JP2010508815A - 卵母細胞受容能の評価 - Google Patents

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Abstract

受精および着床についての卵母細胞の評価方法が提供される。例えば、染色体が正常および染色体が異常な卵母細胞の間で示差的に発現されると同定されるマーカーの一群の１種若しくはそれ以上を卵母細胞が発現するか若しくは発現しないかの決定方法が提供される。例えば、染色体が正常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と染色体が異常な卵母細胞と関連する卵丘細胞の間で示差的に発現されると同定されるマーカーの一群の１種若しくはそれ以上を卵丘細胞が発現するか若しくは発現しないかの決定方法もまた提供される。ＲＮＡレベルならびにタンパク質レベルでの示差的に発現される遺伝子のマーカー発現の検出方法が提供される。
【選択図】なし

Description

配列表への言及
コンパクトディスクで提出された配列表は引用することによりここに組み込まれる。該ディスク上のファイルは０４７１６２−５０３１−００ＷＯ．ｔｘｔと命名される。該ファイルは１６５７ｋｂでありかつ創製の日付は２００７年１１月２日である。
染色体異常は彼らの３０代早期の女性から得た卵母細胞の２０％超を冒し、そしてこの頻度は女性が彼らの４０代に入る際に２倍以上になる。これらの染色体異常はほとんど常に発達中の胚に対し致死的であり、そしてそれらの高頻度は多くの失敗した体外受精（ＩＶＦ）処置の原因である。結果、染色体が正常の卵母細胞の同定はＩＶＦ処置に非常に重要である。
多様な細胞遺伝学的技術を使用する多数の臨床（例えば着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）および着床前遺伝子スクリーニング（ＰＧＳ））ならびに科学的研究が、ＰＧＤおよびＰＧＳの適応症をもつ患者でヒト着床前胚の少なくとも２／３が異数体細胞を含有することを示した（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。ｉｎ ｖｉｔｒｏで製造されかつ子宮に移される胚の８５％が乳児に発達することに失敗し、生存出生になるよう運命付けられたごく少数のみを残すこともまた示されている（非特許文献８）。この低適格性率を取り扱うため、通常は複数の卵母細胞および胚をＩＶＦの間に製造する。しかし、高次の多胎妊娠（例えば三つ子、四つ子など）の危険性を最小限にするために、通常は２若しくは３個の胚を子宮に移す。内科医にとって大きな一課題は、どの胚が妊娠をもたらすことがもっともありそうであるかを同定しかつこれらの胚が子宮への移行に選択される制限された数の１つであることを確実にすることである。
形態学的評価に基づく健康な卵母細胞および胚の同定方法はほとんど成功裏しなかった（総説については非特許文献９を参照されたい）。形態学的評価に加え、若干の診察室は細胞遺伝学的評価もまた使用する。卵母細胞は、第一および第二極体の生検ならびにそれらを細胞遺伝学的分析にかけることにより異数性について試験し得る。極体中の余分な若しくは欠けている染色体の検出は、対応する卵母細胞中の染色体の相互の（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）喪失若しくは獲得を示す。染色体が正常の卵母細胞由来の胚は生殖補助の間の移行に対する優先性を与えられ得、有害な異数性を運搬する胚の移行を回避することにより結果を潜在的に改善する。しかし、古典的細胞遺伝学的技術は高質の染色体スプレッドを得るという問題により極体に適用することが困難である。この理由から、極体で実施される大多数の染色体試験は蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用してきた。ＦＩＳＨを使用して、染色体の形態に関係なく個々の極体／卵母細胞中の５〜１２染色体を評価することが可能である（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。しかしながらこの方法は染色体の半分未満のみ検査する。加えて細胞の除去は胚を損傷しうる侵襲的処置である。
より最近、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）が極体および卵母細胞中の染色体のコピー数を評価するのに使用されているとは言え、今日まで大部分の分析は研究の情況で実施されている（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。ＣＧＨは、ＦＩＳＨを使用して評価される制限されたサブセットよりむしろすべての染色体が分析されるという大きな利点を有するが、しかし、それは、着床前試験に利用可能な制限された時間内で実施することが困難である、時間がかかりかつ労働集約的な
方法である。
逆転写、次いでリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する遺伝子発現分析を実施する研究は、特定の遺伝子が卵母細胞若しくは胚の質および能力に関係しうる活性の変化を表すこと（非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９）、ならびに形態学的に異常な着床前胚が非定型の遺伝子発現パターンを頻繁に表すこと（非特許文献１７）を見出した。リアルタイムＰＣＲの正確性および感度にもかかわらず、該方法は各卵母細胞若しくは胚について評価し得る遺伝子の制限された数（一般に１０遺伝子未満）により制限される。
生殖医学は、卵母細胞の能力および卵母細胞の無能と関連するマーカー発現のレベルを測定することにより成功裏の受精および着床をもたらすことがもっともありそうな卵母細胞若しくは胚の非侵襲的特徴付けおよび同定が可能な方法から、大きく恩恵を受けるとみられる。本発明はこの必要性を満たす。
Ｄｅｌｈａｎｔｙら、１９９７、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９９：７５５−７６０ ＭｕｎｎeとＣｏｈｅｎ、１９９８、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｕｐｄａｔｅ ４：８４２−８５５ ＷｅｌｌｓとＤｅｌｈａｎｔｙ ２０００、Ｍｏｌ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏ ６：１０５５−１０６２ Ｖｏｕｌｌａｉｒｅら、２００２、Ｍｏｌ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏ ８：１０３５−１０４１ Ｖｏｕｌｌａｉｒｅら、２０００、Ｈｕｍ Ｇｅｎ １０６：２１０−２１７ Ｃｏｏｎｅｎら、２００１、Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏ １９：３１６−３２４ Ｂａａｒｔら、２００７、Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｄｉａｇ ２７：５５−６３ ＫｏｖａｌｅｖｓｋｙとＰａｔｒｉｚｉｏ、２００５、Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ８４：３２５−３３０ Ｐａｔｒｉｚｉｏら、２００７、Ｒｅｐｒｏ ＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ Ｏｎｌｉｎｅ １５：３４６−３５３ Ｖｅｒｌｉｎｓｋｙら、１９９８、Ｊ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅｐｒｏ ＆ Ｇｅｎ １５：２８５−２８９ Ｋｕｌｉｅｖら、２００３、Ｒｅｐｒｏ Ｂｉｏｍｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ ６：５４−５９ Ｐｕｊｏｌら、２００３、Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎ １１：３２５−３２６ Ｗｅｌｌｓら、２００２、Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ７８：５４３−５４９ Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｍａｔｅｏら、２００４、Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏ １９：２１１８−２１２５ Ｆｒａｇｏｕｌｉら、２００６、Ｃｙｔｏ Ｇｅｎ Ｒｅｓ １１４：３０−３８ Ｆｒａｇｏｕｌｉら、２００６、Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏ ２１：２３１９−２３２８ Ｗｅｌｌｓら、２００５、Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ８４：３４３−３５５ Ｄｏｄｅら、２００６、Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏ Ｄｅｖｅｌ ７３：２８８−２９７ Ｒｕｓｓｅｌｌら、２００６、Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏ Ｄｅｖｅｌ ７３：１２５５−１２７０
［発明の要約］
本発明は、受精若しくは着床または双方に対する哺乳動物卵母細胞の受容能の評価方法を企図している。一態様において、該方法は、配列番号１−９２および１８３−２９２により例示される核酸の群から選択される最低１核酸のマーカー発現のレベルをサンプル中で測定すること、ならびにサンプル中のマーカー発現のレベルを対照若しくは参照標準と比較することを含んでなり、サンプルと対照の間の示差的マーカー発現を検出することは、受精若しくは着床または双方についての卵母細胞の受容能を示す。
サンプルが卵母細胞、卵胞液、卵丘細胞若しくは培地由来でありうることが本発明の一局面である。対照若しくは参照標準は、着床の能力のある卵母細胞、着床の能力のない卵母細胞、受精の能力のある卵母細胞、受精の能力のない卵母細胞、染色体が正常な卵母細胞、染色体が異常な卵母細胞、着床の能力のある卵母細胞と関連する卵胞液、着床の能力のない卵母細胞と関連する卵胞液、受精の能力のある卵母細胞と関連する卵胞液、受精の能力のない卵母細胞と関連する卵胞液、染色体が正常な卵母細胞と関連する卵胞液、染色体が異常な卵母細胞と関連する卵胞液、着床の能力のある卵母細胞と関連する培地、着床の能力のない卵母細胞と関連する培地、受精の能力のある卵母細胞と関連する培地、受精の能力のない卵母細胞と関連する培地、染色体が正常な卵母細胞と関連する培地、染色体が異常な卵母細胞と関連する培地、着床の能力のある卵母細胞と関連する卵丘細胞、着床の能力のない卵母細胞と関連する卵丘細胞、受精の能力のある卵母細胞と関連する卵丘細胞、受精の能力のない卵母細胞と関連する卵丘細胞、染色体が正常な卵母細胞と関連する卵丘細胞、染色体が異常な卵母細胞と関連する卵丘細胞、着床の能力のある卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液、着床の能力のない卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液、受精の能力のある卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液、受精の能力のない卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液、染色体が正常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液、染色体が異常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液、着床の能力のある卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する培地、着床の能力のない卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する培地、受精の能力のある卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する培地、受精の能力のない卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する培地、染色体が正常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する培地、染色体が異常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する培地若しくはそれらの組合せ由来でありうる。
一局面において、サンプルで測定されるマーカー発現のレベルは、対照若しくは参照標準で測定されるマーカー発現のレベルと最低２０％異なる。一局面において、マーカー発現のレベルは核酸マイクロアレイ、ノーザンブロット若しくは逆転写ＰＣＲにより検出しうる。別の局面において、マーカー発現のレベルは、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着検定法、タンパク質マイクロアレイ若しくはＦＡＣＳ分析により検出しうる。
卵母細胞および卵丘細胞がヒトであることが本発明の一局面であるが、しかし卵母細胞および卵丘細胞は家畜化された哺乳動物のものでもまたありうる。
別の局面において、本発明は固体支持体上に固定される核酸プローブのアレイを含んでなり、該プローブ組は複数のプローブを含んでなり、各プローブは一組の参照標準の下位配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）に正確に相補的な最低２０ヌクレオチドのセグメントを
含んでなり、参照配列の該組は配列番号１−９２を含んでなる。
別の局面において、本発明は固体支持体上に固定される核酸プローブのアレイを含んでなり、該プローブ組は複数のプローブを含んでなり、各プローブは一組の参照配列の下位配列に正確に相補的な最低２０ヌクレオチドのセグメントを含んでなり、参照配列の該組は配列番号１８３−２８２を含んでなる。
［発明の詳細な記述］
本発明は、マーカー発現の分析による成功裏の受精および着床を経験することがより少なくありそうな卵母細胞および胚からの成功裏の受精および着床を経験することがよりありそうな卵母細胞および胚の識別方法を提供する。一態様において、該方法は非侵襲的であり、ならびに、成功裏の受精および着床を経験することがよりありそうと同定された卵母細胞若しくは胚は着床のため生育可能のままである。一態様において、該方法は非損傷的であり、ならびに、成功裏の受精および着床を経験することがよりありそうと同定された卵母細胞若しくは胚は、着床のため生育可能のままである。
一態様において、卵母細胞、卵丘細胞、卵胞液若しくは培地中のマーカー発現の評価を着床について卵母細胞の能力を評価するのに使用する。該評価は、染色体が正常な胚の着床を最大限にすることにおいて補助するため、若しくは染色体が異常な胚の着床を最小限にすることにおいて補助するために着床前に実施しうる。
一態様において、卵母細胞、卵丘細胞、卵胞液若しくは培地中のマーカー発現の評価を受精について卵母細胞の能力を評価するのに使用する。該評価は、染色体が正常な胚の生成を最大限にすることにおいて補助するため、若しくは染色体が異常な胚の生成を最小限にすることにおいて補助するために受精前に実施しうる。
一態様において、卵母細胞、卵丘細胞、卵胞液若しくは培地中のマーカー発現の評価を、受精、着床、若しくは例えば凍結による後の使用のための長期保存について卵母細胞の質を評価するのに使用する。
一態様において、示差的に発現されるマーカーの産物を卵母細胞の異数性のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価に使用する。一態様において、マーカー、遺伝子産物、ＲＮＡ、タンパク質および代謝物を、卵胞液、卵母細胞、極体、卵母細胞、胚、または卵母細胞、卵丘細胞若しくは胚を培養する培地中で評価する。
一局面において、示差的発現を表すマーカーは染色体異常を診断するのに使用する。卵母細胞若しくは卵丘細胞中のマーカー発現の評価は、卵巣刺激方法を最適化するのに使用する。卵母細胞若しくは卵丘細胞中のマーカー発現の評価は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟培地を改変若しくは最適化するのにもまた使用する。さらに、卵母細胞若しくは卵丘細胞中のマーカー発現の評価はヒト卵母細胞に対する毒物の影響をアッセイするのに使用する。
好ましくは、卵母細胞、卵丘細胞および胚はヒトである。しかしながら、卵母細胞、卵丘細胞および胚は他のヒト以外の動物、好ましくは家畜化された動物から得ることができる。
卵母細胞若しくは卵丘細胞中のマーカー発現の評価は、例えば卵巣刺激を最適化するように培地中の成分の濃度を改変することにより影響を受ける遺伝子発現経路の適正な機能を補助するのに使用しうる。
卵母細胞若しくは卵丘細胞中のマーカー発現の評価は、例えば卵巣刺激を最適化するた
めの適正な染色体分離を支援しかつ染色体／染色分体の不均衡を最小限にする培地の設計を導くのに使用しうる。
卵母細胞若しくは卵丘細胞中のマーカー発現の評価は、例えば、栄養補助食品の設計を導くため、形成される異常な卵母細胞の機会を減少させるため、受精率を向上させるため、雌性が繁殖性のまま留まる年数を増大させるため、および例えばダウン症候群のような染色体状態の危険性を低下させるために使用しうる。
本発明は、染色体正常性および異常性の示差的に発現されるマーカーならびに卵母細胞の能力および無能の示差的に発現されるマーカーの同定方法、ならびに染色体の正常性および異常性の示差的に発現されるマーカーならびに卵母細胞の能力および無能の示差的に発現されるマーカーの発現産物の検出方法の使用を企図している。
本発明は、着床の能力のある卵母細胞と着床の能力のない卵母細胞の間で示差的に発現されるマーカーを同定するための全ゲノム核酸マイクロアレイによる示差的に発現されるマーカーの同定を企図している。本発明は、ＲＮＡおよびタンパク質のような示差的に発現されるマーカー発現産物を検出かつそのレベルを測定するため、卵母細胞、ならびに卵胞液、卵丘細胞および卵母細胞と関連する培地中の１種若しくはそれ以上の示差的に発現されるマーカー発現産物のレベルを測定するため、卵母細胞の染色体および遺伝子の能力ならびに着床のその可能性を評価するための、当業者に既知の方法を使用することをさらに企図している。
本発明の実務は、別の方法で示されない限り、当該技術の熟練内にある有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技術を包含する）、細胞生物学、生化学および免疫学の慣習的技術および記述を使用しうる。こうした慣習的技術は、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーションおよび標識を使用するハイブリダイゼーションの検出を包含する。適する技術の特定の具体的説明は下の本明細書の実施例に言及することにより有し得る。しかしながら他の同等の慣習的手順ももちろんまた使用し得る。こうした慣習的技術および記述は、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（第Ｉ〜ＩＶ巻）、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（全部Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓから）；Ｓｔｒｙｅｒ、Ｌ．、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版）Ｆｒｅｅｍａｎ、ニューヨーク；Ｇａｉｔ、１９８４、”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｘ；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ 第３版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．、ニューヨーク州ニューヨーク；ならびにＢｅｒｇら、２００２、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ、第５版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．、ニューヨーク州ニューヨーク（それらの全部は全部の目的上引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる）のような標準的実験室手順書に見出し得る。
本発明で有用である核酸アレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（カリフォルニア州サンタクララ）（例のアレイはｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍのウェブサイトで示される）、およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）（例のアレイはｗｗｗ２．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍのウェブサイトで示される）、ならびにＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州サンタクララ）（例のアレイはｗｗｗ．ｈｏｍｅ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍのウェブサ
イトで示される）などから商業的に入手可能なもののようなアレイを包含する。
本発明はある態様においてサンプル調製法もまた企図している。マーカー発現分析の前若しくは同時に、発現産物サンプルを多様な機構（それらのいくつかはＰＣＲを使用しうる）を使用して増幅しうる。例えば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州ニューヨーク、１９９２）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ、１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９、４９６７（１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １、１７（１９９１）；ＰＣＲ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード）；ならびに米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号 同第４，９６５，１８８号および同第５，３３３，６７５号明細書（それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
他の適する増幅方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、ＷｕとＷａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４、５６０（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４１、１０７７（１９８８）およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら Ｇｅｎｅ ８９：１１７（１９９０））、転写増幅（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６、１１７３（１９８９）および第ＷＯ８８／１０３１５号明細書）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、１８７４（１９９０）および第ＷＯ９０／０６９９５号明細書）、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅（米国特許第６，４１０，２７６号明細書）、コンセンサス配列プライムドＰＣＲ（ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ）（ＣＰ−ＰＣＲ）（米国特許第４，４３７，９７５号明細書）、任意プライムドＰＣＲ（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ）（ＡＰ−ＰＣＲ）（米国特許第５，４１３，９０９号、同第５，８６１，２４５号明細書）、変性オリゴヌクレオチドプライムドＰＣＲ（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ）（ＤＯＰ−ＰＣＲ）（Ｗｅｌｌｓら、１９９９、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１２１４−１２１８）および核酸に基づく配列増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂａｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＢＳＡ）を包含する。（米国特許第５，４０９，８１８号、同第５，５５４，５１７号および同第６，０６３，６０３号（それらのそれぞれは引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。使用しうる他の増幅法は、米国特許第５，２４２，７９４号、同第５，４９４，８１０号、同第４，９８８，６１７号明細書および米国第０９／８５４，３１７号明細書（それらのそれぞれは引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。
付加的なサンプル調製方法および核サンプルの複雑さを低下させるための技術は、Ｄｏｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１、１４１８（２００１）、米国特許第６，３６１，９４７号、同第６，３９１，５９２号明細書、ならびに米国第０９／９１６，１３５号、同第０９／９２０，４９１号（米国特許出願公開第２００３００９６２３５号）、同第０９／９１０，２９２号（米国特許出願公開第２００３００８２５４３号）および同第１０／０１３，５９８号明細書に記述されている。
限定されるものでないがノーザンブロット、サザンブロットおよび核酸マイクロアレイを挙げることができるポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイの実施方法は当該技術分野で開発されている。ハイブリダイゼーションアッセイの手順および条件は応用に依存して変動することができ、そしてＭａｎｉａｔｉｓら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版 ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）；ＢｅｒｇｅｒとＫｉｍｍｅｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１５２、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ、１９８７）；ＹｏｕｎｇとＤａｖｉｓｍ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ、８０：１１９４（１９８３）に言及されるものを包含する既知の一般的結合法に従って選択される。反復および制御ハイブリダイゼーション反応を実施するための方法および装置が米国特許第５，８７１，９２８号、同第５，８７４，２１９号、同第６，０４５，９９６号および同第６，３８６，７４９号、同第６，３９１，６２３号（それらのそれぞれは引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。
本発明はある好ましい態様においてリガンド間のハイブリダイゼーションのシグナル検出もまた企図している。米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，５７８，８３２号；同第５，６３１，７３４号；同第５，８３４，７５８号；同第５，９３６，３２４号；同第５，９８１，９５６号；同第６，０２５，６０１号；同第６，１４１，０９６号；同第６，１８５，０３０号；同第６，２０１，６３９号；同第６，２１８，８０３号；および同第６，２２５，６２５号明細書、米国第１０／３８９，１９４号明細書、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７号明細書（第ＷＯ９９／４７９６４号として公開される）（それらのそれぞれもまた全部の目的上そっくりそのまま引用することによりここに組み込まれる）を参照されたい。
シグナル検出および強度データの処理のための方法および装置は、例えば米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，５４７，８３９号、同第５，５７８，８３２号、同第５，６３１，７３４号、同第５，８００，９９２号、同第５，８３４，７５８号；同第５，８５６，０９２号、同第５，９０２，７２３号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１４１，０９６号、同第６，１８５，０３０号、同第６，２０１，６３９号；同第６，２１８，８０３号；および同第６，２２５，６２５号明細書、米国第１０／３８９，１９４号、同第６０／４９３，４９５号明細書、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７号明細書（第ＷＯ９９／４７９６４号として公開される）（それらのそれぞれもまた全部の目的上そっくりそのまま引用することによりここに組み込まれる）に開示されている。
本発明の実務はソフトウェアおよびシステムもまた使用しうる。本発明のコンピュータソフトウェア製品は、典型的に、本発明の方法の論理的段階を実施するためのコンピュータで実行可能な命令を有するコンピュータで読み出し可能な媒体を包含する。適するコンピュータで読み出し可能な媒体は、フロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ／ＤＶＤ／ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープなどを包含する。コンピュータで実行可能な命令は、適するコンピュータ言語若しくは数種の言語の組合せで書かれうる。基礎的なコンピュータによる生物学の方法が、例えばＳｅｔｕｂａｌとＭｅｉｄａｎｉｓら、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ（ＰＷＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ボストン、１９９７）；Ｓａｌｚｂｅｒｇ、Ｓｅａｒｌｅｓ、Ｋａｓｉｆ（編）、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、アムステルダム、１９９８）；ＲａｓｈｉｄｉとＢｕｅｈｌｅｒ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｂａｓｉｃｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、２０００）およびＯｕｅｌｅｔｔｅ ａｎｄ Ｂｚｅｖａｎｉｓ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、第２版、２００１）に記述されている。米国特許第６，４２０，１０８号明細
書を参照されたい。
本発明は、プローブ設計、データの管理、分析および装置操作のような多様な目的上の多様なコンピュータプログラム製品およびソフトウェアもまた利用しうる。米国特許第５，５９３，８３９号、同第５，７９５，７１６号、同第５，７３３，７２９号、同第５，９７４，１６４号、同第６，０６６，４５４号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１８５，５６１号、同第６，１８８，７８３号、同第６，２２３，１２７号、同第６，２２９，９１１号および同第６，３０８，１７０号明細書を参照されたい。加えて、本発明は、米国第１０／１９７，６２１号、同第１０／０６３，５５９号（米国公開第２００２０１８３９３６号）、同第１０／０６５，８５６号、同第１０／０６５，８６８号、同第１０／３２８，８１８号、同第１０／３２８，８７２号、同第１０／４２３，４０３号および同第６０／４８２，３８９号明細書に示されるところのインターネットのようなネットワークでの遺伝子情報の提供方法を包含する好ましい態様を有しうる。
本開示を通じて本発明の多様な局面をある範囲の形式で提示し得る。範囲の形式の記述は単に便宜性および明瞭性のためでありかつ本発明の範囲に対する柔軟性のない制限と解釈されるべきでないことが理解されるべきである。従って、ある範囲の記述は、とりわけ開示される全部の可能な部分的範囲、ならびにその範囲内の個々の数値を有するとみなされるべきである。例えば、１から６までのような範囲の記述は、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までなどのような具体的に開示される部分的範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば１、２、３、４、５および６を有するとみなされるべきである。これは該範囲の幅に関係なく当てはまる。
一態様において、ハイブリダイズされた核酸はサンプル核酸に結合された１種若しくはそれ以上の標識を検出することにより検出する。標識は当業者に公知の多数の手段のいずれによっても取り込みうる。一態様において、標識はサンプル核酸の調製の増幅段階の間に同時に取り込まれる。従って、例えば標識プライマー若しくは標識ヌクレオチドを用いるＰＣＲが標識増幅産物を提供することができる。別の態様において、標識ヌクレオチド（例えば蛍光標識ＵＴＰおよび／若しくはＣＴＰ）を使用する上述されたところの転写増幅は転写された核酸に標識を取り込む。別の態様において、ＰＣＲ増幅産物は末端デオキシトランスフェラーゼおよび標識ｄＮＴＰにより断片化されかつ標識される。あるいは、標識は元の核酸サンプル（例えばｍＲＮＡ、ポリＡ ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）に、若しくは増幅が完了した後に増幅産物に直接付加しうる。核酸に標識を結合する手段は当業者に公知であり、そして、例えばニックトランスレーション、若しくは核酸をキナーゼ処理すること（ｋｉｎａｓｉｎｇ）、およびサンプル核酸を標識（例えばフルオロフォア）に結合する核酸リンカーのその後の結合（ライゲーション）による（例えば標識ＲＮＡでの）末端標識を包含する。別の態様において、標識は末端デオキシトランスフェラーゼを使用してフラグメントの端に付加する。
本発明での使用に適する検出可能な標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的若しくは化学的手段により検出可能ないかなる組成物も包含する。本発明における有用な標識は、限定されるものでないが、標識ストレプトアビジン複合体で染色するためのビオチン；抗ビオチン抗体、磁性ビーズ（例えばＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ）；蛍光色素（例えばフルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）；放射標識（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、４Ｃ若しくは３２Ｐ）；リン光標識；酵素（例えばワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡで一般に使用される他者）；ならびにコロイド状金または着色ガラス若しくはプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズのような比色標識を挙げることができる。こうした標識の使用を教示する特許は、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５
号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号明細書（それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用することによりここに組み込まれる）を包含する。
こうした標識を検出する手段は当業者に公知である。従って、例えば、放射標識は写真フィルム若しくはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ；蛍光マーカーは発射光を検出するための光検出器を使用して検出しうる。酵素標識は、典型的に、酵素に基質を提供すること、および該基質に対する該酵素の作用により産生される反応生成物を検出することにより検出し、ならびに、比色標識は着色標識を単純に可視化することにより検出する。
競合および非競合イムノアッセイ形式、抗原捕捉アッセイ、２抗体サンドイッチアッセイおよび３抗体サンドイッチアッセイを包含する多様なイムノアッセイ形式が本発明の有用な方法である（Ｓｅｌｆら、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：６０−６５）。本発明はいずれか１つの型の既知の若しくは現在のところ未知のイムノアッセイに制限されると解釈されるべきでない。
一態様において、本発明の方法は１種若しくはそれ以上の抗原捕捉アッセイに頼る。こうした一抗原捕捉アッセイにおいて、抗体を固体支持体に結合し、そして抗原が該抗体により結合されるようなサンプルを添加する。未結合のタンパク質を洗浄により除去した後に、結合した抗原の量を所望の場合は例えば限定されるものでないが放射アッセイ（Ｈａｒｌｏｗら、１９８９、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）を使用して定量し得る。
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）は本発明の方法で有用である。限定されるものでないがワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ若しくはウレアーゼを挙げることができる酵素を、例えば本発明の方法での使用のため抗原抗体若しくは二次抗体に結合し得る。ワサビペルオキシダーゼ検出系を、例えば、４５０ｎｍで検出可能である過酸化水素の存在下で可溶性産物を生じる色素生産性基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とともに使用しうる。他の便宜的酵素結合系は、例えば、４０５ｎｍで容易に検出可能な可溶性産物を生じるために色素生産性基質ｐ−ニトロフェニルリン酸とともに使用しうるアルカリホスファターゼ検出系を包含する。同様に、β−ガラクトシダーゼ検出系は、４１０ｎｍで検出可能な可溶性産物を生じるために色素生産性基質ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）とともに使用しうる。あるいは、ウレアーゼ検出系は尿素ブロモクレゾールパープル（Ｓｉｇｍａ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ミズーリ州セントルイス）のような基質とともに使用しうる。有用な酵素結合一次および二次抗体をいずれかの数の商業的供給源から得ることができる。
化学発光検出もまた本発明の方法により抗原を検出若しくは抗原の量を測定するのに有用である。化学発光二次抗体はいずれかの数の商業的供給源から得ることができる。蛍光検出もまた本発明の方法で抗原を検出若しくは抗原のレベルを測定するのに有用である。有用な蛍光色素は、限定されるものでないがＤＡＰＩ、フルオレセイン、Ｈｏｅｃｈｓｔ
３３２５８、Ｒ−フィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッドおよびリサミン、フルオレセイン若しくはローダミン標識抗原特異的抗体を挙げることができる。
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もまた本発明の方法で有用である。こうしたアッセイは当該技術分野で公知であり、そして例えばＢｒｏｐｈｙら（１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６７：８９８−９０３）およびＧｕｅｃｈｏｔら（１９９６、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：５５８−５６３）に記述されている。ラジオイムノアッセイは、例えばヨウ素１２５標識一次若しくは二次抗体を使用して実施する（Ｈａｒｌｏｗら、上記、１９９９）。
検出可能な抗体から発射されるシグナルは、例えば色素生産性基質からの色を検出するための分光光度計；ヨウ素−１２５の検出のためのガンマカウンターのような放射を検出するための放射カウンター；若しくはある波長の光の存在下で蛍光を検出するための蛍光計を使用して分析する。酵素結合アッセイを使用する場合、抗原の量の定量的分析は分光光度計を使用して実施する。本発明のアッセイは手動で実施し得るか、若しくは、所望の場合は自動化し得ること、および複数のサンプルから発射されるシグナルは商業的に入手可能な多くの装置で同時に検出し得ることが理解される。
本発明の方法は、所望の場合に自動化し得るキャピラリー電気泳動に基づくイムノアッセイ（ＣＥＩＡ）の使用もまた包含する。イムノアッセイは例えばＳｃｈｍａｌｚｉｎｇら（１９９７、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：２１８４−２１９３）およびＢａｏ（１９９７、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．６９９：４６３−４８０）に記述されるところのレーザー誘起蛍光とともにもまた使用しうる。フローインジェクションリポソームイムノアッセイおよびリポソーム免疫センサーのようなリポソームイムノアッセイもまた本発明の方法により抗原を検出するのに使用しうる（Ｒｏｎｇｅｎら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４：１０５−１３３）。
サンドイッチ酵素イムノアッセイもまた本発明の方法で有用でありうる。２抗体サンドイッチアッセイにおいて、第一の抗体を固体支持体に結合し、そして抗原を該第一の抗体に結合させる。抗原の量は、抗原および第一の抗体の複合体に結合する検出可能な第二の抗体の量を検出かつ測定することにより定量する。３抗体サンドイッチアッセイにおいて、第一の抗体を固体支持体に結合し、そして抗原を該第一の抗体に結合させる。その後第二の抗体を添加し、そして第一の抗体に結合されている抗原に結合させる。抗原の量は、第二の抗体に結合する検出可能な第三の抗体の量を検出かつ測定することにより定量する。
定量的ウエスタンブロッティングもまた本発明の方法で抗原を検出若しくは抗原のレベルを測定するのに使用しうる。ウエスタンブロットはスキャニングデンシトメトリー（Ｐａｒｒａら、１９９８、Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．２８：６６９−６７５）のような公知の方法を使用して定量する。蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）分析もまた本発明の方法で抗原を検出若しくは抗原のレベルを測定するのに使用しうる。ＦＡＣＳ分析を使用して、目的の細胞成分に特異的な１種若しくはそれ以上の蛍光色素で細胞を染色することができ、そして各細胞の蛍光をそれが励起ビーム（レーザー若しくは水銀アーク灯）を迅速に横断する際に測定する。蛍光は細胞の多様な生化学的および生物学的特性の量的尺度、ならびに細胞分取の根拠を提供する。他の測定可能な光学的パラメータは光吸収および光散乱を包含し、後者は細胞の大きさ、形状、密度、粒度および染色の取り込みの測定に応用可能である（Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚら、２００４、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（第４版）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、マサチューセッツ州バーリンゲームを参照されたい）。
定義
冠詞「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」は該冠詞の文法上の目的語の１若しくは１以上（すなわち最低１）を指すのに本明細書で使用する。例として「ある要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は１要素若しくは１以上の要素を意味している。
本明細書で使用されるところの「相同な」は、２種のポリマー分子間、例えば２核酸分子、例えば２ＤＮＡ分子若しくは２ＲＮＡ分子間、または２ポリペプチド分子間のサブユニット配列類似性を指す。該２分子の双方中の１サブユニット位置が同一単量体サブユニットにより占有される場合、例えば２ＤＮＡ分子のそれぞれ中の１位置がアデニンにより占有される場合には、それらはその位置で相同である。２配列間の相同性は適合する若しくは相同な位置の数の直接の関数であり、例えば、２化合物の配列の位置の半分（例えば長さ１０サブユニットのポリマーの５位置）が相同である場合には該２配列は５０％相同であり、位置の９０％、例えば１０のうち９が適合若しくは相同である場合、該２配列は９０％の相同性を共有する。例として、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’および３’ＴＡＴＧＧＣは５０％相同性を共有する。
本明細書で使用されるところの「相同性」は「同一性」と同義に使用する。加えて、「相同性」という用語が核酸およびタンパク質を指すのに本明細書で使用される場合、それは核酸およびアミノ酸双方のレベルの相同性に適用されると解釈されるべきである。２種のヌクレオチド若しくはアミノ酸配列間のパーセント同一性の決定は数学的アルゴリズムを使用して達成し得る。例えば、２配列を比較するのに有用な数学的アルゴリズムは、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７）でのとおり改変されたＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８）のアルゴリズムである。このアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれ、そして、例えばＵＲＬ ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を有する国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のワールドワイドウェブでアクセスし得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本明細書に記述される核酸に相同なヌクレオチド配列を得るため、以下のパラメータ、すなわちギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）＝５；ギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝２；ミスマッチペナルティ（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｐｅｎａｌｔｙ）＝３；マッチリウォード（ｍａｔｃｈ ｒｅｗａｒｄ）＝１；期待値（ｅｘｐｅｃｔａｉｏｎ ｖａｌｕｅ）１０．０；および語長（ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ）＝１１を使用するＮＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトで「ｂｌａｓｔｎ」と呼称される）を用いて実施し得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本明細書に記述されるタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るため、以下のパラメータすなわち期待値（ｅｘｐｅｃｔａｉｏｎ ｖａｌｕｅ）１０．０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）を使用してＸＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトで「ｂｌａｓｔｎ」と呼称される）若しくはＮＣＢＩ「ｂｌａｓｔｐ」プログラムを用いて実施し得る。
比較の目的上ギャップを付けたアライメントを得るため、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）に記述されるところのＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用し得る。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔ若しくはＰＨＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠隔関係（ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）（同上）、および共通パターンを共有する分子間の関係を検出する反復検索を実施し得る。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔおよびＰＨＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを使用し得る。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。２配列間のパーセント同一性は、ギャップを許容することを伴う若しくは伴わない上述されたものに類似の技術を使用して決定し得る。パーセント同一性の計算において、典型的には正確な適合を計数する。
本明細書で使用されるところの「抗体」という用語は、抗原上の特定の１エピトープに特異的に結合することが可能である免疫グロブリン分子を指す。抗体は天然の供給源若しくは組換え供給源由来の無傷の免疫グロブリンであり得、および無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。抗体は典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明の抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を包含する多様な形態で存在しうる（Ｈａｒｌｏｗら、１９９９、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク；Ｈａｒｌｏｗら、１９８９、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；Ｈｏｕｓｔｏｎら、１９８８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３；Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６）。
本明細書で使用されるところの「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ）」若しくは「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」という用語により、抗体が特定の１抗原エピトープに優先的に結合するがしかし必ずしもその特定の抗原エピトープにのみ結合するわけではないことを意味している。
本明細書で使用されるところの「単離された抗体」という用語は、それがある生物体中で天然に会合するものから分離された抗体を指す。
本明細書で使用されるところの「合成抗体」という用語は、例えば本明細書に記述されるところのバクテリオファージにより発現される抗体のような組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を指す。該用語は、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成により生成される抗体を意味するともまた解釈されるべきであり、そしてそのＤＮＡ分子は抗体タンパク質若しくは該抗体を指定するアミノ酸配列を発現し、該ＤＮＡ若しくはアミノ酸配列は当該技術分野で利用可能かつ公知である合成ＤＮＡ若しくはアミノ酸配列技術を使用して得られている。
本明細書で使用されるところの「Ｈ鎖抗体（１若しくは複数）」という用語は、抗原での免疫化および血清のその後の単離、若しくはこうした抗体をコードする核酸配列のクローニングおよび発現のいずれかによる新世界ラクダ類（ｃａｍｅｌｉｄ）種由来の免疫グロブリン分子を含んでなる。「Ｈ鎖抗体（１若しくは複数）」という用語は、Ｈ鎖疾患を伴う動物から単離された、若しくは動物からのＶＨ（可変Ｈ鎖免疫グロブリン）遺伝子のクローニングおよび発現により製造される免疫グロブリン分子をさらに包含する。
本明細書で使用されるところの「プローブ」は、１若しくはそれ以上の型の化学結合、通常は水素結合形成により、通常は相補塩基対形成により相補配列の標的核酸に結合することが可能な核酸と定義する。本明細書で使用されるところのプローブは天然の（すなわちＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃ若しくはＴ）または修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）を包含しうる。加えて、ホスホジエステル結合以外の結合が、それがハイブリダイゼーションを妨害しない限りはプローブ中の塩基を結合しうる。従って、プローブは、構成塩基がホスホジエステル結合よりむしろペプチド結合により結合されているペプチド核酸でありうる。
「適合」、「完全一致」、「完全一致プローブ」若しくは「完全一致対照」という用語は、特定の１標的配列に完全に相補的である配列を有する核酸を指す。該核酸は典型的には標的配列の一部分（下位配列）に完全に相補的である。完全一致（ＰＭ）プローブは「試験プローブ」、「正規化対照」プローブ、発現レベル対照プローブなどであり得る。完全一致対照若しくは完全一致は、しかしながら「ミスマッチ」若しくは「ミスマッチプロ
ーブ」と識別される。
「ミスマッチ」、「ミスマッチ対照」若しくは「ミスマッチプローブ」という用語は、その配列が特定の１標的配列に完全には相補的でない核酸を指す。制限しない一例として、高密度プローブアレイ中の各ミスマッチ（ＭＭ）対照について、典型的に、同一の特定の標的配列に完全に相補的である対応する完全一致（ＰＭ）プローブが存在する。ミスマッチは１若しくはそれ以上の塩基を含みうる。ミスマッチ（１若しくは複数）はミスマッチプローブのいずれの場所にも位置しうる一方、末端ミスマッチは標的配列のハイブリダイゼーションを予防することがより少なくありそうであるため、末端ミスマッチはより少なく望ましい。特定の好ましい一態様において、ミスマッチは、ミスマッチが試験ハイブリダイゼーション条件下で標的配列との二重鎖を不安定化することが最もありそうであるようなプローブの中心若しくはその近くに配置される。
ホモミスマッチは、チミン（Ｔ）の代わりにアデニン（Ａ）（および逆もまた同じ）、ならびにシトシン（Ｃ）の代わりにグアニン（Ｇ）（および逆もまた同じ）を用いる。例えば、標的配列がＡＧＧＴＣＣＡであった場合、中央すなわち第四の位置に単一ホモミスマッチを伴い設計されるプローブは、以下の配列すなわちＴＣＣＴＧＧＴをもたらすとみられる。
一態様において、対は完全一致およびミスマッチ対で存在し、各対の一方のプローブは標的配列に対する完全一致でありかつ他方のプローブは中央塩基がホモミスマッチであることを除き完全一致プローブに同一である。ミスマッチプローブは、該プローブが向けられる標的以外のサンプル中の核酸への非特異的結合若しくは交差ハイブリダイゼーションの対照を提供する。従って、ミスマッチプローブはハイブリダイゼーションが特異的であるか若しくは非特異的であるかを示す。例えば、標的が存在する場合、完全一致プローブは、蛍光強度若しくは輝度が結合親和性に対応するためにミスマッチプローブより一貫してより明るいはずである。（例えば米国特許第５，３２４，６３３号明細書（全部の目的上本明細書に組み込まれる）を参照されたい）最後に、完全一致とミスマッチプローブ間の強度の差違（Ｉ（ＰＭ）−Ｉ（ＭＭ））はハイブリダイズされた物質の濃度の良好な尺度を提供する。ＰＣＴ第ＷＯ ９８／１１２２３号明細書（全部の目的上引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本発明の核酸は、ピリミジンおよびプリン塩基、好ましくはそれぞれシトシン、チミンおよびウラシル、ならびにアデニンおよびグアニンのいかなるポリマー若しくはオリゴマーも包含しうる。（Ａｌｂｅｒｔ Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ、７９３−８００（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂ．１９８２）（全部の目的上そっくりそのまま本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。事実、本発明はいかなるデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド若しくはペプチド核酸成分、およびこれらの塩基のメチル化、ヒドロキシメチル化若しくはグルコシル化形態などのようなそれらのいかなる化学的バリアントも企図している。該ポリマー若しくはオリゴマーは組成が不均一であっても若しくは均一であってもよく、そして天然に存在する供給源から単離しうるか、若しくは人工的にすなわち合成で製造しうる。加えて、核酸はＤＮＡ若しくはＲＮＡまたはそれらの混合物であることができ、そして、永続的に若しくは一過性にのいずれかで一本鎖、若しくはホモ二重鎖、ヘテロ二重鎖およびハイブリッド状態を包含する二本鎖の形態で存在しうる。
「オリゴヌクレオチド」若しくは「ポリヌクレオチド」は、長さが最低２、好ましくは最低８、１５若しくは２５ヌクレオチドからの範囲にわたる核酸であるが、しかし５０、１００、１０００若しくは５０００ヌクレオチド長まで、またはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする化合物であることができる。ポリヌクレオチドはデオキシリボ核
酸（ＤＮＡ）若しくはリボ核酸（ＲＮＡ）、または、天然の供給源から単離されうるか、組換え製造されうるか若しくは人工的に合成されうるそれらの模倣物の配列を包含する。本発明のポリヌクレオチドのさらなる一例はペプチド核酸（ＰＮＡ）でありうる。（米国特許第６，１５６，５０１号明細書（そっくりそのまま引用することによりここに組み込まれる）を参照されたい。）本発明は、ある種のｔＲＮＡ分子中で同定されおよび三重らせんで存在すると仮定されているフーグスティーン塩基対形成のような非伝統的塩基対形成が存在する状況もまた包含する。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は本開示中で互換性に使用する。
「ゲノム」は１生物体の全遺伝物質である。いくつかの例において、ゲノムという用語は染色体ＤＮＡを指すことがある。ゲノムは、ＤＮＡが複数の個々の染色体のあいだで細胞で分布されているような多染色体（ｍｕｌｔｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）であることができる。例えば、ヒトでは２２対の染色体および性に関連するＸＸ若しくはＸＹ対が存在する。特定の１生物体の染色体中の遺伝物質由来のＤＮＡがゲノムＤＮＡである。ゲノムという用語は染色体構造を有しない生物体からの遺伝物質もまた指すことがある。加えてゲノムという用語はミトコンドリアＤＮＡを指すことがある。ゲノムライブラリーはゲノムの全部若しくは一部分を表すＤＮＡフラグメントの集合物である。頻繁に、ゲノムライブラリーは、生物体のゲノム全体若しくはゲノムの一部分を表す一組の無作為に生成された、ときに重複するＤＮＡフラグメントから作成されるクローンの集合物である。
「染色体」という用語は、クロマチン由来でありかつＤＮＡおよびタンパク質成分（具体的にはヒストン）を含んでなる細胞の遺伝を担う遺伝子担体を指す。慣習的な国際的に認識される個々のヒトゲノム染色体番号付け体系を本明細書で使用する。個々の染色体の大きさは、所定の多染色体ゲノム内で型ごとおよびゲノムごとに変動し得る。ヒトゲノムの場合、所定の染色体の全ＤＮＡ質量は通常約１００，０００，０００ｂｐより大きい。例えば、全ヒトゲノムの大きさは約３×１０９ｂｐである。最大の染色体すなわち第１染色体は約２．４×１０８ｂｐを含有する一方、最小の染色体すなわち第２２染色体は約５．３×１０７ｂｐを含有する。
「染色体領域」は染色体の一部分である。いずれかの個々の染色体領域の実際の物理的大きさ若しくは広がりは大きく変動し得る。「領域」という用語は、１領域が個別の１遺伝子の特定のコーディングセグメント（エキソン）を特に考慮する必要がないため、特定の１若しくはそれ以上の遺伝子を必ずしも定義しない。
「対立遺伝子」は、１細胞、１個体若しくは１集団内の（遺伝子のような）遺伝子配列の特定の一形態を指し、該特定の形態は、該遺伝子の配列内の最低１および頻繁には１以上の変異部位の配列が同一遺伝子の他の形態と異なる。異なる対立遺伝子間で異なるこれらの変異部位の配列は「バリアント」、「多型」若しくは「突然変異」と命名される。
多型は、１集団中の２若しくはそれ以上の遺伝子的に決定された代替配列若しくは対立遺伝子の存在を指す。多型マーカー若しくは部位は相違が存在する遺伝子座である。多型は１若しくはそれ以上の塩基変化、挿入、反復若しくは欠失を含みうる。多型遺伝子座は１塩基対くらい小さいことができる。第一の同定された対立遺伝子形態を参照形態と任意に呼称し、そして他の対立遺伝子形態は代替若しくはバリアント対立遺伝子と呼称する。選択された１集団に最も頻繁に存在する対立遺伝子形態はときに野生型形態と称される。二対立遺伝子多型は２形態を有する。三対立遺伝子多型は３形態を有する。２核酸間の多型は天然に起こり得るか、あるいは、化学物質、酵素、若しくは他の剤への曝露若しくはそれらとの接触、または核酸に対し損傷を引き起こす剤、例えば紫外放射、変異原若しくは発癌物質への曝露により引き起こされ得る。
一塩基多型（ＳＮＰ）は、所定の１集団中で２個の代替塩基が認識可能な頻度（約最低１％）で存在する位置である。ＳＮＰは多型部位での１ヌクレオチドの代わりの別のものの使用により生じうる。転移は、１種のプリンの別のプリンによる、若しくは１種のピリミジンの別のピリミジンによる置換である。塩基転換はピリミジンによるプリンの置換若しくはその逆である。ＳＮＰは、参照対立遺伝子に関して１ヌクレオチドの欠失若しくは１ヌクレオチドの挿入からもまた生じ得る。
「遺伝子型同定」という用語は、個体がゲノム中の１若しくはそれ以上の位置に保有する遺伝情報の決定を指す。例えば、遺伝子型同定は、単一のＳＮＰについて個体がどの対立遺伝子（１個若しくは複数）を保有するかの決定、または複数のＳＮＰについて個体がどの対立遺伝子（１個若しくは複数）を保有するかの決定を含みうる。例えば、ゲノム中の特定の１ヌクレオチドは若干の個体でＡかつ他の個体でＣでありうる。該位置にＡを有する個体はＡ対立遺伝子を有しかつＣを有する者はＣ対立遺伝子を有する。多型の位置は２若しくはそれ以上の可能な対立遺伝子を有することができ、また、アレイは全部の可能な組合せを識別するように設計しうる。
本明細書で使用されるところの「マーカー発現」という用語は、１遺伝子でコードされる情報のＲＮＡ若しくはタンパク質への変換の全部の局面を包含する、１遺伝子の転写、翻訳、翻訳後修飾および表現型出現を包含する。制限しない例として、マーカー発現は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写およびタンパク質への翻訳、ならびにタンパク質に翻訳されない転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のような型のＲＮＡへの転写を包含する。
「マーカー発現のレベルを測定すること」という句により、検出されるマーカー発現産物の十分な部分が付随する配列表で本明細書に列挙される配列のいずれか１種の発現を示すような、付随する配列表で本明細書に列挙される配列のいずれか１種の（核酸およびタンパク質を包含する）いずれかのマーカー発現産物の十分な一部分を検出するために当業者に利用可能な技術を使用する、サンプル中のマーカーの発現の程度の核酸若しくはタンパク質のレベルでの評価を意味している。
「対照若しくは参照標準」という用語は、サンプルを比較し得る比較体（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）として対照若しくは参照標準がはたらきうるような、なし、または正常、低若しくは高レベルの付随する配列表で本明細書に列挙される１種若しくはそれ以上の配列のマーカー発現産物の１種若しくはそれ以上を含んでなる物質を記述する。制限しない例として、対照若しくは参照標準は、着床の能力のある卵母細胞、着床の能力のない卵母細胞、受精の能力のある卵母細胞、受精の能力のない卵母細胞、染色体が正常の卵母細胞、染色体が異常な卵母細胞、着床の能力のある卵母細胞と関連する卵胞液、着床の能力のない卵母細胞と関連する卵胞液、受精の能力のある卵母細胞と関連する卵胞液、受精の能力のない卵母細胞と関連する卵胞液、染色体が正常な卵母細胞と関連する卵胞液、染色体が異常な卵母細胞と関連する卵胞液、着床の能力のある卵母細胞と関連する培地、着床の能力のない卵母細胞と関連する培地、受精の能力のある卵母細胞と関連する培地、受精の能力のない卵母細胞と関連する培地、染色体が正常な卵母細胞と関連する培地、染色体が異常な卵母細胞と関連する培地、着床の能力のある卵母細胞と関連する卵丘細胞、着床の能力のない卵母細胞と関連する卵丘細胞、受精の能力のある卵母細胞と関連する卵丘細胞、受精の能力のない卵母細胞と関連する卵丘細胞、染色体が正常な卵母細胞と関連する卵丘細胞、染色体が異常な卵母細胞と関連する卵丘細胞、着床の能力のある卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液、着床の能力のない卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液、受精の能力のある卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液、受精の能力のない卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液、染色体が正常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液、染色体が異常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液、着床の能力のある卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する培地、着床の能力のない卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する培地、受精の能力のある卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する培地、受精の能力のない卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する培地、染色体が正常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する培地、染色体が異常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する培地、若しくはそれらの組合せのいずれかの全部若しくは一部を包含しうる。
「アレイ」は支持体に結合された核酸プローブを伴う支持体、好ましくは固体を含んでなる。好ましいアレイは、典型的に、異なる既知の場所で支持体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）の表面に結合されている複数の多様な核酸プローブを含んでなる。「マイクロアレイ」若しくは口語的に「チップ」ともまた記述されるこれらのアレイは、全般として、当該技術分野、例えば米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，４４５，９３４号、同第５，７４４，３０５号、同第５，６７７，１９５号、同第５，８００，９９２号、同第６，０４０，１９３号、同第５，４２４，１８６号明細書、およびＦｏｄｏｒら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６７−７７７（それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる）に記述されている。アレイは、一般に、機械合成法、若しくはフォトリソグラフィー法および固相合成法の組合せを組み込む光に指図される合成法のような多様な技術を使用して製造しうる。機械合成法を使用するこれらのアレイの合成技術は、例えば米国特許第５，３８４，２６１号および同第６，０４０，１９３号明細書（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述される。平坦なアレイ表面が好ましいとは言え、アレイは事実上いかなる形状の表面、若しくはなお複数の表面上でさえ製作しうる。アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマー表面、光ファイバーのようなファイバー、ガラス若しくはいずれかの他の適切な支持体上の核酸でありうる。（米国特許第５，７７０，３５８号、同第５，７８９，１６２号、同第５，７０８，１５３号、同第６，０４０，１９３号および同第５，８００，９９２号明細書（全部の目的上そっくりそのまま引用することによりここに組み込まれる）を参照されたい。）
既知配列の増幅についてのアッセイもまた開示される。例えば、ロングレンジＰＣＲのためのプライマーを配列の領域を増幅するように設計しうる。ＲＮＡについては、一本鎖ＲＮＡから二本鎖ＤＮＡを生成するのに第一の逆転写酵素段階を使用しうる。該アレイは、ゲノム全体；またはゲノムの１若しくはそれ以上の領域、例えば目的のタンパク質若しくはＲＮＡをコードするもののようなゲノムの選択された１領域；または複数のゲノムからの保存された領域；または複数のゲノムからの配列を検出するように設計しうる。アレイおよびアレイを使用する遺伝子分析方法はＣｕｔｌｅｒら、２００１、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（１１）：１９１３−１９２５およびＷａｒｒｉｎｇｔｏｎら、２００２、Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ １９：４０２−４０９ならびに米国特許公開第２００３０１２４５３９号明細書（それらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述される。
アレイは、診断的使用を見込むような様式で包装しうるか、若しくは包括的装置であり得る（例えば米国特許第５，８５６，１７４号および同第５，９２２，５９１号明細書（全部の目的上引用することによりそっくりそのまま組み込まれる））。アレイは例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（カリフォルニア州サンタクララ）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）から商業的に入手可能であり、そして多様な真核生物および原核生物の遺伝子型同定、診断薬、突然変異分析、マーカー発現および遺伝子発現モニタリングを包含する多様な目的に向けられる。固体支持体上のプローブの数は個々の特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）の大きさを変えることにより変動させうる。一態様において、特徴の大きさは２０×２５平方ミクロンであり、他の態様において、特徴は例えば約２，６００，０００、６，６００，０００若しくは１８，０００，０００の個々のプローブの特徴をもたらす８×８、５×５若しくは３×３平方ミクロンでありうる。
ハイブリダイゼーションプローブは、核酸の相補鎖に塩基特異的様式で結合することが可能なオリゴヌクレオチドである。こうしたプローブは、Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４、１４９７−１５００に記述されるところのペプチド核酸、ならびに他の核酸アナログおよび核酸模倣物を包含する。米国特許第６，１５６，５０１号明細書を参照されたい。
ハイブリダイゼーションという用語は、２本の一本鎖核酸が非共有結合して二本鎖核酸を形成する過程を指し；三本鎖ハイブリダイゼーションもまた理論上可能である。核酸中の相補配列は相互と対形成して二重らせんを形成する。生じる二本鎖核酸は「ハイブリッド」である。ハイブリダイゼーションは例えば２本の相補若しくは部分的相補配列間でありうる。ハイブリッドは二本鎖領域および一本鎖領域を有しうる。ハイブリッドは、例えばＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ若しくはＤＮＡ：ＲＮＡでありうる。ハイブリッドはまた修飾核酸間でも形成されうる。核酸の一方若しくは双方を固体支持体上に固定しうる。ハイブリダイゼーション技術を使用して、特定の配列を検出かつ単離し、相同性を評価し、または一方若しくは双方の鎖の他の特徴を定義しうる。
ハイブリッドの安定性は、相補性の長さ、相補領域内のミスマッチの存在、反応中の温度および塩の濃度を包含する多様な因子に依存する。ハイブリダイゼーションは通常緊縮条件下、例えば１Ｍを超えない塩濃度および最低２５℃の温度で実施する。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）若しくは１００ｍＭ ＭＥＳ、１Ｍ Ｎａ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０および２５〜５０℃の温度の条件が対立遺伝子特異的プローブのハイブリダイゼーションに適する。とりわけ好ましい一態様において、ハイブリダイゼーションは４０〜５０℃で実施する。アセチル化ＢＳＡおよびサケ精子ＤＮＡをハイブリダイゼーション反応に添加しうる。
本明細書で使用されるところの「標識」という用語は発光標識、光散乱標識若しくは放射活性標識を指す。蛍光標識は、限定されるものでないが、Ｆｌｕｏｒｅｐｒｉｍｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＦＡＭ（ＡＢＩ）のような商業的に入手可能なフルオレセインホスホルアミダイトを挙げることができる。米国特許第６，２８７，７７８号明細書を参照されたい。
本明細書で使用されるところの「固体支持体」、「支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）」および「支持体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」という用語は互換性に使用され、そして剛性若しくは半剛性の表面（１若しくは複数）を有する１物質若しくは物質の一群を指す。一態様において、固体支持体の最低１表面が実質的に平坦であることができるとは言え、いくつかの態様において、例えば壁、隆起領域、ピン、食刻溝などで異なる化合物の合成領域を物理的に分離することが望ましいことができる。他の態様によれば、固体支持体（１若しくは複数）はビーズ、樹脂、ゲル、マイクロスフェア若しくは他の幾何学的形状をとることができる。例示的支持体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）については米国特許第５，７４４，３０５号明細書を参照されたい。
本明細書で使用されるところの「標的」という用語は所定のプローブに対する親和性を有する分子を指す。標的は天然に存在する若しくは人工の分子でありうる。また、それらはそれらの変えられない状態で若しくは他の種との凝集物として使用し得る。標的は、直接若しくは特定の結合物質を介してのいずれかで結合部材に共有若しくは非共有結合しうる。本発明により使用し得る標的の例は、限定されるものでないが、オリゴヌクレオチド、核酸、抗体、細胞膜受容体、モノクローナル抗体および（ウイルス、細胞若しくは他の物質上のような）特定の抗原決定基と反応性の抗血清、薬物、ペプチド、補助因子、レク
チン、糖、多糖、細胞、細胞膜およびオルガネラを挙げることができる。標的はときに抗プローブと当該技術分野で称される。標的という用語が本明細書で使用される際に、意味の差違は意図していない。
「プローブ標的対」は２巨大分子が分子認識により複合して複合体を形成する場合に形成される。
米国特許第５，８００，９９２号および同第６，０４０，１３８号明細書は、特定のヌクレオチド配列を含有する核酸の存在を検出するのに使用し得る核酸プローブのアレイの作成方法を記述する。最小数の合成段階を伴う核酸、ペプチドおよび他のポリマー配列の高密度アレイの形成方法は既知である。核酸アレイは、限定されるものでないが光指向化学的結合および機械的に指図される（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ）カップリングを挙げることができる多様な方法により固体支持体上で合成し得る。アレイに関する付加的な記述および方法については、米国特許出願第１０／６５８，８７９号、同第６０／４１７，１９０号、同第０９／３８１，４８０号、同第６０／４０９，３９６号、同第５，８６１，２４２号、同第６，０２７，８８０号、同第５，８３７，８３２号、同第６，７２３，５０３号明細書およびＰＣＴ公開第０３／０６０５２６号明細書（それらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
染色体が正常および染色体が異常な卵母細胞の間で示差的に発現されるマーカーの一覧を描く。ＧｅｎｅＩＤはＥｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅの記録に割り当てられる独特の識別子である。Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅは遺伝子のこれらの追跡される独特の識別子を提供し、および、制限されない公的使用のためのそれらの識別子と関連する情報をｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅに報告する。Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｅ ＩＤはｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇで公的に利用可能なＥｎｓｅｍｂｌデータベースの独特な安定な遺伝子識別子である（Ｈｕｂｂａｒｄら、２００６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ００：Ｄ１を参照されたい）。 染色体が正常および染色体が異常な卵母細胞の間で示差的に発現されるマーカーの一覧を描く。ＧｅｎｅＩＤはＥｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅの記録に割り当てられる独特の識別子である。Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅは遺伝子のこれらの追跡される独特の識別子を提供し、および、制限されない公的使用のためのそれらの識別子と関連する情報をｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅに報告する。Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｅ ＩＤはｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇで公的に利用可能なＥｎｓｅｍｂｌデータベースの独特な安定な遺伝子識別子である（Ｈｕｂｂａｒｄら、２００６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ００：Ｄ１を参照されたい）。 染色体が正常および染色体が異常な卵母細胞の間で示差的に発現されるマーカーの一覧を描く。ＧｅｎｅＩＤはＥｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅの記録に割り当てられる独特の識別子である。Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅは遺伝子のこれらの追跡される独特の識別子を提供し、および、制限されない公的使用のためのそれらの識別子と関連する情報をｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅに報告する。Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｅ ＩＤはｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇで公的に利用可能なＥｎｓｅｍｂｌデータベースの独特な安定な遺伝子識別子である（Ｈｕｂｂａｒｄら、２００６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ００：Ｄ１を参照されたい）。 染色体が正常および染色体が異常な卵母細胞の間で示差的に発現されるマーカーの一覧を描く。ＧｅｎｅＩＤはＥｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅの記録に割り当てられる独特の識別子である。Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅは遺伝子のこれらの追跡される独特の識別子を提供し、および、制限されない公的使用のためのそれらの識別子と関連する情報をｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅに報告する。Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｅ ＩＤはｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇで公的に利用可能なＥｎｓｅｍｂｌデータベースの独特な安定な遺伝子識別子である（Ｈｕｂｂａｒｄら、２００６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ００：Ｄ１を参照されたい）。 染色体が正常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と染色体が異常な卵母細胞と関連する卵丘細胞の間で示差的に発現されるマーカーの一覧を描く。ＧｅｎｅＩＤはＥｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅの記録に割り当てられる独特の識別子である。Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅは遺伝子のこれらの追跡される独特の識別子を提供し、および、制限されない公的使用のためのそれらの識別子と関連する情報をｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅに報告する。Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｅ ＩＤはｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇで公的に利用可能なＥｎｓｅｍｂｌデータベースの独特な安定な遺伝子識別子である（Ｈｕｂｂａｒｄら、２００６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ００：Ｄ１を参照されたい）。 染色体が正常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と染色体が異常な卵母細胞と関連する卵丘細胞の間で示差的に発現されるマーカーの一覧を描く。ＧｅｎｅＩＤはＥｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅの記録に割り当てられる独特の識別子である。Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅは遺伝子のこれらの追跡される独特の識別子を提供し、および、制限されない公的使用のためのそれらの識別子と関連する情報をｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅに報告する。Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｅ ＩＤはｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇで公的に利用可能なＥｎｓｅｍｂｌデータベースの独特な安定な遺伝子識別子である（Ｈｕｂｂａｒｄら、２００６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ００：Ｄ１を参照されたい）。 染色体が正常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と染色体が異常な卵母細胞と関連する卵丘細胞の間で示差的に発現されるマーカーの一覧を描く。ＧｅｎｅＩＤはＥｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅの記録に割り当てられる独特の識別子である。Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅは遺伝子のこれらの追跡される独特の識別子を提供し、および、制限されない公的使用のためのそれらの識別子と関連する情報をｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅに報告する。Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｅ ＩＤはｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇで公的に利用可能なＥｎｓｅｍｂｌデータベースの独特な安定な遺伝子識別子である（Ｈｕｂｂａｒｄら、２００６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ００：Ｄ１を参照されたい）。 染色体が正常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と染色体が異常な卵母細胞と関連する卵丘細胞の間で示差的に発現されるマーカーの一覧を描く。ＧｅｎｅＩＤはＥｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅの記録に割り当てられる独特の識別子である。Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅは遺伝子のこれらの追跡される独特の識別子を提供し、および、制限されない公的使用のためのそれらの識別子と関連する情報をｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅに報告する。Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｅ ＩＤはｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇで公的に利用可能なＥｎｓｅｍｂｌデータベースの独特な安定な遺伝子識別子である（Ｈｕｂｂａｒｄら、２００６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ００：Ｄ１を参照されたい）。
実験実施例
本発明は以下の実験実施例への言及により詳細にさらに記述される。これらの実施例は具体的説明のみの目的上提供され、そして別の方法で明記されない限り制限することを意図していない。従って、本発明は以下の実施例に制限されると決して解釈されるべきでなく、しかしむしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるいかなるおよび全部の変形も包含すると解釈されるべきである。
卵母細胞で示差的に発現されるマーカーの同定
卵母細胞の処理は専用のＤＮＡを含まないクリーンルーム環境で実施した。７個の単独卵母細胞（３個の遺伝子正常および４個の遺伝子異常）ならびにそれぞれ未知の染色体状態の５個のプールされた卵母細胞よりなる４個のプールされたサンプルを包含する合計２７個の卵母細胞を分析した。
卵母細胞は無菌のＲＮアーゼを含まない条件下で収集し、そしてマーカー発現の変化を最小限にするため迅速に処理した。透明帯を除去してサンプルからの全卵丘細胞の突出を確実にし、そして極体を卵母細胞から分離した。卵母細胞を微小遠心管に移し、そしてその後直ちに凍結した一方、極体は別個の微小遠心管への移動前に徹底的に洗浄していかなるＤＮＡ汚染物質も除去した。
極体ＤＮＡは細胞を溶解することにより放出した。極体をリン酸緩衝生理的食塩水−０．１％ポリビニルアルコールの１０μＬの滴で洗浄し、２μＬのプロテイナーゼｋ（１２５μｇ／ｍＬ）および１μＬのドデシル硫酸ナトリウム（１７μＭ）を含有する微小遠心管に移し、そして油で覆った。３７℃で１時間、次いで９５℃で１５分のインキュベーションを行ってＤＮＡを放出した。（Ｗｅｌｌｓら、２００２、Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ７８：５４３を参照されたい）。
極体ＤＮＡをその後、縮重オリゴヌクレオチドプライムドＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）と呼ばれる全ゲノム増幅法を使用して増幅した。極体ＤＮＡは以前に報告された方法（Ｗｅｌｌｓら、１９９９、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１２１４−１２１８）の改変を使用して増幅した。増幅は以下すなわち０．２ｍＭ ｄＮＴＰ；２．０μＭ 縮重オリゴヌクレオチドプライマーＣＣＧＡＣＴＣＧＡＧＮＮＮＮＮＮＡＴＧＴＧＧ；１×ＳｕｐｅｒＴａｑ Ｐｌｕｓ緩衝液、および２．５ＵのＳｕｐｅｒＴａｑ Ｐｌｕｓポリメラーゼ（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースチン）を含有する５０μＬ反応容量中で起こった。熱循環条件は後に続くとおりであった。すなわち、９４℃４．５分間；９５℃３０秒間、３０℃１分間、７２℃までの１℃／ｓの傾斜、および７２℃３分間の８周期；９５℃３０秒間、５６℃１分間および７２℃１．５分間の３５周期；ならびに最後に７２℃８分間。増幅が完了した後、増幅したＤＮＡの５μＬアリコートを新たなＰＣＲチューブに移し、そして単一遺伝子試験のため保持した。
増幅ＤＮＡを、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）（サンプル中のすべての染色体のコピー数を示す方法）の目的上使用した。極体内の染色体は卵母細胞中のものの鏡像である（例えば、極体が１コピーの第２１染色体を非常に少なく有する場合、卵母細胞は１コピーの第２１染色体を非常に多く有することができる）。従って、極体の分析は卵母細胞が異常であるかどうかを示す。増幅ＤＮＡサンプル（全ゲノム増幅産物）を沈殿させ、そしてニックトランスレーションにより蛍光標識した。極体ＤＮＡをＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎ−ｄＵＴＰ（Ｖｙｓｉｓ、イリノイ州ダウナーズグローブ）で標識した一方、４６すなわちＸＸ（正常雌性）ＤＮＡはＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄ−ｄＵＴＰ（Ｖｙｓｉｓ）で標識した。双方の標識ＤＮＡを３０μｇのＣｏｔ１ ＤＮＡで沈殿させた。沈殿したＤＮＡを、５０％ホルムアミド；２×生理的食塩水クエン酸ナトリウム［ＳＳＣ；２０×ＳＳＣは１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７であ
る］；ならびに１０％デキストラン硫酸から構成されるハイブリダイゼーション混合物に再懸濁した）。ハイブリダイゼーション混合物に溶解した標識ＤＮＡサンプルを７５℃で１０分間変性させ、その後下述されるところの変性正常染色体スプレッドに適用する前に室温で２分間冷却させた。
正常雄性（４６、ＸＹ；Ｖｙｓｉｓ）からの中期スプレッドを一連のアルコール（７０％、８５％および１００％エタノール各３分間）により脱水しかつ風乾した。スライドガラスをその後７０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ中７５℃で５分間変性した。このインキュベーション後にスライドガラスに−２０℃で一連のアルコールを通過させかつその後乾燥した。標識ＤＮＡプローブをスライドガラスに添加し、そしてカバーガラスをハイブリダイゼーション領域の上に置きかつラバーセメントで封止した。スライドガラスをその後加湿チャンバー中３７℃で２５〜３０時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後にスライドガラスを２×ＳＳＣ（７３℃）、４×ＳＳＣ（３７℃）、４×ＳＳＣ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（３７℃）、４×ＳＳＣ（３７℃）および２×ＳＳＣ（室温）で順次洗浄し；各洗浄は５分持続した。スライドガラスをその後蒸留水に浸漬し、別の一連のアルコールを通過させ、乾燥し、そして最後にジアミドフェニルインドールを含有する抗退色媒体（ＤＡＰＩ ＩＩ、Ｖｙｓｉｓ）中でマウントして染色体および核を対染色した。
蛍光顕微鏡分析は、ハイブリダイズされた極体（緑色）ＤＮＡが各染色体の長さに沿って正常雌性（赤色）ＤＮＡの量と比較されることを可能にした。コンピュータソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ、カリフォルニア州サンタクララ）がこれらのデータを各染色体の単純な赤色−緑色比に変換し；１：１比からの逸脱は染色体物質の喪失若しくは獲得を示した。この分析に基づき、卵母細胞を染色体が正常若しくは染色体が異常と同定した。
染色体が正常と同定された卵母細胞および染色体が異常と同定されたものからＲＮＡを抽出した。これは製造元の説明書に従ってＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ＲＮＡ Ｎａｎｏｐｒｅｐキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して達成した。正常および異常細胞からのＲＮＡを２回のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写手順を使用して増幅した。この目的上、抽出されたＲＮＡを逆転写（ＲＴ）にかけ、その５’端にファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含有するオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用してプライミングした。第一鎖ｃＤＮＡ合成はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により触媒され、そしてＲＮＡ二次構造を減少させるように上昇された温度で実施した。ＲＴの間に製造されたｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡを、ＲＮアーゼＨ酵素を使用して小ＲＮＡフラグメントに消化した。該ＲＮＡフラグメントが第二鎖ｃＤＮＡ合成をプライミングした。生じる二本鎖ｃＤＮＡは、その後のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の間にアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ；ｃＲＮＡともまた呼ばれる）を生成することができる向きにＴ７転写プロモーターを含有した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよび前の段階で製造された二本鎖ｃＤＮＡを利用した迅速ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応で高収量のａＲＮＡが製造された。製造されたａＲＮＡをその後スピンカラムクロマトグラフィーにより精製した。この初回の逆転写およびｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ合成はＴａｒｇｅｔＡｍｐキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して着手した。
第２回の逆転写、第二鎖ｃＤＮＡ合成およびｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、製造元の推奨されるプロトコルに従いＮａｎｏＡｍｐ ＲＴ−ＩＶＴ標識キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して達成した。第２回の増幅の間に標識ヌクレオチドがＲＮＡに取り込まれ、マイクロアレイへのハイブリダイゼーション後のその後の化学発光検出を可能にした。該増幅過程は卵母細胞あたり２１μｇまでのＲＮＡを製造した。製造されたフラグメントは大きさが１０ｋｂまで（平均のフラグメント大きさ約５００ｂｐ）であった。
Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｕｒｖｅｒｙマイクロアレイを使用してＲＮＡ発現を分析した。本マイクロアレイは２９，０９８遺伝子の照合のための３２，８７８プローブを有する。本マイクロアレイの化学発光検出系は、まれな転写物の検出および発現レベルのわずかな変動の信頼できる同定を見込む大きなダイナミックレンジを提供する。本マイクロアレイおよび本特定のマイクロアレイについての情報は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからｗｗｗ２．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍで入手可能である。発現分析はＰａｎｔｈｅｒソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州）およびＳｐｏｔｆｉｒｅを使用して実施した。
ヒト卵母細胞は１２，４００を超えるマーカーを発現することが見出された。これらのうち、６，２２６マーカーは一貫して発現されているようであり、そして評価した全サンプルで検出された。染色体が正常な卵母細胞の染色体が異常な卵母細胞との比較は、発現レベルの有意の差違を表す合計３０８マーカーを示した（４６マーカー ｐ＜０．０１；２６２マーカー ｐ＜０．０５）。染色体が正常な卵母細胞と染色体が異常な卵母細胞の間で発現の統計学的に有意の差違を表すマーカーのうち、発現の最大相違倍数を示すものを図１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄに列挙する。
チェックポイント遺伝子および微小管モータータンパク質を包含する示差的に発現されるマーカーのいくつかは、正確な染色体分離の維持に関与することが既知であるか若しくは疑われ、そして、ヒト卵母細胞での異数性の生成で基礎的な役割を有しうる。例えば、ＴＵＢＡ１の異常な発現されたが異数体卵母細胞で観察された。この遺伝子中の突然変異は紡錘体微小管を不安定化し、潜在的に染色体分離異常につながる。ダイニンおよびキネシン遺伝子（例えばＤＮＣＬ２ＢおよびＫＩＦ２Ｂ遺伝子）の異常発現もまた観察され、そして染色体の動きの促進におけるこうした遺伝子のタンパク質産物の役割を考えれば重要でありうる。
関与する経路のいくつかは減数分裂染色体異常の起源に関与することが示唆されているとは言え、驚くことに、同定された特定の示差的に発現されるマーカーのいずれも減数分裂染色体異常の研究の主題でなかった。例えば、ミトコンドリア機能異常はおそらくＡＴＰ枯渇により染色体分離を伴う問題に至る可能性があることが推測されている。しかしながら、本研究で強調されるミトコンドリア（若しくはミトコンドリア関連）遺伝子（例えばＭＴＣＨ２、ＨＭＧＣＳ２）は異数性においてある役割を有することが以前に示唆されていない。
減数分裂染色体分離異常を調節するための潜在的候補として最も大きな興味を伝統的に引いてきたマーカーは、この分析によりより少なく重要であるようである。例えば、中期−後期（紡錘体）チェックポイントで機能する十分に特徴付けられた遺伝子（例えばＢＵＢ１およびＭＡＤ２）は異数体卵母細胞で変えられた機能を示すことが見出されなかった一方、ＡＳＰ（異常な紡錘体様、小頭症関連）およびＵＢＥ２Ｖ２のような細胞周期制御において潜在的役割をもつより少なく研究された遺伝子が、遺伝子発現の有意の差違を表した。
ＰＲＰＳＡＰ２およびＣＹＰ３Ａ４を包含するヌクレオシド代謝およびコレステロール生合成に関与する数種のマーカーは、染色体が正常および染色体が異常な卵母細胞の間で示差的に発現された。これは、これらの過程が雌性減数分裂の間に染色体分離異常と直接若しくは間接的に関与しうることを示唆する。
数種のマーカーは細胞表面に位置するか、若しくは排出されるタンパク質であるか、ま
たは排出される代謝物のレベルに影響を及ぼす生合成経路に関与するは、染色体が正常なおよび染色体が異常な卵母細胞の間で示差的に発現された。例えば、細胞表面受容体タンパク質の遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＰＴＰＲＭ、ＥＳＲＲＡ、ＧＰＲ１０３およびＴＨＲＡ。
卵丘細胞で示差的に発現されるマーカーの同定
卵丘細胞の処理は専用のＤＮＡを含まないクリーンルーム環境で実施した。合計６個の卵丘細胞（３個の染色体が正常および３個の染色体が異常）を分析した。
卵丘細胞を無菌のＲＮアーゼを含まない条件で収集した。卵丘細胞を卵母細胞から機械的に分離し、そしてマーカー発現の変化を最小限にするため迅速に処理した。透明帯を対応する卵母細胞から除去しそして極体を分離した。卵母細胞を微小遠心管に移しかつその後の直ちに凍結した一方、極体は別個の微小遠心管への移行の前に徹底的に洗浄していかなるＤＮＡ汚染物質も除去した。
極体ＤＮＡは細胞を溶解することにより放出した。極体をリン酸緩衝生理的食塩水−０．１％ポリビニルアルコールの１０μＬの滴で洗浄し、２μＬのプロテイナーゼｋ（１２５μｇ／ｍＬ）および１μＬのドデシル硫酸ナトリウム（１７μＭ）を含有する微小遠心管に移し、そして油で覆った。３７℃で１時間、次いで９５℃で１５分のインキュベーションを行ってＤＮＡを放出した。（Ｗｅｌｌｓら、２００２、Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ７８：５４３を参照されたい）。
極体ＤＮＡをその後、縮重オリゴヌクレオチドプライムドＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）と呼ばれる全ゲノム増幅法を使用して増幅した。極体ＤＮＡは以前に報告された方法（Ｗｅｌｌｓら、１９９９、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１２１４−１２１８）の改変を使用して増幅した。増幅は以下すなわち０．２ｍＭ ｄＮＴＰ；２．０μＭ 縮重オリゴヌクレオチドプライマーＣＣＧＡＣＴＣＧＡＧＮＮＮＮＮＮＡＴＧＴＧＧ；１×ＳｕｐｅｒＴａｑ Ｐｌｕｓ緩衝液、および２．５ＵのＳｕｐｅｒＴａｑ Ｐｌｕｓポリメラーゼ（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースチン）を含有する５０μＬ反応容量中で起こった。熱循環条件は後に続くとおりであった。すなわち、９４℃４．５分間；９５℃３０秒間、３０℃１分間、７２℃までの１℃／ｓの傾斜、および７２℃３分間の８周期；９５℃３０秒間、５６℃１分間および７２℃１．５分間の３５周期；ならびに最後に７２℃８分間。増幅が完了した後、増幅したＤＮＡの５μＬアリコートを新たなＰＣＲチューブに移し、そして単一遺伝子試験のため保持した。
増幅ＤＮＡを、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）（サンプル中のすべての染色体のコピー数を示す方法）の目的上使用した。極体内の染色体は卵母細胞中のものの鏡像である（例えば、極体が１コピーの第２１染色体を非常に少なく有する場合、卵母細胞は１コピーの第２１染色体を非常に多く有することができる）。従って、極体の分析は卵母細胞が異常であるかどうかを示す。増幅ＤＮＡサンプル（全ゲノム増幅産物）を沈殿させ、そしてニックトランスレーションにより蛍光標識した。極体ＤＮＡはＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎ−ｄＵＴＰ（Ｖｙｓｉｓ、イリノイ州ダウナーズグローブ）で標識した一方、４６すなわちＸＸ（正常雌性）ＤＮＡはＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄ−ｄＵＴＰ（Ｖｙｓｉｓ）で標識した。双方の標識ＤＮＡを３０μｇのＣｏｔ１ ＤＮＡで沈殿させた。沈殿したＤＮＡを、５０％ホルムアミド；２×生理的食塩水クエン酸ナトリウム［ＳＳＣ；２０×ＳＳＣは１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である］；ならびに１０％デキストラン硫酸から構成されるハイブリダイゼーション混合物に再懸濁した）。ハイブリダイゼーション混合物に溶解した標識ＤＮＡサンプルを７５℃で１０分間変性させ、その後下述されるところの変性正常染色体スプレッドに適用する前に
室温で２分間冷却させた。
正常雄性（４６、ＸＹ；Ｖｙｓｉｓ）からの中期スプレッドを一連のアルコール（７０％、８５％および１００％エタノール各３分間）により脱水しかつ風乾した。スライドガラスをその後７０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ中７５℃で５分間変性した。このインキュベーション後にスライドガラスに−２０℃で一連のアルコールを通過させかつその後乾燥した。標識ＤＮＡプローブをスライドガラスに添加し、そしてカバーガラスをハイブリダイゼーション領域の上に置きかつラバーセメントで封止した。スライドガラスをその後加湿チャンバー中３７℃で２５〜３０時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後にスライドガラスを２×ＳＳＣ（７３℃）、４×ＳＳＣ（３７℃）、４×ＳＳＣ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（３７℃）、４×ＳＳＣ（３７℃）および２×ＳＳＣ（室温）で順次洗浄し；各洗浄は５分持続した。スライドガラスをその後蒸留水に浸漬し、別の一連のアルコールを通過させ、乾燥し、そして最後にジアミドフェニルインドールを含有する抗退色媒体（ＤＡＰＩ ＩＩ、Ｖｙｓｉｓ）中でマウントして染色体および核を対染色した。
蛍光顕微鏡分析は、ハイブリダイズされた極体（緑色）ＤＮＡが各染色体の長さに沿って正常雌性（赤色）ＤＮＡの量と比較されることを可能にした。コンピュータソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ、カリフォルニア州サンタクララ）がこれらのデータを各染色体の単純な赤色−緑色比に変換し；１：１比からの逸脱は染色体物質の喪失若しくは獲得を示した。この分析に基づき、卵母細胞およびそこで関連する卵丘細胞を染色体が正常若しくは染色体が異常と同定した。
ＲＮＡを、染色体が正常な卵母細胞と関連する卵丘細胞および染色体が異常であった卵母細胞と関連するものから抽出した。これは製造元の説明書に従ってＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ＲＮＡ Ｎａｎｏｐｒｅｐキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して達成した。ＲＮＡは２回のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写手順を使用して増幅した。この目的上、抽出されたＲＮＡを逆転写（ＲＴ）にかけ、その５’端にファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含有するオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用してプライミングした。第一鎖ｃＤＮＡ合成はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により触媒され、そしてＲＮＡ二次構造を減少させるように上昇された温度で実施した。ＲＴの間に製造されたｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡはＲＮアーゼＨ酵素を使用して小ＲＮＡフラグメントに消化した。該ＲＮＡフラグメントが第二鎖ｃＤＮＡ合成をプライミングした。生じる二本鎖ｃＤＮＡは、その後のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の間にアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ；ｃＲＮＡともまた呼ばれる）を生成することができる向きにＴ７転写プロモーターを含有した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよび前の段階で製造された二本鎖ｃＤＮＡを利用した迅速ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応で高収量のａＲＮＡが製造された。製造されたａＲＮＡをその後スピンカラムクロマトグラフィーにより精製した。この初回の逆転写およびｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ合成はＴａｒｇｅｔＡｍｐキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して着手した。
第２回の逆転写、第二鎖ｃＤＮＡ合成およびｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、製造元の推奨されるプロトコルに従いＮａｎｏＡｍｐ ＲＴ−ＩＶＴ標識キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して達成した。第２回の増幅の間に、標識ヌクレオチドがＲＮＡに取り込まれ、マイクロアレイへのハイブリダイゼーション後のその後の化学発光検出を可能にした。該増幅過程は卵丘細胞あたり１５４μｇまでのＲＮＡを製造した。製造されたフラグメントは大きさが１０ｋｂまで（平均のフラグメント大きさ約５００ｂｐ）であった。
Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｕｒｖｅｒｙマイクロアレイを使用してＲＮＡ発現を分析した。本マイクロアレイは２９，０９８遺伝
子の照合のための３２，８７８プローブを有する。本マイクロアレイの化学発光検出系は、まれな転写物の検出および発現レベルのわずかな変動の信頼できる同定を見込む大きなダイナミックレンジを提供する。本マイクロアレイおよび本特定のマイクロアレイについての情報は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからｗｗｗ２．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍで入手可能である。発現分析はＰａｎｔｈｅｒソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州）およびＳｐｏｔｆｉｒｅを使用して実施した。
ヒト卵丘細胞は８，０００を超えるマーカーを発現することが見出された。これらのうち３，３５０マーカーが一貫して発現されているようであり、そして評価した全サンプルで検出された。染色体が正常な卵丘細胞の染色体が異常な卵丘細胞との比較は発現レベルの有意の差違を表す７５２マーカーを示した（１２５マーカー ｐ＜０．０１；６２７マーカー ｐ＜０．０５）。
染色体が正常な卵丘細胞と染色体が異常な卵丘細胞の間で発現の統計学的に有意の差違を表すマーカーのうち、発現の最大相違倍数を伴うものを図２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄに列挙する。
本明細書で引用される各およびすべての特許、特許出願および刊行物の開示はここにそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる。
本発明は特定の態様に関して開示された一方、本発明の他の態様および変形が本発明の技術思想および範囲から離れることなく当業者により考案されうることが明らかである。付随する請求の範囲は全部のこうした態様および同等の変形を包含すると解釈されることを意図している。

Claims (50)

  1. （ｉ）配列番号１−９２により例示される核酸の群から選択される最低１核酸のマーカー発現のレベルをサンプル中で測定すること、および
    （ｉｉ）該サンプル中のマーカー発現のレベルを対照若しくは参照標準と比較することであって、サンプルと対照の間の示差的マーカー発現を検出することが着床についての卵母細胞の受容能を示す、
    を含んでなる、着床についての哺乳動物卵母細胞の受容能の評価方法。
  2. サンプルが卵母細胞由来である、請求項１に記載の方法。
  3. 対照若しくは参照標準が、着床の能力のある卵母細胞、染色体が正常な卵母細胞、着床の能力のない卵母細胞、および染色体が異常な卵母細胞よりなる群の１種由来である、請求項２に記載の方法。
  4. サンプルが卵胞液由来である、請求項１に記載の方法。
  5. 対照若しくは参照標準が、着床の能力のある卵母細胞と関連する卵胞液、染色体が正常な卵母細胞と関連する卵胞液、着床の能力のない卵母細胞と関連する卵胞液、および染色体が異常な卵母細胞と関連する卵胞液よりなる群の１種由来である、請求項４に記載の方法。
  6. サンプルが培地由来である、請求項１に記載の方法。
  7. 対照若しくは参照標準が、着床の能力のある卵母細胞と関連する培地、染色体が正常な卵母細胞と関連する培地、着床の能力のない卵母細胞と関連する培地、および染色体が異常な卵母細胞と関連する培地よりなる群の１種由来である、請求項６に記載の方法。
  8. サンプルで測定されるマーカー発現のレベルが、対照若しくは参照標準で測定されるマーカー発現のレベルと最低２０％異なる、請求項１に記載の方法。
  9. マーカー発現のレベルが、核酸マイクロアレイ、ノーザンブロットおよび逆転写ＰＣＲよりなる群の最低１種により検出される、請求項１に記載の方法。
  10. マーカー発現のレベルが、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着検定法、タンパク質マイクロアレイおよびＦＡＣＳ分析よりなる群の最低１種により検出される、請求項１に記載の方法。
  11. 哺乳動物卵母細胞が家畜化された哺乳動物のものである、請求項１に記載の方法。
  12. 哺乳動物卵母細胞がヒトのものである、請求項１に記載の方法。
  13. （ｉ）配列番号１８３−２８２により例示される核酸の群から選択される最低１核酸のマーカー発現のレベルをサンプル中で測定すること、および
    （ｉｉ）該サンプル中のマーカー発現のレベルを対照若しくは参照標準と比較することであって、サンプルと対照の間の示差的マーカー発現を検出することが着床についての卵母細胞の能力を示す、
    を含んでなる、着床についての哺乳動物卵母細胞の能力の評価方法。
  14. サンプルが卵丘細胞由来である、請求項１３に記載の方法。
  15. 対照若しくは参照標準が、着床の能力のある卵母細胞と関連する卵丘細胞、染色体が正常な卵母細胞と関連する卵丘細胞、着床の能力のない卵母細胞と関連する卵丘細胞、および染色体が異常な卵母細胞と関連する卵丘細胞よりなる群の１種由来である、請求項１４に記載の方法。
  16. サンプルが卵胞液由来である、請求項１３に記載の方法。
  17. 対照若しくは参照標準が、着床の能力のある卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液、染色体が正常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液、着床の能力のない卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液、および染色体が異常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液よりなる群の１種由来である、請求項１６に記載の方法。
  18. サンプルが培地由来である、請求項１３に記載の方法。
  19. 対照若しくは参照標準が、着床の能力のある卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する培地、染色体が正常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する培地、着床の能力のない卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する培地、および染色体が異常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する培地よりなる群の１種由来である、請求項１８に記載の方法。
  20. サンプルで測定されるマーカー発現のレベルが、対照若しくは参照標準で測定されるマーカー発現のレベルと最低２０％異なる、請求項１３に記載の方法。
  21. マーカー発現のレベルが、核酸マイクロアレイ、ノーザンブロットおよび逆転写ＰＣＲよりなる群の最低１種により検出される、請求項１３に記載の方法。
  22. マーカー発現のレベルが、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着検定法、タンパク質マイクロアレイおよびＦＡＣＳ分析よりなる群の最低１種により検出される、請求項１３に記載の方法。
  23. 哺乳動物卵母細胞が家畜化された哺乳動物のものである、請求項１３に記載の方法。
  24. 哺乳動物卵母細胞がヒトのものである、請求項１３に記載の方法。
  25. （ｉ）配列番号１−９２により例示される核酸の群から選択される最低１核酸のマーカー発現のレベルをサンプル中で測定すること、および
    （ｉｉ）該サンプル中のマーカー発現のレベルを対照若しくは参照標準と比較することであって、サンプルと対照の間の示差的マーカー発現を検出することが着床についての卵母細胞の能力を示す、
    を含んでなる、受精についての哺乳動物卵母細胞の能力の評価方法。
  26. サンプルが卵母細胞由来である、請求項２５に記載の方法。
  27. 対照若しくは参照標準が、受精の能力のある卵母細胞、染色体が正常な卵母細胞、受精の能力のない卵母細胞および染色体が異常な卵母細胞よりなる群の１種由来である、請求項２６に記載の方法。
  28. サンプルが卵胞液由来である、請求項２５に記載の方法。
  29. 対照若しくは参照標準が、受精の能力のある卵母細胞と関連する卵胞液、染色体が正常
    な卵母細胞と関連する卵胞液、受精の能力のない卵母細胞と関連する卵胞液、および染色体が異常な卵母細胞と関連する卵胞液よりなる群の１種由来である、請求項２８に記載の方法。
  30. サンプルが培地由来である、請求項２５に記載の方法。
  31. 対照若しくは参照標準が、受精の能力のある卵母細胞と関連する培地、染色体が正常な卵母細胞と関連する培地、受精の能力のない卵母細胞と関連する培地、および染色体が異常な卵母細胞と関連する培地よりなる群の１種由来である、請求項３０に記載の方法。
  32. サンプルで測定されるマーカー発現のレベルが、対照若しくは参照標準で測定されるマーカー発現のレベルと最低２０％異なる、請求項２５に記載の方法。
  33. マーカー発現のレベルが、核酸マイクロアレイ、ノーザンブロットおよび逆転写ＰＣＲよりなる群の最低１種により検出される、請求項２５に記載の方法。
  34. マーカー発現のレベルが、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着検定法、タンパク質マイクロアレイおよびＦＡＣＳ分析よりなる群の最低１種により検出される、請求項２５に記載の方法。
  35. 哺乳動物卵母細胞が家畜化された哺乳動物のものである、請求項２５に記載の方法。
  36. 哺乳動物卵母細胞がヒトのものである、請求項２５に記載の方法。
  37. （ｉ）配列番号１８３−２８２により例示される核酸の群から選択される最低１核酸のマーカー発現のレベルをサンプル中で測定すること、および
    （ｉｉ）該サンプル中のマーカー発現のレベルを対照若しくは参照標準と比較することであって、サンプルと対照の間の示差的マーカー発現を検出することが受精についての卵母細胞の能力を示す、
    を含んでなる、受精についての哺乳動物卵母細胞の能力の評価方法。
  38. サンプルが卵丘細胞由来である、請求項３７に記載の方法。
  39. 対照若しくは参照標準が、受精の能力のある卵母細胞と関連する卵丘細胞、染色体が正常な卵母細胞と関連する卵丘細胞、受精の能力のない卵母細胞と関連する卵丘細胞、および染色体が異常な卵母細胞と関連する卵丘細胞よりなる群の１種由来である、請求項３８に記載の方法。
  40. サンプルが卵胞液由来である、請求項３７に記載の方法。
  41. 対照若しくは参照標準が、受精の能力のある卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液、染色体が正常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液、受精の能力のない卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液、および染色体が異常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する卵胞液よりなる群の１種由来である、請求項４０に記載の方法。
  42. サンプルが培地由来である、請求項３７に記載の方法。
  43. 対照若しくは参照標準が、受精の能力のある卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する培地、染色体が正常な卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する培地、受精の能力のない卵母細胞と関連する卵丘細胞と関連する培地、および染色体が異常な卵母細胞と関連する卵丘
    細胞と関連する培地よりなる群の１種由来である、請求項４２に記載の方法。
  44. サンプルで測定されるマーカー発現のレベルが、対照若しくは参照標準で測定されるマーカー発現のレベルと最低２０％異なる、請求項３７に記載の方法。
  45. マーカー発現のレベルが、核酸マイクロアレイ、ノーザンブロットおよび逆転写ＰＣＲよりなる群の最低１種により検出される、請求項３７に記載の方法。
  46. マーカー発現のレベルが、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着検定法、タンパク質マイクロアレイおよびＦＡＣＳ分析よりなる群の最低１種により検出される、請求項３７に記載の方法。
  47. 哺乳動物卵母細胞が家畜化された哺乳動物のものである、請求項３７に記載の方法。
  48. 哺乳動物卵母細胞がヒトのものである、請求項３７に記載の方法。
  49. 固体支持体に固定された核酸プローブのアレイであって、該アレイが
    複数のプローブを含んでなるプローブ組であって、各プローブが一組の参照配列の下位配列に正確に相補的な最低２０ヌクレオチドのセグメントを含んでなり、参照配列の該組が配列番号１−９２を含んでなる、
    を含んでなる、上記アレイ。
  50. 固体支持体に固定された核酸プローブのアレイであって、該アレイが
    複数のプローブを含んでなるプローブ組であって、各プローブが一組の参照配列の下位配列に正確に相補的な最低２０ヌクレオチドのセグメントを含んでなり、参照配列の該組が配列番号１８３−２８２を含んでなる、
    を含んでなる、上記アレイ。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019244853A1 (ja) 2018-06-18 2019-12-26 株式会社 島津製作所 細胞のゲノム異常の評価方法

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2625259T3 (es) 2006-08-29 2017-07-19 Oxford Biotherapeutics Ltd Identificación de proteína asociada con carcinoma hepatocelular, glioblastoma y cáncer de pulmón
KR20100000336A (ko) * 2008-06-24 2010-01-06 삼성전자주식회사 컨텐츠 감상 경험을 기록/재생하는 멀티미디어 콘텐츠 처리방법 및 장치
US8420084B2 (en) 2009-03-05 2013-04-16 Medarex, Inc. Fully human antibodies specific to CADM1
WO2011000805A1 (en) * 2009-06-29 2011-01-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Biomarkers of oocyte competency and method of use
WO2011060080A2 (en) * 2009-11-10 2011-05-19 Gema Diagnostics, Inc. Genes differentially expressed by cumulus cells and assays using same to identify pregnancy competent oocytes
WO2013056258A1 (en) * 2011-10-14 2013-04-18 Gema Diagnostics, Inc. Genes differentially expressed by cumulus cells and assays using same to identify pregnancy competent oocytes
WO2013056252A1 (en) * 2011-10-14 2013-04-18 Gema Diagnostics, Inc. Assessment of oocyte competence by detecting spsb2 and/or tp53i3 gene expression
US20140371097A1 (en) * 2011-12-21 2014-12-18 The Regents Of The University Of California Non-invasive methods for assessing oocyte quality for in vitro fertilization
EP2802872A4 (en) 2012-01-13 2015-09-09 Univ Leland Stanford Junior MECHANICAL BIOMARKERS FOR THE VITABILITY OF OOCYTES AND EMBRYOS
US10127664B2 (en) 2016-11-21 2018-11-13 International Business Machines Corporation Ovarian image processing for diagnosis of a subject
US10249040B2 (en) 2016-11-21 2019-04-02 International Business Machines Corporation Digital data processing for diagnosis of a subject
US10398385B2 (en) 2016-11-21 2019-09-03 International Business Machines Corporation Brain wave processing for diagnosis of a subject
US10123747B2 (en) 2016-11-21 2018-11-13 International Business Machines Corporation Retinal scan processing for diagnosis of a subject
CN108676801B (zh) * 2018-04-28 2023-06-13 中山大学 一种斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的cDNA及其应用

Family Cites Families (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1359801A (en) 1920-03-03 1920-11-23 Goldner Joe Combination mattress and pillow
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4437975A (en) 1977-07-20 1984-03-20 Mobil Oil Corporation Manufacture of lube base stock oil
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US5242794A (en) 1984-12-13 1993-09-07 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US5333675C1 (en) 1986-02-25 2001-05-01 Perkin Elmer Corp Apparatus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
IL86724A (en) 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
WO1989001050A1 (en) 1987-07-31 1989-02-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Selective amplification of target polynucleotide sequences
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
JP2650159B2 (ja) 1988-02-24 1997-09-03 アクゾ・ノベル・エヌ・ベー 核酸増幅方法
US4988617A (en) 1988-03-25 1991-01-29 California Institute Of Technology Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids
BR8907830A (pt) 1988-12-16 1991-10-22 Siska Diagnostics Inc Processo para preparar uma dna de filamento duplo que codifica uma sequencia que corresponde a uma sequencia objetivada de acido nucleico e processo util para deteccao de pelo menos uma sequencia de acido nucleico objetivada especifica
US5856092A (en) 1989-02-13 1999-01-05 Geneco Pty Ltd Detection of a nucleic acid sequence or a change therein
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5547839A (en) 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
US5871928A (en) 1989-06-07 1999-02-16 Fodor; Stephen P. A. Methods for nucleic acid analysis
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5494810A (en) 1990-05-03 1996-02-27 Cornell Research Foundation, Inc. Thermostable ligase-mediated DNA amplifications system for the detection of genetic disease
JPH06500471A (ja) 1990-08-24 1994-01-20 ザ・ユニバーシティ・オブ・テネシー・リサーチ・コーポレーション Ｄｎａ増幅フィンガープリント法
WO1992007095A1 (en) 1990-10-15 1992-04-30 Stratagene Arbitrarily primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes
US6582908B2 (en) * 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
JP2001524926A (ja) 1991-09-18 2001-12-04 アフィマックス テクノロジーズ ナームロゼ フェンノートシャップ オリゴマーの雑多ライブラリーの集合体を合成する方法
DE69233331T3 (de) 1991-11-22 2007-08-30 Affymetrix, Inc., Santa Clara Kombinatorische Strategien zur Polymersynthese
US5324633A (en) 1991-11-22 1994-06-28 Affymax Technologies N.V. Method and apparatus for measuring binding affinity
US5384261A (en) 1991-11-22 1995-01-24 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis using mechanically directed flow paths
US5837832A (en) 1993-06-25 1998-11-17 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
US6027880A (en) 1995-08-02 2000-02-22 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes and methods of using the same for detecting cystic fibrosis
US5861242A (en) 1993-06-25 1999-01-19 Affymetrix, Inc. Array of nucleic acid probes on biological chips for diagnosis of HIV and methods of using the same
US6156501A (en) 1993-10-26 2000-12-05 Affymetrix, Inc. Arrays of modified nucleic acid probes and methods of use
US6045996A (en) 1993-10-26 2000-04-04 Affymetrix, Inc. Hybridization assays on oligonucleotide arrays
US5631734A (en) 1994-02-10 1997-05-20 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for detection of fluorescently labeled materials
US5578832A (en) 1994-09-02 1996-11-26 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for imaging a sample on a device
US6090555A (en) 1997-12-11 2000-07-18 Affymetrix, Inc. Scanned image alignment systems and methods
US5571639A (en) 1994-05-24 1996-11-05 Affymax Technologies N.V. Computer-aided engineering system for design of sequence arrays and lithographic masks
US5795716A (en) 1994-10-21 1998-08-18 Chee; Mark S. Computer-aided visualization and analysis system for sequence evaluation
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
US5856174A (en) 1995-06-29 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Integrated nucleic acid diagnostic device
US5733729A (en) 1995-09-14 1998-03-31 Affymetrix, Inc. Computer-aided probability base calling for arrays of nucleic acid probes on chips
AU2320597A (en) * 1996-03-19 1997-10-10 Molecular Tool, Inc. Method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide
US6114122A (en) 1996-03-26 2000-09-05 Affymetrix, Inc. Fluidics station with a mounting system and method of using
US5981956A (en) 1996-05-16 1999-11-09 Affymetrix, Inc. Systems and methods for detection of labeled materials
DE19638745C2 (de) 1996-09-11 2001-05-10 Schering Ag Monoklonale Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne des menschlichen VEGF - Rezeptorproteins (KDR)
US6420108B2 (en) 1998-02-09 2002-07-16 Affymetrix, Inc. Computer-aided display for comparative gene expression
WO1999005323A1 (en) 1997-07-25 1999-02-04 Affymetrix, Inc. Gene expression and evaluation system
JP2001514907A (ja) 1997-08-15 2001-09-18 アフィメトリックス・インコーポレーテッド クラスタ解析を利用した多形検出
US6201639B1 (en) 1998-03-20 2001-03-13 James W. Overbeck Wide field of view and high speed scanning microscopy
US6185030B1 (en) 1998-03-20 2001-02-06 James W. Overbeck Wide field of view and high speed scanning microscopy
US5936324A (en) 1998-03-30 1999-08-10 Genetic Microsystems Inc. Moving magnet scanner
US6185561B1 (en) 1998-09-17 2001-02-06 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for providing and expression data mining database
EP1124990B1 (en) 1998-10-27 2006-01-18 Affymetrix, Inc. Complexity management and analysis of genomic dna
AU1326200A (en) * 1998-10-28 2000-05-15 Baylor College Of Medicine Ovary-specific genes and proteins
US6586802B2 (en) 1999-01-14 2003-07-01 Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha Semiconductor device
US6218803B1 (en) 1999-06-04 2001-04-17 Genetic Microsystems, Inc. Position sensing with variable capacitance transducers
US6287778B1 (en) 1999-10-19 2001-09-11 Affymetrix, Inc. Allele detection using primer extension with sequence-coded identity tags
US6958225B2 (en) 1999-10-27 2005-10-25 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
JP3464460B2 (ja) 2000-02-24 2003-11-10 ジー・ケー・エヌ・レブロ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ドライブシャフト
US6386749B1 (en) 2000-06-26 2002-05-14 Affymetrix, Inc. Systems and methods for heating and mixing fluids
US6391592B1 (en) 2000-12-14 2002-05-21 Affymetrix, Inc. Blocker-aided target amplification of nucleic acids
US20020183936A1 (en) 2001-01-24 2002-12-05 Affymetrix, Inc. Method, system, and computer software for providing a genomic web portal
US6632611B2 (en) 2001-07-20 2003-10-14 Affymetrix, Inc. Method of target enrichment and amplification
US20030124539A1 (en) 2001-12-21 2003-07-03 Affymetrix, Inc. A Corporation Organized Under The Laws Of The State Of Delaware High throughput resequencing and variation detection using high density microarrays
US20060024693A1 (en) * 2004-03-29 2006-02-02 Michigan State University Identification of genes or polypeptides the expression of which correlates to fertility, ovarian function and/or fetal/newborn viability

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6008018340; Ｎａｔｕｒｅ，　１９９９，　Ｖｏｌ．４０２，　ｐ．７１５-７２０ *
JPN6008018341; Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，　１９９７，　Ｖｏｌ．１８，　ｐ．５３３-５３７ *
JPN6008018470; Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　１９９９，　Ｖｏｌ．１９，　Ｎｏ．３，　ｐ．１７２０-１７３０ *
JPN6012066982; Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　"Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｕｒｖｅｙ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　Ｖ２．０"，　［ｏｎｌｉｎｅ］．　［ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ　ｏｎ　２０１２-１２-１４］．　Ｒｅｔｒ *
JPN6012066985; Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，　２００１，　Ｖｏｌ．６４，　ｐｐ．１８１２-１８２０ *
JPN6012066987; Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，　１９９８，　Ｖｏｌ．１３，　ｐｐ．１１７-１３２ *
JPN6012066990; Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，　１００４，　Ｖｏｌ．１９，　ｐｐ．２８６９-２８７４ *
JPN6012066994; Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　２００４，　Ｖｏｌ．２７２，　ｐｐ．４８３-４９６ *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019244853A1 (ja) 2018-06-18 2019-12-26 株式会社 島津製作所 細胞のゲノム異常の評価方法

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