JP6563409B2 - 培養培地分析による多能性幹細胞の未分化状態の判定方法 - Google Patents

Description

本発明は、多能性幹細胞が培養された培養培地を分析することにより、多能性幹細胞の未分化状態を判定する方法に関する。

多能性幹細胞は、あらゆる組織に分化しうるその分化多能性ゆえに、組織分化の研究、薬物試験および再生医療などの様々な分野で幅広く用いられている。特にｉＰＳ細胞の樹立以降、この分野における研究の発展は著しく、再生医療実現に向けた様々な取り組みが世界中でなされている。

ところで、多能性幹細胞は、分化しやすく、一度分化してしまうと多能性を失う可能性があるため、多能性幹細胞の培養は、多能性幹細胞の未分化状態を維持しながら行う必要があり、未分化状態の維持は、多能性幹細胞の培養において最も重要な要素の一つであるといえる。

未分化状態を維持するためには、分化を阻害する薬剤の使用や、分化を開始した多能性幹細胞の除去などが行われる。多能性幹細胞の大量調製において、最も大きな障害となりうる問題の一つは、分化を開始した多能性幹細胞の除去である。分化を開始した細胞の除去が不十分な場合には、周囲の細胞の分化を誘導して培養細胞全体に悪影響を及ぼす可能性がある。しかし、多能性幹細胞が未分化状態であるか否かの判断は、熟練した技術者によらなければ難しい。このようなことから、多能性幹細胞の大量調製には自ずと限界がある。そのため、少なくとも熟練した技術者の判断に依らずに多能性幹細胞が未分化状態であるか否かを確認する方法の開発や、分化を開始した多能性幹細胞を自動判定できる方法の開発が望まれていた。

これまで、多能性幹細胞が未分化状態であるか否かを確認する方法としては、ｑＲＴ−ＰＣＲ法、免疫染色法、フローサイトメトリー法が使用されている（非特許文献１）。しかし、ｑＲＴ−ＰＣＲ法や免疫染色法は、測定に際し細胞を破壊する必要がある。フローサイトメトリー法は、非破壊測定が可能であるが、細胞をシングルセルの状態で懸濁する必要があり、煩雑な操作を要する。

一方、特許文献１には、培養細胞の重層化の程度を非侵襲的に判定する方法が開示されている。しかし、当該方法は、予め決定された閾値と比較して培養細胞の重層化の程度を判定する方法である。

特許文献２には、培養細胞の重層化および／または分化の程度を判定する方法が開示されている。しかし、当該方法は、予め決定された相関データベースと照会して培養細胞の重層化および／または分化の程度を判定する方法である。

よって、多能性幹細胞の未分化状態を確認する方法については依然として非破壊かつ簡便な方法の開発が望まれている。

特開２００４−２１５５８５号公報 特開２０１４−０４５６６３号公報

Nature Biotechnology 25, 803 - 816 (2007)

本発明は、熟練した技術者の判断によらず、簡便に多能性幹細胞の未分化状態を判定するための方法および装置、ならびに多能性幹細胞を未分化状態で培養するための細胞培養装置を提供することを目的とする。

本発明者らは、多能性幹細胞の培養工程において、培地交換の際、新しい培養培地に交換するために回収された使用済み培養培地中の代謝物について分析を行ったところ、特定の細胞外代謝物（Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、およびアンモニア）の変動値の経時的変化に基づいて、未分化の多能性幹細胞と分化を開始した多能性幹細胞との判別が可能であることを見出した。本発明は、このような知見に基づくものである。

すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）多能性幹細胞が培養された培養培地に含まれる細胞外代謝物の変動値の経時的変化に基づいて、多能性幹細胞の未分化状態を評価する工程を含んでなり、該細胞外代謝物が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、およびアンモニアからなる群から選択される少なくとも１つである、多能性幹細胞の未分化状態の判定方法。
（２）前記培養培地が、多能性幹細胞の未分化状態を維持するための培養培地である、（１）に記載の判定方法。
（３）前記培養培地が、培地交換により交換された後、次の培地交換まで使用される培養培地として得られる、（１）または（２）に記載の判定方法。
（４）培地交換の時間周期が、２４〜４８時間である、（３）に記載の判定方法。
（５）変動値が、前記培養培地に含まれる細胞外代謝物であるＬ−乳酸の変動量に対するＬ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、またはアンモニアの変動量の比として求められる、（１）〜（４）のいずれかに記載の判定方法。
（６）変動値が、培地交換された後、次の培地交換までの間のＬ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、およびアンモニアからなる群から選択される少なくとも１つの変動値である、（１）〜（５）のいずれかに記載の判定方法。
（７）変動値の経時的変化が、培地交換毎に得られる変動値の増減の傾向として求められる、（１）〜（６）のいずれかに記載の判定方法。
（８）変動値が、直前の培地交換時に得られた培養培地における変動値と比較して、減少傾向を示す場合に、多能性幹細胞が未分化な細胞と評価することを含んでなる、（１）〜（７）のいずれかに記載の判定方法。
（９）減少傾向を連続して示す場合に、多能性幹細胞が未分化な細胞と評価することを含んでなる、（８）に記載の判定方法。
（１０）変動値が、直前の培地交換時に得られた培養培地における変動値と比較して、減少傾向以外の傾向を示した場合に、多能性幹細胞が分化を開始した細胞と評価することを含んでなる、（１）〜（８）のいずれかに記載の判定方法。
（１１）多能性幹細胞が形成するコロニーの画像の微分フィルタ処理画像（微分画像）に基づいて、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価する工程をさらに含んでなる、（１）〜（１０）のいずれかに記載の判定方法。
（１２）（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
（１３）（１２）に記載のプログラムを記録したコンピュータに読み取り可能な記録媒体。
（１４）（１２）に記載のプログラムを内部記憶装置に記録したコンピュータ。
（１５）（１４）に記載のコンピュータを備えた、多能性幹細胞の未分化状態の自動判定システム。
（１６）継代に必要な細胞を回収する工程と、培養および／または継代に不要な細胞を除去する工程とを含んでなる、多能性幹細胞の継代培養方法であって、継代に必要な細胞が、（１）〜（９）および（１１）のいずれかに記載の判定方法により、未分化な細胞と評価された多能性幹細胞であり、培養および／または継代に不要な細胞が、（１）〜（７）、（１０）および（１１）のいずれかに記載の判定方法により、分化を開始した細胞と評価された多能性幹細胞である、方法。
（１７）多能性幹細胞の未分化状態を判定する装置であって、
多能性幹細胞が培養された培養培地を回収する回収手段と、
回収手段により回収された培養培地中のＬ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、およびアンモニアからなる群から選択される少なくとも１つの細胞外代謝物を分析する分析手段と、
分析手段により得られた分析結果に基づいて細胞外代謝物の変動値の経時的変化を求め、多能性幹細胞の未分化状態を評価する評価手段と
を備える、装置。
（１８）多能性幹細胞を未分化状態で培養するための細胞培養装置であって、
未分化状態の多能性幹細胞および培地が収容された培養容器に対してインキュベーション処理を行うインキュベーション部と、
前記インキュベーション処理の終了後に、前記培養容器に対して培地交換処理を行う培地交換部と、
前記培地交換処理で回収されたインキュベーション処理済み培地中の細胞外代謝物の変動値を算出するための第１培地分析処理を行う第１培地分析部と、
前記インキュベーション処理、前記培地交換処理および前記第１培地分析処理が２回以上繰り返し行われるように、前記インキュベーション部、前記培地交換部および前記第１培地分析部の動作を制御する動作制御部と、
前記インキュベーション処理の開始後のいずれかの時点で、前記培養容器に対して細胞形態観察処理を行う細胞形態観察部と、
前記細胞形態観察処理で得られた観察結果に基づいて、前記培養容器中の細胞が未分化状態であるか否かを判定するための第１判定処理を行う第１判定部と、
２回以上行われた前記第１培地分析処理で算出された前記細胞外代謝物の変動値に基づいて、前記細胞外代謝物の変動値の経時的変化を分析するための第２培地分析処理を行う第２培地分析部と、
前記細胞外代謝物の変動値および／または前記細胞外代謝物の変動値の経時的変化に基づいて、前記培養容器中の細胞が未分化状態であるか否かを判定するための第２判定処理を行う第２判定部と、
を備える、細胞培養装置。
（１９）前記細胞外代謝物が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、およびアンモニアからなる群から選択される少なくとも１つである、（１８）に記載の細胞培養装置。
（２０）前記第１判定処理で得られた判定結果および／または前記第２判定処理で得られた判定結果に基づいて、分化を開始した細胞を除去するための細胞除去処理を行う細胞除去部をさらに備える、（１８）または（１９）に記載の細胞培養装置。
（２１）前記第２判定処理で得られた判定結果に基づいて、前記細胞形態観察処理における観察条件を調整する観察条件調整部をさらに備える、（１８）〜（２０）のいずれかに記載の細胞培養装置。
（２２）多能性幹細胞を未分化状態で培養するための細胞培養方法であって、
（ａ）未分化状態の多能性幹細胞および培地が収容された培養容器に対してインキュベーションを行う工程と、
（ｂ）工程（ａ）の終了後に、前記培養容器に対して培地交換を行う工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で回収されたインキュベーション済み培地中の細胞外代謝物の変動値を算出する工程と、
（ｄ）工程（ａ）、工程（ｂ）および工程（ｃ）を２回以上繰り返し行う工程と、
（ｅ）前記インキュベーションの開始後のいずれかの時点で、前記培養容器に対して細胞形態観察を行う工程と、
（ｆ）工程（ｅ）で得られた観察結果に基づいて、前記培養容器中の細胞が未分化状態であるか否かを判定する工程と、
（ｇ）２回以上行われた工程（ｃ）で算出された前記細胞外代謝物の変動値に基づいて、前記細胞外代謝物の変動値の経時的変化を分析する工程と、
（ｈ）前記細胞外代謝物の変動値および／または前記細胞外代謝物の変動値の経時的変化に基づいて、前記培養容器中の細胞が未分化状態であるか否かを判定する工程と、
を含んでなる、細胞培養方法。
（２３）前記細胞外代謝物が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、およびアンモニアからなる群から選択される少なくとも１つである、（２２）に記載の細胞培養方法。
（２４）工程（ｆ）で得られた判定結果および／または工程（ｈ）で得られた判定結果に基づいて、分化を開始した細胞を除去する工程（ｉ）をさらに含む、（２２）または（２３）に記載の細胞培養方法。
（２５）工程（ｈ）で得られた判定結果に基づいて、工程（ｅ）における観察条件を調整する工程（ｊ）をさらに含む、（２２）〜（２４）のいずれか一項に記載の細胞培養方法。

本発明によれば、多能性幹細胞の破壊を必要とせず、多能性幹細胞が培養された培養培地の分析結果のみに基づいて評価することができる点で有利である。また、培養培地の分析によれば、細胞を破壊し細胞内代謝物を測定するような方法と比較して大きく値が変動することがない。そして、培養培地に含まれる細胞外代謝物の経時的変化情報については、予め決定されたプログラムに従って、自動で取得、記録し、これを解析することができるから、多能性幹細胞の未分化状態の自動的な判断が可能になる。すなわち、培養培地の分析は全自動化が可能である点でさらに有利である。

本発明によれば、また、多能性幹細胞の未分化状態の判定は、特定の細胞外代謝物の変動値の経時的な増減の傾向に基づいて行うことができ、すなわち、予め決定された参照値（例えば、予め行った実験によって決定した基準値、蓄積されたデーターベース、および代謝シミュレーション等）と比較する必要がない点で有利である。

本発明によれば、さらに、培養工程中に非破壊でモニタリングすることができ、そうすると全培養ディッシュ／プレートの検査が可能になるため、品質の均一化、歩留まりの向上、コスト削減も期待できる点で有利である。

本発明によれば、さらにまた、培養培地の分析手段として、煩雑な前処理工程が不要な分析手法である酵素電極法を選択することができ、これにより、ロバストかつ迅速な測定系の構築が可能となる点で有利である。

図１は、光学顕微鏡による、Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の細胞群の播種後７日目（ｄａｙ７）の細胞形態の観察の結果を示す図であり、図１ＡはＡ群の細胞形態、図１ＢはＢ群の細胞形態、図１ＣはＣ群の細胞形態をそれぞれ示す。 図２は、Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の細胞群の播種後７日目（ｄａｙ７）の細胞における未分化マーカー遺伝子の発現量を示す図である。 図３は、Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の細胞群の播種後７日目（ｄａｙ７）の細胞における中胚葉系分化マーカー遺伝子の発現量を示す図である。 図４は、Ａ群の細胞群を培養した培養培地に含まれる各細胞外代謝物の変動量ΔＣ（mol）（ΔＬａｃ、ΔＧｌｕ、ΔＡｌａ、ΔＮＨ_３）と、各培養期間中に増加した細胞数ΔＮ（cells）との相関を示す図であり、図４Ａ〜Ｄは、ΔＬａｃ vs. ΔＮプロット、ΔＧｌｕ vs. ΔＮプロット、ΔＡｌａ vs. ΔＮプロット、ΔＮＨ_３ vs. ΔＮプロットをそれぞれ示す。 図５は、Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の細胞群を培養した培養培地に含まれる各細胞外代謝物の変動値、すなわち各細胞外代謝物の変動量ΔＣ（mol）（ΔＧｌｕ）の、同じく多能性幹細胞を培養した培養培地に含まれる細胞外代謝物であるＬ−乳酸の変動量ΔＬａｃ（mol）に対する比（Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の細胞群のΔＧｌｕ／ΔＬａｃ）について、培地交換毎（ｄａｙ３、ｄａｙ５、およびｄａｙ７での培地交換時の変動値）の変化を示す図である。 図６は、Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の細胞群を培養した培養培地に含まれる各細胞外代謝物の変動値、すなわち各細胞外代謝物の変動量ΔＣ（mol）（ΔＡｌａ）の、同じく多能性幹細胞を培養した培養培地に含まれる細胞外代謝物であるＬ−乳酸の変動量ΔＬａｃ（mol）に対する比（Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の細胞群のΔＡｌａ／ΔＬａｃ）について、培地交換毎（ｄａｙ３、ｄａｙ５、およびｄａｙ７での培地交換時の変動値）の変化を示す図である。 図７は、Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の細胞群を培養した培養培地に含まれる各細胞外代謝物の変動値、すなわち各細胞外代謝物の変動量ΔＣ（mol）（ΔＮＨ_３）の、同じく多能性幹細胞を培養した培養培地に含まれる細胞外代謝物であるＬ−乳酸の変動量ΔＬａｃ（mol）に対する比（Ａ群、Ｂ群、Ｃ群の細胞群のΔＮＨ_３／ΔＬａｃ）について、培地交換毎（ｄａｙ３、ｄａｙ５、およびｄａｙ７での培地交換時の変動値）の変化を示す図である。 図８Ａは、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置において使用される培養容器の概略平面図である。 図８Ｂは、図８ＡのＡ−Ａ線断面図である。 図８Ｃは、図８ＡのＢ−Ｂ線断面図である。 図９は、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す概略図である。 図１０は、細胞播種部の構成を示す概略平面図である。 図１１は、インキュベーション部の構成を示す概略断面図である。 図１２は、細胞形態観察部の構成を示す概略側面図である。 図１３は、培地交換部の構成を示す概略平面図である。 図１４は、細胞剥離部の構成を示す概略側面図である。 図１５は、細胞回収部の構成を示す概略平面図である。 図１６は、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置が行う細胞培養処理手順（第１実施形態）を示すフローチャートである。 図１７は、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置が行う細胞培養処理手順（第１実施形態）を示すフローチャート（図１６の続き）である。 図１８は、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置が行う細胞培養処理手順（第２実施形態）を示すフローチャートである。 図１９は、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置が行う細胞培養処理手順（第３実施形態）を示すフローチャートである。 図２０は、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置が行う細胞培養処理手順（第４実施形態）を示すフローチャートである。 図２１は、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置が行う細胞培養処理手順（第５実施形態）を示すフローチャートである。

発明の具体的な説明

本発明において、「多能性幹細胞の未分化状態の判定」とは、対象とする多能性幹細胞が未分化状態であるか否かを判定することを意味する。

本発明で用いられる「多能性幹細胞」は、三胚葉のいずれの由来の細胞にも分化する能力を有する細胞を意味し、接着培養によりコロニーを形成する多能性幹細胞であれば、特に制限無く用いることができる。本発明で用いられる多能性幹細胞は、特に限定されないが、好ましくは、霊長類細胞や齧歯類細胞などの哺乳類の多能性幹細胞とすることができ、より好ましくは、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシまたはヤギの多能性幹細胞とすることができ、さらに好ましくは、ヒトの多能性幹細胞とすることができる。本発明で用いられる多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞または人工多能性幹細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（Multilineage-differentiating Stress Enduring Cell）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）または、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）などの多能性幹細胞が挙げられ、好ましくは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。従って、本発明で用いられる多能性幹細胞は、好ましくは、哺乳類のＥＳ細胞若しくはｉＰＳ細胞であり、より好ましくは、霊長類若しくは齧歯類などのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、さらに好ましくは、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ若しくはヤギのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、最も好ましくは、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である。本発明によれば、フィーダー細胞は用いても用いなくてもよい。

本発明で用いられる「培養培地」（単に「培地」ともいう）は、多能性幹細胞の未分化状態を維持するための培養培地を意味する。このような培養培地としては、多能性幹細胞の未分化状態を維持できれば、特に制限無く用いることができる。本発明で用いられる培養培地は、特に限定されないが、好ましくは、多能性幹細胞を培養することができる培地に未分化維持に寄与する因子が添加された培養培地とすることができる。多能性幹細胞を培養することができる培地としては、多能性幹細胞を培養することができれば、特に制限無く用いることができ、例えば、ＲｅｐｒｏＦＦ２培地、ｍＴｅＳＲ１等が挙げられる。未分化維持に寄与する因子としては、例えば、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−β、インスリン等が挙げられる。なお、培養培地は、培養工程中、所定時間周期で新しい培養培地に交換されるものであるが、詳細については後述する。

本発明において、多能性幹細胞は、前記培養培地が添加された培養容器において培養される。本発明で用いられる培養容器としては、多能性幹細胞を培養することができれば、特に制限無く用いることができる。例えば、ディッシュ、マルチウェルプレート等を用いることができる。

本発明において、多能性幹細胞の培養工程中、培養培地は、所定時間周期で新しい培養培地に交換（培地交換）することができる。培地交換の時間周期は、当業者であれば適宜決定することができるが、例えば、１２〜７２時間、好ましくは、２４〜４８時間とすることができる。

ここで、「培養工程中」とは、多能性幹細胞が、前記培養培地が添加された培養容器に播種され、培養された後、継代されるまでを意味する。多能性幹細胞は、培養工程中、培地交換が１〜５回行われるような密度で播種することができるが、好ましくは、２〜４回、より好ましくは３〜４回培地交換が行われるような密度で播種することができる。

その他の培養条件については、使用する多能性幹細胞の状態に応じて、当業者であれば適宜決定することができる。

本発明によれば、多能性幹細胞が培養された培養培地を分析することにより、多能性幹細胞が未分化状態であるか否かを評価することができる。

分析に供される培養培地は、培地交換により交換された後、次の培地交換まで使用される培養培地として得ることができる。すなわち、分析に供される培養培地は、培地交換時に培養容器から回収することができる。分析に供される培養培地は、例えば培養容器としてディッシュを使用する場合は、ディッシュに存在する培養培地の全量として回収することができる。分析に供される培養培地は、例えば培養容器としてマルチウェルプレートを使用する場合は、各ウェルに存在する培養培地の全量として回収することができる。

培養培地の回収手段としては、培養培地を回収することができれば、特に制限無く用いることができる。例えば、ピペット、シリンジ等を使用して手作業で回収することもできるし、あるいは、培養容器に接続される流路とポンプを備えた送液手段を使用して回収することもできる。全自動化の観点から、送液手段を使用することが好ましい。

本発明によれば、多能性幹細胞が未分化状態であるか否かの評価は、培養培地に含まれる細胞外代謝物の変動値の経時的変化に基づいて行うことができる。

本発明において、「細胞外代謝物」とは、細胞培養の結果、細胞外（培養培地中）に存在する代謝物を意味し、具体的には、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、およびアンモニアからなる群から選択される少なくとも１つである。すなわち、細胞外代謝物の量は、多能性幹細胞の培養中に、細胞から培養培地に分泌される代謝物から細胞で消費される代謝物を引いた量である。後述の実施例から分かるように、細胞外代謝物である、Ｌ−グルタミン酸および／またはＬ−アラニンおよび／またはアンモニアの培養工程中の変動の程度を、多能性幹細胞に未分化状態の評価の指標とすることができる。なお、培養培地には、Ｌ−グルタミン酸および／またはＬ−アラニンおよび／またはアンモニアが培地成分として含まれ得るが、培養前の初期の培地成分としてのＬ−グルタミン酸および／またはＬ−アラニンおよび／またはアンモニアは細胞外代謝物には該当しない。

本発明においては、Ｌ−グルタミン酸および／またはＬ−アラニンおよび／またはアンモニアの培養工程中の変動の程度を「細胞外代謝物の変動値」として算出する。「細胞外代謝物の変動値」は、具体的には、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、またはアンモニアの変動量の、同じく細胞外代謝物であるＬ−乳酸の変動量に対する比として求めることができる。ここで、培養培地に含まれる各細胞外代謝物の「変動量」とは、培地交換された後、次の培地交換までの間の期間、多能性幹細胞が培養されることに起因して変動する培養培地に含まれる細胞外代謝物の量を意味する。後述の実施例からも分かるように、Ｌ−乳酸の変動量は多能性幹細胞の細胞増殖と相関が強い。よって、Ｌ−乳酸の変動量に基づいて変動値を規格化することができる。

なお、Ｌ−乳酸が規格化に適している点として以下の理由が挙げられる。
（１）Ｌ−乳酸は、一般的に用いられる培養培地には含まれない成分であり、多能性幹細胞を培養することで初めて培養培地中に分泌される細胞外代謝物である。そのため、Ｌ−乳酸の変動量の算出する際にコントロール培地との差分を取る必要がないため簡便である。
（２）Ｌ−乳酸は、他の細胞外代謝物と比較して多量に分泌されるため、より高感度かつ正確に変動量の定量が可能である。この特徴は、播種細胞数の少ない場合や、培養日数の浅い（ΔＮが小さい）場合に特に有利に働く。

培養培地の分析手段としては、培養培地に含まれる細胞外代謝物量を測定することができるものであれば特に制限無く用いることができる。分析手段としては、例えば、酵素電極法、比色法、ガスクロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ質量分析、液体クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ質量分析、キャピラリー電気泳動質量分析等が挙げられる。好ましくは、酵素電極法を用いるBioFlow（商標）ＳＴＡＴバイオセンサＢＭ―７Ｍ（王子計測機器社製）等の市販の分析機器を使用することができる。

本発明において、培養培地に含まれる細胞外代謝物の変動値については、培地交換毎にその変動値を測定することにより、培養培地に含まれる細胞外代謝物の変動値の経時的変化を求めることができる。

本発明においては、「変動値の経時的変化」は、培地交換毎に得られる変動値の経時的変化を意味し、培地交換毎に得られる変動値の増減の傾向として求めることができる。ここで「増減の傾向」とは、直前の培地交換時に得られた培養培地における変動値と比較した場合に、変動値が増加しているか、あるいは、減少しているかを意味し、直前の培地交換時に得られた培養培地における変動値と比較することで判断することができる。

後述の実施例から分かるように、多能性幹細胞が未分化状態を維持できている場合は、細胞外代謝物の変動値は、培地交換毎に、すなわち、経時的に減少傾向を示す。よって、本発明によれば、変動値の経時的変化を、培地交換毎に得られる培養培地に含まれる細胞外代謝物の変動値の増減の傾向として評価することができる。培地交換毎の傾向の評価に当たって、変動値は、直前の培地交換時に得られた培養培地における変動値と比較することにより評価を行うことができる。

本発明において、変動値が、直前の培地交換時に得られた培養培地における変動値と比較して、減少傾向を示す場合は、多能性幹細胞が未分化な細胞と評価することができる。特には、減少傾向を連続して（すなわち、減少傾向を連続して２回以上）示す場合に、多能性幹細胞が未分化な細胞と評価することができる。一方で、変動値が、直前の培地交換時に得られた培養培地における変動値と比較して、減少傾向以外の傾向（具体的には、増加傾向や増減無し）を示した場合は、多能性幹細胞が分化を開始した細胞と評価することができる。経時的変化として、一旦、変動値が増加傾向を示した後、その後、減少傾向を示すこともあるが、高精度の判定を達成するために、このような場合も、変動値が増加傾向を示した時点で、多能性幹細胞が分化を開始した細胞と評価することができる。

多能性幹細胞の未分化状態を評価する評価手段としては、分析手段により得られた分析結果に基づいて細胞外代謝物の変動値の経時的変化を求め、多能性幹細胞の未分化状態を評価することができれば、特に制限無く用いることができる。例えば、コンピュータ等を用いることにより自動化することができる。

本発明において、判定の精度をより高めるために、多能性幹細胞が形成するコロニーの画像の微分フィルタ処理画像（微分画像）に基づいて、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価する方法を併用することができる。当該方法は、特開２０１４−１８１８４号公報の記載に従って実行することができる。当該方法は、具体的には、以下の通りである。
（１）多能性幹細胞が形成するコロニーの画像の微分フィルタ処理画像（微分画像）に基づいて、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価する方法。
（２）多能性幹細胞の微分画像から得られた画像パターンに基づいてコロニーの良否を評価する、上記（１）に記載の方法。
（３）微分画像から、各画素の階調に従って画素毎に数値化を行い、次いで、コロニー中心部の数値と、場合によってはその周辺部の数値とに基づいてコロニーの良否を評価する、上記（１）に記載の方法。
（４）微分画像から、各画素の階調に従って画素毎に数値化を行い、次いで、得られた数値分布に基づいてコロニーの良否を評価する、上記（１）に記載の方法。
（５）微分画像から、各画素の階調に従って画素毎に数値化を行い、次いで、コロニーの数値分布に対して予め作成した少なくとも１種類のフィット関数を、評価対象のコロニーの数値分布に対してカーブフィットすることによりそのコロニーの良否を評価する、上記（４）に記載の方法。
（６）予め作成したフィット関数が、
凸形状を表すフィット関数（ｆ_ｇｏｏｄ関数）、および／または、
コロニーの中心部で凹形状を表し、かつ、その周辺部で凸形状を表すフィット関数（ｆ_ｂａｄ関数）
を含んでなる少なくとも１種類のフィット関数である（但し、コロニー中心部を通る直線の位置を平面直交座標系の横軸（Ｘ軸）とし、数値分布（Ｙ軸）を縦軸としてフィット関数のグラフを作成する）、上記（５）に記載の方法。
（７）予め作成したフィット関数が、ｆ_ｇｏｏｄ関数とｆ_ｂａｄ関数とを含んでなる少なくとも２種類のフィット関数である、上記（６）に記載の方法。
（８）ｆ_ｂａｄ関数が、
（条件Ｂ１）ｘ→−∞およびｘ→∞の極限において収束する、
（条件Ｂ２）コロニー内では任意の実数ｘに対して０以上となる、および、
（条件Ｂ３）コロニー内では１つの極小値と２つの極大値を有する
から選択されるいずれか１つ、２つまたはすべての条件を満たす、上記（６）または（７）に記載の方法。
（９）ｆ_ｂａｄ関数が、
、
、
、および、
からなる群から選択される、上記（６）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記ｆ_ｂａｄ関数が、
である、上記（９）に記載の方法。
（１１）ｆ_ｇｏｏｄ関数が、
（条件Ｇ１）ｘ→−∞およびｘ→∞の極限において収束する、
（条件Ｇ２）コロニー内では任意の実数ｘに対して０以上となる、および
（条件Ｇ３）コロニー内では１つの極大値を有する
から選択されるいずれか１つ、２つまたはすべての条件を満たす、上記（６）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）ｆ_ｇｏｏｄ関数が、
、
、および、
からなる群から選択される、上記（６）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）前記ｆ_ｇｏｏｄ関数が、
である、上記（１２）に記載の方法。
（１４）カーブフィットすることにより得られる少なくとも１種類の近似曲線と、評価対象のコロニーの数値分布とのずれの程度を指標としてコロニーの良否を評価する、上記（６）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）カーブフィットすることにより得られる少なくとも１種類の近似曲線から抽出したパラメータを指標としてコロニーの良否を評価する、上記（６）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）パラメータが、コロニー内における、ｆ_ｇｏｏｄ関数の最大値、ｆ_ｂａｄ関数の最大値、ｆ_ｂａｄ関数の極小値、実測値の最大値および実測値の最小値からなる群から選択される１以上のパラメータである、上記（１５）に記載の方法。
（１７）２つのパラメータの和、差、積または比を指標としてコロニーの良否を評価することを含んでなる、上記（１５）または（１６）に記載の方法。
（１８）２つのパラメータの和、差、積または比の値と、別の２つのパラメータの組み合わせにおける２パラメータの和、差、積または比の値との、和、差、積または比を指標としてコロニーの良否を評価することを含んでなる、上記（１７）に記載の方法。
（１９）パラメータが、コロニー内における、ｆ_ｇｏｏｄ関数の最大値、ｆ_ｂａｄ関数の最大値およびｆ_ｂａｄ関数の極小値からなる群から選択される２つのパラメータである、上記（１７）または（１８）に記載の方法。
（２０）近似曲線から、コロニー毎に算出される以下の４つのパラメータ：
パラメータＡ：ｆ_ｇｏｏｄ関数の中心部の値とｆ_ｂａｄ関数の極小値の差、パラメータＢ：ｆ_ｂａｄ関数の最大値と極小値の差、
パラメータＣ：実測値の最大値とコロニー中心部での実測値の最小値の差、および
パラメータＤ：コロニー内のｆ_ｇｏｏｄ関数と実測値の差の二乗平均
からなる群から選択される少なくとも１つのパラメータに基づいてコロニーの良否を評価する、上記（１８）に記載の方法。
（２１）パラメータＡ〜Ｄから選択される２以上のパラメータを重み付けして加算して得られる数値に基づいて評価する、上記（２０）に記載の方法。

本発明において、判定の精度をより高めるために、細胞形態観察を併用することもできる。

本発明によれば、多能性幹細胞が培養された培養培地の分析結果に基づいて多能性幹細胞の未分化状態を評価することは、コンピュータ等により全行程を自動化することができる。従って、本発明の方法をコンピュータに実行させるためのプログラムが提供される。具体的には、本発明によれば、多能性幹細胞が培養された培養培地の分析結果を得る工程と、分析結果に基づいて多能性幹細胞の未分化状態を自動判定する工程とをコンピュータに実行させるためのプログラムが提供される。本発明によればまた、本発明のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体が提供される。本発明によればさらに、本発明のプログラムをその内部記録装置に記録したコンピュータまたは本発明のコンピュータを備えた多能性幹細胞の未分化状態の評価のための自動判定システムが提供される。

本発明のプログラムは、フレキシブルディスクやＣＤ−ＲＯＭ等の記録媒体に記録し、コンピュータに読み込ませて実行させてもよい。記録媒体は、磁気ディスクや光ディスク等の着脱可能なものに限定されず、ハードディスク装置やメモリなどの固定型の記録媒体でもよい。また、本発明のプログラムを、インターネット等の通信回線（無線通信も含む）を介して頒布してもよい。さらに、同プログラムを暗号化したり、変調をかけたり、圧縮した状態で、インターネット等の有線回線や無線回線を介して、あるいは記録媒体に収納して頒布してもよい。

本発明の判定方法によれば、多能性幹細胞を破壊せずにその未分化状態を評価することができ、該方法により、未分化の細胞と評価されれば、培養を継続し、一方で、分化を開始した細胞と評価されれば、除去することができる。よって、本発明による判定方法は、多能性幹細胞の継代培養方法に適用することができる。

本発明の継代培養方法において、本発明の判定方法により分化を開始した細胞と評価された細胞は、培養および／または継代に不要な細胞として除去することができる。ここで、不要な細胞の除去は、培養中に行うこともできるし、あるいは、継代の際に行うこともできる。不要な細胞の除去は、また、培養培地の分析を行うという本発明の特徴から、培養容器ごと（培養容器としてマルチウェルプレートを用いる場合はウェルごと）に行うことができる。

本発明の継代培養方法の一態様としては、以下の工程：
（ｉ）培養培地が添加された培養容器に多能性幹細胞を播種する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で播種された多能性幹細胞を培養する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の培養中、培地交換毎に回収した培養培地を分析する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた分析結果に基づいて、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、およびアンモニアからなる群から選択される少なくとも１つである細胞外代謝物の変動値の経時的変化を求め、多能性幹細胞の未分化状態を評価する工程；
（ｖ−１）工程（ｉｖ）で未分化状態であると評価された多能性幹細胞を培養容器から剥離し、別の培養容器に播種する工程；および
（ｖ−２）工程（ｉｖ）で分化を開始したと評価された多能性幹細胞を除去する工程
を含んでなり、工程（ｉ）〜（ｖ）を適宜繰り返す方法である。

該態様において、多能性幹細胞が形成するコロニーの画像の微分フィルタ処理画像（微分画像）に基づいて、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価する方法を併用することができる。該方法を併用する場合は、工程（ｉｖ）で行われる評価とは独立して多能性幹細胞のコロニーの良否を評価し、コロニーを選択・剥離除去することができる。

該態様において、細胞形態観察を併用することができる。該観察を併用する場合は、工程（ｉｖ）で行われる評価とは独立して多能性幹細胞の細胞形態を観察し、細胞を選択・剥離除去することができる。

本発明によれば、多能性幹細胞の未分化状態を判定する装置であって、
多能性幹細胞が培養された培養培地を回収する回収手段と、
回収手段により回収された培養培地中のＬ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、およびアンモニアからなる群から選択される少なくとも１つの細胞外代謝物を分析する分析手段と、
分析手段により得られた細胞外代謝物の変動値の経時的変化に基づいて、多能性幹細胞の未分化状態を評価する評価手段と
を備える、装置が提供される。

本発明の装置における、回収手段、分析手段および評価手段については上述した通りである。

以下、図面を参照して、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置について説明する。
まず、図８Ａ〜図８Ｃを参照して、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置において使用される培養容器について説明する。図８Ａは、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置において使用される培養容器の概略平面図であり、図８Ｂは、図８ＡのＡ−Ａ線断面図であり、図８Ｃは、図８ＡのＢ−Ｂ線断面図である。

本実施形態において使用される培養容器は、図８Ａ〜図８Ｃに示すように、閉鎖系の培養容器１０である。図８Ａ〜図８Ｃに示すように、培養容器１０は、凹状の流路１２を有する容器本体３１と、流路１２の開口部を封止する平板３２とを備える。容器本体３１および平板３２の材質としては、例えば、光透過性を有する合成樹脂（例えばポリスチレン）が使用される。容器本体３１および平板３２が光透過性を有することにより、培養容器１０中の細胞を外部から光学的に観察することができる。

図８Ａに示すように、容器本体３１は、液体が流入する流入口１１と、流入口１１から流入した液体が通過する流路１２と、流路１２を通過した液体が流出する流出口１３とを有する。流入口１１と流路１２と流出口１３とは、例えば射出成形により、一体に形成されている。

図８Ｂおよび図８Ｃに示すように、容器本体３１の流路１２は、容器本体３１の一方側に開口する凹部（溝部）として形成されている。また、図８Ａに示すように、容器本体３１の流路１２は、平面視において蛇行する形状を有する。

図８Ａに示すように、流路１２の底面には、細胞が播種される複数の細胞播種領域２０が、流路１２に沿って並んで設けられている。流路１２の底面のうち、細胞播種領域２０以外の領域の表面粗さは、細胞播種領域２０の表面粗さより大きいことが好ましい。例えば、細胞播種領域２０の表面粗さは、Ｒａ０．２以下であり、細胞播種領域２０以外の領域の表面粗さは、Ｒａ０．８以下である。ここで、「Ｒａ」は、算術平均粗さであることを示し、ＪＩＳ Ｂ０６０１の規定による。このような表面粗さの違いは、例えば、容器本体３１の射出成形時に使用される金型の表面粗さを調整することにより実現され得る。細胞播種領域２０以外の領域の表面粗さが大きいほど、細胞播種領域２０以外の領域に細胞が付着しにくい。

図８Ｂおよび図８Ｃに示すように、流路１２の底面には、細胞播種領域２０と同心状に窪み２１が凹設されている。図示された例では、窪み２１の形状が四角錐状であるが、窪み２１の形状は特に限定されず、四角錐状以外の角錐状、円錐状、円柱、角柱状、ドーム状等であってもよい。

窪み２１の頂角は、３０°〜９０°であることが好ましい。窪み２１の頂角が９０°より大きい場合、窪み２１の斜面を細胞が滑り落ちにくい。また、窪み２１の頂角が３０°より小さい場合、容器が反転される際に、窪み２１の内側から細胞が落下しにくい。

容器本体３１の流入口１１および流出口１３は、容器本体３１の同一側面に設けられているが、異なる側面に設けられていてもよい。流入口１１は、流路１２の一端に連通しており、流出口１３は流路１２の他端に連通している。図示されていないが、流入口１１および流出口１３には、シリンジの先端を挿入可能なスリット付のゴム栓、注射針を刺すことが可能な弾性膜、ルアーロック等の医療用に使用されている開閉弁を具備する構造が設けられていてもよい。これにより、液体の注入時および回収時において、外界からのコンタミネーションのリスクが軽減され得る。

平板３２は、適度なガス透過性を有するように薄く形成されている。平板３２の厚みは、例えば５０μｍ〜２００μｍである。これにより、培養中の細胞に酸素ガス等のガスを供給することが容易である。なお、嫌気性の細胞を培養する場合には、平板３２は、ガス不透過性を有することが好ましく、この場合、平板３２の厚みは、例えば２０００μｍ〜３０００μｍである。

平板３２は、流路１２の開口部が封止されるように、流路１２の開口部が形成された容器本体３１の面全体に配置され、容器本体３１の壁部（流路１２を規定する壁部の端部）に貼り付けられて固定支持されている。本実施形態において、平板３２は、容器本体３１に接着剤で接着されているが、固定方法は接着剤に限定されず、例えば、熱融着、超音波融着等であってもよい。

培養容器１０は、次のようにして製造することができる。まず、平板３２が貼り付けられる前の容器本体３１の流路１２が形成された面を、Ｏ_２プラズマ処理する。例えば、Ｏ_２ガスを適当なワット数の電力によってプラズマ化し、Ｏ_２プラズマを、容器本体３１の流路１２が形成された面に所定時間曝露する。次いで、容器本体３１の流路１２を細胞非接着コーティング液で処理する。例えば、流路１２内に細胞非接着コーティング液を流入させ、３７℃で所定時間静置する。その後、流路１２から細胞非接着コーティング液を流出させ、流路１２を滅菌水で洗浄する。次いで、容器本体３１の流路１２が形成された一面に、平板３２を貼り付ける。例えば、容器本体３１の壁部の端部に接着剤を塗布した後、平板３２を、容器本体３１上に、流路１２の開口部が覆われるように載置し、接着剤により接着する。次いで、接着剤を乾燥して固化させる。

培養容器１０を細胞培養に使用する前に、次の前処理を行うことが好ましい。まず、流入口１１から流路１２にＰＢＳ溶液を流入させ、流路１２をＰＢＳ溶液で満たす。これにより、流路１２から気泡が除かれる。次いで、平板３２のうち窪み２１と向かい合う部分に細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を付着させる。例えば、流入口１１から流路１２にＥＣＭ溶液を流入させる。流路１２内のＰＢＳ溶液は、ＥＣＭ溶液により押し流されて流出口１３から流出する。流路１２がＥＣＭ溶液で満たされた状態を所定時間維持する。これにより、流路１２の細胞非接着コーティング液が塗布されていない部分、すなわち平板３２のうち流路１２の開口部に対応する領域全体に、ＥＣＭが付着する。ＥＣＭは、細胞培養の際、細胞の足場となる。

次に、図９を参照して、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置について説明する。図９は、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す概略図である。図９において、配線の接続は実線で示されており、容器が搬送される流れは破線で示されている。

本実施形態に係る細胞培養装置１００は、多能性幹細胞を未分化状態で培養するための細胞培養装置である。細胞培養装置１００は、細胞形態観察に基づく細胞状態判定と、細胞培養に使用された培地の成分分析に基づく細胞状態判定とを併用して、多能性幹細胞が未分化状態であるか否かを判定しながら（必要に応じて、当該判定で特定された、分化を開始した細胞を除去しながら）多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞を未分化状態で培養することができる。

図９に示すように、細胞培養装置１００は、細胞処理部２００と、制御部３００と、入力部４１０と、出力部４２０と、記憶部４３０と、報知部４４０とを備える。

細胞処理部２００は、容器または容器中の細胞もしくは培地に対して各種処理を行う操作部である、容器搬入出部２１０と、細胞播種部２２０と、インキュベーション部２３０と、細胞形態観察部２４０と、培地交換部２５０と、細胞剥離部２６０と、細胞回収部２７０と、容器搬送部２８０とを備える。さらに、細胞処理部２００は、培地分析処理を行う第１培地分析部２９１および第２培地分析部２９２を備える。

細胞処理部２００は、容器搬入出部２１０による細胞搬入処理および細胞搬出処理、細胞播種部２２０による細胞播種処理、インキュベーション部２３０によるインキュベーション処理、細胞形態観察部２４０による細胞形態観察処理、培地交換部２５０による培地交換処理、細胞剥離部２６０による細胞剥離処理、細胞回収部２７０による細胞回収処理、第１培地分析部２９１および第２培地分析部２９２による培地分析処理等を含む、細胞を所望の状態で培養するための一連の処理を行う。

容器搬入出部２１０は、細胞搬入処理および細胞搬出処理を行う。細胞搬入処理において、容器搬入出部２１０は、培養容器１０に播種すべき細胞が収容された容器を、細胞培養装置１００の外部から搬入する。細胞搬出処理において、容器搬入出部２１０は、細胞処理部２における処理が完了した培養容器１０または細胞処理部２における処理が中止された培養容器１０を細胞培養装置１００の外部へ搬出する。

細胞播種部２２０は、培養容器１０に対して細胞播種処理を行う。細胞播種処理において、細胞播種部２２０は、細胞培養に使用されていない新しい培養容器１０に細胞を播種する。この際、培養容器１０には、細胞とともに培地も収容される。培養容器１０に播種される細胞は、未分化状態の多能性幹細胞である。

細胞播種部２２０の構成例を図１０に示す。図１０に示すように、細胞播種部２２０は、細胞懸濁液調製部２２１と、細胞懸濁液調製部２２１から供給流路２２２を通じて供給された細胞懸濁液を貯留する細胞供給用タンク２２３と、一端が培養容器１０の流入口１１に連結可能であり、他端が細胞供給用タンク２２３に連結された流入管路２２４と、流入管路２２４に介設されたバルブ、ポンプ等の流量調整器２２５と、細胞回収用タンク２２６と、一端が培養容器１０の流出口１３に連結可能であり、他端が細胞回収用タンク２２６に連結された流出管路２２７と、流出管路２２７に介設されたバルブ、ポンプ等の流量調整器２２８とを備える。

細胞懸濁液調製部２２１は、培養容器１０に播種すべき細胞（未分化状態の多能性幹細胞）が収容された容器から、セルピッカー等により細胞を採取し、採取した細胞から細胞懸濁液を調製し、調製した細胞懸濁液を供給流路２２２から細胞供給用タンク２２３へ供給する。

細胞播種部２２０は、細胞供給用タンク２２３に貯留されている細胞懸濁液を、培養容器１０の流入口１１に連結された流入管路２２４を通じて、培養容器１０に供給する。また、細胞播種部２２０は、培養容器１０の流出口１３から流出する細胞懸濁液を、培養容器１０の流出口１３に連結された流出管路２２７を通じて、細胞回収用タンク２２６で回収する。

培養容器１０に供給された細胞懸濁液が流路１２を通過する際、細胞懸濁液中の細胞は、流路１２の底面に落下（沈殿）する。なお、本実施形態では、流路１２の底面のうち、細胞播種領域２０以外の領域の表面粗さが相対的に大きいため、細胞播種領域２０以外の領域に細胞が付着しにくい。

流路１２の底面に細胞が落下（沈殿）した後、細胞播種部２２０は、不図示の振動機構により、培養容器１０を略水平方向に振動させる。これにより、流路１２の底面のうち、窪み２１以外の領域に落下した細胞が窪み２１の内側に誘導され、細胞播種領域２０の内側で細胞が凝集する。次いで、細胞播種部２２０は、不図示の反転機構により、培養容器１０を上下反転させる。これにより、窪み２１の内側で凝集された細胞が、平板３２のうち窪み２１と向かい合う部分に落下する。平板３２のうち窪み２１と向かい合う部分にはＥＣＭが塗布されているため、平板３２上に落下した細胞は、ＥＣＭを足場として生育および増殖し、コロニーを形成することができる。

インキュベーション部２３０は、未分化状態の多能性幹細胞および培地が収容された培養容器１０に対してインキュベーション処理を行う。インキュベーション処理において、インキュベーション部２３０は、培養容器１０を細胞培養に適した環境に置き、培養容器１０中の細胞を生育および増殖させる。

インキュベーション部２３０によるインキュベーション処理は、培地単位で行われる。したがって、ある培地が収容された培養容器１０に対するインキュベーション処理と、当該培地と交換された新しい培地が収容された培養容器１０に対するインキュベーション処理とは、別のインキュベーション処理である。ある培地が収容された培養容器１０に対するインキュベーション処理は、インキュベーション処理の開始からインキュベーション処理の終了まで行われる。インキュベーション処理は、連続的に行われてもよいし、断続的に行われてもよい。例えば、インキュベーション処理の開始からインキュベーション処理の終了までの間を通じて、ある培地が収容された培養容器１０をインキュベーション部２３０内に保持し、培養容器１０に対するインキュベーション処理を連続的に行ってもよい。また、インキュベーション処理の開始後、培養容器１０に対してインキュベーション処理以外の処理（例えば、細胞形態観察処理、細胞剥離処理）を行うためにインキュベーション処理を中断し、当該処理の終了後、培地交換処理を行うことなく、インキュベーション処理を再開してもよい。「インキュベーション処理の開始」には、インキュベーション処理が行われていない新鮮な培地が収容された培養容器１０に対してインキュベーション処理を開始する場合に加えて、インキュベーション処理が行われていない新鮮な培地が収容された培養容器１０に対するインキュベーション処理の開始後、培養容器１０に対してインキュベーション処理以外の処理（例えば、細胞形態観察処理、細胞剥離処理）を行うためにインキュベーション処理を中断し、当該処理の終了後、培地交換処理を行うことなく、インキュベーション処理を再開する場合も含まれる。「インキュベーション処理の終了」は、ある培地が収容された培養容器１０に対するインキュベーション処理がもはや行われないことを意味する。インキュベーション処理の開始後、培養容器１０に対してインキュベーション処理以外の処理（例えば、細胞形態観察処理、細胞剥離処理）を行うためにインキュベーション処理を中断し、当該処理の終了後、培地交換処理を行うことなく、インキュベーション処理を再開する場合、インキュベーション処理の中断は、インキュベーション処理の終了に該当しない。インキュベーション処理は、例えば、ある培地が収容された培養容器１０に対して所定時間（例えば、２４時間）行われた場合（すなわち、同一培地で所定時間インキュベーション処理が行われた場合）に終了する。

インキュベーション部２３０の構成例を図１１に示す。図１１に示すように、インキュベーション部２３０は、１または２以上の培養容器１０を収容可能な容器収容部２３１と、１または２以上の培養容器１０が載置される載置部２３２と、容器収容部２３１の内部雰囲気を細胞培養に適した環境に維持する環境調整部２３３とを有する。環境調整部２３３は、容器収容部２３１の内部雰囲気を細胞培養に適した条件（例えば、温度３７℃、湿度９０％、ＣＯ_２濃度５％）に調整することができる。

細胞形態観察部２４０は、培養容器１０に対して細胞形態観察処理を行う。細胞形態観察処理において、細胞形態観察部２４０は、培養容器１０中の細胞の形態を観察し、観察結果として観察画像を取得する。細胞形態観察は、例えば、コロニー単位で行われる。

細胞形態観察処理が行われる培養容器１０は、インキュベーション処理の開始後のいずれかの時点の培養容器１０である。「インキュベーション処理の開始後のいずれかの時点」には、インキュベーション処理の中断後のいずれかの時点およびインキュベーション処理の終了後のいずれかの時点が含まれる。インキュベーション処理と、インキュベーション処理の終了後の培地交換処理とが２回以上繰り返し行われる場合、細胞形態観察処理が行われる培養容器１０は、インキュベーション処理済み培地が収容された培養容器１０（すなわち、インキュベーション処理の開始後であって培地交換処理の前の培養容器１０）であってもよいし、インキュベーション処理が行われていない新鮮な培地が収容された培養容器１０（すなわち、培地交換処理の後であってインキュベーション処理の開始前の培養容器１０）であってもよい。

細胞形態観察部２４０は、培養容器１０に対して細胞形態観察処理を行う。細胞形態観察部２４０は、例えば、培養容器１０中の細胞の形態を観察するための電子カメラモジュールである。細胞形態観察部２４０の構成例を図１２に示す。図１２に示すように、細胞形態観察部２４０は、透過型顕微鏡（例えば位相差顕微鏡）を介して培養容器１０中の細胞の形態を撮像するミクロ観察系の撮像部２４１と、培養容器１０中の細胞全体を俯瞰的に撮像するマクロ観察系の撮像部２４２と、ミクロ観察系およびマクロ観察系の撮像装置２４１および２４２で撮像された画像を処理して、細胞の状態を判定するための画像データを作成する画像処理部２４３とを備える。画像処理部２４３は、例えば、多能性幹細胞が形成するコロニーの画像の微分フィルタ処理画像（微分画像）を作成する。画像処理部２４３で作成された画像データは、観察時刻と対応付けられて記憶部４３０に記憶される。

培地交換部２５０は、培養容器１０に対して培地交換処理を行う。培地交換処理において、培地交換部２５０は、培養容器１０中の培地を新しい培地と交換する。インキュベーション処理の終了後に培地交換処理が行われる場合、新しい培地と交換される培養容器１０中の培地は、インキュベーション処理済み培地（以下「使用済み培地」ともいう）である。培地交換処理の後であってインキュベーション処理の開始前に培地交換処理が行われる場合、新しい培地と交換される培養容器１０中の培地は、インキュベーション処理されていない培地である。細胞剥離処理後に培地交換処理が行われる場合、細胞剥離処理において培養容器１０から剥離された不要な細胞（例えば、分化を開始した細胞）は、培地交換処理において培養容器１０から除去される。したがって、細胞剥離処理後に培地交換処理が行われる場合、培地交換部２５０は、細胞剥離部２６０とともに、培養容器１０から不要な細胞を除去する細胞除去処理を行う細胞除去部として機能する。

培地交換部２５０の構成例を図１３に示す。図１３に示すように、培地交換部２５０は、インキュベーション処理に使用されていない新鮮な培地を貯留する培地供給用タンク２５１と、一端が培養容器１０の流入口１１に連結可能であり、他端が培地供給用タンク２５１に連結された流入管路２５２と、流入管路２５２に介設されたバルブ、ポンプ等の流量調整器２５３と、培地回収用タンク２５４と、一端が培養容器１０の流出口１３に連結可能であり、他端が培地回収用タンク２５４に連結された流出管路２５５と、流出管路２５５に介設されたバルブ、ポンプ等の流量調整器２５６とを備える。

培地交換部２５０は、培地供給用タンク２５１に貯留されている新鮮な培地を、培養容器１０の流入口１１に連結された流入管路２５２を通じて、培養容器１０に供給する。培養容器１０に新鮮な培地が供給されると、培養容器１０中の古い培地（例えば、インキュベーション処理済み培地）は、培養容器１０の流出口１３から流出する。培地交換部２５０は、培養容器１０の流出口１３から流出する培地（例えば、インキュベーション処理済み培地）を、培養容器１０の流出口１３に連結された流出管路２５５を通じて、培地回収用タンク２５４で回収する。

培地交換部２５０で回収されたインキュベーション処理済み培地は、第１培地分析部２９１および第２培地分析部２９２で分析される。第１培地分析部２９１は、培地交換部２５０で回収されたインキュベーション処理済み培地の成分を分析して、細胞外代謝物の変動値を算出する第１培地分析処理を行う。細胞外代謝物の種類は特に限定されないが、好ましくは、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、およびアンモニアからなる群から選択される少なくとも１つの細胞外代謝物である。第２培地分析部２９２は、２回以上行われた第１培地分析処理で算出された細胞外代謝物の変動値に基づいて、細胞外代謝物の変動値の経時的変化を分析する第２培地分析処理を行う。

細胞剥離部２６０は、培養容器１０に対して細胞剥離処理を行う。細胞剥離処理において、細胞剥離部２６０は、培養容器１０中の不要な細胞（例えば、分化を開始した細胞）を選択的に剥離する。剥離すべき細胞は、細胞形態観察処理の観察結果に基づいて特定される。

細胞剥離部２６０の構成例を図１４に示す。図１４に示すように、細胞剥離部２６０は、培養容器１０に可視光を照射する光源２６１と、光を収束させるためのレンズ等の収光部２６２と、光源２６１から収光部２６２に光を供給する光ファイバー２６３とを有する。細胞剥離部２６０は、剥離すべき細胞に可視光を照射することにより、培養容器１０から目的の細胞を選択的に剥離することができる。光源２６１は、例えば、４００〜５００ｎｍの波長の光を照射する光源であり、好ましくはレーザー光源またはＬＥＤ光源（例えば、４０５ｎｍ、４２０ｎｍまたは４５０ｎｍの波長の光を照射するレーザー光源またはＬＥＤ光源）である。光源２６１の出力は、特に限定されないが、例えば、細胞の剥離に必要とされる光照射量を短期間（例えば、１０分以内）で与えるという観点では、１００ｍＷ以上の出力を有することが好ましい。

本実施形態では、光を利用して細胞剥離処理を行うが、超音波を利用して細胞剥離処理を行うことも可能である。超音波を利用する場合、細胞剥離部２６０は、上下方向（所定方向）に超音波振動する振動子を有する超音波プローブを備える。この場合、細胞剥離部２６０は、培養容器１０の平板３２のうち、剥離すべき細胞が位置する箇所に超音波振動する振動子を接触させることにより、培養容器１０から目的の細胞を選択的に剥離することができる。

細胞回収部２７０は、培養容器１０に対して細胞回収処理を行う。細胞回収処理において、細胞回収部２７０は、培養容器１０中の細胞を培養容器１０から剥離させ、回収する。

細胞回収部２７０の構成例を図１５に示す。図１５に示すように、細胞回収部２７０は、剥離剤溶液を貯留する剥離剤溶液供給用タンク２７１ａと、新鮮な培地を貯留する培地供給用タンク２７１ｂと、一端が培養容器１０の流入口１１に連結可能であり、他端が剥離剤溶液供給用タンク２７１ａおよび培地供給用タンク２７１ｂに連結された流入管路２７２と、流入管路２７２に介設されたバルブ、ポンプ等の流量調整器２７３と、剥離剤溶液回収用タンク２７４ａと、細胞回収用タンク２７４ｂと、一端が培養容器１０の流出口１３に連結可能であり、他端が剥離剤溶液回収用タンク２７４ａおよび細胞回収用タンク２７４ｂに連結された流出管路２７５と、流出管路２７５に介設されたバルブ、ポンプ等の流量調整器２７６とを有する。培養容器１０に供給すべき液体（剥離剤溶液または新鮮な培地）は、流量調整器２７３が有する切換弁によって選択される。培養容器１０から回収される液体（剥離剤溶液または細胞含有培地）は、流量調整器２７６が有する切換弁によって選択される。

細胞回収部２７０は、剥離剤溶液供給用タンク２７１ａに貯留されている剥離剤溶液を、培養容器１０の流入口１１に連結された流入管路２７２を通じて、培養容器１０に供給する。培養容器１０に剥離剤溶液が供給されると、培養容器１０中の細胞は培養容器１０から剥離される。細胞回収部２７０は、培養容器１０の流出口１３から流出する剥離剤溶液を、培養容器１０の流出口１３に連結された流出管路２７５を通じて、剥離剤溶液回収用タンク２７４ａで回収する。その後、細胞回収部２７０は、培地供給用タンク２７１ｂに貯留されている新鮮な培地を、培養容器１０の流入口１１に連結された流入管路２７２を通じて、培養容器１０に供給する。培養容器１０に新鮮な培地が供給されると、剥離された細胞は、新鮮な培地により押し流されて、新鮮な培地とともに流出口１３から流出する。細胞回収部２７０は、培養容器１０の流出口１３から流出する細胞含有培地を、培養容器１０の流出口１３に連結された流出管路２７５を通じて、細胞回収用タンク２７４ｂで回収する。

容器搬送部２８０は、細胞処理部２００内で培養容器１０等の容器を搬送し、ある操作部と別の操作部との間で培養容器１０等の容器の受け渡しを行う。容器搬送部２８０は、所定方向に延在する搬送路と、搬送路に設けられた搬送アームとを有する。各操作部は搬送路に隣接して設けられており、搬送アームは、ある操作部の内部にアクセスして当該操作部から容器を搬出し、搬出した容器を搬送路に沿って搬送し、別の操作部の内部にアクセスして当該別の操作部へ容器を搬入することができる。搬送アームは、例えば、容器を保持する保持機構を備え、水平方向および鉛直方向への移動並びに鉛直軸を中心とする旋回が可能となるように構成される。

制御部３００は、細胞培養装置１００の動作を統括的に制御するとともに、細胞培養装置１００における各処理を培養容器単位で管理するコンピュータである。制御部３００は、例えば、ＣＰＵ、ＲＡＭ、ＲＯＭ等から構成され、記憶部４３０に記憶されている各種データ、各種プログラム等に基づいて、各種処理を行う。この際、制御部３００は、動作制御部３１０、第１判定部３２０、第２判定部３３０または観察条件調整部３４０として機能する。

動作制御部３１０は、記憶部４３０に記憶されている処理スケジュールに従って、各種操作部を制御し、各種処理を実行する。例えば、動作制御部３１０は、ある培地が収容された培養容器１０に対して、インキュベーション処理、培地交換処理および第１培地分析処理が２回以上繰り返し行われるように、インキュベーション部２３０、培地交換部２５０および第１培地分析部２９１の動作を制御する。例えば、ある培地が収容された培養容器１０に対して、インキュベーション処理、培地交換処理および第１培地分析処理がｋ回（ｋは２以上の整数である）繰り返し行われる場合、１回目のインキュベーション処理、１回目の培地交換処理、１回目の第１培地分析処理、２回目のインキュベーション処理、２回目の培地交換処理、２回目の第１培地分析処理、・・・・、ｋ回目のインキュベーション処理、ｋ回目の培地交換処理、ｋ回目の第１培地分析処理が順次行われる。

第１判定部３２０は、細胞形態観察処理で得られた観察結果（観察画像および／またはその処理画像）に基づいて、培養容器１０中の細胞が未分化状態であるか否かを判定するための第１判定処理を行う。

第２判定部３３０は、第１培地分析処理で算出された細胞外代謝物の変動値および／または第２培地分析処理で分析された細胞外代謝物の変動値の経時的変化に基づいて、培養容器１０中の細胞が未分化状態であるか否かを判定するための第２判定処理を行う。

観察条件調整部３４０は、第２判定処理で得られた判定結果に基づいて、細胞形態観察処理における観察条件を調整する。例えば、第２判定処理において、培養容器１０中の細胞が未分化状態であると判定された場合、観察条件調整部３４０は、次回の細胞形態観察処理における観察感度を向上させるために、観察倍率、観察回数、観察ポイント数等を増加させる。

入力部４１０は、例えば、オペレータが操作するキーボード、マウス等のポインティングデバイスから構成され、オペレータからの指示（例えば、処理の開始指示、処理結果の表示指示等）、各処理に必要なデータの入力等の各種操作信号を入力する。入力されたデータは、制御部３００により記憶部４３０に記憶される。

出力部４２０は、例えば、ディスプレイ等から構成され、各種手段によって取得または分析された結果（例えば、観察画像等の観察結果、細胞外代謝物の変動値またはその経時的変化等の分析結果）を出力する。

記憶部４３０は、例えば、ＲＡＭ、ハードディスク等のストレージから構成され、各種データ、各種プログラム等を記憶する。記憶部４３０には、例えば、培養容器の属性情報（例えば、細胞の種類、培地の種類、継代の履歴等）と、インキュベーション処理条件（例えば、温度等）、インキュベーション処理スケジュール（例えば、インキュベーション処理の開始時刻、終了時刻等）、細胞形態観察条件（例えば、観察のインターバル、観察倍率、観察回数、観察ポイント数、撮像条件等）、各種判定を行うときの判定条件（例えば、基準範囲）等の情報が記憶されている。

報知部４４０は、例えば、培養容器１０中の細胞が不良な状態（例えば、分化を開始した状態）であると判定されたときに、警告を外部に出力する。例えば、報知部４４０は、出力部４２０に警告表示を出力する。

以下、図１６〜図２１を参照して、細胞培養装置１００が行う細胞培養処理手順の実施形態について説明する。
＜第１実施形態＞
まず、図１６および図１７を参照して、細胞培養装置１００が行う細胞培養処理手順の第１実施形態について説明する。図１６および図１７は、細胞培養装置１００が行う細胞培養処理手順の第１実施形態を示すフローチャートである。

オペレータからの開始指示が入力部４１０から入力されると、動作制御部３１０は、容器搬入出部２１０を制御して、細胞搬入処理を実行する（ステップＳ５０１）。細胞搬入処理では、培養すべき細胞（未分化状態の多能性幹細胞）が収容された容器が、細胞培養装置１００の外部から容器搬入出部２１０へ搬入される。

ステップＳ５０１の後、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、容器搬入出部２１０へ搬入された容器を容器搬入出部２１０から細胞播種部２２０へ搬送し、次いで、細胞播種部２２０を制御して、細胞播種処理を実行する（ステップＳ５０２）。細胞播種処理では、培養すべき細胞（未分化状態の多能性幹細胞）が、細胞培養に使用されていない新しい培養容器１０に播種される。この際、培養容器１０には、細胞とともにインキュベーション処理に使用されていない新鮮な培地が収容される。

ステップＳ５０２の後、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、未分化状態の多能性幹細胞および新鮮な培地が収容された培養容器１０を細胞播種部２２０からインキュベーション部２３０へ搬送し、次いで、インキュベーション部２３０を制御して、培養容器１０に対してインキュベーション処理を開始する（ステップＳ５０３）。動作制御部３１０は、記憶部４３０に記憶されているインキュベーション処理条件を参照し、細胞培養に適した所定条件下でインキュベーション処理が実現されるように、インキュベーション部２３０を制御する。インキュベーション処理では、培養容器１０が細胞培養に適した環境下に置かれ、培養容器１０中の細胞が生育および増殖する。

ステップＳ５０３の後、動作制御部３１０は、記憶部４３０に記憶されているインキュベーション処理スケジュールを参照し、現時点が培地交換時刻であるか否かを判定する（ステップＳ５０４）。培地交換時刻は、例えば、インキュベーション処理の開始後、所定時間（例えば、２４時間）が経過した時点である。

動作制御部３１０は、現時点が培地交換時刻でないと判定した場合（Ｎｏ側）、インキュベーション処理を続行する。動作制御部３１０は、現時点が培地交換時刻であると判定するまで、インキュベーション処理を続行する。

動作制御部３１０は、現時点が培地交換時刻であると判定した場合（Ｙｅｓ側）、インキュベーション処理を終了し（ステップＳ５０５）、細胞形態観察処理（ステップＳ５０６）へ移行する。

ステップＳ５０５の後、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、インキュベーション処理終了後の培養容器１０をインキュベーション部２３０から細胞形態観察部２４０へ搬送し、次いで、細胞形態観察部２４０を制御して、培養容器１０に対して細胞形態観察処理を実行する（ステップＳ５０６）。細胞形態観察処理では、ミクロ観察系の撮像部２４１による細胞形態観察および観察画像の撮像と、マクロ観察系の撮像部２４２による細胞形態観察および観察画像の撮像とが行われ、撮像された観察画像は、画像処理部２４３により、細胞状態の判定に適するように処理される。細胞状態の判定に適する画像は、例えば、コロニーの画像の微分フィルタ処理画像（微分画像）である。ミクロ観察系の撮像部２４１によって撮像された観察画像およびその処理画像は、主として、各コロニーに含まれる細胞状態を判定するために使用され、マクロ観察系の撮像部２４２によって撮像された観察画像およびその処理画像は、主として、不要な細胞（例えば、分化を開始した細胞、成長状態が不良な細胞等）を含むコロニーの位置を特定するために使用される。動作制御部３１０は、観察画像およびその処理画像を、観察時刻と対応付けて記憶部４３０に記憶させる。

ステップＳ５０６の後、第１判定部３２０は、記憶部４３０に記憶されている観察画像および／またはその処理画像に基づいて、培養容器１０中の細胞状態を判定し、不要な細胞（例えば、分化を開始した細胞、成長状態が不良な細胞等）が存在するか否かを判定する（ステップＳ５０７）。第１判定部３２０は、例えば、記憶部４３０に記憶されている観察画像および／またはその処理画像に基づいて、あるコロニーの輪郭画像を抽出し、抽出した輪郭画像に基づいて、当該コロニーの形状情報、面積情報等を取得する。そして、取得した形状情報に基づいて、当該コロニーの形状が基準形状（例えば、真円）と比較してどの程度変形しているか（基準形状に対する変形度）を分析し、変形度が基準範囲内にあるとき、当該コロニーに含まれる細胞は未分化状態であると判定し、変形度が基準範囲外であるとき、当該コロニーに含まれる細胞は未分化状態でないと判定する。あるいは、取得した面積情報に基づいて、当該コロニーの面積が基準範囲内にあるか否かを分析し、当該コロニーの面積が基準範囲内にあるとき、当該コロニーに含まれる細胞は未分化状態であると判定し、当該コロニーの面積が基準範囲外であるとき、当該コロニーに含まれる細胞は未分化状態でないと判定する。好ましくは、第１判定部３２０は、コロニーの画像の微分フィルタ処理画像（微分画像）に基づいて、上述した特開２０１４−１８１８４号公報の記載に方法に従って、コロニーに含まれる細胞が未分化状態であるか否かを判定する。同一の培養容器１０に対して２回以上の細胞形態観察処理が行われた場合、第１判別部３２０は、今回の細胞形態観察処理における観察画像および／またはその処理画像と、今回よりも前の細胞形態観察処理（好ましくは、直前の細胞形態観察処理）における観察画像および／またはその処理画像とを比較し、細胞形態の経時的変化に基づいて、コロニーに含まれる細胞が未分化状態であるか否かを判定してもよい。第１判定部３２０は、不要な細胞（例えば、分化を開始した細胞、成長状態が不良な細胞等）を含むコロニーが存在すると判定した場合、不要な細胞を含むコロニーが存在する位置を特定し、その位置情報を記憶部４３０に記憶させる。

ステップＳ５０７において、第１判定部３２０が、不要な細胞を含むコロニーが存在すると判定した場合（Ｙｅｓ側）、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞形態観察部２４０から細胞剥離部２６０へ搬送し、次いで、細胞剥離部２６０を制御して、培養容器１０に対して細胞剥離処理を実行する（ステップＳ５０８）。動作制御部３１０は、記憶部４３０に記憶されている不要な細胞を含むコロニーの位置情報に基づいて、不要な細胞を含むコロニーを選択的に剥離する。細胞剥離処理で剥離された細胞は、培地中に浮遊した状態にあり、培地交換処理の際に古い培地とともに除去される。細胞剥離処理後、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞剥離部２６０から培地交換部２５０へ搬送し、培地交換処理（ステップＳ５０９）に移行する。

ステップＳ５０７において、第１判定部３２０が、不要な細胞を含むコロニーが存在しないと判定した場合（Ｎｏ側）、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞形態観察部２４０から培地交換部２５０へ搬送し、培地交換処理（ステップＳ５０９）に移行する。

動作制御部３１０は、培養容器１０を培地交換部２５０へ搬送した後、培地交換部２５０を制御して、培養容器１０に対して培地交換処理を実行する（ステップＳ５０９）。培地交換処理において、培養容器１０中のインキュベーション処理済み培地は、インキュベーション処理に使用されていない新鮮な培地と交換される。ステップ５０８で剥離された細胞は、インキュベーション済み培地とともに培養容器１０から除去される。細胞剥離処理後に培地交換処理が行われる場合、培地交換部２５０は、細胞剥離部２６０とともに細胞除去部として機能する。

ステップＳ５０９の後、動作制御部３１０は、第１培地分析部２９１を制御して、培地交換処理で回収されたインキュベーション処理済み培地中の細胞外代謝物の変動値を算出するための第１培地分析処理を実行する（ステップＳ５１０）。本実施形態における細胞外代謝物は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、およびアンモニアからなる群から選択される少なくとも１つである。但し、第１培地分析部２９１によって変動値が分析される細胞外代謝物は、その他の細胞外代謝物であってもよい。

ステップＳ５１０の後、第２判定部３３０は、第１培地分析部２９１によって算出された細胞外代謝物の変動値に基づいて、具体的には、細胞外代謝物の変動値が正常であるか否かに基づいて、培養容器１０中の細胞が未分化状態であるか否かを判定する（ステップＳ５１１）。第２判定部３３０は、細胞外代謝物の変動値が正常であるとき、細胞が未分化状態であると判定し、細胞外代謝物の変動値が正常でないとき、細胞が未分化状態でないと判定する。第２判定部３３０は、細胞外代謝物の変動値が基準範囲内にあるとき、細胞外代謝物の変動値が正常であると判定し、細胞外代謝物の変動値が基準範囲外であるとき、細胞外代謝物の変動値が正常でないと判定する。例えば、第２判定部３３０は、細胞外代謝物の変動値がゼロであるとき、細胞外代謝物の変動値が正常でないと判定する。

ステップＳ５１１において、第２判定部３３０が、細胞外代謝物の変動値が正常でない（すなわち、細胞が未分化状態でない）と判定した場合（Ｎｏ側）、動作制御部３１０は、培養容器１０に対する処理を中止する。この際、報知部４４０は、警告を外部に出力する。例えば、報知部は、出力部４２０に警告表示を出力する。

ステップＳ５１１において、第２判定部３３０が、細胞外代謝物の変動値が正常である（すなわち、細胞が未分化状態である）と判定した場合（Ｙｅｓ側）、動作制御部３１０は、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が分析可能であるか否かを判定する（ステップＳ５１２）。

動作制御部３１０は、今回の培地交換処理で回収されたインキュベーション処理済み培地中の細胞外代謝物の変動値が正常であって、かつ、今回よりも前の培地交換処理（好ましくは、直前の培地交換処理）で回収されたインキュベーション処理済み培地中の細胞外代謝物の変動値が正常であるとき、細胞外代謝物の変動値の経時的変化を分析可能であると判定する。

細胞外代謝物の変動値の経時的変化を分析するためには、今回の培地交換処理で回収されたインキュベーション処理済み培地中の細胞外代謝物の変動値と、今回よりも前の培地交換処理（好ましくは、直前の培地交換処理）で回収されたインキュベーション処理済み培地中の細胞外代謝物の変動値とを比較する必要がある。高精度で比較するためには、比較される２つのインキュベーション処理済み培地に対して行われたインキュベーション処理時間が等しいことが必要であるが、本実施形態では、いずれの培地交換処理で回収されたインキュベーション処理済み培地も、この要件を満たす。

ステップＳ５１２において、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が分析可能でないと判定した場合（Ｎｏ側）、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を培地交換部２５０からインキュベーション部２３０へ搬送し、インキュベーション処理が行われていない新鮮な培地が収容された培養容器１０に対してインキュベーション処理を開始する（ステップＳ５０３）。動作制御部３１０は、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が分析可能であると判定するまで、ステップＳ５０３〜ステップＳ５１２の一連の処理を繰り返す。

ステップＳ５１２において、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が分析可能であると判定した場合（Ｙｅｓ側）、動作制御部３１０は、第２培地分析部２９２を制御して、細胞外代謝物の変動値の経時的変化を分析するための第２培地分析処理を実行する（ステップＳ５１３）。第２培地分析部２９２は、動作制御部３１０の制御に従って、今回の培地交換処理で回収されたインキュベーション処理済み培地中の細胞外代謝物の変動値と、今回よりも前の培地交換処理（好ましくは、直前の培地交換処理）で回収されたインキュベーション処理済み培地中の細胞外代謝物の変動値とを比較し、細胞外代謝物の変動値の経時的変化を分析する。細胞外代謝物の変動値の経時的変化は、例えば、減少傾向、増加傾向または増減なし（ほぼ増減なし）として取得される。

ステップＳ５１３の後、第２判定部３３０は、細胞外代謝物の変動値の経時的変化に基づいて、具体的には、細胞外代謝物の変動値が減少傾向であるか否かに基づいて、細胞が未分化状態であるか否かを判定する（ステップＳ５１４）。本実施形態における細胞外代謝物、すなわち、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニンおよびアンモニアから選択される少なくとも１つは、その変動値の経時的変化が減少傾向であるとき、多能性幹細胞が未分化状態であることの指標となる。但し、その他の細胞外代謝物を指標として使用する場合、細胞外代謝物の種類によっては、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が増加傾向であるとき、多能性幹細胞が未分化状態であることの指標となる場合がある。

第２判定部３３０は、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が減少傾向であるとき、細胞が未分化状態であると判定し、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が減少傾向以外（増加傾向、増減なし等）であるとき、細胞が未分化状態でないと判定する。

ステップＳ５１４において、第２判定部３３０が、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が減少傾向でない（すなわち、細胞が未分化状態でない）と判定した場合（Ｎｏ側）、動作制御部３１０は、培養容器１０に対する処理を中止する。この際、報知部４４０は、警告を外部に出力する。例えば、報知部は、出力部４２０に警告表示を出力する。

ステップＳ５１４において、第２判定部３３０が、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が減少傾向である（すなわち、細胞が未分化状態である）と判定した場合（Ｙｅｓ側）、動作制御部３１０は、培養容器１０が培養終了条件を満たすか否かを判定する（ステップＳ５１５）。培養終了条件としては、例えば、培養容器１０中の細胞数が閾値以上であること（コンフルエント状態またはそれに近い状態）、インキュベーション処理が所定時間行われたこと等が挙げられる。培養容器１０中の細胞数を培養終了条件とする場合、動作制御部３１０は、細胞形態観察処理で取得された観察画像および／またはその処理画像に基づいて、培養容器１０中の細胞数を分析する。

ステップＳ５１５において、培養容器１０が培養終了条件を満たさないと判定した場合（Ｎｏ側）、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を培地交換部２５０からインキュベーション部２３０へ搬送し、インキュベーション部２３０を制御して、インキュベーション処理が行われていない新鮮な培地が収容された培養容器１０に対してインキュベーション処理を開始する（ステップＳ５０３）。動作制御部３１０は、培養容器１０が培養終了条件を満たすと判定するまで、ステップＳ５０３〜ステップＳ５１５の一連の処理を繰り返し実行する。

ステップＳ５１５において、培養容器１０が培養終了条件を満たすと判定した場合（Ｙｅｓ側）、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を培地交換部２５０から細胞回収部２７０へ搬送し、次いで、細胞回収部２７０を制御して、培養容器１０に対して細胞回収処理を実行する（ステップＳ５１６）。細胞回収処理では、培養容器１０から細胞が回収され、別の容器に収容される。

ステップＳ５１６の後、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０から回収された細胞が収容された容器を細胞回収部２７０から容器搬入出部２１０へ搬送し、次いで、容器搬入出部２１０を制御して、容器を細胞処理装置１００の外部へ搬出する（ステップＳ５１７）。

ステップＳ５１６の後、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０から回収された細胞が収容された容器を細胞回収部２７０から細胞播種部２２０へ搬送し、次いで、細胞播種部２２０を制御して、容器中の細胞を新しい培養容器１０に播種し、継代培養処理を実行してもよい。この場合、細胞播種処理後の処理は上記と同様に行われる。

＜第２実施形態＞
次に、図１８を参照して、細胞培養装置１００が行う細胞培養処理手順の第２実施形態について説明する。図１８は、細胞培養装置１００が行う細胞培養処理手順の第２実施形態を示すフローチャートである。なお、第２実施形態における各処理は、別段規定しない限り、第１実施形態と同様に実行される。

第２実施形態では、第１実施形態におけるステップＳ５０２までの処理が、第１実施形態と同様にして実行される。

ステップＳ５０２の後、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞播種部２２０からインキュベーション部２３０へ搬送し、次いで、インキュベーション部２３０を制御して、培養容器１０に対してインキュベーション処理を開始する（ステップＳ６０１）。

ステップＳ６０１の後、動作制御部３１０は、記憶部４３０に記憶されている細胞形態観察スケジュールを参照し、現時点が細胞形態観察処理の開始時刻であるか否かを判定する（ステップＳ６０２）。細胞形態観察処理の開始時刻としては、例えば、インキュベーション処理の開始後、所定時間（例えば、６、１２、１８、２４時間）が経過した時点が挙げられる。細胞形態観察処理の開始時刻は、例えば、インキュベーション処理開始から培地交換処理までの間（例えば、インキュベーション処理開始後２４時間）に、細胞形態観察処理が所定の間隔（例えば６時間間隔）で複数回行われるように設定される。

ステップＳ６０２において、細胞形態観察処理の開始時刻でないと判定した場合（Ｎｏ側）、動作制御部３１０は、インキュベーション処理を続行する。ステップＳ６０２において、細胞形態観察処理の開始時刻であると判定した場合（Ｙｅｓ側）、動作制御部３１０は、インキュベーション部２３０によるインキュベーション処理を中断し、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０をインキュベーション部２３０から細胞形態観察部２４０へ搬送し、次いで、細胞形態観察部２４０を制御して、培養容器１０に対して細胞形態観察処理を実行する（ステップＳ６０３）。

ステップＳ６０３の後、動作制御部３１０は、記憶部４３０に記憶されているインキュベーション処理スケジュールを参照し、現時点が培地交換時刻であるか否かを判定する（ステップＳ６０４）。培地交換時刻としては、例えば、インキュベーション処理開始後、所定時間（例えば、２４時間）が経過した時点が挙げられる。

ステップＳＳ６０４において、現時点が培地交換時刻でないと判定した場合（Ｎｏ側）、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞形態観察部２４０からインキュベーション部２３０へ搬送し、インキュベーション部２３０を制御して、培養容器１０に対して中断されていたインキュベーション処理を再開する（ステップＳ６０１）。動作制御部３１０は、現時点が培地交換時刻であると判定するまで、ステップＳ６０１〜ステップＳ６０４の一連の処理を繰り返し実行する。

動作制御部３１０は、現時点が培地交換時刻であると判定した場合（Ｙｅｓ側）、インキュベーション処理を終了し（ステップＳ６０５）、ステップＳ６０６へ移行する。

ステップＳ６０５の後、第１判定部３２０は、記憶部４３０に記憶されている観察画像および／またはその処理画像に基づいて、培養容器１０中に、不要な細胞（例えば、分化を開始した細胞、成長状態が不良な細胞等）を含むコロニーが存在するか否かを判定する（ステップＳ６０６）。インキュベーション処理の開始からインキュベーション処理の終了までに２回以上の細胞形態観察処理が行われた場合、第１判別部３２０は、それら全ての細胞形態観察処理で撮像された観察画像および／またはその処理画像に基づいて、不要な細胞を含むコロニーが存在するか否かを判定する。第１判別部３２０は、不要な細胞を含むコロニーが存在すると判定した場合、不要な細胞を含むコロニーが存在する位置を特定し、その位置情報を記憶部４３０に記憶させる。

ステップＳ６０６において、第１判定部３２０が、不要な細胞を含むコロニーが存在すると判定した場合（Ｙｅｓ側）、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞形態観察部２４０から細胞剥離部２６０へ搬送し、次いで、細胞剥離部２６０を制御して、培養容器１０に対して細胞剥離処理を実行する（ステップＳ６０７）。ステップＳ６０７の後、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞剥離部２６０から培地交換部２５０へ搬送し、培地交換処理（ステップＳ５０９）に移行する。

ステップＳ６０６において、第１判定部３２０が、不要な細胞を含むコロニーが存在しないと判定した場合（Ｎｏ側）、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞形態観察部２４０から培地交換部２５０へ搬送し、培地交換処理（ステップＳ５０９）に移行する。

第２実施形態におけるステップＳ５０９以降の処理は、第１実施形態と同様である。

第２実施形態では、インキュベーション処理開始からインキュベーション処理終了までに２回以上の細胞形態観察処理が行われ得る。観察条件調整部３４０は、第２判定処理で得られた判定結果に基づいて、細胞形態観察処理における観察条件を調整する際、インキュベーション処理開始からインキュベーション処理終了までに行われる細胞形態観察処理の回数を調整することができる。例えば、第２判定処理において、培養容器１０中の細胞が未分化状態であると判定された場合、観察条件調整部３４０は、インキュベーション処理開始からインキュベーション処理終了までに行われる細胞形態観察処理の回数を増加させる。それに加えてまたはそれに代えて、インキュベーション処理開始からインキュベーション処理終了までに行われる細胞形態観察処理の観察倍率、観察ポイント数等を増加させてもよい。

＜第３実施形態＞
次に、図１９を参照して、細胞培養装置１００が行う細胞培養処理手順の第３実施形態について説明する。図１９は、細胞培養装置１００が行う細胞培養処理手順の第３実施形態を示すフローチャートである。なお、第３実施形態における各処理は、別段規定しない限り、第１実施形態と同様に実行される。

第３実施形態では、第１実施形態におけるステップＳ５０２までの処理が、第１実施形態と同様にして実行される。

ステップＳ５０２の後、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞播種部２２０からインキュベーション部２３０へ搬送し、次いで、インキュベーション部２３０を制御して、培養容器１０に対してインキュベーション処理を開始する（ステップＳ７０１）。

ステップＳ７０１の後、動作制御部３１０は、記憶部４３０に記憶されている細胞形態観察スケジュールを参照し、現時点が細胞形態観察処理の開始時刻であるか否かを判定する（ステップＳ７０２）。細胞形態観察処理の開始時刻としては、例えば、インキュベーション処理開始後、所定時間（例えば、６、１２、１８、２４時間）が経過した時点が挙げられる。細胞形態観察処理の開始時刻は、例えば、インキュベーション処理開始から培地交換処理までの間（例えば、インキュベーション処理開始後２４時間）に、細胞形態観察処理が所定の間隔（例えば６時間間隔）で複数回行われるように設定される。

ステップＳ７０２において、現時点が細胞形態観察処理の開始時刻でないと判定した場合（Ｎｏ側）、動作制御部３１０は、インキュベーション処理を続行する。ステップＳ７０２において、現時点が細胞形態観察処理の開始時刻であると判定した場合（Ｙｅｓ側）、動作制御部３１０は、インキュベーション部２３０によるインキュベーション処理を中断し、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０をインキュベーション部２３０から細胞形態観察部２４０へ搬送し、次いで、細胞形態観察部２４０を制御して、培養容器１０に対して細胞形態観察処理を実行する（ステップＳ７０３）。

ステップＳ７０３の後、第１判定部３２０は、記憶部４３０に記憶されている観察画像および／またはその処理画像に基づいて、培養容器１０中に、不要な細胞（例えば、分化を開始した細胞、成長状態が不良な細胞等）を含むコロニーが存在するか否かを判定する（ステップＳ７０４）。

ステップＳ７０４において、第１判定部３２０が、不要な細胞を含むコロニーが存在しないと判定した場合（Ｎｏ側）、動作制御部３１０は、同一培地で所定時間インキュベーション処理が実行されたか否かを判定する（ステップＳ７０５）。動作制御部３１０は、同一培地で所定時間インキュベーション処理が実行されていないと判定した場合（Ｎｏ側）、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞形態観察部２４０からインキュベーション部２３０へ搬送し、インキュベーション部２３０を制御して、培養容器１０に対して中断されていたインキュベーション処理を再開する（ステップＳ７０１）。動作制御部３１０は、同一培地で所定時間インキュベーション処理が実行されたと判定した場合（Ｙｅｓ側）、インキュベーション処理を終了し（ステップＳ７０６）、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞形態観察部２４０から培地交換部２５０へ搬送し、培地交換処理（ステップＳ５０９）に移行する。

ステップＳ７０４において、第１判定部３２０が、不要な細胞を含むコロニーが存在すると判定した場合（Ｙｅｓ側）、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞形態観察部２４０から細胞剥離部２６０へ搬送し、次いで、細胞剥離部２６０を制御して、培養容器１０に対して細胞剥離処理を実行する（ステップＳ７０７）。

ステップＳ７０７の後、動作制御部３１０は、同一培地で所定時間インキュベーション処理が実行されたか否かを判定する（ステップＳ７０８）。

ステップＳ７０８において、同一培地で所定時間インキュベーション処理が実行されていないと判定した場合（Ｎｏ側）、動作制御部３１０は、インキュベーション処理を終了し（ステップＳ７０９）、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞剥離部２６０から培地交換部２５０へ搬送し、次いで、培地供給部２５０を制御して、培養容器１０に対して培地交換処理を実行する（ステップＳ７１０）。

ステップＳ７１０の後、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を培地交換部２５０からインキュベーション部２３０へ搬送し、次いで、インキュベーション部２３０を制御して、インキュベーション処理が行われていない新鮮な培地が収容された培養容器１０に対してインキュベーション処理を開始する（ステップＳ７０１）。

ステップＳ７０８において、同一培地で所定時間インキュベーション処理が実行されたと判定した場合（Ｙｅｓ側）、動作制御部３１０は、インキュベーション処理を終了し（ステップＳ７０６）、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞剥離部２６０から培地交換部２５０へ搬送し、培地交換処理（ステップＳ５０９）に移行する。

第３実施形態におけるステップＳ５０９以降の処理は、第１実施形態と同様である。

第３実施形態では、インキュベーション処理開始からインキュベーション処理終了までに２回以上の細胞形態観察処理が行われ得る。観察条件調整部３４０は、第２判定処理で得られた判定結果に基づいて、細胞形態観察処理における観察条件を調整する際、インキュベーション処理開始からインキュベーション処理終了までに行われる細胞形態観察処理の回数を調整することができる。例えば、第２判定処理において、培養容器１０中の細胞が未分化状態であると判定された場合、観察条件調整部３４０は、インキュベーション処理開始からインキュベーション処理終了までに行われる細胞形態観察処理の回数を増加させる。それに加えてまたはそれに代えて、インキュベーション処理開始からインキュベーション処理終了までに行われる細胞形態観察処理の観察倍率、観察ポイント数等を増加させてもよい。

＜第４実施形態＞
次に、図面を参照して、細胞培養装置１００が行う細胞培養処理手順の第４実施形態について説明する。図２０は、細胞培養装置１００が行う細胞培養処理手順の第４実施形態を示すフローチャートである。なお、第４実施形態における各処理は、別段規定しない限り、第１実施形態と同様に実行される。

第４実施形態では、第１実施形態におけるステップＳ５１０までの処理が、第１実施形態と同様にして実行される。

ステップＳ５１０の後、第２判定部３３０は、第１培地分析部２９１によって算出された細胞外代謝物の変動値に基づいて、具体的には、細胞外代謝物の変動値が正常であるか否かに基づいて、培養容器１０中の細胞が未分化状態であるか否かを判定する（ステップＳ８０１）。第２判定部３３０は、細胞外代謝物の変動値が正常であるとき、細胞が未分化状態であると判定し、細胞外代謝物の変動値が正常でないとき、細胞が未分化状態でないと判定する。

ステップＳ８０１において、第２判定部３３０が、細胞外代謝物の変動値が正常でない（すなわち、細胞が未分化状態でない）と判定した場合（Ｎｏ側）、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を培地交換部２５０から細胞形態観察部２４０へ搬送し、次いで、細胞形態観察部２４０を制御して、培養容器１０に対する高倍率細胞形態観察処理を実行する（ステップＳ８０６）。この際、観察条件調整部３４０は、細胞形態観察処理における観察倍率を高倍率に調整する。

ステップＳ８０１において、第２判定部３３０が、細胞外代謝物の変動値が正常である（すなわち、細胞が未分化状態である）と判定した場合（Ｙｅｓ側）、動作制御部３１０は、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が分析可能であるか否かを判定する（ステップＳ８０２）。

ステップＳ８０２において、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が分析可能でないと判定した場合（Ｎｏ側）、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を培地交換部２５０からインキュベーション部２３０へ搬送し、インキュベーション処理が行われていない新鮮な培地が収容された培養容器１０に対してインキュベーション処理を開始する（ステップＳ５０３）。

ステップＳ８０２において、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が分析可能であると判定した場合（Ｙｅｓ側）、動作制御部３１０は、第２培地分析部２９２を制御して、細胞外代謝物の変動値の経時的変化を分析する第２培地分析処理を実行する（ステップＳ８０３）。

ステップＳ８０３の後、第２判定部３３０は、細胞外代謝物の変動値の経時的変化に基づいて、具体的には、細胞外代謝物の変動値が減少傾向であるか否かに基づいて、細胞が未分化状態であるか否かを判定する（ステップＳ８０４）。第２判定部３３０は、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が減少傾向であるとき、細胞が未分化状態であると判定し、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が減少傾向以外（増加傾向、増減なし等）であるとき、細胞が未分化状態でないと判定する。

ステップＳ８０４において、第２判定部３３０が、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が減少傾向である（すなわち、細胞が未分化状態である）と判定した場合（Ｙｅｓ側）、動作制御部３１０は、ステップＳ５１５に移行する。

ステップＳ８０４において、第２判定部３３０が、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が減少傾向でない（すなわち、細胞が未分化状態でない）と判定した場合（Ｎｏ側）、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が許容範囲内であるか否かを判定する（ステップＳ８０５）。例えば、第２判定部３３０は、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が増減なしを示す場合や、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が僅かに増加傾向を示す場合に、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が許容範囲内であると判定する。細胞外代謝物の変動値の経時的変化が減少傾向を示さないが、許容範囲内である場合、細胞が未分化状態でないものの、分化の程度が僅かであり、分化を開始した細胞を除去することにより培養継続可能であると考えられる。

ステップＳ８０５において、第２判定部３３０が、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が許容範囲内でないと判定した場合（Ｎｏ側）、動作制御部３１０は、培養容器１０に対する処理を中止する。この際、報知部４４０は、警告を外部に出力する。例えば、報知部４４０は、出力部４２０に警告表示を出力する。

ステップＳ８０５において、第２判定部３３０が、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が許容範囲内であると判定した場合（Ｙｅｓ側）、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を培地交換部２５０から細胞形態観察部２４０へ搬送し、細胞形態観察部２４０を制御して、培養容器１０に対する高倍率細胞形態観察処理を実行する（ステップＳ８０６）。この際、観察条件調整部３４０は、細胞形態観察処理における観察倍率を高倍率に調整する。ステップＳ８０６の高倍率細胞形態観察処理は、高倍率である点を除き、通常の細胞形態観察処理と同様に実行される。

ステップＳ８０６の後、第１判定部３２０は、記憶部４３０に記憶されている観察画像および／またはその処理画像に基づいて、培養容器１０中に、不要な細胞（例えば、分化を開始した細胞、成長状態が不良な細胞等）を含むコロニーが存在するか否かを判定する（ステップＳ８０７）。

ステップＳ８０７において、第１判定部３２０が、不要な状態の細胞を含むコロニーが存在しないと判定した場合（Ｎｏ側）、動作制御部３１０は、ステップＳ５１５に移行する。ステップＳ８０７において、第１判定部３２０が、不要な細胞を含むコロニーが存在すると判定した場合（Ｙｅｓ側）、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞形態観察部２４０から細胞剥離部２６０へ搬送し、次いで、細胞剥離部２６０を制御して、培養容器１０に対して細胞剥離処理を実行する（ステップＳ８０８）。

Ｓ８０８の後、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞剥離部２６０から培地交換部２５０へ搬送し、次いで、培地交換部２５０を制御して、培養容器１０に対して培地交換処理を行う（ステップＳ８０９）。細胞剥離処理後に培地交換処理が行われる場合、培地交換部２５０は、細胞剥離部２６０とともに細胞除去部として機能する。ステップＳ８０９の後、動作制御部３１０は、ステップＳ５１５に移行する。

第４実施形態におけるステップＳ５１５以降の処理は、第１実施形態と同様である。

＜第５実施形態＞
次に、図２１を参照して、細胞培養装置１００が行う細胞培養処理手順の第５実施形態について説明する。図２１は、細胞培養装置１００が行う細胞培養処理手順の第５実施形態を示すフローチャートである。なお、第５実施形態における各処理は、別段規定しない限り、第１実施形態と同様に実行される。

第５実施形態では、第１実施形態におけるステップＳ５０２までの処理が、第１実施形態と同様にして実行される。

ステップＳ５０２の後、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞播種部２２０からインキュベーション部２３０へ搬送し、次いで、インキュベーション部２３０を制御して、培養容器１０に対してインキュベーション処理を開始する（ステップＳ９０１）。

ステップＳ９０１の後、動作制御部３１０は、記憶部４３０に記憶されている細胞形態観察スケジュールを参照し、現時点が細胞形態観察処理の開始時刻であるか否かを判定する（ステップＳ９０２）。細胞形態観察処理の開始時刻としては、例えば、インキュベーション処理開始後、所定時間（例えば、６、１２、１８、２４時間）が経過した時点が挙げられる。細胞形態観察処理の開始時刻は、例えば、インキュベーション処理開始から培地交換処理までの間（例えば、インキュベーション処理開始後２４時間）に、細胞形態観察処理が所定の間隔（例えば６時間間隔）で複数回行われるように設定される。

動作制御部３１０は、ステップＳ９０２において細胞形態観察処理の開始時刻でないと判定した場合（Ｎｏ側）、インキュベーション処理を続行する。動作制御部３１０は、ステップＳ９０２において細胞形態観察処理の開始時刻であると判定した場合（Ｙｅｓ側）、インキュベーション部２３０によるインキュベーション処理を中断し、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０をインキュベーション部２３０から細胞形態観察部２４０へ搬送し、次いで、細胞形態観察部２４０を制御して、培養容器１０に対して細胞形態観察処理を実行する（ステップＳ９０３）。

ステップＳ９０３の後、第１判定部３２０は、記憶部４３０に記憶されている観察画像および／またはその処理画像に基づいて、培養容器１０中に、不要な細胞（例えば、分化を開始した細胞、成長状態が不良な細胞等）を含むコロニーが存在するか否かを判定する（ステップＳ９０４）。インキュベーション処理開始からインキュベーション処理終了までに２回以上の細胞形態観察処理が行われた場合、第１判別部３２０は、それら全ての細胞形態観察処理で撮像された観察画像およびその処理画像に基づいて、不要な細胞を含むコロニーが存在するか否かを判定する。第１判別部３２０は、不要な細胞を含むコロニーが存在すると判定した場合、不要な細胞を含むコロニーが存在する位置を特定し、その位置情報を記憶部４３０に記憶させる。

ステップＳ９０４において、第１判定部３２０が、不要な細胞を含むコロニーが存在すると判定した場合（Ｙｅｓ側）、動作制御部３１０は、インキュベーション処理を終了し（ステップＳ９０５）、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞剥離部２６０へ搬送し、次いで、細胞剥離部２６０を制御して、培養容器１０に対して細胞剥離処理を実行する（ステップＳ９０８）。ステップＳ９０８の後、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞剥離部２６０から培地交換部２５０へ搬送し、培地交換処理（ステップＳ９０９）に移行する。

ステップＳ９０４において、第１判定部３２０が、不要な細胞を含むコロニーが存在しないと判定した場合（Ｎｏ側）、動作制御部３１０は、記憶部４３０に記憶されているインキュベーション処理スケジュールを参照し、現時点が培地交換時刻であるか否かを判定する（ステップＳ９０６）。培地交換時刻としては、例えば、インキュベーション処理開始後、所定時間（例えば、２４時間）が経過した時点が挙げられる。

動作制御部３１０は、ステップＳ９０６において現時点が培地交換時刻でないと判定した場合（Ｎｏ側）、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞形態観察部２４０からインキュベーション部２３０へ搬送し、インキュベーション部２３０を制御して、培養容器１０に対して中断されていたインキュベーション処理を再開する（ステップＳ９０１）。

動作制御部３１０は、ステップＳ９０６において現時点が培地交換時刻であると判定した場合（Ｙｅｓ側）、インキュベーション処理を終了し（ステップＳ９０７）、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞形態観察部２４０から培地交換部２５０へ搬送し、培地交換処理（ステップＳ９０９）に移行する。

動作制御部３１０は、培養容器１０を培地交換部２５０へ搬送した後、培地交換部２５０を制御して、培養容器１０に対して培地交換処理を実行する（ステップＳ９０９）。ステップＳ９０８で剥離された細胞は、培地交換処理により培養容器１０から除去される。細胞剥離処理後に培地交換処理が行われる場合、培地交換部２５０は、細胞剥離部２６０とともに細胞除去部として機能する。

ステップＳ９０９の後、動作制御部３１０は、第１培地分析部２９１を制御して、培地交換処理で回収されたインキュベーション処理済み培地中の細胞外代謝物の変動値を算出するための第１培地分析処理を実行する（ステップＳ９１０）。

ステップＳ９１０の後、動作制御部３１０は、ステップＳ５１１に移行する。
第５実施形態におけるステップＳ５１５以降の処理は、第１実施形態と同様である。

細胞外代謝物の変動値の経時的変化を分析するためには、今回の培地交換処理で回収されたインキュベーション処理済み培地中の細胞外代謝物の変動値と、今回よりも前の培地交換処理（好ましくは、直前の培地交換処理）で回収されたインキュベーション処理済み培地中の細胞外代謝物の変動値とを比較する必要がある。高精度で比較するためには、比較される２つのインキュベーション処理済み培地に対して行われたインキュベーション処理時間が等しいことが必要であるが、第５実施形態では、この要件が満たされない。したがって、第５実施形態のステップＳ５１２において、動作制御部３１０は、今回の培地交換処理で回収されたインキュベーション処理済み培地中の細胞外代謝物の変動値が正常であって、かつ、今回よりも前の培地交換処理（好ましくは、直前の培地交換処理）で回収されたインキュベーション処理済み培地中の細胞外代謝物の変動値が正常であって、かつ、比較される２つのインキュベーション処理済み培地に対して行われたインキュベーション処理時間が等しいとき、細胞外代謝物の変動値の経時的変化が分析可能であると判定する。

第５実施形態では、細胞形態観察処理において不要な細胞が観察された場合、不要な細胞が観察されるまでに行われたインキュベーション処理時間の合計を、次回のインキュベーション処理における培地交換時刻として設定することが好ましい。例えば、培地交換時刻が、インキュベーション処理開始後、２４時間経過した時点として初期設定されていたが、不要な細胞が観察されるまでに行われたインキュベーション処理時間の合計が１２時間であった場合、次回のインキュベーション処理における培地交換時刻は、インキュベーション処理開始後、１２時間経過した時点に変更される。なお、細胞形態観察処理において不要な細胞が観察されなかった場合、今回のインキュベーション処理における培地交換時刻が、そのまま、次回のインキュベーション処理における培地交換時刻として使用される。動作制御部３１０は、Ｓ５１５において培養終了条件が満たさないと判定した場合（Ｎｏ側）、新たな培地交換時刻を設定した上でインキュベーション処理を開始する。

第１実施形態〜第５実施形態は、組み合わせ可能である限り、それらのうち２または３以上を組み合わせてもよい。例えば、第２実施形態、第３実施形態または第５実施形態と第４実施形態とを組み合わせる場合、第２判定処理において、培養容器１０中の細胞が未分化状態でないと判定された場合、観察条件調整部３４０は、インキュベーション処理開始からインキュベーション処理終了までに行われる細胞形態観察処理の回数を増加させることができる。それに加えてまたはそれに代えて、インキュベーション処理開始からインキュベーション処理終了までに行われる細胞形態観察処理の観察倍率、観察ポイント数等を増加させてもよい。

以下に、具体的な実施例に則して本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例の特定の態様により制限されると理解されるべきではない。本発明には、実施例に開示された発明のあらゆる改変や変更が含まれると理解されるべきである。

実施例１：多能性幹細胞の未分化状態と培養培地成分との関係についての検討
本実施例では、多能性幹細胞の未分化状態を評価するための培地解析方法について検討した。

（細胞培養および培養培地の回収）
本実施例では、多能性幹細胞として、ヒトｉＰＳ細胞（公益財団法人 先端医療振興財団 細胞評価グループ 川真田研究室による樹立株）を用いた。
ヒトｉＰＳ細胞を、以下の３つの条件で培養し、分化状態の異なる３つの細胞群（Ａ群、Ｂ群、Ｃ群）を準備した。なお、いずれの群についても、ＥＣＭとしてビトロネクチン−Ｎ（ライフテクノロジーズ社製、製品番号：Ａ１４７０１ＳＡ）を用いた。
Ａ群：ＲｅｐｒｏＦＦ２培地（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社製、製品番号：ＲＣＨＥＭＤ００６）に、ｂＦＧＦ（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社製、製品番号：ＲＣＨＥＭＤ００３）が最終濃度５ｎｇ／ｍＬとなるように添加された培養培地（未分化維持培養培地）を用いてｉＰＳ細胞を播種し、その後も該未分化維持培養培地を用いて培養。
Ｂ群：未分化維持培養培地を用いてｉＰＳ細胞を播種し、播種後１日目（ｄａｙ１）からは、ＲｅｐｒｏＦＦ２培地（すなわち、未分化維持に寄与するｂＦＧＦを添加しない培養培地）を用いて培養。
Ｃ群：未分化維持培養培地を用いてｉＰＳ細胞を播種し、播種後１日目（ｄａｙ１）からは、ＲｅｐｒｏＦＦ２培地に分化誘導因子であるレチノイン酸（シグマアルドリッチ社製、製品番号：Ｒ２６２５−５０ＭＧ）が１×１０^−８ｍｏｌ／Ｌとなるように添加された培養培地を用いて培養。

Ａ群、Ｂ群、Ｃ群のそれぞれの細胞はマルチウェルプレート（６ウェル）（ＢＤ社製、製品番号：３５３０４６）を用いて培養した。６ウェル中の５ウェルを細胞培養に使用し、残りの１ウェルには細胞を播種せず、培地のみのウェルとした。培地交換は播種後１日目（ｄａｙ１）、３日目（ｄａｙ３）、５日目（ｄａｙ５）に全量交換（１ウェルあたり２ｍＬ）し、播種後７日目（ｄａｙ７）まで培養を行った。ここで、培地交換時に、５ウェルから回収される培地を使用済み培地とし、１ウェルから回収される培地をコントロール培地とした。

（細胞形態の観察）
Ａ群、Ｂ群、Ｃ群それぞれの播種後７日目（ｄａｙ７）の細胞形態の観察を、ＣＣＤ付き光学顕微鏡（オリンパス社製、製品番号：ＩＸ８１およびＤＰ７２）を用いて行った。その結果、Ａ群、Ｂ群、Ｃ群は、それぞれ特徴的な細胞形態を有することが確認された（図１Ａ〜Ｃ）。すなわち、Ａ群では、コロニー内部で細胞の大きさが均一な様子が観察され、これは未分化の細胞に特徴的な細胞形態である。よって、Ａ群は、未分化の細胞に相当することが確認された。一方、Ｂ群およびＣ群では、コロニー内部で細胞の大きさが不均一な様子が観察され、これは分化細胞に特徴的な細胞形態である。よって、Ｂ群およびＣ群は、分化を開始した細胞に相当することが確認された。

（遺伝子発現の比較）
Ａ群、Ｂ群、Ｃ群それぞれの播種後７日目（ｄａｙ７）の細胞における各種遺伝子の発現量について、TaqMan（商標）hPSC Scorecard（商標）Panel（ライフテクノロジーズ社：製品番号Ａ１５８７０）を用いて分析を行った。その結果、各種未分化マーカー遺伝子の発現量については、Ａ群とＢ群との差は僅かである一方、Ｃ群では大きく低下していることが分かった（図２）。各種中胚葉系分化マーカーの発現量については、Ｃ群で最も大きく、次にＢ群が大きくなっていた（図３）。すなわち、Ｂ群およびＣ群は、いずれも分化を開始した細胞であるが、Ｃ群がより分化が進行した細胞であることが分かった。

（培養培地の分析）
培地交換時（ｄａｙ１、ｄａｙ３、ｄａｙ５）および培養終了時（ｄａｙ７）に回収した使用済み培地およびコントロール培地を分析に供した。分析としては、回収した培地中に含まれる以下の成分：Ｌ−乳酸（Ｌａｃ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｇｌｕ）、Ｌ−アラニン（Ａｌａ）、アンモニア（ＮＨ_３）の濃度Ｃ（ｍｍｏｌ／Ｌ）の定量を、BioFlow（商標）ＳＴＡＴバイオセンサＢＭ―７Ｍ（王子計測機器社製）を用いて行った。なお、回収した培地は分析まで−８０℃にて冷凍保存し、分析直前に室温にて解凍して分析に供した。

（細胞数の算出）
細胞数については、培地交換時および培養終了時に細胞の形態像をＣＣＤ付き位相差顕微鏡（オリンパス社製、製品番号：ＩＸ８１およびＤＰ７２）にてデジタル画像として取得し、得られたデジタル画像よりコロニー面積を求め、単位面積あたりの細胞数を４０００cells/mm²として細胞数Ｎ（cells）を算出した。

（評価方法およびその結果）
使用済み培地とコントロール培地の分析値の差分（ΔＣ（ｍｏｌ）＝Ｃ_{使用済み培地}−Ｃ_{コントロール培地}）を取り、これを、ｄａｙ１からｄａｙ３、ｄａｙ３からｄａｙ５、ｄａｙ５からｄａｙ７の間の各細胞外代謝物の変動量（増加量／減少量）とした（ΔＬａｃ、ΔＧｌｕ、ΔＡｌａ、ΔＮＨ_３）。

また、培養終了時と各培地交換時の細胞数の差分（ΔＮ（cells））を取り、これを、ｄａｙ１からｄａｙ３、ｄａｙ３からｄａｙ５、ｄａｙ５からｄａｙ７の間に増加した細胞数とした。
そして、ΔＮ vs. ΔＣのプロットを直線近似して得られる傾きΔＣ／ΔＮを算出した（ΔＬａｃ／ΔＮ、ΔＧｌｕ／ΔＮ、ΔＡｌａ／ΔＮ、ΔＮＨ_３／ΔＮ）。

その結果、Ａ群では、ΔＬａｃ、ΔＧｌｕ、ΔＡｌａ、ΔＮＨ_３はいずれもΔＮ（すなわち細胞増殖）と相関があることが確認された（図４）。

ここで、ΔＬａｃ／ΔＮについてはオフセットが小さくなっていることから、ΔＬａｃを基準にして、ΔＬａｃに対するΔＧｌｕ、ΔＡｌａ、ΔＮＨ_３の比を求めた（ΔＧｌｕ／ΔＬａｃ、ΔＡｌａ／ΔＬａｃ、ΔＮＨ_３／ΔＬａｃ）。

その結果、未分化状態が維持されているＡ群では、ΔＧｌｕ／ΔＬａｃ、ΔＡｌａ／ΔＬａｃ、ΔＮＨ_３／ΔＬａｃの値が、培地交換毎（ｄａｙ３→ｄａｙ５→ｄａｙ７）に減少していくことが確認された（図５〜図７）。一方で、分化を開始しているＢ群、Ｃ群ではそのような変化傾向から外れていることが認められた（図５〜７）。なお、図５〜７中、「ｂＦＧＦ（＋）−１」〜「ｂＦＧＦ（＋）−５」はＡ群を示し、「ｂＦＧＦ（−）−１」〜「ｂＦＧＦ（−）−５」はＢ群を示し、「ＲＡ（＋）−１」〜「ＲＡ（＋）−５」はＣ群を示す。「ｂＦＧＦ（＋）」、「ｂＦＧＦ（−）」および「ＲＡ（＋）」の末尾に付加された「１」〜「５」の数字は、５ウェルから回収された培地を識別するための数字（すなわち、サンプル番号）である。

以上のことから、ΔＧｌｕ／ΔＬａｃ、ΔＡｌａ／ΔＬａｃ、ΔＮＨ_３／ΔＬａｃの経時的変化に基づいて、多能性幹細胞の未分化状態の判定が可能であることが分かった。

Claims (29)

1. 未分化状態の多能性幹細胞を、前記多能性幹細胞の未分化状態を維持するための未分化維持培養培地で培養する培養工程において、前記多能性幹細胞の未分化状態が維持されているか否かを判定する判定方法であって、
   前記未分化維持培養培地に含まれる細胞外代謝物の変動値の経時的変化に基づいて、前記多能性幹細胞の未分化状態が維持されているか否かを評価する評価工程を含んでなり、
   前記細胞外代謝物の変動値が、Ｌ−乳酸の変動量に対するＬ−グルタミン酸の変動量の比、Ｌ−乳酸の変動量に対するＬ−アラニンの変動量の比、および、Ｌ−乳酸の変動量に対するアンモニアの変動量の比からなる群から選択される少なくとも１つである、判定方法。
2. 前記培養工程において、使用済みの未分化維持培養培地を新しい未分化維持培養培地と交換する培地交換が行われる、請求項１に記載の判定方法。
3. 前記培養工程において、培地交換が２〜４回行われる、請求項２に記載の判定方法。
4. 培地交換の時間周期が、２４〜４８時間である、請求項２または３に記載の判定方法。
5. 前記Ｌ−乳酸の変動量、前記Ｌ−グルタミン酸の変動量、前記Ｌ−アラニンの変動量および前記アンモニアの変動量が、培地交換された後、次の培地交換までの間の変動量である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の判定方法。
6. 前記細胞外代謝物の変動値が、培地交換により回収された使用済みの未分化維持培養培地の分析により得られる、請求項５に記載の判定方法。
7. 前記使用済みの未分化維持培養培地の分析が培地交換毎に行われ、前記細胞外代謝物の変動値が培地交換毎に得られる、請求項６に記載の判定方法。
8. 前記細胞外代謝物の変動値の経時的変化が、培地交換毎に得られる前記細胞外代謝物の変動値の増減の傾向として求められる、請求項７に記載の判定方法。
9. 細胞外代謝物の変動値が、直前の培地交換時に得られた細胞外代謝物の変動値と比較して、減少傾向を示す場合に、前記評価工程において、前記多能性幹細胞の未分化状態が維持されていると評価し、減少傾向以外の傾向を示した場合に、前記評価工程において、前記多能性幹細胞の未分化状態が維持されていないと評価する、請求項８に記載の判定方法。
10. 前記減少傾向が連続して示される場合に、前記評価工程において、前記多能性幹細胞の未分化状態が維持されていると評価する、請求項９に記載の判定方法。
11. 多能性幹細胞が形成するコロニーの画像の微分フィルタ処理画像（微分画像）に基づいて、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価する工程をさらに含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の判定方法。
12. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
13. 請求項１２に記載のプログラムを記録したコンピュータに読み取り可能な記録媒体。
14. 請求項１２に記載のプログラムを内部記憶装置に記録したコンピュータ。
15. 未分化状態の多能性幹細胞を、前記多能性幹細胞の未分化状態を維持するための未分化維持培養培地で培養する培養工程において、前記多能性幹細胞の未分化状態が維持されているか否かを判定する自動判定システムであって、請求項１４に記載のコンピュータを備えた、自動判定システム。
16. 継代に必要な細胞を回収する工程と、培養および／または継代に不要な細胞を除去する工程とを含んでなる、多能性幹細胞の継代培養方法であって、継代に必要な細胞が、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の判定方法により、未分化状態が維持されていると評価された多能性幹細胞であり、培養および／または継代に不要な細胞が、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の判定方法により、未分化状態が維持されていないと評価された多能性幹細胞である、方法。
17. 未分化状態の多能性幹細胞を、前記多能性幹細胞の未分化状態を維持するための未分化維持培養培地で培養する培養工程において、前記多能性幹細胞の未分化状態が維持されているか否かを判定する装置であって、
    前記装置が、
    多能性幹細胞の培養に使用された前記未分化維持培養培地を回収する回収手段と、
    回収手段により回収された前記未分化維持培養培地中の細胞外代謝物を分析する分析手段と、
    分析手段により得られた分析結果に基づいて前記細胞外代謝物の変動値の経時的変化を求め、前記細胞外代謝物の変動値の経時的変化に基づいて、多能性幹細胞の未分化状態が維持されているか否かを評価する評価手段と
    を備え、
    前記細胞外代謝物の変動値が、Ｌ−乳酸の変動量に対するＬ−グルタミン酸の変動量の比、Ｌ−乳酸の変動量に対するＬ−アラニンの変動量の比、および、Ｌ−乳酸の変動量に対するアンモニアの変動量の比からなる群から選択される少なくとも１つである、装置。
18. 多能性幹細胞を未分化状態で培養するための細胞培養装置であって、
    未分化状態の多能性幹細胞および培地が収容された培養容器に対してインキュベーション処理を行うインキュベーション部と、
    前記インキュベーション処理の終了後に、前記培養容器に対して培地交換処理を行う培地交換部と、
    前記培地交換処理で回収されたインキュベーション処理済み培地中の細胞外代謝物の変動値を算出するための第１培地分析処理を行う第１培地分析部と、
    前記インキュベーション処理、前記培地交換処理および前記第１培地分析処理が２回以上繰り返し行われるように、前記インキュベーション部、前記培地交換部および前記第１培地分析部の動作を制御する動作制御部と、
    前記インキュベーション処理の開始後のいずれかの時点で、前記培養容器に対して細胞形態観察処理を行う細胞形態観察部と、
    前記細胞形態観察処理で得られた観察結果に基づいて、前記培養容器中の細胞が未分化状態であるか否かを判定するための第１判定処理を行う第１判定部と、
    ２回以上行われた前記第１培地分析処理で算出された前記細胞外代謝物の変動値に基づいて、前記細胞外代謝物の変動値の経時的変化を分析するための第２培地分析処理を行う第２培地分析部と、
    前記細胞外代謝物の変動値および／または前記細胞外代謝物の変動値の経時的変化に基づいて、前記培養容器中の細胞が未分化状態であるか否かを判定するための第２判定処理を行う第２判定部と、
    を備え、
    前記培地が、前記多能性幹細胞の未分化状態を維持するための未分化維持培養培地であり、
    前記細胞外代謝物の変動値が、Ｌ−乳酸の変動量に対するＬ−グルタミン酸の変動量の比、Ｌ−乳酸の変動量に対するＬ−アラニンの変動量の比、およびＬ−乳酸の変動量に対するアンモニアの変動量の比からなる群から選択される少なくとも１つである、細胞培養装置。
19. 前記第２培地分析部が、前記細胞外代謝物の変動値の経時的変化を、培地交換毎に得られる前記細胞外代謝物の変動値の増減の傾向として求める、請求項１８に記載の細胞培養装置。
20. 細胞外代謝物の変動値が、直前の培地交換時に得られた細胞外代謝物の変動値と比較して、減少傾向を示す場合に、前記第２判定部が、前記多能性幹細胞が未分化状態であると評価し、減少傾向以外の傾向を示した場合に、前記第２判定部が、前記多能性幹細胞が未分化状態でないと評価する、請求項１９に記載の細胞培養装置。
21. 前記減少傾向が連続して示される場合に、前記第２判定部が、前記多能性幹細胞が未分化状態であると評価される、請求項２０に記載の細胞培養装置。
22. 前記第１判定処理で得られた判定結果および／または前記第２判定処理で得られた判定結果に基づいて、分化を開始した細胞を除去するための細胞除去処理を行う細胞除去部をさらに備える、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
23. 前記第２判定処理で得られた判定結果に基づいて、前記細胞形態観察処理における観察条件を調整する観察条件調整部をさらに備える、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
24. 多能性幹細胞を未分化状態で培養するための細胞培養方法であって、
    （ａ）未分化状態の多能性幹細胞および培地が収容された培養容器に対してインキュベーションを行う工程と、
    （ｂ）工程（ａ）の終了後に、前記培養容器に対して培地交換を行う工程と、
    （ｃ）工程（ｂ）で回収されたインキュベーション済み培地中の細胞外代謝物の変動値を算出する工程と、
    （ｄ）工程（ａ）、工程（ｂ）および工程（ｃ）を２回以上繰り返し行う工程と、
    （ｅ）前記インキュベーションの開始後のいずれかの時点で、前記培養容器に対して細胞形態観察を行う工程と、
    （ｆ）工程（ｅ）で得られた観察結果に基づいて、前記培養容器中の細胞が未分化状態であるか否かを判定する工程と、
    （ｇ）２回以上行われた工程（ｃ）で算出された前記細胞外代謝物の変動値に基づいて、前記細胞外代謝物の変動値の経時的変化を分析する工程と、
    （ｈ）前記細胞外代謝物の変動値および／または前記細胞外代謝物の変動値の経時的変化に基づいて、前記培養容器中の細胞が未分化状態であるか否かを判定する工程と、
    を含んでなり、
    前記培地が、前記多能性幹細胞の未分化状態を維持するための未分化維持培養培地であり、
    前記細胞外代謝物の変動値が、Ｌ−乳酸の変動量に対するＬ−グルタミン酸の変動量の比、Ｌ−乳酸の変動量に対するＬ−アラニンの変動量の比、およびＬ−乳酸の変動量に対するアンモニアの変動量の比からなる群から選択される少なくとも１つである、細胞培養方法。
25. 工程（ｇ）において、前記細胞外代謝物の変動値の経時的変化が、培地交換毎に得られる前記細胞外代謝物の変動値の増減の傾向として求められる、請求項２４に記載の細胞培養方法。
26. 細胞外代謝物の変動値が、直前の培地交換時に得られた細胞外代謝物の変動値と比較して、減少傾向を示す場合に、工程（ｈ）において、前記多能性幹細胞が未分化状態であると評価され、減少傾向以外の傾向を示した場合に、前記多能性幹細胞が未分化状態でないと評価される、請求項２５に記載の細胞培養方法。
27. 前記減少傾向が連続して示される場合に、工程（ｈ）において、前記多能性幹細胞が未分化状態であると評価される、請求項２６に記載の細胞培養方法。
28. 工程（ｆ）で得られた判定結果および／または工程（ｈ）で得られた判定結果に基づいて、分化を開始した細胞を除去する工程（ｉ）をさらに含む、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
29. 工程（ｈ）で得られた判定結果に基づいて、工程（ｅ）における観察条件を調整する工程（ｊ）をさらに含む、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の細胞培養方法。