KR20100128274A - 공동배양된 세포 군들의 분리 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 공동 배양된 세포 군들을 분리시키기 위한 방법 및 장치의 사용에 관한 것이다.

Description

공동배양된 세포 군들의 분리{SEPARATION OF CO-CULTIVATED CELL POPULATIONS}
본 발명은 공동배양된 세포 군들(co-cultivated cell populations)을 분리하기 위한 방법 및 장치의 사용에 관한 것이다.
공동배양(co-cultivation)은 여러 생물학적 시스템들(조직 형태/세포 형태)에 대하여 가능하다. 특히, 동물 및 인간의 배아 줄기 세포들은 주로 피더 셀 모노레이어(feeder cell monolayer) 상에서 배양되는데, 여기서 피더 셀들(feeder cells)은 성장 인자를 제공한다.
배아 줄기 세포 연구는 세포 교체 치료법에 전문화된 세포(specialized cells)들이 유용하게 사용될 수 있도록 전문화된 세포들로의 차별화(differentiation)를 주요 관심사로 하고 있다. 줄기 세포들의 배양을 위해서는, 예컨대 피더 셀들(feeder cells)이 사용된다. 배아의 세포들은 분리되어 모노레이어(monolayer)로 배양된다. 상기 이종 세포 군(heterogeneous cell population)는 방사선(irradiaion) 처리 또는 미토마이신(mitomycin) 처리에 의해 비활성화되므로 세포들은 더 이상 분할될 수 없다. 그러나, 피더 셀들은 여전히 신진대사에 있어서 활동적이다. 배아 줄기 세포의 증식은 피더 셀들에 의해 매개체(medium)로 방출되는 물질에 의존한다. 줄기 세포들을 차별화시키기 위해 피더 셀들을 포함하는 전체 배양 조직(culture)은 사용된 배양판으로부터 분리된다. 부유배양(suspension culture)에 있어서, 줄기 세포들은 우선 소위 행잉 드롭스(hanging drops)에서 배아체(embryoid bodies)로 발전한다. 이 배아체는 줄기 세포와 피더 셀이 혼합된 배양 조직이다. 상기 베아체가 특별한 메신저의 추가로 인해 다른 세포 타입들로 차별화되는 다음 단계에서 또한 상기 배양 조직(cultures)은 피더 셀들에 의해 오염되어 있다. 상기 줄기 세포들은 상기 조기 차별화 단계에서 분열하나 상기 피더 셀들은 활성화되지 않았기 때문에, 줄기 세포와 피더 셀의 양적인 비가 변하게 된다. 따라서, 피더 셀들과 공동 배양되는 경우, 상기 줄기 세포들은 순수한 상태로 존재하지 않고 피더 셀들과 혼합된 상태로 존재한다. 또한, 상기 피더 셀 오염은 차별화된 세포 군들(differenciated cell populations)에서도 낮은 정도로 확인된다. 그리고, 이것은 특히 회생 세포 교체 치료법(regenerative cell replacement therapies)에서 문제를 일으키는데, 이는 상기 피더 셀들이 줄기 세포들과 함께 각각의 장기들로 이식되기 때문이다. 이식된 장기 내의 이종 피더 셀의 효과는 알려지지 않고 있다. 그러나, 상기 피더 셀들이 차별화된 줄기 세포들의 기능을 조절한다는 것과 이식된 피더 셀들은 이식 후 몇 주가 경과하여도 여전히 각각의 장기에서 발견될 수 있다는 것은 실험에 의해 입증되었다. 이와 같은 이유로 인해, 조기 단계에서 줄기 세포와 피더 셀들의 완전한 분리가 필요하다.
따라서, 본 발명의 목적은 공동 배양된 세포 군들을 분리하는 것이다.
상술한 바와 같은 목적은 적어도 두 개의 공동 배양된 세포 군들을 분리하기 위한 장치를 사용함으로써 달성된다. 상기 장치는 청구항1의 특징들을 갖는다. 그리고, 상술한 바와 같은 목적은 적어도 두 개의 공동 배양된 세포 군들을 분리하는 방법을 사용함으로써 달성된다. 상기 방법은 청구항5의 특징들을 갖는다. 종속항들은 상기 방법 또는 사용의 적절한 또는 이로운 실시형태들 그리고 특징들을 각각 갖는다.
본 발명에 의하면, 적어도 2개의 공동 배양된 세포 군들(cell populations)의 분리를 위해 장치가 사용된다. 그리고, 상기 장치는, 적어도 2개의 공동 배양된 세포 군들을 포함하는 세포 배양 조직(8)의 마이크로스코픽 스캐닝을 위해 구비되고, 상기 세포 배양 조직(8) 내 세포들의 위치를 탐지하기 위한 이미지 유닛(2) 및 이미지 평가 유닛(3)과 결합하도록 구비된 마이크로스코프 유닛(1); 상기 세포들의 탐지된 위치를 저장하는 제어 및 저장 유닛(4); 및 상기 탐지된 위치에 있는 세포들을 제거하기 위한 제거 도구(10a)를 갖는 수확 모듈(5);을 포함한다.
본 발명에 따라 사용되는 상기 장치는 국제출원 제PCT/EP2007/059951호에 상세하게 기술되어 있다. 상기 국제출원 제PCT/EP2007/059951호에 개시된 기술적 특징들은 본 발명의 개시에 인용된다.
여러 공동 배양된 세포 군들의 분리 범주 내에서는 세포 군들의 다양한 조합들이 가능하다. 특히, 피더 셀 군들(feeder cell populations) 및 줄기 세포 군들(stem cell populations)을 포함하는 적어도 2개의 공동 배양된 세포 군들이 분리될 수 있다. 흡입 조건들이 배양 조건들에 맞춰질 수 있기 때문에 상기 방법은 다른 공동 배양된 세포 군들의 분리에 또한 적용될 수 있다. 추가적인 실시형태들은 혈관 내피 세포 군들(endothelial cell populations) 및 평활근(smooth muscles) 세포 군들의 분리를 위한 사용에 관한 것이고, 혈관 내피 세포 군들 및 간 세포 군들의 분리를 위한 사용에 관한 것이다.
피더 셀들과 줄기 세포들 간의 재현 가능하고 완전한 분리가 이루어질 수 있다는 사실과, 줄기 세포를 순수화시키는 본 방법은 줄기 세포들의 분화다능성(pluripotency)에 전혀 영향을 미치지 않는 사실이 입증될 수 있었다.
적어도 2개의 공동 배양된 세포 군들을 분리하기 위한 본 발명에 따른 방법은 물질적(material) 및/또는 물리적(physical) 파라미터에 기초하여 첫 번째 세포 군의 세포들을 선택하기 위한 첫 번째 탐지 단계를 수행하는 단계; 및 상기 선택된 세포들의 위치 데이터를 기록하고, 상기 기록된 위치 데이터를 위치 데이터베이스에 저장하는 단계;를 포함한다. 그리고, 상기 방법은 아래 과정에 특징에 있다.
- 상기 첫 번째 세포 군의 세포들의 적어도 하나의 추가적인 파라미터를 탐지하기 위한 적어도 하나의 두 번째 탐지 단계를 수행하는 단계
- 상기 첫 번째 탐지 단계의 데이터 및 상기 두 번째 탐지 단계의 데이터로부터 비교 데이터를 생성하고, 상기 비교 데이터를 상기 위치 데이터에 할당하는 단계
- 상기 비교 데이터에 기초하여 세포들을 선택하는 단계
- 상기 비교 데이터와 링크된 상기 위치 데이터를 상기 위치 데이터베이스로부터 수확 유닛으로 송신하는 단계
상기 방법은 국제출원 제PCT/EP2007/059951호에 개시된 방법에 상응한다. 따라서, 상기 국제출원 제PCT/EP2007/059951호에 개시된 방법의 세부 내용은 본 발명의 개시에 인용된다.
바람직한 실시예에 있어서, 적어도 2개의 공동 배양된 세포 군들을 분리하기 위한 상기 방법은 분리될 적어도 2개의 공동 배양된 세포 군들이 피더 셀 인구들과 줄기 세포 군들을 포함하는 것에 특징이 있다. 마찬가지로, 혈관 내피 세포(endothelial cell) 군들 및 간 세포 군들을 분리하기 위해, 그리고 혈관 내피 세포 군들 및 평활근(smooth muscles) 세포 군들을 분리하기 위해 상기 방법이 사용되는 것이 바람직하다.
피더 셀들과 줄기 세포들 간의 재현 가능하고 완전한 분리가 이루어질 수 있다는 사실과, 줄기 세포를 순수화시키는 본 방법은 줄기 세포들의 분화다능성(pluripotency)에 전혀 영향을 미치지 않는 사실이 입증될 수 있었다.
도 1 : 줄기 세포들과 피더 셀들(feeder cells)의 광학 현미경 이미지.(피더 셀들 상에서 배양되는 줄기 세포들)
도 2A 내지 2E : 하나의 군집 내 줄기 세포들의 반복적 흡입.(현미경 분석)
도 3 : 피더 셀들 내에 표현된 네오마이신 유전자의 표현 분석.(RT-PCR)
도 4 : 차별화 가능성(differentiation potential)의 확인.(피더 프리 줄기 세포들과 표준 방법에 따라 차별화된 줄기 세포들의 비교)
도 5 : PCT/EP2007/059951호에 따른 장치의 모범적인 실시예.
줄기 세포들의 배양을 위해 피더 셀들(feeder cells)은 예컨대 13.5일 된 쥐의 배아들로부터 얻어진다. 장기들(organs)과 머리는 상기 배아들로부터 제거된다. 남아있는 배아의 세포들은 분리되어 모노레이어(monolayer)로 배양된다. 상기 이종 세포 군(heterogeneous cell population)는 방사능(irradiation) 처리 또는 미토마이신(mitomycin) 처리에 의해 비활성화되고 이로써 상기 세포들은 더 이상 분열하지 않으나, 상기 피더 셀들은 신진대사에 있어서 활성상태로 남아있다. 적어도 2개의 공동 배양된 세포 군들을 분리시키기 위한 본 발명에 따른 방법은 물질적(material) 및/또는 물리적(physical) 파라미터들에 기초하여 첫 번째 세포 군의 세포들을 선택하는 단계를 포함한다. 광학 현미경을 이용하여 감지될 수 있는 바와 같이, 예컨대 피더 셀들과 줄기 세포들은 상이한 구조 또는 형태(shape)를 각각 갖는다(도 1). 광학 현미경 하에서는 줄기 세포들이 가늘고 긴 피더 셀들의 모노레이어 상에서 거의 원형 군집들(colonies)로 성장하는 것이 명확하게 감지될 수 있다. 따라서, 국제출원 제PCT/EP2007/059951호의 장치를 이용하면, 여러 세포 군들의 분리가 놀라울 정도로 가능하다.
아래에서는, 국제출원 제PCT/EP2007/059951호에 따른 장치의 사용 및 방법이 실시예들에 기초하여 상세하게 설명된다.
실험예
제1실험예
줄기 세포들과 피더 셀들의 분리
줄기 세포들(D3)은 네오마이신 저항성 피더 셀들(neomycin-resistant feeder cells) 상에서 5-8일 동안 배양되었다. 각 군집들의 줄기 세포들은 표준 조건(흡입 압력, 액체(liquid)의 양) 하에서 부동 세포(non-floating cells)를 위한 도구(유리 모세관, glass capillary)에 의해 흡입되었다. 국제출원 제PCT/EP2007/059951호에 따른 장치를 이용하여 페트리 접시(Petri dish) 내 여러 군집들로부터 선택된 줄기 세포들을 개별적으로 특별한 웰들(specific wells)로 운송할 수 있었고, 이로써 개별 클론들(clones)이 검사될 수 있었다. 피더 셀 모노레이어(feeder cell monoalyer)는 네오마이신 저항 유전자(neomycin resistance gene)로 감염되었다. 그리고, 이 유전자는 줄기 세포 라인 D3에 표현되어 있지 않다. 따라서, 세포 군들의 성공적인 분리 후에는 흡입된 줄기 세포 클론들에서 상기 네오마이신 저항 유전자를 확인하는 것이 불가능해야 한다. 줄기 세포들과 피더 셀들의 분리가 도 2A 내지 2E에 나타나 있다. 이 도면들은 하나의 군집(colony)에 포함된 줄기 세포들의 반복적인 흡입을 보여주고 있다(현미경 분석). 피더 셀들 내에 표현된 상기 네오마이신 유전자의 표현 분석(RT-PCR)이 도 3에 나타나 있다. 상기 현미경 분석과 그 후의 표현 분석에 따르면, 상기 모노레이어의 피더 셀들이 함께 흡입되기 전까지 상기 줄기 세포들의 흡입은 수회 반복될 수 있음을 명확히 알 수 있다. 4번의 반복 후에 피더 셀들 또한 흡입되었다. 이와 같은 확인은 전기영동법으로 분리된 아가로즈 젤(agarose gel)의 트랙 E에 있는 상기 네오마이신 유전자의 표현에 기초하여 이루어졌다.
제2실험예
순수화(피더 셀로부터의 분리)를 거친 줄기 세포들의 기능 온전성(functional integrity) 확인
배아 줄기 세포들은 분화다능(pluripotent)적이다. 즉, 체외에서 배아 줄기 세포들은 다른 세포 타입들로 차별화(differentiation)될 수 있다. 피더 세포들로부터 배아 줄기 세포들이 조기에(early) 분리되어도 특별한 세포 형태들로 차별화되기 위한 줄기 세포의 능력은 감소되지 않는다는 것을 확인하기 위해, 피더 셀 없이 배양된 줄기 세포들(feeder-free stem cells)의 차별화 가능성(potential)과 표준 방법에 의해 배양된 줄기 세포들, 즉 피더 셀들 상에서 배양된 줄기 세포들의 차별화 가능성이 뉴런 차별화(neuronal differentiation)에 기초하여 비교되었다. 상기 뉴런 차별화는 형태학적 기준(morphological criteria)에 기초하여, 그리고 뉴런 차별화의 여러 단계들(phases)에 표현된 표식들의 표현에 기초하여 분석되었다. 비교 결과, 어떠한 경우에도 상기 피더 프리 줄기 세포들의 차별화 가능성과 상기 표준 방법에 의해 배양된 줄기 세포들의 차별화 가능성 간에 중요한 차이점은 발견되지 않았다(도 3). 피더 셀들과 줄기 세포들 간의 재현 가능하고 완전한 분리가 이루어질 수 있다는 사실과 줄기 세포를 순수화시키는 본 방법은 줄기 세포들의 분화다능성(pluripotency)에 전혀 영향을 미치지 않는 사실이 입증될 수 있었다(도 4).
1 : 마아크로스코프 유닛(microscope unit)
Ia : 굴절 프리즘(deflecting prism)
Ib : 렌즈 시스템(lens system)
2 : 이미지 유닛(imaging unit)
3 : 피씨(PC)
3a : 이미지 평가 유닛(image evaluation unit)
4 : 제어 및 저장 유닛
4a : 모니터, 디스플레이
5 : 수확 유닛(harvesting unit)
5a : 리트팅 컬럼(lifting column)
5b : 트래버스 드라이브(traverse drive)
6 : 조명
7 : 조명 필터
8 : 세포 배양 조직(cell culture)
9 : xy 테이블
10 : 툴 헤드(tool head)
10a : 제거 툴(removal tool)
11 : 분리 배터리(separating battery)

Claims (8)

  1. 적어도 2개의 공동 배양된 세포 군들을 포함하는 세포 배양 조직(8)의 마이크로스코픽 스캐닝을 위해 구비되고, 상기 세포 배양 조직(8) 내 세포들의 위치를 탐지하기 위한 이미지 유닛(2) 및 이미지 평가 유닛(3)과 결합하도록 구비된 마이크로스코프 유닛(1);
    상기 세포들의 탐지된 위치를 저장하는 제어 및 저장 유닛(4); 및
    상기 탐지된 위치에 있는 세포들을 제거하기 위한 제거 도구(10a)를 갖는 수확 모듈(5);을 적어도 2개의 공동 배양된 세포 군들의 분리를 위해 포함하는 장치의 사용.
  2. 제1항에 있어서,
    분리될 상기 적어도 2개의 공동 배양된 세포 군들은 피더 셀 군 및 줄기 세포 군을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치의 사용.
  3. 제1항에 있어서,
    분리될 상기 적어도 2개의 공동 배양된 세포 군들은 혈관 내피 세포(endothelial cell) 군 및 평활근(smooth muscles) 세포 군을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치의 사용.
  4. 제1항에 있어서,
    분리될 상기 적어도 2개의 공동 배양된 세포 군들은 혈관 내피 세포 군 및 간 세포 군을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치의 사용.
  5. 물질적 및/또는 물리적 파라미터들에 기초하여 첫 번째 세포 군의 세포들을 선택하기 위한 첫 번째 탐지 단계를 수행하는 단계; 및 상기 선택된 세포들의 위치 데이터를 기록하고, 상기 기록된 위치 데이터를 위치 데이터베이스에 저장하는 단계;를 포함하는 적어도 2개의 공동 배양된 세포 군들을 분리하기 위한 방법으로서,
    상기 첫 번째 세포 군의 세포들의 적어도 하나의 추가적인 파라미터를 탐지하기 위한 적어도 하나의 두 번째 탐지 단계를 수행하는 단계;
    상기 첫 번째 탐지 단계의 데이터 및 상기 두 번째 탐지 단계의 데이터로부터 비교 데이터를 생성하고, 상기 비교 데이터를 상기 위치 데이터에 할당하는 단계;
    상기 비교 데이터에 기초하여 세포들을 선택하는 단계; 및
    상기 비교 데이터와 링크된 상기 위치 데이터를 상기 위치 데이터베이스로부터 수확 유닛으로 송신하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 공동 배양된 세포 군들을 분리하기 위한 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    분리될 상기 적어도 2개의 공동 배양된 세포 군들은 피더 셀 군 및 줄기 세포 군을 포함하는 것을 특징으로 하는 공동 배양된 세포 군들을 분리하기 위한 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    분리될 상기 적어도 2개의 공동 배양된 세포 군들은 혈관 내피 세포(endothelial cell) 군 및 평활근(smooth muscles) 세포 군을 포함하는 것을 특징으로 하는 공동 배양된 세포 군들을 분리하기 위한 방법.
  8. 제5항에 있어서,
    분리될 상기 적어도 2개의 공동 배양된 세포 군들은 혈관 내피 세포 군 및 간 세포 군을 포함하는 것을 특징으로 하는 공동 배양된 세포 군들을 분리하기 위한 방법.
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