JP6748654B2 - 細胞の分化状態の評価方法 - Google Patents
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Description
ビトロネクチン−N(Vitronectin-N、Life Technologies社)コートが施された3枚の培養皿(直径60 mm)に前記PFX#9株を植え継いで培養を行った(図1Aでは簡略化のため培養皿1枚のみを示している)。培地としてはmTeSR1(modified Tenneille Serum Replacer 1、STEMCELL Technologies社)又はTeSR−E8(Tenneille Serum Replacer E8、STEMCELL Technologies社)を使用し、毎日培地の交換を行った。mTeSR1の構成成分を表2に、TeSR−E8の構成成分を表3に示す。細胞の植え継ぎ(継代)を行った日を0日目として6日間培養を継続し、各日の培地交換時に培養皿から回収した培養上清を質量分析用サンプルとした。
ビトロネクチン−Nコートが施された3枚の培養皿(直径60 mm)に前記PFX#9株を植え継いで培養を行った(図1Aでは簡略化のため培養皿1枚のみを示している)。培地としてはmTeSR1又はTeSR−E8を使用し、毎日培地の交換を行ってコンフルエントに達するまで培養を継続した。継代を行った日を0日目とし、1日目にアクチビン−A(Activin-A、PeproTech社)、Wnt3a(Wingless-type MMTV integration site family, member 3A、PeproTech社)、BMP−4(Bone Morphogenetic Proteins-4、PeproTech社)をそれぞれ終濃度100 ng/mL、40 ng/mL、0.5 ng/mLとなるよう添加した培地に交換した。2日目以降はアクチビン−AとBMP−4をそれぞれ終濃度100 ng/mL、0.5 ng/mLとなるよう添加した培地に交換することにより内胚葉分化誘導刺激を行った。細胞の植え継ぎ(継代)を行った日を0日目として6日間培養を継続し、各日の培地交換時に培養皿から回収した培養上清を質量分析用サンプルとした。
ビトロネクチン−Nコートが施された3枚の培養皿(直径60 mm)に前記PFX#9株を植え継いで培養を行った(図1Bでは簡略化のため培養皿1枚のみを示している)。培地としてはmTeSR1又はTeSR−E8を使用し、毎日培地の交換を行ってコンフルエントに達するまで培養を継続した。継代を行った日を0日目とし、1日目以降はBMP−4を終濃度40 ng/mLとなるよう添加した培地に交換することにより中胚葉分化誘導刺激を行った。細胞の植え継ぎ(継代)を行った日を0日目として6日間培養を継続し、各日の培地交換時に培養皿から回収した培養上清を質量分析用サンプルとした。
ビトロネクチン−Nコートが施された3枚の培養皿(直径60 mm)に前記PFX#9株を植え継いで培養を行った(図1Bでは簡略化のため培養皿1枚のみを示している)。培地としてはmTeSR1又はTeSR−E8を使用し、毎日培地の交換を行ってコンフルエントに達するまで培養を継続した。継代を行った日を0日目とし、1日目以降はSB431542 (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide、和光純薬工業株式会社)及びNoggin(PeproTech社)をそれぞれ終濃度10 μM、500 ng/mLとなるよう添加した培地に交換することにより外胚葉分化誘導刺激を行った。細胞の植え継ぎ(継代)を行った日を0日目として6日間培養を継続し、各日の培地交換時に培養皿から回収した培養上清を質量分析用サンプルとした。
前記サンプル100 μLに、内部標準物質として0.5 mMイソプロピルリンゴ酸水溶液を20 μL添加し、混合した後、アセトニトリルを200 μL添加して除蛋白を行った。その後、サンプルを遠心分離(15,000 rpm、室温、15分間)して上清を回収し、超純水(Milli-Q(登録商標)水、メルク株式会社)で10倍希釈してLC−MS分析に供した。LC−MS分析では、島津製作所製の「LC/MS/MSメソッドパッケージ 細胞培養プロファイリング」(以下「MP」と略す)に収録された分析条件に従った。MPは培地に含まれる化合物及び細胞から分泌される代謝物をLC−MSで分析するための分析条件パラメータが集約されたものである。化合物の同定は、MPに登録されている標準品の保持時間とサンプル中の化合物の保持時間との差が±0.3分以内であること、定量イオン、確認イオンの両ピークが検出されていること、強度値が1000以上であることを基準に行った。また、化合物の定量は、サンプル中の各化合物に特徴的なイオン(定量イオン)についてマスクロマトグラムの面積を算出する方法により実施した。
前記サンプル100 μLに、内部標準物質として0.5 mg/mLイソプロピルリンゴ酸水溶液を10 μL添加し、混合した後、アセトニトリルを200 μL添加して除蛋白を行った。その後、サンプルを遠心分離(15,000 rpm、室温、15分間)して上清100 μLを回収し、減圧乾燥を行った。各サンプルをメトキシアミン塩酸塩を含むピリジン溶液中でインキュベートすることにより、サンプル中の化合物のメトキシム化を行った。更に、各サンプルにMSTFA(N−メチル−N−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド)を添加してサンプル中の化合物をトリメチルシリル化(誘導体化)した。そして、これらの誘導体化処理を施したサンプルをGC−MSによる分析に供した。
培養1日目から6日目に回収された培養上清について、上記のLC−MS分析及びGC−MS分析により求められた各化合物の定量値(面積値)を、前記内部標準物質の定量値(面積値)で除した値(面積比)を算出し、これを培養上清中における各化合物の存在量の指標値とした。未分化維持細胞(対照細胞)、内胚葉分化細胞、中胚葉分化細胞、及び外胚葉分化細胞のそれぞれについて同定された化合物の存在量の指標値を、横軸を培養日数、縦軸を該指標値とする座標系にプロットした。また、培養の経過に伴う存在量の指標値の変化が対照細胞と明確に異なる化合物を選別した。具体的には培養3日目から6日目の間で上記対照細胞における指標値の平均値をA、被検細胞における指標値の平均値をBとしたときに、A/B、又はB/Aが1.5以上となる化合物を選別した。
以上により、対照細胞の培養液上清中と分化誘導刺激を行った被検細胞の培養上清中とで、培養の経過に伴う存在量の指標値の変化が明確に異なる化合物を以下の表4〜24に示す。なお、これらの表において、数値に網掛を付けたサンプルは対照細胞の指標値から変化有りと判定されたサンプルを示す。
培養上清におけるバイオマーカーの存在量の分析と他の試験方法による分析との整合を確認するために、細胞破壊的検査による分析を行った。
培養1日目から6日目に回収された培養上清について、LC−MS分析により求められた各化合物の存在量の指標値を算出した。対照細胞(未分化維持細胞)、被検細胞(内胚葉分化細胞、中胚葉分化細胞、及び外胚葉分化細胞)のそれぞれの培養上清のキヌレニン(Kynurenine)、トリプトファン(Tryptophan)、オルニチン(Ornithine)、アルギニン(Arginine)及びプトレシン(Putrescine)の指標値から、被検細胞における指標値の平均値Bを対照細胞における指標値の平均値Aで除した値B/Aを算出した。
代謝生成物としてのキヌレニンのB/Aの値とともに、キヌレニンのB/Aを、キヌレニン経路の前駆物質であるトリプトファンのB/Aで除した値を表27及び表28に示す。
代謝生成物としてのオルニチンのB/Aの値とともに、オルニチンのB/Aを、オルニチン回路(尿素回路)の前駆物質であるアルギニンのB/Aで除した値を表29及び表30に示す。
代謝生成物としてのプトレシンのB/Aの値とともに、プトレシンのB/Aを、アルギニン/プロリン代謝の前駆物質であるオルニチンのB/Aで除した値を表31に示す。
Claims (10)
- 細胞分化状態の評価方法であって、
分化状態が未知の幹細胞あるいは多能性幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞とし、分化状態が既知である多能性幹細胞を対照細胞として、
前記被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量とを比較することにより、前記被検細胞の分化状態を評価し、
前記指標物質が、オルニチン、2−アミノアジピン酸、デオキシシチジン、トリプトファン、ヒポキサンチン、ウリジン、及びキヌレニンから成る群から選択される2種以上であり、
前記被検細胞および前記対照細胞は、同一種類の培地で培養される、細胞分化状態の評価方法。 - 前記被検細胞および前記対照細胞は、同一細胞株由来である、請求項1に記載の細胞分化状態の評価方法。
- 前記2種以上の指標物質のそれぞれについて、前記被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量との比が予め定めた閾値以上であるか否か又は閾値以下であるか否かに基づいて、前記分化状態の評価が行われる、請求項1又は2に記載の細胞分化状態の評価方法。
- 前記対照細胞として未分化であることが明らかな細胞を使用する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の細胞分化状態の評価方法。
- 細胞分化状態の評価方法であって、
分化状態が未知の幹細胞あるいは多能性幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞とし、分化状態が既知である多能性幹細胞を対照細胞として、
前記被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量とを比較することにより、前記被検細胞の分化状態を評価し、
前記指標物質が、オルニチン、2−アミノアジピン酸、デオキシシチジン、トリプトファン、アラニン、ヒポキサンチン、ウリジン、及びアルギニンから成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物であり、
前記被検細胞および前記対照細胞は、同一種類の培地で培養されていることを特徴とする細胞分化状態の評価方法。 - 前記被検細胞および前記対照細胞は、同一細胞株由来である、請求項5に記載の細胞分化状態の評価方法。
- 前記指標物質のそれぞれについて、前記被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量との比が予め定めた閾値以上であるか否か又は閾値以下であるか否かに基づいて、前記分化状態の評価が行われる、請求項5又は6に記載の細胞分化状態の評価方法。
- 前記対照細胞として未分化であることが明らかな細胞を使用する、請求項7に記載の細胞分化状態の評価方法。
- 前記指標物質のうち、アルギニン及びトリプトファンから成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物の、前記対照細胞の培養上清における存在量に対する前記被検細胞の培養上清における存在量の比が予め定めた閾値以下である場合に、前記分化状態が未知の幹細胞は未分化状態である、又は前記幹細胞より分化誘導を行った細胞には未分化状態の細胞が混在していると判定することを特徴とする請求項8に記載の細胞分化状態の評価方法。
- 前記指標物質のうち、オルニチン及びアラニンから成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物の、前記対照細胞の培養上清における存在量に対する前記被検細胞の培養上清における存在量の比が予め定めた閾値以上である場合に、前記分化状態が未知の幹細胞は未分化状態である、又は前記幹細胞より分化誘導を行った細胞には未分化状態の細胞が混在していると判定することを特徴とする請求項8に記載の細胞分化状態の評価方法。
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