではない。例えば、培養上清に所定の前処理を施した試料を溶離液とともに液体クロマトグラフィー（ＬＣ）装置のカラムに流し、カラムにより分離されて溶出する成分を、紫外可視分光検出器や赤外分光検出器等の検出器で検出した結果から、試料中に含まれる前記指標物質の存在量を求めるようにしてもよい。また、前記各指標物質を特異的に発色又は発光させる試薬等を培養上清に添加し、該発色又は発光の強度に基づいて指標物質の存在量を求めるようにしてもよい。
　前記指標物質の存在量については、ガスクロマトグラフィー分析法（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー分析法（ＬＣ）、ガスクロマトグラフ質量分析法（ＧＣ－ＭＳ）、又は液体クロマトグラフ質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）における、該指標物質のピーク面積値(Area)、あるいは、該指標物質のピーク面積値(Area)から算出される培養上清における前記指標物質の濃度(Concentration)を用いることができる。あるいは、細胞の密集度(Confluency)で補正（規格化）した「Area／Confluency」、「Concentration／Confluency」；　細胞の数(Cell Number, or Cell Count)で補正した「Area／Cell Number」、「Concentration／Cell Number」を用いてもよい。細胞の密集度(Confluency)又は細胞の数(Cell Number, or Cell Count)で補正（規格化）した値を用いることにより、対照細胞と被検細胞との間で、これらの増殖率に差異がある場合においても、細胞個数当たりの指標物質のピーク面積値（Area／Confluency）又は指標物質の濃度（Concentration／Confluency）同士で比較できる。そのため、対照細胞と被検細胞それぞれの代謝がより反映された精度の高い比較が可能となり、被検細胞がゲノム異常を有するか否かをより精度高く評価することが可能となる。
　以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に制限されるものではない。
　本発明の方法による細胞のゲノム異常の有無の評価の一実施例について説明する。図１は、本発明の一実施例における細胞のゲノム異常の評価方法を説明する模式図である。
　本実施例では、同一のヒトｉＰＳ細胞株からそれぞれ培養された４つのサンプル［正常な染色体を持つヒトｉＰＳ細胞株サンプル（Ａ，Ｂ，Ｃ）及び１８番目の染色体に異常を有するヒトｉＰＳ細胞株サンプル（Ｄ）］を使用した。すなわち、この例では、正常な染色体を持つｉＰＳ細胞株からの対照細胞サンプルＡ，Ｂ，Ｃ、及び染色体に異常を有するｉＰＳ細胞株からの被験細胞サンプルＤを用いた。以下、本実施例における細胞培養から培養上清の分析までの手順について説明する。
［対照細胞の培養及び培養上清の回収］
　ビトロネクチン－Ｎ（Vitronectin-N、Life Technologies社）がコートされた６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（ｗｅｌｌ直径３５ｍｍ）の５ｗｅｌｌに前記対照細胞を植え継いで培養を行った（図１では簡略化のためｗｅｌｌ１枚のみを示している）。また、コントロールサンプルとして細胞を植え継かずに培地のみ添加したものを１ｗｅｌｌ作製した。培地としてはＥｓｓｅｎｔｉａｌ－８を使用し、毎日培地の交換を行った。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ－８の構成成分を表２に示す。細胞の植え継ぎ（継代）を行った日を１日目として４日目に達するまで培養を継続した。培養４日後に新しい６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（ｗｅｌｌ直径３５ｍｍ）の５ｗｅｌｌに細胞を植え継ぎ、同様に４日目に達するまで培養を継続した。継代は合計３回実施し、各日の培地交換時に培養ｗｅｌｌから回収した培養上清を分析用のサンプルＡとした。前記対照細胞を植え継いでから３回の継代培養が完了するまでを１セットとし、合計で３セット同じ条件で培養を実施し各日の培地交換時に培養ｗｅｌｌから回収した培養上清を分析用のサンプルとした（２セット目に回収した培養上清サンプルを分析用のサンプルＢ、３セット目に回収した培養上清サンプルを分析用のサンプルＣとした。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［被検細胞の培養及び培養上清の回収］
　ビトロネクチン－Ｎ（Vitronectin-N、Life Technologies社）がコートされた６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（ｗｅｌｌ直径３５ｍｍ）の５ｗｅｌｌに前記被検細胞を植え継いで培養を行った（図１では簡略化のためｗｅｌｌ１枚のみを示している）。また、コントロールサンプルとして細胞を植え継かずに培地のみ添加したものを１ｗｅｌｌ作製した。培地としてはＥｓｓｅｎｔｉａｌ－８を使用し、毎日培地の交換を行った。細胞の植え継ぎ（継代）を行った日を１日目として４日目に達するまで培養を継続した。培養４日後に新しい６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（ｗｅｌｌ直径３５ｍｍ）の５ｗｅｌｌに細胞を植え継ぎ、同様に４日目に達するまで培養を継続した。継代は合計３回実施し、各日の培地交換時に培養ｗｅｌｌから回収した培養上清を質量分析用のサンプルＤとした。
［サンプルの前処理］
　前記各サンプル５０μＬに、それぞれ内部標準物質として０．５ｍＭイソプロピルリンゴ酸水溶液２０μＬを添加し、さらにメタノール２６０μＬを添加することでサンプル中に含まれるタンパク質を変性させた。ろ過フィルターによる除タンパク処理を行い、ろ液を回収した。
［ＧＣ－ＭＳによる分析］
　上述の前処理を行った各サンプルを凍結乾燥した後、メトキシアミン塩酸塩を含むピリジン溶液中でインキュベートした後、更に、各サンプルにＭＳＴＦＡ（Ｎ－メチル－Ｎ－トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド）を添加することでサンプル中の化合物をトリメチルシリル化した。そして、これらの誘導体化処理を施したサンプルをＧＣ－ＭＳによる分析に供した。分析結果の解析には、島津製作所製の「Smart Metabolites Database」を使用した。該データベースは前記と同様の誘導体化処理を施した種々の化合物標準品をＧＣ－ＭＳで分析したデータが集約されたものである。化合物の同定は、前記データベースで設定された保持指標（保持時間を相対化した数値）とサンプル中の誘導体化化合物の保持指標との差が±５以内であるか否か、及び前記データベースで設定された定量イオン及び確認イオンの両者がサンプル中の誘導体化化合物について検出されているか否かを指標に行った。一方、化合物の定量は、前記データベースで設定された条件に従い、サンプル中の各誘導体化化合物に特徴的なイオンに関するマスクロマトグラムの面積を算出する方法により実施した。
［ＬＣ－ＭＳによる分析］
　上述の前処理を行った各サンプルに適当量の超純水（Milli-Q（登録商標）水、メルク株式会社）を加えて希釈し、ＬＣ－ＭＳによる分析に供した。ＬＣ－ＭＳ分析では、各サンプル中の化合物を逆相分離カラムを用いた勾配溶出によって時間的に分離した後、多重反応モニタリング（ＭＲＭ、Multiple Reaction Monitoring）モードによる質量分析を行った。ＭＲＭモードにおける分析条件の設定は、化合物標準品を用いて実施した。化合物の同定は、標準品の保持時間とサンプル中の化合物の保持時間との差が±０．１分以内であるか否かを基準に行った。また、化合物の定量は、サンプル中の各化合物に特徴的なイオンについてマスクロマトグラムの面積を算出する方法により実施した。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの条件：
ＨＰＬＣ：
使用装置：超高速液体クロマトグラフNexera X2シリーズ（島津製作所）
カラム：Discovery HS F5-3* (2.1mmI.D.×150mmL、粒子径：3μｍ、Sigma-Aldrich）
ＬＣ／ＭＳ：
使用装置：超高速トリプル四重極型質量分析計LCMS-8060（島津製作所）
　ＧＣ－ＭＳによる分析、ＬＣ－ＭＳによる分析の他に、ＬＣによっても分析でき、その結果を用いて、以下と同様の手順によって、データ解析を行い、ゲノム異常についての評価を行うことができる。
［細胞被覆率の測定］
　Biostudio（Nikon製）を用いて各培養日にｗｅｌｌを撮像し、ｗｅｌｌ中の細胞が占める面積割合を細胞被覆率として算出した。
［データ解析１：指標物質の面積比］
　各培養日に回収された培養上清サンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄについて、上記のＬＣ－ＭＳ分析を行うことにより求められた各指標物質化合物（マーカー）の定量値（面積値）を、前記内部標準物質の定量値（面積値）で除した値(面積比)を算出した。そして、対照細胞と被検細胞のそれぞれに関し、前記５ｗｅｌｌから回収した培養上清をそれぞれＬＣ－ＭＳで分析した結果から得られた面積比からコントロールサンプルの面積比を差し引いた値を計算し、さらに細胞被覆率で補正した補正値を、１細胞が培養２４時間の間に産生または消費した物質量の指標値として比較した。具体的には、対照細胞について求められた面積比からコントロールサンプルの面積比を差し引いた値を［ａ］、被検細胞について求められた面積比からコントロールサンプルの面積比を差し引いた値を［ｂ］、培養２４時間毎における対象細胞の細胞被覆率の増加率を［ｃ］、培養２４時間毎における被検細胞の細胞被覆率の増加率を［ｄ］としたときに、［ａ］／［ｃ］と［ｂ］／［ｄ］の信頼区間が重ならないとき、１細胞が培養２４時間の間に産生または消費した物質量には対照細胞の培養上清と被検細胞の培養上清の間で有意差があると判定した。
　まず、面積比(Area ratio)から得られた結果を以下に示す。
　図２は、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質トレオン酸(Threonic acid)の存在量の経時変化を示すグラフである。横軸は培養日数であり、縦軸は面積比である。面積比＝指標物質の面積値／内部標準物質の面積値。図３～図８において、横軸、及び縦軸は同じことを表す。
　図３は、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質シスタチオニン(Cystathionine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
　図４は、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質キヌレニン(Kynurenine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
　図５は、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質システイン(Cysteine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
　図６は、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質アラニン(Alanine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
　図７は、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質プトレシン(Putrecine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
　図８は、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質デオキシシチジン(Deoxycytidine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
　ここで、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）は、培養による細胞増殖率が略同じであるもの、すなわち、時間経過による細胞数が略同じものである。図１５は、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、ｗｅｌｌの撮像により求められた細胞被覆率の経時変化を示すグラフである。横軸は培養日数であり、縦軸は細胞被覆率(Confluency)である。図１５より、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）で培養による細胞増殖曲線が略一致していることがわかる。対照細胞のサンプルとしては、被検細胞のサンプルと、細胞増殖曲線が概ね一致しているものであることが好ましい。細胞増殖曲線が概ね一致していれば、細胞個数が概ね同等であるので、細胞個数当たりの指標物質のピーク面積値（Area）又は指標物質の濃度（Concentration）同士で比較できる。そのため、対照細胞と被検細胞それぞれの代謝がより反映された精度の高い比較が可能となり、被検細胞がゲノム異常を有するか否かをより精度高く評価することが可能となる。
　図２～図４、及び図７～図８より、指標物質としてのトレオン酸、シスタチオニン、キヌレニン、プトレシン、及びデオキシシチジンは、正常型染色体を有する対照細胞（サンプルＣ）に比べ、１８番目の染色体に異常を有する被検細胞（サンプルＤ）では、時間経過により有意な減少が見られた。
　一方、図５～図６より、指標物質としてのシステイン、及びアラニンは、正常型染色体を有する対照細胞（サンプルＣ）に比べ、１８番目の染色体に異常を有する被検細胞（サンプルＤ）では、時間経過により有意な増加が見られた。
　図９～図１４は、前記の図２及び図４～図８に対して、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）の他に、さらに、対照細胞（サンプルＡ）及び対照細胞（サンプルＢ）についての結果を書き加えたものである。対照細胞（サンプルＡ）及び対照細胞（サンプルＢ）は、対照細胞（サンプルＣ）及び被検細胞（サンプルＤ）とは、培養による細胞増殖率が異なっており、すなわち、時間経過による細胞数は異なっているが、対照細胞（サンプルＡ～Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）とでは、各指標物質の存在量において有意な差が見られる。したがって、培養による細胞増殖率が異なる場合であっても、対照細胞と被検細胞における各指標物質の存在量を比較することで、被検細胞がゲノム異常を有するか否かを評価することが可能である。
　次に、面積比（Area ratio）の値を細胞被覆率（Confluency）により補正した補正値（Area ratio／Confluency）から得られた結果を以下に示す。
　図１６は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質トレオン酸(Threonic acid)の存在量の経時変化を示すグラフである。横軸は培養日数であり、縦軸は面積比／細胞被覆率である。面積比＝指標物質の面積値／内部標準物質の面積値。図１７～図２１において、横軸、及び縦軸は同じことを表す。
　図１７は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質キヌレニン(Kynurenine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
　図１８は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質システイン(Cysteine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
　図１９は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質アラニン(Alanine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
　図２０は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質プトレシン(Putrecine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
　図２１は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質デオキシシチジン(Deoxycytidine)の存在量の経時変化を示すグラフである。
　ここで、前述したように、図１５より、対照細胞（サンプルＣ）と被検細胞（サンプルＤ）は、培養による細胞増殖率が略同じであるもの、すなわち、時間経過による細胞数が略同じものである。
　図１６、図１７、図２０及び図２１より、指標物質としてのトレオン酸、キヌレニン、プトレシン、及びデオキシシチジンは、正常型染色体を有する対照細胞（サンプルＣ）に比べ、１８番目の染色体に異常を有する被検細胞（サンプルＤ）では、時間経過により有意な減少が見られた。
　一方、図１８及び図１９より、指標物質としてのシステイン、及びアラニンは、正常型染色体を有する対照細胞（サンプルＣ）に比べ、１８番目の染色体に異常を有する被検細胞（サンプルＤ）では、時間経過により有意な増加が見られた。
　ΔArea ratio／ΔConfluencyの信頼区間の算出方法は以下の通りである。
　ΔArea ratio＝（３日目の対照細胞について求められた面積比）－（３日目のコントロールサンプルの面積比）
　ΔConfluency＝（３日目の対照細胞について求められた細胞被覆率）－（２日目の対照細胞Ｃについて求められた細胞被覆率）
　ここで、正常系の対照細胞については、対象細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）の測定値を全て用いて信頼区間を算出した。
　表３に各指標物質についての９５％信頼区間を示し、表４に各指標物質についての９０％信頼区間を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表３及び表４より、対照細胞サンプルＡ，Ｂ，Ｃについて求められた面積比からコントロールサンプルの面積比を差し引いた値を［ａ］、被検細胞について求められた面積比からコントロールサンプルの面積比を差し引いた値を［ｂ］、培養２４時間毎における対象細胞の細胞被覆率の増加率を［ｃ］、培養２４時間毎における被検細胞の細胞被覆率の増加率を［ｄ］としたときに、［ａ］／［ｃ］と［ｂ］／［ｄ］の信頼区間が重ならないとき、１細胞が培養２４時間の間に産生または消費した物質量には対照細胞の培養上清と被検細胞の培養上清の間で有意差があると判定した。このように判定することにより、より正確な判定が可能となる。
［データ解析２：指標物質の濃度比］
　各培養日に回収された培養上清サンプルについて、上記のＬＣ－ＭＳ分析を行うことにより求められた各指標物質化合物（マーカー）の面積値を、濃度が既知の各指標物質化合物のＬＣ－ＭＳ分析結果から、外部標準法により各指標物質化合物の濃度値を算出した。そして、対照細胞サンプルと被検細胞サンプルのそれぞれに関し、前記５ｗｅｌｌから回収した培養上清をそれぞれＬＣ－ＭＳで分析した結果から得られた濃度値からコントロールサンプルの濃度値を差し引いた値（ΔConc）を計算し、さらに細胞被覆率の変化量（ΔConfluency）で補正した補正値（ΔConc／ΔConfluency）を、１細胞が培養２４時間の間に産生または消費した物質量の指標値として比較した。
　ΔConc＝（３日目の培養上清サンプルについて求められた濃度値）－（３日目のコントロールサンプルの濃度値）
　ΔConfluency＝（３日目の培養上清サンプルについて求められた細胞被覆率）－（２日目の培養上清サンプルについて求められた細胞被覆率）
　ここで、正常系の対照細胞サンプルについては、対象細胞サンプルＡ，Ｂ，Ｃの各ΔConc／ΔConfluencyの平均値である。
　図２２は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質トレオン酸(Threonic acid)の培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。縦軸はΔConc／ΔConfluencyである。図２３～図２７において、縦軸は同じことを表す。
　図２３は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質キヌレニン(Kynurenine)の培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。
　図２４は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質システイン(Cysteine)の培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。
　図２５は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質アラニン(Alanine)の培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。
　図２６は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質プトレシン(Putrecine)の培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。
　図２７は、対照細胞（サンプルＡ，Ｂ，Ｃ）と被検細胞（サンプルＤ）についての、培養３日目の培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた指標物質デオキシシチジン(Deoxycytidine)の培養上清中のΔConc／ΔConfluencyを示すグラフである。
　このように、面積比ではなく、濃度比で比較した場合でも同様に、正常系と異常系で有意差が生じる結果が得られた。
　上記実施例では、細胞株Ａ，Ｂ，Ｃを対照細胞として、細胞株Ｄを被験細胞とした例について示した。本発明は、他の細胞株を対照細胞として、他の細胞株を被験細胞とした場合についても適用できる。このことは、上記実施例を見れば、上記指標物質（すなわち、マーカー）がゲノム異常の判定に使用できることは当業者であれば理解される。また、細胞の培地についても、実施例で用いたものに限らず、種々のものを用いてもよいことは明らかである。
　本発明の方法によるゲノム異常評価結果に基づいて、前記被検細胞を選別する工程を行うことにより、非侵襲的に正常な細胞のみを引き続いて培養することができる。

Claims (10)

  1. 　培地中で培養された多能性幹細胞あるいは多能性幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞として、該被検細胞がゲノム異常を有するか否かを評価する方法であって、
    　被検細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップと、
    　前記指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かを評価するステップとを含み、
    　前記指標物質が、デオキシシチジン、キヌレニン、プトレシン、アラニン、システイン、シスタチオニン、及びトレオン酸からなる群から選ばれる少なくとも１つであり、
    　前記少なくとも１つの指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、ゲノム異常評価方法。
  2. 　正常型の染色体を有することが判っている対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップをさらに含み、
    　前記少なくとも１つの指標物質について、前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量とを比較することにより、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、請求項１に記載のゲノム異常評価方法。
  3. 　前記少なくとも１つの指標物質について、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量に対する前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量との比が、予め定めた閾値以上であるか否か又は閾値以下であるか否かに基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、請求項２に記載のゲノム異常評価方法。
  4. 　前記指標物質が、デオキシシチジン、キヌレニン、プトレシン、シスタチオニン、又はトレオン酸の場合に、前記比が、予め定めた閾値以下であるか否かに基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、請求項３に記載のゲノム異常評価方法。
  5. 　前記指標物質が、アラニン、又はシステインの場合に、前記比が、予め定めた閾値以上であるか否かに基づいて、前記被検細胞がゲノム異常を有するか否かの評価が行なわれる、請求項３に記載のゲノム異常評価方法。
  6. 　前記指標物質のうち、プトレシン、デオキシシチジン、及びキヌレニンからなる群から選ばれる少なくとも１つを指標物質として選択する、請求項１に記載のゲノム異常評価方法。
  7. 　前記指標物質のうち、２種以上を指標物質として選択する、請求項１に記載のゲノム異常評価方法。
  8. 　１８番目の染色体に異常を有するか否かを評価する、請求項１に記載のゲノム異常評価方法。
  9. 　前記培養上清中の前記指標物質の存在量を、ＬＣ－ＭＳ（液体クロマトクラフ質量分析計）を用いて行う、請求項１に記載のゲノム異常評価方法。
  10. 　請求項１に記載の方法によるゲノム異常評価結果に基づいて、前記被検細胞を選別する工程を含む、細胞の培養方法。
PCT/JP2019/023962 2018-06-18 2019-06-17 細胞のゲノム異常の評価方法 WO2019244853A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17/253,118 US20210278413A1 (en) 2018-06-18 2019-06-17 Evaluation method for genomic abnormalities in cells
CN201980047166.XA CN112673110A (zh) 2018-06-18 2019-06-17 细胞的基因组异常评价方法
EP19821933.9A EP3808855A4 (en) 2018-06-18 2019-06-17 METHOD OF EVALUATION OF GENOMIC ABNORMALITIES IN CELLS
JP2020525728A JPWO2019244853A1 (ja) 2018-06-18 2019-06-17 細胞のゲノム異常の評価方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-115655 2018-06-18
JP2018115655 2018-06-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019244853A1 true WO2019244853A1 (ja) 2019-12-26

Family

ID=68983209

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/023962 WO2019244853A1 (ja) 2018-06-18 2019-06-17 細胞のゲノム異常の評価方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210278413A1 (ja)
EP (1) EP3808855A4 (ja)
JP (1) JPWO2019244853A1 (ja)
CN (1) CN112673110A (ja)
WO (1) WO2019244853A1 (ja)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007195533A (ja) * 2006-01-27 2007-08-09 Toshiki Minami 細胞の評価方法、これを用いたる測定成分のがん化評価方法、がん診断キットおよびコンピュータ可読媒体
WO2008066655A2 (en) 2006-11-02 2008-06-05 Yale University Assessment of oocyte competence
JP2012223104A (ja) * 2011-04-15 2012-11-15 Olympus Corp 誘導多能性幹細胞の識別方法
WO2015166845A1 (ja) * 2014-05-01 2015-11-05 株式会社島津製作所 細胞の分化状態の評価方法
WO2017042309A1 (en) * 2015-09-11 2017-03-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Non-invasive methods for assessing genetic integrity of pluripotent stem cells
WO2017068801A1 (ja) * 2015-10-23 2017-04-27 株式会社島津製作所 細胞の分化状態の評価方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2853645A1 (en) * 2011-11-30 2013-06-06 National Cancer Center Induced malignant stem cells
KR101655383B1 (ko) * 2013-07-27 2016-09-08 고려대학교 산학협력단 소분자 화합물을 포함하는 만능성 줄기세포의 염색체 안정성 유지용 조성물
US10067145B2 (en) * 2013-10-30 2018-09-04 Toagosei Co., Ltd. Method for removing genomically unstable IPS cells and synthetic peptide used therefor

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007195533A (ja) * 2006-01-27 2007-08-09 Toshiki Minami 細胞の評価方法、これを用いたる測定成分のがん化評価方法、がん診断キットおよびコンピュータ可読媒体
WO2008066655A2 (en) 2006-11-02 2008-06-05 Yale University Assessment of oocyte competence
JP2010508815A (ja) 2006-11-02 2010-03-25 イエール・ユニバーシテイ 卵母細胞受容能の評価
JP2012223104A (ja) * 2011-04-15 2012-11-15 Olympus Corp 誘導多能性幹細胞の識別方法
WO2015166845A1 (ja) * 2014-05-01 2015-11-05 株式会社島津製作所 細胞の分化状態の評価方法
WO2017042309A1 (en) * 2015-09-11 2017-03-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Non-invasive methods for assessing genetic integrity of pluripotent stem cells
WO2017068801A1 (ja) * 2015-10-23 2017-04-27 株式会社島津製作所 細胞の分化状態の評価方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 29, 2011, pages 1132 - 1144
ARITA MAO : "P-02-001: Non invasive genomic abnormality assessment of pluripotent stem cells by analysis of culture supernatant components using a liquid chromatograph-mass spectrometer", REGENERATIVE MEDICINE, vol. 18, February 2019 (2019-02-01), pages 1 - 2, XP009524927, ISSN: 1347-7919 *
JAPANESE ASSOCIATION FOR CHROMOSOME AND GENE ANALYSIS: "Guidelines for Quality Assurance of Chromosomal and Genetic Testing Second Edition", THE OFFICIAL JOURNAL OF THE JAPANESE ASSOCIATION FOR CHROMOSOME AND GENE ANALYSIS, vol. 32, no. 1, 2014, pages 60 - 89
LOUISE C. LAURENT: "Dynamic Changes in the Copy Number of Pluripotency and Cell Proliferation Genes in Human ES and iPS Cells during Reprogramming and Time in Culture", CELL STEM CELL, vol. 8, 7 January 2011 (2011-01-07), pages 106 - 118
See also references of EP3808855A4
THE JAPANESE ASSOCIATION FOR CHROMOSOME AND GENE ANALYSIS, vol. 32, no. 1, 2014, pages 60 - 89

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2019244853A1 (ja) 2021-07-08
CN112673110A (zh) 2021-04-16
EP3808855A4 (en) 2022-03-23
EP3808855A1 (en) 2021-04-21
US20210278413A1 (en) 2021-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Collins et al. Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry
KR101931420B1 (ko) 세포의 분화 상태의 평가 방법
Hendrickson et al. Comparison of spectral counting and metabolic stable isotope labeling for use with quantitative microbial proteomics
DeHaven et al. Software techniques for enabling high-throughput analysis of metabolomic datasets
Crowell et al. An R-based reproducible and user-friendly preprocessing pipeline for CyTOF data
WO2017068727A1 (ja) 細胞の分化状態の評価方法
DE102005056408B4 (de) Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von asymmetrischem Dimethylarginin (ADMA)
KR20120033649A (ko) 배추 원산지 판별용 바이오마커
Ries et al. m6A governs length-dependent enrichment of mRNAs in stress granules
Rosenberg et al. Exploring dyserythropoiesis in patients with myelodysplastic syndrome by imaging flow cytometry and machine‐learning assisted morphometrics
CN113484449B (zh) 一种高通量定量和定性分析蛋白质的方法
WO2019244853A1 (ja) 細胞のゲノム異常の評価方法
CN102901729A (zh) 一种用图像仪标准样品法定量分析盘条索氏体含量的方法
CN101532047A (zh) 一种可溯源酶校准物质的制备方法
CN114660103B (zh) 一种重金属痕量检测方法及其应用
EP3936870B1 (en) Method for quantitation of her2 in breast cancer sample by mass spectrometry and scoring of her2 state by using same
Oliva et al. Fibroblast phenylalanine concentration as a surrogate biomarker of cellular number
Mancia et al. Quantitative methods to characterize morphological properties of cell lines
Peterson et al. Pushing the Isotopic Envelope: When carrier channels pollute their neighbors’ signals
Guscott et al. Tracking genome evolution in single cell clones reveals the rates and features of copy number alterations generated by ongoing chromosomal instability in cancer
Nims et al. Cell line authentication using isoenzyme analysis
KR20150075826A (ko) 아미노산을 포함하는 방사선 피폭 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법
DE102021130356B3 (de) Referenzdatensatz-basiertes, spektrometrisches Charakterisieren von Zellsubstraten unter Verwendung von Teilbibliotheken
CN110343746B (zh) 一种校正egfr基因突变频率的定值方法
Shamshad et al. Diagnosing Beta Thalassemia trait in a developing country

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19821933

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020525728

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019821933

Country of ref document: EP

Effective date: 20210118