CN111304305B - 一种用于检测egfr基因甲基化的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测EGFR基因甲基化的试剂盒及方法。该试剂盒包括EGFR基因扩增引物EGFR‑mF：GTTTGATAAGATTTGAAGGATT和EGFR‑mR：Biotin‑TACCAACTTTAAACAAACTAACCG，以及测序引物EGFR‑mS：GATAAGATTTGAAGGATTTT。本发明采用焦磷酸测序技术，可以低成本、高通量定位定量检测EGFR基因8个CpG位点的甲基化比例，从而精准评估EGFR基因的甲基化水平。

Description

一种用于检测EGFR基因甲基化的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于核酸体外扩增及甲基化的定位、定量检测领域，具体涉及一种基于焦磷酸测序技术定量检测EGFR基因启动子区甲基化的引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)属于表皮生长因子受体(ErbB)家族，是一种普遍表达于人体的上皮细胞表面、具有酪氨酸激酶活性的膜表面蛋白。EGFR通过与相应配体结合分别激活PI3K/Akt/mTOR通路、RAS/RAF/ErK-MAPK通路、Ral/c-Src/STAT通路，调节细胞生长、增殖和分化。研究发现EGFR表达异常与肺癌、肝癌、乳腺癌、脑胶质细胞瘤、胃癌、结肠癌等多种肿瘤的发生、增殖、侵袭、转移及血管生成有关，是目前肿瘤靶向药物重要靶点之一。

吉非替尼(商品名易瑞沙)是阿斯利康公司推出的首个EGFR酪氨酸激酶选择性抑制剂(EGFR-TKI)，然而随着治疗方案的不断推广，EGFR-TKI耐药问题逐渐出现。有研究结果表明EGFR基因突变及二次突变是EGFR-TKI原发/继发性耐药的重要机制，并因此研发出各类EGFR基因突变检测试剂盒。然而，基因突变论无法解释较快的获得耐药以及耐药逆转的现象。由此表明癌细胞的特性并不完全由其DNA序列决定，表观遗传信息(包括组蛋白的乙酰化修饰、DNA甲基化、染色质重塑以及非编码RNA)也参与其中，并逐渐成为肿瘤分子病理研究新的热点。

DNA甲基化主要是一种DNA甲基转移酶(DNMTs)介导的可逆的表观遗传修饰形式。正常人类基因组中约有5000万个5-mC，其中1-2％的CpG位点呈现高度聚集状态，通常位于基因的启动子区，被称为CpG岛。研究表明，结直肠癌、乳腺癌、肺癌用药过程中，肿瘤细胞的EGFR基因甲基化水平存在逐渐上升的现象。例如，王起龙等利用重亚硫酸盐测序法(BSP)对人肺腺癌PC9/GR耐药细胞株的EGFR基因甲基化进行研究，发现吉非替尼可能通过EGFR启动子甲基化诱导肺腺癌细胞继发性耐药。但基于Sanger测序的BSP法仅能定性判断CpG是否发生了甲基化，但无法精准定量每个CpG位点甲基化比例，且检测灵敏度低(仅能检测出当C/C+T≥20％时的甲基化)，易出现假阴性检测结果，不利于实验室或临床检测。

目前基因甲基化检测方法还包括：甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法(MS-HRM)、甲基化特异性PCR(MSP)、荧光定量甲基化特异PCR(qMSP)。其中MSP和qMSP仅能定性判断1-2个CpG位点是否发生甲基化；MS-HRM无法精确测定每个CpG位点，仅能检测片段整体甲基化情况；另外，BSP尽管能够半定量每一个CpG位点的甲基化状态，但是必需挑取大量克隆进行测序，不适用于大量样本的检测。

焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶，荧光素酶以及双磷酸酶共同催化作用下将每次dNTP的结合与荧光信号偶联，如果与模板配对，聚合酶就可发生反应产生荧光信号。C在Na₂SO₃处理下转化为T，而5-mC不转变，因此可以用焦磷酸测序观察C/C+T比例，间接反映位点C甲基化和非甲基化比例，得出每个CpG位点甲基化程度的精确数据。焦磷酸测序技术检测通量大、灵敏度高，可以一次实现扩增子上多个CpG位点甲基化水平的定量分析，并可以设置质控监测DNA样本是否转化完全，避免假阳性结果产生，因此是检测基因甲基化的又一“金标准”。

焦磷酸测序结果的准确性通常受到模板DNA纯度和浓度、扩增引物特异性、测序引物和测序程序等多因素的影响。文献(ESR1、GATA3、GSTP1基因甲基化与人乳腺癌临床病理特征及细胞耐药关联分析)中采用焦磷酸测序技术对EGFR基因启动子区CpG岛甲基化程度进行检测。但由于引物的特异性和测序程序原因，导致测序结果中部分CpG位点甲基化比例常常出现可疑结果(测序结果报黄)，甚至失败(测序结果报红)，从而影响测定结果的准确性，不利于EGFR基因CpG位点甲基化的精准检测，进而影响对EGFR基因甲基化水平的表观效应的揭示。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测EGFR基因甲基化的试剂盒及方法。

为实现以上目的，本发明采用了以下技术方案：

一种基于焦磷酸测序技术检测EGFR基因甲基化的引物，包括EGFR基因甲基化测序引物EGFR-mS，该测序引物与EGFR基因测序片段相匹配，所述测序引物的序列如下所示：

EGFR-mS：5’-GATAAGATTTGAAGGATTTT-3’。

优选的，所述测序引物EGFR-mS对应的分析序列为：

5’-CTCGGACTTTAGAGCACCACCTCGGACGCCTGGCACCCCTGCCGCGCGGGCACGGCGA-3’

根据该分析序列，测序程序编辑为：5’-TTYGGATTTTAGAGTATTATTTYGGAYGTTTGGTATTTTTGTYGYGYGGGTAYGGYGA-3’。

优选的，所述EGFR基因测序片段采用EGFR基因特异性扩增引物EGFR-mF和EGFR-mR扩增得到，该扩增引物与经重亚硫酸盐转化后的EGFR基因启动子区序列片段相匹配，所述扩增引物的序列如下所示：

EGFR-mF：5’-GTTTGATAAGATTTGAAGGATT-3’

EGFR-mR：5’-TACCAACTTTAAACAAACTAACCG-3’

其中，EGFR-mR的5’端带有生物素(Biotin)标记。

一种基于焦磷酸测序技术检测EGFR基因甲基化的试剂盒，该试剂盒包括上述EGFR基因特异性扩增引物和EGFR基因甲基化测序引物。

优选的，所述试剂盒具体包括以下4个部分：

(1)样本(血液、组织、细胞)中基因组DNA提取、重亚硫酸盐转化及纯化试剂：蛋白酶K、裂解缓冲液、结合缓冲液、洗涤液、NaOH、重亚硫酸盐转化液(3M Na₂S₂O₅)、DNA保护剂(10mM对苯二酚)和无RNase水；

(2)扩增EGFR基因目标区域试剂：10×HS缓冲液、dNTP混合液、Hotstart酶、EGFR基因特异性扩增引物EGFR-mF和EGFR-mR；

(3)检测EGFR基因目标区域甲基化的试剂：琼脂糖磁珠、焦磷酸测序结合缓冲液、EGFR基因甲基化测序引物EGFR-mS、焦磷酸测序退火缓冲液、焦磷酸测序变性缓冲液、焦磷酸测序清洗缓冲液、焦磷酸测序底物、焦磷酸测序酶体系和四种dNTP；

(4)焦磷酸测序所用的分析序列的说明书。

优选的，所述试剂盒检测的CpG位点选自以下EGFR基因位点(即以EGFR-mF和EGFR-mR为引物对扩增的EGFR基因测序片段中的CpG位点)中的一个或多个：egfr-603、egfr-583、egfr-579、egfr-563、egfr-561、egfr-559、egfr-553、egfr-550。

一种检测EGFR基因甲基化的方法，包括以下步骤：

1)提取样本中的DNA，并测定提取的DNA的浓度、纯度；

2)对提取的DNA进行重亚硫酸盐转化；

3)以经步骤2)处理过的DNA为模板，使用上述EGFR基因特异性扩增引物EGFR-mF和EGFR-mR进行PCR扩增；

4)使用焦磷酸测序的配套试剂(包括上述琼脂糖磁珠、焦磷酸测序结合缓冲液、焦磷酸测序退火缓冲液、焦磷酸测序底物、焦磷酸测序酶体系、四种dNTP等)及上述EGFR基因甲基化测序引物EGFR-mS对步骤3)得到的扩增产物进行焦磷酸测序，并应用甲基化检测软件分析测序结果，从而获得EGFR基因测序片段中8个CpG位点的甲基化状态。

优选的，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环；72℃延伸10min。

优选的，所述样本选自人实体肿瘤组织、血液或人实体肿瘤细胞。

优选的，所述肿瘤选自肺癌、结肠癌、肝癌或乳腺癌。

本发明的有益效果体现在：

本发明的试剂盒提供了焦磷酸测序法定量检测样本DNA中EGFR基因甲基化水平的引物，利用该试剂盒可以简便、快速、低成本、高通量的检测EGFR基因8个CpG位点的甲基化比例，从而实现对EGFR基因甲基化水平的精准评估。

进一步的，通过优化与测序序列相关的测序程序，将测序读长提高到60bp左右，可快速、准确的完成对8个CpG位点的焦磷酸测序分析。

进一步的，本发明通过EGFR基因特异性扩增引物获得的测序片段，包含具有显著表观效应(例如，肿瘤细胞对吉非替尼的耐药性)的CpG位点。

附图说明

图1为EGFR基因启动子及第一外显子区的CpG岛分析。

图2为EGFR基因CpG岛PCR扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图；其中：泳道1、2、3为人非小细胞肺癌细胞系(A549)，泳道N为阴性对照。

图3为EGFR基因启动子区CpG岛焦磷酸测序结果图；其中：竖条区域为测定的甲基化位点，竖条上方百分比数值为该位点甲基化比例(即C/C+T比例，间接反映原序列中5-mC/C+5-mC)。

图4为不同实体瘤细胞样本中EGFR基因CpG位点甲基化聚类分析图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明设计了一组高特异性扩增引物及测序引物，进而通过DNA重亚硫酸盐转化、PCR扩增和焦磷酸测序技术，检测EGFR基因8个CpG位点甲基化比例，本发明可用于定位定量评估EGFR基因甲基化水平，具有特异性高、定量准确、高通量、成本低等特点。

(一)非小细胞肺癌细胞中EGFR基因甲基化检测的引物和方法

(1)细胞系培养及其基因组DNA的提取

将非小细胞肺癌(NSCLC)细胞A549(ATCC CCL-185，购自中科院上海细胞工程中心)置于含10％胎牛血清的RPMI1640营养液中，37℃、5％CO₂及饱和湿度下培养至对数生长期，用胰蛋白酶消化，移入离心管，1000rpm离心5min，PBS洗涤2-3次。随后按照基因组提取试剂盒(TIANGEN，DP304)说明书操作：用200μL的PBS重悬细胞，加入20μL蛋白酶K混匀，65℃孵育5min；再加入220μL的缓冲液GB，70℃裂解细胞10min；然后加入220μL的无水乙醇，剧烈振荡15sec，将反应液转移到过滤柱中，12000rpm离心1min；加500μL的缓冲液GD(结合缓冲液)，12000rpm离心1min；再加700μL的洗涤液PW，12000rpm离心1min，洗涤2次；将过滤柱置于新的收集管上，加入50-100μL 70℃预热的无RNase水，室温静置3min，12000rpm离心1min，收集洗脱DNA，测定浓度和纯度，-80℃保存。

(2)细胞系基因组DNA的重亚硫酸盐转化

取9μL(1)中的DNA的水溶液(DNA含量50ng-2μg)，加3M NaOH 1μL，37℃预变性15min；随后加入104μL重亚硫酸盐转化液(3M Na₂S₂O₅)，及6μL DNA保护剂(10mM对苯二酚)，混合均匀，按照先55℃15min，后95℃30sec，运行20个循环以转化DNA。转化后的DNA使用基因组DNA提取试剂盒进行纯化，具体操作步骤如下：取DNA转化液，加320μL的缓冲液GD，及250μL的无水乙醇，涡旋振荡15sec，移入过滤柱中，12000rpm离心1min；随后按照(1)中步骤依次洗涤、结合(指样本中DNA在结合缓冲液环境下与过滤柱中树脂结合)、再洗涤2次，最后加15-30μL的65℃预热的无RNase水，洗脱转化的DNA，测定浓度和纯度，-80℃保存。

(3)EGFR基因CpG岛分析及引物的设计与合成

从Genebank数据库中查找和下载EGFR基因DNA序列，使用Methyl Primer Express Software(Life Technologies公司)分析EGFR基因启动子及第一外显子区(GRCh38.p13参考基因组序列NG_007726第一外显子及其上游1500bp区域，即chr7:55017532-55019531，合计2000bp)CpG岛及CpG位点分布特点(在CpG岛>100bp，G+C％>50％，及Obs/Exp>0.6的条件下)，确定EGFR基因启动子及第一外显子区有2个CpG岛(图1)，选取位于启动子区的第一个CpG岛及其下游部分区域，使用PyroMark Assay Design 2.0软件设计EGFR基因焦磷酸测序片段扩增引物5对。

(4)EGFR基因启动子区片段的PCR扩增

按照表1配制合适管数的反应体系(平行样本3份，并设阴性对照)，置于BioRadPCR仪。按照表1扩增程序进行梯度PCR扩增反应。

取3μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，成像仪下观察，以出现230bp的产物条带判定扩增成功，并根据是否存在其它条带来判断引物扩增的特异性以及是否存在引物二聚体；结果如图2所示，退火温度为55℃时，扩增条带约为230bp，条带单一、丰度高，无杂带、无引物二聚体(泳道1、2、3)，适用于进行下一步测序实验。

表1.EGFR基因甲基化片段的PCR扩增反应体系和程序

本发明分别以人乳腺癌细胞系(MCF7)、肝癌细胞系(HepG2)等的基因组DNA为实验样本，验证各对扩增引物的特异性和扩增效率；最终筛选出一对特异性高、扩增效率好的引物(EGFR-mF和EGFR-mR)，如表2所示。

表2.EGFR基因甲基化的扩增及测序引物

(5)EGFR基因启动子区片段的焦磷酸测序

以EGFR基因的PCR扩增片段为测序目标(启动子区的第一个CpG岛及其下游部分区域)，分析其碱基序列，按照测序引物设计原则(特异与测序片段结合，长度10-25bp，G+C％≥40％，无发夹结构，避免包括待测CpG)，设计了4条测序引物。取无杂带、无引物二聚体的有效PCR扩增产物进行焦磷酸测序，具体操作如下。

取0.2mL的离心管，每管依次加入40μL PyroMark结合缓冲液、1μL的琼脂糖磁珠(QIAGEN)，及10μL PCR产物，并用超纯水补充至总体积80μL，1500rpm混匀15min；取PyroMark 96孔反应板，每孔依次加入20μL PyroMark退火缓冲液，及2.5μL浓度为5μM的测序引物，吹吸混匀；打开真空泵的开关，将超纯水清洗过的96头电磁过滤器对应插入含PCR产物的琼脂糖磁珠混合液中约2min，充分捕获含测序模板(PCR产物)的琼脂糖磁珠，然后将过滤器依次放入70％的乙醇中1min、PyroMark变性缓冲液中约1min，及PyroMark清洗缓冲液中约1min；移出过滤器，关闭真空泵的开关，使过滤器吸头释放琼脂糖磁珠于对应的96孔板中，充分混匀；80℃变性2min，冷却至室温；在PyroMark Q 96试剂仓中加入酶E、底物S和4种dNTP碱基；将96孔板和试剂仓都放入焦磷酸测序仪中，编辑测序程序开始检测；检测完成后使用PyroMark Q 96分析软件对测序结果进行分析并输出测序报告，荧光吸收峰上面的数字代表每个CpG位点甲基化所占的比例，蓝色代表最优，黄色代表基本可信，红色代表测序失败。测序结果稳定且最优(全部蓝色)的测序引物EGFR-mS如表2所示，其对应的测序程序为：

5’-TTYGGATTTTAGAGTATTATTTYGGAYGTTTGGTATTTTTGTYGYGYGGGTAYGGYGA-3’。

结果如图3所示，采用本发明设计的测序引物和程序测序，结果成蓝色，达到最优(测序读长较长，达到60bp左右)，且DNA转化质控监测C点(粉色柱)无吸收峰检出，证明DNA完全转化，检测结果非假阳性，说明成功建立了基于焦磷酸测序技术的EGFR基因启动子区8个CpG位点的甲基化检测方法。

以上焦磷酸测序结果经BSP检验，结果可靠。

(二)不同药物敏感性实体瘤细胞中EGFR基因甲基化的检测

(1)MTT检测吉非替尼对不同实体瘤细胞系的半数抑制浓度IC50

将不同实体瘤细胞系(人非小细胞肺癌A549、人结肠癌SW480、人肝细胞癌HepG2、人乳腺癌MDA-MB-231和MCF7，均购自中科院上海细胞工程中心)，培养至对数生长期，胰酶消化，调整细胞数至0.5×10⁶-1×10⁶个/mL；接种于96孔培养板内(每孔100μL)，37℃、5％CO₂及饱和湿度下培养至细胞贴壁，更换新鲜配制的含一定浓度梯度的吉非替尼的培养基，每个浓度设5个复孔，同时设空白对照组(加药无细胞)和阴性对照组(细胞不加药)；培养48h后，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，继续培养4h；小心吸去上清，加DMSO 150μL/孔，震荡10min；于酶标仪上492nm检测波长测各孔OD值，绘制吉非替尼作用于不同细胞的生长抑制曲线，并分别计算其半数抑制浓度(IC50)，结果吉非替尼对A549、SW480、HepG2、MDA-MB-231和MCF7细胞的半数抑制浓度IC50分别为24.36μM、54.4μM、7.58μM、13.49μM和58.05μM，即A549、HepG2和MDA-MB-231细胞对吉非替尼较敏感，SW480和MCF7细胞对吉非替尼耐药性较强。

(2)焦磷酸测序检测不同实体瘤细胞系中EGFR基因的甲基化水平

取(1)中不同实体瘤细胞系样本，参照(一)中的方法，检测各个细胞系中EGFR基因的甲基化水平，结果如表3及图4所示，HepG2和MDA-MB-231细胞中EGFR基因甲基化水平最低，平均甲基化比例分别为4.38％和4.88％；A549、SW480和MCF7细胞中EGFR基因甲基化水平较高，平均甲基化比例分别为64.6％、69％和77.13％。

(3)吉非替尼对非小细胞肺癌细胞EGFR基因的甲基化的影响

A549细胞传代，胰酶消化，重悬后以终浓度10⁵个/孔铺板，培养至贴壁，分别更换终浓度为1/2IC50的吉非替尼RPMI1640营养液，连续培养30天，每2天换药1次，按照(1)中MTT法检测吉非替尼对加药培养细胞A549+G的IC50，发现吉非替尼对A549+G细胞的IC50为28.05μM，说明持续加药培养可以诱导A549细胞对吉非替尼产生一定耐药性。提取加药培养30天后的细胞A549+G的基因组DNA，参照(一)中的方法，进行EGFR基因的甲基化分析，结果如表3及图4所示，与A549细胞相比较，A549+G细胞甲基化水平有所升高，平均甲基化比例为67％。

表3.不同实体瘤细胞中EGFR基因甲基化比例及其对吉非替尼的敏感性相关分析

注：各列数字表示各个CpG位点及EGFR基因平均的甲基化比例；最后一行表示吉非替尼对不同细胞系的IC50；最后一列表示各个CpG位点的甲基化比例与不同细胞的耐药性相关系数，*示p≤0.05；**示p≤0.01；***示p≤0.001。

根据以上实验结果，发现实验肿瘤细胞EGFR基因启动子区的平均甲基化比例越低，其对吉非替尼的IC50越小，即肿瘤细胞EGFR基因启动子区的平均甲基化比例与其对吉非替尼的耐药性成正比(平均甲基化比例高的细胞，IC50也高，细胞对药物更耐药)。并且长期使用吉非替尼会诱导非小细胞肺癌A549细胞EGFR基因启动子区的平均甲基化比例升高，药物敏感性降低。对EGFR基因8个CpG位点的甲基化比例(指每个CpG位点C/C+T比例)分别与其对吉非替尼的IC50作非参数Spearman`s相关系数分析发现，EGFR基因的3个CpG位点efgr-561、efgr-553、efgr-550的甲基化水平与肿瘤细胞(指实验涉及的6个实体瘤细胞株)对吉非替尼的耐药性显著正相关，其相关系数分别为R_efgr-561＝0.202(p＝0.05)、R_efgr-553＝0.292(p＝0.006)、R_efgr-550＝0.245(p＝0.022)，因此，EGFR基因的启动子区的3个CpG位点efgr-561、efgr-553、efgr-550可作为监测吉非替尼耐药性的表观遗传候选靶点。

总之，本发明提出的焦磷酸测序技术，可以对EGFR基因启动子区甲基化程度进行快速定量检测，可以用于评估多种人实体肿瘤EGFR基因特异性位点甲基化水平，有助于实现肿瘤早期表观诊断、精准治疗(例如，实时监控患者对EGFR-TKI的药物敏感性)和预后评估，并为缓解吉非替尼等EGFR-TKI的耐药提供新的表观遗传治疗靶点。

<110> 陕西科技大学

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<160> 5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 1

gtttgataag atttgaagga tt 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

taccaacttt aaacaaacta accg 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gataagattt gaaggatttt 20

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ctcggacttt agagcaccac ctcggacgcc tggcacccct gccgcgcggg cacggcga 58

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ttyggatttt agagtattat ttyggaygtt tggtattttt gtygygyggg tayggyga 58

Claims (8)

1.一种基于焦磷酸测序技术检测EGFR基因的3个CpG位点甲基化水平的引物在制备肿瘤EGFR酪氨酸激酶选择性抑制剂吉非替尼药物敏感性分析试剂中的应用，其特征在于：所述引物包括EGFR基因甲基化测序引物EGFR-mS，该测序引物与EGFR基因测序片段相匹配，测序引物的序列如下所示：

EGFR-mS：5’-GATAAGATTTGAAGGATTTT -3’；

所述EGFR基因的3个CpG位点为efgr-561、efgr-553、efgr-550，3个CpG位点的参考序列位置为NG_007726 4440、NG_007726 4448、NG_007726 4450；

所述肿瘤选自非小细胞肺癌、结肠癌、肝癌或乳腺癌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述测序引物EGFR-mS对应的测序程序编辑为：5’-TTYGGATTTTAGAGTATTATTTYGGAYGTTTGGTATTTTTGTYGYGYGGGTAYGGYGA -3’。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述EGFR基因测序片段采用EGFR基因特异性扩增引物EGFR-mF和EGFR-mR扩增得到，扩增引物的序列如下所示：

EGFR-mF：5’- GTTTGATAAGATTTGAAGGATT -3’

EGFR-mR：5’- TACCAACTTTAAACAAACTAACCG -3’。

4.一种基于焦磷酸测序技术检测EGFR基因的3个CpG位点甲基化水平的试剂盒在制备肿瘤EGFR酪氨酸激酶选择性抑制剂吉非替尼药物敏感性分析试剂中的应用，其特征在于：该试剂盒包括EGFR基因特异性扩增引物和EGFR基因甲基化测序引物；

所述测序引物的序列如下所示：

EGFR-mS：5’-GATAAGATTTGAAGGATTTT -3’

所述扩增引物的序列如下所示：

EGFR-mF：5’- GTTTGATAAGATTTGAAGGATT -3’

EGFR-mR：5’- TACCAACTTTAAACAAACTAACCG -3’；

所述EGFR基因的3个CpG位点为efgr-561、efgr-553、efgr-550，3个CpG位点的参考序列位置为NG_007726 4440、NG_007726 4448、NG_007726 4450；

所述肿瘤选自非小细胞肺癌、结肠癌、肝癌或乳腺癌。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述试剂盒还包括样本DNA提取及DNA重亚硫酸盐转化试剂、扩增EGFR基因测序片段的试剂和焦磷酸测序试剂。

6.根据权利要求1或4所述的应用，其特征在于：检测EGFR基因甲基化的方法，包括以下步骤：

1）提取样本中的DNA；

2）对提取的DNA进行重亚硫酸盐转化；

3）以经步骤2）处理过的DNA为模板，使用EGFR基因特异性扩增引物EGFR-mF和EGFR-mR进行PCR扩增：

EGFR-mF：5’- GTTTGATAAGATTTGAAGGATT -3’

EGFR-mR：5’- TACCAACTTTAAACAAACTAACCG -3’；

4）使用以下的EGFR基因甲基化测序引物EGFR-mS对步骤3）得到的扩增产物进行焦磷酸测序，从而获得EGFR基因测序片段中CpG位点的甲基化状态：

EGFR-mS：5’-GATAAGATTTGAAGGATTTT -3’。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增的程序为：95 ℃预变性5min；95 ℃变性20 sec，55 ℃退火30 sec，72 ℃延伸30 sec，40个循环；72 ℃延伸10 min。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述样本选自人实体肿瘤组织、血液或人实体肿瘤细胞。

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