JP2010539963A - 共培養細胞集団の分離 - Google Patents

Abstract

本発明は、共培養細胞集団を分離する方法及び装置の使用に関する。

Description

本発明は、共培養された細胞集団の分離の方法及び装置の使用に関する。

共培養は、様々な生物学的システム（組織／細胞のタイプ）に可能である。特に、動物及びヒトの胚性幹細胞は、成長因子を与えるフィーダー細胞単分子層上でしばしば初期培養される。

胚性幹細胞研究についての主たる関心は、細胞置換療法を可能にするため、特化細胞への細胞分化に集中している。幹細胞を培養するために、例えばフィーダー細胞が使用される。胚細胞が解離されて単分子層として培養される。異種細胞集団はＸ線照射又はマイトマイシン処理により非活性化され、それゆえ細胞はもはや分裂しない。

しかしながら、フィーダー細胞は、代謝的に依然活性化されている。胚性幹細胞の増殖は、フィーダー細胞によって培地中へ放出される物質に依存する。幹細胞を分化させるために、フィーダー細胞を含む全体の培養は、使用された培養プレートから取り除かれる。浮遊培養では、幹細胞は、いわゆる宙づり液滴にて、最初、胚様体に進化する。これらの胚様体は、幹細胞とフィーダー細胞との混合培養である。

胚様体が特定のメッセンジャーの添加により異なる細胞タイプに分化する、次の分化ステップにおいても、培養物はフィーダー細胞によりコンタミしている。しかしながら、幹細胞は初期の分化段階で分裂するので、フィーダー細胞は非活性化し、幹細胞とフィーダー細胞との定量比は変化する。フィーダー細胞との共培養のケースでは、このように幹細胞は純粋状態では存在せず、フィーダー細胞との混合状態にて存在する。フィーダー細胞のコンタミは、分化細胞集団の程度が低い範囲においても確証される。幹細胞と一緒にフィーダー細胞が個々の臓器に移植されるため、このことは、再生細胞置換治療にとってとりわけ問題であることを意味する。移植された臓器での異種フィーダー細胞集団の効果は記述しない。

ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５９９５１

しかしながら、フィーダー細胞が分化した幹細胞の機能を調節すること、及び、移植後数週間後であっても、移植されたフィーダー細胞は依然として個々の組織において確認されることは、実験によって立証される。この理由のため、初期段階において幹細胞とフィーダー細胞との完全な分離は必須のものとされる。このように、本発明の目的は、共培養細胞集団の分離である。

この課題は、請求項１記載の発明の特徴を有する、少なくとも二つの共培養細胞集団を分離する装置を使用すること、及び、請求項５記載の発明の特徴を有する、少なくとも二つの共培養細胞集団を分離する方法を使用すること、により解決される。従属項に係る発明は、各々、方法又は使用における適切又は有利な具体例及び特徴を含む。

幹細胞及びフィーダー細胞（フィーダー細胞により培養された幹細胞）の光学顕微鏡イメージである。 コロニーの幹細胞の連続呼吸（顕微鏡分析）である。 コロニーの幹細胞の連続呼吸（顕微鏡分析）である。 コロニーの幹細胞の連続呼吸（顕微鏡分析）である。 コロニーの幹細胞の連続呼吸（顕微鏡分析）である。 コロニーの幹細胞の連続呼吸（顕微鏡分析）である。 フィーダー細胞において発現されたネオマイシン遺伝子の発現分析（ＲＴ−ＰＣＲ）である。 分化ポテンシャルの検証（標準プロトコルに従って分化されたフィーダーフリー幹細胞と幹細胞との比較）である。 典型的実施形態におけるＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５９９５１に従った装置である。

本発明に係る、少なくとも二つの共培養細胞集団の分離のために使用される装置は、イメージングユニット（２）と前記細胞培養（８）中での細胞の位置検知のためのイメージ評価ユニット（３）との組み合わせからなり、少なくとも二つの共培養細胞集団を含む細胞培養（８）の顕微鏡スキャンを行う顕微鏡ユニット（１）と、細胞の検知された位置を保存する制御保存ユニット（４）と、少なくとも二つの共培養細胞集団の分離のため、細胞が検知された位置にて細胞を取り除く除去手段（１０ａ）を有する採取モジュール（５）と、を有する。

本発明によって使用される装置は、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５９９５１に詳細に記載されている。ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５９９５１に開示されている全ての技術的特徴は、本発明の教示に含まれる。

様々な共培養細胞集団の分離の範囲内において、細胞集団の種々の組み合わせが可能である。特に、フィーダー細胞と幹細胞集団とを含む、少なくとも二つの共培養細胞集団が分離される。呼吸条件が培養条件に適用されるため、この方法は、他の共培養細胞集団の分離にも適用されることが可能である。更に実施形態は、内皮細胞集団と平滑筋細胞集団との分離のみならず、内皮細胞と肝細胞集団の分離の使用にも関する。

フィーダー細胞と幹細胞との再生可能で完全な分離が達成されること、及び、幹細胞の多分化能がいかなるものであれ幹細胞精製方法はいかなる影響も有しないことが実証される。

本発明に係る少なくとも二つの共培養細胞集団の分離方法は、材料及び／又は物理パラメータに基づいて第１の細胞集団の細胞を選択する第１検出ステップの実行工程と、位置データの記録、及び、選択された細胞の記録された位置データについての位置データベースへの保存工程と、を有する。そして、この方法は下記の工程を特徴とする。即ち、前記第１の細胞集団の細胞の少なくとも一つの更なるパラメータを検出する少なくとも一つの第２検出ステップの実行工程と、前記第１検出ステップ及び第２検出ステップのデータからの比較データの生成、及び、前記位置データに対する前記比較データの割り当て工程と、前記比較データに基づく細胞の選択工程と、前記位置データベースから採取ユニットへの比較データとリンクする位置データの伝達工程と、を有することを特徴とする。

この方法は、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５９９５１に記載されている方法に対応する。ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５９９５１に記載されている方法の全ての特徴は、本発明の教示に含まれる。

好ましい実施形態として、少なくとも二つの共培養細胞集団の分離方法は、分離される少なくとも二つの共培養細胞集団が、フィーダー細胞と幹細胞集団を含むことを特徴とする。内皮細胞集団と平滑筋細胞集団との分離のみならず内皮細胞と肝細胞集団との分離の方法を使用することが同様に好ましい。

幹細胞の培養のため、フィーダー細胞が例えば１３．５日齢マウス胚から得られる。臓器及び頭が胚から取り除かれる。残りの胚細胞が分離されて単分子層として培養される。異なる細胞集団がＸ線照射又はマイトマイシン処理により非活性化され、それゆえ細胞はもはや分裂しないが、しかしながらフィーダー細胞は代謝的に活性のままである。少なくとも二つの共培養細胞集団を分離する本発明に係る方法は、材料及び／又は物理パラメータに基づいて第１の細胞集団の細胞の選択を含む。光学顕微鏡を使用することにより、例えば、フィーダー細胞と幹細胞とは異なる構造又は形状を各々有していることが検知される（図１）。光学顕微鏡により、細長いフィーダー細胞の単分子層上のほぼ円形のコロニーとして幹細胞の成長が明確に検知される。以下に、ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５９９５１による装置のみならず方法の使用が、実施例に基づいてより詳細に記載される。

（実施例１）
幹細胞とフィーダー細胞との分離
幹細胞（Ｄ３）をネオマイシン耐性フィーダー細胞上で５〜８日間培養した。個々のコロニーの幹細胞は、標準条件下（吸気圧力、液体量）で、非浮遊細胞ツール（ガラスキャピラリー）にて吸引された。ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５９９５１による装置を使用することにより、シャーレー内の様々なコロニーから採取された幹細胞を特定のウェルに個々に移動させることができ、それゆえ個々のクローンが調査できた。

フィーダー細胞単分子層が、ネオマイシン耐性遺伝子導入された。この遺伝子は幹細胞ラインＤ３にて発現しなかった。細胞集団の分離が成功した後、吸引された幹細胞クローン中のネオマイシン耐性遺伝子の各々の確証はできなかった。幹細胞とフィーダー細胞との分離は図２Ａから図２Ｅに示される。これらの図は、あるコロニーの幹細胞の繰り返し呼吸を示す（顕微鏡分析）。フィーダー細胞中に発現したネオマイシン遺伝子の発現分析（ＲＴ−ＰＣＲ）が図３に示される。顕微鏡分析及びそれに続く発現解析により、単分子層のフィーダー細胞が共呼吸する前に、幹細胞の呼吸が数回繰り返されることが明確になった。５回目の繰り返しの後に、フィーダー細胞は同様に呼吸した。この確証は、電気泳動により分離されたアガロースゲルのトラックＥにおけるネオマイシン遺伝子の発現に基づいてなされた。

（実施例２）
以下の精製による幹細胞の機能的統合性の検査（フィーダー細胞からの分離）
胚性幹細胞は多能性である。即ち、インビトロにて胚性幹細胞は異なる細胞タイプに分化しうる。フィーダー細胞からの胚性幹細胞の早期分離は、特定の細胞タイプへ分化する幹細胞の能力を弱めることを検査するため、フィーダーフリー幹細胞と標準方法に従って培養された幹細胞、即ちフィーダー細胞を有する幹細胞との分化能を神経分化に基づいて比較した。

神経分化が、形態学的基準に基づいて分析され、更に神経分化の様々な状態にて発現するマーカーに基づいても分析された。フィーダーフリー幹細胞と標準プロトコルに従って分化された幹細胞との分化能において、重要な差異は発見されなかった（図３）。フィーダー細胞と幹細胞との再現可能かつ完全な分離が実行されたこと、及び、幹細胞の多能性がいかなるものであっても、幹細胞精製に係る本方法はいかなる影響も有しないことが実証された（図４）。

１ ：顕微鏡ユニット
１ａ：偏向プリズム
１ｂ：レンズシステム
２ ：イメージングユニット
３ ：ＰＣ
３ａ：イメージ評価ユニット
４ ：制御保存ユニット
４ａ：モニター，ディスプレイ
５ ：採取モジュール
５ａ：上昇コラム
５ｂ：トラバースドライブ
６ ：光源
７ ：光源フィルター
８ ：細胞培養
９ ：ｘｙテーブル
１０：ツールヘッド
１０ａ：除去ツール
１１：分離電池

Claims (8)

1. イメージングユニット（２）と細胞培養（８）中での細胞の位置検知のためのイメージ評価ユニット（３）との組み合わせからなり、少なくとも二つの共培養細胞集団を含む細胞培養（８）の顕微鏡スキャンを行う顕微鏡ユニット（１）と、細胞の検知された位置を保存する制御保存ユニット（４）と、少なくとも二つの共培養細胞集団の分離のため、細胞が検知された位置にて細胞を取り除く除去手段（１０ａ）を有する採取モジュール（５）と、を有する装置の使用。
2. 分離される前記少なくとも二つの共培養細胞集団は、フィーダー細胞及び幹細胞集団を含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。
3. 分離される前記少なくとも二つの共培養細胞集団は、内皮細胞集団及び平滑筋細胞集団を含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。
4. 分離される前記少なくとも二つの共培養細胞集団は、内皮細胞及び肝細胞集団を含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。
5. 材料及び／又は物理パラメータに基づいて第１の細胞集団の細胞を選択する第１検出ステップの実行工程と、
   位置データの記録、及び、選択された細胞の記録された位置データについての位置データベースへの保存工程と、を有する、少なくとも二つの共培養細胞集団の分離方法であって、
   前記第１の細胞集団の細胞の少なくとも一つの更なるパラメータを検出する少なくとも一つの第２検出ステップの実行工程と、
   前記第１検出ステップ及び第２検出ステップのデータからの比較データの生成、及び、前記位置データに対する前記比較データの割り当て工程と、
   前記比較データに基づく細胞の選択工程と、
   前記位置データベースから採取ユニットへの比較データとリンクする位置データの伝達工程と、を有することを特徴とする少なくとも二つの共培養細胞集団の分離方法。
6. 分離される前記少なくとも二つの共培養細胞集団は、フィーダー細胞及び幹細胞集団を含むことを特徴とする請求項５に記載の少なくとも二つの共培養細胞集団の分離方法。
7. 分離される前記少なくとも二つの共培養細胞集団は、内皮細胞集団及び平滑筋細胞集団を含むことを特徴とする請求項５に記載の少なくとも二つの共培養細胞集団の分離方法。
8. 分離される前記少なくとも二つの共培養細胞集団は、内皮細胞及び肝細胞集団を含むことを特徴とする請求項５に記載の少なくとも二つの共培養細胞集団の分離方法。