JP2008199919A

JP2008199919A - 細胞選別分取方法および装置

Info

Publication number: JP2008199919A
Application number: JP2007037146A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Kishida; 昌浩岸田; Hideki Matsune; 英樹松根; Takeshi Takenaka; 竹中　　壮
Original assignee: Kyushu University NUC
Current assignee: Kyushu University NUC
Priority date: 2007-02-16
Filing date: 2007-02-16
Publication date: 2008-09-04

Abstract

【課題】細胞の選別のために試薬を一切使用することなく、細胞の選別および分取を可能にした細胞選別分取方法および装置の提供。
【解決手段】細胞を非接触で捕捉して移動させることが可能な光ピンセット１と、この光ピンセット１により細胞を捕捉したまま、この捕捉している細胞の形態変化を観察する観察部２と、この観察部２による観察の結果、捕捉している細胞の形態変化の程度に応じて、この捕捉している細胞を光ピンセット１により移動させ、分取させる光ピンセット制御部２とを有する。
【選択図】図１

Description

本発明は、光ピンセットを利用して細胞の選別および分取を行う細胞選別分取方法および装置に関する。

近年、細胞を単一レベルで精密に調べる研究が進められている。また、近年、光の放射圧を利用して物体を固定できる光ピンセットが生物学分野に導入され始めている。光ピンセットでは、直接には全く触れることなく、レーザ光を用いてミクロンサイズ以下の物体を捕捉し、移動させることが可能である。このような光ピンセットを用いて細胞を観察する装置として、例えば特許文献１，２に記載のものが知られている。

特許文献１には、微生物や細胞を培養し、その培養液を交換できるようにした培養容器と、細胞培養容器内の細胞を長期観察することのできる顕微光学手段とを具備した一細胞長期培養顕微観察装置が記載されている。この装置は、細胞培養容器内の細胞を捕捉し、移動させる手段として光ピンセットを具備する。

また、特許文献２には、培養器に付着する細胞群から所定の細胞を分離して採取するに際し、培養器内へキレート剤溶液を加えて細胞の培養器への付着力を弱めた後に、所定の細胞を光ピンセットによりトラップしてマイクロピペット先端の吸引孔まで移動させて採取することにより、培養器に付着する細胞を破壊することなく効率良く細胞を分離して採取することが記載されている。

特開２００２−１５３２６０号公報特開２０００−２３２８７３号公報

上述のように、従来、光ピンセットを用いて細胞を捕捉し、移動させた研究例はある。ところが、近年注目を集めている胚性幹細胞（ＥＳ（Embryonic stem cell）細胞）を、光ピンセットを用いて実用レベルで操作した例や培養した例はない。ＥＳ細胞のように物理的に傷つきやすい細胞を非接触のまま操作できる光ピンセットは、細胞操作に最適な操作法であるといえるが、ＥＳ細胞を傷つけることなく特定の細胞を選別する手法が確立されていないからである。

つまり、従来、細胞を選別するために、細胞を標識する試薬を加えることが行われているが、ＥＳ細胞にこのような試薬を加えると選別後にＥＳ細胞を利用する範囲が限られてしまうという問題がある。また、特定の薬品がＥＳ細胞に及ぼす影響を調査するために選別する場合であっても、選別のために標識用の他の試薬を加えると、調査結果にこの試薬の影響が及んでしまうという問題がある。

そこで、本発明においては、細胞の選別のために試薬を一切使用することなく、細胞の選別および分取を可能にした細胞選別分取方法および装置を提供することを目的とする。

本発明の細胞選別分取方法は、細胞を非接触で捕捉して移動させることが可能な光ピンセットにより細胞を捕捉すること、光ピンセットにより細胞を捕捉したまま、この捕捉している細胞の形態変化を観察すること、捕捉している細胞の形態変化の程度に応じて、この捕捉している細胞を光ピンセットにより移動し、分取することを含むことを特徴とする。

また、本発明の細胞選別分取装置は、細胞を非接触で捕捉して移動させることが可能な光ピンセットと、この光ピンセットにより細胞を捕捉したまま、この捕捉している細胞の形態変化を観察する観察部とを有し、光ピンセットは、観察部による観察の結果、捕捉している細胞の形態変化の程度に応じて、この捕捉している細胞を移動し、分取するものであることを特徴とする。

本発明者らは、光ピンセットにより捕捉した細胞について鋭意研究を重ねた結果、光ピンセットにより捕捉した細胞が、光ピンセットのレーザ光に反応して形態変化を示す細胞と示さない細胞とが存在し、形態変化を示す細胞は分裂速度が速く、形態変化を示さない細胞は分裂せずに死んでいくことを見出し、本発明をなすに至ったものである。本発明によれば、光ピンセットにより細胞が捕捉されると、この捕捉されている細胞の形態変化が観察され、この観察の結果、捕捉されている細胞の形態変化の程度に応じて、この捕捉されている細胞が光ピンセットにより移動され、分取される。これにより、形態変化を示す細胞のみを分取することが可能となる。

本発明の細胞選別分取装置は、さらに、選別対象の細胞を循環させる循環部と、光ピンセットにより捕捉した細胞を回収する回収部とを有し、光ピンセットは、循環部内を循環する細胞を捕捉するとともに、分取する細胞を循環部内から回収部へ移動させるものであることが望ましい。これにより、選別対象の細胞を循環させた状態で、形態変化を示す細胞のみを分取することが可能となる。

また、回収部は、利用可能な細胞を回収する第１回収部と、利用不可能な細胞を回収する第２回収部とから構成され、光ピンセットは、捕捉している細胞の形態変化の程度に応じて、この捕捉している細胞を前記第１回収部または第２回収部のいずれかへ移動するものであることが望ましい。これにより、光ピンセットにより捕捉した細胞のうち、形態変化を示す細胞を利用可能な細胞として第１回収部により回収し、形態変化を示さない細胞を利用不可能な細胞として第２回収部により回収することが可能となる。

（１）細胞を非接触で捕捉して移動させることが可能な光ピンセットにより細胞を捕捉し、光ピンセットにより細胞を捕捉したまま、この捕捉している細胞の形態変化を観察し、捕捉している細胞の形態変化の程度に応じて、この捕捉している細胞を光ピンセットにより移動し、分取する構成により、細胞の選別のために試薬を一切使用することなく、光ピンセットにより捕捉している細胞の形態変化を示す細胞のみを選別して分取することができるので、実用レベルでの細胞の選別および分取が可能となる。

（２）選別対象の細胞を循環させる循環部と、光ピンセットにより捕捉した細胞を回収する回収部とを有し、光ピンセットが、循環部内を循環する細胞を捕捉するとともに、分取する細胞を循環部内から回収部へ移動させるものであることにより、選別対象の細胞を循環させた状態で、形態変化を示す細胞のみを分取することが可能となり、連続的な細胞の選別および分取が可能となる。

（３）回収部が、利用可能な細胞を回収する第１回収部と、利用不可能な細胞を回収する第２回収部とから構成され、光ピンセットが、捕捉している細胞の形態変化の程度に応じて、この捕捉している細胞を前記第１回収部または第２回収部のいずれかへ移動するものであることにより、利用可能な細胞と利用不可能な細胞とを分別回収することが可能となる。

図１は本発明の実施の形態における細胞選別分取装置の概略構成図、図２は図１の細胞選別分取装置の要部を示す平面図、図３は図２の右側面図である。

図１において、本発明の実施の形態における細胞選別分取装置は、選別対象のＥＳ細胞Ｅ₀を循環させる循環部１０と、循環部１０の途中に設けられ、この循環部１０内を流れるＥＳ細胞Ｅ₀を非接触で捕捉して移動させることが可能な光ピンセット１と、光ピンセット１により捕捉したＥＳ細胞Ｅ₁を観察する観察部２と、光ピンセット１により捕捉したＥＳ細胞Ｅ₁を分離回収する第１回収部２０および第２回収部３０等により構成される。

循環部１０は、選別対象のＥＳ細胞Ｅ₀を緩衝液とともに流す流路１１と、ポンプ１２と、流路１１を通過したＥＳ細胞Ｅ₂を再び流路１１に戻す流路１３等とから構成される。第１回収部２０は、循環部１０に隣接して設けられ、後述するように光ピンセット１により分離された利用可能なＥＳ細胞Ｅ₃を流す流路２１と、流路２１へ緩衝液を送り込むポンプ２２と、流路２１からＥＳ細胞Ｅ₃を回収する回収容器２３等とから構成される。第２回収部３０は、循環部１０に隣接して第１回収部２０とは反対側に設けられ、後述するように光ピンセット１により分離された利用不可能なＥＳ細胞Ｅ₄を流す流路３１と、流路３１へ緩衝液を送り込むポンプ３２と、流路３１からＥＳ細胞Ｅ₄を回収する回収容器３３等とから構成される。

光ピンセット１は、対物レンズ３、ダイクロイックミラー４、レーザ光源５や、光ピンセット制御部６等により構成される。レーザ光源５により発生させたレーザ光は、ダイクロイックミラー４によって対物レンズ３に誘導される。光ピンセット１は、この対物レンズ３によって集束されたレーザ集束光を対象細胞に照射することによって１つの細胞を捕捉するとともに、この捕捉した状態のまま、レーザ集束光を絶対的または相対的に移動することにより細胞を移動するものである。

観察部２は、例えば照明手段２ａ、ミラー２ｂや、カメラ等の撮影手段２ｃ等により構成される。本実施形態においては、照明手段２ａにより照射された光が、対物レンズ３およびダイクロイックミラー４を透過し、ミラー２ｂによって反射されることにより、撮影手段２ｃの受光面に結像する。これにより、観察部２は、光ピンセット１により捕捉しているＥＳ細胞Ｅ₁を撮影し、この撮影した画像に基づいてＥＳ細胞Ｅ₁の形態変化を観察するものである。

光ピンセット制御部６は、観察部２による観察の結果、光ピンセット１により捕捉しているＥＳ細胞Ｅ₁の形態変化の程度、例えばＥＳ細胞Ｅ₁の形態変化の有無に応じて、この捕捉しているＥＳ細胞Ｅ₁を光ピンセット１により捕捉したまま第１回収部２０または第２回収部３０のいずれかへ移動するものである。なお、本実施形態においては、ＥＳ細胞Ｅ₁の形態変化が示された場合には第１回収部２０へ、示されない場合には第２回収部３０へ移動する。

上記構成の細胞選別分取装置によれば、光ピンセット１により循環部１０内を循環するＥＳ細胞Ｅ₀の１つが捕捉されると、この捕捉されているＥＳ細胞Ｅ₁の形態変化が観察部２によって観察され、この観察の結果、捕捉されているＥＳ細胞Ｅ₁の形態変化の程度に応じて、この捕捉されているＥＳ細胞Ｅ₁が光ピンセット１により第１回収部２０または第２回収部３０のいずれかへ移動され、分取される。これにより、形態変化を示すＥＳ細胞Ｅ₃のみを利用可能なものとして回収容器２３に分取することができる。一方、観察の結果、形態変化を示さないＥＳ細胞Ｅ₄は利用不可能なものとして回収容器３３に分取し、廃棄等することができる。

なお、循環部１０内を循環する緩衝液や、第１回収部２０および第２回収部３０へ送り込んでいる緩衝液は、従来の選別のための標識用の試薬とは異なり、単にＥＳ細胞を搬送するために用いているもので、ＥＳ細胞には何ら影響を及ぼさないものである。本実施形態における細胞選別分取装置によれば、ＥＳ細胞の選別のために試薬を一切使用することなく、光ピンセット１により捕捉しているＥＳ細胞の形態変化を示すもののみを選別して分取することができるので、実用レベルでのＥＳ細胞の選別および分取が可能である。

また、本実施形態における細胞選別分取装置では、選別対象のＥＳ細胞Ｅ₀を循環部１０により循環させた状態で、形態変化を示すＥＳ細胞Ｅ₃のみを分取することが可能であるため、連続的なＥＳ細胞の選別および分取が可能である。また、選別対象のＥＳ細胞Ｅ₀を、回収容器２３，３３のいずれかへ移動して分別回収するので、分別後の処理が容易である。

なお、本実施形態においては選別対象としてＥＳ細胞を例に説明したが、他の細胞の分別にも利用することが可能である。また、本実施形態においては、形態変化の有無により捕捉したＥＳ細胞Ｅ₁の利用の可・不可を判断しているが、この判断基準として形態変化の程度を閾値により設定することも可能である。

また、本実施形態においては、循環部１０内を循環するＥＳ細胞Ｅ₀を光ピンセット１により１つずつ捕捉して移動するものとして説明したが、この光ピンセット１を循環部１０内のＥＳ細胞Ｅ₀の流れ方向に複数並べて設ければ、複数のＥＳ細胞Ｅ₀を一度に処理することが可能となる。

光ピンセット１により捕捉したＥＳ細胞のうち、形態変化を示すものと示さないものとでどのように異なるかについて検証した。まず凍結状態から解凍したＥＳ細胞の懸濁液の中に形態変化の大きい細胞がどの程度存在するかを調べた。細胞懸濁液を長期培養装置に入れ、１つずつ光ピンセットで捕捉してそれぞれ１分間観察した。１分以内に形態変化を示すものを形態変化大、変化を示さないものを形態変化小と定義し、無作為に細胞を４０個サンプリングし、細胞懸濁液中に形態変化を示す細胞が存在する割合を調べた。次に、懸濁液中の細胞を数日間、通常の培養条件下で培養して細胞の増加数を調べた。細胞が１×１０⁵個／ｍＬになるように懸濁液の濃度を調節して、培養皿３つに３ｍＬずつ播種した。そのまま温度３７℃、５％ＣＯ₂雰囲気下のインキュベータ内で培養した。培地交換は１日に１回行った。培養した細胞を１日後および３日後に回収し、血球計算板を用いて細胞数を数えた。以上の操作を十数回行い、各培養皿における、形態変化の大小と細胞増加数との関係を調べた。図４はＥＳ細胞の培養１日後の細胞数を測定した結果を示す図、図５はＥＳ細胞の３日間培養における平均倍加時間を測定した結果を示す図である。

図４に示すように、形態変化の大きいサンプルほど、細胞増加率が高いことが分かった。また、培養前よりも細胞数が減るサンプルがあるのは、１日後に死んでいるからである。図４により、形態変化の大きいＥＳ細胞は分裂するが、形態変化をしないＥＳ細胞は１日後にはほとんど死んでいることが分かった。すなわち、形態変化の有無により、ＥＳ細胞の今後の寿命を判別することができることが検証できた。

また、図５に示すように、形態変化の大きいサンプルほど倍加時間が短いことが確認できた。倍加時間とは、細胞分裂してから次の細胞分裂までの時間であり、倍加時間が短いほど、ＥＳ細胞が活発に動いていることになる。なお、実際には倍加時間自体はどのＥＳ細胞でも同じであり、死ぬ細胞の割合が少ないほど、平均倍加時間が短くなり、真の倍加時間に近づくと考えられる。

本発明の細胞選別分取方法および装置は、細胞を非接触で選別および分取を行い、操作および培養を行える方法および装置として有用である。特に、本発明は、ＥＳ細胞等の物理的に傷つきやすく、かつ、選別のために標識用の試薬等を加えることのできない細胞の選別および分取を行うことが可能な細胞選別分取方法および装置として好適である。

本発明の実施の形態における細胞選別分取装置の概略構成図である。図１の細胞選別分取装置の要部を示す平面図である。図２の右側面図である。ＥＳ細胞の培養１日後の細胞数を測定した結果を示す図である。ＥＳ細胞の３日間培養における平均倍加時間を測定した結果を示す図である。

符号の説明

１光ピンセット
２観察部
２ａ照明手段
２ｂミラー
２ｃ撮影手段
３対物レンズ
４ダイクロイックミラー
５レーザ光源
６光ピンセット制御部
１０循環部
１１，１３流路
１２ポンプ
２０第１回収部
２１流路
２２ポンプ
２３回収容器
３０第２回収部
３１流路
３２ポンプ
３３回収容器

Claims

細胞を非接触で捕捉して移動させることが可能な光ピンセットにより細胞を捕捉すること、
前記光ピンセットにより前記細胞を捕捉したまま、この捕捉している細胞の形態変化を観察すること、
前記捕捉している細胞の形態変化の程度に応じて、この捕捉している細胞を前記光ピンセットにより移動し、分取すること
を含む細胞選別分取方法。
細胞を非接触で捕捉して移動させることが可能な光ピンセットと、
この光ピンセットにより細胞を捕捉したまま、この捕捉している細胞の形態変化を観察する観察部とを有し、
前記光ピンセットは、前記観察部による観察の結果、捕捉している細胞の形態変化の程度に応じて、この捕捉している細胞を移動し、分取するものである
ことを特徴とする細胞選別分取装置。
選別対象の細胞を循環させる循環部と、
前記光ピンセットにより捕捉した細胞を回収する回収部とを有し、
前記光ピンセットは、前記循環部内を循環する細胞を捕捉するとともに、前記分取する細胞を前記循環部内から前記回収部へ移動させるものである
請求項２記載の細胞選別分取装置。
前記回収部は、利用可能な細胞を回収する第１回収部と、利用不可能な細胞を回収する第２回収部とから構成され、
前記光ピンセットは、捕捉している細胞の形態変化の程度に応じて、この捕捉している細胞を前記第１回収部または第２回収部のいずれかへ移動するものである
請求項３記載の細胞選別分取装置。