EP2198002A1 - Trennung co-kultivierter zellpopulationen - Google Patents

Trennung co-kultivierter zellpopulationen

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Publication number
EP2198002A1
EP2198002A1 EP08804915A EP08804915A EP2198002A1 EP 2198002 A1 EP2198002 A1 EP 2198002A1 EP 08804915 A EP08804915 A EP 08804915A EP 08804915 A EP08804915 A EP 08804915A EP 2198002 A1 EP2198002 A1 EP 2198002A1
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EP
European Patent Office
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cell populations
cells
populations
cultured
cultured cell
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08804915A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ute SCHÄFER
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AVISO MECHATRONIC SYSTEMS GmbH
Original Assignee
AVISO MECHATRONIC SYSTEMS GmbH
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Filing date
Publication date
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Publication of EP2198002A1 publication Critical patent/EP2198002A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting

Definitions

  • the invention relates to the use of a device and a method for separating co-cultivated cell populations.
  • Co-cultivation is possible for various biological systems (tissue / cell types).
  • animal and human embryonic stem cells are often cultured primarily on a feeder cell monolayer, the feeder cells providing growth factors.
  • Feeder cells are used, for example, for breeding stem cells.
  • Cells of an embryo are dissociated and cultured as monolayers.
  • the heterogeneous cell population can be inactivated by irradiation or mitomycin treatment, so that the cells can no longer divide.
  • the feeder cells are still metabolically active. Proliferation of embryonic stem cells is dependent on substances released into the medium by feeder cells. To differentiate stem cells, the total culture, including the feeder cells, is removed from the culturing plate used.
  • the stem cells can first develop into so-called hanging drops to form "embryoid bodies.” These "embryoid bodies” are a mixed culture of stem cells and feeder cells. Even in the next differentiation steps, in which the embryoid bodies differ in different cell types by the addition of specific messenger substances. The cultures are contaminated by feeder cells. Since the stem cells divide in the early differentiation phases, but the spring cells were inactivated, the quantitative ratio of the stem cell and feeder cell content changes. In the case of co-cultivation with feeder cells, the stem cells are therefore not pure, but in mixture with feeder cells. Feeder cell contamination can also be demonstrated to a minor extent in differentiated cell populations.
  • the object of the invention is thus to separate co-cultured cell populations.
  • the object is achieved by the use of a device for separating at least two co-cultured cell populations with the features of claim 1 and with a method for separating at least two co-cultured cell populations with the features of claim 5.
  • the subclaims contain expedient or advantageous embodiments and features of the method or the use.
  • a device for the separation of at least two cultured cell populations, which comprises a microscope unit (1) for the microscopic scanning of the cell culture (8), which co-cultured at least two Cell populations, in combination with an image capture unit (2) and an image evaluation unit (3) for detecting the position of cells in the cell culture (8), a control and storage unit (4) for storing the detected position of the cells and a harvesting module (5 ) with a removal tool (10a) for withdrawing the cells at the detected position of the cell.
  • co-cultured cell populations As part of the separation of different co-cultured cell populations, various combinations of cell populations are possible. In particular, at least two co-cultured cell populations may be separated comprising feeder cell and stem cell populations. Since the aspiration conditions can be adapted to the culture conditions, the methodology can also be applied to the separation of other co-cultured cell populations. Other embodiments relate to the use of separating endothelial cell populations and smooth muscle cell populations, as well as separating endothelial cell and liver cell populations.
  • the method according to the invention for separating at least two co-cultured cell populations comprises carrying out a first detection step for selecting cells of a first cell population based on physical and / or physical See parameters and capture position data and store the captured position data of the selected cells in a position database.
  • the method is characterized by the following method steps:
  • Position data from the position database to a harvesting unit is
  • the method corresponds to the method described in international application PCT / EP2007 / 059951. All process specificities disclosed in PCT / EP2007 / 059951 are part of the teaching of the present invention.
  • the method of separating at least two co-cultured cell populations is characterized in that the at least two co-cultured cell populations to be separated comprise feeder cell and stem cell populations. It is also preferred to use the method for the separation of endothelial cell populations and populations of smooth muscle cells and for the separation of endothelial cell and liver cell populations.
  • feeder cells from 13.5-day-old mouse embryos are obtained for the cultivation of stem cells.
  • the embryos are removed organs and the head.
  • the cells of the residual embryo are dissociated and cultured as monolayers.
  • the heterogeneous cell population is treated by irradiation or mitomycin treatment. inactivated so that the cells can no longer divide, but the feeder cells remain metabolically active.
  • the method according to the invention for separating at least two co-cultured cell populations comprises the selection of cells of a first cell population on the basis of physical and / or physical parameters. As can be seen, for example, by light microscopy, feeder cells and stem cells have different structures or shapes (see Figure 1).
  • stem cells grow as almost round colonies on the monolayer of the elongated feeder cells. Accordingly, when using the device of PCT / EP2007 / 059951, surprisingly, the separation of the different cell populations is possible.
  • Stem cells were cultured on neomycin resistant spring cells for 5-8 days. Stem cells of individual colonies were aspirated with the "tool for non-floating cells" under standardized conditions (suction pressure, amount of liquid) .
  • the PCT / EP2007 / 059951 device allowed stem cells to be picked from different colonies within a petri dish
  • the transporter of the feeder cell monolayer with the neomycin resistance gene, this gene is not expressed in the stem cell line D3
  • the separation of stem and feeder cells is shown in Figures 2A to 2E These images show the repeated aspiration of stem cells from a colony (microscopic analysis) Expression analysis (RT-PCR) of the in feeder cells expressed neomycin gene is i Figure 3 can be seen.
  • the microscopic analysis and the subsequent expression analysis illustrate that the aspiration of the stem cells could be repeated several times before the spring cells of the monolayer were aspirated with. Feeder cells were aspirated only after the fifth repetition. Detection was carried out by expression of the neomycin gene in lane E of the electrophoretically separated agarose gel. I 2
  • Embryonic stem cells are pluripotent, ie they can be differentiated into different cell types in vitro.
  • the differentiation potential of feeder-free stem cells and stem cells which were cultivated with feeder cells according to the standard method, based on the neural Differentiation compared.
  • Neuronal differentiation was analyzed by morphological criteria as well as the expression of markers expressed in different phases of neuronal differentiation. At no time were significant differences found in the differentiation potential of feeder-free and stem-cell differentiated stem cells (see Figure 3). It could be shown that a reproducible and complete separation of feeder and stem cells can be achieved and that this method of stem cell purification in no way influences the pluripotency of stem cells (see Figure 4).
  • Fig. 1 Light microscope image of parent
  • Feeder cells stem cells cultured on feeder cells
  • Fig. 2A to 2E repeated aspiration of stem cells of a colony (microscopic analysis)
  • Fig. 3 Expression analysis (RT-PCR) of the in
  • Fig. 4 Detection of the differentiation potential (comparison of feeder-free and according to standard protocol differentiated stem cells)
  • Fig. 5 Apparatus according to PCT / EP2007 / 059951 in an exemplary embodiment

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und die Verwendung einer Vorrichtung zur Trennung co-kultivierter Zellpopulationen.

Description

Trennung co-kultivierter Zellpopulationen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Vorrichtung sowie ein Verfahren zur Trennung co-kultivierter Zellpopulationen.
Co-Kultivierung ist für verschiedene biologische Systeme (Ge- webe-/Zellarten) möglich. Insbesondere werden oft tierische und humane embryonale Stammzellen primär auf einem Feederzel- len-Monolayer kultiviert, wobei die Feederzellen Wachstumsfaktoren liefern.
Das Hauptinteresse der Forschung an embryonalen Stammzellen gilt der Differenzierung in spezialisierte Zellen, um diese für mögliche Zellersatztherapien verfügbar zu machen. Zur Züchtung von Stammzellen werden beispielsweise Feederzellen eingesetzt. Zellen eines Embryos werden dissoziiert und als Monolayer kultiviert. Die heterogene Zellpopulation kann durch Bestrahlung oder Mitomycinbehandlung inaktiviert werden, so- dass die Zellen sich nicht mehr teilen können. Die Feederzellen sind jedoch metabolisch noch aktiv. Die Proliferation embryonaler Stammzellen ist von Substanzen abhängig, die von Feederzellen in das Medium abgegeben werden. Um Stammzellen zu differenzieren, wird die Gesamtkultur, inklusive der Feederzellen, von der verwendeten Kultivierungsplatte entfernt. In Suspensionskulturen können sich die Stammzellen zunächst in den so genannten hängenden Tropfen zu „Embryoid Bodies" entwickeln. Diese „Embryoid Bodies" sind eine Mischkultur aus Stammzellen und Feederzellen. Auch in den nächsten Differenzierungsschritten, in denen die Embryoid Bodies durch Zusatz spezifischer Botenstoffe in unterschiedliche Zelltypen diffe- renziert werden, sind die Kulturen durch Feederzellen kontaminiert. Da sich die Stammzellen in den frühen Differenzierungsphasen teilen, die Federzellen aber inaktiviert wurden, verändert sich das quantitative Verhältnis des Stammzellen- und Feederzellenanteils. Im Falle der Co-Kultivierung mit Feederzellen liegen die Stammzellen also nicht rein, sondern in Mischung mit Feederzellen vor. Die Feederzellenkontamination ist auch in geringem Ausmaß in differenzierten Zellpopulationen nachzuweisen . Dies ist vor allem für regenerative Zellersatztherapien problematisch, da die Feederzellen zusammen mit den Stammzellen in entsprechende Organe transplantiert werden. Die Wirkung der heterogenen Feederzellenpopulation im transplan- tierten Organ ist nicht beschrieben. Es konnte allerdings in Untersuchungen gezeigt werden, dass die Feederzellen die Funktion differenzierter Stammzellen modulieren und dass trans- plantierte Feederzellen, auch einige Wochen nach Transplantation im entsprechenden Organ nachzuweisen waren. Aus diesem Grund ist eine vollständige Trennung von Stammzellen und Feederzellen zu einem frühen Zeitpunkt unabdingbar.
Aufgabe der Erfindung ist es somit, co-kultivierte Zellpopulationen zu trennen.
Die Aufgabe wird durch die Verwendung einer Vorrichtung zur Trennung mindestens zweier co-kultivierter Zellpopulationen mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und mit einem Verfahren zur Trennung mindestens zweier co-kultivierter Zellpopulationen mit den Merkmalen des Anspruchs 5 gelöst. Die Unteransprüche enthalten zweckmäßige bzw. vorteilhafte Ausführungsformen und Merkmale des Verfahrens bzw. der Verwendung.
Erfindungsgemäß wird zur Trennung mindestens zweier co- kultivierter Zellpopulationen eine Vorrichtung verwendet, welche eine Mikroskopeinheit (1) zur mikroskopischen Abtastung der Zellkultur (8), welche mindestens zwei co-kultivierte Zellpopulationen aufweist, in Kombination mit einer Bilderfassungseinheit (2) und einer Bildauswerteeinheit (3) zur Positi- onsdetektierung der Zellen in der Zellkultur (8), eine Steuer- und Speichereinheit (4) zum Speichern der detektierten Position der Zellen und ein Erntemodul (5) mit einem Entnahmewerkzeug (10a) zur Entnahme der Zellen an der detektierten Position der Zelle, umfasst.
Die Vorrichtung, welche erfindungsgemäß zum Einsatz kommt, ist detailliert in der internationalen Anmeldung PCT/EP2007/059951 beschrieben. Alle in der PCT/EP2007/059951 offenbarten technischen Merkmale gehören zur Lehre der vorliegenden Erfindung.
Im Rahmen der Trennung verschiedener co-kultivierter Zellpopulationen sind diverse Kombinationen von Zellpopulationen möglich. Insbesondere können mindestens zwei co-kultivierte Zellpopulationen getrennt werden, welche Feederzellen- und Stammzellenpopulationen umfassen. Da die Aspirationsbedingungen den Kultivierungsbedingungen angepasst werden können, kann die Methodik auch auf die Trennung anderer co-kultivierter Zellpopulationen angewendet werden. Weitere Ausführungsformen betreffen die Verwendung zur Trennung von Endothelzellenpopulationen und Populationen von Zellen der glatten Muskulatur sowie zur Trennung von Endothelzellen- und Leberzellenpopulationen.
Es konnte gezeigt werden, dass eine reproduzierbare und vollständige Trennung von Feeder- und Stammzellen erreicht werden kann und dass diese Methode der Stammzellenaufreinigung die Pluripotenz der Stammzellen in keiner Weise beeinflusst.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Trennung mindestens zweier co-kultivierter Zellpopulationen umfasst das Ausführen eines ersten Detektionsschritts zum Auswählen von Zellen einer ersten Zellpopulation anhand von physischen und/oder physikali- sehen Parametern und das Erfassen von Positionsdaten und Speichern der erfassten Positionsdaten der ausgewählten Zellen in einer Positionsdatenbank. Das Verfahren ist gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:
- Ausführung mindestens eines zweiten Detektions- schritts zur Erkennung mindestens eines weiteren Parameters der Zellen der ersten Zellpopulation,
- Erstellen von Vergleichsdaten aus den Daten des ersten und zweiten Detektionsschritts und Zuordnen der Vergleichsdaten zu den Positionsdaten,
- Auswählen von Zellen anhand der Vergleichsdaten und - Übergeben der mit den Vergleichsdaten verknüpften
Positionsdaten aus der Positionsdatenbank an eine Ernteeinheit .
Das Verfahren entspricht dem Verfahren, welches in der internationalen Anmeldung PCT/EP2007/059951 beschrieben wurde. Alle in der PCT/EP2007/059951 offenbarten Verfahrensbesonderheiten gehören zur Lehre der vorliegenden Erfindung.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren zur Trennung mindestens zweier co-kultivierter Zellpopulationen dadurch gekennzeichnet, dass die zu trennenden mindestens zwei co-kultivierten Zellpopulationen Feederzellen- und Stammzellenpopulationen umfassen. Ebenso ist es bevorzugt, das Verfahren zur Trennung von Endothelzellenpopulationen und Populationen von Zellen der glatten Muskulatur sowie zur Trennung von Endothelzellen- und Leberzellenpopulationen einzusetzen.
Zur Züchtung von Stammzellen werden beispielsweise Feederzellen aus 13,5 Tage alten Mausembryonen gewonnen. Den Embryonen werden Organe und Kopf entfernt. Die Zellen des Restembryos werden dissoziiert und als Monolayer kultiviert. Die heterogene Zellpopulation wird durch Bestrahlung oder Mitomycinbehand- lung inaktiviert, sodass die Zellen sich nicht mehr teilen können, wobei die Feederzellen aber metabolisch aktiv bleiben. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Trennung mindestens zweier co-kultivierter Zellpopulationen umfasst die Auswahl von Zellen einer ersten Zellpopulation anhand von physischen und/oder physikalischen Parametern. Wie beispielsweise mittels Lichtmikroskopie erkennbar ist, weisen Feederzellen und Stammzellen unterschiedliche Strukturen bzw. Formen auf (vgl. Abbildung 1) . In der Lichtmikroskopie ist deutlich zu erkennen, dass Stammzellen als fast runde Kolonien auf dem Monolayer der lang gestreckten Feederzellen wachsen. Entsprechend ist bei Verwendung der Vorrichtung aus PCT/EP2007/059951 überraschenderweise die Trennung der verschiedenen Zellpopulationen möglich.
Das Verwendung der Vorrichtung nach PCT/EP2007/059951 sowie das Verfahren sollen nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
Beispiele
Beispiel 1
Trennung von Stamm- und Feederzellen
Stammzellen (D3) wurden für 5-8 Tage auf Neomycin resistenten Federzellen kultiviert. Stammzellen einzelner Kolonien wurden mit dem „Tool for non-floating cells" (Glaskapillare) unter standardisierten Bedingungen (Saugdruck, Flüssigkeitsmenge) aspiriert. Mit der Vorrichtung nach PCT/EP2007/059951 war es möglich, Stammzellen, die von verschiedenen Kolonien innerhalb einer Petrischale gepickt wurden, individuell in spezifischen Wells zu transportieren, so dass einzelne Klone untersucht werden konnten. Der Feederzellenmonolayer wurde mit dem Neomy- cin-Resistenzgen transfiziert . Dieses Gen wird nicht in der Stammzelllinie D3 exprimiert. Nach der erfolgreichen Trennung der Zellpopulationen sollte das Neomycin-Resitenzgen entsprechend nicht in den aspirierten Stammzellklonen nachzuweisen sein. Die Trennung von Stamm- und Feederzellen ist in den Abbildungen 2A bis 2E dargestellt. Diese Abbildungen zeigen die wiederholte Aspiration von Stammzellen einer Kolonie (mikroskopische Analyse) . Eine Expressionsanalyse (RT-PCR) des in Feederzellen exprimierten Neomycin-Gens ist in Abbildung 3 zu sehen. Die mikroskopische Analyse und die daran anschließende Expressionsanalyse verdeutlichen, dass die Aspiration der Stammzellen mehrmals wiederholt werden konnte, bevor die Federzellen des Monolayers mit aspiriert wurden. Erst nach der fünften Wiederholung wurden auch Feederzellen aspiriert. Der Nachweis erfolgte anhand der Expression des Neomycin-Gens in Spur E des elektrophoretisch aufgetrennten Agarosegels. Be i spie l 2
Nachweis der funktionellen Integrität der Stammzellen nach Aufreinigung (Trennung von Feederzellen)
Embryonale Stammzellen sind pluripotent, d.h. sie können in vitro in unterschiedliche Zelltypen differenziert werden. Um nachzuweisen, dass die frühe Trennung der embryonalen Stammzellen von den Feederzellen die Fähigkeit der Stammzellen zur Differenzierung in spezifische Zelltypen nicht attenuiert, wurden das Differenzierungspotential von Feeder-freien Stammzellen und Stammzellen, die nach dem Standardverfahren, also mit Feederzellen kultiviert wurden, anhand der neuronalen Differenzierung verglichen. Die neuronale Differenzierung wurde anhand morphologischer Kriterien, aber auch anhand der Expression von Markern, die in den verschiedenen Phasen der neuronalen Differenzierung exprimiert werden, analysiert. Es konnten zu keinem Zeitpunkt signifikante Unterschiede im Differenzierungspotential der Feeder-freien und der nach Standard- Protokoll differenzierten Stammzellen gefunden werden (vgl. Abbildung 3) . Es konnte gezeigt werden, dass eine reproduzierbare und vollständige Trennung von Feeder- und Stammzellen erreicht werden kann und dass diese Methode der Stammzellenauf- reinigung die Pluripotenz der Stammzellen in keiner Weise be- einflusst (vgl. Abbildung 4) .
Beschreibung der Abbildungen/Figuren
Abb. 1: Lichtmikroskop-Aufnahme von Stamm- und
Feederzellen (Stammzellen, die auf Feederzellen kultiviert wurden)
Abb. 2A bis 2E: wiederholte Aspiration von Stammzellen einer Kolonie (mikroskopische Analyse)
Abb. 3: Expressionsanalyse (RT-PCR) des in
Feederzellen exprimierten Neomycin- Gens
Abb. 4: Nachweis des Differenzierungspotentials (Vergleich Feeder-freier und nach Standard-Protokoll differenzierter Stammzellen)
Abb. 5: Vorrichtung nach PCT/EP2007/059951 in einer beispielhaften Ausführungsform
Bezugszeichenliste
1 Mikroskopeinheit
Ia Umlenkprisma
Ib Linsensystem
2 Bildaufnahmeeinheit
3 PC
3a Bildauswerteeinheit
4 Steuer- und Speichereinheit
4a Monitor, Display
5 Erntemodul
5a Hubsäule
5b Verfahrantrieb
6 Beleuchtung
7 Beleuchtungsfilter
8 Zellkultur
9 xy-Tisch
10 Werkzeugkopf
10a Entnahmewerkzeug
11 Vereinzelungsbatterie

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer Vorrichtung, umfassend eine Mikroskopeinheit (1) zur mikroskopischen Abtastung der Zellkultur (8), welche mindestens zwei co-kultivierte Zellpopulationen aufweist, in Kombination mit einer Bilderfassungseinheit (2) und einer
Bildauswerteeinheit (3) zur Positionsdetektierung der Zellen in der Zellkultur (8), eine Steuer- und Speichereinheit (4) zum Speichern der detektierten Position der Zellen und ein Erntemodul (5) mit einem Entnahmewerkzeug (10a) zur Entnahme der Zellen an der detektierten Position der Zelle, zur Trennung mindestens zweier co-kultivierter Zellpopulationen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zu trennenden mindestens zwei co-kultivierten Zellpopulationen Feederzellen- und Stammzellenpopulationen umfassen .
3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zu trennenden mindestens zwei co-kultivierten Zellpopulationen Endothelzellenpopulationen und Populationen von Zellen der glatten Muskulatur umfassen .
4. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zu trennenden mindestens zwei co-kultivierten Zellpopulationen Endothelzellen- und
Leberzellenpopulationen umfassen .
5. Verfahren zur Trennung mindestens zweier co- kultivierter Zellpopulationen unter - Ausführen eines ersten Detektionsschritts zum Auswählen von Zellen einer ersten Zellpopulation anhand von physischen und/oder physikalischen Parametern und
- Erfassen von Positionsdaten und Speichern der erfassten Positionsdaten der ausgewählten Zellen in einer Positionsdatenbank,
gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:
Ausführung mindestens eines zweiten Detektionsschritts zur Erkennung mindestens eines weiteren Parameters der Zellen der ersten Zellpopulation, Erstellen von Vergleichsdaten aus den Daten des ersten und zweiten Detektionsschritts und Zuordnen der Vergleichsdaten zu den Positionsdaten, Auswählen von Zellen anhand der Vergleichsdaten und
- Übergeben der mit den Vergleichsdaten verknüpften Positionsdaten aus der Positionsdatenbank an eine Ernteeinheit .
6. Verfahren zur Trennung mindestens zweier co-kultivier- ter Zellpopulationen nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zu trennenden mindestens zwei co-kultivierten Zellpopulationen Feederzellen- und Stammzellenpopulationen umfassen .
7. Verfahren zur Trennung mindestens zweier co-kultivier- ter Zellpopulationen nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zu trennenden mindestens zwei co-kultivierten Zellpopulationen
Endothelzellenpopulationen und Populationen von Zellen der glatten Muskulatur umfassen.
8. Verfahren zur Trennung mindestens zweier co-kultivier- ter Zellpopulationen nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zu trennenden mindestens zwei co-kultivierten Zellpopulationen Endothelzellen- und Leberzellenpopulationen umfassen .
EP08804915A 2007-10-02 2008-09-30 Trennung co-kultivierter zellpopulationen Withdrawn EP2198002A1 (de)

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