WO2021005729A1 - ｉＰＳ細胞の分化効率予測モデルの構築方法及びｉＰＳ細胞の分化効率予測方法 - Google Patents

ｉＰＳ細胞の分化効率予測モデルの構築方法及びｉＰＳ細胞の分化効率予測方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2021005729A1
WO2021005729A1 PCT/JP2019/027225 JP2019027225W WO2021005729A1 WO 2021005729 A1 WO2021005729 A1 WO 2021005729A1 JP 2019027225 W JP2019027225 W JP 2019027225W WO 2021005729 A1 WO2021005729 A1 WO 2021005729A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
acid
cells
differentiation efficiency
ips
differentiation
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/027225
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
真 渡辺
佐藤　孝明
淳也 戸口田
Original Assignee
株式会社島津製作所
国立大学法人京都大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社島津製作所, 国立大学法人京都大学 filed Critical 株式会社島津製作所
Priority to US17/623,777 priority Critical patent/US20220246231A1/en
Priority to JP2021530411A priority patent/JP7185243B2/ja
Priority to PCT/JP2019/027225 priority patent/WO2021005729A1/ja
Publication of WO2021005729A1 publication Critical patent/WO2021005729A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B5/00—ICT specially adapted for modelling or simulations in systems biology, e.g. gene-regulatory networks, protein interaction networks or metabolic networks
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/20—Supervised data analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for non-invasively predicting the differentiation efficiency of undifferentiated iPS cells (induced pluripotent stem cells), and particularly to a method for predicting the differentiation efficiency of iPS cells into chondrocytes and the like.
  • a pathway from iPS cells to chondrocytes via neural crest cells is known.
  • N cells neural crest cells
  • each iPS cell line is induced to differentiate into chondrocytes, and then the cartilage in each cell is used.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Therefore, after inducing differentiation from iPS cells to NC cells, the expression level of CD271 in each cell was measured, and an iPS cell line with a high proportion of CD271 high + NC cells was selected, resulting in cartilage. It is possible to select iPS cells having high differentiation efficiency.
  • the time required to investigate the differentiation efficiency can be significantly shortened. However, even in this case, since it takes at least 8 days to induce the differentiation of iPS cells to NC cells, further shortening of the period has been required.
  • the present invention has been made in view of the above points, and an object of the present invention is the efficiency of differentiation of iPS cells into chondrocytes (or NC cells) (hereinafter, may be simply referred to as "differentiation efficiency"). ) Is to provide a method that can predict in a short time.
  • the method for constructing a differentiation efficiency prediction model for iPS cells is Culture supernatants were collected from each of a plurality of iPS cell clones whose differentiation efficiency into chondrocytes or nerve ridge cells was known, and a plurality of metabolites contained in each culture supernatant were quantified, and the quantified results were multivariate.
  • the feature is to construct a prediction model which is a mathematical formula for predicting the differentiation efficiency of iPS cells into chondrocytes or nerve ridge cells from the quantitative values of the plurality of metabolites by analysis.
  • the method for predicting the differentiation efficiency of iPS cells according to the present invention is A culture supernatant was collected from a test cell group consisting of a single iPS cell clone, a plurality of biotransformers contained in the culture supernatant were quantified, and the quantified values of the obtained plurality of biotransformers were obtained as described above.
  • the prediction model constructed by the method the efficiency of differentiation of the test cell group into cartilage cells or nerve ridge cells is predicted.
  • the plurality of metabolites are 2-aminoethanol, 2-deoxyglucone, 2-hydroxyisocaproic acid, 2 -Hydroxyisovaleric acid, 2-methyl-3-hydroxybutyric acid, 4-aminobutyric acid, acetoacetic acid, cadaberine, dihydroxyacetone, fructose, galacturonic acid, gluconic acid, glutamic acid, glycine, isobutyrylglycine, lysine, liquisauce, apple It is desirable to include acids, mesaconic acid, methyl malic acid, mevalonic acid lactone, monostea, proline, psicose, succinic acid, tagatos, tretol, and threonine.
  • the plurality of metabolites are further added to 2'-deoxyuridine, 2-hydroxy-3-methylvaleric acid, and the like.
  • the present invention further provides a method for obtaining neural crest cells having high differentiation efficiency into cartilage.
  • the method for obtaining neural ridge cells having high differentiation efficiency into cartilage according to the present invention is to differentiate one or a plurality of test cell groups each consisting of a single iPS cell clone by the method of the present invention.
  • the efficiency was predicted, and as a result, one or more test cell groups predicted to have high differentiation efficiency were induced to differentiate into nerve ridge cells, and then the test cell group that received the differentiation induction was subjected to the differentiation.
  • By performing cell sorting using an antibody against the CD271 protein cells whose expression level of the protein is higher than a predetermined threshold are sorted.
  • the cartilage of the iPS cell is based on the metabolite contained in the culture supernatant of the undifferentiated iPS cell. It is possible to predict the differentiation efficiency into cells or NC cells. Therefore, since it is not necessary to induce the differentiation of iPS cells into chondrocytes and NC cells as in the conventional case, it is possible to reduce the time and labor required to know the differentiation efficiency.
  • the conceptual diagram explaining the method of constructing the differentiation efficiency prediction model of iPS cells which concerns on one Embodiment of this invention.
  • the flowchart explaining the method of predicting the differentiation efficiency of iPS cells in the same embodiment.
  • the conceptual diagram which shows the procedure for identifying the cell group with high differentiation efficiency from a plurality of iPS cell groups whose differentiation efficiency is unknown.
  • the conceptual diagram explaining the method of acquiring NC cells with high differentiation efficiency into chondrocytes from the iPS cell group judged to have high differentiation efficiency by a prediction model.
  • the graph which shows the ratio of CD271 high + NC cell in the reference cell group after induction of differentiation into NC cell.
  • the graph which shows the ratio of CD271 high + NC cells in each of the cell group with high differentiation efficiency (Good Clones) and the cell group with low differentiation efficiency (Poor Clones).
  • Score plot showing the results of OPLS analysis for the first metabolite profile.
  • the method for constructing the iPS cell differentiation efficiency prediction model according to the present invention is Culture supernatants were collected from each of a plurality of iPS cell clones whose differentiation efficiency into cartilage cells or neural crest cells was known, and a plurality of metabolites contained in each culture supernatant were quantified, and the quantified results were multivariate.
  • a prediction model which is a mathematical formula for predicting the differentiation efficiency of iPS cells into cartilage cells or neural crest cells from the quantitative values of the plurality of metabolites is constructed.
  • the method for predicting the differentiation efficiency of iPS cells is A culture supernatant was collected from a test cell group consisting of a single iPS cell clone, the plurality of biotransformers contained in the culture supernatant were quantified, and the quantified values of the obtained plurality of biotransformers were obtained.
  • the efficiency of differentiation of the test cell group into cartilage cells or nerve ridge cells is predicted.
  • a method for quantifying a plurality of metabolites contained in the culture supernatant for example, a gas chromatograph mass spectrometer (GC-MS), a liquid chromatograph mass spectrometer (LC-MS), or a capillary electrophoresis mass is used. Quantitative analysis using an analyzer (CE-MS) can be preferably used.
  • a sample obtained by subjecting a culture supernatant to a predetermined pretreatment is flowed together with an eluent on a column of a liquid chromatography (LC) apparatus, and components separated and eluted by the column are subjected to.
  • the plurality of metabolites contained in the sample may be quantified from the results detected by a detector such as an ultraviolet-visible spectroscopic detector or an infrared spectroscopic detector.
  • a procedure for creating a model for predicting differentiation efficiency of iPS cells will be described with reference to FIG.
  • a reference cell group a plurality of iPS cell lines CH1 , CH2 , ... CHn , which are known to have high differentiation efficiency into cartilage cells or NC cells, are known to have low differentiation efficiency.
  • the culture supernatants S H1, S H2, ... S Hn and S L1, S L2, ... S Lm relative, by performing quantitative analysis by GC-MS, the reference cell population C H1, C H2, ... C Hn and C L1, C L2, ... metabolite profile P H1, P H2 for C Lm, ... P Hn and P L1, P L2, obtains a ... P Lm.
  • the metabolite profile includes at least the identifiers of the plurality of metabolites contained in the culture supernatant and their quantitative values.
  • the "identifier" of the metabolite is a name, number, or symbol unique to each compound, which is typically a compound name, but other than that, m / z (m / z) of the peak of the compound on the mass spectrum. Mass-to-charge ratio) or the like.
  • the "quantitative value” is a value indicating the abundance of each biotransformation in the culture supernatant, and is calculated from, for example, the intensity of the detection signal of the compound by the GC-MS detector or the intensity. , The concentration of the compound in the culture supernatant and the like.
  • differentiation-effective reference cell population C H1, C H2, ... are metabolites profile P H1, P H2 obtained for C Hn, ... metabolite profiles and P Hn, differentiation efficiency was obtained for a low reference cell population P L1, P L2, ... to construct a predictive model by comparing analyzed by multivariate analysis and a P Lm.
  • each metabolite profile contains data on metabolites A, B, C ...
  • the measured values of the abundance of each metabolite are [A], [B], [C] ...
  • the predictive model for distinguishing iPS cells with high differentiation efficiency from iPS cells with low differentiation efficiency is as follows.
  • Predicted score i + a [A] + b [B] + c [C] ...
  • the present invention is made by determining the constant terms i and the coefficients a, b, c ... Of the mathematical formula so that it can be determined that the differentiation efficiency is high when the predicted score is equal to or higher than a predetermined threshold value T. It is possible to construct a differentiation efficiency prediction model in.
  • OPLS Orthogonal Partial Least Square
  • PLS Partial Least Squares regression
  • PCA Principal Component Analysis
  • a culture supernatant was collected from an iPS cell clone (test cell group) having an unknown differentiation efficiency and cultured in an undifferentiated state (step S11), and the culture supernatant was quantitatively analyzed by GC-MS.
  • Obtain a biotransform profile step S12).
  • the metabolite profile is applied to a predetermined prediction model (step S13), and it is determined whether or not the predicted score obtained as a result is equal to or higher than a predetermined threshold value (step S14).
  • step S14 When the predicted score is equal to or higher than the threshold value (Yes in step S14), it is determined that the test cell group has high differentiation efficiency (step S15), and when the predicted score is smaller than the threshold value (No in step S14). Determines that the test cells have low differentiation efficiency (step S16).
  • the plurality of metabolites used for constructing a prediction model and predicting the differentiation efficiency of test cells are at least 2-aminoethanol, 2-deoxyglucone, 2-hydroxyisocaproic acid, and 2-hydroxyisovalonic acid.
  • the plurality of metabolites used for constructing a prediction model and predicting the differentiation efficiency of test cells further include 2'-deoxyuridine, 2-hydroxy-3-methylsucrose acid, 2-hydroxybutyric acid, 2-. Selected from ketoadipic acid, 3-aminopropanoic acid, 3-hydroxydodecanoic acid, allose, asparagine, citrulin, galactose, glucaric acid, glucosamine, glucose, maleic acid, mandelic acid, sorbitol, sorbose, sucrose, timine, and xylitol. It may contain at least one metabolite.
  • the method for predicting the differentiation efficiency of iPS cells according to the present invention can be suitably used, for example, when a clone having a high differentiation efficiency into chondrocytes or NC cells is selected from a large number of iPS cell clones. Even for iPS cell clones with high differentiation efficiency, the differentiation efficiency may decrease due to aging as the culture is continued. Therefore, the method for predicting differentiation efficiency according to the present invention is used for quality evaluation (confirmation of whether or not differentiation efficiency has decreased) at each time point when one iPS cell clone is used for a long period of time. You can also do it.
  • chondrocytes differentiated from an NC cell population having a high expression level of the cell surface marker protein CD271 of NC cells are differentiated from an NC cell population having a low expression level of CD271. It is known that the expression level of chondrocyte-related genes is higher than that of other cells. Therefore, the iPS cell clone predicted to have high differentiation efficiency by the above differentiation efficiency prediction method is induced to differentiate into NC cells, and the cells having a high expression level of CD271 are sorted from the differentiation-induced cells. Then, NC cells having a high differentiation efficiency into cartilage cells can be obtained with high efficiency.
  • a plurality of test cell group C U1 each consisting of a single iPS cell clones, C U2 ... C Uk (k is an integer of 2 or more.
  • C U1 a plurality of test cell group C U1
  • C U2 ... C Uk k is an integer of 2 or more.
  • the metabolite profile P U1, P U2 ... P Uk is applied to a prediction model created in advance to predict the differentiation efficiency.
  • one differentiation efficiency is predicted to be high or more test cell populations (e.g., C U2) induced to differentiate into NC cells (Fig.
  • NC cells having a high expression level of CD271 are sorted by a cell sorter 10 using fluorescence flow cytometry. ..
  • the test cells stained with the fluorescent antibody are ejected from the nozzle 11 on the flow of the sheath liquid (sheath flow 20).
  • the laser beam emitted from the laser light source 12 is irradiated to the sheath stream 20, and the fluorescence emitted by each cell by the irradiation of the laser beam is detected by the detector 13.
  • the detection signal from the detector 13 is sent to the control / data processing unit 14, and the amount of antigen present on the cell surface (that is, the expression level of CD271) is determined based on the detected fluorescence intensity.
  • the vibrator 15 provided in the nozzle 11 vibrates the nozzle 11 ultrasonically to change the sheath flow 20 into droplets from the middle (below the irradiation position of the laser beam).
  • the charge-imparting portion 16 provided below the nozzle 11 is on the verge of forming droplets by the sheath solution containing the target cells (that is, cells in which the expression level of CD271 is higher than a predetermined threshold value). A charge is applied to the sheath liquid. As a result, a charged droplet 21 containing the target cells is generated, and the charged droplet 21 is attracted to the deflection electrode plate 17 provided below the charging portion 16 and collected in the collection container 18.
  • the cell sorter of the method of separating the target cells by charging the droplets has been described as an example here, any other type of cell sorter may be used.
  • 14 types of human iPS cell lines 201B2, 201B7, 414C2, 451F3, 409B2, TIG118-4f1, 604A1, 606A1, 610B1, 665A1, 703A1, 1503, as reference cell groups for constructing a predictive model.
  • -4f1, TIG107-4f1, and TIG120-4f1 were used.
  • iPS cells of each reference cell group cultured on feeder cells using a medium for iPS / ES cells were placed in a culture dish coated with Matrigel (Matrigel Growth Factor Reduce, manufactured by Corning). The cells were re-seeded (passage ratio 1: 5) and cultured in a feeder-free medium (mTeSR1, manufactured by Veritas) for 1 week. Then, the differentiation into neural crest cells was induced by culturing in the NC differentiation medium for 6 days.
  • the composition of the medium for NC differentiation is 10uM SB431542, 450uM 1-Thioglycerol, 170uM Ascorbic acid-2 nutrient, 20ug / mL Insulin, 100ug / mL Human holo-Transferrin, 2mM Glutamax-I, 37% Iscove's Modified Dulbecco's Medium ( IMDM) 2% CD lipid concentrate, 9.4% Chemical defined medium (CDM) base (both are final concentrations).
  • the CDM base is obtained by dissolving 5 g of Bovine serum albumin in Ham's F12 Nutrient Mixture solution and IMDM in the solution. Prepared by adding 127 mL, 3 mL of penicillin / streptomycin solution.
  • Each reference cell group after induction of differentiation was stained with a fluorescent antibody of CD271 which is a cell surface marker protein of NC cells, and the ratio of cells having a high expression level of CD271 (CD271 high + NC cells) was determined by fluorescence flow cytometry.
  • CD271 high + NC cells were defined as the differentiation efficiency of each reference cell group.
  • fluorescence flow cytometry those in which the intensity of fluorescence derived from the fluorescent antibody was equal to or higher than a predetermined threshold were counted as "CD271 high + NC cells" (such a threshold is a standard sample of only a fluorescent antibody). May be determined by measuring, or may be determined based on the distribution of the fluorescence intensity in the target sample as a histogram.
  • the threshold determination method is such that "CD271 high + NC cells" can be identified.
  • the reference cell group includes 7 cell groups with high differentiation efficiency (cell group in which the ratio of CD271 high + NC cells is 20% or more) and a cell group with low differentiation efficiency (CD271 high +). It was confirmed that the cells were divided into 7 strains (cell group) in which the proportion of NC cells was less than 20%. Furthermore, when the differentiation efficiencies of these cell groups with high differentiation efficiency and those with low differentiation efficiency were compared and analyzed by t-test, it was confirmed that there was a statistically significant (p ⁇ 0.001) difference in differentiation efficiency. (Fig. 6).
  • the iPS cells cultured on the feeder cells were re-seeded (passage ratio 1: 5) in a culture dish coated with Matrigel (Matrigel Growth Factor Reduce, manufactured by Corning), and the feeder-free medium (mTeSR1, It was cultured for 1 week using a product manufactured by Veritas. After 1 week, the medium was collected, centrifuged at 3,000 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was collected as a medium metabolite sample.
  • mTeSR1 feeder-free medium
  • the cells after removing the medium were washed with PBS (Phosphate buffered saline) solution, 1 mL of papine solution was added, and then the cell suspension was recovered using a cell scraper. The cell suspension was allowed to stand at 60 ° C. overnight, centrifuged at 15,000 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was collected as a DNA quantitative sample.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • the DNA in the above-mentioned DNA quantification sample was quantified using a picogreen reagent (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and the profile of each biotransformer obtained by the analysis by the GC-MS was used to obtain the internal standard MS peak intensity of Ribitol. The data was normalized by dividing by the total amount of DNA.
  • a model for distinguishing a cell group having a high differentiation efficiency from a cell group having a low differentiation efficiency is constructed by using either the first metabolite profile or the second metabolite profile. It was suggested that it could be done.
  • first prediction model By instructing the construction of a prediction model using the first metabolite profile on SIMCA13, a prediction model represented by the following formula (1) (hereinafter referred to as “first prediction model”) was obtained. Integrated value of constant (0.845284) + ((coefficient for each metabolite (see Fig. 11) x (measured value of each metabolite))) ... (1) Similarly, by instructing the construction of a prediction model using the second metabolite profile on SIMCA13, a prediction model represented by the following equation (2) (hereinafter referred to as "second prediction model”) can be obtained. Was done. Integrated value of constant (0.630201) + ((coefficient for each metabolite (see Fig. 12) x (measured value of each metabolite)) ... (2)
  • FIG. 13 shows the results of obtaining the R2 value and the Q2 value of the first prediction model
  • FIG. 14 shows the results of obtaining the R2 value and the Q2 value of the second prediction model.
  • the R2 value is an index showing the goodness of fit of the model to the data used for model construction, and it can be said that the closer this value is to 1, the higher the goodness of fit of the model.
  • the Q2 value is an index showing the suitability (predictability) of the model to unknown data, and if this value is 0.5 or more, it can be said that the predictability of the model is high. As shown in FIGS. 13 and 14, it was confirmed that the R2 value and the Q2 value of the first prediction model and the second prediction model were both high values.
  • FIGS. 15 and 16 the results of testing the first prediction model and the second prediction model by the permutation test are shown in FIGS. 15 and 16.
  • the vertical axis represents the R2 value or the Q2 value.
  • the horizontal axis represents the frequency of data replacement, and the smaller the value on the horizontal axis, the higher the frequency of data replacement.
  • the y-intercept of the Q2 straight line was negative in both models, confirming that these prediction models did not overfit only the data used for model construction. Was done.
  • each prediction model was verified by applying the above first prediction model and the second prediction model to another iPS cell line.
  • each verification cell group was analyzed by fluorescence flow cytometry using an antibody against the CD271 protein in the same manner as described above. As a result, it was confirmed that the above-mentioned verification cell group was divided into a cell group having a high differentiation efficiency (6 strains) and a cell group having a low differentiation efficiency (4 strains) (FIG. 17).
  • the median predicted score for cell lines with high differentiation efficiency is compared to the median predicted score for strains with low differentiation efficiency, regardless of which prediction model is used. It was confirmed that it was high. From this, it was confirmed that the actual differentiation efficiency of iPS cells can be predicted by these prediction models.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

軟骨細胞又は神経堤細胞への分化効率が既知である複数のｉＰＳ細胞クローンの培養上清に含まれる複数の代謝物を定量し、該定量によって得られた前記複数の代謝物の測定値と前記分化効率との関係を多変量解析することによってｉＰＳ細胞の分化効率予測モデルを構築する。更に、単一のｉＰＳ細胞クローンから成る被検細胞群の培養上清に含まれる前記複数の代謝物を定量し、該定量によって得られた前記モデルに当てはめることにより、該被検細胞群の軟骨細胞又は神経堤細胞への分化効率を予測する。これにより、ｉＰＳ細胞の軟骨細胞又は神経堤細胞への分化効率を短時間で予測することが可能となる。

Description

ｉＰＳ細胞の分化効率予測モデルの構築方法及びｉＰＳ細胞の分化効率予測方法
　本発明は、未分化状態のｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）の分化効率を非侵襲的に予測する方法に関し、特にｉＰＳ細胞の軟骨細胞等への分化効率を予測する方法に関する。
　ｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化経路としては、図２０に示すように、ｉＰＳ細胞から神経堤細胞（ＮＣ細胞）を経て軟骨細胞に分化する経路が知られている。ヒトから作製した複数のｉＰＳ細胞株の中から軟骨細胞への分化効率が高いものを見つけ出すための手段としては、従来、各ｉＰＳ細胞株を軟骨細胞へと分化誘導した上で、各細胞における軟骨関連遺伝子の発現量を測定したり（図２０中の網掛けの矢印）、分化誘導後の各細胞に免疫組織化学染色を施すことによって軟骨関連タンパク質の発現量を測定したりする方法があった。
　しかし、こうした方法では、作製したｉＰＳ細胞を、一度、軟骨細胞に分化させてみる必要があるため、分化効率を調べるのに長期間を要するという問題があった。
　そこで、上記に代わる手段として、ｉＰＳ細胞をＮＣ細胞へ分化誘導した後に、各細胞におけるＮＣ細胞の細胞表面マーカータンパク質であるＣＤ２７１の発現量を調べる方法が知られている（図２０中の白矢印）。前記ＮＣ細胞への分化誘導後の細胞を蛍光抗体で染色して蛍光フローサイトメトリーによる定量分析を行うと、前記分化誘導後の細胞は、ＣＤ２７１の発現量が少ない細胞集団 （ＣＤ２７１low+ ＮＣ細胞）と発現量が多い集団（ＣＤ２７１high+ ＮＣ細胞）とに分かれる （図２１）。これらの細胞をそれぞれ更に軟骨細胞へと分化誘導すると、ＣＤ２７１high+ ＮＣ細胞集団から分化誘導した細胞はＣＤ２７１low+ ＮＣ細胞から分化させたものと比較して、軟骨関連遺伝子の発現量が多いことが分かっている（非特許文献１、２）。したがって、ｉＰＳ細胞からＮＣ細胞への分化誘導を行った後に各細胞におけるＣＤ２７１の発現量を測定して、ＣＤ２７１high+ ＮＣ細胞の割合が多いｉＰＳ細胞株を選定することにより、結果的に、軟骨への分化効率の高いｉＰＳ細胞を選別することができる。
Umeda K. et al., Stem Cell Reports. 2015 Apr 14;4（4）, p.712-26 Fukuta M. et al., PLOS ONE. 2014 9 (12）
　上記のようにＮＣ細胞への分化誘導後におけるマーカータンパク質ＣＤ２７１の発現量を調べる方法によれば、軟骨細胞への分化誘導後に軟骨関連遺伝子（又は軟骨関連タンパク質）の発現量を調べる方法に比べて、分化効率を調べるのに要する期間を大幅に短縮することができる。しかし、この場合でも、ｉＰＳ細胞からＮＣ細胞の分化誘導には、少なくとも８日程度が必要であるため、更なる期間短縮が求められていた。
　本発明は、上記の点に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、ｉＰＳ細胞の軟骨細胞（又はＮＣ細胞）への分化効率（以下単に「分化効率」とよぶことがある）を短時間で予測することのできる方法を提供することにある。
　上記課題を解決するためになされた本発明に係るｉＰＳ細胞の分化効率予測モデルの構築方法は、
　軟骨細胞又は神経堤細胞への分化効率が既知である複数のｉＰＳ細胞クローンからそれぞれ培養上清を採取し、各培養上清に含まれる複数の代謝物を定量し、該定量した結果を多変量解析することによって、前記複数の代謝物の定量値からｉＰＳ細胞の軟骨細胞又は神経堤細胞への分化効率を予測する数式である予測モデルを構築することを特徴としている。
　また、上記課題を解決するためになされた本発明に係るｉＰＳ細胞の分化効率予測方法は、
　単一のｉＰＳ細胞クローンから成る被検細胞群から培養上清を採取し、該培養上清に含まれる複数の代謝物を定量し、得られた前記複数の代謝物の定量値を、上記の方法で構築された前記予測モデルに当てはめることによって、該被検細胞群の軟骨細胞又は神経堤細胞への分化効率を予測することを特徴とする。
　上記本発明に係るｉＰＳ細胞の分化効率予測モデルの構築方法及びｉＰＳ細胞の分化効率予測方法は、前記複数の代謝物が、2-アミノエタノール、2-デオキシグルコース、2-ヒドロキシイソカプロン酸、2-ヒドロキシイソ吉草酸、2-メチル-3-ヒドロキシ酪酸、4-アミノ酪酸、アセト酢酸、カダベリン、ジヒドロキシアセトン、フルクトース、ガラクツロン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリシン、イソブチリルグリシン、リシン、リキソース、リンゴ酸、メサコン酸、メチルこはく酸、メバロン酸ラクトン、モノステアリン、プロリン、プシコース、コハク酸、タガトース、トレイトール、及びトレオニンを含むことが望ましい。
　上記本発明に係るｉＰＳ細胞の分化効率予測モデルの構築方法及びｉＰＳ細胞の分化効率予測方法は、前記複数の代謝物が、更に、2'-デオキシウリジン、2-ヒドロキシ-3-メチル吉草酸、2-ヒドロキシ酪酸、2-ケトアジピン酸、3-アミノプロパン酸、3-ヒドロキシドデカン二酸、アロース、アスパラギン、シトルリン、ガラクトース、グルカル酸、グルコサミン、グルコース、マレイン酸、マンデル酸、ソルビトール、ソルボース、スクロース、チミン、及びキシリトールから選ばれる少なくとも１種の代謝物を含むものであってもよい。
　本発明は更に、軟骨への分化効率の高い神経堤細胞を取得する方法を提供する。
　すなわち、本発明に係る軟骨への分化効率の高い神経堤細胞の取得方法は、それぞれが単一のｉＰＳ細胞クローンから成る１つ又は複数の被検細胞群に対して上記本発明の方法による分化効率の予測を行い、その結果、分化効率が高いと予測された１つ又は複数の被検細胞群を神経堤細胞へと分化誘導した後、該分化誘導を受けた前記被検細胞群に対してＣＤ２７１タンパク質に対する抗体を用いたセルソーティングを行うことによって該タンパク質の発現量が予め定めた閾値よりも高い細胞を分取することを特徴としている。
　上記本発明に係るｉＰＳ細胞の分化効率予測モデルの構築方法及びｉＰＳ細胞の分化効率予測方法によれば、未分化状態のｉＰＳ細胞の培養上清に含まれる代謝物に基づいて該ｉＰＳ細胞の軟骨細胞又はＮＣ細胞への分化効率を予測することが可能となる。したがって、ｉＰＳ細胞を従来のように軟骨細胞やＮＣ細胞まで分化誘導する必要がないため、分化効率を知るのに要する時間や手間を低減することができる。
本発明の一実施形態に係るｉＰＳ細胞の分化効率予測モデルの構築方法を説明する概念図。 同実施形態におけるｉＰＳ細胞の分化効率予測方法を説明するフローチャート。 分化効率が未知である複数のｉＰＳ細胞群の中から分化効率が高い細胞群を特定する際の手順を示す概念図。 予測モデルにより分化効率が高いと判定されたｉＰＳ細胞群から軟骨細胞への分化効率が高いＮＣ細胞を取得する方法を説明する概念図。 ＮＣ細胞への分化誘導後の参照細胞群におけるＣＤ２７１high+ ＮＣ細胞の割合を示すグラフ。 分化効率が高い細胞群（Good Clones）と分化効率が低い細胞群（Poor Clones）のそれぞれにおけるＣＤ２７１high+ ＮＣ細胞の割合を示すグラフ。 分化効率が高い細胞群と低い細胞群との間で１．５倍以上の量変動が見られた代謝物の名称及びその変動倍率。 分化効率が高い細胞群と低い細胞群との間で有意な量変動が見られた代謝物の名称、その変動倍率、及びp-値。 第１の代謝物プロファイルに対するＯＰＬＳ解析の結果を示すスコアプロット。 第２の代謝物プロファイルに対するＯＰＬＳ解析の結果を示すスコアプロット。 第１予測モデルにおいて各代謝物の測定値に与えられる係数を示す図。 第２予測モデルにおいて各代謝物の測定値に与えられる係数を示す図。 第１予測モデルの分化効率が高い細胞群（Good Clones）と分化効率が低い細胞群（Poor Clones）におけるＲ２値及びＱ２値を示すグラフ。 第２予測モデルの分化効率が高い細胞群と分化効率が低い細胞群におけるＲ２値及びＱ２値を示すグラフ。 第１予測モデルに対する並べ替え検定（Permutation test）の結果を示すグラフ。 第２予測モデルに対する並べ替え検定の結果を示すグラフ。 ＮＣ細胞への分化誘導後の検証用細胞群におけるＣＤ２７１high+ ＮＣ細胞の割合を示すグラフ。 検証用細胞群の代謝物プロファイルを第１予測モデルに適用した結果を示すグラフ。 検証用細胞群の代謝物プロファイルを第２予測モデルに適用した結果を示すグラフ。 従来のｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化効率を調べる方法を説明するための概念図。 蛍光フローサイトメトリーによって測定された、ＮＣ細胞におけるマーカータンパク質ＣＤ２７１の発現量を示すグラフ。
　本発明に係るｉＰＳ細胞の分化効率予測モデルの構築方法は、
　軟骨細胞又は神経堤細胞への分化効率が既知である複数のｉＰＳ細胞クローンからそれぞれ培養上清を採取し、各培養上清に含まれる複数の代謝物を定量し、該定量した結果を多変量解析することによって、前記複数の代謝物の定量値からｉＰＳ細胞の軟骨細胞又は神経堤細胞への分化効率を予測する数式である予測モデルを構築するものである。
　また、本発明に係るｉＰＳ細胞の分化効率予測方法は、
　単一のｉＰＳ細胞クローンから成る被検細胞群から培養上清を採取し、該培養上清に含まれる前記複数の代謝物を定量し、得られた前記複数の代謝物の定量値を、上記の方法で構築された前記予測モデルに当てはめることによって、該被検細胞群の軟骨細胞又は神経堤細胞への分化効率を予測するものである。
　なお、前記培養上清に含まれる複数の代謝物を定量する方法としては、例えば、ガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ－ＭＳ）、液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ）、又はキャピラリー電気泳動質量分析計（ＣＥ－ＭＳ）を用いた定量分析を好適に利用することができる。また、こうした質量分析による定量分析の他、例えば、培養上清に所定の前処理を施した試料を溶離液とともに液体クロマトグラフィ（ＬＣ）装置のカラムに流し、カラムにより分離されて溶出する成分を、紫外可視分光検出器や赤外分光検出器等の検出器で検出した結果から、試料中に含まれる前記複数の代謝物を定量するようにしてもよい。
　本発明の一実施形態によるｉＰＳ細胞の分化効率予測モデルの作成手順について、図１を参照しつつ説明する。まず、参照細胞群として、予め軟骨細胞又はＮＣ細胞への分化効率が高いことが分かっている複数のｉＰＳ細胞株ＣＨ１、ＣＨ２、…ＣＨｎと、前記分化効率が低いことが分かっている複数のｉＰＳ細胞株ＣＬ１、ＣＬ２、…ＣＬｍ（ｎ、ｍは２以上の整数、以下同じ）を用意し、未分化状態の各参照細胞群から培養上清ＳＨ１、ＳＨ２、…ＳＨｎ及びＳＬ１、ＳＬ２、…ＳＬｍを採取する。これらの培養上清ＳＨ１、ＳＨ２、…ＳＨｎ及びＳＬ１、ＳＬ２、…ＳＬｍ、に対して、ＧＣ－ＭＳによる定量分析を行うことにより、各参照細胞群ＣＨ１、ＣＨ２、…ＣＨｎ及びＣＬ１、ＣＬ２、…ＣＬｍについての代謝物プロファイルＰＨ１、ＰＨ２、…ＰＨｎ及びＰＬ１、ＰＬ２、…ＰＬｍを取得する。ここで、代謝物プロファイルは、少なくとも前記培養上清に含まれる複数の代謝物の識別子とその定量値を含んでいる。ここで、代謝物の「識別子」とは各化合物に固有の名称、番号、又は記号であり、典型的には化合物名であるが、その他、マススペクトル上における該化合物のピークのm/z（質量電荷比）などであってもよい。また、「定量値」とは、培養上清中における各代謝物の存在量を示す値であり、例えば、ＧＣ－ＭＳの検出器による該化合物の検出信号の強度や、該強度から算出された、前記培養上清中における当該化合物の濃度等とすることができる。その後、分化効率が高い参照細胞群ＣＨ１、ＣＨ２、…ＣＨｎについて取得された代謝物プロファイルＰＨ１、ＰＨ２、…ＰＨｎと、分化効率が低い参照細胞群について取得された代謝物プロファイルＰＬ１、ＰＬ２、…ＰＬｍとを多変量解析によって比較解析することによって予測モデルを構築する。
　例えば、各代謝物プロファイルに代謝物Ａ、Ｂ、Ｃ…のデータが含まれているものとし、各代謝物の存在量の測定値を［Ａ］、［Ｂ］、［Ｃ］…とすると、分化効率が高いｉＰＳ細胞と分化効率が低いｉＰＳ細胞を識別するための予測モデルは以下のようになる。
　予測スコア＝ｉ＋ａ[Ａ]＋ｂ［Ｂ］＋ｃ[Ｃ]…
　ここで、例えば、前記予測スコアが所定の閾値Ｔ以上である場合に分化効率が高いと判定できるように、前記数式の定数項ｉ及び係数ａ、ｂ、ｃ…を決定することによって、本発明における分化効率予測モデルを構築することができる。
　なお、前記予測モデルの構築に使用する多変量解析の手法としては、ＯＰＬＳ（Orthogonal Partial Least Square）を好適に用いることができるが、このほか、ＰＬＳ（Partial Least Squares regression ）やＰＣＡ（Principal Component Analysis）等の解析法を用いることもできる。
　次に、本発明の一実施形態によるｉＰＳ細胞の分化効率予測方法の実施手順について、図２のフローチャートを参照しつつ説明する。まず、未分化状態で培養されている分化効率未知のｉＰＳ細胞クローン（被検細胞群）から培養上清を採取し（ステップＳ１１）、該培養上清についてＧＣ－ＭＳによる定量分析を行うことにより代謝物プロファイルを取得する（ステップＳ１２）。その後、前記代謝物プロファイルを、予め作成された予測モデルに適用し（ステップＳ１３）、その結果求められた予測スコアが、予め定められた閾値以上であるか否かを判定する（ステップＳ１４）。予測スコアが閾値以上であった場合（ステップＳ１４でＹｅｓ）は、前記被検細胞群は分化効率が高いと判定し（ステップＳ１５）、予測スコアが閾値よりも小さかった場合（ステップＳ１４でＮｏ）は、前記被検細胞は分化効率が低いと判定する（ステップＳ１６）。
　なお、予測モデルの構築及び被検細胞の分化効率の予測に用いられる前記複数の代謝物は、少なくとも、2-アミノエタノール、2-デオキシグルコース、2-ヒドロキシイソカプロン酸、2-ヒドロキシイソ吉草酸、2-メチル-3-ヒドロキシ酪酸、4-アミノ酪酸、アセト酢酸、カダベリン、ジヒドロキシアセトン、フルクトース、ガラクツロン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリシン、イソブチリルグリシン、リシン、リキソース、リンゴ酸、メサコン酸、メチルこはく酸、メバロン酸ラクトン、モノステアリン、プロリン、プシコース、コハク酸、タガトース、トレイトール、及びトレオニンを含むものであることが望ましい。
　また、予測モデルの構築及び被検細胞の分化効率の予測に用いられる前記複数の代謝物は、更に、2'-デオキシウリジン、2-ヒドロキシ-3-メチル吉草酸、2-ヒドロキシ酪酸、2-ケトアジピン酸、3-アミノプロパン酸、3-ヒドロキシドデカン二酸、アロース、アスパラギン、シトルリン、ガラクトース、グルカル酸、グルコサミン、グルコース、マレイン酸、マンデル酸、ソルビトール、ソルボース、スクロース、チミン、及びキシリトールから選ばれる少なくとも１種の代謝物を含むものであってもよい。
　本発明に係るｉＰＳ細胞の分化効率予測方法は、例えば、多数のｉＰＳ細胞クローンの中から軟骨細胞又はＮＣ細胞への分化効率が高いクローンを選出するような場合に好適に利用することができる。なお、分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンであっても、培養を続けるうちにエイジングによって分化効率が落ちることがある。そこで、本発明に係る分化効率の予測方法は、１つのｉＰＳ細胞クローンを長期間に亘って利用するにあたり、各時点における該クローンの品質評価（分化効率が低下していないかの確認）に用いることもできる。
　また、非特許文献１、２に記載のように、ＮＣ細胞の細胞表面マーカータンパク質ＣＤ２７１の発現量が高いＮＣ細胞集団から分化させた軟骨細胞は、ＣＤ２７１の発現量が低いＮＣ細胞集団から分化させたものと比較して、軟骨関連遺伝子の発現量が高いことが分かっている。そこで、上記の分化効率予測方法によって分化効率が高いと予測されたｉＰＳ細胞クローンをＮＣ細胞に分化誘導し、該分化誘導された細胞の中からＣＤ２７１の発現量が高い細胞を分取することにすれば、軟骨細胞への分化効率の高いＮＣ細胞を高効率に取得することができる。
　具体的には、まず、図３に示すように、それぞれが単一のｉＰＳ細胞クローンから成る複数の被検細胞群ＣＵ１、ＣＵ２…ＣＵｋ（ｋは２以上の整数。以下同じ。）について、それぞれ培養上清ＳＵ１、ＳＵ２…ＳＵｋを採取してＧＣ－ＭＳで定量分析することにより代謝物プロファイルＰＵ１、ＰＵ２…ＰＵｋを作成し、該代謝物プロファイルＰＵ１、ＰＵ２…ＰＵｋを、予め作成した予測モデルに適用することによって分化効率の予測を行う。その結果、分化効率が高いと予測された１つ又は複数の被検細胞群（例えばＣＵ２）をＮＣ細胞に分化誘導し（図４）、該分化誘導を受けた被検細胞群ＣＵ２を細胞表面マーカータンパク質ＣＤ２７１に対する蛍光抗体で染色した後、蛍光フローサイトメトリーを利用したセルソーター１０によってＣＤ２７１の発現量が高い（すなわちＣＤ２７１の発現量が予め定めた閾値以上である）ＮＣ細胞を分取する。
　セルソーター１０では、上記蛍光抗体で染色された被検細胞が、シース液の流れ（シース流２０）に乗ってノズル１１から吐出される。このとき、レーザ光源１２から出射されたレーザ光がシース流２０に照射され、該レーザ光の照射によって各細胞が発する蛍光が検出器１３で検出される。検出器１３からの検出信号は制御／データ処理部１４に送られ、検出された蛍光の強度に基づいて細胞表面に存在する抗原の量（すなわちＣＤ２７１の発現量）が求められる。また、ノズル１１内に設けられた振動子１５がノズル１１を超音波振動させることによってシース流２０を途中（レーザ光の照射位置よりも下方）から液滴に変化させる。更に、ノズル１１の下方に設けられた電荷付与部１６が、目的の細胞（すなわちＣＤ２７１の発現量が予め定めた閾値よりも高い細胞）を含むシース液が液滴を形成しようとする寸前に、該シース液に電荷を付与する。これにより目的の細胞を内包した荷電液滴２１が生成され、この荷電液滴２１は電荷付与部１６の下方に設けられた偏向用電極板１７に引き寄せられて回収容器１８に捕集される。なお、ここでは液滴を帯電させることによって目的細胞の分取を行う方式のセルソーターを例に挙げて説明を行ったが、そのほか、いかなる方式のセルソーターを用いてもよい。
　本実施例では、予測モデルを構築するための参照細胞群として、１４種類のヒトｉＰＳ細胞株、201B2, 201B7, 414C2, 451F3, 409B2, TIG118-4f1, 604A1, 606A1, 610B1, 665A1, 703A1, 1503-4f1, TIG107-4f1, 及びTIG120-4f1を使用した。
［既知手法による分化効率の判定］
　まず、ｉＰＳ／ＥＳ細胞用培地（リプロセル社製）を使用してフィーダー細胞上で培養した各参照細胞群のｉＰＳ細胞を、マトリゲル（マトリゲル グロースファクター リデュースト、コーニング社製）でコートした培養皿に再播種（継代比率１：５）し、フィーダーフリー用培地（mTeSR1, ベリタス社製）で１週間培養した。その後、ＮＣ分化用培地で６日間培養することによって、神経堤細胞への分化誘導を行った。なお、ＮＣ分化用培地の組成は、10uM SB431542, 450uM 1-Thioglycerol, 170uM Ascorbic acid-2 phosphate, 20ug/mL Insulin, 100ug/mL Human holo-Transferrin, 2mM Glutamax-I, 37% Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) 2% CD lipid concentrate, 9.4% Chemical defined medium (CDM) base（いずれも終濃度）であり、前記CDM baseは、Bovine serum albumin 5gをHam's F12 Nutrient Mixture液中に溶解し、その溶液にIMDM 127mL, ペニシリン・ストレプトマイシン溶液 3mLを添加することによって調製した。分化誘導後の各参照細胞群をＮＣ細胞の細胞表面マーカータンパク質であるＣＤ２７１の蛍光抗体で染色し、蛍光フローサイトメトリーによってＣＤ２７１の発現量が多い細胞（ＣＤ２７１high+ ＮＣ細胞）の割合を求め、これを各参照細胞群の分化効率とした。なお、前記蛍光フローサイトメトリーでは、前記蛍光抗体に由来する蛍光の強度が所定の閾値以上であったものを「ＣＤ２７１high+ ＮＣ細胞」として計数した（このような閾値は、蛍光抗体のみの標準サンプルを測定して決定してもよく、対象サンプル中における蛍光強度をヒストグラムにしたときの分布に基づいて決定してもよい。その他、閾値の決定方式は「ＣＤ２７１high+ ＮＣ細胞」が特定できる程度に設定される限りにおいて、限定されるものではない。）。その結果、図５に示すように、上記参照細胞群は、分化効率が高い細胞群（ＣＤ２７１high+ ＮＣ細胞の割合が20％以上である細胞群）７株と分化効率が低い細胞群（ＣＤ２７１high+ ＮＣ細胞の割合が20％未満である細胞群）７株に分かれることが確認された。更に、これら分化効率が高い細胞群と分化効率が低い細胞群の分化効率を、t-検定により比較解析すると、統計学的有意（p<0.001）に分化効率の差が見られることが確認できた（図６）。
［代謝物プロファイルの取得］
　次に、各参照細胞群を未分化状態で培養している培地から培養上清を回収し、ガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ－ＭＳ）による分析によって培地中の各代謝物を定量することにより代謝物プロファイルを取得した。具体的な手順を以下に説明する。
　まず、フィーダー細胞上で培養しているｉＰＳ細胞をマトリゲル（マトリゲル グロースファクター リデュースト、コーニング社製）でコートした培養皿に再播種（継代比率１：５）し、フィーダーフリー用培地（mTeSR1, ベリタス社製）を用いて１週間培養した。１週間後に培地を回収し、3,000×gで5分間遠心分離後、その上清を培地代謝物サンプルとして回収した。
　また、培地除去後の細胞をＰＢＳ（Phosphate buffered saline）溶液で洗浄し、パパイン溶液1mLを添加後、セルスクレイパーを用いて細胞懸濁液を回収した。前記細胞懸濁液を、60℃で終夜静置した後、15,000×gで5分間遠心分離し、その上清をＤＮＡ定量サンプルとして回収した。
　前記培地代謝物サンプル溶液200uLに対して氷冷したメタノール800uL、リビトール溶液（7.2nmol/uL）1uLを添加し、-20℃で30分間静置した。その後、10,000×gで5分間遠心分離して上清を回収した後、遠心濃縮機を用いてサンプル溶液を乾固させた。乾固させたサンプルに無水ピリジン80uLと ＭＳＴＦＡ（N-Methyl-N-TMS-Trifluoroacetamide）溶液40uLを添加し、再溶解後、30℃で30分間静置した。反応後、サンプル溶液1uLをＧＣ－ＭＳにインジェクションし、各代謝物のプロファイルを取得した。
　一方、ピコグリーン試薬 （ThermoFisher Scientific社製）を用いて上述のＤＮＡ定量サンプル中のＤＮＡを定量し、前記ＧＣ－ＭＳによる分析で取得された各代謝物のプロファイルを、リビトールの内部標準ＭＳピーク強度と総ＤＮＡ量で割ることによってデータのノーマライゼーションを行った。
　［モデル構築に使用する代謝物候補の選定］
　分化効率が高い細胞群と分化効率が低い細胞群とで、取得した代謝物プロファイルを比較した結果、４７種類の代謝物について１．５倍以上の量変動が確認された（図７）。他方、２９種類の代謝物については統計学的有意（t-検定による有意差検定でp<0.05）に量変動が見られた（図８）。なお、図７及び図８中の代謝物名に含まれる「-nTMS」、「-nTMS(m)」、「-meto-nTMS」、「-meto-nTMS(m)」、又は「「-oxime-nTMS」」（n及びmは自然数）は、ＧＣ－ＭＳによる分析時に添加されたＧＣ用試薬に起因するものであり、例えば、図８中の「Tagatose-meto-5TMS(1)」、「Tagatose-5TMS(2)」、及び「Tagatose-5TMS(3)」はいずれも培地中の同一の代謝物（Tagatose）に由来するものである。
　［代謝物プロファイルの検討］
　Umetrics社製多変量解析ソフトウェアＳＩＭＣＡ１３を使用し、ＯＰＬＳ法による、上記４７種類の代謝物に関する代謝物プロファイル（以下「第１の代謝物プロファイル」とよぶ）、及び上記２９種類の代謝物に関する代謝物プロファイル（以下「第２の代謝物プロファイル」とよぶ）に対する多変量解析を行った。その結果、図９及び図１０に示すようなスコアプロットが得られた。これらの図から明らかなように、いずれのスコアプロットでも、分化効率が高い細胞群（Good Clones）を示す白丸と、分化効率が低い細胞群（Poor Clones）を示す灰色の丸とが異なる分布を示しており、第１の代謝物プロファイル及び第２の代謝物プロファイルのいずれを用いても、分化効率が高い細胞群と分化効率が低い細胞群とを識別するためのモデル（予測モデル）を構築できることが示唆された。
　［予測モデルの構築］
　ＳＩＭＣＡ１３上で、前記第１の代謝物プロファイルを用いた予測モデルの構築を指示することにより、以下の式（１）で示す予測モデル（以下「第１予測モデル」とよぶ）が得られた。
　定数(0.845284)+((各代謝物についての係数(図１１参照)×(各代謝物の測定値))の積算値　…（１）
　同様に、ＳＩＭＣＡ１３上で、前記第２の代謝物プロファイルを用いた予測モデルの構築を指示することにより、以下の式（２）で示す予測モデル（以下「第２予測モデル」とよぶ）が得られた。
　定数(0.630201)+((各代謝物についての係数(図１２参照)×(各代謝物の測定値))の積算値　…（２）
　［予測モデルの統計学的検証］
　上記第１予測モデルについてＲ２値及びＱ２値を求めた結果を図１３に、上記第２予測モデルについてＲ２値及びＱ２値を求めた結果を図１４に示す。Ｒ２値は、モデル構築に使用したデータへのモデルの適合度を示す指標であり、この値が１に近いほど該モデルの適合度は高いといえる。Ｑ２値は、未知データへのモデルの適合性（予測性）を示す指標であり、この値が０．５以上であればモデルの予測性は高いといえる。図１３及び図１４に示す通り、第１予測モデル及び第２予測モデルのＲ２値とＱ２値は、いずれも高い値であることが確認された。
　更に、並べ替え検定（Permutation test）によって第１予測モデル及び第２予測モデルを検定した結果を図１５及び図１６に示す。これらの図において縦軸はＲ２値又はＱ２値を示している。また、横軸はデータ入れ替えの頻度を表しており、横軸の値が小さいほどデータの入れ替え頻度が大きいことを示している。これらの図から明らかなように、どちらのモデルにおいてもＱ２直線のｙ切片が負であったことから、これらの予測モデルは、モデル構築に使用したデータのみにオーバーフィットしたものではないことが確認された。
　［予測モデルを用いた分化効率の予測］
　次に、上記の第１の予測モデル及び第２の予測モデルを別のｉＰＳ細胞株に適用することによって、各予測モデルを検証した。
　まず、検証用細胞群として、上記予測モデルの構築に使用したものとは異なる１０種類のヒトｉＰＳ細胞株、201B6、253G4、404C2、454E2、585A1、585B1、604A3、604B1、606A1、及び610A2を用意し、各検証用細胞群に対して上記同様にＣＤ２７１タンパク質に対する抗体を用いた蛍光フローサイトメトリーによる解析を行った。その結果、上記検証用細胞群は、分化効率が高い細胞群（６株）と分化効率が低い細胞群（４株）に分かれることを確認した（図１７）。これらの検証用細胞群を未分化のｉＰＳ細胞の状態で培養している培地からそれぞれ上記と同様にして培養上清を回収し、ＧＣ－ＭＳ分析によって各培養上清中の代謝物プロファイルを取得した。以上で得られた各代謝物プロファイルに含まれる複数の代謝物の測定値のうち、図７に記載の４７種類の代謝物の測定値を第１の予測モデルに適用（すなわち上記の（１）に代入）して得られた予測スコアの分布を図１８に示す。また、図８に記載の２９種類の代謝物の測定値を第２の予測モデルに適用（すなわち上記の式（２）に代入）して得られた予測スコアの分布を図１９に示す。これらの図から明らかなように、どちらの予測モデルを用いた場合でも、分化効率が高い細胞株での予測スコアの中央値が、分化効率が低い株での予測スコアの中央値と比較して高いことが確認された。このことから、これらの予測モデルによって実際のｉＰＳ細胞の分化効率を予測可能であることが確認された。
１０…セルソーター
１１…ノズル
１２…レーザ光源
１３…検出器
１４…制御／データ処理部
１５…振動子
１６…電荷付与部
１７…偏向用電極板
１８…回収容器
２０…シース流
２１…荷電液滴

Claims (5)

  1. 　軟骨細胞又は神経堤細胞への分化効率が既知である複数のｉＰＳ細胞クローンからそれぞれ培養上清を採取し、各培養上清に含まれる複数の代謝物を定量し、該定量した結果を多変量解析することによって、前記複数の代謝物の定量値からｉＰＳ細胞の軟骨細胞又は神経堤細胞への分化効率を予測する数式である予測モデルを構築することを特徴とするｉＰＳ細胞の分化効率予測モデルの構築方法。
  2. 　単一のｉＰＳ細胞クローンから成る被検細胞群から培養上清を採取し、該培養上清に含まれる複数の代謝物を定量し、得られた前記複数の代謝物の定量値を、請求項１に記載の方法で構築された前記予測モデルに当てはめることによって、該被検細胞群の軟骨細胞又は神経堤細胞への分化効率を予測することを特徴とするｉＰＳ細胞の分化効率予測方法。
  3. 　前記複数の代謝物が、2-アミノエタノール、2-デオキシグルコース、2-ヒドロキシイソカプロン酸、2-ヒドロキシイソ吉草酸、2-メチル-3-ヒドロキシ酪酸、4-アミノ酪酸、アセト酢酸、カダベリン、ジヒドロキシアセトン、フルクトース、ガラクツロン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリシン、イソブチリルグリシン、リシン、リキソース、リンゴ酸、メサコン酸、メチルこはく酸、メバロン酸ラクトン、モノステアリン、プロリン、プシコース、コハク酸、タガトース、トレイトール、及びトレオニンを含むことを特徴とする請求項２に記載のｉＰＳ細胞の分化効率予測方法。
  4. 　前記複数の代謝物が、更に、2'-デオキシウリジン、2-ヒドロキシ-3-メチル吉草酸、2-ヒドロキシ酪酸、2-ケトアジピン酸、3-アミノプロパン酸、3-ヒドロキシドデカン二酸、アロース、アスパラギン、シトルリン、ガラクトース、グルカル酸、グルコサミン、グルコース、マレイン酸、マンデル酸、ソルビトール、ソルボース、スクロース、チミン、及びキシリトールから選ばれる少なくとも１種の代謝物を含むことを特徴とする請求項３に記載のｉＰＳ細胞の分化効率予測方法。
  5. 　それぞれが単一のｉＰＳ細胞クローンから成る１つ又は複数の被検細胞群に対して請求項２に記載の方法による分化効率の予測を行い、その結果、分化効率が高いと予測された１つ又は複数の被検細胞群を神経堤細胞へと分化誘導した後、該分化誘導を受けた前記被検細胞群に対してＣＤ２７１タンパク質に対する抗体を用いたセルソーティングを行うことによって該タンパク質の発現量が予め定めた閾値よりも高い細胞を分取することを特徴とする軟骨への分化効率の高い神経堤細胞の取得方法。
PCT/JP2019/027225 2019-07-09 2019-07-09 ｉＰＳ細胞の分化効率予測モデルの構築方法及びｉＰＳ細胞の分化効率予測方法 WO2021005729A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17/623,777 US20220246231A1 (en) 2019-07-09 2019-07-09 Method for constructing model for predicting differentiation efficiency of ips cell and method for predicting differentiation efficiency of ips cell
JP2021530411A JP7185243B2 (ja) 2019-07-09 2019-07-09 ｉＰＳ細胞の分化効率予測モデルの構築方法及びｉＰＳ細胞の分化効率予測方法
PCT/JP2019/027225 WO2021005729A1 (ja) 2019-07-09 2019-07-09 ｉＰＳ細胞の分化効率予測モデルの構築方法及びｉＰＳ細胞の分化効率予測方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2019/027225 WO2021005729A1 (ja) 2019-07-09 2019-07-09 ｉＰＳ細胞の分化効率予測モデルの構築方法及びｉＰＳ細胞の分化効率予測方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021005729A1 true WO2021005729A1 (ja) 2021-01-14

Family

ID=74115000

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/027225 WO2021005729A1 (ja) 2019-07-09 2019-07-09 ｉＰＳ細胞の分化効率予測モデルの構築方法及びｉＰＳ細胞の分化効率予測方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20220246231A1 (ja)
JP (1) JP7185243B2 (ja)
WO (1) WO2021005729A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4092107A4 (en) * 2020-01-16 2023-12-06 FUJIFILM Corporation METHOD FOR PRODUCING PLURIPOTENT STEM CELLS WITH CAPACITY OF DIFFERENTIATION INTO SPECIFIC CELLS AND USE THEREOF

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016032470A (ja) * 2010-03-22 2016-03-10 ステミナ バイオマーカー ディスカバリー， インコーポレイテッド ヒト幹細胞様細胞及びメタボロミクスを使用した医薬のヒト発生毒性の予測
JP2017148046A (ja) * 2011-03-02 2017-08-31 バーグ エルエルシー 照合性細胞ベースのアッセイ及びその使用
WO2018225868A1 (ja) * 2017-06-10 2018-12-13 株式会社 島津製作所 ｉＰＳ細胞の遺伝子発現プロファイルによる軟骨細胞への分化能予測方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3202911B1 (en) 2014-09-29 2023-09-20 Tokyo Electron Limited Method for determining undifferentiated state of pluripotent stem cells by culture medium analysis
WO2017068727A1 (ja) 2015-10-23 2017-04-27 株式会社島津製作所 細胞の分化状態の評価方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016032470A (ja) * 2010-03-22 2016-03-10 ステミナ バイオマーカー ディスカバリー， インコーポレイテッド ヒト幹細胞様細胞及びメタボロミクスを使用した医薬のヒト発生毒性の予測
JP2017148046A (ja) * 2011-03-02 2017-08-31 バーグ エルエルシー 照合性細胞ベースのアッセイ及びその使用
WO2018225868A1 (ja) * 2017-06-10 2018-12-13 株式会社 島津製作所 ｉＰＳ細胞の遺伝子発現プロファイルによる軟骨細胞への分化能予測方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CEZAR, GABRIELA G. ET AL.: "Identification of Small Molecules from Human Embryonic Stem Cells Using Metabolomics", STEM CELLS AND DEVELOPMENT, vol. 16, 2007, pages 869 - 882, XP055559282 *
FOLMES, CLIFFORD DL ET AL.: "Metabolome and metaboproteome remodeling in nuclear reprogramming", CELL CYCLE, vol. 12, no. 15, 2013, pages 2355 - 2365, XP055558941, DOI: 10.4161/cc.25509 *
STRINGARI, CHIARA ET AL.: "Phasor approach to fluorescence lifetime microscopy distinguishes different metabolic states of germ cells in a live tissue", PNAS, vol. 108, no. 33, 2011, pages 13582 - 13587, XP055788937 *
TOHYAMA,SHUGO,: "Application of comprehensive metabolic anaivsis t.o recrenerat. i ve medicine", VASCULAR BIOLOGY & MEDICINE, vol. 14, no. 4, 2013 *
WATANABE, MAKOTO ET AL.: "Development of an algorithm predicting the differentiation potential of human IPS cells into chondrocytes, Shimadzu Review)", IPS, vol. 75, no. 4, 20 March 2019 (2019-03-20), pages 167 - 171 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4092107A4 (en) * 2020-01-16 2023-12-06 FUJIFILM Corporation METHOD FOR PRODUCING PLURIPOTENT STEM CELLS WITH CAPACITY OF DIFFERENTIATION INTO SPECIFIC CELLS AND USE THEREOF

Also Published As

Publication number Publication date
US20220246231A1 (en) 2022-08-04
JPWO2021005729A1 (ja) 2021-01-14
JP7185243B2 (ja) 2022-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Derks et al. Increasing the throughput of sensitive proteomics by plexDIA
Li et al. Recent developments in data independent acquisition (DIA) mass spectrometry: application of quantitative analysis of the brain proteome
CN103109345B (zh) 产物离子光谱的数据独立获取及参考光谱库匹配
EP1444526A1 (en) Ion mobility analysis of biological particles
JP2003532115A (ja) ヒト身体または動物身体由来の液体サンプルのタンパク質パターンおよび／またはペプチドパターンを定性的および／または定量的に分析するための方法およびデバイス
Nassar et al. Automation of sample preparation for mass cytometry barcoding in support of clinical research: protocol optimization
Steen et al. Analytical and computational advances, opportunities, and challenges in marine organic biogeochemistry in an era of “omics”
CN109390036B (zh) 一种挖掘甄选微藻油脂合成代谢标志物的方法
WO2021005729A1 (ja) ｉＰＳ細胞の分化効率予測モデルの構築方法及びｉＰＳ細胞の分化効率予測方法
Jagtap et al. Workflow for analysis of high mass accuracy salivary data set using M ax Q uant and P rotein P ilot search algorithm
CN107210184B (zh) 允许用于脂质组学研究的全面解决方案的脂质筛选平台
Rödiger et al. Tailored use of targeted proteomics in plant-specific applications
Petrosius et al. Evaluating the capabilities of the Astral mass analyzer for single-cell proteomics
Thompson et al. An enhanced isotopic fine structure method for exact mass analysis in discovery metabolomics: FIA-CASI-FTMS
Feng et al. Rapid characterization of protein productivity and production stability of CHO cells by matrix‐assisted laser desorption/ionization time‐of‐flight mass spectrometry
Su et al. Top-down proteomics of 10,000 single brain cells
Parker et al. Quantitative analysis of SILAC data sets using spectral counting
Merkley et al. A proteomics tutorial
Zheng et al. Deep Single-Shot NanoLC-MS Proteome Profiling with a 1500 Bar UHPLC System, Long Fully Porous Columns, and HRAM MS
CN110763784B (zh) 基于数据挖掘的高纯多肽中肽段杂质分析方法
US20110236906A1 (en) Secretory protein biomarkers for high efficiency protein expression
WO2020044435A1 (ja) データ解析方法、データ解析装置、及びデータ解析用の学習モデル作成方法
Santamaria-Fernandez et al. Precise and traceable 13C/12C isotope amount ratios by multicollector ICPMS
Pallecchi et al. Isomers Recognition in HPLC-MS/MS Analysis of Human Plasma Samples by Using an Ion Trap Supported by a Linear Equations-Based Algorithm
WO2021252514A1 (en) Metabolite fingerprinting

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19937348

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021530411

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19937348

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1