DE102014109468B3

DE102014109468B3 - Kulturkammervorrichtung zur Erzeugung von flusslosen und zeitstabilen Gradienten

Info

Publication number: DE102014109468B3
Application number: DE102014109468.9A
Authority: DE
Inventors: Siegfried Steltenkamp; Simon Tätzner; Sam Schmitz; Peter Holik; Georg Siebke; Simon Stepniak
Original assignee: Stiftung Caesar Center of Advanced European Studies and Research
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2014-07-07
Filing date: 2014-07-07
Publication date: 2015-08-06
Anticipated expiration: 2034-07-08
Also published as: WO2016005173A1

Abstract

Kulturkammervorrichtung zur Erzeugung von flusslosen und zeitstabilen Gradienten (1), umfassend eine Beobachtungskammer (2), in der ein Konzentrationsgefüge dreidimensional einstellbar ist, mehrere Versorgungskanäle (4) zur Durchströmung mit einem Versorgungsfluid (10), jeweils eine Trennwand (13) zwischen den Versorgungskanälen (4) und der Beobachtungskammer (2), wobei die Trennwand (13) Poren (5) zur Diffusion von Versorgungsfluid zwischen dem jeweiligen Versorgungskanal (4) und der Beobachtungskammer (2) aufweist, wobei eine erste Anordnung von Versorgungskanälen (4O) oberhalb der Beobachtungskammer (2) und eine zweite Anordnung von Versorgungskanälen (4U) unterhalb der Beobachtungskammer (2) angeordnet sind.

Description

Die Erfindung betrifft eine Kulturkammervorrichtung zur Erzeugung von flusslosen und zeitstabilen Gradienten.
In einer solchen Kulturkammervorrichtung können unter anderem Zellkulturen definiert mit Nährlösung versorgt oder einem Lockstoffgradienten oder anderen Chemikalien ausgesetzt werden (im Rahmen dieser Anmeldung unter den Begriff Versorgungsfluid zusammengefasst). Dabei ist das Versorgungsfluid frei in der Form von allen wesentlichen mathematischern Funktionen einstellbar. In unterschiedlichen Bereichen der Kulturkammer werden die Zellkulturen mit unterschiedlichen Zusammensetzungen des Versorgungsfluids beaufschlagt, so dass die Entwicklung der Zellkulturen in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Versorgungsfluids beobachtet werden kann. Die Zellkulturen sind dabei in einer Beobachtungskammer angeordnet, die mit einem Fluid gefüllt ist. Das Fluid in der Beobachtungskammer unterliegt bei einem flusslosen Gradienten keiner nennenswerten Strömung. Lediglich durch Diffusion kann an unterschiedlichen Bereichen der Beobachtungskammer die Konzentration des Fluids beeinflusst werden.
Die US 2012/0135446 A1 zeigt eine solche Kulturkammervorrichtung. Durch unterschiedliche Versorgungskanäle strömen unterschiedliche Fluidkomponenten hindurch, die zu einem gemeinsamen Abflusskanal fließen. Nachteilig wirkt sich dabei aus, dass die unterschiedlichen Fluidkomponenten jeweils einen separaten Zufluss benötigen. So kann nur ein diskreter Gradient entstehen. Große Mikroporen im Bereich der Zuflusskanäle ermöglichen eine Diffusion der Fluidkomponenten in die Beobachtungskammer hinein. Durch die relativ großen Poren von 80 µm bis 100 µm im Durchmesser besitzt die Beobachtungskammer einen relativen hohen Fluss. Die Versorgungskanäle sind allesamt seitlich zu der Beobachtungskammer angeordnet; die Diffusion der Nährlösung kann daher nur von einer Seite in die Beobachtungskammer erfolgen. Dies bedingt bereits eine starke Begrenzung bezüglich der Einstellbarkeit in allen Raumrichtungen des Konzentrationsgefüges in der Beobachtungskammer. Ferner sind die Poren jeweils nur mit einer Fluidkomponente beaufschlagbar; es lassen sich so nur diskrete Konzentrationsschritte an den Poren einstellen. Die Vorrichtung wird aus mehreren Komponenten gebildet, die unter anderem aus PDMS gebildet sind. In dieser Vorrichtung laufen die Gradienten in der dritten Ebene spitz nach oben zu. Dies bedeutet, dass diese Vorrichtung ausschließlich die Untersuchung der Chemotaxie an adhärent-bewegenden Zellen erlaubt und keine einheitlichen Gradienten orthogonal zur Gradientenebene erzeugen kann.
Des Weiteren zeigt das Patent DE 10 2011 102 071 eine Vorrichtung zur Untersuchung der Differenzierung von Zellen bei Kontakt mit einem Gradienten aus mindestens einer biologisch wirksamen Spezies. Es ist ein Kammerteil zur Aufnahme von Zellen in einer Nährlösung vorgesehen. In einem Mischerteil werden mindestens zwei unterschiedliche Konzentrationen der biologisch wirksamen Spezies bereitgestellt. Eine zumindest teilweise perforierte Membran ist zwischen dem Mischerteil und dem Kammerteil angeordnet. Als nachteilig ist zu bemerken, dass im Kammerteil eine Trennwand vorgesehen ist, wodurch keine Migration von Zellen untersucht werden kann.
Bei der häufig in diesem Bereich angewendeten Verklebung von Kunststoffen muss ein zusätzlicher Klebstoff verwendet werden, der auch unweit der Poren aufzubringen ist. Da die Poren aber sehr klein sind, besteht bei dem Klebeprozess stets die Gefahr des Zusetzens dieser Poren. Zusätzlich entsteht durch den Klebeprozess eine undefiniert dicke Verbindungsschicht, die keine mikrometergenauen Abstände in dem Aufbau zulässt.
Vielfach wird bei solchen Kulturkammervorrichtungen bislang PDMS eingesetzt. PDMS inkorporiert im Laufe der Zeit Wasser (Wasseraufnahme von ca. 5%) und ist anfällig gegen Verunreinigungen. Zusätzlich sind diese PDMS Chips auf Grund der Wasseraufnahme für eine Aufreinigung oder Wiederverwertung ungeeignet. Des Weiteren ist PDMS luftdurchlässig, so dass bei mikrofluidischen Aufbauten Probleme durch Blasenbildung auftreten.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Kulturkammervorrichtung bereit zu stellen, die sich insbesondere durch folgende Vorteile auszeichnet: Bei der Herstellung der Vorrichtung soll im Bereich der Poren möglichst auf Kunststoffe sowie Verklebungen verzichtet werden; das Konzentrationsgefüge in der Beobachtungskammer soll hoch flexibel – in alle Raumrichtungen quasi frei einstellbar sein. Die Beobachtungskammer soll von beiden Seiten einsehbar sein und damit insbesondere für durch- und/oder auflichtmikroskopische Analyseverfahren geeignet sein.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird gelöst durch eine Kulturkammervorrichtung nach Anspruch 1; bevorzugte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen. Die erfindungsgemäße Kulturkammervorrichtung umfasst eine Beobachtungskammer, in der ein Konzentrationsgefüge dreidimensional einstellbar ist, mehrere Versorgungskanäle, zur Durchströmung mit einem Versorgungsfluid, jeweils eine Trennwand zwischen den Versorgungskanälen und der Beobachtungskammer, wobei die Trennwand Poren zur Diffusion des Versorgungsfluids zwischen dem jeweiligen Versorgungskanal und der Beobachtungskammer aufweist. Die Kulturkammervorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass eine erste Anordnung von Versorgungskanälen oberhalb der Beobachtungskammer und eine zweite Anordnung von Versorgungskanälen unterhalb der Beobachtungskammer angeordnet ist. Durch Abstimmung der Versorgungskanäle oberhalb und unterhalb der Beobachtungskammer zueinander kann ein dreidimensionaler Gradient in der Beobachtungskammer frei eingestellt werden.
Ein Vorteil der Erfindung liegt insbesondere darin, die Beobachtungskammer nicht nur von einer, sondern von zwei Seiten gezielt durch Diffusion mit dem Versorgungsfluid zu versorgen. Durch die Beaufschlagung von zwei Seiten lässt sich das Konzentrationsgefüge innerhalb der Beobachtungskammer nun deutlich feiner und variabler einstellen. Bislang scheiterten solche Konzepte zur möglichst flexiblen Einstellung des Konzentrationsgefüges daran, dass komplexe Versorgungskanalstrukturen auf beiden Seiten zu Lasten der Durchsichtigkeit gehen. Durch das erfindungsgemäße Verfahren, welches weiter unten noch näher erläutert wird, kann eine entsprechende Vorrichtung realisiert werden.
Flussloser Gradient bedeutet dabei, dass sich die Flüssigkeit in der Beobachtungskammer, die insbesondere ein Raum ohne Trennwände oder sonstige Barrieren ist, nicht wesentlich bewegt. Ein Hauptversorgungsstrom ist zwar in den Versorgungskanälen vorgesehen, wird aber durch die Trennwände aus der Beobachtungskammer herausgehalten.
Vorzugsweise umfassen beide Versorgungskanalanordnungen stromaufwärts der Poren jeweils mehrere Zuflussöffnungen, durch die unterschiedliche Fluidkomponenten in die jeweiligen Versorgungskanalanordnungen einfließen können. Das bedeutet, dass durch die Versorgungskanalanordnungen nicht nur ein einziges Fluid beziehungsweise eine Fluidkomponente hindurchströmt, sondern dass mehrere Fluidkomponenten dort eingeführt werden, wobei es zu einer definiert vorgegebenen Vermischung innerhalb der Versorgungskanalanordnung kommt. Bevorzugt wird in den Versorgungskanalanordnungen eine laminare Strömung eingestellt. So lässt sich ein Konzentrationsgefüge quer zur Strömungsrichtung definiert einstellen. Es sind eine Vielzahl mathematischer Funktionen abbildbar, wie z.B. Exponential-, Sinus-, Tangens, Polynom- Sägezahn-, Signum- oder Stufenfunktionen. Einzelnen Poren innerhalb der Trennwand kann so stufenlos eine bestimmte Konzentration der durch sie hindurch diffundierenden Fluidkomponenten vorgegeben werden. Durch eine Variation der Porendurchmesser, der Porenmatrix und/ oder der Porosität der Trennwand ist so ein nahezu stufenloser Gradient in beliebiger Form möglich.
Dabei wird der Versorgungskanal insbesondere durch eine Trennwand an einer der Beobachtungskammer zugewandten Seite begrenzt und durch eine Gehäusewand an einer der Beobachtungskammer abgewandten Seite begrenzt. Die Gehäusewand dient dann insbesondere zur Abgrenzung des Versorgungskanals gegenüber der Umgebung. Vorzugsweise sind sowohl die Trennwände als auch die Gehäusewände aus einem durchsichtigen Material gebildet. Dies dient der verbesserten Einsichtmöglichkeit trotz des Umstandes, dass auf beiden Seiten der Beobachtungskammer die Versorgungskanäle angeordnet sind.
Vorzugsweise ist dabei die Trennwand aus Siliziumdioxid. Siliziumdioxid zeichnet sich insbesondere durch die Durchsichtigkeit und die hohe Variabilität in der Verarbeitbarkeit aus. Alternativ sind Silizium oder Siliziumnitrid als zu verwendendes Material für die Trennwand möglich. Es kommen aber auch Kunststoffe wie zum Beispiel Polycarbonat oder poröse Materialien in Betracht. Die Gehäusewand ist vorzugsweise aus Glas bzw. einem Glaswerkstoff gebildet. Insbesondere kann ein Glaswafer durch einen Ätzprozess strukturiert werden.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer solchen Vorrichtung. Durch das Einbringen der Fluidkomponenten wird innerhalb des Versorgungskanals eine laminare Strömung erzeugt. Die in einem gemeinsamen Versorgungskanal geführten unterschiedlichen Fluidkomponenten werden insbesondere mit einer identischen Strömungsgeschwindigkeit eingeleitet. Wesentlich ist, dass die laminare Strömung im Bereich der Poren gegeben ist. Insbesondere weist der laminare Fluss in seinen äußeren Bereichen, also an den Trennwänden, keine Fließgeschwindigkeit auf. Im Zusammenspiel mit den recht kleinen Poren in der Trennwand wird sichergestellt, dass in der Beobachtungskammer kein Fluss entsteht. Dafür weisen die Poren vorzugsweise einen Durchmesser von maximal 10 µm, vorzugsweise von maximal 5 µm, insbesondere von etwa 2 µm auf. Die Dicke der Trennwand bzw. die Länge der Poren beträgt insbesondere 100 nm bis 100 µm, vorzugsweise in etwa 1 µm.
In unterschiedlichen Bereichen der laminaren Strömung (insbesondere quer zur Strömungsrichtung betrachtet) kann das Versorgungsfluid nun unterschiedliche Konzentrationen der Fluidkomponenten aufweisen. Durch gezielte geometrische Vorgaben der Poren, insbesondere die Position und/oder die Gestalt, dabei insbesondere der Durchmesser und / oder die Länge der Poren, kann die Diffusion einzelner Fluidkomponenten gezielt und insbesondere stufenlos bzw. kontinuierlich beeinflusst werden. Im Zusammenspiel mit der gezielten Einstellung der Konzentrationen kann wiederum die Zusammensetzung des Versorgungsfluids im Inneren der Beobachtungskammer im Bereich der jeweiligen Poren eingestellt werden. So können nicht nur lineare Gradienten erzeugt werden, sondern auch, induziert durch die Mischgeometrie in der Ebene mit den Versorgungskanälen, beliebige Formen orthogonal zur Flussrichtung, wie oben bereits angegeben. Durch die Variation der Porenmatrix kann in der ersten und der zweiten Mischebene (z.B. LB-Ebene) der Gradient frei in der Beobachtungskammer eingestellt werden. Der Gradient wird in der dritten Raumrichtung (H-Richtung) durch die beiden Mischebenen und die Variation der Porenmatrix eingestellt.
Das Versorgungsfluid wird durch unterschiedliche Fluidkomponenten gebildet, die im Versorgungskanal eine Durchmischung erfahren. Im Versorgungskanal fließt das Versorgungsfluid vorzugsweise laminar von der einen Stirnseite mit den Zuflussöffnungen zu einer anderen Stirnseite mit Abflussöffnungen. Die vorzugsweise laminare Strömung wird insbesondere dadurch erreicht, dass zum einen der Versorgungskanal einen konstanten, insbesondere rechteckigen, Querschnitt über seine Länge aufweist. Zum anderen strömt das Versorgungsfluid insbesondere von zumindest mehr als 0,1 µl/min bis zu 500 µl/min durch den Versorgungskanal. Es kann in den Einlässen der Versorgungskanäle ein Druck maximal 10 bar anliegen.
Eine solche Einrichtung wird folglich bevorzugt derart verwendet, dass durch gezieltes Einbringen der Fluidkomponenten in die beiden Versorgungskanalanordnungen sowohl oberhalb als auch unterhalb der Beobachtungskammer eine laminare Strömung mit einem vorgegebenen Gradienten quer zur Strömungsrichtung erzeugt wird. Dabei wird durch die gezielte Erzeugung der laminaren Strömung mit einem vorgegebenen Gradienten quer zur Strömungsrichtung innerhalb der Versorgungskanalanordnungen insbesondere der Gradient in der Beobachtungskammer in allen drei Raumrichtungen frei eingestellt.
So kann durch die Anordnung der Poren der Gradient in der Beobachtungskammer gezielt beeinflusst werden. Zunächst wird dazu ein gewünschter Gradient innerhalb der Beobachtungskammer festgelegt. Anschließend werden Verhältnisse einander gegenüberliegender Poren in den beiden Trennwänden, basierend auf dem gewünschten Gradienten, festgelegt, wodurch der Verlauf des Gradienten in H-Richtung (vertikal zur Ebene des Versorgungskanal) eingestellt wird. Das Verhältnis der Porenanordnung in einer Trennwand definiert den Gradienten in L-Richtung (parallel zur Strömungsrichtung in dem Versorgungskanal). Die beiden vorgenannten Planungsschritte erfolgen in direktem Zusammenhang miteinander. Anschließend wird der Gradient in den Versorgungskanälen festgelegt. Dieser Gradient wird über die Anordnung der Mäander und die Anzahl der Anschlüsse eingestellt. Die Ordnung (linear, quadratisch, kubisch, etc.) des Verlaufs des Gradienten in B-Richtung (quer zur Strömungsrichtung parallel zur Ebene des Versorgungskanals) ist über die Anzahl der Einlässe mit den jeweiligen Anfangskonzentrationen festgelegt und kann durch die Veränderung der Versorgungskonzentration während des Betriebes frei eingestellt werden.
Die Aufgabe wird ferner gelöst durch ein Verfahren zum Herstellen einer solchen Vorrichtung. Zur Bildung der Trennwand wird ein Siliziumwafer, umfassend eine erste Siliziumschicht und sich eine daran anschließende erste Siliziumdioxidschicht, bereitgestellt. Durch Strukturieren der Siliziumdioxidschicht werden die Poren erzeugt. Die erste Siliziumdioxidschicht stellt an der fertigen Vorrichtung die erste Trennwand dar. Die Siliziumschicht kann dann an der späteren Vorrichtung entweder die Beobachtungskammer oder zumindest Teile davon oder einen Versorgungskanal oder zumindest Teile davon bilden.
Es werden zumindest ein weiterer, vorzugsweise zwei weitere, Siliziumwafer im Laufe des weiteren Herstellungsverfahrens verwendet, welche jeweils eine Siliziumschicht umfassen. Durch Strukturieren der jeweiligen Siliziumschicht werden die Versorgungskanäle, nämlich insbesondere der obere oder der untere Versorgungskanal gebildet. Die Schichten, insbesondere die Siliziumschichten oder Siliziumdioxidschichten, die an unterschiedlichen Wafern bereitgestellt wurden, werden bevorzugt durch Waferbonding, vorzugsweise Fusionsbonden, miteinander verbunden. Das Waferbonding hat im Vergleich zum Verkleben, Plasma-Aktivierung oder Thermobonden den Vorteil, dass diese Verbindung irreversibel und inert ist sowie hohen Drücken und ohne Wasseraufnahme in die Vorrichtung standhält. Zusätzlich entfällt die Klebeschicht. Durch das Waferbonding kann zusätzlich ausgeschlossen werden, dass Leckagen durch Kleben oder anderen Sollbruchstellen entstehen.
Vorzugsweise wird durch Strukturieren einer an dem weiteren Siliziumwafer angebrachten Siliziumdioxidschicht eine weitere Trennwand zwischen der Beobachtungskammer und dem anderen der Versorgungskanäle gebildet. Das Verbinden dieser Trennwand, also der Siliziumdioxidschicht mit der Siliziumschicht, die die Beobachtungskammer begrenzt, findet vorzugsweise wiederum durch Waferbonding statt.
Vorzugsweise wird der Versorgungskanal auf der der Beobachtungskammer abgewandten Seite durch einen Glaswafer abgedeckt. Dieser kann, insbesondere durch einen chemischen oder physikalisch-chemischen Ätzprozess, strukturiert werden.
Für das Herstellungsverfahren eignet sich insbesondere ein Ätzprozess insbesondere mit einem vorhergehenden Belichtungsprozess mit einer Maske zur Strukturierung. Vorzugsweise kann die Strukturierung durch UV- oder Elektronenstrahllithographie erfolgen.
Durch die Integration der Herstellung in die MEMS-Technologie ist die hier vorgestellte Vorrichtung für den Betrieb mit hohen Drücken geeignet und lässt sich einfach mit vielen verschiedenen Säuren, insbesondere Caro’scher Sauere, reinigen. Ein weiterer Vorteil dieser Vorrichtung ist die zu vernachlässigende Wasseraufnahme, die Inertheit gegenüber vielen gängigen Säuren und Basen und der einstellbaren Hydrophilie, bzw Oberflächenenergie und Ladung.
Die Erfindung wird anhand der Figuren nachfolgend näher erläutert. Hierin zeigt:
1 eine erfindungsgemäße Kulturkammervorrichtung, aufgeschnitten und in Explosionsdarstellung;
2 die Kulturkammervorrichtung in Einzelteildarstellung;
3

a) eine Aufsicht auf den Versorgungskanal der Kulturkammervorrichtung aus 1 in Schnittdarstellung mit beispielhaften Fluidkomponenten;
b) eine Frontalansicht des Versorgungskanals nach 3a;
c) ein beispielhaftes paraboloides Konzentrationsgefüge innerhalb des Versorgungskanals nach 3a;

4 ein beispielhaftes Konzentrationsgefüge in der Beobachtungskammer bei einem dreistufigen Gradienten in den jeweiligen Versorgungsebenen;
5 bis 15 einzelne Stufen während der Herstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Die 1 und 2 zeigen eine erfindungsgemäße Kulturkammervorrichtung 1. In einer Beobachtungskammer 2 werden Zellen kultiviert, die definiert mit einer Nährlösung oder Chemikalien (im Folgenden stets Versorgungsfluid 10) versorgt werden. In der Beobachtungskammer 2 ist keine Strömung vorhanden. Das Versorgungsfluid 10 diffundiert aus den oberen und unteren Versorgungskanälen 4 _O, 4 _U durch Mikroporen 5 in die Beobachtungskammer 2 hinein. In den Versorgungskanälen 4 wird eine laminare Strömung erzeugt, die aus unterschiedliche Fluidkomponenten gebildet wird. Die Versorgungskanäle sind Bestandteil jeweils einer oberen bzw. unteren Mischebene 3 _O, 3 _U, in denen ein vorgegebenes Konzentrationsgefüge des Versorgungsfluids 10 definiert gebildet wird.
Die Mischebenen 3 _O, 3 _U werden gebildet aus je einer Gehäusewand 14. In dieser Gehäusewand 14 sind mehrere Einlassbohrungen 16 vorgesehen, durch die unterschiedliche Fluidkomponenten von unterschiedlicher Konzentration eingelassen werden können. In einem daran anschließenden Mischbereich 18, im vorliegenden Beispiel aufweisend eine Mäanderstruktur, werden die unterschiedlichen Fluidkomponenten vermischt. Die gemischten Fluidkomponenten werden dann anschließend durch Zuflussöffnungen 7, die sich an einer ersten Stirnseite 6 des Versorgungskanals 4 befinden, in den Versorgungskanal 4 eingelassen. Über eine Abflussöffnung 9 an einer zweiten Stirnseite 8 strömt das Versorgungsfluid 10 aus dem Versorgungskanal 4 aus. Über eine Auslassbohrung 17 wird das ausgeströmte Versorgungsfluid zur Entsorgung nach außen geleitet. Beide Mischebenen 3 _O und 3 _U sind weitgehend identisch zueinander ausgebildet. Über eine Zugangsbohrung 19 kann die Beobachtungskammer 2 entlüftet oder entwässert werden oder initial mit Fluid aufgefüllt werden.
3a zeigt einen vereinfacht dargestellten Versorgungskanal 4 im Querschnitt entlang der Flussrichtung des Versorgungsfluides. Durch drei Zuflussöffnungen 7 an der ersten Stirnseite 6 (3b) strömen gezielt unterschiedliche Fluidkomponenten 11 ₁, 11 ₂, 11 ₃ in den Versorgungskanal 4 ein in Richtung zu Abflussöffnungen 9 an einer zweiten Stirnseite 8. Es stellt sich über die Breite B ein stufenloses Konzentrationsgefüge ein, wie es in 3c gezeigt ist. Es lassen sich vielseitige Konzentrationsgefüge einstellen, auch unter Verwendung unterschiedlichster Fluidkomponenten 11.
Der Versorgungskanal 4 kann rechteckig sein, wie im Ausführungsbeispiel angegeben; die Strömung im Bereich der Poren ist vorzugsweise laminar. Unter Stirnseite kann der Bereich verstanden werden, in welchem die einzelnen Fluidkomponenten erstmalig in den gemeinsamen Versorgungskanal 4 münden. Auch die Beobachtungskammer kann einen gekrümmten Verlauf aufweisen.
In 2 sind die Poren 5 zu erkennen, die einen Durchmesser von etwa 2 µm aufweisen können. Die Dicke der Trennwand (entspricht der Länge der Poren) beträgt 1 µm. Innerhalb einer Trennwand kann die geometrische Ausbildung und Anordnung der Poren beliebig variiert werden. So sind zum Beispiel Poren 5 ₁ mit kleinerem Durchmesser und Poren 5 ₂ mit größerem Durchmesser möglich. Auch können die Abstände der Poren untereinander variieren. Dadurch lässt sich der Gradient in der Beobachtungskammer flexibel einstellen. Die Trennwand 13 kann auch durch eine Membran gebildet werden. Alternativ kann die Trennwand auch durch ein poröses Material gebildet werden, welches für das Versorgungsfluid durchlässig ist. Durch geeignete Beschichtungen oder Strukturierung der Oberfläche kann die Durchlässigkeit an einzelnen Stellen definiert verringert oder vergrößert werden.
Anhand 4 soll verdeutlicht werden, wie sich in den Versorgungskanälen oberhalb und unterhalb der Beobachtungskammer 2 das Konzentrationsgefüge (Gradient) in der Beobachtungskammer 2 variabel und stufenlos einstellen lässt. Auch hier werden beispielhaft gleichartige Fluidkomponenten verwendet, die sich nur durch die Konzentration voneinander unterscheiden. Im oberen Versorgungskanal 4 _O wird ein in etwa lineares Konzentrationsgefüge erzeugt, welches von links nach rechts abfällt. Im unteren Versorgungskanal 4 _U wird ein zur Mitte ansteigendes und nach außen abfallendes Konzentrationsgefüge erzeugt.
Dies zeigt sich auch in dem Konzentrationsgefüge innerhalb der Beobachtungskammer 2, welches durch die sechs Diagramme rechts dargestellt ist. Die oberen Diagramme stellen das Konzentrationsgefüge in einer oberen Position h = H₃ im Bereich der oberen Trennwand dar; die mittleren Diagramme stellen das Konzentrationsgefüge in einer mittleren Höhenposition h = H₂ dar; die unteren Diagramme stellen das Konzentrationsgefüge in einer unteren Position h = H₁ dar. Die linken Diagramme stellen das Konzentrationsgefüge in einer Längenposition l = L₁ dar, eher der ersten Stirnseite 7 zugewandt; die rechten Diagramme stellen das Konzentrationsgefüge in einer Längenposition l = L₂ dar, eher der zweiten Stirnseite 8 abgewandt; D1 > D2 bedeutet, dass die Poren im Bereich L₁ einen kleineren Durchmesser aufweisen als im Bereich L₂.
Im unteren Bereich H₁ ähnelt das Konzentrationsgefüge in der Beobachtungskammer 2 dem im unteren Versorgungskanal 4 _U; im oberen Bereich H₃ ähnelt das Konzentrationsgefüge dem im oberen Versorgungskanal 4 _O. Durch die geringere Porengröße im Bereich L₁ ist das Konzentrationsniveau dort grundsätzlich geringer als im Bereich L₂. Das Konzentrationsgefüge im mittleren Bereich H₂ stellt eine Mischung aus dem Konzentrationsgefüge im oberen und unteren Bereich dar.
Anhand 5 bis 15 wird das Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen Vorrichtung erläutert. 5 zeigt einen sogenannten Silicon-on-Insulater-Wafer 21. Dieser umfasst zwei Siliziumschichten HL, DL, die beidseits einer Siliziumdioxidschicht (insulating layer) IL angeordnet sind. Bei der einen Siliziumschicht HL handelt es sich um den sogenannten handle layer, die andere Schicht DL ist der sogenannte device layer. Der handle layer wird während des Herstellungsverfahrens benutzt, um den Wafer während der Produktion halten zu können. Die device layer Schicht DL, 24 wird im Laufe des Verfahrens strukturiert und stellt Material für die spätere Vorrichtung bereit. Ein solcher Silicon-on-Insulater-Wafer 21, nachfolgend kurz Wafer oder Siliziumwafer genannt, wird im beschriebenen Verfahren mehrfach eingesetzt; der grundsätzliche Aufbau eines solchen Wafers 21 bleibt stets identisch. Dieser erste Siliziumwafer 21 ist an der freien Seite, also die Seite, die dem handle layer HL abgewandt ist, mit einer ersten Siliziumdioxidschicht 27 versehen.
In einem ersten Ätzvorgang wird die Porenstruktur in die erste Siliziumdioxidschicht 27 übertragen. Die erste Siliziumdioxidschicht 27 stellt in der fertigen Vorrichtung später die Trennwand 13 dar. Durch die Strukturierung werden die Poren 5 erzeugt. Sogleich können bei Bedarf auch weitere Strukturen 30 erzeugt werden, die in der späteren Vorrichtung Bestandteile von Zuflüssen oder Ähnlichem sind (6).
In einem nächsten Verfahrensschritt (7) wird die Trennwand 13 bzw. der strukturierten ersten Siliziumdioxidschicht 27 mit einem zweiten Siliziumwafer 22 mit einer zweiten Siliziumschicht 25, die durch die device layer DL des zweiten Siliziumwafers 22 gebildet ist, verbunden. Dies geschieht durch Bonden. Vom ersten Siliziumwafer 21 wurde dabei bereits die Isolierschicht IL und der handle layer HL entfernt, so dass lediglich die erste Siliziumschicht 24 und die Siliziumdioxidschicht 27 übrig bleibt. 8 zeigt die Anordnung aus erster Siliziumschicht 24 mit Trennwand 13 und daran befestigtem zweiten Siliziumwafer 22.
In einem weiteren Verfahrensschritt wird die erste Siliziumschicht 24 in einem Ätzprozess strukturiert (9). Von der ersten Siliziumschicht 24 wird nun bis auf die Seitenwandungen 31, die die spätere Beobachtungskammer seitlich begrenzen, sämtliches Material abgetragen. Auch hier können freigeätzte Strukturen 30 als Bestandteile späterer Zu- oder Abflüsse bestehen bleiben. Der zwischen den Seitenwandungen 31 gebildete Raum stellt in der fertigen Vorrichtung die Beobachtungskammer 2 dar. Die zweite Siliziumschicht 25 bildet später in der fertigen Vorrichtung den unteren Versorgungskanal 4 _U.
In 10 wird nun auf die Oberseite der Seitenwandungen 31 wiederum ein weiterer dritter, Siliziumwafer 23 mit einer Siliziumdioxidschicht (dritte Siliziumdioxidschicht 29) aufgebracht 29, 13. Dies entspricht exakt der Anordnung, wie sie in 6 gezeigt ist und weiter oben beschrieben wurde. Zur Verdeutlichung sind daher in 6 die Bezugszeichen 23 für den dritten Siliziumwafer, Bezugszeichen 26 für die dritte Siliziumschicht und Bezugszeichen 29 für die dritte Siliziumdioxidschicht in Klammern eingefügt. Die dritte Siliziumschicht 26 bildet später den oberen Versorgungskanal 4 _O. Die Trennwand 13, die durch die dritte Siliziumdioxidschicht 29 gebildet wird, wird nun auf die Seitenwandungen 31 aufgesetzt und gebondet.
Die entstehende Anordnung ist in 11 gezeigt.
In einem weiteren Verfahrensschritt (12) wird nun die dritte Siliziumschicht 26 strukturiert, wodurch der obere Versorgungskanal 4 _O gebildet wird, sowie ebenfalls geätzte Strukturen 30, die später Bestandteile eines Zu- oder Abflusses darstellen.
In einem weiteren Verfahrensschritt wird auf die zuvor strukturierte dritte Siliziumschicht 26 ein Glaswafer 32 aufgebracht (13), der den oberen Versorgungskanal 4 _O abdeckt. Zugleich stabilisiert er auch die bisher erzeugte Anordnung für die weitere Prozessierung. In einem weiteren Schritt (14) wird die folgende Siliziumschicht 25 strukturiert, um den unteren Versorgungskanal 4 _U auszubilden.
Es ist ersichtlich, dass der Schritt nach 12 auch abweichend zunächst mit der zweiten Siliziumschicht 25 anstelle der dritten Siliziumschicht 26 durchgeführt werden könnte. Entsprechend würde sich auch der Ablauf der nachfolgenden Schritte verändern.
In einem weiteren Verfahrensschritt in 15 wird auf die strukturierte zweite Siliziumschicht 25, die den unteren Versorgungskanal 4 _U bildet, ein weiterer Glaswafer 32 aufgebracht und ggf. strukturiert. Die beiden strukturierten Glaswafer 32 bilden dann die Gehäusewand 14 an der fertigen Kulturkammervorrichtung 1 aus.
Bei der fertigen Kulturkammervorrichtung kann so durch die aus Glas gebildete Gehäusewand 14, durch den Versorgungskanal 4 _O, 4 _U und die dünne Trennwand 13 hindurch geblickt werden, um die Vorgänge in der Beobachtungskammer 2 zu beobachten, wahlweise von beiden Seiten. Daraus ergibt sich die Eignung für durch- und auflichtmikroskopische Analyseverfahren.
Bezugszeichenliste

1: Kulturkammervorrichtung
2: Beobachtungskammer
3: Mischebene
4: Versorgungskanal
5: Poren
6: erste Stirnseite
7: Zuflussöffnung
8: zweite Stirnseite
9: Abflussöffnung
10: Versorgungsfluid
11: Fluidkomponente
12: laminarer Strömungsbereich
13: Trennwand
14: Gehäusewand
15: Wandung der Beobachtungskammer
16: Einlassbohrung
17: Auslassbohrung
18: Mäanderstruktur (Mischbereich)
19: Zugangsbohrung zu Beobachtungskammer
21: erster Siliziumwafer
22: zweiter Siliziumwafer
23: dritter Siliziumwafer
24: erste Siliziumschicht (auf ersten Siliziumwafer)
25: zweite Siliziumschicht (auf zweitem Siliziumwafer)
26: dritte Siliziumschicht (auf drittem Siliziumwafer)
27: erste Siliziumdioxidschicht (auf erstem Siliziumwafer)
28: zweite Siliziumdioxidschicht (auf zweitem Siliziumwafer)
29: dritte Siliziumdioxidschicht (auf drittem Siliziumwafer)
30: geätzte Strukturen als Bestandteile späterer Zu- oder Abflüsse
31: Seitenwandungen der Beobachtungskammer
32: Glaswafer
IL: Insulating Layer
HL: Handling Layer
DL: Device Layer

Claims

Kulturkammervorrichtung zur Erzeugung von flusslosen und zeitstabilen Gradienten (1), umfassend eine Beobachtungskammer (2), in der ein Konzentrationsgefüge dreidimensional einstellbar ist, mehrere Versorgungskanäle (4) zur Durchströmung mit einem Versorgungsfluid (10), jeweils eine Trennwand (13) zwischen den Versorgungskanälen (4) und der Beobachtungskammer (2), wobei die Trennwand (13) Poren (5) zur Diffusion von Versorgungsfluid zwischen dem jeweiligen Versorgungskanal (4) und der Beobachtungskammer (2) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass eine erste Anordnung von Versorgungskanälen (4 _O) oberhalb der Beobachtungskammer (2) und eine zweite Anordnung von Versorgungskanälen (4 _U) unterhalb der Beobachtungskammer (2) angeordnet sind.
Vorrichtung nach dem vorherigen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass beide Versorgungskanalanordnungen (4) stromaufwärts der Poren (5), insbesondere an einer ersten Stirnseite (6), jeweils mehrere Zuflussöffnungen (7) aufweisen, durch die unterschiedliche Fluidkomponenten in die jeweiligen Versorgungskanalanordnungen (4) einfließen können.
Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Versorgungskanal (4) durch eine Trennwand (13) an einer der Beobachtungskammer (2) zugewandten Seite und durch eine Gehäusewand (14) an einer der Beobachtungskammer (2) abgewandten Seite begrenzt wird, insbesondere der Umgebung begrenzt wird, wobei sowohl die Trennwand (13) als auch die Gehäusewand (14) aus einem durchsichtigen Material gebildet sind.
Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennwand (13) aus Silizium, Siliziumdioxid oder Siliziumnitrid gebildet ist.
Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Gehäusewand (14) aus einem durchsichtigen Material, insbesondere einem Glaswerkstoff oder einem durchsichtigen Kunststoff, gebildet ist.
Verwendung einer Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche und des Anspruchs 2, dadurch gekennzeichnet, dass durch gezieltes Einbringen der Fluidkomponenten (11) in die beiden Versorgungskanalanordnungen (4) sowohl oberhalb als auch unterhalb der Beobachtungskammer eine laminare Strömung mit einem Gradienten quer zur Strömungsrichtung erzeugt wird.
Verwendung nach dem vorherigen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass durch die gezielte Erzeugung der laminaren Strömung mit einem vorgegebenen Gradienten quer zur Strömungsrichtung innerhalb der Versorgungskanalanordnungen (4) der Gradient in der Beobachtungskammer in allen drei Raumrichtungen frei einstellbar ist.
Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei zur Bildung der Trennwand (13) ein Siliziumwafer (21), umfassend eine erste Siliziumschicht (24) und eine erste Siliziumdioxidschicht (27) bereitgestellt wird, wobei durch Strukturieren der ersten Siliziumdioxidschicht (27) die Poren (5) in die erste Siliziumdioxidschicht (27) eingebracht werden.
Verfahren nach dem vorherigen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass durch Strukturieren der ersten Siliziumschicht (24) Wandungen (31) der Beobachtungskammer (2) gebildet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass durch zumindest einen, vorzugsweise zwei, weitere Siliziumwafer (22, 23), jeweils umfassend eine weitere Siliziumschicht (25, 26), und durch Strukturieren der jeweiligen Siliziumschicht (25, 26) die Versorgungskanäle (4 _O, 4 _U) gebildet werden.
Verfahren nach dem vorherigen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Siliziumschichten oder Siliziumoxidschichten, die an unterschiedlichen Wafern bereitgestellt wurden, durch Waferbonding, vorzugsweise Fusionsbonding, miteinander verbunden werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass durch Strukturieren einer an dem weiteren Siliziumwafer (22, 23) angebrachten Siliziumdioxidschicht (29) eine weitere Trennwand (13) zwischen der Beobachtungskammer (2) und einem der Versorgungskanäle (4) gebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Versorgungskanal (4) auf der der Beobachtungskammer (2) abgewandten Seite durch einen Glaswafer (32) abgedeckt wird, der insbesondere durch einen Ätzprozess strukturiert wird.