WO2017068801A1 - 細胞の分化状態の評価方法 - Google Patents

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differentiation state
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鈴木　崇
大介 平丸
雅俊 高橋
健太郎 富田
邦忠 畑林
加川　健一
成則 尾▲崎▼
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株式会社島津製作所
東京エレクトロン株式会社
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the differentiation state of a cell.
  • Patent Document 1 a method using immunostaining (see, for example, Patent Document 1) or a method for quantifying the expression level of a marker gene (see, for example, Patent Document 2) has been widely used. Yes.
  • cells to be evaluated such as pluripotent stem cells
  • SSEA-4 and TRA1-60 are widely used as antibodies for determining whether pluripotent stem cells are in an undifferentiated state (see, for example, Patent Document 1).
  • a secondary antibody that binds to the antibody is added to the cells, and then a fluorescent label or the like previously imparted to the secondary antibody is detected. This makes it possible to evaluate whether or not an antigen for the antibody exists on the cell, that is, whether or not the cell is in an undifferentiated state.
  • mRNA is extracted from pluripotent stem cells, converted into cDNA by reverse transcriptase, and then the marker gene is obtained by PCR (Polymerase Chain Reaction, polymerase chain reaction). Amplify.
  • PCR Polymerase Chain Reaction, polymerase chain reaction
  • Amplify At this time, NANOG and POU5F1 (OCT3 / 4) are widely used as marker genes for evaluating the undifferentiation of pluripotent stem cells (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • the PCR product is detected by electrophoresis or a real-time PCR apparatus to confirm the expression level of the marker gene in the cell, and from the result, it is evaluated whether or not the cell is in an undifferentiated state.
  • any of the conventional evaluation methods described above requires invasive processing on cells. Therefore, after evaluating the differentiation state, the cells subjected to the evaluation cannot be used for another purpose, for example, as a cell source for regenerative medicine. In addition, it is impossible to evaluate changes over time for the same sample (ie, cells in the same culture dish). In order to evaluate changes over time in the differentiation state, multiple culture dishes are used in parallel. Therefore, complicated operations such as culturing were necessary.
  • the present invention has been made in view of the above points, and an object of the present invention is to provide a method for non-invasively evaluating the differentiation state of cells.
  • the present inventors have found that the abundance of a specific indicator substance in the culture supernatant varies depending on the differentiation state of the cells, and have reached the present invention.
  • the cell differentiation state evaluation method includes a step of measuring the abundance of the indicator substance in the culture supernatant of the test cell, and the differentiation state of the test cell based on the abundance of the indicator substance. Having steps.
  • the indicator substances include ornithine, 2-aminoadipic acid, deoxycytidine, glutamic acid, tryptophan, asparagine, alanine, cystine, hypoxanthine, uridine, aspartic acid, arginine, 2-hydroxybutyric acid, 2-hydroxyisovaleric acid, 3-hydroxy From hydroxyisovaleric acid, urea, 4-hydroxybenzoic acid, 4-aminobenzoic acid, ribbon acid, kynurenine, cystathionine, threonic acid, pyruvic acid, putrescine, ascorbic acid, riboflavin, serine, cysteine, orotic acid, and citric acid
  • the method for evaluating a cell differentiation state according to the present invention includes, for example, an amount of an indicator substance in a culture supernatant of a test cell and an amount of an indicator substance in a culture supernatant of a control cell whose differentiation state is known. By comparing, the differentiation state of the test cell can be evaluated.
  • indicator substances such as arginine, tryptophan, and 4-aminobenzoic acid tend to have a larger amount of differentiated cells in the culture supernatant than the amount of undifferentiated cells in the culture supernatant. Therefore, when cells that are clearly undifferentiated are used as control cells, the culture of the test cells with respect to the abundance of the indicator substances such as arginine, tryptophan, and 4-aminobenzoic acid in the culture supernatant of the control cells When the ratio of the abundance in the supernatant is greater than or equal to a predetermined threshold, it can be determined that the test cell is in a differentiated state.
  • indicator substances such as ornithine, alanine, aspartic acid, 2-hydroxybutyric acid, 2-hydroxyisovaleric acid, urea, 4-hydroxybenzoic acid are present in the culture supernatant of differentiated cells in the culture of undifferentiated cells. It tends to be smaller than the abundance in Qing. Therefore, when cells that are clearly undifferentiated are used as control cells, indicator substances such as ornithine, alanine, aspartic acid, 2-hydroxybutyric acid, 2-hydroxyisovaleric acid, urea, 4-hydroxybenzoic acid, etc. When the ratio of the abundance in the culture supernatant of the test cell to the abundance in the culture supernatant of the control cell is equal to or less than a predetermined threshold, it can be determined that the test cell is in a differentiated state.
  • the differentiation state is evaluated based on the abundance of two or more of the above indicator substances.
  • the differentiation state is evaluated by comparing the abundance of the indicator substance in the culture supernatant of the test cell and the abundance of the indicator substance in the culture supernatant of the control cell. Is done.
  • the ratio between the amount of the indicator substance present in the culture supernatant of the test cell and the amount of the indicator substance present in the culture supernatant of the control cell was determined, and these ratios were determined in advance. You may evaluate a differentiation state based on whether it is more than a threshold value.
  • the target cells for example, cells that are clearly undifferentiated are used.
  • a precursor substance and a metabolite that are in the context of the metabolic pathway can be selected, and based on the ratio of the amount of the precursor substance to the metabolite in the culture supernatant of the test cell Differentiation status.
  • Examples of combinations of precursors and metabolites include tryptophan and kynurenine, ornithine and putrescine, and arginine and ornithine.
  • the two or more kinds of indicator substances for example, a combination containing kynurenine, 2-aminoadipic acid, ornithine and deoxycytidine can be adopted.
  • the two or more indicator substances may further contain tryptophan, cystathionine, hypoxanthine, and uridine.
  • the differentiation state of the test cell can be evaluated with higher accuracy by evaluating the differentiation state based on the abundance of two or more kinds of indicator substances. Further, by evaluating the differentiation state based on the abundance of two or more kinds of indicator substances, in addition to evaluating whether the test cell is in a differentiated state or an undifferentiated state, it is evaluated that it is in a differentiated state. It is also possible to evaluate whether the direction of differentiation of the test cells thus obtained is endoderm, mesoderm, or ectoderm.
  • kynurenine ornithine
  • 2-aminoadipic acid deoxycytidine
  • tryptophan cystathionine
  • hypoxanthine hypoxanthine
  • uridine in the culture supernatant of test cells
  • the stem cell is a pluripotent stem cell such as an ES cell (Embryonic Stemscells, embryonic stem cell) or an iPS cell (Induced Puriuripotent Stem cells, induced pluripotent stem cell). Also good.
  • ES cell Embryonic Stemscells, embryonic stem cell
  • iPS cell Induced Puriuripotent Stem cells, induced pluripotent stem cell. Also good.
  • the abundance of the indicator substance in the culture supernatant used in the cell differentiation state evaluation method according to the present invention may be determined using any method, and representative methods include liquid chromatography analysis, mass Analytical methods can be mentioned.
  • the cell differentiation state can be evaluated non-invasively without the need to destroy the cell as in the prior art. This makes it possible to use the test cell as a cell source for regenerative medicine after the differentiation state is evaluated.
  • the differentiation state of the test cell can be evaluated with higher accuracy by evaluation based on the abundance of two or more kinds of indicator substances in the culture supernatant.
  • the direction of differentiation of the test cell evaluated to be in a differentiated state in addition to the evaluation of whether the test cell is in a differentiated state or an undifferentiated state by an evaluation based on the abundance of two or more kinds of indicator substances Sex can also be evaluated.
  • the schematic diagram explaining the evaluation method of the cell differentiation state in one Example of this invention (the 1).
  • the schematic diagram explaining the evaluation method of the cell differentiation state in one Example of this invention (the 2).
  • required by LC-MS analysis of the culture supernatant in the Example (the 1).
  • required by LC-MS analysis of the culture supernatant in the Example (the 3).
  • the cell differentiation state evaluation method evaluates the differentiation state of a test cell based on the abundance of a biomarker (indicator substance) in the culture supernatant of the test cell.
  • test cells typically pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells can be used.
  • cells induced to differentiate from the stem cells can also be used as test cells.
  • a stem cell whose differentiation state is unknown is a test cell, it can be determined whether it is a differentiation state or an undifferentiation state by the evaluation method of the present invention.
  • the evaluation method of the present invention can determine whether or not undifferentiated cells are mixed.
  • a medium used for culturing a test cell a medium generally used for culturing a stem cell, for example, DMEM / F12, or a medium mainly containing the DMEM / F12 (eg, mTeSR1, TeSR-E8, etc.) is used. be able to.
  • Table 1 shows the components of DMEM / F12.
  • biomarkers examples include ornithine, 2-aminoadipic acid, deoxycytidine, glutamic acid, tryptophan, asparagine, alanine, cystine, hypoxanthine, uridine, aspartic acid, arginine, 2-hydroxybutyric acid, 2-hydroxyisovaleric acid, 3 -Hydroxyisovaleric acid, urea, 4-hydroxybenzoic acid, 4-aminobenzoic acid, ribbon acid, kynurenine, cystathionine, threonic acid, pyruvic acid, putrescine, ascorbic acid, riboflavin, serine, cysteine, orotic acid, and citric acid Etc.
  • the amount of these biomarkers is different between the culture supernatant of undifferentiated cells and the culture supernatant of differentiated cells. Therefore, by measuring the abundance of these bimarkers in the culture supernatant, it can be determined whether the cell is in a differentiated state or an undifferentiated state.
  • the abundance of the biomarker in the culture supernatant of the control cell whose differentiation state is known is measured, the abundance of the indicator substance in the culture supernatant of the test cell, and the abundance of the indicator substance in the culture supernatant of the control cell
  • the differentiation state may be evaluated by comparing.
  • the control cell may be an undifferentiated cell or a differentiated cell as long as the differentiation state is known. Differentiated cells may vary in the abundance of biomarkers in the culture supernatant due to differences in the degree of differentiation and the direction of differentiation, and therefore, undifferentiated cells are preferably used as control cells. Comparison of the abundance of the biomarker in the culture supernatant of the test cell and the abundance of the biomarker in the culture supernatant of the control cell is performed, for example, by determining the ratio between the two. When this ratio is greater than or equal to a predetermined threshold (threshold greater than 1), or less than or equal to a predetermined threshold (threshold smaller than 1), it can be determined that the cell is in a differentiated state.
  • a predetermined threshold threshold greater than 1
  • a predetermined threshold threshold smaller than 1
  • the ratio between the amount of biomarker present in the culture supernatant of the test cell and the amount of biomarker present in the culture supernatant of the control cell is the same as the predetermined threshold, it is determined that the cell is undifferentiated, and the threshold is When exceeding or below the threshold, it may be determined that the cell is in a differentiated state.
  • the “undifferentiated state” may include a case where undifferentiated cells are mixed with differentiated cells.
  • the differentiation state of the test cell is evaluated based on the abundance of two or more biomarkers in the culture supernatant of the test cell.
  • the differentiation state can be evaluated with higher accuracy.
  • two or more types of biomarkers not only the differentiation state of the cells but also whether the cells in the differentiation state differentiate into endoderm, mesoderm, or ectoderm, that is, the direction of differentiation. Can be evaluated.
  • biomarkers useful for evaluating the direction of differentiation include kynurenine, 2-aminoadipic acid, ornithine, deoxycytidine, tryptophan, cystathionine, hypoxanthine, and uridine. It is preferable to evaluate based on the abundance of two or more of these biomarkers.
  • a method for evaluating the differentiation state based on the abundance of two or more kinds of biomarkers a method for analyzing changes in the abundance of each biomarker in the culture supernatant of a test cell with the culture time, two or more kinds of biomarkers Examples include a method for multivariate analysis of the abundance of the marker, a method for obtaining a ratio of the abundance of the two kinds of indicator substances, and the like. You may evaluate combining these methods.
  • the determination based on the abundance of the two types of biomarkers is, for example, the abundance (or index value) of the first biomarker as the abscissa, the abundance (or index value) of the second biomarker as the ordinate, This may be done by plotting. Multivariate analysis is useful when evaluating based on the abundance of three or more biomarkers.
  • ⁇ Two types of biomarkers include a combination of metabolites and precursors in the context of metabolic pathways. By performing the evaluation based on the ratio of the metabolite and the precursor, the evaluation accuracy of the direction of differentiation is improved.
  • the precursor of the metabolic pathway is not limited to a metabolite for a metabolite, and may be a substance two or more before the metabolic pathway.
  • Examples of the combination of the precursor and the metabolite include a combination of tryptophan and kynurenine, a combination of ornithine and putrescine, and a combination of arginine and ornithine.
  • the type of metabolic pathway is not particularly limited, and the combination of the precursor and the metabolite is not limited to the above.
  • the evaluation may be based on the ratio of the metabolite to the precursor in the culture supernatant of the test cell, and the metabolite in the culture supernatant of the control cell
  • the ratio of the abundance of the precursor and the abundance of the precursor may be compared with the ratio of the abundance of the metabolite and the abundance of the precursor in the culture supernatant of the test cell.
  • the ratio of the abundance of the metabolite in the culture supernatant of the control cell and the abundance of the metabolite in the culture supernatant of the test cell, and the abundance of the precursor in the culture supernatant of the control cell and the test cell Evaluation may be carried out by determining the ratio of the abundance of precursors in the culture supernatants of these and comparing them.
  • LC-MS liquid chromatograph mass spectrometer
  • GC-MS gas chromatograph mass spectrometer
  • a sample obtained by subjecting the culture supernatant to a predetermined pretreatment is flowed to the column of a liquid chromatography (LC) device together with the eluent, and the components separated and eluted by the column are detected with an ultraviolet-visible spectroscopic detector or an infrared spectroscopic detector.
  • the abundance of the biomarker contained in the sample may be obtained from the result detected by a detector such as a vessel.
  • a reagent that specifically develops or emits light from each of the biomarkers may be added to the culture supernatant, and the amount of the biomarker present may be determined based on the intensity of the color development or emission.
  • FIG. 1A and FIG. 1B are schematic diagrams showing an execution procedure of the cell differentiation state evaluation method according to this example.
  • human iPS cell line PFX # 9 was used.
  • a cell to which differentiation induction stimulation was given to a human iPS cell line was used as a test cell, and a cell that was not given differentiation induction stimulation to a human iPS cell line (that is, an undifferentiated state was maintained) was used as a control cell.
  • a cell that was not given differentiation induction stimulation to a human iPS cell line was used as a control cell.
  • FIG. 1A shows only one culture dish for simplification.
  • mTeSR1 or TeSR-E8 was used, and the medium was changed every day, and the culture was continued until it reached confluence.
  • the day of passage was defined as day 0, and on day 1, Activin-A (Activin-A, PeproTech), Wnt3a (Wingless-type MMTV integration site family, member 3A, PeproTech), BMP-4 (Bone Morphogenetic Proteins-4 (PeproTech) was replaced with media supplemented to final concentrations of 100 ng / mL, 40 ng / mL, and 0.5 ng / mL, respectively. From the second day onward, endoderm differentiation induction stimulation was performed by exchanging the medium with activin-A and BMP-4 added to final concentrations of 100 ng / mL and 0.5 ng / mL, respectively. The culture was continued for 6 days, starting on day 0 when the cells were transplanted (passaged), and the culture supernatant collected from the culture dish when the medium was changed each day was used as a sample for mass spectrometry.
  • the PFX # 9 strain was planted and cultured in three culture dishes (diameter 60 mm) coated with vitronectin-N (FIG. 1B shows only one culture dish for simplification).
  • As the medium mTeSR1 or TeSR-E8 was used, and the medium was changed every day, and the culture was continued until it reached confluence.
  • the day of passage was defined as day 0, and the stimulation of mesoderm differentiation was stimulated by replacing the medium with BMP-4 added to a final concentration of 40 ng / mL after the first day.
  • the culture was continued for 6 days, starting on day 0 when the cells were transplanted (passaged), and the culture supernatant collected from the culture dish when the medium was changed each day was used as a sample for mass spectrometry.
  • the day of passage was defined as day 0, and from day 1 onwards, SB431542 (4- [4- (1,3-benzodioxol-5-yl) -5- (2-pyridinyl) -1H-imidazol-2- yl] benzamide, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and Noggin (PeproTech) were exchanged for medium supplemented with final concentrations of 10 ⁇ M and 500 ng / mL, respectively, to induce ectoderm differentiation induction.
  • the culture was continued for 6 days, starting on day 0 when the cells were transplanted (passaged), and the culture supernatant collected from the culture dish when the medium was changed each day was used as a sample for mass spectrometry.
  • MP is a collection of analysis condition parameters for analyzing compounds contained in a medium and metabolites secreted from cells by LC-MS.
  • the difference between the retention time of the standard product registered in the MP and the retention time of the compound in the sample is within ⁇ 0.3 minutes, and both peaks of quantitative ions and confirmation ions are detected.
  • the strength value was 1000 or more.
  • the compound was quantified by a method of calculating the area of the mass chromatogram for ions characteristic to each compound in the sample (quantitative ions).
  • MSTFA N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide
  • DB Smart Metabolites Database
  • the DB is a collection of data obtained by analyzing various standard products subjected to the same process as the derivatization process described above by GC-MS.
  • the identification of the compound is set in the database whether or not the difference between the retention index set in the DB (a numerical value relative to the retention time) and the retention index of the derivatized compound in the sample is within ⁇ 5. Whether or not both quantitative ions and confirmed ions were detected for the derivatized compound in the sample was used as an indicator.
  • the compound was quantified by a method of calculating the area of the mass chromatogram for ions characteristic of each derivatized compound in the sample according to the conditions set in the database.
  • the quantitative value (area value) of each compound determined by the LC-MS analysis and GC-MS analysis described above is the quantitative value of the internal standard substance.
  • a value (area ratio) divided by (area value) was calculated and used as an index value for the amount of each compound present in the culture supernatant.
  • the values are plotted in the coordinate system.
  • a / B or B / where A is the average index value in the control cells and B is the average index value in the test cells between day 3 and day 6 of the culture.
  • a compound having A of 1.5 or more was selected.
  • multivariate analysis was performed in order to select effective compounds for evaluating the state of cells at the initial stage of culture.
  • the index values calculated above were input to the multivariate analysis software (R version 3.1.2) for the samples on the second day to the fourth day of culture, and the principal component analysis was performed. Based on the results, a combination of compounds capable of distinguishing undifferentiated maintenance cells from endoderm differentiated cells, mesoderm differentiated cells, and ectoderm differentiated cells was selected.
  • test cells / control cells the ratio of the abundance in the culture supernatant of the test cells to the abundance of ornithine in the culture supernatant of the control cells (test cells / control cells) is determined in advance. When it is below the threshold value, the test cell can be determined to be in a differentiated state.
  • Table 6 shows that 2-Aminoadipic acid is present in the supernatant in test cells induced to differentiate into endoderm and mesoderm as compared to control cells. It was. On the other hand, in the test cells induced to differentiate into the ectoderm, the abundance in the supernatant was found to increase compared to the control cells on any of the third to sixth days of culture.
  • the test cell when an undifferentiated cell is used as the control cell, the ratio of the abundance in the culture supernatant of the test cell to the abundance of 2-aminoadipic acid in the culture supernatant of the control cell (test cell / control cell) ) Is less than or equal to a predetermined threshold value, the test cell can be determined to differentiate toward the endoderm or mesoderm, and when it is equal to or greater than the threshold value, the test cell differentiates toward the ectoderm. Can be determined.
  • the amount of cystathionine (Cystathionine) in the supernatant of the test cells generally decreased as compared to the amount of the test cells in the supernatant due to differentiation induction. Therefore, when an undifferentiated cell is used as the control cell, the ratio of the abundance in the culture supernatant of the test cell to the abundance of cystathionine in the culture supernatant of the control cell (test cell / control cell) is a predetermined threshold value. In the following cases, the test cell can be determined to be in a differentiated state.
  • alanine generally decreased in the supernatant of the test cell supernatant compared to the abundance of the control cell supernatant due to differentiation induction. Therefore, when undifferentiated cells are used as the control cells, the ratio of the abundance in the culture supernatant of the test cell to the abundance of alanine in the culture supernatant of the control cell (test cell / control cell) is a predetermined threshold. In the following cases, the test cell can be determined to be in a differentiated state.
  • cystine (Cystine) generally decreased in the amount of supernatant in the test cells induced to differentiate into endoderm and ectoderm compared to control cells.
  • the abundance in the supernatant generally increased compared to the control cells. Therefore, when undifferentiated cells are used as control cells, the ratio of the abundance in the culture supernatant of the test cells to the abundance of cystine in the culture supernatant of the control cells (test cells / control cells) is determined in advance.
  • the test cell can be determined to differentiate toward the endoderm or ectoderm, and if it is equal to or greater than the threshold, the test cell can be determined to differentiate toward the mesoderm. it can.
  • hypoxanthine shows that in test cells induced to differentiate into mesoderm and ectoderm, the abundance in the supernatant is generally increased compared to control cells until day 5 of culture. I understood. Therefore, for hypoxanthine, when undifferentiated cells were used as the control cells, the culture cells of the test cells were compared with the amount of hypoxanthine present in the culture supernatant of the control cells between the start of culture and the fifth day. It can be determined that the test cell differentiates toward the mesoderm or ectoderm when the ratio of the abundance of (test cell / control cell) is equal to or greater than a predetermined threshold.
  • the amount of arginine (Arginine) in the supernatant of the test cells generally increased due to differentiation induction compared to the amount of arginine in the supernatant of the control cells. Therefore, when undifferentiated cells are used as control cells, the ratio of the abundance in the culture supernatant of the test cells to the abundance of arginine in the culture supernatant of the control cells (test cells / control cells) is a predetermined threshold. When it is above, it can be determined that the test cell is in a differentiated state.
  • test cell the ratio of the abundance in the culture supernatant of the test cell to the abundance of 2-hydroxyisovaleric acid in the culture supernatant of the control cell (test cell / control).
  • 3-hydroxyisovaleric acid is present in the supernatant of the test cells except for some of the test cells induced to differentiate into endoderm and ectoderm by differentiation induction. It was found that the amount was reduced compared to the amount present in the supernatant of the control cells. Therefore, when undifferentiated cells are used as control cells, the ratio of the abundance in the culture supernatant of the test cells to the abundance of 3-hydroxyisovaleric acid in the culture supernatant of the control cells (test cells / control cells) Is less than or equal to a predetermined threshold value, it can be determined that the test cell is in a differentiated state.
  • urea Urea
  • Urea is abundant in the supernatant of the test cells except for some of the test cells induced to differentiate into the ectoderm by differentiation induction. It was found to decrease compared to.
  • undifferentiated cells are used as control cells, the ratio of the abundance in the culture supernatant of the test cell to the abundance of urea in the culture supernatant of the control cell (test cell / control cell) is below a predetermined threshold. In some cases, the test cell can be determined to be in a differentiated state.
  • 4-hydroxybenzoic acid (4-Hydroxybenzoic acid) is induced by differentiation, except for some test cells induced to differentiate into endoderm and some test cells induced to differentiate into ectoderm. It was found that the abundance in the supernatant of the test cells was reduced compared to the abundance in the supernatant of the control cells. Therefore, when undifferentiated cells are used as the control cells, the ratio of the abundance in the culture supernatant of the test cell to the abundance of 4-hydroxybenzoic acid in the culture supernatant of the control cell (test cell / control cell) is When the value is equal to or less than a predetermined threshold, the test cell can be determined to be in a differentiated state.
  • test cell increases in the amount of test cell supernatant in comparison with the amount of control cell supernatant due to differentiation induction. . Therefore, when an undifferentiated cell is used as the control cell, the ratio of the abundance in the culture supernatant of the test cell to the abundance of 4-aminobenzoic acid in the culture supernatant of the control cell (test cell / control cell) is When it is equal to or greater than a predetermined threshold value, the test cell can be determined to be in a differentiated state.
  • citric acid is present in the supernatant of the test cell by differentiation induction in a part of the test cell induced to differentiate into the mesoderm and a part of the test cell induced to differentiate into the endoderm.
  • the amount was found to increase compared to control cells. Therefore, when an undifferentiated cell is used as the control cell, the ratio of the abundance in the culture supernatant of the test cell to the abundance of citrate in the culture supernatant of the control cell (test cell / control cell) is determined in advance. When it is equal to or less than a predetermined threshold, it can be determined that the test cell differentiates toward the endoderm or mesoderm.
  • 2A, 2B, 2C, 2D, 3A, and 3B show changes in the abundance of the biomarkers in the culture supernatants of cultures 1 to 6 of mTeSR1 and TeSR-E8.
  • 2A to 2D are the results by LC-MS analysis
  • FIGS. 3A and 3B are the results by GC-MS analysis.
  • the abundance of biomarkers varies depending on the differentiation state of the test cells (endoderm differentiated cells, mesoderm differentiated cells, ectoderm differentiated cells).
  • the amount of kynurenine present in the culture supernatant increases significantly as the culture time elapses compared to the test cells.
  • 2-aminoadipic acid hardly changes in the culture supernatant in the endoderm differentiated cells and mesoderm differentiated cells, but changes (increases) in the culture supernatant in the control cells and ectoderm differentiated cells. ), Especially in ectodermal differentiated cells.
  • Deoxycytidine shows a change (increase) in the abundance in the culture supernatant in all cells after seeding, but in the cells subjected to differentiation induction stimulation in the endoderm, the abundance in the culture supernatant is the culture time. It decreases greatly with the passage of time.
  • test cell is in a differentiated state or in a non-differentiated state.
  • the direction of differentiation of the test cells determined as (endoderm, mesoderm, ectoderm) can be evaluated.
  • endoderm, mesoderm, ectoderm it is difficult to evaluate all of endoderm differentiation, mesoderm differentiation, and ectoderm differentiation in an evaluation based on only one type of biomarker, a determination is made based on the abundance of two or more types of biomarkers. For example, the direction of differentiation can be evaluated more accurately.
  • FIG. 4A shows the result of principal component analysis of the abundance of kynurenine, 2-aminoadipic acid, ornithine, deoxycytidine, tryptophan, cystathionine, hypoxanthine, and uridine in the culture supernatants of the mTeSR1 cultures from day 2 to day 4. Shown in From this figure, it was found that the undifferentiated state (control cells), endoderm differentiated cells, mesoderm differentiated cells, and ectoderm differentiated cells can be clearly distinguished on the third day of culture.
  • FIG. 4B shows the result of principal component analysis of the abundance of the biomarker in the culture supernatant of the culture day 2 to 4 of the TeSR-E8 strain. From this figure, it was found that the undifferentiated state (control cells), endoderm differentiated cells, mesoderm differentiated cells, and ectoderm differentiated cells can be clearly distinguished from each other on the fourth day of culture.
  • test cell by using the abundance of two or more kinds of biomarkers in the culture supernatant as an index, it is determined whether the test cell is in a differentiated state or a non-differentiated state. It was found that the direction of differentiation of the test cells (endoderm, mesoderm, ectoderm) can be evaluated.
  • TaqMan HPSC Scorecard Panel (Applied Biosystems) extracted mRNA of collected cells and evaluated 96 gene expression levels by quantitative PCR, and calculated the degree of differentiation into each germ layer based on the results did.
  • Table 25 shows the analysis score of the mTeSR1 strain
  • Table 26 shows the analysis score of the TeSR-E8 strain. In these tables, samples with shaded numerical values have an analysis score of 0.5 or more, indicating that the cells are differentiated in a specific direction.
  • the evaluation method using the abundance of the biomarker in the culture supernatant as an index can reproduce the conventional cell destructive method, and the differentiation state over time in cells in the same culture dish It can be said that it is an excellent method that can evaluate the change of.
  • Table 27 and Table 28 show values obtained by dividing A / B of kynurenine by the A / B of tryptophan, which is a precursor of the kynurenine pathway, together with the value of A / B of kynurenine as a metabolite.
  • the amount of kynurenine present in the culture supernatant of the test cells in the culture supernatant (B) is less than the amount of the control cells in the culture supernatant (A) due to differentiation induction. It can be determined whether or not the cell is in a differentiated state (as described above, the greater the value from the table, the greater the change from the control cell).
  • Table 27 mTeSR1
  • Table 28 TeSR-E8
  • Tables 25 and 26 are the results of evaluation using a cell destructive method
  • the method for evaluating the abundance in the culture supernatant of test cells has fewer days elapsed after the initiation of differentiation-inducing stimulation. It can be seen that a significant difference appears between the target cell and the test cell at the stage.
  • the ratio of kynurenine to tryptophan rather than using kynurenine alone as an indicator, the difference from the control cells tends to become more prominent. It can be seen that it can be evaluated.
  • Tables 29 and 30 show values obtained by dividing A / B of ornithine by A / B of arginine, which is a precursor of the ornithine cycle (urea cycle), together with the value of A / B of ornithine as a metabolite.
  • the abundance (B) in the culture supernatant of the test cells was decreased from the abundance (A) in the culture supernatant of the control cells by differentiation induction, It can be determined whether the cell is in a differentiated state.
  • Table 29 (mTeSR1) and Table 30 (TeSR-E8) the ratio of ornithine and its precursor arginine in the endoderm differentiated cells and mesoderm differentiated cells is higher than that in the case of ornithine alone. It can be seen that the difference from the control cells is large, and the tendency becomes more prominent with the passage of the culture days. From these results, it can be seen that the differentiation state of the test cells can be evaluated with higher accuracy by using the ratio of ornithine and arginine rather than using ornithine alone.
  • Table 31 shows the value of A / B of putrescine as a metabolite and the A / B of putrescine divided by A / B of ornithine, which is a precursor of arginine / proline metabolism.
  • putrescine When mTeSR1 medium was used, putrescine tended to increase the abundance (B) in the culture supernatant of the test cells more than the abundance (A) in the culture supernatant of the control cells due to differentiation induction, In particular, for endoderm differentiated cells and ectoderm differentiated cells, the tendency becomes more prominent with the passage of the number of days of culture, so it is possible to determine whether or not the test cells are differentiated with putrescine alone. For mesendoderm differentiated cells, putrescine alone did not show a clear trend.
  • the ratio of putrescine and its precursor, ornithine the difference from the control cells increases with the passage of the culture days, and it can be determined that the mesodermal differentiated cells are also differentiated. .
  • the ratio of putrescine and its precursor, ornithine is greater than that of putrescine alone. It turns out that it can be evaluated.

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Abstract

本発明は、分化状態が未知の幹細胞あるいは幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞とし、該被検細胞の培養上清における所定の指標物質の存在量に基づいて該被検細胞の分化状態を評価する方法である。前記指標物質は、オルニチン、２－アミノアジピン酸、デオキシシチジン、グルタミン酸、トリプトファン、アスパラギン、アラニン、シスチン、ヒポキサンチン、ウリジン、アスパラギン酸、アルギニン、２－ヒドロキシ酪酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４－ヒドロキシ安息香酸、４－アミノ安息香酸、リボン酸、キヌレニン、シスタチオニン、トレオン酸、ピルビン酸、プトレシン、アスコルビン酸、リボフラビン、セリン、システイン、オロト酸、及びクエン酸から成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物である。本発明の一形態では２種以上の指標物質の存在量に基づいて分化状態の評価が行われる。

Description

細胞の分化状態の評価方法
　本発明は、細胞の分化状態を評価するための方法に関する。
　従来、細胞の分化状態を評価するためには、免疫染色を利用した方法（例えば特許文献１を参照）やマーカー遺伝子の発現レベルを定量する方法（例えば特許文献２を参照）が広く用いられている。
　免疫染色を利用した方法では、まず評価対象とする細胞、例えば多能性幹細胞をパラホルムアルデヒド等で固定化した上で抗原－抗体反応を行う。ここで、多能性幹細胞が未分化状態であるか否かを判定するための抗体としては、ＳＳＥＡ－４やＴＲＡ１－６０が広く用いられている（例えば特許文献１を参照）。続いて、前記抗体に結合する二次抗体を細胞に添加し、その後、予め前記二次抗体に付与しておいた蛍光標識等を検出する。これにより、細胞上に前記抗体に対する抗原が存在するか否か、すなわち該細胞が未分化状態であるか否かを評価することができる。
　また、マーカー遺伝子の発現レベルの定量による方法では、例えば多能性幹細胞からｍＲＮＡを抽出し、これを逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換した後、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction、ポリメラーゼ連鎖反応）によってマーカー遺伝子を増幅する。このとき、多能性幹細胞の未分化性を評価するためのマーカー遺伝子としては、ＮＡＮＯＧやＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ３／４）が広く用いられる（例えば非特許文献１を参照）。このＰＣＲ産物を電気泳動やリアルタイムＰＣＲ装置で検出することにより前記細胞におけるマーカー遺伝子の発現量を確認し、その結果から該細胞が未分化状態であるか否かを評価する。
特開2004-313184号公報 特開2006-042663号公報
ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）, 2007, 第25巻, pp.803-816
　しかしながら、上記従来の評価方法では、いずれも細胞に対して侵襲的な処理を行う必要がある。そのため、分化状態の評価を行った後に、該評価に供した細胞を別の目的に利用すること、例えば再生医療用の細胞源とすることができなかった。また、同一サンプル（すなわち同一培養皿中の細胞）について、時間経過に伴う変化を評価することは不可能であり、分化状態の経時的な変化を評価するためには複数の培養皿で並行して培養を行う等、煩雑な作業が必要であった。
　本発明は、上記の点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、細胞の分化状態を非侵襲的に評価する方法を提供することである。
　本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、細胞の分化状態によって培養上清中の特定の指標物質の存在量が異なることを見出し、本発明に至った。
　本発明に係る細胞分化状態の評価方法では、分化状態が未知の幹細胞あるいは幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞とし、該被検細胞の培養上清における所定の指標物質の存在量に基づいて該被検細胞の分化状態を評価する。すなわち、本発明に係る細胞分化状態の評価方法は、被検細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップ、及び指標物質の存在量に基づいて被検細胞の分化状態を評価するステップを有する。
　前記指標物質は、オルニチン、２－アミノアジピン酸、デオキシシチジン、グルタミン酸、トリプトファン、アスパラギン、アラニン、シスチン、ヒポキサンチン、ウリジン、アスパラギン酸、アルギニン、２－ヒドロキシ酪酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４－ヒドロキシ安息香酸、４－アミノ安息香酸、リボン酸、キヌレニン、シスタチオニン、トレオン酸、ピルビン酸、プトレシン、アスコルビン酸、リボフラビン、セリン、システイン、オロト酸、及びクエン酸から成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物である。
　上記本発明に係る細胞分化状態の評価方法は、例えば、被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、分化状態が既知である対照細胞の培養上清における指標物質の存在量とを比較することにより、被検細胞の分化状態を評価できる。
　例えば、アルギニン、トリプトファン、４－アミノ安息香酸等の指標物質は、分化細胞の培養上清における存在量が未分化細胞の培養上清における存在量よりも大きくなる傾向がある。そのため、対照細胞として未分化であることが明らかな細胞を使用する場合、アルギニン、トリプトファン、及び４－アミノ安息香酸等の指標物質の、対照細胞の培養上清における存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比が予め定めた閾値以上である場合に、被検細胞は分化状態であると判定できる。
　例えば、オルニチン、アラニン、アスパラギン酸、２－ヒドロキシ酪酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４－ヒドロキシ安息香酸等の指標物質は、分化細胞の培養上清における存在量が未分化細胞の培養上清における存在量よりも小さくなる傾向がある。そのため、対照細胞として未分化であることが明らかな細胞を使用する場合、オルニチン、アラニン、アスパラギン酸、２－ヒドロキシ酪酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４－ヒドロキシ安息香酸等の指標物質の、対照細胞の培養上清における存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定できる。
　本発明の一形態では、２種以上の上記指標物質の存在量に基づいて分化状態の評価が行われる。例えば、２種以上の指標物質のそれぞれについて、被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、対照細胞の培養上清における指標物質の存在量とを比較することにより、分化状態の評価が行われる。２種以上の指標物質のそれぞれについて、被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、対照細胞の培養上清における指標物質の存在量との比を求め、これらの比が予め定めた閾値以上であるか否かに基づいて、分化状態の評価を行ってもよい。対象細胞としては、例えば未分化であることが明らかな細胞が用いられる。
　２種以上の指標物質として、例えば、代謝経路の前後関係にある前駆物質と代謝生成物とを選択でき、被検細胞の培養上清における前駆物質の存在量と代謝生成物との比に基づいて分化状態を評価できる。前駆物質と代謝生成物の組み合わせの例として、トリプトファンとキヌレニンの組み合わせ、オルニチンとプトレシンの組み合わせ、アルギニンとオルニチンの組み合わせ等が挙げられる。
　２種以上の指標物質として、例えば、キヌレニン、２－アミノアジピン酸、オルニチン及びデオキシシチジンを含む組み合わせを採用できる。２種以上の指標物質には、さらに、トリプトファン、シスタチオニン、ヒポキサンチン、及びウリジンが含まれていてもよい。
　２種以上の指標物質の存在量に基づいて分化状態の評価を行うことにより、被検細胞の分化状態をより高精度に評価できる。また、２種以上の指標物質の存在量に基づいて分化状態の評価を行うことにより、被検細胞が分化状態であるか未分化状態であるかの評価に加えて、分化状態であると評価された被検細胞の分化の方向が内胚葉、中胚葉、及び外胚葉のいずれであるかを評価することもできる。
　例えば、被検細胞の培養上清における、キヌレニン、２－アミノアジピン酸、及びデオキシシチジンから成る群から選択される２種以上の指標物質の存在量の培養時間に伴う変化を解析することにより、被検細胞が分化状態であるか未分化状態であるかを評価するとともに、分化状態であると評価された被検細胞の分化の方向が内胚葉、中胚葉、及び外胚葉のいずれであるかを評価できる。
　被検細胞の培養上清における、キヌレニン、オルニチン、２－アミノアジピン酸、デオキシシチジン、トリプトファン、シスタチオニン、ヒポキサンチン、及びウリジンから成る群から選択される２種以上の指標物質の存在量を多変量解析することにより、被検細胞が分化状態であるか未分化状態であるかを評価するとともに、分化状態であると評価された被検細胞の分化の方向が内胚葉、中胚葉、及び外胚葉のいずれであるかを評価できる。
　本発明に係る細胞分化状態の評価方法は、前記幹細胞がＥＳ細胞（Embryonic Stem cells、胚性幹細胞）やｉＰＳ細胞（Induced Pluripotent Stem cells、人工多能性幹細胞）等の多能性幹細胞であってもよい。
　本発明に係る細胞分化状態の評価方法で用いる前記培養上清中の前記指標物質の存在量は、どのような方法を用いて求めてもよく、代表的な方法として液体クロマトグラフィー分析法、質量分析法を挙げることができる。
　上記本発明に係る細胞分化状態の評価方法によれば、従来のように細胞を破壊する必要がなく、非侵襲的に細胞の分化状態を評価することができる。これにより、分化状態の評価後に、被検細胞を再生医療用の細胞源等として利用することが可能となる。また、分化状態の経時的な変化を評価する場合にも、従来のように複数の培養皿で並行して培養を行うといった煩雑な作業を行う必要がなく、同一培養皿中の細胞を対象として容易に時間経過に伴う分化状態の変化を評価することが可能となる。また、培養上清中の２種以上の指標物質の存在量に基づく評価により被検細胞の分化状態をより高精度に評価できる。２種以上の指標物質の存在量に基づく評価により、被検細胞が分化状態であるか未分化状態であるかの評価に加えて、分化状態であると評価された被検細胞の分化の方向性を評価することもできる。
本発明の一実施例における細胞分化状態の評価方法を説明する模式図（その１）。 本発明の一実施例における細胞分化状態の評価方法を説明する模式図（その２）。 実施例において培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた各物質の存在量の経時変化を示すグラフ（その１）。 実施例において培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた各物質の存在量の経時変化を示すグラフ（その２）。 実施例において培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた各物質の存在量の経時変化を示すグラフ（その３）。 実施例において培養上清のＬＣ－ＭＳ分析により求められた各物質の存在量の経時変化を示すグラフ（その４）。 実施例において培養上清のＧＣ－ＭＳ分析により求められた各物質の存在量の経時変化を示すグラフ（その１）。 実施例において培養上清のＧＣ－ＭＳ分析により求められた各物質の存在量の経時変化を示すグラフ（その２）。 実施例において、培養２日目～４日目のサンプルにおける各物質の存在量の主成分分析結果を示すグラフ（その１）。 実施例において、培養２日目～４日目のサンプルにおける各物質の存在量の主成分分析結果を示すグラフ（その２）。
　本発明に係る細胞分化状態の評価方法は、被検細胞の培養上清におけるバイオマーカー（指標物質）の存在量に基づいて該被検細胞の分化状態を評価するものである。
　前記被検細胞としては幹細胞、典型的にはＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を用いることができる。また前記幹細胞より分化誘導を行った細胞も被検細胞として用いることができる。分化状態が未知の幹細胞が被検細胞である場合、本発明の評価方法により、分化状態であるか未分化状態であるかを判定できる。幹細胞より分化誘導を行った細胞が被検細胞である場合、本発明の評価方法により、未分化状態の細胞が混在しているか否かを判定できる。
　被検細胞の培養に用いる培地としては、幹細胞の培養に一般的に使用される培地、例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２や、該ＤＭＥＭ／Ｆ１２を主成分とする培地（例えばｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ－Ｅ８等）を用いることができる。表１にＤＭＥＭ／Ｆ１２の構成成分を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　前記バイオマーカーとしては、オルニチン、２－アミノアジピン酸、デオキシシチジン、グルタミン酸、トリプトファン、アスパラギン、アラニン、シスチン、ヒポキサンチン、ウリジン、アスパラギン酸、アルギニン、２－ヒドロキシ酪酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４－ヒドロキシ安息香酸、４－アミノ安息香酸、リボン酸、キヌレニン、シスタチオニン、トレオン酸、ピルビン酸、プトレシン、アスコルビン酸、リボフラビン、セリン、システイン、オロト酸、及びクエン酸等が挙げられる。
　未分化状態の細胞の培養上清と、分化状態の細胞の培養上清では、これらのバイオマーカーの存在量が異なる。そのため、培養上清におけるこれらのバイマーカーの存在量を測定することにより、細胞が分化状態であるか未分化状態であるかを判定できる。分化状態が既知である対照細胞の培養上清におけるバイオマーカーの存在量を測定し、被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、対照細胞の培養上清における指標物質の存在量とを比較することにより、分化状態を評価してもよい。
　対照細胞は、分化状態が既知であれば未分化細胞でも分化細胞でもよい。分化細胞は分化の進行度合いや分化の方向性の相違等に起因して培養上清におけるバイオマーカーの存在量が変動する場合があるため、未分化細胞を対照細胞とすることが好ましい。被検細胞の培養上清におけるバイオマーカーの存在量と、対照細胞の培養上清におけるバイオマーカーの存在量との比較は、例えば両者の比を求めることにより行われる。この比が所定の閾値（１よりも大きい閾値）以上である場合、あるいは所定の閾値（１よりも小さい閾値）以下である場合に、細胞が分化状態にあると判定することができる。被検細胞の培養上清におけるバイオマーカーの存在量と、対照細胞の培養上清におけるバイオマーカーの存在量との比が所定の閾値と同一の場合は未分化状態であると判定し、閾値を超える場合あるいは閾値未満の場合に、細胞が分化状態にあると判定してもよい。なお、幹細胞より分化誘導を行った細胞が被検細胞である場合、「未分化状態」とは、分化状態の細胞に未分化状態の細胞が混在している場合を含んでいてもよい。
　本発明に係る細胞分化状態の評価方法の好ましい形態では、被検細胞の培養上清における２種以上のバイオマーカーの存在量に基づいて該被検細胞の分化状態を評価する。２種以上のバイオマーカーを組み合わせることにより、分化状態をより高精度で評価できる。また、２種以上のバイオマーカーを組み合わせることにより、細胞の分化状態だけでなく、分化状態にある細胞が内胚葉、中胚葉、及び外胚葉のいずれに分化するか、つまり、分化の方向性を評価することができる。
　２種以上のバイオマーカーは、上記のバイオマーカーから任意に選択できる。上記バイオマーカーの中でも、分化の方向性を評価する上で有用なバイオマーカーとして、キヌレニン、２－アミノアジピン酸、オルニチン、デオキシシチジン、トリプトファン、シスタチオニン、ヒポキサンチン、及びウリジンが挙げられる。これらの中の２種以上のバイオマーカー存在量に基づいて評価を行うことが好ましい。
　２種以上のバイオマーカーの存在量に基づく分化状態の評価方法としては、被検細胞の培養上清におけるそれぞれのバイオマーカーの存在量の培養時間に伴う変化を解析する方法、２種以上のバイオマーカーの存在量を多変量解析する方法、２種の指標物質の存在量の比を求める方法等が挙げられる。これらの手法を組み合わせて評価を行ってもよい。２種のバイオマーカーの存在量に基づく判定は、例えば、第一のバイオマーカーの存在量（あるいは指標値）を横軸、第二のバイオマーカーの存在量（あるいは指標値）を縦軸として、プロットすることにより行ってもよい。３種以上のバイオマーカーの存在量に基づく評価を行う場合は、多変量解析が有用である。
　２種類のバイオマーカーとして、代謝経路の前後関係にある代謝生成物とその前駆物質の組み合わせが挙げられる。代謝生成物と前駆物質の比に基づいて評価を行うことにより、分化の方向性の評価精度が向上する。代謝経路の前駆物質は、代謝生成物に対する代謝物に限定されず、代謝経路の２つ以上前の物質でもよい。前駆物質と代謝生成物の組み合わせとしては、例えばトリプトファンとキヌレニンの組み合わせ、オルニチンとプトレシンの組み合わせ、アルギニンとオルニチンの組み合わせ等が挙げられる。なお、代謝経路の種類は特に限定されず、前駆物質と代謝生成物の組み合わせも上記に限定されない。
　代謝生成物と前駆物質との比を求める場合、被検細胞の培養上清における代謝生成物と前駆物質との比に基づいて評価を行ってもよく、対照細胞の培養上清における代謝生成物の存在量と前駆物質の存在量の比と、被検細胞の培養上清における代謝生成物の存在量と前駆物質の存在量の比とを対比してもよい。また、対照細胞の培養上清における代謝生成物の存在量と被検細胞の培養上清における代謝生成物の存在量の比、及び対照細胞の培養上清における前駆物質の存在量と被検細胞の培養上清における前駆物質の存在量の比を求め、これらを対比することにより評価を行ってもよい。
　培養上清における前記バイオマーカーの存在量を測定する方法としては、質量分析法による定量分析、特に液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ）や、ガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ－ＭＳ）を用いた定量分析を好適に利用することができるが、これに限定されるものではない。例えば、培養上清に所定の前処理を施した試料を溶離液とともに液体クロマトグラフィー（ＬＣ）装置のカラムに流し、カラムにより分離されて溶出する成分を、紫外可視分光検出器や赤外分光検出器等の検出器で検出した結果から、試料中に含まれる前記バイオマーカーの存在量を求めるようにしてもよい。また、前記各バイオマーカーを特異的に発色又は発光させる試薬等を培養上清に添加し、該発色又は発光の強度に基づいてバイオマーカーの存在量を求めるようにしてもよい。
　以下、本発明の方法による細胞の分化状態評価の一実施例について説明する。図１Ａ及び図１Ｂは本実施例による細胞分化状態の評価方法の実施手順を示す模式図である。
　本実施例では、ヒトｉＰＳ細胞株ＰＦＸ#９を使用した。また、ヒトｉＰＳ細胞株に分化誘導刺激を与えたものを被検細胞とし、ヒトｉＰＳ細胞株に分化誘導刺激を与えなかったもの（即ち、未分化状態を維持したもの）を対照細胞とした。以下、本実施例における細胞培養から培養上清の分析までの手順について説明する。
［対照細胞の培養及び培養上清の回収］
　ビトロネクチン－Ｎ（Vitronectin-N、Life Technologies社）コートが施された３枚の培養皿（直径60 mm）に前記ＰＦＸ#９株を植え継いで培養を行った（図１Ａでは簡略化のため培養皿１枚のみを示している）。培地としてはｍＴｅＳＲ１（modified Tenneille Serum Replacer 1、STEMCELL Technologies社）又はＴｅＳＲ－Ｅ８（Tenneille Serum Replacer E8、STEMCELL Technologies社）を使用し、毎日培地の交換を行った。ｍＴｅＳＲ１の構成成分を表２に、ＴｅＳＲ－Ｅ８の構成成分を表３に示す。細胞の植え継ぎ（継代）を行った日を０日目として６日間培養を継続し、各日の培地交換時に培養皿から回収した培養上清を質量分析用サンプルとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［内胚葉分化細胞の培養及び培養上清の回収］
　ビトロネクチン－Ｎコートが施された３枚の培養皿（直径60 mm）に前記ＰＦＸ#９株を植え継いで培養を行った（図１Ａでは簡略化のため培養皿１枚のみを示している）。培地としてはｍＴｅＳＲ１又はＴｅＳＲ－Ｅ８を使用し、毎日培地の交換を行ってコンフルエントに達するまで培養を継続した。継代を行った日を０日目とし、１日目にアクチビン－Ａ（Activin-A、PeproTech社）、Ｗｎｔ３ａ（Wingless-type MMTV integration site family, member 3A、PeproTech社）、ＢＭＰ－４（Bone Morphogenetic Proteins-4、PeproTech社）をそれぞれ終濃度100 ng/mL、40 ng/mL、0.5 ng/mLとなるよう添加した培地に交換した。２日目以降はアクチビン－ＡとＢＭＰ－４をそれぞれ終濃度100 ng/mL、0.5 ng/mLとなるよう添加した培地に交換することにより内胚葉分化誘導刺激を行った。細胞の植え継ぎ（継代）を行った日を０日目として６日間培養を継続し、各日の培地交換時に培養皿から回収した培養上清を質量分析用サンプルとした。
［中胚葉分化細胞の培養及び培養上清の回収］
　ビトロネクチン－Ｎコートが施された３枚の培養皿（直径60 mm）に前記ＰＦＸ#９株を植え継いで培養を行った（図１Ｂでは簡略化のため培養皿１枚のみを示している）。培地としてはｍＴｅＳＲ１又はＴｅＳＲ－Ｅ８を使用し、毎日培地の交換を行ってコンフルエントに達するまで培養を継続した。継代を行った日を０日目とし、１日目以降はＢＭＰ－４を終濃度40 ng/mLとなるよう添加した培地に交換することにより中胚葉分化誘導刺激を行った。細胞の植え継ぎ（継代）を行った日を０日目として６日間培養を継続し、各日の培地交換時に培養皿から回収した培養上清を質量分析用サンプルとした。
［外胚葉分化細胞の培養及び培養上清の回収］
　ビトロネクチン－Ｎコートが施された３枚の培養皿（直径60 mm）に前記ＰＦＸ#９株を植え継いで培養を行った（図１Ｂでは簡略化のため培養皿１枚のみを示している）。培地としてはｍＴｅＳＲ１又はＴｅＳＲ－Ｅ８を使用し、毎日培地の交換を行ってコンフルエントに達するまで培養を継続した。継代を行った日を０日目とし、１日目以降はＳＢ４３１５４２ (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide、和光純薬工業株式会社）及びＮｏｇｇｉｎ（PeproTech社）をそれぞれ終濃度10 μM、500 ng/mLとなるよう添加した培地に交換することにより外胚葉分化誘導刺激を行った。細胞の植え継ぎ（継代）を行った日を０日目として６日間培養を継続し、各日の培地交換時に培養皿から回収した培養上清を質量分析用サンプルとした。
［ＬＣ－ＭＳによる分析］
　前記サンプル100 μLに、内部標準物質として0.5 mMイソプロピルリンゴ酸水溶液を20 μL添加し、混合した後、アセトニトリルを200 μL添加して除蛋白を行った。その後、サンプルを遠心分離（15,000 rpm、室温、15分間）して上清を回収し、超純水（Milli-Q（登録商標）水、メルク株式会社）で10倍希釈してＬＣ－ＭＳ分析に供した。ＬＣ－ＭＳ分析では、島津製作所製の「ＬＣ／ＭＳ／ＭＳメソッドパッケージ　細胞培養プロファイリング」（以下「ＭＰ」と略す）に収録された分析条件に従った。ＭＰは培地に含まれる化合物及び細胞から分泌される代謝物をＬＣ－ＭＳで分析するための分析条件パラメータが集約されたものである。化合物の同定は、ＭＰに登録されている標準品の保持時間とサンプル中の化合物の保持時間との差が±0.3分以内であること、定量イオン、確認イオンの両ピークが検出されていること、強度値が1000以上であることを基準に行った。また、化合物の定量は、サンプル中の各化合物に特徴的なイオン（定量イオン）についてマスクロマトグラムの面積を算出する方法により実施した。
［ＧＣ－ＭＳによる分析］
　前記サンプル100 μLに、内部標準物質として0.5 mg/mLイソプロピルリンゴ酸水溶液を10 μL添加し、混合した後、アセトニトリルを200 μL添加して除蛋白を行った。その後、サンプルを遠心分離（15,000 rpm、室温、15分間）して上清100 μLを回収し、減圧乾燥を行った。各サンプルをメトキシアミン塩酸塩を含むピリジン溶液中でインキュベートすることにより、サンプル中の化合物のメトキシム化を行った。更に、各サンプルにＭＳＴＦＡ（Ｎ－メチル－Ｎ－トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド）を添加してサンプル中の化合物をトリメチルシリル化（誘導体化）した。そして、これらの誘導体化処理を施したサンプルをＧＣ－ＭＳによる分析に供した。
　ＧＣ－ＭＳ分析では、島津製作所製の「Smart Metabolites Database」（以下「ＤＢ」と略す）を使用した。該ＤＢは上述した誘導体化処理と同様の処理を施した種々の標準品をＧＣ－ＭＳで分析したデータが集約されたものである。化合物の同定は、前記ＤＢで設定された保持指標（保持時間を相対化した数値）とサンプル中の誘導体化化合物の保持指標との差が±5以内であるか否か、及び前記データベースで設定された定量イオン及び確認イオンの両者がサンプル中の誘導体化化合物について検出されているか否かを指標に行った。一方、化合物の定量は、前記データベースで設定された条件に従い、サンプル中の各誘導体化化合物に特徴的なイオンについてマスクロマトグラムの面積を算出する方法により実施した。
［データ解析］
　培養１日目から６日目に回収された培養上清について、上記のＬＣ－ＭＳ分析及びＧＣ－ＭＳ分析により求められた各化合物の定量値（面積値）を、前記内部標準物質の定量値（面積値）で除した値（面積比）を算出し、これを培養上清中における各化合物の存在量の指標値とした。未分化維持細胞（対照細胞）、内胚葉分化細胞、中胚葉分化細胞、及び外胚葉分化細胞のそれぞれについて同定された化合物の存在量の指標値を、横軸を培養日数、縦軸を該指標値とする座標系にプロットした。また、培養の経過に伴う存在量の指標値の変化が対照細胞と明確に異なる化合物を選別した。具体的には培養３日目から６日目の間で上記対照細胞における指標値の平均値をＡ、被検細胞における指標値の平均値をＢとしたときに、Ａ／Ｂ、又はＢ／Ａが1.5以上となる化合物を選別した。
　また、培養の初期段階での細胞の状態を評価するための有効な化合物を選定するために、多変量解析を行った。具体的には、培養２日目～４日目のサンプルについて、上記で算出した指標値を多変量解析ソフトウェア（R version 3.1.2）に入力し、主成分分析を行った。その結果に基づき、未分化維持細胞と内胚葉分化細胞、中胚葉分化細胞、外胚葉分化細胞を区別できる化合物の組み合わせを選別した。
[ 結果 ]
　以上により、対照細胞の培養液上清中と分化誘導刺激を行った被検細胞の培養上清中とで、培養の経過に伴う存在量の指標値の変化が明確に異なる化合物を以下の表４～２４に示す。なお、これらの表において、数値に網掛を付けたサンプルは対照細胞の指標値から変化有りと判定されたサンプルを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　表４から、キヌレニン（Kynurenine）は、分化誘導によって被検細胞の培養上清中の存在量が対照細胞の培養上清中の存在量よりも減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中のキヌレニンの存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　表５から、オルニチン（Ornithine）は、分化誘導によって被検細胞の上清中の存在量が対照細胞と比較して減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中のオルニチンの存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　表６から、２-アミノアジピン酸（2-Aminoadipic acid）は、内胚葉及び中胚葉に分化誘導された被検細胞では、上清中の存在量が対照細胞と比較して減少することが分かった。一方、外胚葉に分化誘導された被検細胞では、上清中の存在量は培養３日目～６日目のいずれにおいても対照細胞と比較して増加することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中の２-アミノアジピン酸の存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は内胚葉又は中胚葉に向かって分化すると判定することができ、閾値以上であるときは、被検細胞が外胚葉に向かって分化すると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　表７から、デオキシシチジン（Deoxycytidine）は、内胚葉に分化誘導された被検細胞では、上清中の存在量が対照細胞と比較して減少することが分かった。一方、中胚葉に分化誘導された被検細胞及び外胚葉に分化誘導された被検細胞の一部では、上清中の存在量は対照細胞と比較して増加することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中のデオキシシチジンの存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は内胚葉に向かって分化すると判定することができ、閾値以上であるときは、被検細胞が中胚葉又は外胚葉に向かって分化すると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　表８から、グルタミン酸（Glutamic acid）は、内胚葉に分化誘導された被検細胞の上清中の存在量が対照細胞と比較して増加することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中のグルタミン酸の存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以上である場合に、被検細胞は内胚葉に向かって分化すると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 　表９から、トリプトファン（Tryptophan）は、分化誘導によって、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して増加することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清におけるトリプトファンの存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以上である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 　表１０から、シスタチオニン（Cystathionine）は分化誘導により、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して概ね減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清におけるシスタチオニンの存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 　表１１から、アラニン（Alanine）は分化誘導により、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して概ね減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清におけるアラニンの存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
 　表１２から、シスチン（Cystine）は、内胚葉及び外胚葉に分化誘導された被検細胞では、上清中の存在量が対照細胞と比較して概ね減少することが分かった。一方、中胚葉に分化誘導された被検細胞では、上清中の存在量は対照細胞と比較して概ね増加することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中のシスチンの存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は内胚葉又は外胚葉に向かって分化すると判定することができ、閾値以上であるときは、被検細胞が中胚葉に向かって分化すると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 　表１３から、ヒポキサンチン（Hypoxanthine）は、中胚葉及び外胚葉に分化誘導された被検細胞では、培養５日目までは上清中の存在量が対照細胞と比較して概ね増加することが分かった。従って、ヒポキサンチンについては、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、培養開始から５日目までの間に対照細胞の培養上清中のヒポキサンチンの存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以上である場合に、被検細胞は中胚葉又は外胚葉に向かって分化すると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
 　表１４から、ウリジン（Uridine）は、分化誘導により、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して増加することがわかった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中のウリジンの存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以上である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
 　表１５から、アスパラギン酸（Aspartic acid）は分化誘導により、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清におけるアスパラギン酸の存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
 　表１６から、アルギニン（Arginine）は分化誘導により、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して概ね増加することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清におけるアルギニンの存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以上である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
 　表１７から、２－ヒドロキシ酪酸（2-Hydroxybutyric acid）は分化誘導により、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清における２－ヒドロキシ酪酸の存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
 　表１８から、２－ヒドロキシイソ吉草酸（2-Hydroxyisovaleric acid）は、分化誘導によって被検細胞の上清中の存在量が対照細胞と比較して概ね減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中の２－ヒドロキシイソ吉草酸の存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
 　表１９から、３－ヒドロキシイソ吉草酸（3-Hydroxyisovaleric acid）は分化誘導により、内胚葉及び外胚葉に分化誘導された被検細胞の一部を除いて、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清における３－ヒドロキシイソ吉草酸の存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
 　表２０から、尿素（Urea）は分化誘導により、外胚葉に分化誘導された被検細胞の一部を除いて、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して減少することが分かった。対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清における尿素の存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
 　表２１から、４－ヒドロキシ安息香酸（4-Hydroxybenzoic acid）は分化誘導により、内胚葉に分化誘導された被検細胞の一部、外胚葉に分化誘導された被検細胞の一部を除いて、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清における４－ヒドロキシ安息香酸の存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
 　表２２から、４－アミノ安息香酸（4-Aminobenzoic acid）は分化誘導により、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して増加することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清における４－アミノ安息香酸の存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以上である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
 　表２３から、リボン酸（Ribonic acid）は、中胚葉に分化誘導された被検細胞では、上清中の存在量が対照細胞と比較して減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中のリボン酸の存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は中胚葉に向かって分化すると判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
 　表２４から、クエン酸（Citric acid）は、中胚葉に分化誘導された被検細胞及び内胚葉に分化誘導された被検細胞の一部において、分化誘導によって被検細胞の上清中の存在量が対照細胞と比較して増加することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中のクエン酸の存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は内胚葉又は中胚葉に向かって分化すると判定することができる。
　ｍＴｅＳＲ１株、ＴｅＳＲ－Ｅ８株の培養１日目～６日目の培養上清における前記バイオマーカーの存在量の変化を図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、３Ａ及び３Ｂに示す。なお、図２Ａ～図２ＤはＬＣ－ＭＳ分析による結果であり、図３Ａ及び図３ＢはＧＣ－ＭＳ分析による結果である。これらの図から明らかなように、培養開始直後は被検細胞と対照細胞とで前記バイオマーカーの存在量に違いはないが、多くのバイオマーカーについて、時間が経過するにつれて被検細胞と対照細胞の間でその存在量の差が広がっていくことが確認された。対照細胞と被検細胞との間で存在量の違いが最大となる時期が培養細胞の種類やバイオマーカーの種類によって異なることが確認された。さらに、被検細胞の分化状態（内胚葉分化細胞、中胚葉分化細胞、外胚葉分化細胞）によって、バイオマーカーの存在量に違いがあることも確認された。
　例えば、キヌレニンは、被検細胞よりも対照細胞の方が培養時間の経過とともに培養上清中の存在量が大きく増加する。２-アミノアジピン酸は、内胚葉分化細胞及び中胚葉分化細胞では、培養上清中の存在量はほとんど変化しないが、対照細胞及び外胚葉分化細胞において培養上清中の存在量に変化（増加）が見られ、特に外胚葉分化細胞において大きな変化が見られる。デオキシシチジンは、播種後、全ての細胞において培養上清中の存在量の変化（増加）が見られるが、内胚葉に分化誘導刺激を行った細胞では、培養上清中の存在量が培養時間の経過とともに大きく減少する。従って、このような、培養上清中の存在量の変化に関するバイオマーカー毎の特徴を利用することにより、被検細胞が分化状態にあるか非分化状態にあるかの判定とともに、分化状態にあると判定された被検細胞の分化の方向性（内胚葉、中胚葉、外胚葉）を評価することができる。１種のバイオマーカーのみに基づく評価では、内胚葉分化、中胚葉分化及び外胚葉分化の全てについて評価を行うことは困難であるが、２種以上のバイオマーカーの存在量に基づいて判定を行えば、分化の方向性をより正確に評価できる。
　ｍＴｅＳＲ１株の培養２日目～４日目の培養上清におけるキヌレニン、２－アミノアジピン酸、オルニチン、デオキシシチジン、トリプトファン、シスタチオニン、ヒポキサンチン、及びウリジンの存在量を主成分分析した結果を図４Ａに示す。この図から、培養３日目で未分化状態（対照細胞）と内胚葉分化細胞、中胚葉分化細胞及び外胚葉分化細胞をそれぞれ明確に区別することができることが分かった。
　また、ＴｅＳＲ－Ｅ８株の培養２日目～４日目の培養上清における前記バイオマーカーの存在量を主成分分析した結果を図４Ｂに示す。この図から、培養４日目で未分化状態（対照細胞）と内胚葉分化細胞、中胚葉分化細胞及び外胚葉分化細胞をそれぞれ明確に区別することができることが分かった。
　すなわち、図４Ａ及び図４Ｂに示すように、培養上清における２種類以上のバイオマーカーの存在量を指標とすることにより、被検細胞が分化状態にあるか非分化状態にあるかの判定とともに、被検細胞の分化の方向性（内胚葉、中胚葉、外胚葉）を評価できることが分かった。
［他の試験方法との対比］
　培養上清におけるバイオマーカーの存在量の分析と他の試験方法による分析との整合を確認するために、細胞破壊的検査による分析を行った。
　上記の「対象細胞の培養」、「内胚葉分化細胞の培養」、「中胚葉分化細胞の培養」、及び「外胚葉分化細胞の培養」と同様に、培地としてｍＴｅＳＲ１又はＴｅＳＲ－Ｅ８を使用して、細胞の培養及び分化誘導刺激を行い、継代を行った日を０日目として、４日後及び７日後に細胞を採取した。
　TaqMan HPSC Scorecard Panel （アプライドバイオシステムズ社）により、採取した細胞のｍＲＮＡを抽出して９６種類の遺伝子発現レベルを定量ＰＣＲにより評価し、その結果を基に各胚葉系への分化度合のスコアを算出した。ｍＴｅＳＲ１株の解析スコアを表２５、ＴｅＳＲ－Ｅ８株の解析スコアを表２６に示す。これらの表において、数値に網掛を付けたサンプルは解析スコアが０．５以上であり、特定の方向に細胞が分化していることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　表２５及び表２６の結果から、「対象細胞の培養」（分化誘導刺激なし）では特定方向への分化はみられず、「内胚葉分化細胞の培養」（アクチビン－Ａ、Ｗｎｔ３ａ、及びＢＭＰ－４による分化誘導刺激）では内胚葉分化が進行しており、「中胚葉分化細胞の培養」（ＢＭＰ－４による分化誘導刺激）では中胚葉分化が進行しており、「外胚葉分化細胞の培養」（Ｂ４３１５４２及びＮｏｇｇｉｎによる分化誘導刺激）では外胚葉分化が進行していることが分かる。
　これらの結果から、培養上清におけるバイオマーカーの存在量を指標とする評価手法は、従来の細胞破壊的な手法を再現可能であり、同一培養皿中の細胞を対象として時間経過に伴う分化状態の変化を評価することが可能な優れた手法であるといえる。
［代謝経路の前後関係にある化合物の比に基づくデータ解析］
　培養１日目から６日目に回収された培養上清について、ＬＣ－ＭＳ分析により求められた各化合物の存在量の指標値を算出した。対照細胞（未分化維持細胞）、被検細胞（内胚葉分化細胞、中胚葉分化細胞、及び外胚葉分化細胞）のそれぞれの培養上清のキヌレニン（Kynurenine）、トリプトファン（Tryptophan）、オルニチン（Ornithine）、アルギニン（Arginine）及びプトレシン（Putrescine）の指標値から、被検細胞における指標値の平均値Ｂを対照細胞における指標値の平均値Ａで除した値Ａ／Ｂを算出した。
（キヌレニン／トリプトファン）
　代謝生成物としてのキヌレニンのＡ／Ｂの値とともに、キヌレニンのＡ／Ｂを、キヌレニン経路の前駆物質であるトリプトファンのＡ／Ｂで除した値を表２７及び表２８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　表４に示したように、キヌレニンは分化誘導によって被検細胞の培養上清中の存在量（Ｂ）が対照細胞の培養上清中の存在量（Ａ）よりも減少し、単独でも被検細胞が分化状態であるか否かを判定できる（前述のように、表の値が１から離れるほど対照細胞からの変化が大きいことを表している）。一方、表２７（ｍＴｅＳＲ１）及び表２８（ＴｅＳＲ－Ｅ８）に示すように、キヌレニンとその前駆物質であるトリプトファンの比は、キヌレニン単独の場合よりも対照細胞との差が大きく、培養日数の経過とともにその傾向が顕著となることが分かる。
　これらの結果を、細胞破壊的な手法による評価結果である表２５，２６と比べると、被検細胞の培養上清中の存在量を評価する方法では、分化誘導刺激開始後の経過日数が少ない段階で、対象細胞と被検細胞との間に有意な差が表れていることが分かる。また、キヌレニンを単独で指標とするよりも、キヌレニンとトリプトファンの比を用いた場合には、対照細胞との差がより顕著となる傾向があることから、被検細胞の分化状態をより高精度に評価できることが分かる。
（オルニチン／アルギニン）
　代謝生成物としてのオルニチンのＡ／Ｂの値とともに、オルニチンのＡ／Ｂを、オルニチン回路（尿素回路）の前駆物質であるアルギニンのＡ／Ｂで除した値を表２９及び表３０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　表５に示したように、オルニチンは分化誘導によって被検細胞の培養上清中の存在量（Ｂ）が対照細胞の培養上清中の存在量（Ａ）よりも減少し、単独でも被検細胞が分化状態であるか否かを判定できる。一方、表２９（ｍＴｅＳＲ１）及び表３０（ＴｅＳＲ－Ｅ８）に示すように、内胚葉分化細胞及び中胚葉分化細胞については、オルニチンとその前駆物質であるアルギニンの比は、オルニチン単独の場合よりも対照細胞との差が大きく、培養日数の経過とともにその傾向が顕著となることが分かる。これらの結果から、オルニチンを単独で指標とするよりも、オルニチンとアルギニンの比を用いることにより、被検細胞の分化状態をより高精度に評価できることが分かる。
（プトレシン／オルニチン）
　代謝生成物としてのプトレシンのＡ／Ｂの値とともに、プトレシンのＡ／Ｂを、アルギニン／プロリン代謝の前駆物質であるオルニチンのＡ／Ｂで除した値を表３１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　ｍＴｅＳＲ１培地を用いた場合、プトレシンは、分化誘導によって被検細胞の培養上清中の存在量（Ｂ）が対照細胞の培養上清中の存在量（Ａ）よりも増加する傾向がみられ、特に内胚葉分化細胞及び外胚葉分化細胞については、培養日数の経過とともにその傾向が顕著となることから、プトレシン単独で被検細胞が分化状態であるか否かを判定できる。中内胚葉分化細胞については、プトレシン単独では明確な傾向がみられなかった。これに対して、プトレシンとその前駆物質であるオルニチンの比を用いることにより、培養日数の経過とともに対照細胞との差が大きくなっており、中胚葉分化細胞に関しても分化状態であることを判定できる。内胚葉分化細胞及び外胚葉分化細胞については、プトレシン単独よりも、プトレシンとその前駆物質であるオルニチンの比を用いる方が対照細胞との差が大きく、被検細胞の分化状態をより高精度に評価できることが分かる。

 

Claims (20)

  1. 　分化状態が未知の幹細胞あるいは幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞として、該被検細胞の分化状態を評価する方法であって、
    　被検細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップ、及び前記指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞の分化状態を評価するステップを有し、
    　前記指標物質が、オルニチン、２－アミノアジピン酸、デオキシシチジン、グルタミン酸、トリプトファン、アスパラギン、アラニン、シスチン、ヒポキサンチン、ウリジン、アスパラギン酸、アルギニン、２－ヒドロキシ酪酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４－ヒドロキシ安息香酸、４－アミノ安息香酸、リボン酸、キヌレニン、シスタチオニン、トレオン酸、ピルビン酸、プトレシン、アスコルビン酸、リボフラビン、セリン、システイン、オロト酸、及びクエン酸から成る群から選択される２種以上であり、
    　２種以上の指標物質の存在量に基づいて前記分化状態の評価が行われる、細胞分化状態の評価方法。
  2. 　分化状態が既知である対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップをさらに有し、
    　前記２種以上の指標物質のそれぞれについて、前記被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量とを比較することにより、前記分化状態の評価が行われる、請求項１に記載の細胞分化状態の評価方法。
  3. 　前記２種以上の指標物質のそれぞれについて、前記被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量との比が予め定めた閾値以上であるか否か又は閾値以下であるか否かに基づいて、前記分化状態の評価が行われる、請求項２に記載の細胞分化状態の評価方法。
  4. 　前記対照細胞として未分化であることが明らかな細胞を使用する、請求項２または３に記載の細胞分化状態の評価方法。
  5. 　前記分化状態の評価において、分化状態であるか未分化状態であるかを評価するとともに、分化状態であると評価された被検細胞の分化の方向が内胚葉、中胚葉、及び外胚葉のいずれであるかを評価することを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞分化状態の評価方法。
  6. 　前記２種以上の指標物質のそれぞれについて、前記被検細胞の培養上清における指標物質の存在量の培養時間に伴う変化を解析することにより、前記評価が行われる、請求項５に記載の細胞分化状態の評価方法。
  7. 　前記２種以上の指標物質の存在量を多変量解析することにより、前記評価が行われる、請求項５または６に記載の細胞分化状態の評価方法。
  8. 　前記２種以上の指標物質として、キヌレニン、２－アミノアジピン酸、オルニチン、及びデオキシシチジンからなる群から選択される２種以上を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞分化状態の評価方法。
  9. 　前記２種以上の指標物質として、キヌレニン、２－アミノアジピン酸、オルニチン、デオキシシチジン、トリプトファン、シスタチオニン、ヒポキサンチン、及びウリジンからなる群から選択される２種以上を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞分化状態の評価方法。
  10. 　前記２種以上の指標物質が、代謝経路の前後関係にある前駆物質と代謝生成物とを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞分化状態の評価方法。
  11. 　前記前駆物質がトリプトファンであり、前記代謝生成物がキヌレニンである、請求項１０に記載の細胞分化状態の評価方法。
  12. 　前記前駆物質がオルニチンであり、前記代謝生成物がプトレシンである、請求項１０に記載の細胞分化状態の評価方法。
  13. 　前記前駆物質がアルギニンであり、前記代謝生成物がオルニチンである、請求項１０に記載の細胞分化状態の評価方法。
  14. 　前記被検細胞の培養上清における前記前駆物質の存在量と前記代謝生成物との比に基づいて前記評価が行われる、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の細胞分化状態の評価方法。
  15. 　分化状態が未知の幹細胞あるいは幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞として、該被検細胞の分化状態を評価する方法であって、
    　被検細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップ、及び前記指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞の分化状態を評価するステップを有し、
    　前記指標物質が、オルニチン、２－アミノアジピン酸、デオキシシチジン、グルタミン酸、トリプトファン、アスパラギン、アラニン、シスチン、ヒポキサンチン、ウリジン、アスパラギン酸、アルギニン、２－ヒドロキシ酪酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、３－ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４－ヒドロキシ安息香酸、４－アミノ安息香酸、及びリボン酸から成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物であることを特徴とする細胞分化状態の評価方法。
  16. 　前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量と、分化状態が既知である対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量とを比較することにより、前記被検細胞の分化状態を評価することを特徴とする請求項１５に記載の細胞分化状態の評価方法。
  17. 　前記対照細胞として未分化であることが明らかな細胞を使用し、アルギニン、トリプトファン、及び４－アミノ安息香酸から成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物の、前記対照細胞の培養上清における存在量に対する前記被検細胞の培養上清における存在量の比が予め定めた閾値以上である場合に、前記被検細胞が分化状態であると判定することを特徴とする請求項１６に記載の細胞分化状態の評価方法。
  18. 　前記対照細胞として未分化であることが明らかな細胞を使用し、オルニチン、アラニン、アスパラギン酸、２－ヒドロキシ酪酸、２－ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４－ヒドロキシ安息香酸から成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物の、前記対照細胞の培養上清における存在量に対する前記被検細胞の培養上清における存在量の比が予め定めた閾値以下である場合に、前記被検細胞が分化状態であると判定することを特徴とする請求項１６に記載の細胞分化状態の評価方法。
  19. 　前記幹細胞が多能性幹細胞であることを特徴とする請求項１～１８のいずれか１項に記載の細胞分化状態の評価方法。
  20. 　請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法による被検細胞の分化状態の評価結果に基づいて、前記被検細胞を選別する工程を含む、細胞の培養方法。

     
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