CN110343746B - 一种校正egfr基因突变频率的定值方法 - Google Patents

一种校正egfr基因突变频率的定值方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110343746B
CN110343746B CN201910616310.9A CN201910616310A CN110343746B CN 110343746 B CN110343746 B CN 110343746B CN 201910616310 A CN201910616310 A CN 201910616310A CN 110343746 B CN110343746 B CN 110343746B
Authority
CN
China
Prior art keywords
egfr
seq
gene
detecting
mutation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910616310.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110343746A (zh
Inventor
李达
王会如
王军
杨忠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BEIJING INSTITUTE OF MEDICAL DEVICE TESTING
Original Assignee
BEIJING INSTITUTE OF MEDICAL DEVICE TESTING
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEIJING INSTITUTE OF MEDICAL DEVICE TESTING filed Critical BEIJING INSTITUTE OF MEDICAL DEVICE TESTING
Priority to CN201910616310.9A priority Critical patent/CN110343746B/zh
Publication of CN110343746A publication Critical patent/CN110343746A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110343746B publication Critical patent/CN110343746B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Abstract

本发明公开了一种校正EGFR基因突变频率的定值方法，具体涉及EGFR基因4个突变位点的数字PCR探针体系，通过实验优化，达到了正确分型和良好的线性表现，通过参照质控品，成功的对基因频率的定值进行有效的评估并计算得到校正系数，实现对定值实验体系的校正。

Description

一种校正EGFR基因突变频率的定值方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及到一种校正EGFR基因突变频率的定值方法。
背景技术
EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体，属受体酪氨酸激酶家族。EGFR突变或过表达一般会引发肿瘤。EGFR的过表达和肿瘤细胞的转移、侵润、预后差有关。在非小细胞肺腺癌(Non-small cell lungadenocarcinoma,NSCLC)里，EGFR基因的突变频率非常高，是非小细胞肺癌的热点突变基因，尤其是亚裔非吸烟的女性患者。针对EGFR基因的突变位点和相对应的靶向药物也研究的比较清楚。EGFR基因的常见突变位点发生在18、19、20和21号外显子上，其中19号外显子和21号外显子的突变最常见，占整个突变的90％左右，19号外显子的非移码缺失突变约占45％，21号外显子的L858R点突变占40-45％，这两种突变被称为常见突变。以EGFR基因为代表性靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine-kinase inhibitor,TKI)是近年来NSCLC靶向治疗研究的热点之一，多项研究证实，EGFR基因突变是EGFR-TKI治疗疗效的决定性因素。研究还表明，TKI的疗效不仅与是否有EGFR基因突变相关，还与基因突变的量有密切关系。此外，EGFR基因外显子20的T790M体细胞突变是EGFR-TKI继发耐药的主要机制之一，突变使得非小细胞肺癌患者对吉非替尼和厄罗替尼出现继发耐药。因此，选择合适的检测方法筛选出靶向治疗受益人群具有重要的临床意义，尤其在肺癌患者中检测EGFR基因突变对靶向药物的筛选具有非常重要的指导意义。
目前，检测EGFR基因突变的方法主要有基于测序技术的Sanger测序法和高通量测序法(Next Generation Sequencing，NGS)，基于PCR技术的ARMS-PCR(amplification-refractory mutation system，ARMS)、突变富集PCR和COLD-PCR。而这些方法在其特异性和灵敏度方面有很大差异。如Sanger测序在应用于测定等位基因突变时所能测定的灵敏度20％左右；而高通量测序方法的灵敏度则在2-6％左右。临床实验室常用ARMS-PCR法来检测血浆游离肿瘤DNA T790M的突变，其具有操作方便、费时少等优势，然而其灵敏度仍有待提高，在1％左右。例如当血液样本中EGFR耐药位点T790M突变的丰度比较低时，会造成了一定的假阴性，使得一部分患者EGFR基因耐药突变被漏检。
数字PCR是近年来一种新兴的液态活检方法，与ARMS-PCR相比理论上具有更高的精度、重复性和敏感性，且可绝对定量，灵敏度可以达到0.01％，开始逐渐替代ARMS-PCR。数字PCR方法在无创肿瘤循环DNA检测中占有重要地位，发挥了仪器检测灵敏度和分型准确的优势。然而，由于不同方法的分析灵敏度不同，会导致检测结果的不一致和不可比，且不同企业产品和实验体系在核酸定值结果上存在较大不同，主要原因可能是探针结合效率、探针荧光信号稳定性、引物与探针相互干扰等因素造成。突变频率定值在体外诊断产品中具有重要意义，作为核酸定值的公认方法，如何做到正确地评价实验体系的优劣，目前没有合适的方法体系。急需具有准确突变比例的EGFR定量标准品或定值方法等标准化方法来检验各种分析方法的灵敏度和特异性，以及各种方法之间的可比性。
发明内容
数字PCR仪作为核酸计量的参考方法，在基因突变频率的定值上发挥着重要用途。然而，不同的数字PCR仪和试剂在检测EGFR基因突变频率时存在显著的差异，本发明设计了一种实验计算方法，可以正确地评价仪器和试剂并计算突变频率。在本发明中，校正EGFR基因突变频率的定值方法不涉及疾病的诊断，可判断数字PCR实验体系的准确性，因此本发明的方法属于非诊断方法。
本发明的目的是提供一种EGFR基因突变频率的定值实验体系，该体系依托于数字PCR进行检测，充分发挥了数字PCR检测灵敏度和分型准确的优势。所述定值实验体系区别于以往的EGFR基因突变检测，具有量值的可靠性。该实验体系设计了一套探针和引物组合，并引入了不同位点之间的校正系数，使得不同探针在核酸定量中得到较好的一致性。
具体的，本发明涉及一种校正EGFR基因突变频率的定值方法，包括以下步骤：1)分别制备检测EGFR基因突变型和野生型的引物和探针，以及检测参照基因的引物和探针；3)使用上述引物和探针进行数字PCR，获得EGFR基因突变型、EGFR基因野生型以及参照基因的拷贝数；4)计算定量拷贝数校正系数n，使用所述校正系数n对突变频率进行校正。
具体的，所述检测EGFR基因突变型引物探针，选自检测EGFR突变位点G719S、Ex19del、T790M和L858R的引物和探针中的一种或多种。
所述检测EGFR突变位点G719S、Ex19del、T790M和L858R的引物具体序列可以是：
EGFR-G719S F CTTACACCCAGTGGAGAAGC SEQ ID No.1
EGFR-G719S R TGCCAGGGACCTTACCTTAT SEQ ID No.2
EGFR-Ex19del F TCTGTCATAGGGACTCTGGAT SEQ ID No.3
EGFR-Ex19del R AGCAAAGCAGAAACTCACATC SEQ ID No.4
EGFR-T790M F CATCTGCCTCACCTCCACC SEQ ID No.5
EGFR-T790M R AGCAGGTACTGGGAGCCAAT SEQ ID No.6
EGFR-L858R F AGCCAGGAACGTACTGGTGA SEQ ID No.7
EGFR-L858R R TGCCTCCTTCTGCATGGTAT SEQ ID No.8。
所述检测EGFR突变位点G719S、Ex19del、T790M和L858R的野生型和突变型探针分别使用不同的荧光标记，例如野生型探针均使用VIC，突变型探针使用FAM。
具体的，所述检测EGFR突变位点的野生型和突变型探针可以是：
EGFR-G719S WT VIC-ATCAAAGTGCTGGGCTC-MGB-NFQ SEQ ID No.13
EGFR-G719S MU FAM-ATCAAAGTGCTGAGCTC-MGB-NFQ SEQ ID No.14
EGFR-Ex19del WT VIC-TCAAGGAATTAAGAGAAGC-MGB-NFQ SEQ ID No.15
EGFR-Ex19del MU FAM-TCGCTATCAAGACATCT-MGB-NFQ SEQ ID No.16
EGFR-T790M WT VIC-ATGAGCTGCGTGATGAG-MGB-NFQ SEQ ID No.17
EGFR-T790M MU FAM-ATGAGCTGCATGATGAG-MGB-NFQ SEQ ID No.18
EGFR-L858R WT VIC-AGTTTGGCCAGCCCAA-MGB-NFQ SEQ ID No.19
EGFR-L858R MU FAM-AGTTTGGCCCGCCCAA-MGB-NFQ SEQ ID No.20。
具体的，所述检测参照基因为DCK和/或EIF5B中的一种或两种，例如所述检测DCK和/或EIF5B的引物可以是：
DCK-Ex3F ATGCCTGTCTCAGTCGAATAAG SEQ ID No.9
DCK-Ex3R GCCACGTACAAGCCATTTATAC SEQ ID No.10
EIF5B-Ex1F GCTGAGCGGAGACCAAAGT SEQ ID No.11
EIF5B-Ex1R TCTACCTGTCTTCGCTCTTGTT SEQ ID No.12。
所述检测DCK和/或EIF5B的探针可以是：
DCK-Ex3FAM-CTCAGCTTGCCTCTC-MGBNFQ SEQ ID No.21
EIF5B-Ex1FAM-CGGGAGACAGTGGGT-MGB-NFQ SEQ ID No.22。
进一步的，所述定量拷贝数校正系数n通过如公式(1)计算获得，其中CP参照为参照基因的拷贝数，如使用2个以上的参照基因，则使用平均数。分别获得野生型和突变型探针的拷贝数校正系数nMU和nWT。
进一步的，使用所述校正系数n对突变频率进行校正，即所述突变频率AF通过如公式(2)计算获得，其中CPMU为突变型探针拷贝数，CPWT为野生型型探针拷贝数。
另一方面，本发明还涉及一种EGFR基因突变频率的定值引物组，所述定值引物组包括检测EGFR基因突变型和野生型的引物对，以及检测参照基因的引物对。
具体的，所述检测EGFR基因突变型引物对选自检测EGFR突变位点G719S、Ex19del、T790M和L858R的引物对的一种或多种。
具体的，所述检测EGFR突变位点G719S、Ex19del、T790M和L858R的引物对分别为：
EGFR-G719S F CTTACACCCAGTGGAGAAGC SEQ ID No.1
EGFR-G719S R TGCCAGGGACCTTACCTTAT SEQ ID No.2
EGFR-Ex19del F TCTGTCATAGGGACTCTGGAT SEQ ID No.3
EGFR-Ex19del R AGCAAAGCAGAAACTCACATC SEQ ID No.4
EGFR-T790M F CATCTGCCTCACCTCCACC SEQ ID No.5
EGFR-T790M R AGCAGGTACTGGGAGCCAAT SEQ ID No.6
EGFR-L858R F AGCCAGGAACGTACTGGTGA SEQ ID No.7
EGFR-L858R R TGCCTCCTTCTGCATGGTAT SEQ ID No.8。
具体的，所述检测参照基因的引物对选自能够扩增DCK和/或EIF5B的引物对。进一步的，所述检测DCK和/或EIF5B的引物分别为：
DCK-Ex3F ATGCCTGTCTCAGTCGAATAAG SEQ ID No.9
DCK-Ex3R GCCACGTACAAGCCATTTATAC SEQ ID No.10
EIF5B-Ex1F GCTGAGCGGAGACCAAAGT SEQ ID No.11
EIF5B-Ex1R TCTACCTGTCTTCGCTCTTGTT SEQ ID No.12。
另一方面，本发明还涉及一种EGFR基因突变频率的定值探针组，所述定值探针组包括检测EGFR基因突变型和野生型的探针，以及检测参照基因的探针。
具体的，所述检测EGFR基因突变型探针选自检测EGFR突变位点G719S、Ex19del、T790M和L858R的探针的一种或多种。进一步的，所述检测EGFR突变位点G719S、Ex19del、T790M和L858R的野生型和突变型探针分别使用不同的荧光标记，例如野生型探针均使用VIC，突变型探针使用FAM。
具体的，所述检测EGFR突变位点G719S、Ex19del、T790M和L858R的野生型和突变型探针分别为：
EGFR-G719S WT VIC-ATCAAAGTGCTGGGCTC-MGB-NFQ SEQ ID No.13
EGFR-G719S MU FAM-ATCAAAGTGCTGAGCTC-MGB-NFQ SEQ ID No.14
EGFR-Ex19del WT VIC-TCAAGGAATTAAGAGAAGC-MGB-NFQ SEQ ID No.15
EGFR-Ex19del MU FAM-TCGCTATCAAGACATCT-MGB-NFQ SEQ ID No.16
EGFR-T790M WT VIC-ATGAGCTGCGTGATGAG-MGB-NFQ SEQ ID No.17
EGFR-T790M MU FAM-ATGAGCTGCATGATGAG-MGB-NFQ SEQ ID No.18
EGFR-L858R WT VIC-AGTTTGGCCAGCCCAA-MGB-NFQ SEQ ID No.19
EGFR-L858R MU FAM-AGTTTGGCCCGCCCAA-MGB-NFQ SEQ ID No.20。
具体的，所述检测参照基因的探针选自能够检测DCK和/或EIF5B的探针。进一步的，所述检测DCK和/或EIF5B的探针分别为：
DCK-Ex3FAM-CTCAGCTTGCCTCTC-MGBNFQ SEQ ID No.21
EIF5B-Ex1FAM-CGGGAGACAGTGGGT-MGB-NFQ SEQ ID No.22。
另一方面，本发明还涉及一种EGFR基因突变频率的定值引物和探针组，所述定值引物和探针组包括前述任意的检测EGFR基因突变型和野生型的引物对和探针，以及前述任意的检测参照基因的引物对和探针。
此外，本发明还涉及校正EGFR基因突变频率的试剂盒，所述试剂盒包括：1)前述任意的检测EGFR基因突变型和野生型的引物和探针，以及前述任意的检测参照基因的引物和探针。
本发明还涉及所述定值引物组、定值探针组或定值引物和探针组在制备校正EGFR基因突变频率的试剂盒的应用。
本发明还涉及一种参照基因的引物对和探针组在制备校正EGFR基因突变频率的试剂盒的应用，所述参照基因选自DCK和/或EIF5B中的至少一种。
具体的，所述检测参照基因的引物对选自能够扩增DCK和/或EIF5B的引物对。进一步的，所述检测DCK和/或EIF5B的引物分别为：
DCK-Ex3F ATGCCTGTCTCAGTCGAATAAG SEQ ID No.9
DCK-Ex3R GCCACGTACAAGCCATTTATAC SEQ ID No.10
EIF5B-Ex1F GCTGAGCGGAGACCAAAGT SEQ ID No.11
EIF5B-Ex1R TCTACCTGTCTTCGCTCTTGTT SEQ ID No.12。
具体的，所述检测参照基因的探针选自能够检测DCK和/或EIF5B的探针。进一步的，所述检测DCK和/或EIF5B的探针分别为：
DCK-Ex3 FAM-CTCAGCTTGCCTCTC-MGBNFQ SEQ ID No.21
EIF5B-Ex1 FAM-CGGGAGACAGTGGGT-MGB-NFQ SEQ ID No.22。
本发明的技术效果及优点如下：
1.设计合成的探针能够很好的分型EGFR基因4个位点的野生型和突变型，并计算不同的突变频率；
2.通过实验设计，引入校正系数，有效的优化了不同探针之间对突变频率定值的纠正，实现正确地评价实验体系的优劣。
3.通过梯度突变频率定值实验发现，随着拷贝数的增加，突变频率定值的变异系数(CV)降低，而在1000拷贝数时，不同探针定值一致性最高，过高或过低都会增加探针对定值的误差，明确了该套探针定量体系最佳使用范围。
附图说明
图1.伯乐数字PCR生成的微滴
图2.合成的野生型和突变型质粒
图3.质粒PCR扩增片段
图4.探针特异性验证
图5.探针分型验证
图6.探针梯度定量
图7.探针定量曲线
图8.四种探针定量重复性
图9.四种探针突变频率定值结果
具体实施方式
本发明设计了EGFR基因4个突变位点的数字PCR探针体系，通过实验优化，达到了正确分型和较好的线性表现，通过参照质控品，成功的对基因频率的定值进行有效的评估并计算得到校正系数，实现对定值实验体系的校正。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1质粒合成、引物探针设计以及数字PCR体系
人工合成两种质粒，分别含有EGFR基因第18、19、20、21号外显子序列、DCK基因第3号外显子序列、EIF5B基因第1号外显子序列。其中，Fusion-EGFR-Ex-WT质粒为野生型序列，Fusion-EGFR-Ex-MU质粒含有p.G719S、E746-A750delELREA(COSM6225)、p.T790M和p.L858R突变位点。用Primer Express 3.0.1和Primer Primer5.0软件设计EGFR基因p.G719S、p.E746_A750delELREA(COMS6225)、p.T790M和p.L858R突变分型引物探针，DCK基因和EIF5B基因引物探针(见表1-2)。质粒序列和探针引物序列交付英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
实验仪器采用美国伯乐QX200型微滴数字PCR仪，试剂为ddPCR supermix forProbes(#1863010)。根据试剂要求总体系为20μL，设置三种150nM、250nM和400nM探针浓度，设置三种55℃、57℃和60℃退火温度以优化引物探针实验体系，数字PCR反应体系见表3。
片段扩增采用全式金EasyPfu DNA Ploymerase(#AP211)，引物为M13(5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’和5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)。用莱卡倒置荧光显微镜观察生成微滴的均匀性。
表1.引物序列信息
表2.探针序列信息
表3.数字PCR反应体系
实施例2材料准备和探针定性定量实验
1.仪器性能考察和实验材料的制备
将PCR结束后的微滴在显微镜下镜检，微滴直径大小在110μm左右，荧光下观察，绿色微滴为含有模板DNA的微滴，从图1中可以看到，在视野中存在较小直径的微滴。图2中为人工合成的野生型和突变型质粒，将质粒用M13引物分别扩增合成的质粒，得到两种不同长度的片段(图3)，分别为1483bp和1486bp，电泳跑胶回收，排除质粒和非特异扩增污染，得到野生型和突变型DNA片段核酸样品，野生型和突变型DNA片段中含有完全相同的DCK基因和EIF5B序列。
2.探针特异性验证
按照表3反应体系加入反应试剂，分别加入野生型和突变型DNA片段，验证探针特异性，结果显示四种分型探针均分型正确，荧光信号没有出现交叉现象(图4)。将野生型和突变型DNA片段按照1:1质量比例混合，做数字PCR，结果显示荧光信号分为明显的4个象限区域，分型正确(图5)。
3.探针线性定量和重复性
采用Qubit 4.0进行核酸定量，分别将野生型和突变型DNA片段稀释到30000拷贝、3000拷贝、1500拷贝、300拷贝和60拷贝做数字PCR，重复测定6次。可以看到微滴荧光信号数量依次降低(图6)，将定量拷贝数数值分别取log10，线性拟合发现VIC和FAM信号探针都具有较好的一致性，相关系数均大于0.99，VIC信号的探针之间存在一定的数值波动(图7)。
实施例3数字PCR验证和拷贝数校正
1.使用的仪器
BIO-RAD QX200 droplet digital PCR；超净工作台；生物安全柜；凝胶电泳仪；凝胶成像仪；核酸定量仪；10μL、100μL和1000μL移液器；
2.使用的试剂
Bio-Rad ddPCR Supermix for Probe、Droplet Generation Oil for Probes、DG8 Cartiridges、DG8Gaskets、96-well plates、Foil Seals、0.2mL、1mL Ep管。
3.环境要求
a)十万级洁净间；工作室内温度应恒定，可以控制在25℃±3℃；
4.操作步骤
按照表3中给出的实验体系配置反应溶液，依照BIO-RAD QX200数字PCR操作方法进行实验。按照设计的探针和引物，分别测试质粒Fusion-EGFR-Ex-WT和Fusion-EGFR-Ex-MU，得到拷贝数结果。
5、结果分析
野生型和突变型DNA片段中含有相同的DCK基因和EIF5B基因序列，所以，DCK和EIF5B探针在野生型和突变型DNA片段拷贝数定量结果理论上是完全一致的。从图7可以看到，G719S、Ex19del、T790M、L858R探针和DCK和EIF5B探针的定量值基本吻合，但G719S、Ex19del、T790M、L858R探针体系得到的VIC信号(野生型)和FAM信号(突变型)拷贝数之间还是存在一定的差异。
以DCK和EIF5B探针得到的平均结果作为G719S、Ex19del、T790M、L858R探针的野生型和突变型拷贝数的参照。按照公式(1)得到各探针的定量拷贝数校正系数(n)，参见表4。
其中CP参照为参照基因的拷贝数，如使用2个以上的参照基因，则使用平均数。分别获得野生型和突变型探针的拷贝数校正系数nMU和nWT。
表4.探针定量拷贝数校正系数
从图8中可以看到，4种探针测定不同拷贝数时，VIC信号和FAM信号的重复性没有明显差异，平均变异系数(CV)随着拷贝数的增加依次降低，在60拷贝数时，CV值最大，为9.8％；而在30000拷贝数时，CV值最小，仅0.23％，说明数字PCR在测定高拷贝数时具有较好的重复性。
5.突变频率校正
根据公式(2)可以计算样本的突变频率，将野生型和突变型DNA片段按照1:1质量比例混合，稀释到100000拷贝、10000拷贝、5000拷贝、1000拷贝和100拷贝，不同拷贝数的样本分别做数字PCR定值。
理论上，不同拷贝数样品得到的突变频率应完全相同，均为50％。然而，由于探针结合效率、探针荧光信号稳定性、微滴信号强弱等因素，各探针得到的突变频率会存在一定的差异，样品重复6次取平均值作为探针的定量结果。如图9所示，突变频率结果发现，突变频率最高为56.1％，最低为50.1％，平均突变频率为52.9％，各探针平均突变频率CV值为3.2％。说明校正后的EGFR基因突变频率，各探针之间具有较好的一致性。且拷贝数在1000拷贝数时，四种探针的定值结果差异最小。
基于上述，EGFR基因突变频率的定值实验体系，区别于以往的EGFR基因突变检测，具有量值的可靠性。数字PCR方法在无创肿瘤循环DNA检测中占有重要地位，发挥了仪器检测灵敏度和分型准确的优势。然而，作为核酸定值的公认方法，如何做到正确地评价实验体系的优劣，却没有合适的方法体系。本文首先设计了EGFR基因4个突变位点的数字PCR探针体系，通过实验优化，达到了正确分型和较好的线性表现，通过参照质控品，成功的对基因频率的定值进行有效的评估并计算得到校正系数，实现对定值实验体系的校正。
本发明虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本发明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围准。
序列表
<110> 北京市医疗器械检验所
<120> 一种校正EGFR基因突变频率的定值方法
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttacaccca gtggagaagc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgccagggac cttaccttat 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctgtcatag ggactctgga t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agcaaagcag aaactcacat c 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catctgcctc acctccacc 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agcaggtact gggagccaat 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agccaggaac gtactggtga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgcctccttc tgcatggtat 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgcctgtct cagtcgaata ag 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gccacgtaca agccatttat ac 22
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gctgagcgga gaccaaagt 19
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tctacctgtc ttcgctcttg tt 22
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atcaaagtgc tgggctc 17
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atcaaagtgc tgagctc 17
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcaaggaatt aagagaagc 19
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tcgctatcaa gacatct 17
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atgagctgcg tgatgag 17
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atgagctgca tgatgag 17
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agtttggcca gcccaa 16
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agtttggccc gcccaa 16
<210> 21
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ctcagcttgc ctctc 15
<210> 22
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cgggagacag tgggt 15

Claims (5)

1.一种校正EGFR基因突变频率的定值方法，其特征在于，包括以下步骤：1)分别制备检测EGFR基因突变型和野生型的引物和探针，以及检测参照基因的引物和探针；3)使用上述引物和探针进行数字PCR，获得EGFR基因突变型、EGFR基因野生型以及参照基因的拷贝数；4)计算定量拷贝数校正系数n，使用所述校正系数n对突变频率进行校正；
所述检测EGFR基因突变型的引物和探针，选自检测EGFR突变位点G719S、Ex19del、T790M和L858R的引物和探针中的一种或多种；
所述检测参照基因为DCK和/或EIF5B中的一种或两种；
被检测的EGFR基因突变型和野生型DNA片段被稀释到1000拷贝；
所述检测EGFR突变位点G719S、Ex19del、T790M和L858R的引物分别为：
EGFR-G719S F CTTACACCCAGTGGAGAAGC SEQ ID No.1
EGFR-G719S R TGCCAGGGACCTTACCTTAT SEQ ID No.2
EGFR-Ex19del F TCTGTCATAGGGACTCTGGAT SEQ IDNo.3
EGFR-Ex19del R AGCAAAGCAGAAACTCACATC SEQ IDNo.4
EGFR-T790M F CATCTGCCTCACCTCCACC SEQ ID No.5
EGFR-T790M RAGCAGGTACTGGGAGCCAAT SEQ ID No.6
EGFR-L858R F AGCCAGGAACGTACTGGTGASEQ IDNo.7
EGFR-L858R RTGCCTCCTTCTGCATGGTAT SEQ ID No.8；
所述检测EGFR突变位点的野生型和突变型探针是：
EGFR-G719S WT VIC-ATCAAAGTGCTGGGCTC-MGB-NFQ SEQ ID No.13
EGFR-G719S MU FAM-ATCAAAGTGCTGAGCTC-MGB-NFQSEQ ID No.14
EGFR-Ex19del WTVIC-TCAAGGAATTAAGAGAAGC-MGB-NFQ SEQ ID No.15
EGFR-Ex19del MU FAM-TCGCTATCAAGACATCT-MGB-NFQ SEQ ID No.16
EGFR-T790M WT VIC-ATGAGCTGCGTGATGAG-MGB-NFQ SEQ ID No.17
EGFR-T790M MU FAM-ATGAGCTGCATGATGAG-MGB-NFQSEQ ID No.18
EGFR-L858R WT VIC-AGTTTGGCCAGCCCAA-MGB-NFQ SEQ ID No.19
EGFR-L858R MU FAM-AGTTTGGCCCGCCCAA-MGB-NFQ SEQ ID No.20；
所述检测DCK和/或EIF5B的引物分别为：
DCK-Ex3 F ATGCCTGTCTCAGTCGAATAAG SEQ ID No.9
DCK-Ex3 R GCCACGTACAAGCCATTTATAC SEQ ID No.10
EIF5B-Ex1 F GCTGAGCGGAGACCAAAGT SEQ ID No.11
EIF5B-Ex1 R TCTACCTGTCTTCGCTCTTGTT SEQ ID No.12；
所述检测DCK和/或EIF5B的探针分别为：
DCK-Ex3 FAM-CTCAGCTTGCCTCTC-MGBNFQ SEQ IDNo.21
EIF5B-Ex1 FAM-CGGGAGACAGTGGGT-MGB-NFQ SEQ IDNo.22。
2.根据权利要求1所述定值方法，其特征在于，所述检测EGFR突变位点G719S、Ex19del、T790M和L858R的野生型和突变型探针分别使用不同的荧光标记。
3.根据权利要求2所述定值方法，其特征在于，所述野生型探针使用VIC，所述突变型探针使用FAM。
4.根据权利要求1所述定值方法，其特征在于，所述定量拷贝数校正系数n通过如公式(1)计算获得，
其中CP参照为参照基因的拷贝数，分别获得野生型和突变型探针的拷贝数校正系数nMU和nWT。
5.根据权利要求4所述定值方法，其特征在于，使用所述校正系数n对突变频率进行校正，即所述突变频率AF通过如公式(2)计算获得，
其中CPMU为突变型探针拷贝数，CPwt为野生型探针拷贝数。
CN201910616310.9A 2019-07-09 2019-07-09 一种校正egfr基因突变频率的定值方法 Active CN110343746B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910616310.9A CN110343746B (zh) 2019-07-09 2019-07-09 一种校正egfr基因突变频率的定值方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910616310.9A CN110343746B (zh) 2019-07-09 2019-07-09 一种校正egfr基因突变频率的定值方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110343746A CN110343746A (zh) 2019-10-18
CN110343746B true CN110343746B (zh) 2023-11-03

Family

ID=68178599

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910616310.9A Active CN110343746B (zh) 2019-07-09 2019-07-09 一种校正egfr基因突变频率的定值方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110343746B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106520931A (zh) * 2016-10-17 2017-03-22 上海赛安生物医药科技有限公司 Egfr基因突变检测引物探针及其试剂盒
CN107365868A (zh) * 2017-09-04 2017-11-21 中国计量科学研究院 Braf和egfr基因突变检测定量标准品及其制备方法和定值方法
CN108642154A (zh) * 2018-06-01 2018-10-12 领航基因科技（杭州）有限公司 一种检测egfr突变位点的引物探针组合和试剂盒及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106520931A (zh) * 2016-10-17 2017-03-22 上海赛安生物医药科技有限公司 Egfr基因突变检测引物探针及其试剂盒
CN107365868A (zh) * 2017-09-04 2017-11-21 中国计量科学研究院 Braf和egfr基因突变检测定量标准品及其制备方法和定值方法
CN108642154A (zh) * 2018-06-01 2018-10-12 领航基因科技（杭州）有限公司 一种检测egfr突变位点的引物探针组合和试剂盒及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110343746A (zh) 2019-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108949990B (zh) 一种检测egfr基因突变的试剂盒及方法
CN111304303A (zh) 微卫星不稳定的预测方法及其应用
CN111235272A (zh) 一次性检测肺癌多重基因突变的组合物及其应用
CN110878333A (zh) 一种制备基因突变参考品的方法
CN110863053A (zh) 一种检测EGFR vIII突变体的引物、探针及方法
CN108342461A (zh) ddPCR技术检测IDH1基因变异的引物、试剂盒及检测方法
US10274459B2 (en) Gene mutation analyzer, gene mutation analysis system, and gene mutation analysis method
Kim et al. Novel method of real-time PCR-based screening for common fetal trisomies
CN109593832A (zh) 一种ARMS-ddPCR基因点突变的检测方法
CN108913775A (zh) 检测L858R和Del19突变的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用和检测方法
CN110343746B (zh) 一种校正egfr基因突变频率的定值方法
Wang et al. Establishment of primary reference measurement procedures and reference materials for EGFR variant detection in non-small cell lung cancer
JP2015534813A (ja) 鎖を除外することによりマイクロアレイの性能を向上する方法
CN115992245A (zh) 用于人微卫星不稳定msi检测的引物组合物、试剂、试剂盒及应用
Wang et al. Establishment and evaluation of digital PCR methods for HER2 copy number variation in breast cancer
CN115927623A (zh) 检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合、试剂盒及其应用
CN111793675B (zh) 一种用于egfr基因18外显子g719x突变检测的核酸序列、试剂盒及其应用
CN111304305B (zh) 一种用于检测egfr基因甲基化的试剂盒及方法
WO2019084998A1 (zh) 一种kras、nras、braf基因突变检测试剂盒
CN110343747A (zh) 一种校正egfr基因突变频率的定值引物和探针组
Liu et al. Development and validation of a tetra-primer amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction combined with melting analysis-assay for clinical JAK2 V617F mutation detection
CN109811041A (zh) 一种检测pik3ca基因h1047r位点的特异性引物对、探针及试剂盒
CN111718979B (zh) 基因扩增参考品及其应用
CN109504772A (zh) 一种基于数字pcr平台pole基因突变的检测方法
CN108330171A (zh) 检测egfr基因第19号外显子缺失突变的试剂盒、方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant