CN108350480B - 细胞的分化状态的评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种细胞分化状态的评价方法，将分化状态未知的干细胞或由干细胞进行了分化诱导的细胞作为被检细胞，基于该被检细胞的培养上清中的指示物质的存在量来评价该被检细胞的分化状态。所述指示物质是选自由鸟氨酸、2‑氨基己二酸、脱氧胞苷、谷氨酸、色氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、胱氨酸、次黄嘌呤、尿苷、天冬氨酸、精氨酸、2‑羟基丁酸、2‑羟基异戊酸、3‑羟基异戊酸、尿素、4‑羟基苯甲酸、4‑氨基苯甲酸、核糖酸、犬尿素、胱硫醚、苏糖酸、丙酮酸、腐胺、抗坏血酸、核黄素、丝氨酸、半胱氨酸、乳清酸和柠檬酸组成的组中的至少一种化合物。本发明的一个方式中，基于两种以上指示物质的存在量来进行分化状态的评价。

Description

细胞的分化状态的评价方法
技术领域
本发明涉及用于评价细胞的分化状态的方法。
背景技术
以往，为了评价细胞的分化状态，广泛使用利用免疫染色的方法(例如参见专利文献1)、对标记基因(marker gene)的表达水平进行定量的方法(例如参见专利文献2)。
利用了免疫染色的方法中，首先在用多聚甲醛等对作为评价对象的细胞例如多能干细胞进行固定化的基础上进行抗原-抗体反应。在此，作为用于判定多能干细胞是否为未分化状态的抗体广泛使用SSEA-4、TRA1-60(例如参见专利文献1)。接着，向细胞中添加与前述抗体结合的二次抗体，之后检测出预先对前述二次抗体赋予的荧光标记等。由此能够评价在细胞上是否存在相对于前述抗体的抗原、即该细胞是否为未分化状态。
另外，在利用对标记基因的表达水平进行定量的方法中，例如从多能干细胞中提取mRNA，通过逆转录酶将其转变为cDNA后，利用PCR(Polymerase Chain Reaction、聚合酶链反应)扩增标记基因。此时，作为用于评价多能干细胞的未分化性的标记基因，广泛使用NANOG、POU5F1(OCT3/4)(例如参见非专利文献1)。通过用电泳、实时PCR装置对该PCR产物进行检测从而确认前述细胞中的标记基因的表达量，基于该结果来评价该细胞是否为未分化状态。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2004-313184号公报
专利文献2:日本特开2006-042663号公报
非专利文献
非专利文献1：《自然·生物技术》(Nature Biotechnology),2007,第25巻,pp.803-816
发明内容
发明要解决的问题
然而，上述以往的评价方法中均需对细胞进行侵入性的处理。因此，在进行分化状态的评价之后无法将用于该评价的细胞应用于例如作为再生医疗用的细胞源的其它目的。另外，对于同一样品(即同一培养皿中的细胞)不能评价随时间经过的变化，在评价分化状态的经时性变化时需要用多个培养皿进行并行培养等繁琐的操作。
本发明是鉴于上述问题而完成的，其目的在于：提供非侵入性地评价细胞的分化状态的方法。
用于解决问题的方案
本发明人进行了深入广泛的研究，其结果发现根据细胞的分化状态不同，培养上清液中的指示物质的存在量不同，从而完成了本发明。
本发明的细胞分化状态的评价方法中，将分化状态未知的干细胞或由干细胞进行了分化诱导的细胞作为被检细胞，基于该被检细胞的培养上清中的规定指示物质的存在量来评价该被检细胞的分化状态。即，本发明的细胞分化状态的评价方法具有：测定被检细胞的培养上清中的指示物质的存在量的步骤；以及、基于指示物质的存在量评价被检细胞的分化状态的步骤。
所述指示物质是选自由鸟氨酸、2-氨基己二酸、脱氧胞苷、谷氨酸、色氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、胱氨酸、次黄嘌呤、尿苷、天冬氨酸、精氨酸、2-羟基丁酸、2-羟基异戊酸、3-羟基异戊酸、尿素、4-羟基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、核糖酸、犬尿素、胱硫醚、苏糖酸、丙酮酸、腐胺、抗坏血酸、核黄素、丝氨酸、半胱氨酸、乳清酸和柠檬酸组成的组中的至少一种化合物。
上述本发明的细胞分化状态的评价方法通过例如将被检细胞的培养上清中的指示物质的存在量与分化状态已知的对照细胞的培养上清中的指示物质的存在量进行比较，从而能够对被检细胞的分化状态进行评价。
例如，精氨酸、色氨酸、4-氨基苯甲酸等指示物质有如下倾向：分化细胞的培养上清中的存在量大于未分化细胞的培养上清中的存在量。因此，作为对照细胞使用明显未分化的细胞时，精氨酸、色氨酸和4-氨基苯甲酸等指示物质的、被检细胞的培养上清中的存在量相对于对照细胞的培养上清中的存在量的比为预定的阈值以上时，判定被检细胞为分化状态。
例如，鸟氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、2-羟基丁酸、2-羟基异戊酸、尿素、4-羟基苯甲酸等指示物质有如下倾向：分化细胞的培养上清中的存在量小于未分化细胞的培养上清中的存在量。因此，作为对照细胞使用明显未分化的细胞时，鸟氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、2-羟基丁酸、2-羟基异戊酸、尿素、4-羟基苯甲酸等指示物质的、被检细胞的培养上清中的存在量相对于对照细胞的培养上清中的存在量的比为预定的阈值以下时，判定被检细胞为分化状态。
本发明的一个方式中，基于两种以上上述指示物质的存在量来进行分化状态的评价。例如，分别对于两种以上指示物质，将被检细胞的培养上清中的指示物质的存在量与对照细胞的培养上清中的指示物质的存在量进行比较，从而进行分化状态的评价。也可以例如，分别对于两种以上指示物质，求出被检细胞的培养上清中的指示物质的存在量与对照细胞的培养上清中的指示物质的存在量的比，基于该比是否在预定的阈值以上来进行分化状态的评价。作为对照细胞，可以使用例如明显未分化的细胞。
作为两种以上指示物质，可以选择例如在代谢途径中具有前后关系的前体物质和代谢产物，基于被检细胞的培养上清中的前体物质的存在量与代谢产物的比来评价分化状态。作为前体物质与代谢产物组合的例子，可列举出色氨酸与犬尿素的组合、鸟氨酸与腐胺的组合、精氨酸与鸟氨酸的组合等。
作为两种以上指示物质，可以采用包含例如犬尿素、2-氨基己二酸、鸟氨酸和脱氧胞苷的组合。两种以上指示物质中也可以进一步包含色氨酸、胱硫醚、次黄嘌呤和尿苷。
通过基于两种以上指示物质的存在量进行分化状态的评价，能够更高精度地评价被检细胞的分化状态。另外，通过基于两种以上指示物质的存在量进行分化状态的评价，在对于被检细胞是分化状态还是未分化状态进行评价的基础上，对于被评价为是分化状态的被检细胞也可以评价分化的方向是内胚层、中胚层和外胚层中的任一者。
通过例如对于被检细胞的培养上清中的、选自由犬尿素、2-氨基己二酸和脱氧胞苷组成的组中的两种以上指示物质的存在量伴随着培养时间的变化进行分析，对于被检细胞是分化状态还是未分化状态进行评价，并且对于被评价为是分化状态的被检细胞也可以评价分化的方向是内胚层、中胚层和外胚层中的任一者。
对于被检细胞的培养上清中的、选自由犬尿素、鸟氨酸、2-氨基己二酸、脱氧胞苷、色氨酸、胱硫醚、次黄嘌呤和尿苷组成的组中的两种以上指示物质的存在量进行多变量分析，从而对于被检细胞是分化状态还是未分化状态进行评价，并且对于被评价为是分化状态的被检细胞也可以评价分化的方向是内胚层、中胚层和外胚层中的任一者。
本发明的细胞分化状态的评价方法中，所述干细胞可以是ES细胞(EmbryonicStem cells、胚性干细胞)、iPS细胞(Induced Pluripotent Stem cells、人工多能干细胞)等多能干细胞。
本发明的细胞分化状态的评价方法中所使用的所述培养上清中的所述指示物质的存在量无论使用何种方法求出都可以，作为代表的方法，可列举出液相色谱分析法、质谱分析法。
发明的效果
通过上述本发明的细胞分化状态的评价方法，不需要像现有技术那样对细胞进行破坏，而可以非侵袭地对细胞的分化状态进行评价。由此，在分化状态的评价之后，也可以将被检细胞作为再生医疗用的细胞源等加以利用。另外，对于分化状态的经时变化进行评价时，也不需要像现有技术那样进行用多个培养皿平行地进行培养这样复杂的操作，而是以同一培养皿中的细胞作为对象从而能够容易地评价伴随着时间经过的分化状态的变化。另外，通过基于培养上清中的两种以上指示物质的存在量进行评价，能够更高精度地评价被检细胞的分化状态。通过基于两种以上指示物质的存在量进行评价，在对于被检细胞是分化状态还是未分化状态进行评价的基础上，也可以对于被评价为是分化状态的被检细胞的分化方向性进行评价。
附图说明
图1A是对本发明一实施例中的细胞分化状态的评价方法进行说明的示意图(其1)。
图1B是对本发明一实施例中的细胞分化状态的评价方法进行说明的示意图(其2)。
图2A是表示实施例中培养上清的通过LC-MS分析而求出的各物质存在量的经时变化的曲线图(其1)。
图2B是表示实施例中培养上清的通过LC-MS分析而求出的各物质存在量的经时变化的曲线图(其2)。
图2C是表示实施例中培养上清的通过LC-MS分析而求出的各物质存在量的经时变化的曲线图(其3)。
图2D是表示实施例中培养上清的通过LC-MS分析而求出的各物质存在量的经时变化的曲线图(其4)。
图3A是表示实施例中培养上清的通过GC-MS分析而求出的各物质存在量的经时变化的曲线图(其1)。
图3B是表示实施例中培养上清的通过GC-MS分析而求出的各物质存在量的经时变化的曲线图(其2)。
图4A是表示实施例中培养第2天～第4天的样品中的各物质存在量的主要成分分析结果的曲线图(其1)。
图4B是表示实施例中培养第2天～第4天的样品中的各物质存在量的主要成分分析结果的曲线图(其2)。
具体实施方式
本发明的细胞分化状态的评价方法基于被检细胞的培养上清中的生物标志物(指示物质)的存在量对该被检细胞的分化状态进行评价。
作为所述被检细胞，可以使用干细胞、典型地使用ES细胞、iPS细胞等多能干细胞。另外，也可以使用由所述干细胞进行了分化诱导的细胞作为被检细胞。分化状态未知的干细胞为被检细胞时，根据本发明的评价方法，能够判定是分化状态还是未分化状态。由干细胞进行了分化诱导得到的细胞作为被检细胞时，通过本发明的评价方法，能够判定是否混合存在有未分化状态的细胞。
作为被检细胞的培养中使用的培养基，可以使用干细胞的培养中通常使用的培养基例如DMEM/F12、以该DMEM/F12作为主要成分的培养基(例如mTeSR1、TeSR-E8等)。表1中示出DMEM/F12的构成成分。
[表1]
成分
氨基酸
甘氨酸
L-丙氨酸
L-精氨酸盐酸盐
L-天冬酰胺-H<sub>2</sub>O
L-天冬氨酸
L-半胱氨酸盐酸盐-H<sub>2</sub>O
L-胱氨酸二盐酸盐
L-谷氨酸
L-谷氨酰胺
L-组氨酸盐酸盐-H2O
L-异亮氨酸
L-亮氨酸
L-赖氨酸盐酸盐
L-蛋氨酸
L-苯丙氨酸
L-脯氨酸
L-丝氨酸
L-苏氨酸
L-色氨酸
L-酪氨酸二钠盐二水合物
L-缬氨酸
维生素
生物素
氯化胆碱
D-泛酸钙
叶酸
烟酰胺
盐酸吡哆醇
核黄素
盐酸硫胺
维生素B12
i-肌醇
无机盐
氯化钙(CaCl<sub>2</sub>)(无水物)
硫酸铜(CuSO<sub>4</sub>-5H<sub>2</sub>O)
硝酸铁(Fe(NO<sub>3</sub>)<sub>3</sub>˙9H<sub>2</sub>O)
硫酸铁(FeSO<sub>4</sub>-7H<sub>2</sub>O)
氯化镁(无水物)
硫酸镁(MgSO<sub>4</sub>)(无水物)
氯化钾(KCl)
碳酸氢钠(NaHCO<sub>3</sub>)
氯化钠(NaCl)
磷酸氢二钠(Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>)无水物
磷酸二氢钠单水合物(NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>-H<sub>2</sub>O)
硫酸锌(ZnSO<sub>4</sub>-7H<sub>2</sub>O)
其他
D-葡萄糖(右旋葡萄糖)
次黄嘌呤钠盐
亚油酸
硫辛酸
酚红
腐胺二盐酸盐
丙酮酸钠
胸苷
作为所述生物标志物，可列举出：鸟氨酸、2-氨基己二酸、脱氧胞苷、谷氨酸、色氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、胱氨酸、次黄嘌呤、尿苷、天冬氨酸、精氨酸、2-羟基丁酸、2-羟基异戊酸、3-羟基异戊酸、尿素、4-羟基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、核糖酸、犬尿素、胱硫醚、苏糖酸、丙酮酸、腐胺、抗坏血酸、核黄素、丝氨酸、半胱氨酸、乳清酸和柠檬酸等。
未分化状态细胞的培养上清和分化状态细胞的培养上清中，这些生物标志物的存在量不同。因此，通过对培养上清中的生物标志物的存在量进行测定，能够判定细胞是分化状态还是未分化状态。对分化状态已知的对照细胞的培养上清中的生物标志物的存在量进行测定，将被检细胞的培养上清中的指示物质的存在量与对照细胞的培养上清中的指示物质的存在量进行比较，从而对分化状态进行评价。
对照细胞只要分化状态是已知的，既可以为未分化细胞也可以为分化细胞。分化细胞由于分化的进行程度、分化的方向性差异等而有培养上清中的生物标志物的存在量变化的情况，因此优选将未分化细胞作为对照细胞。将被检细胞的培养上清中的生物标志物的存在量与对照细胞的培养上清中的生物标志物的存在量进行的比较可以通过例如求出两者的比来进行。该比为规定的阈值(大于1的阈值)以上时或者为规定的阈值(小于1的阈值)以下时，可以判定为细胞为分化状态。被检细胞的培养上清中的生物标志物的存在量与对照细胞的培养上清中的生物标志物的存在量之比与规定的阈值相同时，判定为未分化状态；超过阈值的情况或者小于阈值的情况下，也可以判定为细胞处于分化状态。需要说明的是，由干细胞进行分化诱导而成的细胞为被检细胞的情况下，“未分化状态”包括分化状态的细胞中混合存在有未分化状态细胞的情况。
本发明的细胞分化状态的评价方法优选的方式中，基于被检细胞的培养上清中的两种以上生物标志物的存在量对该被检细胞的分化状态进行评价。通过组合两种以上生物标志物，能够更高精度地评价分化状态。另外，通过组合两种以上生物标志物，不仅对于细胞的分化状态，而且对于处于分化状态的细胞分化成内胚层、中胚层和外胚层的哪一者、即分化的方向性也能够进行评价。
两种以上生物标志物可以由上述的生物标志物中任意地选择。上述生物标志物中，作为在评价分化方向性的方面有用的生物标志物，可列举出犬尿素、2-氨基己二酸、鸟氨酸、脱氧胞苷、色氨酸、胱硫醚、次黄嘌呤和尿苷。优选基于它们中的两种以上生物标志物存在量来进行评价。
作为基于两种以上生物标志物存在量的分化状态的评价方法，可列举出：对于被检细胞的培养上清中的各种生物标志物的存在量伴随着培养时间的变化进行分析的方法；对两种以上生物标志物的存在量进行多变量分析的方法；求出两种指示物质的存在量的比的方法等。也可以组合这些方法来进行评价。基于两种生物标志物存在量的判定可以例如将第一生物标志物的存在量(或者指标值)作为横轴、将第二生物标志物的存在量(或者指标值)作为纵轴进行作图，从而进行判定。进行基于3种以上生物标志物存在量的评价时，多变量分析是有用的。
作为两种生物标志物，可列举出在代谢途径中具有前后关系系的代谢产物与其前体物质的组合。通过基于代谢产物与前体物质的比进行评价，从而分化方向性的评价精度提高。代谢途径的前体物质不限定于相对于代谢产物的代谢物质，也可以是代谢途径的两种以上前体物质。作为前体物质与代谢产物的组合，可列举出例如色氨酸与犬尿素的组合、鸟氨酸与腐胺的组合、精氨酸与鸟氨酸的组合等。需要说明的是，对于代谢途径的种类没有特别的限定，前体物质与代谢产物的组合也不限定于上述。
求出代谢产物与前体物质的比时，也可以基于被检细胞的培养上清中的代谢产物与前体物质的比来进行评价；也可以将对照细胞的培养上清中的代谢产物存在量与前体物质的存在量的比、以及被检细胞的培养上清中的代谢产物的存在量与前体物质的存在量的比进行对比。另外，也可以求出对照细胞的培养上清中的代谢产物的存在量与被检细胞的培养上清中的代谢产物的存在量的比、以及对照细胞的培养上清中的前体物质的存在量与被检细胞的培养上清中的前体物质的存在量的比，通过将它们进行对比来进行评价。
作为测定培养上清中的所述生物标志物存在量的方法，优选利用通过质谱分析法的定量分析、特别是使用了液相色谱质谱分析装置(LC-MS)、气相色谱质谱分析装置(GC-MS)的定量分析，但不限定于这些方法。例如，将对培养上清实施了规定的前处理得到的试样与洗脱液一起上样至液相色谱(LC)装置的柱中，由对于被柱分离而洗脱的成分用紫外可见分光检测器、红外分光检测器等检测器进行了检测的结果，求出试样中所包含的所述生物标志物的存在量。另外，也可以向培养上清中添加使所述各生物标志物特异地显色或发光的试剂等，基于该显色或发光的强度求出生物标志物的存在量。
实施例
以下，对于利用本发明的方法的细胞分化状态评价的一实施例进行说明。图1A和图1B是表示本实施例的细胞分化状态评价方法的实施步骤的示意图。
本实施例中，使用人iPS细胞株PFX#9。另外，将对人iPS细胞株给予了分化诱导刺激的细胞作为被检细胞、将没有对人iPS细胞株给予分化诱导刺激的细胞(即维持了未分化状态的细胞)作为对照细胞。以下，对于本实施例中的由细胞培养起至培养上清的分析为止的步骤进行说明。
[对照细胞的培养以及培养上清的回收]
在实施了玻璃体结合蛋白-N(Vitronectin-N、Life Technologies公司)涂敷的3个培养皿(直径60mm)中对所述PFX#9株进行继代培养(图1A中，为了简化只示出了1个培养皿)。作为培养基使用mTeSR1(modified Tenneille Serum Replacer 1、STEMCELLTechnologies公司)或TeSR-E8(Tenneille Serum Replacer E8、STEMCELL Technologies公司)，每天进行培养基的更换。将mTeSR1的构成成分示于表2、将TeSR-E8的构成成分示于表3。将进行细胞的继续培养(继代)的那一天作为第0天继续6天的培养，将在各天的培养基更换时由培养皿回收的培养上清作为质谱分析用样品。
[表2]
成分
DMEM/F12
NaHCO<sub>3</sub>
L-抗坏血酸
硒
转铁蛋白
胰岛素
FGF2
TGF-β
牛血清白蛋白(BSA)
谷胱甘肽
微量元素
β-巯基乙醇
哌啶酸
GABA
氯化锂
成分确定的脂质
[表3]
成分
DMEM/F12
NaHCO<sub>3</sub>
L-抗坏血酸
硒
转铁蛋白
胰岛素
FGF2
TGF-β
[内胚层分化细胞的培养以及培养上清的回收]
在实施了玻璃体结合蛋白-N涂敷的3个培养皿(直径60mm)中对所述PFX#9株进行继代培养(图1A中，为了简化只示出了1个培养皿)。作为培养基，使用mTeSR1或TeSR-E8，每天进行培养基的更换直至铺满为止继续进行培养。将进行继代的那一天作为第0天，在第1天更换成以使终浓度分别成为100ng/mL、40ng/mL、0.5ng/mL的方式添加了激活素-A(Activin-A、PeproTech公司)、Wnt3a(Wingless-type MMTV integration site family,member 3A、PeproTech公司)、BMP-4(Bone Morphogenetic Proteins-4、PeproTech公司)的培养基。在第2天之后，更换成以使终浓度分别成为100ng/mL、0.5ng/mL的方式添加了激活素-A和BMP-4的培养基，从而进行内胚层分化诱导刺激。将进行细胞的继续培养(继代)的那一天作为第0天继续6天的培养，将在各天的培养基更换时由培养皿回收的培养上清作为质谱分析用样品。
[中胚层分化细胞的培养以及培养上清的回收]
在实施了玻璃体结合蛋白-N涂敷的3个培养皿(直径60mm)中对所述PFX#9株进行继代培养(图1B中，为了简化只示出了1个培养皿)。作为培养基，使用mTeSR1或TeSR-E8，每天进行培养基的更换直至铺满为止继续进行培养。将进行继代的那一天作为第0天、在第1天以后更换成以终浓度成为40ng/mL的方式添加了BMP-4的培养基，从而进行中胚层分化诱导刺激。将进行细胞的继续培养(继代)的那一天作为第0天继续6天的培养，将在各天的培养基更换时由培养皿回收的培养上清作为质谱分析用样品。
[外胚层分化细胞的培养以及培养上清的回收]
在实施了玻璃体结合蛋白-N涂敷的3个培养皿(直径60mm)中对所述PFX#9株进行继代培养(图1B中，为了简化只示出了1个培养皿)。作为培养基，使用mTeSR1或TeSR-E8，每天进行培养基的更换直至铺满为止继续进行培养。将进行了继代的那一天作为第0天，在第1天以后，更换成以终浓度分别成为10μM、500ng/mL的方式添加了SB431542(4-[4-(1,3-苯并二唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯酰胺、和光纯药工业株式会社)和头蛋白(PeproTech公司)的培养基，由此进行外胚层分化诱导刺激。将进行细胞的继续培养(继代)的那一天作为第0天继续6天的培养，将在各天的培养基更换时由培养皿回收的培养上清作为质谱分析用样品。
[利用LC-MS的分析]
向所述样品100μL中添加0.5mM异丙基苹果酸水溶液20μL作为内标物质，进行混合之后，添加乙腈200μL进行除蛋白。之后，对样品进行离心分离(15000rpm、室温、15分钟)回收上清，用超纯水(Milli-Q(注册商标)水、Merck公司)进行10倍稀释而供于LC-MS分析。LC-MS分析中，按照收录于岛津制作所制“LC/MS/MS Method Package细胞培养封闭”(以下简称为“MP”)的分析条件进行。MP收集了用于对培养基所包含的化合物以及由细胞分泌的代谢物质用LC-MS进行分析的分析条件参数。化合物的鉴定按照如下基准进行：MP中所登记的标准品的保留时间与样品中化合物的保留时间之差为±0.3分钟以内；检测到定量离子、确认离子两个峰；强度值为1000以上。另外，化合物的定量可以通过对于样品中各化合物特征的离子(定量离子)计算出质谱面积的方法来实施。
[利用GC-MS的分析]
向所述样品100μL中添加0.5mg/mL异丙基苹果酸水溶液10μL作为内标物质进行混合之后，添加乙腈200μL进行除蛋白。之后，对样品进行离心分离(15000rpm、室温、15分钟)而回收上清100μL，进行减压干燥。通过在包含甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液中对各样品进行培养，从而进行样品中化合物的甲氧基化。进而，向各样品中添加MSTFA(N-甲基-N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺)，对样品中的化合物进行三甲基甲硅烷基化(衍生物化)。然后，将这些实施了衍生物化处理的样品供于利用了GC-MS的分析中。
GC-MS分析中，使用岛津制作所制的“Smart Metabolites Database”(以下简称为“DB”)。该DB收集了对实施了与上述的衍生物化处理同样处理的各种标准品用GC-MS进行了分析的数据。化合物的鉴定以如下指标进行：所述DB所设定的保留指标(将保留时间相对化而得到的数值)与样品中的衍生化化合物的保留指标之差是否在±5以内；以及、对于样品中的衍生化化合物是否检测到所述数据库所设定的定量离子和确认离子两者。另一方面，化合物的定量通过如下方法来实施：按照所述数据库所设定的条件，对于样品中的各衍生物化化合物特征的离子计算出质谱的面积。
[数据分析]
对于培养第1天起至培养第6天所回收的培养上清，算出将通过上述LC-MS分析和GC-MS分析而求出的各化合物的定量值(面积值)除以所述内标物质的定量值(面积值)而得到的值(面积比)，将其作为培养上清中的各化合物存在量的指标值。对未分化维持细胞(对照细胞)、内胚层分化细胞、中胚层分化细胞和外胚层分化细胞各自的进行鉴定得到的化合物存在量的指标值，以横轴作为培养天数、纵轴作为该指标值的坐标系进行作图。另外，筛选出伴随着培养经过的存在量的指标值变化明显与对照细胞不同的化合物。具体而言，在培养第3天起至第6天之间，将上述对照细胞中的指标值的平均值设为A、将被检细胞中的指标值的平均值设为B时，筛选A/B或者B/A成为1.5以上的化合物。
另外，为了选定用于评价培养初期阶段的细胞状态的有效的化合物，进行了多变量分析。具体而言，对于培养第2天～第4天的样品，将上述算出的指标值输入至多变量分析软件(R version 3.1.2)中，进行主要成分分析。基于该结果，筛选出能够区分未分化维持细胞和内胚层分化细胞、中胚层分化细胞、外胚层分化细胞的化合物的组合。
[结果]
由以上，将在对照细胞的培养液上清中和进行了分化诱导刺激的被检细胞的培养上清中的、伴随着培养经过的存在量的指标值变化明显不同的化合物示于以下的表4～24中。需要说明的是，这些表中，数值带有阴影的样品表示被判定为由对照细胞的指标值有变化的样品。
[表4]
Figure GDA0001638052520000141
由表4可知，犬尿素(Kynurenine)的通过分化诱导而在被检细胞培养上清中的存在量与对照细胞培养上清中的存在量相比减少了。因此，作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞培养上清中犬尿素的存在量相对于对照细胞培养上清中犬尿素的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以下时，可以判定为被检细胞为分化状态。
[表5]
Figure GDA0001638052520000151
由表5可知，鸟氨酸(Ornithine)的通过分化诱导而在被检细胞上清中的存在量与对照细胞相比较减少了。因此，作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞的培养上清中鸟氨酸的存在量相对于对照细胞的培养上清中鸟氨酸的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以下时，可以判定为被检细胞为分化状态。
[表6]
Figure GDA0001638052520000152
由表6可知，2-氨基己二酸(2-Aminoadipic acid)在被分化诱导成内胚层和中胚层的被检细胞中，上清中的存在量与对照细胞相比较减少了。另一方面，可知被分化诱导成外胚层的被检细胞中，在培养第3天～第6天上清中的存在量与对照细胞相比较均增加了。因此，作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞的培养上清中2-氨基己二酸的存在量相对于对照细胞的培养上清中2-氨基己二酸的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以下时，可以判定为被检细胞向内胚层或中胚层分化；为阈值以上时，可以判定为被检细胞向外胚层分化。
[表7]
Figure GDA0001638052520000161
由表7可知，脱氧胞苷(Deoxycytidine)在被分化诱导成内胚层的被检细胞中，上清中的存在量与对照细胞相比较减少了。另一方面，可知被分化诱导成中胚层的被检细胞和外胚层的被检细胞的一部分中，上清中的存在量与对照细胞相比较增加了。因此，作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞的培养上清中脱氧胞苷的存在量相对于对照细胞的培养上清中脱氧胞苷的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以下时，可以判定为被检细胞向内胚层分化；为阈值以上时，可以判定为被检细胞向中胚层或外胚层分化。
[表8]
Figure GDA0001638052520000162
由表8可知，谷氨酸(Glutamic acid)在被分化诱导成内胚层的被检细胞的上清中的存在量与对照细胞相比较增加了。因此，作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞的培养上清中谷氨酸的存在量相对于对照细胞的培养上清中谷氨酸的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以上时，可以判定为被检细胞向内胚层分化。
[表9]
Figure GDA0001638052520000171
由表9可知，色氨酸(Tryptophan)由于分化诱导在被检细胞的上清中的存在量与在对照细胞的上清中的存在量相比较增加了。因此，作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞的培养上清中色氨酸的存在量相对于对照细胞的培养上清中色氨酸的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以上时，能够判定为被检细胞是分化状态。
[表10]
Figure GDA0001638052520000172
由表10可知，胱硫醚(Cystathionine)由于分化诱导在被检细胞的上清中的存在量与在对照细胞的上清中的存在量相比较，大致减少了。因此，作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞的培养上清中胱硫醚的存在量相对于对照细胞的培养上清中胱硫醚的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以下时，能够判定为被检细胞是分化状态。
[表11]
Figure GDA0001638052520000173
由表11可知，丙氨酸(Alanine)由于分化诱导在被检细胞的上清中的存在量与在对照细胞的上清中的存在量相比较，大致减少了。因此，作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞的培养上清中丙氨酸的存在量相对于对照细胞的培养上清中丙氨酸的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以下时，能够判定为被检细胞是分化状态。
[表12]
Figure GDA0001638052520000181
由表12可知，胱氨酸(Cystine)在被分化诱导成内胚层和外胚层的被检细胞中，上清中的存在量与对照细胞相比较大致减少了。另一方面可知，被分化诱导成中胚层的被检细胞中，上清中的存在量与对照细胞相比较大致增加了。因此，作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞的培养上清中胱氨酸的存在量相对于对照细胞的培养上清中胱氨酸的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以下时，可以判定为被检细胞向内胚层或外胚层分化；为阈值以上时，可以判定为被检细胞向中胚层分化。
[表13]
Figure GDA0001638052520000182
由表13可知，次黄嘌呤(Hypoxanthine)在被分化诱导成中胚层和外胚层的被检细胞中，至培养第5天为止，上清中的存在量与对照细胞相比较，大致增加。因此，对于次黄嘌呤，作为对照细胞使用未分化细胞时，从培养开始起至第5天为止的期间，被检细胞的培养上清中次黄嘌呤的存在量相对于对照细胞的培养上清中次黄嘌呤的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以上时，可以判定为被检细胞向中胚层或外胚层分化。
[表14]
Figure GDA0001638052520000191
由表14可知，尿苷(Uridine)由于分化诱导在被检细胞的上清中的存在量与在对照细胞的上清中的存在量相比较增加了。因此，作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞的培养上清中尿苷的存在量相对于对照细胞的培养上清中尿苷的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以上时，能够判定为被检细胞是分化状态。
[表15]
Figure GDA0001638052520000192
由表15可知，天冬氨酸(Aspartic acid)由于分化诱导在被检细胞的上清中的存在量与在对照细胞的上清中的存在量相比较减少了。因此，作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞的培养上清中天冬氨酸的存在量相对于对照细胞的培养上清中天冬氨酸的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以下时，能够判定为被检细胞是分化状态。
[表16]
Figure GDA0001638052520000193
由表16可知，精氨酸(Arginine)由于分化诱导在被检细胞的上清中的存在量与在对照细胞的上清中的存在量相比较，大致增加了。因此，作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞的培养上清中精氨酸的存在量相对于对照细胞的培养上清中精氨酸的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以上时，能够判定为被检细胞是分化状态。
[表17]
Figure GDA0001638052520000201
由表17可知，2-羟基丁酸(2-Hydroxybutyric acid)由于分化诱导在被检细胞的上清中的存在量与在对照细胞的上清中的存在量相比较减少了。因此，作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞的培养上清中2-羟基丁酸的存在量相对于对照细胞的培养上清中2-羟基丁酸的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以下时，能够判定为被检细胞是分化状态。
[表18]
Figure GDA0001638052520000202
由表18可知，2-羟基异戊酸(2-Hydroxyisovaleric acid)由于分化诱导在被检细胞的上清中的存在量与对照细胞相比较，大致减少了。因此，作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞的培养上清中2-羟基异戊酸的存在量相对于对照细胞的培养上清中2-羟基异戊酸的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以下时，能够判定为被检细胞是分化状态。
[表19]
Figure GDA0001638052520000203
由表19可知，3-羟基异戊酸(3-Hydroxyisovaleric acid)由于分化诱导，除了被分化诱导成内胚层和外胚层的被检细胞的一部分，在被检细胞的上清中的存在量与在对照细胞上清中的存在量相比较减少了。因此，作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞的培养上清中3-羟基异戊酸的存在量相对于对照细胞的培养上清中3-羟基异戊酸的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以下时，能够判定为被检细胞是分化状态。
[表20]
Figure GDA0001638052520000211
由表20可知，尿素(Urea)由于分化诱导，除了被分化诱导成外胚层的被检细胞的一部分，在被检细胞的上清中的存在量与在对照细胞的上清中的存在量相比较减少了。作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞的培养上清中尿素的存在量相对于对照细胞的培养上清中尿素的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以下时，能够判定为被检细胞是分化状态。
[表21]
Figure GDA0001638052520000212
由表21可知，4-羟基苯甲酸(4-Hydroxybenzoic acid)由于分化诱导，除了被分化诱导成内胚层的被检细胞的一部分、被分化诱导成外胚层的被检细胞的一部分，在被检细胞的上清中的存在量与在对照细胞的上清中的存在量相比较减少了。因此，作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞的培养上清中4-羟基苯甲酸的存在量相对于对照细胞的培养上清中4-羟基苯甲酸的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以下时，能够判定为被检细胞是分化状态。
[表22]
Figure GDA0001638052520000221
由表22可知，4-氨基苯甲酸(4-Aminobenzoic acid)由于分化诱导在被检细胞的上清中的存在量与在对照细胞的上清中的存在量相比较增加了。因此，作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞的培养上清中4-氨基苯甲酸的存在量相对于对照细胞的培养上清中4-氨基苯甲酸的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以上时，能够判定为被检细胞是分化状态。
[表23]
Figure GDA0001638052520000222
由表23可知，核糖酸(Ribonic acid)在被分化诱导成中胚层的被检细胞中，上清中的存在量与对照细胞相比较减少了。因此，作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞的培养上清中核糖酸的存在量相对于对照细胞的培养上清中核糖酸的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以下时，可以判定为被检细胞向中胚层分化。
[表24]
Figure GDA0001638052520000223
由表24可知，柠檬酸(Citric acid)在被分化诱导成中胚层的被检细胞和被分化诱导成内胚层的被检细胞的一部分中，由于分化诱导在被检细胞的上清中的存在量与对照细胞相比较增加了。因此，作为对照细胞使用未分化细胞时，被检细胞的培养上清中柠檬酸的存在量相对于对照细胞的培养上清中柠檬酸的存在量的比(被检细胞/对照细胞)为预定的阈值以下时，可以判定为被检细胞向内胚层或中胚层分化。
将mTeSR1株、TeSR-E8株的在培养第1天～第6天的培养上清中的所述生物标志物存在量的变化示于图2A、2B、2C、2D、3A和3B中。需要说明的是，图2A～图2D是通过LC-MS分析的结果；图3A和图3B是通过GC-MS分析的结果。由这些图可知，刚培养开始之后，在被检细胞与对照细胞中所述生物标志物的存在量没有差异，对于多种生物标志物，随着时间的经过，在被检细胞与对照细胞之间，其存在量的差异变广。可以确认，对照细胞与被检细胞之间存在量的差异成为最大的时期会很据培养细胞的种类、生物标志物的种类而不同。进而可以确认，根据被检细胞分化状态(内胚层分化细胞、中胚层分化细胞、外胚层分化细胞)的不同，生物标志物的存在量也存在差异。
例如，相比于被检细胞，犬尿素在对照细胞会随着培养时间的经过而在培养上清中的存在量大幅地增加。2-氨基己二酸在内胚层分化细胞和中胚层分化细胞中、在培养上清中的存在量几乎没有变化；而在对照细胞和外胚层分化细胞中则可以见到培养上清中的存在量变化(增加)，特别是在外胚层分化细胞中可见大的变化。脱氧胞苷在接种后，在所有细胞中均可见培养上清中的存在量的变化(增加)；但在对内胚层进行了分化诱导刺激的细胞中，培养上清中的存在量会随着培养时间的经过而大幅地减少。因此，通过利用这样的、与培养上清中存在量的变化有关的每个生物标志物的特征，能够判定被检细胞是分化状态还是非分化状态，并且能够评价被判定为是分化状态的被检细胞分化的方向性(内胚层、中胚层、外胚层)。仅基于一种生物标志物的评价中，难以对内胚层分化、中胚层分化和外胚层分化的全部进行评价，但如果基于两种以上生物标志物的存在量进行判定，则能够更准确地评价分化的方向性。
将对mTeSR1株的培养第2天～第4天的培养上清中的犬尿素、2-氨基己二酸、鸟氨酸、脱氧胞苷、色氨酸、胱硫醚、次黄嘌呤和尿苷的存在量进行了主要成分分析的结果示于图4A中。由该图可知，在培养第3天，能够分别明显地区分未分化状态(对照细胞)和内胚层分化细胞、中胚层分化细胞以及外胚层分化细胞。
另外，将对TeSR-E8株的培养第2天～第4天的培养上清中的所述生物标志物的存在量进行了主要成分分析的结果示于图4B中。由该图可知，在培养第4天，能够分别明显地区分未分化状态(对照细胞)和内胚层分化细胞、中胚层分化细胞以及外胚层分化细胞。
即，如图4A和图4B所示，通过以培养上清中的两种以上生物标志物的存在量作为指标，能够判定被检细胞是分化状态还是非分化状态，并且能够评价被检细胞的分化的方向性(内胚层、中胚层、外胚层)。
[与其他试验方法的对比]
为了确认培养上清中的生物标志物存在量的分析与利用其他试验方法的分析的整合，利用细胞破坏的检查进行分析。
与上述的“对照细胞的培养”、“内胚层分化细胞的培养”、“中胚层分化细胞的培养”、以及“外胚层分化细胞的培养”同样地，作为培养基使用mTeSR1或TeSR-E8，进行细胞的培养和分化诱导刺激，将进行继代的那一天作为第0天，在4天后以及7天后采集细胞。
通过TaqMan HPSC Scorecard Panel(Applied Biosystems公司)提取采集的细胞的mRNA，通过定量PCR来评价96种基因的表达水平，以其结果作为基础计算出向各胚层系的分化程度的分值。将mTeSR1株的分析分值示于表25中、将TeSR-E8株的分析分值示于表26中。这些表中，数值带有阴影的样品的分析分值为0.5以上，表示细胞向特定的方向分化。
[表25]
Figure GDA0001638052520000251
[表26]
Figure GDA0001638052520000252
由表25和表26的结果可知，“对照细胞的培养”(无分化诱导刺激)中没有看到向特定方向的分化；“内胚层分化细胞的培养”(利用激活素-A、Wnt3a和BMP-4的分化诱导刺激)中内胚层分化进行；“中胚层分化细胞的培养”(利用BMP-4的分化诱导刺激)中中胚层分化进行；“外胚层分化细胞的培养”(利用B431542和头蛋白的分化诱导刺激)中外胚层分化进行。
由这些结果可以说，以培养上清中的生物标志物的存在量作为指标的评价方法是能够再现现有的细胞破坏的手法、并且能够以同一培养皿中的细胞作为对象评价伴随着时间经过的分化状态变化的优异的方法。
[基于在代谢途径中具有前后关系的化合物的比的数据分析]
对于培养第1天～第6天所回收的培养上清，计算出利用LC-MS分析而求出的各化合物存在量的指标值。由对照细胞(未分化维持细胞)、被检细胞(内胚层分化细胞、中胚层分化细胞和外胚层分化细胞)的各自培养上清的犬尿素(Kynurenine)、色氨酸(Tryptophan)、鸟氨酸(Ornithine)、精氨酸(Arginine)和腐胺(Putrescine)的指标值计算出将被检细胞中的指标值的平均值B除以对照细胞中的指标值的平均值A而得到的值B/A。
(犬尿素/色氨酸)
将作为代谢产物的犬尿素的B/A值、以及将犬尿素的B/A除以作为犬尿素途径的前体物质的色氨酸的B/A得到的值示于表27和表28。
[表27]
Figure GDA0001638052520000261
[表28]
Figure GDA0001638052520000262
如表4所示，犬尿素由于分化诱导在被检细胞培养上清中的存在量(B)相比于对照细胞培养上清中的存在量(A)减少了，即便单独使用也能够判定被检细胞是否为分化状态(如前所述，表中的值越偏离1则由对照细胞的变化越大)。另一方面，如表27(mTeSR1)和表28(TeSR-E8)所示，犬尿素与作为其前体物质的色氨酸的比，相比于犬尿素单独的情况，与对照细胞的差变大且伴随着培养天数的经过该倾向变得显著。
将这些结果与作为利用细胞破坏方法的评价结果的表25，26相比较时，对于被检细胞的培养上清中的存在量进行评价的方法中，在分化诱导刺激开始后的经过天数少的阶段中，在对照细胞与被检细胞之间表现出显著的差异。另外，与将犬尿素单独作为指标相比，使用犬尿素与色氨酸的比的情况下，与对照细胞的差有变得更显著的倾向，因此能够以更高精度评价被检细胞的分化状态。
(鸟氨酸/精氨酸)
将作为代谢产物的鸟氨酸的B/A值、以及将鸟氨酸的B/A除以作为鸟氨酸循环(尿素循环)的前体物质的精氨酸的B/A而得到的值示于表29和表30中。
[表29]
Figure GDA0001638052520000271
[表30]
Figure GDA0001638052520000272
如表5所示，鸟氨酸通过分化诱导，被检细胞的培养上清中的存在量(B)相比于对照细胞培养上清中的存在量(A)减少了，即便单独使用也能够判定被检细胞是否为分化状态。另一方面，如表29(mTeSR1)和表30(TeSR-E8)所示，可知对于内胚层分化细胞和中胚层分化细胞，鸟氨酸与作为其前体物质的精氨酸的比，与鸟氨酸单独使用的情况相比较和对照细胞的差变大，随着培养天数的经过该倾向变得明显。由这些结果可知，相比于以鸟氨酸单独作为指标，通过使用鸟氨酸与精氨酸的比，能够更高精度地评价被检细胞的分化状态。
(腐胺/鸟氨酸)
将作为代谢产物的腐胺B/A的值、以及将腐胺的B/A除以精氨酸/脯氨酸代谢的前体物质的鸟氨酸的B/A得到的值示于表31中。
[表31]
Figure GDA0001638052520000281
使用mTeSR1培养基的情况下，可以看到腐胺由于分化诱导在被检细胞的培养上清中的存在量(B)与在对照细胞的培养上清中的存在量(A)相比增加的倾向，特别是对于内胚层分化细胞和外胚层分化细胞，伴随着培养天数的经过该倾向变得显著，因此在腐胺单独时能够判定被检细胞是否为分化状态。对于中胚层分化细胞，腐胺单独时未见明显的倾向。与此相对，通过使用腐胺与作为其前体物质的鸟氨酸的比，随着培养天数的经过与对照细胞的差变大，即便对于中胚层分化细胞也能判定是分化状态。对于内胚层分化细胞和外胚层分化细胞，与腐胺单独相比较，使用腐胺与作为其前体物质的鸟氨酸的比，与对照细胞的差变大且能够更高精度地评价被检细胞的分化状态。

Claims (7)

1.一种细胞分化状态的评价方法，其为评价细胞分化状态的方法，
将分化状态未知的干细胞或者由多能干细胞进行了分化诱导而成的细胞作为被检细胞，将分化状态已知的多能干细胞作为对照细胞，将所述被检细胞的培养上清中的指示物质的存在量与所述对照细胞的培养上清中的所述指示物质的存在量进行比较，从而对于所述被检细胞的分化状态进行评价，
所述指示物质为鸟氨酸、2-氨基己二酸、脱氧胞苷、色氨酸和犬尿素。
2.根据权利要求1所述的细胞分化状态的评价方法，其中，分别对于所述指示物质，基于所述被检细胞的培养上清中的指示物质的存在量与所述对照细胞的培养上清中的所述指示物质的存在量的比是否在预定的阈值以上、或者是否在阈值以下来进行所述分化状态的评价。
3.根据权利要求1或2所述的细胞分化状态的评价方法，其中，作为所述对照细胞使用明显为未分化的细胞。
4.根据权利要求1或2所述的细胞分化状态的评价方法，其特征在于，在所述分化状态的评价中，对于是分化状态还是未分化状态进行评价，并且对于被评价为分化状态的被检细胞的分化的方向是内胚层、中胚层和外胚层中的哪一者进行评价。
5.根据权利要求4所述的细胞分化状态的评价方法，其中，分别对于所述指示物质，分析所述被检细胞的培养上清中的指示物质的存在量的伴随着培养时间的变化来进行所述评价。
6.根据权利要求4所述的细胞分化状态的评价方法，其中，通过对所述指示物质的存在量进行多变量分析来进行所述评价。
7.一种细胞的培养方法，其包含如下工序：基于利用权利要求1～6中任一项所述的方法的被检细胞分化状态的评价结果，对所述被检细胞进行筛选。
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