JPWO2013011962A1 - 細胞培養装置、細胞培養長期観察装置、細胞長期培養方法、および細胞培養長期観察方法 - Google Patents
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Abstract
Description
<実施例1>細胞培養基板の作成
大腸菌を連続的に培養するための細胞培養基板として、ガラス基板(60mm(長さ)×24mm(幅)×0.17mm(厚さ))に、培養用溝L(溝深さL1:1.0μm、溝幅L2:3.0μm、長さ30μm、50本)、排出用溝M(M1:溝深さ17μm、M2:溝幅60μm、長さ5000μm、20本)を格子状に設けた(図1参照)。
<実施例2>半透膜による被覆
実施例1で作成した細胞培養基板の表面をビオチンで修飾した。一方、半透膜として幅1mm×長さ1mmのセルロース製半透膜を使用し、表面をストレプトアビジンで修飾した。そして、細胞培養基板の表面の培養用溝L、排出用溝Mの上方から大腸菌を含む培養液を1μl滴下した後、細胞培養基板の培養用溝Lおよび排出用溝Mの上方の中央部分の一部の領域を半透膜でシールした。
<実施例3>細胞の培養・観察
本発明の細胞培養装置によって、細胞を連続的に培養・観察した。具体的には、両面テープである四角枠形状をしたフレームシール(バイオラッド社製:SLF-0201)を培養用溝および排出用溝を取り囲む形で細胞培養基板上にシールし、さらにフレームシール上面にPDMS製の送液パッドを貼付けた。PDMS製の送液パッドに取付けてある2本のシリコン製チューブのうち1本をシリンジ(送液ポンプ)に連結し、もう1本を廃液タンク内に導入した(図3参照)。シリンジにより、2ml/hの流速で、0.2%重量比のグルコースを栄養源として含む、大腸菌培養用M9最小培地を連続的に流し続けた。この細胞培養装置を、倒立型電動顕微鏡のステージ上に配置することによって図6に示すような細胞培養長期観察装置を構成し、培養用溝内の細胞を倍率100倍位相差対物レンズを用いて、2分間隔でタイムラプス観察した。
<実施例4>タンパク質発現量の頻度分布
実施例3と同様の細胞培養基板、PDMS製の送液パッド、シリンジ(送液ポンプ)、および廃液タンクを有する細胞培養装置を倒立型電動顕微鏡のステージ上に配置し、培養用溝内の蛍光タンパク質GFPを発現する大腸菌をタイムラプス観察した。シリンジにより、2ml/hの流速で、0.2%重量比のグルコースを栄養源として含む、大腸菌培養用M9最小培地を連続的に流し続けた。観察時の培養温度は37℃に維持し、培養用溝内の細胞を1分間隔で5000分にわたってタイムラプス観察した。
<実施例5>細胞サイズの頻度分布
実施例4のタイムラプス観察において、細胞サイズの頻度分布を測定した。その結果を図10に示す。
<実施例6>成長率の頻度分布
実施例4のタイムラプス観察において、成長率の頻度分布を測定した。1細胞の成長率は分裂から分裂までの細胞サイズの変化を指数関数C×2ktでフィッティングし、その指数kを各細胞の成長率とした。ただし、Cは定数、tは時間を表す。その結果を図11に示す。
<実施例7>世代時間分布
実施例4のタイムラプス観察において、世代時間の頻度分布を測定した。世代時間とは、各細胞が分裂から次の分裂にまで要する時間である。その結果を図12に示す。
<実施例8>タンパク質発現量の自己相関関数
実施例4のタイムラプス観察において、タンパク質発現量の自己相関関数を測定した。ある時点tでのタンパク質発現量をx(t)とすると、時間t離れた時点との自己相関A(t)は次式を計算することで求めた。
<実施例9>細胞分裂齢の分布
実施例4のタイムラプス観察において、細胞分裂齢の頻度分布を測定した。細胞分裂齢とは、直前の分裂から現在までの時間を表す。その結果を図14に示す。
<実施例10>ひとつの観察用溝内で観察される細胞系譜
実施例4のタイムラプス観察において、ひとつの観察用溝内で観察された細胞系譜を測定した。その結果を図15に示す。系列の枝分かれは細胞分裂を表し、系列の途切れているところは細胞が洗い流されたことを示している。
<実施例11>
実施例3と同様の細胞培養基板、PDMS製の送液パッド、シリンジ(送液ポンプ)、および廃液タンクを有する細胞培養装置を倒立型電動顕微鏡のステージ上に配置し、培養用溝内の細胞をタイムラプス観察した。実施例3の大腸菌をマウスES細胞に代えて、シリンジポンプにより2ml/hの流速で、大腸菌培養用M9最小培地に代えて未分化維持用無血清培地ESF7を連続的に流し続けた。前記ガラス基板表面は、マウスES細胞のへの接着を促進するため、コラーゲンもしくは、Eカドヘリン-Fcをコートした。培養用溝内のマウスES細胞は、倒立型電動顕微鏡で倍率20倍位相差対物レンズを用い、タイムラプス観察を15分間隔で行った。
<比較例1>
ガラス基板の表面に、溝深さL1が細胞のサイズよりも小さい培養用溝Lを形成し、大腸菌の培養が可能であるか検討した。具体的には、培養用溝L(L1:溝深さ0.5μm、L2:溝幅2.0μm、長さ30μm、50本)、排出用溝M(M1:溝深さ17μm、M2:溝幅60μm、長さ5000μm、20本)を格子状に設けた。
<比較例2>
ガラス基板の表面に、溝深さL1が細胞サイズ(厚さ)の2倍を超えて大きい培養用溝Lを形成し、大腸菌の培養が可能であるか検討した。具体的には、培養用溝L(L1:溝深さ2.0μm、L2:溝幅2.0μm、長さ30μm、50本)、排出用溝M(M1:溝深さ17μm、M2:溝幅60μm、長さ5000μm、20本)を格子状に設けた。
1a 細胞培養長期観察装置
2 細胞培養基板
3 半透膜
4 供給手段
5 顕微観察手段
41 送液ポンプ
42 送液パッド
43 廃液タンク
44 泡トラップ用溝
51a 明視野観察光源
51b 蛍光観察用光源
52a 自動シャッター
52b 自動シャッター
53 コンデンサーレンズ
54 ダイクロイックミラー
55 対物レンズ
56 XYステージ
57 カメラ
58 コンピュータ
L 培養用溝
M 排出用溝
A 開口部
S フレームシール
Claims (9)
- 細胞培養基板と、半透膜と、培養液の供給手段とを有する細胞培養装置であって、
細胞培養基板は、表面に、細胞を保持培養するための細い培養用溝と、この培養用溝内に保持培養された細胞を排出するための太い排出用溝を有するとともに、前記培養用溝の両端は、排出用溝に接続し、排出用溝は、培養用溝より太く、深いものであり、
半透膜は、細胞培養基板の培養用溝および排出用溝を覆うように使用されるものであり、
培養液の供給手段は、半透膜によって覆われた細胞培養基板に、培養液を連続的に供給できるものであることを特徴とする細胞培養装置。 - 前記半透膜は、ビオチン−アビジン結合を介して細胞培養基板を被覆可能とされていることを特徴とする請求項1に記載の細胞培養装置。
- 前記培養液の供給手段は、送液パッドを有することを特徴とする請求項1に記載の細胞培養装置。
- 請求項1から3のいずれか一項に記載の細胞培養装置と、細胞培養基板上の細胞を観察可能な顕微観察手段とを備えることを特徴とする細胞培養長期観察装置。
- 顕微観察手段は、倒立型顕微鏡であることを特徴とする請求項4に記載の細胞培養長期観察装置。
- 請求項1に記載の細胞培養装置によることを特徴とする細胞長期培養方法。
- 所望の細胞を細胞培養基板の培養用溝内に保持する工程と、
半透膜で、細胞培養基板の培養用溝および排出用溝を覆う工程と、
供給手段によって培養液を連続的に細胞培養基板へ送り、細胞培養基板の培養用溝内に保持された細胞へ半透膜を介して培養液の供給を行うとともに、培養用溝の両端と接続する排出用溝を流れる培養液によって、培養用溝内の細胞の一部を排出用溝へ排出する工程と、
を含む請求項6に記載の細胞長期培養方法。 - 請求項4に記載の細胞培養長期観察装置によることを特徴とする細胞培養長期観察方法。
- 所望の細胞を細胞培養基板の培養用溝内に保持する工程と、
半透膜で、細胞培養基板の培養用溝および排出用溝を覆う工程と、
供給手段によって培養液を連続的に細胞培養基板へ送り、細胞培養基板の培養用溝内に保持された細胞へ半透膜を介して培養液の供給を行うとともに、培養用溝の両端と接続する排出用溝を流れる培養液によって、培養用溝内の細胞の一部を排出用溝へ排出する工程と、
顕微観察手段によって細胞培養基板上の細胞を観察する工程と、
を含む請求項8に記載の細胞培養長期観察方法。
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