KR101391679B1 - 세포 배양 장치, 세포 배양 장기 관찰 장치, 세포 장기 배양 방법, 및 세포 배양 장기 관찰 방법 - Google Patents

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Abstract

배양 세포의 가령에 따르는 생리 상태의 변화를 수반하는 일 없이 균일한 환경 조건으로 연속적으로 세포를 배양·관찰할 수 있고, 특정 세포의 히스토리(계보)를 추적하는 것도 가능한 세포 배양 장치, 세포 배양 장기 관찰 장치, 세포 장기 배양 방법, 세포 배양 장기 관찰 방법을 제공하는 것이다. 세포 배양 기판과, 반투막과, 배양액의 공급 수단을 갖는 세포 배양 장치로서, 세포 배양 기판은 표면에 세포를 유지 배양하기 위한 좁은 배양용 홈과, 이 배양용 홈 안에 유지 배양된 세포를 배출하기 위한 굵은 배출용 홈을 가짐과 아울러 상기 배양용 홈의 양단은 배출용 홈에 접속하고, 배출용 홈은 배양용 홈보다 굵고 깊은 것이며, 반투막은 세포 배양 기판의 배양용 홈 및 배출용 홈을 덮도록 사용되는 것이며, 배양액의 공급 수단은 반투막에 의해 덮인 세포 배양 기판에 배양액을 연속적으로 공급할 수 있는 것으로 한다.

Description

세포 배양 장치, 세포 배양 장기 관찰 장치, 세포 장기 배양 방법, 및 세포 배양 장기 관찰 방법{CELL CULTURE DEVICE, DEVICE FOR LONG-TERM MONITORING OF CELL CULTURE, METHOD FOR LONG-TERM CELL CULTURE, AND METHOD FOR LONG-TERM MONITORING OF CELL CULTURE}
본 발명은 세포 배양 장치, 세포 배양 장기 관찰 장치, 세포 장기 배양 방법, 및 세포 배양 장기 관찰 방법에 관한 것이다.
종래, 디시 등에 세포를 넣고, 현미경 하에서 세포를 관찰할 경우, 시간 경과와 함께 세포가 영양을 소비하고, 노폐물이 축적되고, 세포 주위의 환경이 변화되기 때문에 몇 세대에 걸친 세포의 연속적인 배양·관찰이 곤란했다. 또한, 이 경우 세포가 기하급수적으로 증식하기 때문에 특정 세포를 추적해서 관찰하는 것이 어렵다는 문제도 있었다.
그래서, 본 발명자는 세포를 장기 배양하기 위한 방법으로서, 예를 들면 ㎛ 사이즈의 용기에 세포를 넣고, 일부의 세포를 광 핀셋 등의 세포 핸들링 기술을 사용해서 계측계 외로 제거하는 방법을 제안하고 있다(비특허문헌 1). 그러나, 이 방법은 한번에 움직이게 하는 세포의 수가 적고, 또한 실험자가 하나하나의 세포를 선별해서 제거할 필요가 있기 때문에 작업의 부담이 크고, 실제상 길어도 10세대 정도의 연속 배양이 한계이었다.
한편, 최근에는 세포를 장기 배양·관찰하기 위한 방법으로서 「Mother machine」이라고 불리는 방법이 주목받고 있다(비특허문헌 2). 이 방법에서는 기판 상에 폭이 큰 홈(100㎛ 폭)과, 수염형상으로 폭이 작은 홈(1㎛ 폭, 25㎛ 길이)을 형성하고 있다. 그리고, 이 폭이 작은 홈에 세포를 넣고, 폭이 큰 홈으로부터 배양액을 흘리고, 세포 증식에 따라 폭이 작은 홈으로부터 폭이 큰 홈으로 압출되어 온 세포를 배양액으로 씻어냄으로써 연속적으로 불필요한 세포를 제거해서 폭이 작은 홈 안의 세포를 200세대 이상에 걸쳐 배양할 수 있다고 여겨지고 있다.
Wakamoto, Y. et al. (2001) Fres' J Anal Chem; Wakamoto, Y. et al.(2005) Analyst Current Biology, 22 June 2010, Pages 1099-1103 「Robust Growth of Escheruchia coli.」Ping Wang et al.
그러나, 「Mother machine」에서는 수염형상의 폭이 작은 홈의 한쪽의 단부가 폐쇄되어 있어 연속 배양에 불필요한 세포가 제거되어도 이 폭이 작은 홈에 남는 세포가 반드시 오래된 세포(모세포)가 되도록 설계되어 있다. 즉, 「Mother machine」에 있어서는 배양 세포의 가령(加齡)에 따르는 생리 상태의 변화를 억제한다는 착상이 존재하지 않아 관찰하는 세포의 가령에 따르는 생리 상태의 변화가 부수되는 것이 불가피해지는 문제가 있다.
또한, 「Mother Machine」에서는 세포 주위의 배양 환경은 폭이 큰 홈으로부터의 확산에 의해 일어나는 폭이 작은 홈 안의 배양액의 교환에 의해 행해지고 있다. 이 방법에서는 폭이 작은 홈의 길이를 길게 형성했을 경우, 폭이 작은 홈 안에 있어서 폭이 큰 홈에 가까운 영역과 먼 영역에서는 환경 조건이 크게 변화된다는 문제가 있다. 따라서, 예를 들면 세포의 약물 등으로의 응답을 관찰할 경우에는 환경 조건의 차이에 기인해서 배양 세포의 응답의 결과에 변동이 생겨 정확한 검증이 곤란해지는 것도 고려된다.
본 발명은 이상과 같은 사정을 감안하여 이루어진 것이며, 배양 세포의 가령에 따르는 생리 상태의 변화를 수반하는 일 없이 균일한 환경 조건에서 연속적으로 세포를 장기 배양·관찰할 수 있어 특정 세포의 히스토리(계보)를 추적하는 것이 가능한 세포 배양 장치, 세포 배양 장기 관찰 장치, 세포 장기 배양 방법, 및 세포 배양 장기 관찰 방법을 제공하는 것을 과제로 하고 있다.
본 발명의 세포 배양 장치는 상기 과제를 해결하기 위해서 세포 배양 기판과, 반투막과, 배양액의 공급 수단을 갖는 세포 배양 장치로서, 세포 배양 기판은 표면에 세포를 유지 배양하기 위한 좁은 배양용 홈과, 이 배양용 홈 안에 유지 배양된 세포를 배출하기 위한 굵은 배출용 홈을 가짐과 아울러 상기 배양용 홈의 양단은 배출용 홈에 접속되고, 배출용 홈은 배양용 홈보다 굵고 깊은 것이며, 반투막은 세포 배양 기판의 배양용 홈 및 배출용 홈을 덮도록 사용되는 것이며, 배양액의 공급 수단은 반투막에 의해 덮인 세포 배양 기판에 배양액을 연속적으로 공급할 수 있는 것을 특징으로 하고 있다.
이 세포 배양 장치에서는 반투막은 바이오틴-아비딘 결합을 통해 세포 배양 기판을 피복할 수 있게 되어 있는 것이 바람직하다.
이 세포 배양 장치에서는 상기 배양액의 공급 수단이 송액 패드를 갖는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 세포 배양 장기 관찰 장치는 상기 세포 배양 장치와, 세포 배양 기판 상의 세포를 관찰할 수 있는 현미경 관찰 수단을 구비하는 것을 특징으로 하고 있다.
이 세포 배양 장기 관찰 장치에서는 현미경 관찰 수단은 도립형 현미경인 것이 바람직하다.
본 발명의 세포 장기 배양 방법은 상기 세포 배양 장치에 의해 세포를 장기 배양하는 방법이다. 또한, 소망의 세포를 세포 배양 기판의 배양용 홈 안에 유지하는 공정과, 반투막으로 세포 배양 기판의 배양용 홈 및 배출용 홈을 덮는 공정과, 공급 수단에 의해 배양액을 연속적으로 세포 배양 기판으로 보내고, 세포 배양 기판의 배양용 홈 안에 유지된 세포에 반투막을 통해 배양액의 공급을 행함과 아울러 배양용 홈의 양단과 접속하는 배출용 홈을 흐르는 배양액에 의해 배양용 홈 안의 세포의 일부를 배출용 홈으로 배출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명의 세포 배양 장기 관찰 방법은 상기 세포 배양 장기 관찰 장치에 의해 세포를 장기 배양하고, 관찰하는 방법이다. 또한, 소망의 세포를 세포 배양 기판의 배양용 홈 안에 유지하는 공정과, 반투막으로 세포 배양 기판의 배양용 홈 및 배출용 홈을 덮는 공정과, 공급 수단에 의해 배양액을 연속적으로 세포 배양 기판으로 보내고, 세포 배양 기판의 배양용 홈 안에 유지된 세포에 반투막을 통해 배양액의 공급을 행함과 아울러 배양용 홈의 양단과 접속하는 배출용 홈을 흐르는 배양액에 의해 배양용 홈 안의 세포의 일부를 배출용 홈으로 배출하는 공정과, 현미경 관찰 수단에 의해 세포 배양 기판 상의 세포를 관찰하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.
(발명의 효과)
본 발명에 의하면 장기 연속 배양을 가능하게 하고, 배양 세포의 가령에 따르는 생리 상태의 변화를 수반하는 일 없이 균일한 환경 조건 또는 제어된 환경 변화 조건 하에서 연속적으로 세포를 배양하면서 생육 상태를 장기 관찰할 수 있고, 특정 세포의 생육을 장기에 걸쳐 추적해서 관찰할 수 있으므로 세포 사이즈 빈도 분포, 성장률의 빈도 분포, 세대 시간의 빈도 분포, 단백질 발현량의 자기 상관 함수의 측정, 세포 계보의 측정이 가능해진다.
도 1(A)는 본 발명의 세포 배양 장치를 구성하는 세포 배양 기판의 일실시형태를 예시한 부분 확대도이다. 도 1(B)는 도 1(A)의 A-A' 단면도이며, 도 1(C)는 도 1(A)의 B-B' 단면도이다.
도 2는 본 발명의 세포 배양 장치를 구성하는 세포 배양 기판의 다른 실시형태를 예시한 부분 확대도이다.
도 3(A)는 본 발명의 세포 배양 장치의 일실시형태를 예시한 전체도이며, 일부를 단면으로 나타내고 있다. 도 3(B)는 반투막의 사용 방법을 예시한 개요도이다.
도 4는 반투막으로 덮은 세포 배양 기판에 배양액을 공급했을 때의 세포의 상태를 예시한 모식도이다. 도 4(A)는 평면도이며, 도 4(B)는 단면도이다.
도 5는 본 발명의 세포 배양 장치의 다른 실시형태를 예시한 전체도이며, 일부를 단면으로 나타내고 있다.
도 6은 본 발명의 세포 배양 장기 관찰 장치의 일실시형태를 예시한 전체도이며, 일부를 단면으로 나타내고 있다.
도 7은 세포 배양 기판 상의 배양용 홈 안에 존재하는 세포의 모양을 기록한 연속 화상의 일부이다.
도 8은 화상 해석에 의해 얻어진 1세포 계열에 있어서의 55세대분의 세포 사이즈의 변화 및 세포 내부에서의 GFP 발현량(세포 내 농도)의 변화를 플로팅한 도면이다.
도 9는 GFP를 발현하는 대장균의 타임랩스 관찰을 행하고, 관찰된 모든 시점의 모든 세포의 세포 내 GFP 평균 형광 휘도를 측정하고, 그것을 바탕으로 추정한 GFP 발현량의 빈도 분포를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다(실시예 4).
도 10은 GFP를 발현하는 대장균의 타임랩스 관찰을 행하고, 세포 사이즈의 빈도 분포를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다(실시예 5).
도 11은 GFP를 발현하는 대장균의 타임랩스 관찰을 행하고, 성장률의 빈도 분포를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다(실시예 6).
도 12는 GFP를 발현하는 대장균의 타임랩스 관찰을 행하고, 세대 시간의 빈도 분포를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다(실시예 7).
도 13은 GFP를 발현하는 대장균의 타임랩스 관찰을 행하고, 단백질 발현량의 자기 상관 함수를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다(실시예 8).
도 14는 GFP를 발현하는 대장균의 타임랩스 관찰을 행하고, 세포 분열령의 빈도 분포를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다(실시예 9).
도 15는 GFP를 발현하는 대장균의 타임랩스 관찰을 행하고, 1개의 관찰용 홈 안에서 관찰된 세포 계보를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다(실시예 10).
도 16(A)는 유리 기판의 표면에 홈 깊이가 세포의 사이즈보다 작은 배양용 홈을 형성했을 경우의 세포의 상태를 나타낸 유리 기판 상방으로부터의 사진이다. 도 16(B)는 유리 기판의 표면에 홈 깊이가 세포의 사이즈보다 2배 이상 큰 배양용 홈을 형성했을 경우의 세포의 상태를 나타낸 유리 기판 상방으로부터의 사진이다.
본 발명의 세포 배양 장치는 세포 배양 기판과, 반투막과, 배양액의 공급 수단을 갖고 있다.
도 1(A)는 본 발명의 세포 배양 장치를 구성하는 세포 배양 기판의 일실시형태를 예시한 부분 확대도이다. 도 1(B)는 도 1(A)의 A-A' 단면도이며, 도 1(C)는 도 1(A)의 B-B' 단면도이다.
세포 배양 기판은 표면에 좁은 배양용 홈(L)의 양단이 굵은 배출용 홈(M)에 접속한 격자상의 홈 패턴이 형성되어 있다. 배양용 홈(L)과 배출용 홈(M)은 대략 직각으로 교차하고 있다.
배양용 홈(L)은 세포를 홈 안에 유지해서 연속적인 배양을 가능하게 하는 영역으로서 기능하고, 배출용 홈(M)은 배양용 홈(L) 안에 유지 배양된 세포를 적당히 씻어내서 배출함으로써 배양용 홈(L) 안의 환경을 조정하는 영역으로서 기능한다.
본 발명에 있어서 연속적인 배양이란 복수 세대에 걸친 세포 배양을 말하고, 본 발명에서는 세포 주위의 환경을 제어함으로써 200세대 이상에 걸친 장기 세포 배양을 실현할 수 있다.
본 발명의 대상이 되는 세포는 소망의 세포이면 좋고, 세포의 종류는 한정되지 않는다. 구체적으로는, 예를 들면 인간 또는 비인간 동물의 조직으로부터 단리한 줄기 세포, 피부 세포, 점막 세포, 간세포, 췌도 세포, 신경 세포, 연골 세포, 내피 세포, 상피 세포, 골세포, 근세포 등이나, 식물 세포, 곤충 세포, 대장균 등의 세균 세포 등의 세포가 포함되고, 이들 중 1종 또는 2종 이상을 배양할 수 있다.
배양용 홈(L)은 홈 안에 세포를 유지하기 위한 것인 점에서 홈 깊이(L1) 및 홈 폭(L2)이 배양하는 세포의 사이즈보다 큰 것이 전제가 된다. 구체적으로는 배양용 홈(L)의 홈 깊이(L1)는 세포의 사이즈보다 1배~2배, 바람직하게는 1배~1.5배 크게 설계할 수 있다. 또한, 배양용 홈(L)의 홈 폭(L2)은 세포의 사이즈보다 1배~3배, 바람직하게는 1배~2배 크게 설계할 수 있다.
여기에서 「세포의 사이즈」란 대략 구형의 세포이면 세포의 직경(최대 길이)이 기준이 된다. 또한, 예를 들면 세장(細長)의 봉형상 등의 구형 이외의 세포이면 세포를 기판 상에 놓은 상태에서의 세포의 두께(폭)에 의거하여 결정할 수 있고, 이 경우 배양용 홈(L)의 홈 깊이(L1)는 세포의 두께(폭)보다 1배~2배, 홈 폭(L2)은 세포의 두께(폭)보다 1배~3배 크게 설계할 수 있다.
또한, 세포의 사이즈는 문헌 등에 기재된 공지의 사이즈를 참고로 할 수도 있고, 실제로 현미경 등으로 세포의 사이즈를 측정한 결과에 의거하여 결정할 수도 있다.
배양용 홈(L)의 홈 깊이(L1) 및 홈 깊이(L2)가 상기 범위이면 배양용 홈(L) 안에 세포를 안정적으로 유지할 수 있고, 세포의 연속적인 배양·관찰이 가능해진다. 또한, 배양용 홈(L)의 홈 깊이(L1)가 세포의 사이즈보다 2배를 초과해서 큰 경우에는 세포가 배양용 홈(L) 안에 머무르지 않고 배출용 홈(M)으로 유출될 우려가 있어 배양용 홈(L) 안에 세포를 유지해서 연속적으로 배양하는 것이 어렵다. 또한, 배양용 홈(L)의 홈 폭(L2)이 세포의 사이즈보다 3배를 초과해서 큰 경우에는 반투막이 배양용 홈 안에도 접착하여 세포를 뭉개버리거나 또는 세포가 배출용 홈으로 흘러 나오지 않을 우려가 있어 연속적으로 배양하는 것이 어렵다.
또한, 배양용 홈(L)의 길이는 세포의 사이즈나 배양용 홈(L) 안에 유지 배양해야 할 세포의 수 등에 따라 적당히 설계할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 10㎛~100㎛ 정도의 범위, 바람직하게는 30㎛~100㎛ 정도의 범위를 예시할 수 있다.
한편, 배출용 홈(M)은 배양용 홈(L)보다 굵고 깊게 형성되어 있다. 즉, 배출용 홈(M)의 홈 깊이(M1) 및 홈 폭(M2)은 배양용 홈(L)의 홈 깊이(L1) 및 홈 폭(L2)보다 크게 형성되어 있다. 여기에서 「배출용 홈(M)의 홈 깊이(M1)」란 도 1에 나타낸 바와 같이 배양용 홈(L)의 홈 바닥의 높이 위치로부터 배출용 홈(M)의 홈 바닥까지의 거리를 말한다.
배출용 홈(M)의 홈 깊이(M1) 및 홈 폭(M2)은 배양용 홈(L)에 유지 배양하는 세포의 사이즈나 수, 세포 배양 기판 위를 흐르는 세포 배양액의 속도에 따라 배양용 홈(L) 안의 세포를 씻어내는 것이 가능한 범위에서 적당히 설계할 수 있다. 일단 목표로서는 배출용 홈(M)의 홈 깊이(M1)는 세포의 사이즈의 3배~50배의 크기가 바람직하다. 또한, 배양용 홈(L)과의 관계에서는 배양용 홈(L)의 홈 깊이(L1)의 1. 5배~50배의 깊이를 예시할 수 있다. 구체적으로는 배출용 홈(M)의 홈 깊이(M1)는 5㎛~50㎛ 정도의 범위를 바람직하게 예시할 수 있다.
또한, 배출용 홈(M)의 홈 폭(M2)은 홈 깊이(M1)와 같은 정도 또는 그 이상의 크기를 갖고 있는 것이 바람직하다. 배양용 홈(L)과의 관계에서는 배양용 홈(L)의 홈 폭(L2)의 10배~100배의 길이를 예시할 수 있고, 구체적으로는 10㎛ 이상, 바람직하게는 30㎛ 이상의 범위를 예시할 수 있다.
이와 같이 배양용 홈(L) 및 배출용 홈(M)의 홈 깊이(L1, M1) 및 홈 폭(L2, M2)은 배양하는 소망의 세포의 사이즈에 따라 적당히 설계할 수 있다. 구체예를 나타내면, 예를 들면 대장균은 사이즈가 약 0.5㎛~1.0㎛(폭)×1.5㎛~7.0㎛(길이)인 것이 알려져 있다. 본 발명의 세포 배양 장치에 의해 대장균을 연속 배양할 경우에는, 예를 들면 세포 배양 기판의 배양용 홈(L)은 홈 깊이(L1): 1.0㎛~1.5㎛, 홈 폭(L2): 1.0㎛~3.0㎛, 배출용 홈(M)은 홈 깊이(M1): 5㎛~20㎛, 홈 폭(M2): 20㎛~100㎛의 범위를 바람직하게 예시할 수 있다.
세포 배양 기판의 재료는, 예를 들면 붕규산 유리, 석영 유리 등의 유리나, 폴리스티렌 등의 수지나 플라스틱 또는 실리콘 기판 등을 예시할 수 있다. 그 중에서도 유리 기판은 가공성, 취급성이 우수하기 때문에 바람직하다.
세포 배양 기판을 유리로 제작할 경우에는 유리판의 한쪽의 면에 대하여, 예를 들면 포토리소그래피법에 의해 배양용 홈(L)과 배출용 홈(M)의 형상을 포토레지스트에 패터닝하고, 공지의 방법으로 에칭함으로써 배양용 홈(L)과 배출용 홈(M)을 형성해서 세포 배양 기판을 작성할 수 있다. 또한, 적당히 유리판에 레이저 가공 등을 실시할 수도 있다. 또한, 패터닝으로서는 포토리소그래피법 이외에 전자 빔 직접 묘화법 등을 사용할 수도 있다. 세포 배양 기판은 그 표면을 표면 처리제에 의해 처리해도 좋고, 물리적인 표면 가공 처리를 해도 좋다. 예를 들면, 세포 배양 기판 표면 또는 표면의 일부를 친수성, 친유성, 발수성 등 기능을 부여하는 처리를 할 수 있다. 예를 들면, 실리콘 코팅, 관능기 코팅, 예를 들면 아미노기, 이소시아네이트기, 에폭시기, 카르복실기, 수산기, SH기, 실라놀기 등 관능기를 표면 부여할 수 있다. 또한, 바이오틴, 아비딘, 스트렙타아비딘 등 중 어느 하나로 표면을 수식한 것이 바람직하다. 또는 콜라겐, 피브로넥틴, 젤라틴 등의 세포 접착 기질로 세포 배양 기판의 표면을 코팅할 수도 있다.
배양용 홈(L)과 배출용 홈(M)의 홈 패턴은 도 1에서 예시한 형상에 한정되는 것은 아니다. 세포 배양 기판은 배양용 홈(L)과 배출용 홈(M)은 대략 직각인 각도로 접속하고 있으면 좋고, 예를 들면 도 2에 예시한 2개의 배출용 홈(M) 사이에 1개의 배양용 홈(L)이 형성되어 있는 홈 패턴을 갖는 형태이어도 좋다. 또한, 배양용 홈(L) 안의 세포를 적당히 씻어낼 수 있으면 배양용 홈(L)에 대하여 배출용 홈(M)이 엄밀히 직각으로 접속되어 있지 않아도 좋고, 구체적으로는 배양용 홈(L)에 대한 배출용 홈(M)의 각도는 90°±15°의 범위 정도는 허용할 수 있다. 또한, 배양용 홈(L) 및 배출용 홈(M)은 직선상인 것이 바람직하지만, 부분적으로 굴곡한 영역을 갖고 있어도 좋다. 또한, 도 1에서는 배양용 홈(L)과 배출용 홈(M)의 단면 형상이 방형으로 형성되어 있지만 이 형상에 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 홈의 저부가 만곡한 형상이어도 좋다.
본 발명의 세포 배양 장치가 갖는 반투막이란 세포 배양 기판의 배양용 홈 및 배출용 홈을 덮도록 사용된다. 반투막으로서는, 예를 들면 셀룰로오스막 등의 공지의 것을 채용할 수 있다. 반투막은 바이오틴, 아비딘, 스트렙타아비딘 중 어느 하나로 수식되어 있는 것이 바람직하고, 이 경우 세포 배양 기판도 기판의 표면이 바이오틴, 아비딘, 스트렙타아비딘 중 어느 하나로 수식되어 있는 것이 바람직하다. 세포 배양 기판이 바이오틴으로 수식되어 있을 경우에는 아비딘 또는 스트렙타아비딘으로 수식된 반투막을 이용하고, 세포 배양 기판이 아비딘, 스트렙타아비딘으로 수식되어 있을 경우에는 바이오틴으로 수식된 반투막을 이용함으로써 바이오틴-아비딘 결합에 의해 세포 배양 기판의 배양용 홈(L) 및 배출용 홈(M)을 상방으로부터 실링할 수 있다. 이 반투막에 의해 신선한 배양액을 상면으로부터 항상 세포에 공급할 수 있다.
반투막으로 세포 배양 기판의 표면을 덮을 경우, 예를 들면 이하의 방법을 예시할 수 있다. 우선, 세포 배양 기판의 상면에 실리콘 또는 산화 실리콘 또는 크롬 또는 알루미늄 또는 철 또는 티탄 등의 실라놀기와 실란 커플링하는 소재의 박막을 증착 또는 스퍼터링한다. 그리고, 이 박막의 표면에, 예를 들면 편단에 실라놀기를 갖고, 타단에 아미노기 또는 카르복실기 또는 SH기를 갖는 2가성 시약 등에 의해 아미노기 또는 카르복실기 또는 SH기를 도입하고, 바이오틴을 공유 결합시킨다. 그리고, 셀룰로오스 등 막 등의 반투막을 아비딘 또는 스트렙타아비딘으로 수식하여 이 반투막과 박막을 접촉시키고, 바이오틴-아비딘 결합시킴으로써 세포 배양 기판의 상면을 실링할 수 있다. 또한, 세포 배양 기판의 박막의 표면에 아비딘 또는 스트렙타아비딘을, 반투막에 바이오틴을 결합시킬 수도 있다. 또한, 반투막은 세포 배양 기판의 배출용 홈 및 배양용 홈을 상방으로부터 양호한 밀착성을 갖고 피복할 수 있으면 좋고, 반드시 바이오틴-아비딘 결합을 이용하는 형태에 한정되지 않는다.
이어서, 본 발명의 세포 배양 장치의 일실시형태에 대해서 설명한다. 도 3(A)는 본 발명의 세포 배양 장치의 일실시형태를 예시한 전체도이며, 일부를 단면으로 나타내고 있다. 도 3(B)는 반투막의 사용 방법을 예시한 개요도이다. 또한, 도 4는 반투막으로 덮은 세포 배양 기판에 배양액을 공급했을 때의 세포의 상태를 예시한 모식도이며, 도 4(A)가 평면도, 도 4(B)가 단면도이다.
세포 배양 장치(1)는 세포 배양 기판(2)과, 반투막(3)과, 배양액의 공급 수단(4)을 갖고 있다.
상술한 바와 같이 세포 배양 기판(2)에는 배양용 홈(L) 및 배출용 홈(M)이 형성되고, 이 상면이 반투막(3)으로 덮여 있다. 도 3(B)에 예시한 바와 같이 반투막(3)은 적어도 배양용 홈(L)의 상방 영역으로 덮여 있으면 좋다. 배출용 홈(M)의 양단부측은 반투막(3)으로 덮지 않고 개방된 상태로 함으로써 배출용 홈(M)의 일단으로부터 배양액을 공급하고, 타단으로부터 배양액을 배출할 수 있다. 그리고, 반투막(3)으로 덮인 배양용 홈(L) 안에는 세포가 유지되어 있다.
배양용 홈(L) 및 배출용 홈(M)의 주위에는 세포 배양 기판(2)의 표면에 프레임 실(S)이 배치되어 있다. 프레임 실은 적당한 두께가 있고, 표리면에 접착성을 갖는 것을 바람직하게 예시할 수 있지만, 특별히 한정되는 것은 아니다.
배양액의 공급 수단(4)은 송액 펌프(41)(시린지)와, 송액 패드(42)와, 폐액 탱크(43)를 갖고 있다.
송액 펌프(41)는 송액 패드(42)의 일단의 관통 구멍과 송액관으로 접속되어 있고, 세포를 위한 배양액을 내보내 세포 배양 기판(2)으로 배양액을 공급할 수 있다.
송액 패드(42)는 세포 배양 기판(2) 위에 배치되어서 배양용 홈(L), 배출용 홈(M) 및 반투막(3)을 덮고, 또한 배양용 홈(L), 배출용 홈(M) 및 반투막(3)을 포함하는 범위의 주위에서 프레임 실(S)을 통해 밀착하여 밀봉되도록 배치된다. 또한, 송액 패드(42)는 그 한쪽의 단부에 배양액이 유입하는 관통 구멍과, 다른쪽의 단부에 폐배양액을 외부로 배출하는 관통 구멍을 적어도 1개소씩 패드면을 관통하도록 설치되어 있다. 이들 각 관통 구멍은 송액 패드(42)와 세포 배양 기판(2) 사이에 형성되어 배양액이 채워지는 공간에 있어서 배양액 유입용 관통 구멍으로부터 배출용 관통 구멍으로 배양액이 흐르도록 각각 배치되면 좋다.
즉, 송액 패드(42)는 세포 배양 기판(2) 위에 신선한 배양액을 항상 유지하는 기능을 갖는다.
송액 패드(42)는 유리, 아크릴 등의 경질 재료나, 고무, 엘라스토머 등의 유연 재료를 특별히 제한 없이 사용해서 얻을 수 있다. 또한, 송액 패드(42)의 투명성에 대해서는 세포 배양 장치(1)의 상면으로부터의 투과광을 현미경 관찰에 필요로 할 경우에는 투명한 재료가 적합하지만, 형광 관찰 등 투과광을 필요로 하지 않을 경우에는 반드시 투명할 필요는 없다.
이 실시형태에서는 도 3(A)에 나타내는 바와 같이 송액 패드(42)는 프레임 실(S)을 통해 세포 배양 기판(2)의 상방에 접착되어 있다. 세포 배양 기판(2)과 송액 패드(42) 사이에는 공간이 형성되어 있고, 배양 시에는 송액 펌프로부터 공급된 배양액으로 이 공간이 채워진다. 그리고, 세포 배양 기판(2) 위를 통과한 배양액은 송액 패드(42)의 상기 관통 구멍에 의해 이 송액 패드(42)와 접속하는 폐액 탱크(43)로 내보내진다. 송액 패드(42)는, 예를 들면 PDMS(폴리디메틸실록산)에 의해 형성된 투명한 것을 바람직하게 예시할 수 있다. PDMS에 의한 송액 패드(42)는, 예를 들면 실리콘 웨이퍼 위에 포토레지스트를 도포해서 리소그래피법에 의해 홈을 반전시킨 볼록형의 주형을 제작하고, 그 주형에 PDMS 수지를 흘려 넣고 가열해서 성형함으로써 상자 덮개형으로 작성할 수 있다. 또한, 송액 패드(42)에는, 예를 들면 배양액 중의 거품을 제거하는 거품 트랩홈 등을 상자 덮개 내면 바닥에 형성할 수도 있다.
그리고, 도 3(A)에 있어서는 배양액의 공급 수단(4)은 송액 펌프(41)로부터 세포 배양 기판(2)으로 공급되는 배양액의 공급 방향이 세포 배양 기판(2)의 배출용 홈(M)의 길이 방향과 일치하도록 배치되어 있다.
또한, 도 6과 같이 본 발명의 세포 배양 장치(1)는 세포 배양 기판(2) 위의 세포를 관찰할 수 있는 현미경 관찰 수단(5)과 함께 세포 배양 장기 관찰 장치를 구성할 수 있다. 현미경 관찰 수단(5)으로서는, 예를 들면 관찰 대상의 세포의 상을 확대하는 렌즈 등의 광학계를 구비한 장치를 들 수 있고, 구체적으로는 도립형 현미경, 광학 현미경, 형광 현미경, 비디오 녹화 장치, 카메라 등을 예시할 수 있다. 또한, 이들 현미경 관찰 수단을 퍼스널 컴퓨터 등과 접속해서 화상 처리를 행할 수도 있다. 또한, 세포의 관찰을 용이하게 하기 위한 광조사 장치와 함께 사용해도 좋다.
이어서, 본 발명의 세포 배양 장치를 이용한 세포 장기 배양 방법, 세포 배양 장기 관찰 방법의 일실시형태에 대해서 설명한다.
도 3, 도 5의 공급 수단(4)의 송액 펌프(41)를 구동시켜 세포 배양 기판(2) 위로 배양액을 보낸다. 송액 펌프(41)로부터 세포 배양 기판(2)으로의 배양액의 송액 방향이 세포 배양 기판(2)의 배출용 홈(M)의 방향과 일치하고 있기 때문에 송액 펌프(41)로부터 공급된 배양액은 배출용 홈(M)의 일단으로부터 스무스하게 유입되고, 송액 패드(42)와 세포 배양 기판(2) 사이의 내부 공간을 채우면서 세포 배양 기판(2) 위를 통과한다. 예를 들면, 배양액의 송액은 송액 속도 0.5㎖/hr~200㎖/hr정도의 범위에서 행할 수 있다.
이때, 세포 배양 기판(2)의 상면이 반투막(3)으로 덮여 있음으로써 세포 배양 기판(2)에 배양액을 흘렸을 때에 배양용 홈(L) 안에서 유지 배양된 세포가 유출되는 것을 억제함과 아울러 배양액을 공급할 수 있다. 세포 배양 기판(2)은 좁은 배양용 홈(L)의 양측에 굵은 배출용 홈(M)이 접속하고 있기 때문에, 예를 들면 대향하는 2개의 배출용 홈(M)을 흐르는 배양액의 유속이 약간 다른 경우 등이 있다. 이 때문에 반투막(3)을 사용하지 않을 경우에는 배양용 홈(L) 안에 배양액이 빠른 유속으로 유입되어 배양용 홈(L) 안으로부터 배출용 홈(M)으로 세포가 유출될 우려가 있다. 세포 배양 기판(2)의 배양용 홈(L)을 반투막(3)으로 덮음으로써 배출용 홈(M)으로부터 배양용 홈(L)으로의 배양액의 유입을 억제하여 배양용 홈(L) 안의 세포를 안정적으로 유지할 수 있다.
또한, 배양용 홈(L) 안에 유지된 세포에 대해서는 반투막(3)의 상측을 흐르는 배양액이 반투막(3)을 통해 투과, 확산됨으로써 공급된다. 이 때문에 예를 들면, 배양용 홈(L)을 30㎛ 이상으로 길게 형성했을 경우에도 배양용 홈(L) 안에는 안정되며 또한 균일한 환경 조건이 유지된다. 또한, 배양 환경이 균일함으로써 세포의 약물 등으로의 응답을 보다 정확하게 검증하는 것이 가능해진다.
도 4는 반투막으로 덮은 세포 배양 기판으로 배양액을 공급했을 때의 세포의 상태를 예시한 모식도이다. 또한, 도 4에 있어서는 배양용 홈(L)과 배출용 홈(M)의 접속부의 경계선의 도시는 생략하고 있다. 도 4(A)는 평면도이며, 도 4(B)는 단면도이다.
반투막(3)을 통한 배양액의 공급에 의해 배양용 홈(L) 안의 세포는 안정적으로 배양되어 기하급수적으로 증식한다. 그리고, 세포가 배양용 홈(L) 안을 채우는 상태가 되면 배양용 홈(L)의 양측에서 대략 직각인 각도로 접속하는 배출용 홈(M)을 흐르는 배양액에 의해 배양용 홈(L)의 양단[배출용 홈(M)과 배양용 홈(L)의 접속부] 부근에 위치하는 세포의 일부는 배출용 홈(M) 내로 씻어내어져 배양액과 함께 배출되어서 폐액 탱크(43)로 회수된다. 이 때문에 배양용 홈(L) 안의 세포의 수를 소정의 수로 유지할 수 있고, 종래 시간 경과와 함께 발생하고 있었던 세포의 영양 소비, 노폐물의 축적, 세포 주위의 환경의 변화 등의 문제를 해소할 수 있어 현미경 관찰 수단(5)을 사용한 세포 배양 장기 관찰 장치에 의해 200세대 이상에나 걸친 세포의 연속적인 배양·관찰을 행할 수 있다. 이것에 의해 1세포 계열에 의한 성장 속도나 유전자 발현량의 변동의 크기, 자기 상관 함수라는 정보를 지금까지 없는 장기간의 시계열 데이터를 바탕으로 계측하는 것이 가능해진다. 그리고, 100세대 이상에나 걸친 시간은 유전자형의 변화를 수반하는 진화 상태가 일어나는 시간 스케일에 상당하는 점에서 본 발명의 세포 배양 장치, 세포 배양 장기 관찰 장치는 지금까지 실험적인 실증, 검증이 어려웠던 진화 연구로의 응용이 가능해진다.
그리고, 본 발명의 세포 배양 장치를 구성하는 세포 배양 기판은 배양용 홈(L)의 양단에서 배출용 홈(M)이 접속하고 있기 때문에 배양용 홈(L) 안의 세포에는 유동성이 있고, 종래의 「Mother machine」과 같이 모세포가 배양용 홈(L)에 남는 것을 피할 수 있다. 따라서, 배양용 홈(L) 안의 세포에 가령에 따르는 생리 상태의 변화를 수반하는 것이 억제된다.
또한, 배양용 홈(L) 안에 남아있는 세포는 배양용 홈(L) 안에 존재한 세포(모세포)로부터 분열된 것인 점에서 현미경 관찰 수단(5)이나 컴퓨터에 의한 화상 해석 등을 행함으로써 특정 세포의 히스토리(계보)를 추적해서 세포 배양 장기 관찰 장치에 의한 관찰, 해석을 할 수 있다.
또한, 본 발명의 세포 배양 장치, 세포 배양 장기 관찰 장치는 유전자 변이의 검출에도 사용할 수 있다. 구체적으로는 프레임 시프트 변이, 점 변이 등의 유전자 변이가 어떤 특정 부위에 발생했을 때에 그 부위에 배치된 형광 단백질이 올바른 서열로 발현되도록 설계된 세포주를 사용함으로써 배양용 홈 안에 존재하는 세포에 있어서 상기 변이가 발생했을 경우, 형광 단백질의 발현에 의해 세포가 형광을 발현하기 시작한다는 형태에서 세포를 죽이지 않고 변이가 발생한 것을 검출할 수 있다. 이 세포를 세포 배양 장치 내에서 장기간 연속 관찰함으로써 상기 유전자 변이의 발생 빈도, 분열 주기 중에서의 발생 타이밍 등의 정보를 취득할 수 있다.
도 5는 본 발명의 세포 배양 장치의 다른 실시형태를 예시한 전체도이며, 일부를 단면으로 나타내고 있다. 도 3, 도 4에서 나타낸 형태와 공통되는 부분에 관한 설명은 생략한다.
도 5에 예시한 세포 배양 장치(1)에서는 복수의 송액 펌프(41)가 송액 패드(42)에 접속되고, 반투막(3)으로 덮인 세포 배양 기판(2)에 각각의 송액 펌프로부터 배양액의 공급이 가능하게 되어 있다. 이 실시형태에서는, 예를 들면 각각의 송액 펌프(41)에 다른 성분의 배양액을 넣고, 연속 배양에 있어서의 적당한 타이밍에서 사용하는 송액 펌프를 스위칭함으로써 세포 배양 기판(2)의 배양용 홈(L)에 유지된 세포에 여러 가지 환경 조건의 변화를 줄 수 있어 환경 조건의 변화가 주는 세포로의 영향을 장기에 걸쳐 검증할 수 있다.
도 6은 본 발명의 세포 배양 장기 관찰 장치의 일실시형태를 예시한 전체도이며, 일부를 단면으로 나타내고 있다. 도 3, 도 5에서 나타낸 실시형태와 공통되는 부분에 관한 설명은 생략한다.
도 6에 예시한 세포 배양 장기 관찰 장치(1a)는 세포 배양 장치(1)와, 현미경 관찰 수단(5)을 구비하고 있다.
이 실시형태에서는 상술한 세포의 성장 속도나 형광 단백질의 발현 등의 경 시 관찰에 적합한 현미경 관찰 수단(5)으로서 형광 현미경의 기능을 구비한 도립형 전동 현미경을 사용하고 있다.
도립형 전동 현미경[현미경 관찰 수단(5)]은 명시야 관찰 광원(51a), 형광 관찰용 광원(51b), 자동 셔터(52a), 자동 셔터(52b), 콘덴서 렌즈(53), 다이크로익 미러(54), 대물 렌즈(55) 및 XY 스테이지(56)를 구비하고 있다. XY 스테이지(56)는 개구부(A)를 갖고, 세포 배양 장치(1)의 세포 배양 기판(2)은 세포가 유지되는 배양용 홈(L)이 개구부(A)에 위치하도록 XY 스테이지(56) 위에 적재된다.
배양용 홈(L)에 유지된 세포는 전동 모터로 구동되는 XY 스테이지(56)에 의해 자동으로 관찰하고 싶은 위치로 이동할 수 있도록 되어 있다. XY 스테이지(56)의 개구부(A)의 하방에는 대물 렌즈(55)가 인접해서 배치되어 있다. XY 스테이지(56)의 광축을 가로 지르는 X, Y축 방향으로 개별로 이동시키고, 또한 대물 렌즈(55)를 Z축 방향으로 상하 방향으로 이동시킴으로써 XY 스테이지(56)와 대물 렌즈(55)의 상대적인 위치의 조정이 가능하다. 또한, XY 스테이지(56)를 X, Y축 방향에 추가해서 Z축 방향으로 독립해서 이동시키고, 이에 따라 대물 렌즈(55)와의 상대적인 거리를 조정할 수도 있다.
도립형 전동 현미경은 도시되지 않는 본체 케이스의 내부에 명시야 투과 조명계, 낙사 조명계, 촬상계를 구비하고 있다. 명시야 투과 조명계는 XY 스테이지(56)의 높이 위치보다 위에 배치되고, 낙사 조명계 및 촬상계는 XY 스테이지(56)의 높이 위치보다 아래에 배치되어 있다.
명시야 투과 조명계는 투과광에 의한 관찰을 행하기 위해서 사용된다. 명시야 투과 조명계는 명시야 관찰 광원(51a), 자동 셔터(52a), 콘덴서 렌즈(53)를 포함한다. 명시야 관찰 광원(51a)에는 할로겐 램프 등을 사용할 수 있다. 이 명시야 관찰 광원(51a)으로부터 출사된 광은 자동 셔터(52a)가 열린 상태에서 콘덴서 렌즈(53)를 통과하고, 수직 방향 하방을 향해서 XY 스테이지(56) 위에 적재된 세포 배양 기판(2)의 배양용 홈(L)에 유지된 세포를 조사한다.
낙사 조명계는 형광에 의한 관찰을 행하기 위해서 사용된다. 낙사 조명계는 형광 관찰용 광원(51b), 자동 셔터(52b), 다이크로익 미러(54)를 포함한다. 형광 관찰용 광원(51b)에는 수은 램프 등을 사용할 수 있다. 낙사 조명계는 그 밖에 열흡수 필터, 콜렉터 렌즈나, 형광 관찰용 광원(51b)으로부터의 광을 특정의 단파장 대역의 여기광으로 하기 위한 여기 필터 등의 광학계를 구비할 수 있다. 이 형광 관찰용 광원(51b)으로부터 출사된 광은 자동 셔터(52b)가 열린 상태에서 다이크로익 미러(54) 및 대물 렌즈(55)를 통과하고, 수직 방향 상방을 향해 XY 스테이지(56) 위에 적재된 세포 배양 기판(2)의 배양용 홈(L)에 유지된 세포를 개구부(A)로부터 조사한다.
촬상계는 다이크로익 미러(54)에 면해서 부착된 카메라(57)를 포함한다. 카메라(57)는, 예를 들면 CCD 카메라를 사용할 수 있다.
또한, 도립형 전동 현미경은 전원 유닛, 모터 구동 회로 기판 등이 탑재되어 있다. 전원 유닛은 명시야 관찰 광원(51a)의 전원, 도립형 전동 현미경에 장착된 모터 등의 시스템을 제어하기 위한 전원, 형광 관찰용 광원(51b)의 전원 등을 포함한다. 모터 구동 회로 기판은, 예를 들면 XY 스테이지(56)를 X, Y축 방향으로 구동하기 위한 모터, 촬상계의 전동 줌 기구를 구동하기 위한 모터, 수은 램프 등의 형광 관찰용 광원(51b)의 조리개를 구동하기 위한 모터 등을 제어한다.
도립형 전동 현미경은 퍼스널 컴퓨터 등의 컴퓨터(58)에 의해 키보드나 마우스를 사용해서 유저가 각종 조작이나 설정을 행할 수 있다.
투과 조명계와 낙사 조명계는 선택적으로 사용된다. 투과 조명계가 선택되었을 때에는 명시야 관찰 광원(51a)으로부터의 투과 조명광에 의해 얻어진 배양용 홈(L)에 유지된 세포의 상은 개구부(A)로부터 대물 렌즈(55)를 통과하여 다이크로익 미러(54)로 반사되고, 수평 방향을 향해서 배치된 카메라(57)에 도입된다.
한편, 낙사 조명계가 선택되었을 때에는 형광 관찰용 광원(51b)으로부터의 여기광의 조사에 의해 얻어진 배양용 홈(L)에 유지된 세포의 형광에 의한 상은 개구부(A)로부터 대물 렌즈(55)를 통과하여 다이크로익 미러(54)로 반사되고, 수평 방향을 향해서 배치된 카메라(57)에 도입된다.
또한, 도시는 하지 않지만 도립형 전동 현미경은 세포를 눈으로 관찰하기 위한 접안 렌즈와, 접안 렌즈와 대물 렌즈(55)를 광학적으로 결합하는 광학계를 구비하고 있다. 이 광학계는 미러, 릴레이 렌즈, 광로 스위칭 프리즘을 포함한다. 예를 들면, 카메라(57)로 관찰할 경우에는 광로 스위칭 프리즘이 관찰 광축 상에 삽입되고, 대물 렌즈 1차상은 광로 스위칭 프리즘으로 반사되어 카메라(57)로 관찰할 수 있도록 되어 있다. 한편, 눈으로 관찰할 경우에는 광로 스위칭 프리즘이 관찰 광축으로부터 제외되고, 대물 렌즈 1차상은 미러에 의해 접안 렌즈를 향해서 반사된다. 또한, 대물 렌즈 1차상은 릴레이 렌즈에 의해 릴레이되고, 접안 렌즈에 의해 눈으로 관찰할 수 있도록 되어 있다.
이상과 같은 구성의 세포 배양 장치(1)를 사용해서 다음과 같은 세포 관찰을 행할 수 있다.
도 3, 도 5의 실시형태와 마찬가지로 배양액의 공급 수단(4)에 의해 프레임 실(S)을 통해 세포 배양 기판(2)의 상방에 접착된 송액 패드(42)와, 세포 배양 기판(2) 사이에 배양액을 공급한다. 또한, 이 실시형태에서는 송액 패드(42)에는 상술한 배양액 중의 거품을 제거하는 홈인 거품 트랩용 홈(44)을 형성하고 있다.
이 실시형태에서는 현미경 관찰 수단(5)으로서 도립형 전동 현미경을 사용함으로써 현미경 관찰 수단(5)의 관찰 위치가 세포 배양 장치(1) 아래에 위치하고 있는 것이 중요하다.
이것에 의해 송액 패드(42)와 세포 배양 기판(2) 사이에 공급된 배양액 중의 거품은 세포 배양 기판(2)의 상방의 거품 트랩용 홈(44)에 의해 상방으로 제거되고, 이와는 반대측의 세포 배양 기판(2)의 하방으로부터 XY 스테이지(56)의 개구부(A)를 통해 대물 렌즈(55)로부터 배양용 홈(L) 안에 유지된 세포의 확대상을 얻을 수 있다.
그 때문에 세포 배양 장치(1) 안에 발생한 거품이 현미경 관찰 수단(5)에 의한 관찰을 방해하는 것이 방지되어 장기 연속 세포 관찰, 예를 들면 200세대의 장기 연속 세포 관찰도 가능해진다.
반투막(3)을 통한 배양액의 공급에 의해 배양용 홈(L) 안의 세포는 안정적으로 배양되어 기하급수적으로 증식한다. 그리고, 세포가 배양용 홈(L) 안을 채운 상태가 되면 배양용 홈(L)의 양측에서 대략 직각인 각도로 접속하는 배출용 홈(M)을 흐르는 배양액에 의해 배양용 홈(L)의 양단 부근에 위치하는 세포의 일부는 배출용 홈(M) 내로 씻어내어져 배양액과 함께 배출된다.
이렇게 해서 배양용 홈(L) 안에서 배양된 세포는 투과 조명계와 낙사 조명계 중 어느 하나를 조사하고, 대물 렌즈(55)를 사용해서 확대한 상으로서 카메라(57) 또는 접안 렌즈에 의해 관찰할 수 있다.
투과 조명계에 의한 관찰에서는 구체적으로는 상술한 세포의 사이즈, 특히 하나의 세포 계열에 있어서의 세포 사이즈의 변화나 성장 속도 등을 관찰할 수 있다.
낙사 조명계에 의한 형광 관찰에서는 구체적으로는 상술한 세포 내부에서의 형광 단백질의 발현량과 그 변화나, 염색한 세포의 형광 화상과 그 변화 등을 관찰할 수 있다.
즉, 배양용 홈(L) 안에 남아있는 세포는 배양용 홈(L) 안에 존재한 세포(모세포)로부터 분열된 것인 점에서 현미경 관찰 수단(5)이나 컴퓨터(58)에 의한 해석 등을 행함으로써 특정 세포의 히스토리를 추적해서 관찰, 해석을 할 수 있다.
예를 들면, 형광 단백질의 형광 화상 등을 경시에서 카메라(57)에 의해 취득하고, 이것을 컴퓨터(58)에 기록함으로써 타임랩스 계측을 행할 수 있다. 이 타임랩스 화상을 전용의 화상 해석 소프트를 사용해서 컴퓨터(58)로 해석함으로써 취득 화상에 포함되는 세포의 사이즈, 내부의 형광 휘도의 평균 등에 대한 시계열 정보를 취득할 수 있다. 이것에 의해 1세포 계열에 의한 성장 속도나 유전자 발현량의 변동의 크기, 자기 상관 함수라는 정보를 지금까지 없는 장기간의 시계열 데이터를 바탕으로 계측하는 것이 가능해진다.
본 발명은 이상의 실시형태에 한정되는 일은 없다. 그 세부에 대해서 여러 가지 형태가 가능한 것은 말할 필요도 없다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 조금도 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 세포 배양 기판의 작성
대장균을 연속적으로 배양하기 위한 세포 배양 기판으로서 유리 기판[60㎜(길이)×24㎜(폭)×0.17㎜(두께)]에 배양용 홈(L)[홈 깊이(L1): 1.0㎛, 홈 폭(L2): 3.0㎛, 길이 30㎛, 50개], 배출용 홈(M)(M1: 홈 깊이 17㎛, M2: 홈 폭 60㎛, 길이 5000㎛, 20개)을 격자상으로 형성했다(도 1 참조).
<실시예 2> 반투막에 의한 피복
실시예 1에서 작성한 세포 배양 기판의 표면을 바이오틴으로 수식했다. 한편, 반투막으로서 폭 1㎜×길이 1㎜의 셀룰로오스제 반투막을 사용하고, 표면을 스트렙타아비딘으로 수식했다. 그리고, 세포 배양 기판의 표면의 배양용 홈(L), 배출용 홈(M)의 상방으로부터 대장균을 포함하는 배양액을 1㎕ 적하한 후, 세포 배양 기판의 배양용 홈(L) 및 배출용 홈(M)의 상방의 중앙 부분의 일부의 영역을 반투막으로 실링했다.
<실시예 3> 세포의 배양·관찰
본 발명의 세포 배양 장치에 의해 세포를 연속적으로 배양·관찰했다. 구체적으로는 양면 테이프인 사각 프레임 형상을 한 프레임 실(Bio-Rad Laboratories, Inc.제: SLF-0201)을 배양용 홈 및 배출용 홈을 둘러싸는 형태로 세포 배양 기판 상에 실링하고, 또한 프레임 실 상면에 PDMS제의 송액 패드를 첩부했다. PDMS제의 송액 패드에 부착되어 있는 2개의 실리콘제 튜브 중 1개를 시린지(송액 펌프)에 연결하고, 다른 1개를 폐액 탱크 내로 도입했다(도 3 참조). 시린지에 의해 2㎖/h의 유속으로 0.2% 중량비의 글루코오스를 영양원으로서 포함하는 대장균 배양용 M9 최소 배지를 연속적으로 계속해서 흘렸다. 이 세포 배양 장치를 도립형 전동 현미경의 스테이지 위에 배치함으로써 도 6에 나타내는 세포 배양 장기 관찰 장치를 구성하고, 배양용 홈 안의 세포를 배율 100배 위상차 대물 렌즈를 사용해서 2분 간격으로 타임랩스 관찰했다.
관찰에 사용한 대장균은 구체적으로는 W3110주이며, rpsL 유전자의 프로모터에 제어되는 형태로 형광 단백질(GFP)을 발현하는 플러스미드를 갖는 것이다.
타임랩스 계측에서는 세포의 GFP의 형광 화상을 취득하고, 이것을 PC상에 기록했다. 화상 해석 소프트 ImageJ(http://rsbweb.nih.gov/ij/)를 사용해서 이 타임랩스 화상을 해석함으로써 취득 화상에 포함되는 세포의 사이즈, 내부의 형광 휘도의 평균(GFP의 세포 내 농도에 상당)에 대한 시계열 정보를 취득했다.
도 7은 세포 배양 기판 상의 배양용 홈 안에 존재하는 세포의 모양을 기록한 연속 화상의 일부이다.
도 7에 나타낸 바와 같이 세포 배양 기판에 배양액을 공급해서 연속 배양하면 배양용 홈 안에 존재하는 세포 중 배양용 홈의 양단에 존재하는 세포의 일부가 적당히 배출용 홈으로 씻어내어져 화면으로부터 사라져 있는 모양이 확인된다. 또한, 세포 배양 기판의 홈형상 및 반투막에 의해 배양용 홈(L) 안에 세포가 안정적으로 유지되어 배양되고 있는 것도 확인된다. 또한, 반투막을 통한 세포로의 배양액의 공급에 의해 배양용 홈(L) 안은 안정되며 또한 균일한 환경 하가 유지되고 있다.
배양용 홈의 양단에 존재하는 세포가 적당히 배출용 홈으로 씻어내어짐으로써 배양용 홈(L) 안의 세포의 수를 소정의 수로 유지할 수 있고, 종래 시간 경과와 함께 발생하고 있었던 세포의 영양 소비, 노폐물의 축적, 세포 주위의 환경의 변화 등의 문제를 해소할 수 있어 세포의 연속적인 배양·관찰을 행할 수 있는 것이 확인되었다. 또한, 모세포가 배양용 홈(L)에 남는 것을 피할 수 있고, 가령에 따르는 생리 상태의 변화를 수반하지 않고 배양용 홈(L) 안의 세포를 장기 배양할 수 있는 것도 확인되었다.
도 8은 화상 해석에 의해 얻어진 하나의 세포 계열에 있어서의 55세대분의 세포 사이즈의 변화 및 세포 내부에서의 GFP 발현량(세포 내 농도)의 변화를 플로팅한 도면이다.
도 8에 나타낸 바와 같이 본 발명의 세포 배양 장치에 의해 장기에 걸친 세포의 연속적인 배양이 가능한 것이 확인되었다. 이것에 의해 1세포 계열에 의한 성장 속도(세포 사이즈의 변화)나 유전자 발현량의 변동의 크기 등의 정보를 지금까지 없는 장기간의 시계열 데이터를 바탕으로 계측하는 것이 가능해지는 것이 확인되었다.
<실시예 4> 단백질 발현량의 빈도 분포
실시예 3과 마찬가지의 세포 배양 기판, PDMS제의 송액 패드, 시린지(송액 펌프) 및 폐액 탱크를 갖는 세포 배양 장치를 도립형 전동 현미경의 스테이지 위에 배치하고, 배양용 홈 안의 형광 단백질 GFP를 발현하는 대장균을 타임랩스 관찰했다. 시린지에 의해 2㎖/h의 유속으로 0.2% 중량비의 글루코오스를 영양원으로서 포함하는 대장균 배양용 M9 최소 배지를 연속적으로 계속해서 흘렸다. 관찰 시의 배양 온도는 37℃로 유지하고, 배양용 홈 안의 세포를 1분 간격으로 5000분에 걸쳐 타임랩스 관찰했다.
관찰된 모든 시점의 모든 세포의 세포 내 GFP 평균 형광 휘도를 측정하고, 그것을 바탕으로 추정한 GFP 발현량의 빈도 분포를 측정했다. 그 결과를 도 9에 나타낸다.
<실시예 5> 세포 사이즈의 빈도 분포
실시예 4의 타임랩스 관찰에 있어서 세포 사이즈의 빈도 분포를 측정했다. 그 결과를 도 10에 나타낸다.
<실시예 6> 성장률의 빈도 분포
실시예 4의 타임랩스 관찰에 있어서 성장률의 빈도 분포를 측정했다. 1세포의 성장률은 분열로부터 분열까지의 세포 사이즈의 변화를 지수함수 C×2kt로 피팅하고, 그 지수 k를 각 세포의 성장률로 했다. 단, C는 정수, t는 시간을 나타낸다. 그 결과를 도 11에 나타낸다.
<실시예 7> 세대 시간 분포
실시예 4의 타임랩스 관찰에 있어서 세대 시간의 빈도 분포를 측정했다. 세대 시간이란 각 세포가 분열로부터 다음 분열까지 필요로 하는 시간이다. 그 결과를 도 12에 나타낸다.
<실시예 8> 단백질 발현량의 자기 상관 함수
실시예 4의 타임랩스 관찰에 있어서 단백질 발현량의 자기 상관 함수를 측정했다. 어떤 시점(t)에서의 단백질 발현량을 x(t)로 하면, 시간(t) 떨어진 시점과의 자기 상관[A(t)]은 다음 식을 계산함으로써 구했다.
Figure 112014002242245-pct00001
단, E[], V[]는 각각 기대값과 분산을 나타낸다. 그 결과를 도 13에 나타낸다. 이 도면은 A(τ)을 τ에 대하여 플로팅한 것이다.
<실시예 9> 세포 분열령의 분포
실시예 4의 타임랩스 관찰에 있어서 세포 분열령의 빈도 분포를 측정했다. 세포 분열령이란 직전의 분열로부터 현재까지의 시간을 나타낸다. 그 결과를 도 14에 나타낸다.
<실시예 10> 하나의 관찰용 홈 안에서 관찰되는 세포 계보
실시예 4의 타임랩스 관찰에 있어서 하나의 관찰용 홈 안에서 관찰된 세포 계보를 측정했다. 그 결과를 도 15에 나타낸다. 계열의 분기는 세포 분열을 나타내고, 계열이 도중에 끊어지고 있는 것은 세포가 씻어내어진 것을 나타내고 있다.
<실시예 11>
실시예 3과 마찬가지의 세포 배양 기판, PDMS제의 송액 패드, 시린지(송액 펌프) 및 폐액 탱크를 갖는 세포 배양 장치를 도립형 전동 현미경의 스테이지 위에 배치하고, 배양용 홈 안의 세포를 타임랩스 관찰했다. 실시예 3의 대장균을 마우스ES 세포로 바꾸고, 시린지 펌프에 의해 2㎖/h의 유속으로 대장균 배양용 M9 최소 배지 대신에 미분화 유지용 무혈청 배지 ESF7을 연속적으로 계속해서 흘렸다. 상기 유리 기판 표면은 마우스 ES 세포로의 접착을 촉진하기 위해서 콜라겐 또는 E카드헤린-Fc를 코팅했다. 배양용 홈 안의 마우스 ES 세포는 도립형 전동 현미경으로 배율 20배 위상차 대물 렌즈를 사용하여 타임랩스 관찰을 15분 간격으로 행했다.
그 결과, 세포 배양 기판에 배양액을 공급해서 연속 배양하면 배양용 홈 안에 존재하는 마우스 ES 세포 중 배양용 홈의 양단에 존재하는 마우스 ES 세포의 일부가 적당히 배출용 홈으로 씻어내어져 가는 모양이 확인되었다.
또한, 세포 배양 기판의 홈형상 및 반투막에 의해 배양용 홈(L) 안에 마우스 ES 세포가 안정적으로 유지되어 배양되어 있는 것도 확인되었다.
반투막을 통한 마우스 ES 세포로의 배양액의 공급에 의해 배양용 홈(L) 안은 안정되며 또한 균일한 환경 하가 유지되고, 배양용 홈의 양단에 존재하는 마우스 ES 세포가 적당히 배출용 홈으로 씻어내어짐으로써 배양용 홈(L) 안의 마우스 ES 세포의 수를 소정의 수로 유지할 수 있어 세포의 연속적인 배양·관찰을 행할 수 있는 것이 확인되었다. 또한, 모세포가 배양용 홈(L)에 남는 것을 피할 수 있고, 가령에 따르는 생리 상태의 변화를 수반하지 않고 배양용 홈(L) 안의 마우스 ES 세포를 장기 배양할 수 있는 것도 확인되었다.
<비교예 1>
유리 기판의 표면에 홈 깊이(L1)가 세포의 사이즈보다 작은 배양용 홈(L)을 형성하고, 대장균의 배양이 가능한지 검토했다. 구체적으로는 배양용 홈(L)(L1: 홈 깊이 0.5㎛, L2: 홈 폭 2.0㎛, 길이 30㎛, 50개), 배출용 홈(M)(M1: 홈 깊이 17㎛, M2: 홈 폭 60㎛, 길이 5000㎛, 20개)을 격자상으로 형성했다.
그리고, 실시예 2와 같이 세포 배양용 기판을 반투막으로 덮고, 실시예 3과 마찬가지의 장치 구성으로 세포 배양 기판에 배양액을 공급하여 세포를 관찰했다.
결과는 도 16(A)에 나타낸 바와 같이 배양용 홈(L) 안의 세포(C)는 반투막에 의해 뭉개져서 정상 상태에서의 관찰은 불가능했다.
<비교예 2>
유리 기판의 표면에 홈 깊이(L1)가 세포 사이즈(두께)의 2배를 초과해서 큰 배양용 홈(L)을 형성하고, 대장균의 배양이 가능한지 검토했다. 구체적으로는 배양용 홈(L)(L1: 홈 깊이 2.0㎛, L2: 홈 폭 2.0㎛, 길이 30㎛, 50개), 배출용 홈(M)(M1: 홈 깊이 17㎛, M2: 홈 폭 60㎛, 길이 5000㎛, 20개)을 격자상으로 형성했다.
그리고, 실시예 2와 마찬가지로 세포 배양용 기판을 반투막으로 덮고, 실시예 3과 마찬가지의 장치 구성으로 세포 배양 기판에 배양액을 공급하여 세포를 관찰했다.
결과는 도 16(B)에 나타낸 바와 같이 배양용 홈(L) 안의 세포(C)는 안정적으로 유지되지 않고, 배양용 홈(L)으로부터 배출용 홈(M)으로 유출되어버려 연속 배양이 곤란한 것이 확인되었다.
1 : 세포 배양 장치 1a : 세포 배양 장기 관찰 장치
2 : 세포 배양 기판 3 : 반투막
4 : 공급 수단 5 : 현미경 관찰 수단
41 : 송액 펌프 42 : 송액 패드
43 : 폐액 탱크 44 : 거품 트랩용 홈
51a : 명시야 관찰 광원 51b : 형광 관찰용 광원
52a : 자동 셔터 52b : 자동 셔터
53 : 콘덴서 렌즈 54 : 다이클로익 미러
55 : 대물 렌즈 56 : XY 스테이지
57 : 카메라 58 : 컴퓨터
L : 배양용 홈 M : 배출용 홈
A : 개구부 S : 프레임 실

Claims (9)

  1. 세포 배양 기판과, 반투막과, 배양액의 공급 수단을 갖는 세포 배양 장치로서,
    세포 배양 기판은 표면에 세포를 유지 배양하기 위한 좁은 배양용 홈과, 이 배양용 홈 안에 유지 배양된 세포를 배출하기 위한 굵은 배출용 홈을 가짐과 아울러 2개의 배출용 홈 사이에 배양용 홈이 형성되어 있는 홈 패턴이며, 상기 배양용 홈의 양단은 배양용 홈에 대한 배출용 홈의 각도 90°±15°의 범위로 배출용 홈의 측면에 접속하고, 배출용 홈은 배양용 홈보다 굵고 깊은 것이며,
    반투막은 세포 배양 기판의 배양용 홈 및 배출용 홈을 덮도록 사용되는 것이며,
    배양액의 공급 수단은 반투막에 의해 덮인 세포 배양 기판에 배양액을 연속적으로 공급할 수 있는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 반투막은 바이오틴-아비딘 결합을 통해 세포 배양 기판을 피복 가능하게 되어 있는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 배양액의 공급 수단은 송액 패드를 갖는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 배양 장치와, 세포 배양 기판 상의 세포를 관찰 가능한 현미경 관찰 수단을 구비하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장기 관찰 장치.
  5. 제 4 항에 있어서,
    현미경 관찰 수단은 도립형 현미경인 것을 특징으로 하는 세포 배양 장기 관찰 장치.
  6. 제 1 항에 기재된 세포 배양 장치에 의한 것을 특징으로 하는 세포 장기 배양 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    소망의 세포를 세포 배양 기판의 배양용 홈 안에 유지하는 공정과,
    반투막으로 세포 배양 기판의 배양용 홈 및 배출용 홈을 덮는 공정과,
    공급 수단에 의해 배양액을 연속적으로 세포 배양 기판으로 보내고, 세포 배양 기판의 배양용 홈 안에 유지된 세포에 반투막을 통해 배양액의 공급을 행함과 아울러 배양용 홈의 양단과 접속하는 배출용 홈을 흐르는 배양액에 의해 배양용 홈 안의 세포의 일부를 배출용 홈으로 배출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 장기 배양 방법.
  8. 제 4 항에 기재된 세포 배양 장기 관찰 장치에 의한 것을 특징으로 하는 세포 배양 장기 관찰 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    소망의 세포를 세포 배양 기판의 배양용 홈 안에 유지하는 공정과,
    반투막으로 세포 배양 기판의 배양용 홈 및 배출용 홈을 덮는 공정과,
    공급 수단에 의해 배양액을 연속적으로 세포 배양 기판으로 보내고, 세포 배양 기판의 배양용 홈 안에 유지된 세포에 반투막을 통해 배양액의 공급을 행함과 아울러 배양용 홈의 양단과 접속하는 배출용 홈을 흐르는 배양액에 의해 배양용 홈 안의 세포의 일부를 배출용 홈으로 배출하는 공정과,
    현미경 관찰 수단에 의해 세포 배양 기판 상의 세포를 관찰하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장기 관찰 방법.
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